CN103003299A

CN103003299A - 用于预防或治疗炎性肠病尤其是克罗恩病的拮抗剂

Info

Publication number: CN103003299A
Application number: CN2011800242895A
Authority: CN
Inventors: 阿莱特·达尔弗耶-米肖; 保罗·霍夫曼; 纳塔莉·罗利恩
Original assignee: Universite Clermont Auvergne
Current assignee: Universite Clermont Auvergne
Priority date: 2010-04-15
Filing date: 2011-04-15
Publication date: 2013-03-27
Also published as: EP2377883A1; WO2011128429A1; EP2558487A1; CA2796248A1; US20130084292A1; US8974789B2

Abstract

Gp96受体与大肠杆菌(E.coli)AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂，其用于预防或治疗炎性肠病。所述拮抗剂特异地阻断或降低Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株的外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)(通常为外蛋白膜OmpA)之间的相互作用。本发明提供了包含这种拮抗剂的药物组合物，所述拮抗剂可以是针对gp96或OmpA的抗体，或者gp96或OmpA多肽。它可以与CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂(例如抗CEACAM6抗体、CEACAM6多肽或者甘露糖苷或具有甘露糖单元的颗粒)组合。本发明还涉及用于诊断炎性肠病或者确定人患炎性肠病的倾向的方法。

Description

用于预防或治疗炎性肠病尤其是克罗恩病的拮抗剂

本发明涉及用于预防或治疗炎性肠病尤其是克罗恩病的肽或多肽拮抗剂。本发明还涉及用于诊断这种疾病的方法。

炎性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)主要由溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)这两种疾病组成，在西方国家这两者结合起来的患病率为约每100,000人150-200例。IBD中观察到的异常炎性反应需要宿主遗传因子与肠微生物丛(microbiota)之间的相互作用[1，2]。多条证据支持这样的看法：IBD由对肠共生生物的过度免疫应答引起[1，3]。但是，该疾病可由导致全身或局部微生态失衡的微生物群落(microflora)组成的问题引起。在CD患者中观察到粘膜相关大肠杆菌(E.coli)的数量增加[4，5，6，7，8，9]。这些粘膜相关大肠杆菌(称为粘附-侵袭性大肠杆菌，Adherent-Invasive Escherichiacoli，AIEC)能够粘附到并且侵袭肠上皮细胞(IEC)[6，10]，并且能够定殖在CD患者的回肠粘膜[11]。在患回肠CD的遗传倾向性患者中，AIEC能够通过诱导作为这些细菌之受体的CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘附分子6，carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6)的表达增加来促进其自身的定殖[12]。

WO2006/040481描述了患有克罗恩病患者回肠水平的CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘附分子6)受体的异常过表达，以及这种受体与大肠杆菌AIEC菌株之间的显著亲和力。其还描述了基于评估待测试对象的样品中这种受体之表达来诊断克罗恩病的体外方法，以及甘露糖苷或者抗CEACAM6抗体或肽作为预防治疗克罗恩病的药物的用途。

在AIEC菌株携带的毒力因子中，外膜囊泡(outer membranevesicles，OMV)通过将细菌效应因子递送至宿主细胞而在AIEC参照菌株LF82的侵袭能力中发挥作用[13]。通过其与真核细胞的相互作用，OMV(50-200nm的脂蛋白体)可以将囊泡组分和毒力因子递送至宿主细胞或宿主细胞内[14，15]。OMV表面膜上的主要蛋白质之一是OmpA蛋白，其为在粘附、侵袭和细胞内细菌持久性中具有多种作用的多面(multifaceted)蛋白质[16，17，18]。在其生物学作用中，其与脑膜炎相关大肠杆菌通过与内皮细胞糖蛋白EcGp96的相互作用来侵袭脑微血管内皮细胞(BMEC)的能力有关[19，20]。IEC表达EcGp96糖蛋白的同源物：内质网(ER)定位的应激应答伴侣蛋白Gp96[21]。有趣的是，在编码转录因子XBP1(ER应激应答的关键组分)的XBP1基因内发现单核苷酸多态性之后，最近有报道指出ER应激在UC和CD患者中都发挥关键作用[22，23]。

WO2009/113074涉及组成型表达且通常存在于内质网腔中的热休克或应激蛋白Gp96。Gp96是被大量研究的应激蛋白。TLR是有助于先天免疫并调节适应性免疫的重要受体家族。TLR表达或功能的缺陷可导致对多种病原体感染的易感性增加。相反，过度或不适当的TLR信号转导与病理过程(如败血症中LPS诱导的内毒素休克、某些自身免疫和炎性病症以及和癌症)有关。因此，调节TLR表达和功能的机制对于调整对病原体的免疫和病理性免疫反应都至关重要。最近的证据证明Gp96是TLR的独有且专一的主伴侣蛋白。其对通过TLR1-9的信号转导必不可少[30]。根据这些和现有技术中Gp96或TLR4的强制表达可参与诱导自身免疫疾病的发现，推测Gp96活性的抑制可被用作治疗目标以减轻多种疾病状况中的TLR功能失常。在TLR功能失常可引起的疾病中，WO2009/113074描述了变态反应、动脉粥样硬化、败血症中的心脏功能失调、充血性心力衰竭、缺血性损伤、急性异体移植排斥、感染相关的早产、癌症、败血症期间对侵袭病原体的全身应答、炎性病症等。WO2009/113074提出过去的研究策略集中于开发能够抑制先天免疫应答以潜在地治疗大量免疫调节疾病的TLR拮抗剂，并且集中于靶向CD91(Gp96的受体)。而WO2009/113074提出，拮抗Gp96可以是治疗这些疾病状态的有效途径。该文件因而提出了旨在使用Gp96拮抗剂来调节TLR信号转导的非特异性治疗途径。其以完全非特异性的理论性方式提出拮抗Gp96对以下多种极为不同的病症、失调和疾病有治疗价值：败血症、脓毒性休克、内毒素休克、内毒素血症(endotoxinaemia)、全身炎性应答综合症(SIRS)、自身免疫疾病(在大量自身免疫疾病中提到IBD和CD)、涉及呼吸道炎症的疾病、自身炎性疾病、缺血再灌注损伤相关疾病、心血管疾病、重金属引起的疾病、肾病、传染病、癌症、炎症诱导的癌症、早产、手术并发症、急性异体移植排斥。Gp96抑制剂可以是源自Gp96的肽、抗体和融合蛋白。

仍然需要与炎性肠病尤其是克罗恩病更密切相关且对其有特异性的治疗和诊断途径。

发明概述

本发明人的工作：对组织阵列进行免疫组织化学表明，Gp96在50％的CD患者的回肠上皮细胞顶端质膜处强表达，并且在对照中不表达。在抗Gp96抗体的存在下或者在用Gp96siRNA转染肠-407细胞之后，侵袭实验表明Gp96通过识别外膜蛋白OmpA使得OMV与肠上皮细胞融合，对促进AIEC参照菌株LF82的侵袭必不可少。Gp96在CD患者回肠上皮细胞的顶端表面上过表达，并且作为OMV的宿主细胞受体来促进AIEC侵袭。根据本文所示的结果，认为AIEC细菌可利用CD患者中异常表达的Gp96来侵袭回肠粘膜。[31]中也公开了这些结果，其内容通过整体引用并入本文。

因此，本发明作者致力于鉴定用于预防或治疗炎性肠病的化合物，优选肽或多肽化合物。本发明的核心是，本发明人证明了在炎性肠病尤其是克罗恩病患者中回肠水平的Gp96受体的这种异常过表达；该受体与大肠杆菌AIEC菌株的外蛋白膜OmpA之间的显著亲和力；以及使用可与Gp96或OmpA结合的化合物(优选肽或多肽化合物)来阻断或减少这种相互作用的意义。

基于抑制肠上皮细胞与大肠杆菌AIEC之间的特异性相互作用，并且基于抑制这种微生物和/或可同时存在的其它病原体对这些细胞的可能侵袭，其为预防和/或治疗这些疾病的新治疗方法开通了道路。这种新治疗方法可有益于在肠上皮细胞(尤其是回肠水平，特别在回肠上皮细胞的顶端质膜处)具有Gp96表达的患者，并且更特别有益于存在大肠杆菌AIEC或者也表达能够识别Gp96之外膜蛋白A的其它病原菌的患者。

因此，本发明的一个目的是Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂，其用于预防或治疗炎性肠病，例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。

特别地，本发明的一个目的是用作Gp96受体与AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之间相互作用的抑制剂的这种拮抗剂。更特别地，这种拮抗剂被用作Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之间相互作用的抑制剂，来预防或治疗炎性肠病例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。

本发明还有一个目的是用于抑制大肠杆菌AIEC菌株侵袭肠上皮细胞的这种拮抗剂。这是为了预防或治疗炎性肠病，例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。

OmpA与Gp96受体的结合还可有助于其它病原体侵袭肠上皮细胞。因此，本发明的另一个目的是用于抑制大肠杆菌AIEC菌株和/或其它病原体(例如胃肠道腔内存在的病原菌)侵袭肠上皮细胞的这种拮抗剂。

本发明的另一个目的是这种拮抗剂和针对CEACAM6与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂的组合用于预防和/或治疗炎性肠病，例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。

本发明的另一个目的是用于诊断炎性肠病(例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))，或者确定人患炎性肠病(例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))的倾向的体外方法，其中测定待测试对象的生物样品中Gp96表达水平是否高于对照样品中的表达水平，这指示炎性肠病或被测试对象患炎性肠病的倾向。

本发明的另一个目的是筛选用于预防或治疗炎性肠病(例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))的候选物质的体外方法，其包括：

(i)在待测试物质的存在下，使可溶形式或表达在细胞表面的Gp96受体与至少一种大肠杆菌AIEC菌株相接触；

(ii)测定所述物质特异性抑制Gp96受体与所述菌株之间相互作用的能力，并且选择和/或鉴定所述物质。

发明详述

本发明的第一目的是Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂，其用于预防或治疗炎性肠病，更特别地用于预防或治疗克罗恩病。

根据第一实施方案，所述拮抗剂为肽或多肽拮抗剂，其特异性阻断Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株之间的相互作用或将其降低至少30％。

在一个实施方案中，所述肽或多肽拮抗剂是特异性阻断或降低Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株外膜囊泡(OMV)之间相互作用的拮抗剂。OMV是存在于细菌表面的OMV和/或从细菌脱离的游离OMV。

根据另一实施方案，所述肽或多肽拮抗剂特异性地阻断或降低Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株外蛋白膜OmpA之间的相互作用。OmpA存在于细菌表面和/或是从细菌脱离的游离OMV。

根据一个实施方案，所述肽或多肽拮抗剂为抗Gp96抗体。

根据另一实施方案，所述肽或多肽拮抗剂为抗OmpA抗体。

根据另一实施方案，所述肽或多肽拮抗剂包含抗OmpA抗体和抗Gp96抗体二者。

“抗体”广义地指可与Gp96或OmpA结合的任何抗体，其中这种结合使得与Gp96与OmpA之间的结合变得不可能。在一个实施方案中，所述抗体对OmpA的Gp96特异性结合氨基酸序列或Gp96的OmpA特异性结合氨基酸序列具有特异性。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和表现出期望生物活性的这些抗体的抗原结合片段。单克隆抗体可以是鼠的、嵌合的或人源化的。术语“抗体”指任何全长抗体或抗体的功能性片段(由或不由遗传工程获得)，它包含至少一个抗原结合位点或者由其组成，使得所述抗体能与抗原化合物的至少一个抗原决定簇结合。作为抗体片段的例子，可提及的是片段Fab、Fab’、F(ab’)2和单链可变片段(scFv链)。用于本发明的抗体是对抗原特异的抗体。它们优选为单克隆抗体或单特异性多克隆抗体，即它们只特异性识别一种表位。用于本发明上下文的单克隆抗体或单特异性多克隆血清或者通过筛选基因组文库得到的抗体的生产是常规技术。

尤其地，可以通过以下过程得到抗Gp96的多克隆抗体：根据本领域技术人员本身已知方法，借助可溶性Gp96受体或其抗原片段免疫动物(例如兔、小鼠等)，收集抗血清然后在例如包含所述受体的免疫吸附剂上消耗得到的抗血清。

已开发并销售几种抗Gp96单克隆或多克隆抗体：

-抗Grp94H-212，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，USA；

-大鼠抗Grp94单克隆抗体(9G10)，产品号SPA-850，

Assay Designs，Ann Arbor，Ml 48108USA；

-大鼠抗Grp94单克隆抗体(9G10)Dylight 488缀合物；产品号SPA-850-488，

Assay Designs，Ann Arbor，Ml 48108USA；

-大鼠抗Grp94单克隆抗体(9G10)产品号SPA-850，

Assay Designs，Ann Arbor，Ml 48108USA

-兔抗Gp96(N端)单克隆抗体，Clone ZMD.287，Invitrogen，Carlsbad，California，USA

天然Gp96氨基酸序列如SEQ ID NO：1中所示，并且可全部或部分用于设计抗体。也可如下所述使用变体序列。

如图5所示，LF82和K-12的氨基酸序列相差5个氨基酸。两者中的任一种序列都可用于设计所述抗体。或者，使用包含至少一个以下氨基酸变化的完整LF82氨基酸序列或者片段：Val115、Phe132、Asp133、Thr223、Ala269。在一些具体实施方案中，氨基酸序列包含Asp133和Thr223，或者Phe132、Asp133和Thr223。也可如下所述使用变体序列。

通常，根据

和Milstein(1975)描述的淋巴细胞融合和杂交瘤培养的常规方法，可以得到另一些单克隆抗体。已知用于制备单克隆抗体的其他方法(Harlow等编著，1988“Antibodies：a laboratorymanual”)。可以通过免疫哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔或甚至人等)然后使用淋巴细胞融合技术产生杂交瘤来制备单克隆抗体(

和Milstein，1975)。

存在这种常规技术的替代技术。例如，可通过表达克隆自杂交瘤的核酸来生产单克隆抗体。也可通过噬菌体展示技术通过将抗体的cDNA引入载体来生产抗体，所述载体通常为在噬菌体表面显示基因文库V的丝状噬菌体(例如，大肠杆菌的fUSE5，Scott，1990)。在Marks等(1991)中描述了构建这些抗体文库的方案。

在一个实施方案中，所述拮抗剂是Gp96或OmpA多肽。

天然Gp96氨基酸序列如SEQ ID NO：1中所述。

大肠杆菌AIEC LF82的天然OmpA氨基酸序列如SEQ ID NO：2中所述。

大肠杆菌K-12的天然OmpA氨基酸序列如SEQ ID NO：3中所述。

“Gp96或OmpA多肽”包括Gp96或OmpA天然序列多肽、Gp96或OmpA多肽变体以及嵌合Gp96或OmpA多肽。

“Gp96或OmpA天然序列多肽”包括与发现或来源于人的相应Gp96或OmpA多肽的氨基酸序列相同的多肽。Gp96或OmpA天然序列多肽可以是天然的(即分离自人)、重组的(即通过重组方法产生)或合成的(即通过合成产生)。

Gp96或OmpA天然序列多肽涵盖发现自人类的相应Gp96或OmpA多肽的全长氨基酸序列，或者天然截短或分泌形式。其还涵盖了能够结合其靶标OmpA或Gp96的全长氨基酸序列的片段。

“Gp96或OmpA多肽变体”意指氨基酸序列不同于相应的Gp96或OmpA天然序列多肽且保留全长序列与其靶标特异性结合之功能的多肽。这种全长Gp96或OmpA多肽变体或片段与相应的全长或部分(片段)Gp96或OmpA天然序列多肽可以有至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的氨基酸序列同一性。

“嵌合Gp96或OmpA多肽”是与异源氨基酸序列融合的Gp96或OmpA多肽。本发明涵盖了包含Gp96或OmpA多肽的一部分(例如，特异性结合结构域)和补充氨基酸的嵌合Gp96或OmpA多肽。

在一个实施方案中，嵌合Gp96或OmpA多肽是包含Gp96或OmpA多肽和免疫球蛋白结构域的融合蛋白。“免疫球蛋白结构域”意指Fc结构域、重链或轻链。在一个优选实施方案中，免疫球蛋白结构域为Fc序列。尤其可以是来自人IgG1的Fc。

根据另一实施方案，所述肽或多肽拮抗剂是能够与大肠杆菌AIEC菌株的OmpA结合的天然或变体Gp96片段，所述结合阻断或降低大肠杆菌AIEC菌株与肠上皮细胞表面Gp96受体之间的相互作用。

根据另一实施方案，所述肽或多肽拮抗剂是能够与Gp96结合的大肠杆菌AIEC菌株天然或变体OmpA的片段，所述结合阻断或降低大肠杆菌AIEC菌株与肠上皮细胞表面Gp96受体之间的相互作用。

“片段”意指本发明天然蛋白质(Gp96或OmpA)或其变体之一的至少5个，优选至少8个，更特别地至少10、15或20个连续氨基酸序列。

如图5中所示，LF82与K-12的氨基酸序列相差5个氨基酸。两者中的任一种序列可用于设计本发明的多肽或肽拮抗剂，包括抗体。或者，使用包含至少一个以下氨基酸变化的完整LF82氨基酸序列或者片段：Val115、Phe132、Asp133、Thr223、Ala269。在一些具体实施方案中，所述氨基酸序列包含Asp133和Thr223，或者Phe132、Asp133和Thr223。

根据另一实施方案，所述拮抗剂是使gp96基因沉默的siRNA。

小干扰RNA或siRNA是可具有10或50个核苷酸的长度且降低靶基因表达的双链RNA(dsRNA)。第一链的一部分与靶基因互补，即其具有足够的互补性以与靶基因杂交，例如与靶基因或其部分有至少80％的同一性。

本发明的肽或多肽拮抗剂可以被整合入药物组合物中，优选用于经口施用。

例如，这些组合物可以口服施用，例如以立即或控制释放的片剂、胶囊或颗粒剂的形式。

用于经口施用的固体组合物通过以下过程制备：向肽或多肽拮抗剂中添加填充剂，适当时添加粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂或矫味剂；然后使混合物形成片剂、包衣片剂、颗粒剂、粉剂或胶囊。

填充剂的实例包括乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素和二氧化硅，粘合剂的实例包括聚(乙烯醇)、聚(乙烯醚)、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、虫胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、柠檬酸钙、糊精和果胶。

润滑剂的实例包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、硅石和硬化的植物油、着色剂可以是批准用于药物的着色剂的任一种。

矫味剂的实例包括可可粉、草形式的薄荷、芳香粉末、油形式的薄荷、冰片和肉桂粉。应理解，片剂或颗粒剂可合适地包被糖、明胶等。

在一个具体实施方案中，药物组合物还包含针对CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂。

该第二拮抗剂可以是本领域技术人员可参照的WO2006/0404481中所述的任何一种。如这个文件所公开的，这种拮抗剂可以是这种相互作用的任何肽或多肽拮抗剂。

在一个实施方案中，CEACAM66(在WO2006/0404481命名为Cd66c)受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂为抗CEACAM6抗体。

在另一实施方案中，所述拮抗剂是可以与AIEC菌株特异性相互作用并阻碍与CEACAM6结合的CEACAM6多肽。在WO2006/0404481和WO0I/013937中已经描述了这种多肽。

关于Gp96和OmpA所给出的抗体和多肽的定义也适用于可用作拮抗剂的CEACAM6抗体和多肽。特别地，这些可以是多克隆或单克隆抗体，鼠、嵌合或人源化抗体，天然多肽或衍生物，全长或片段，嵌合多肽(例如融合多肽)等。

在另一实施方案中，CEACAM6/AIEC菌株相互作用的拮抗剂是甘露糖苷，例如D-甘露糖、甲基-D-甘露糖或者携带一个或更多个甘露糖单元的颗粒。因此，术语甘露糖苷定义为包括D-甘露糖和能够通过水解释放D-甘露糖的化合物(例如通过水解释放D-甘露糖的多糖和寡糖(均多糖或杂多糖))，以及能够与AIEC菌株的粘附素FimH相互作用的任何D-甘露糖衍生物。携带一个或更多个甘露糖单元的颗粒可以例如是惰性珠或颗粒或者活或死细胞。

本发明还涉及药物组合物，其包含Gp96与OmpA之间相互作用的拮抗剂和CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂，以及可药用载体。

本发明还涉及药物组合物，其包含Gp96与OmpA之间相互作用的拮抗剂和CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂，它们同时、单独或分开施用。

因此，本发明可涉及包含第一组合物和第二组合物的药盒，所述第一组合物包含Gp96与OmpA之间相互作用的拮抗剂和可药用载体，所述第二组合物包含CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂和可药用载体。

施用肽或多肽拮抗剂来预防或治疗炎性肠病特别是克罗恩病的有效量和剂量取决于很多因素，例如取决于拮抗剂的性质、患者的体形、疾病的阶段、使用的具体药物组合物以及主治医生的观察和结论。

例如，在经口施用(例如片剂或胶囊)的情况下，合适剂量可以为约0.1mg/kg至约100mg/kg体重/天，优选约0.5mg/kg至约50mg/kg体重/天，更优选约1mg/kg至约10mg/kg体重/天，还优选约2mg/至约5m g/kg体重/天的活性物质。

为了阐明可如以上所述使用的口服途径的日剂量范围，如果认为代表性体重为10kg至100kg，那么合适剂量为约1-10mg至1000-10000mg/天，优选约5-50mg至500-5000mg/天，还优选约10.0-100.0mg至100.0-1000.0mg/天，更优选约20.0-200.0mg至约50.0-500.0mg/天的活性成分。

这些剂量范围表示每天用于给定患者的活性成分的总量。每天的施用(施用一剂量)次数可有很大不同，特别是根据药代动力学因素。

因此，本发明还涉及Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂(优选肽或多肽拮抗剂)在制备用于预防或治疗炎性肠病或克罗恩病中的用途。尤其是将这种拮抗剂用作Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之间相互作用的抑制剂。更特别地，为了预防或治疗炎性肠病，例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，将这种拮抗剂用作Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之间相互作用的抑制剂。

因此，本发明还涉及抗Gp96抗体在制备用于预防或治疗炎性肠病或克罗恩病的药物中的用途。

因此，本发明还涉及抗OmpA抗体在制备用于预防或治疗炎性肠病或克罗恩病的药物中的用途。

与用途类似，本发明涉及用于预防或治疗炎性肠病(例如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD))的方法，其中向有此需要的患者施用有效量的根据本发明的拮抗剂或药物组合物。以上所示的各种特征也适用于本主题。因此，所述拮抗剂可以是本文公开的Gp96多肽、OmpA多肽、抗Gp96抗体、抗OmpA抗体、siRNA或其混合物。

基于抑制肠上皮细胞与大肠杆菌AIEC之间的特异性相互作用，并且基于抑制这种微生物和/或可同时存在的其它病原体对这些细胞的潜在侵袭，这种方法允许预防和/或治疗这些疾病。该方法可应用于在肠上皮细胞上(尤其是在回肠水平，特别地在回肠上皮细胞的顶端质膜处)具有Gp96表达的患者；更特别地可应用于存在大肠杆菌AIEC或者也表达能够识别Gp96之外膜蛋白A的其它病原菌的患者。

该方法可包括向该患者施用包含CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂的如上公开的组合物。

本发明的另一方面是用于诊断炎性肠病或者确定人患炎性肠病的倾向的体外方法，其中测定待测试对象的生物样品中Gp96表达水平是否高于对照样品中的表达水平，其指示炎性肠病或测试对象患炎性肠病的倾向。

在一个优选实施方案中，所述方法用于诊断克罗恩病。

在本发明的上下文中，“生物样品”可以是回肠或结肠活检样品，分离自回肠或结肠活检样品的肠细胞制备物、血液、口腔上皮细胞或粪便。词语“回肠或结肠活检样品”应理解为意指回肠或结肠(或者回肠或结肠粘膜)之一部分的样品，例如在手术切除期间或内窥镜检查期间得到的。

“对象”或“患者”为哺乳动物，优选人，不考虑性别、年龄和一般情况。也包括儿童。测试对象可以无症状，或者可被认为有患炎性肠病的风险。

术语“诊断”指确定或证实感染炎性肠病的感染，无论其患病阶段为何。更特别地“诊断”可以是早期诊断或复发诊断。

本发明的方法涉及定量测定Gp96受体表达的绝对水平，然后与对照对象中受体的表达水平(平行地测定或以其它方式已知)进行比较，或者直接测定与对照样品相比待测试生物样品中Gp96受体的相对表达水平(在这种情况下可以使用表达的半定量检测)。“对照”样品是来自“健康”对象或未患克罗恩病的对象或者未患有任何炎性肠病(IBD)或结直肠癌的对象的样品。根据情况，“对照”样品可以是具有外伤或感染性来源的小肠炎性病变的对象。为了确定克罗恩病的进展，可有用的是通过在例如几周之后第二次测试对象来测定对象中Gp96的表达水平，并控制药物作用或疾病的进展。在这种情况下，将第二次测试的结果与第一次测试的结果以及通常也与在“健康”对象中得到的结果进行比较。因此，“对照”样品指同一测试对象或“健康”对象。

Gp96受体的表达水平可以以多种方式进行测定。尤其是可以通过测定Gp96受体或通过测量其转录水平(即编码该受体的mRNA的量)进行确定。以下描述了用于检测和/或定量Gp96受体表达的多种方法。

根据第一实施方案，通过测量Gp96受体糖蛋白的量(通常通过使生物样品与能够选择性与样品中存在的Gp96受体相互作用的结合伴侣相接触)来测定Gp96受体的表达水平。结合伴侣通常是抗体，其可以是多克隆或单克隆的，优选单克隆的。其也可以是Gp96受体的肽片段。抗体可通过与上述相同的方法得到。

因此，优选通过免疫学测试来测量Gp96受体糖蛋白的量，所述测试包括使生物样品与(任选标记的)特异性识别Gp96的抗Gp96抗体相接触，然后示出所形成的抗体-Gp96受体复合物。

根据一个优选实施方案，生物样品是回肠或结肠活检样品，免疫学测试为免疫组织化学测试。

本发明还提供了用于诊断炎性疾病或者确定人患炎性肠病的倾向的体外方法，其中测定待测试对象的生物样品中Gp96受体和CEACAM6(Cd66c)(参照WO2006/040481)的表达水平是否高于对照样品中的表达水平，其指示炎性肠病或测试对象患炎性肠病的倾向。

此外，本发明提供了筛选用于预防或治疗炎性肠病的候选物质的体外方法，其包括：

(i)在待测试物质的存在或不存在的情况下，使可溶形式或表达在细胞表面的Gp96受体与至少一种大肠杆菌AIEC菌株相接触；

在一个优选实施方案中，所述方法用于筛选预防或治疗克罗恩病的候选物质。

候选物质可以是任何类型，包括天然或合成化合物、或者化合物的混合物。所述物质可以是结构确定的或者结构未知的，例如以生物提取物的形式。

为了测定候选物质抑制大肠杆菌AIEC菌株与Gp96受体之间结合的能力，可以在表达Gp96受体的细胞培养物上进行标准竞争测试。例如，所述细胞可以是进行遗传转化以过表达所述受体的细胞，或者是分离自克罗恩病患者的回肠活检样品的肠细胞。它们可以是单层培养的肠上皮细胞(例如HT29、Caco-2、T84、肠-407)。在候选物质是已确定化合物的情况下，它可以是标记的，例如用放射性或非放射性标志物(例如荧光素)。

然后，可以在浓度变化的所述候选物质(例如10-10至10-5M)的存在下，对与Gp96受体特异性结合的标志物进行定量。或者，可通过粘附测试监测候选物质与大肠杆菌AIEC细菌对Gp96受体的竞争。

以下图和实施例阐明本发明，而并不限制范围。

附图说明

图1.CD患者和对照的肠活检样品中的Gp96表达。在对照、CD急性期或静止期患者的结肠和回肠活检样品的TMA中，使用Spot Browser软件进行Gp96免疫染色的定量，＊＊P＜0.01。

图2.Caco-2细胞中的Gp96表达。A，使用RT-PCR，相对于未处理细胞(NT)，经TNF-α或IFN-γ刺激24或48小时(h)之后，Caco-2细胞中Gp96mRNA水平的变化倍数。测量gapdh mRNA水平作为对照。数据为三次单独实验的平均值±SEM。B-C，Western印迹分析，显示经TNF-α或IFN-γ刺激24或48小时之后(B)，或者用MOI为10或100的AIEC LF82细菌感染3小时之后(C)，Caco-2细胞的Gp96表达水平。作为上样对照，使用抗β-肌动蛋白多克隆抗体进行标记。

图3.Gp96表达支持LF82侵袭。A，用抗Gp96抗体对肠-407上皮细胞进行预处理对LF82侵袭水平的影响。用针对Gp96的兔多克隆抗体(Gp96Ab)或者1∶200或1∶500稀释的兔多克隆抗体(同种型对照)对肠-407细胞进行预处理30分钟，然后用LF82细菌感染。在感染3小时之后以及庆大霉素处理另一小时之后，测定侵袭。结果被表示为相对于菌株LF82对未处理细胞(NT)所得的细菌(看做100％)的胞内细菌。每个值都是至少四个单独实验的平均值±SEM。与野生型菌株对未处理细胞相比＊P＜0.05。B，使用抗Gp96和抗β-肌动蛋白抗体对来自肠-407细胞的全蛋白提取物进行Western印迹分析。肠-407细胞是未转染的(NT)、用10ng阻断Gp96的siRNA(Gp96siRNA)转染的、或者用空载体(pSUPER)转染的作为对照。C，gp96siRNA对野生型菌株LF82侵袭水平的作用。如A中所述对侵袭细菌进行定量。与野生型菌株对未处理细胞相比＊＊P＜0.01。

图4.Gp96依赖性侵袭涉及AIEC OmpA。A，LF82-ΔompA突变体、用克隆的LF82ompA基因或克隆的K-12MG1655ompA基因或单独的pBAD33载体转化的LF82-ΔompA突变体对肠-407上皮细胞的侵袭能力。如图3A中所述对侵袭细菌进行定量。与野生型菌株相比＊＊P＜0.01。通过酵母凝集视检确定1型菌毛的表达并且将滴度记录为得到阳性凝集结果的最终稀释度。生长在含L-阿拉伯糖的培养基中的LF82、用克隆的LF82ompA基因或克隆的K-12ompA基因或单独的pBAD33载体转化的LF82-ΔompA细菌的全细胞裂解物经SDS-PAGE分离，并用考马斯亮蓝染色。标记OmpC/F和OmpA的位置。B，用OMV和抗Gp96抗体(Gp96Ab)对肠-407上皮细胞进行预处理对LF82-ΔompA侵袭水平的影响。用1∶500稀释的针对Gp96的兔多克隆抗体(Gp96Ab)对肠-407细胞进行预处理30分钟，然后用来自WT或LF82-ΔompA细菌的OMV进行预处理1小时，并且在洗涤之后，用细菌感染细胞。如图3A中所述对侵袭细菌进行定量。

图5.OmpA的氨基酸序列比对。胞外环氨基酸为黑体，AIEC LF82OmpA(SEQ ID NO：2)与大肠杆菌K-12MG1655(SEQ ID NO：16)之间不同的氨基酸用下划线和黑体表示。

实施例

材料和方法

A.患者和活检标本

本研究包括的所有患者都在消化科(Archet II Hospital，University ofNice Sophia Antipolis，France)住院并且签署了本研究的协议，Universityof Nice Sophia Antipolis的当地伦理委员会批准了本方案。从65名克罗恩病(CD)患者(活跃CD)的末端回肠和结肠的视检发炎粘膜(macroscopically inflamed mucosa)以及从55名CD患者(疾病的静止期)的末端回肠和结肠的视检未发炎粘膜中得到肠活检样品。有67名男性和53名女性，平均年龄为40岁(范围为19-60)，平均疾病持续时间为10年(范围为2-23年)。患者都是法国高加索人种。此外，从对照患者(由40名因大便习惯改变、腹痛、上消化道出血或癌症监督进行内窥镜检查之后没有显著病变的个体组成)的回肠和结肠中取得活检样品。

B.组织微阵列(TMA)构建和免疫组织化学

从苏木精和伊红染色片选择每个个体建造TMA的代表性肠活检样品。简言之，从每个标本的粘膜上部得到一个组织芯(直径为600μm)，凹部或腺体总是纵向切割。使用细钢针将组织芯排列成新的石蜡块。两个最终的TMA由患者和对照回肠粘膜或结肠粘膜的480、600μm直径的组织芯组成。在如Hoffman等所述处理的系列4μm脱蜡TMA片上进行免疫组织化学方法。在室温下使用单克隆大鼠抗GP96(9G10，SPA-850，Stressgen)处理45分钟。用PBS冲洗之后，将片用过氧物酶标记的抗大鼠Ig(DAKO Envision System)孵育45分钟。为了测量组织学疾病活性，如Sandborn等[25]中所使用的，使用CD粘膜生物活检标本中组织学异常情况的评分系统。如Hoffman等所述[24]，免疫染色之后，用图像分析工作站(Spot Browser version 7；Alphelys)对切片进行分析。

C.细菌菌株、质粒和培养条件

以下列出本研究使用的细菌菌株和质粒。37℃下将细菌常规地在LB培养液中或LB上或者Mueller-Hinton琼脂板上培养过夜。添加下述浓度的抗生素：氨苄青霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(25μg/ml)。使用Datsenko和Wanner[26]所述并且由Chaveroche等[27]进行修改的方式用PCR产物产生LF82-ΔompA等基因突变体(表1)。对于反式回补测定，将包含AIEC LF82或大肠杆菌K-12MG1655菌株完整ompA基因的PCR产物克隆到pBAD33载体中(表1)。

菌株或质粒：

-LF82：大肠杆菌：分离自CD患者的回肠活检样品[6]

-LF82-ΔompA：缺失ompA基因的LF82等基因突变体

-K-12MG1655：非病原性大肠杆菌菌株(实验室储藏种)

-pKOBEG：携带λ噬菌体redγβα操纵子的pBAD克隆载体，氯霉素r[27]

-pBAD33：大肠杆菌克隆载体，氯霉素r[29]

-pPBI13：具有菌株LF82的完整ompA基因的携带1.1kb HindIII-SaII片段的pBAD33

-pPBI14：具有菌株MG1655的完整ompA基因的携带1.1kbHindIII-SaII片段的pBAD33

-pSUPER.neo：用于表达短干扰RNA的载体系统(Oligoengine)

-gp96siRNA：携带对gp96mRNA特异的寡核苷酸的pSUPER.neo

表1：用于PCR实验的寡核苷酸

D.OMV制备

如Rolhion等所述分离了OMV[13]。过滤培养上清液，并且通过在4℃下以150,000×g超速离心3小时来收集OMV。将OMV沉淀重悬于10mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl。

E.细胞培养、转染和侵袭测定

肠-407和Caco-2细胞得自于ATCC。选择19-mer寡核苷酸(5′UCAGUUGGAU GGAUUAAAU 3′，对gp96mRNA特异)用于合成siRNA，根据制造商说明书克隆入pSUPER载体(Oligoengine)，并且用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染。如Boudeau等所述对细菌侵袭进行定量[10]。用10个细菌/细胞的感染复数(MOI)对单层细胞进行感染3小时，并且如Boudeau所述测定胞内细菌的数量[28]。在37℃下使用抗Gp96(H-212，Santa Cruz Biotech)或兔IgG(同种型对照，C-20，Santa Cruz Biotech)对细胞进行30分钟的预处理之后，进行抑制侵袭测定。如Rolhion等[13]先前所述的用OMV对IEC进行预处理。对于用抗体和OMV对IEC进行预处理，将单层细胞与抗Gp96(1∶500稀释)孵育30分钟，然后与OMV孵育1小时，然后洗涤并感染。

F：mRNA定量

用50ng/ml的IFN-γ或TNF-α对IEC刺激1或2天。使用TRIzol(Invitrogen)根据制造商说明书分离总RNA。使用二步法逆转录酶PCR试剂盒(MP Biochemicals)得到cDNA，然后使用SYBR green TaqReadyMix(Sigma)和gp96特异性寡核苷酸(表1)进行定量。每个样品一式两份进行。所有结果均用未受影响的gapdh持家基因归一化。

G.酵母细胞凝集测定

如Rolhion等[13]所述进行酵母细胞凝集测定。

H.蛋白质制备和分析

将用L-阿拉伯糖培养的细菌重悬于SDS-PAGE上样缓冲液，通过SDS-12％PAGE分离等量的蛋白质提取物，并通过考马斯亮蓝染色。如Barnich等[12]所述，使经IFN-γ或TNF-α刺激，或者通过MOI为10或100的细菌感染的IEC发生裂解。通过SDS-12％PAGE分离10μg蛋白质，在硝酸纤维素膜(Amersham international)上进行印迹，然后使用大鼠抗Grp94单克隆抗体(9G10，SPA-850，Stressgen)对Gp96进行染色，并且用山羊抗人β-肌动蛋白多克隆抗体(C-11，Santa CFuz Biotech)对β-肌动蛋白进行染色。

I.统计分析

为了分析Gp96免疫染色中的差异显著性，使用Student’s t检验来比较测定。值表示为“n”个实验的平均值±SEM。使用X2分析得到Gp96表达与一系列病理特征的联系。通过Windows的SPSS 11.5进行计算和分析，并且在合适时进行双尾分析。将Student’s t检验用于分析侵袭水平之间的统计差异性。认为P值小于或等于0.05是统计显著的。

实施例1：CD患者回肠上皮中Gp96蛋白表达的增加

Gp96免疫染色的定量证明相对于在对照组中所观察到的，在急性期或静止期CD患者回肠活检样品中，阳性细胞密度显著更高(图1)。相反，在来自对照和CD对象的结肠活检样品中观察到极少数阳性细胞。在活跃期的CD患者中，33/65(50％)的个体中观察到Gp96-免疫染色，而在静止期的CD患者中，19/55(34％)的个体中观察到Gp96免疫染色。

实施例2：炎性病症或AIEC感染对Gp96表达的影响

为了调查CD患者中的异常Gp96表达是否由促炎性细胞因子刺激或大肠杆菌感染回肠上皮细胞而引起，在用IFN-γ或TNF-α刺激或者在经AIEC细菌感染所培养的IEC之后分析Gp96表达。与未处理细胞相比，在TNF-α或IFN-γ刺激24或48小时之后，在Caco-2细胞中观察到gp96mRNA水平没有改变(图2A)。此外，使用抗Gp96抗体的Western印迹分析表明促炎细胞因子刺激或未刺激的Caco-2细胞中Gp96表达相似(图2B)。在通过MOI为10或100的AIEC菌株LF82感染3小时之后，Caco-2细胞的Gp96蛋白水平没有改变(图2C)。通过肠-407细胞观察到相似的结果。因此，炎性病症或AIEC感染不改变IEC中的Gp96表达。

实施例3：Gp96表达对LF82大肠杆菌侵袭的影响

使用在抗Gp96多克隆抗体存在下的侵袭抑制测定以及使用通过RNA沉默降低gp96水平的IEC的侵袭测定，调查了Gp96在AIEC侵袭IEC中的作用。当用抗Gp96抗体(1∶200稀释)对IEC进行预处理时，LF82细菌的侵袭水平为菌株LF82对未处理细胞侵袭水平的54.5％±3.3％(图3A)。相比之下，用抗IgG同种型对照进行预处理对LF82侵袭没有作用。有趣的是，通过用gp96siRNA转染IEC(图3B)降低Gp96表达，使得LF82侵袭水平降低(图3C)。实际上，LF82细菌对用Gp96siRNA转染的肠-407细胞的侵袭水平为菌株LF82对未处理细胞的侵袭水平的30.9％±5.0％。相比之下，用不降低Gp96蛋白水平的空载体转染细胞，不影响AIEC LF82侵袭IEC的能力。综合起来，这些结果强有力地证明了Gp96在AIEC侵袭中发挥重要作用。

实施例4：OmpA对LF82大肠杆菌侵袭的影响(图4A)

调查了OmpA在AIEC菌株LF82中的作用。构建缺失ompA基因的LF82等基因突变体，并且观察到LF82-ΔompA在1型菌毛表达中并无缺陷。经负染色的细菌的电子显微镜检查表明，与野生型菌株LF82相比，细菌表达1型菌毛且得到了相似的酵母细胞凝集滴度(1/8)，这表明LF82-ΔompA等基因突变体合成与野生型菌株LF82相似水平的功能性1型菌毛。定量侵袭测定表明LF82-ΔompA突变体侵袭肠-407上皮细胞的能力降低，与野生型菌株LF82(看做100％)相比，残留56.3％±2.6％的侵袭水平(图4A)。克隆的AIEC LF82ompA基因的反式回补完全恢复了突变体的侵袭。OmpA序列的分析证明LF82OmpA与非病原性大肠杆菌K-12菌株MG1655的差别为5个氨基酸：位于周质结构域之一的两个氨基酸，跨膜结构域的一个氨基酸，以及OmpA蛋白的第三细胞外环中的两个氨基酸(图5)。用克隆的大肠杆菌K-12菌株MG1655的ompA基因转化LF82-ΔompA突变体并不使侵袭恢复至与野生型LF82相似的水平。这不是因为OmpA表达的缺陷，因为用克隆的AIEC LF82ompA或克隆的大肠杆菌K-12的ompA进行反式回补的LF82-ΔompA细菌中产生的OmpA量相似。

实施例5：LF82OMV恢复LF82-ΔompA侵袭的能力(图4B)

分析了LF82OMV恢复LF82-ΔompA等基因突变体侵袭的能力。当用LF82OMV对IEC进行预处理时，LF82-ΔompA突变体的侵袭能力增加，达到85.2％±5.3％；并且与菌株LF82(看做100％)的侵袭能力没有显著差异。在宿主这一面，其涉及Gp96，因为添加抗Gp96抗体阻断了LF82-ΔompA突变体对LF82OMV处理细胞侵袭能力的恢复。在细菌这一面，其涉及OmpA，因为用LF82-ΔompA OMV预处理的IEC中，未观察到LF82-ΔompA突变体的侵袭水平的增加。

热休克蛋白90kDa β(Grp94ou Grp96)，成员1[人(Homo sapiens)]

SEQ ID NO：1

1 mralwvlglc cvlltfgsvr addevdvdgt veedlgksre gsrtddevvq reeeaiqldg

61 lnasqirelr eksekfafqa evnrmmklii nslyknkeif Irelisnasd aldkirlisl

121tdenalsgne eltvkikcdk eknllhvtdt gvgmtreelv knlgtiaksg tseflnkmte

181aqedgqstse ligqfgvgfy saflvadkvi vtskhnndtq hiwesdsnef sviadprgnt

241lgrgttitlv lkeeasdyle ldtiknlvkk ysqfinfpiy vwssktetve epmeeeeaak

301eekeesddea aveeeeeekk pktkkvektv wdwelmndik piwqrpskev eedeykafyk

361sfskesddpm ayihftaege vtfksilfvp tsaprglfde ygskksdyik lyvrrvfitd

421dfhdmmpkyl nfvkgvvdsd dlplnvsret lqqhkllkvi rkklvrktld mikkiaddky

481ndtfwkefgt niklgviedh snrtrlakll rfqsshhptd itsldqyver mkekqdkiyf

541magssrkeae sspfverllk kgyeviylte pvdeyciqal pefdgkrfqn vakegvkfde

601sektkesrea vekefeplln wmkdkalkdk iekavvsqrl tespcalvas qygwsgnmer

661imkaqayqtg kdistnyyas qkktfeinpr hplirdmlrr ikededdktv ldlavvlfet

721atlrsgyllp dtkaygdrie rmlrlslnid pdakveeepe eepeetaedt tedteqdede

781emdvgtdeee etakestaek del

OmpA菌株LF82

SEQ ID NO：2

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFFTINNNGPTHEN

QLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAFTKLGY

PITDDLDVYTRLGGMVWRADTKSNFDGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLFTE

YQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTL

KFTSDVLFTFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQA

LSERFTRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDR

RVEIEVFTKGIKDVVTQPQA

参考文献

1-Strober W，Fuss I，Mannon P，J Clin Invest 2007；117：514-21.

2-Xavier RJ，Podolsky DK，Nature 2007；448：427-34.

3-Sartor RB，Gastroenterology 2008；134：577-94.

4-Baumgart M et al.，ISME J 2007；1：403-18.

5-Gonte MP et al.，Gut 2006；55：1760-7.

6-Darfeuille-Michaud A et al.，Gastroenterology 1998；115：1405-13.

7-Kotlowski R et al.，Gut 2007；56：669-75.

8-Martin HM et al.，Gastroenterology 2004；127：80-93.

9-Sasaki M et al.，Lab Invest 2007；87：1042-54.

10-Boudeau J at al.，Infect Immun 1999；67：449g-509.

11-Darfeuille-Michaud A et al.，Gastroenterology 2004；127：412-21.

12-Barnich N et al.，J Clin Invest 2007；117：1566-74.

13-Rolhion N et al.，J Bacteriol 2005；187：2286-96.

14-Kuehn MJ，Kesty NC，Genes Dev 2005；19：2645-55.

15-Mashburn-Warren LM et al.，Mol Microbiol2006；61：839-46.

16-Nicholson TF at al.，Infect Immun 2009.

17-Torres AG，Kaper JB，Infect Immun 2003；71：4985-95.

18-Weiser JN，Gotschlich EC，Infect Immun 1991；59：2252-8.

19-Prasadarao NV，Infect Immun 2002；70：4556-63.

20-Prasadarao NV at al.，Infect Immun 2003；71：1680-8.

21-Cabanes D et al.，EMBO J 2005；24：2827-38.

22-Heazlewood CK et al.，PLoS Med 2008；5：e54.

23-Kaser A et al.，Cell 2008；134：743-56.

24-Hofman P et al.，Br J Cancer 2008；98：956-64.

25-Sandborn WJ et al.，Gastroenterology 2002；122：512-30.

26-Datsenko KA，Wanner BL.Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97：6640-5.

27-Chaveroche MK et al.，Ghigo JM，d′Enfert C.Nucleic Acids Res 2000；28：E97.

28-Boudeau J et al.，Barnich N，Darfeuille-Michaud A.Mol Microbiol 2001；39：1272-84.

29-Guzman LM et al.，J Bacteriol 1995；177：4121-30.

30-Yang et al.，2007，Immunity，26，215-226

31-Rolhion et al.，2010，Gut，59：1355-1362.

Claims

1.针对Gp96受体与大肠杆菌(E.coli)AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂，其用于预防或治疗炎性肠病。

2.根据权利要求1所述的拮抗剂，其用于特异性阻断或降低Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株外膜囊泡(OMV)之间的相互作用。

3.根据权利要求2所述的拮抗剂，其用于特异性阻断或降低Gp96受体与大肠杆菌AIEC菌株的外蛋白膜OmpA之间的相互作用。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的拮抗剂，其是抗Gp96抗体。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的拮抗剂，其是抗OmpA抗体。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的拮抗剂，其是Gp96多肽。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的拮抗剂，其是OmpA多肽。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的拮抗剂，其是使gp96基因沉默的siRNA。

9.根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂，其用于预防或治疗克罗恩病。

10.药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂和可药用载体。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其还包含针对CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于所述针对CEACAM6受体与大肠杆菌AIEC菌株之间相互作用的拮抗剂为抗CEACAM6抗体、CEACAM6多肽、或者甘露糖苷或携带一个或更多个甘露糖单元的颗粒。

13.用于诊断炎性肠病或者确定人患炎性肠病的倾向的体外方法，其中测定待测试对象的生物样品中Gp96受体的表达水平是否高于对照样品中的表达水平，其指示炎性肠病或所述测试对象患炎性肠病的倾向。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物样品是回肠活检样品、结肠活检样品、血液、口腔上皮细胞或粪便。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述Gp96受体的表达水平通过测量Gp96受体糖蛋白的量来测定。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述Gp96受体蛋白的量通过免疫学测试来测量，所述测试包括使所述生物样品与任选标记的特异性识别Gp96的抗Gp96抗体相接触，然后示出所形成的抗体-Gp96受体复合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样品为回肠或结肠活检样品，以及所述免疫学测试为免疫组织化学测试。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述Gp96受体的表达水平通过测量所述生物样品中Gp96mRNA的量来测定。

19.筛选用于预防或治疗炎性肠病的候选物质的体外方法，其包括：

(ii)测定所述物质特异性抑制所述Gp96受体与所述菌株之间相互作用的能力，并且选择和/或鉴定所述物质。