JP2012105662A - ヒトトール相同体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ヒトトールたんぱく質PRO285、PRO286またはPRO358をコードする新規DNAの同定および単離、およびこれらのたんぱく質の組換え生産方法と手段に関する。本発明は、またPRO285またはPRO286またはPRO358トールたんぱく質に特異的に結合する抗体に関する。
【選択図】なし
Description
胚背側−腹側パターンの確立に中心的な役割を演じる母性遺伝効果遺伝子であるショウジョウバエのトール遺伝子のクローニングは、Hashimotoら,Cell 52,269−279(1988)により報告されている。ショウジョウバエのトール遺伝子は803個のアミノ酸の細胞質外ドメインと269個のアミノ酸の細胞質ドメインを有する統合膜タンパク質をコードする。この細胞質外ドメインは膜にわたる潜在的なセグメントを有し、多くのトランスメンブレンタンパク質に見られる構造的モチーフであるロイシンに富むセグメントの複数のコピーを有する。トールタンパク質は、ショウジョウバエ胚の背側−腹側パターンを調節し、そのリガンドのスペッツルに結合する際に転写因子ドーサルを活性化するMorisato and Anderson,Cell 76,677−688(1994)。成熟したショウジョウバエにおいて、トール/ドーサルシグナル経路は抗微生物免疫応答に関与するLenaitreら,Cell 86,973−983(1996)。
そのようなベクターを有する宿主も提供される。例えば、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌または酵母であってよい。
さらに別の実施態様において、本発明は天然のPRO285、PRO286およびPRO358ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストに関する。特定の実施態様において、該アゴニストまたはアンタゴニストは抗PRO285、抗PRO286または抗PRO358抗体である。
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、PRO285、PRO286またはPRO358ポリペプチドに特異的に結合する抗体からなる組成物に関する。
ここで用いられる「PROポリペプチド」、「PRO286ポリペプチド」、「PRO285」および「PRO286」との用語は、(ここでさらに定義される)天然配列PRO285およびPRO286トールタンパク質および変異体を包含する。該PRO285およびPRO286ポリペプチドは、ヒト組織タイプ等の多様なソースまたは別のソースから単離してもよいし、組換えまたは合成方法により、またはこれらの技術や類似の技術の組合せにより調製してもよい。
ここで用いられる場合の「エピトープタグ」との用語は、FIZZポリペプチドを「タグポリペプチド」に融合させてなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、抗体が作られうるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合するポリペプチドの活性に干渉しないように短い残基を有する。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独自なものでなければならない。適するタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも6アミノ酸残基、通常は約8〜50アミノ酸残基(好ましくは、約10〜20アミノ酸残基)を有する。
「長期(chronic)」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって保持するように、急性の態様に対する連続的な形態での薬剤の投与を言う。
一つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与とは、同時投与および順番は問わない連続的な投与を含む。
A.全長PRO285、PRO286およびPRO358
本発明は、本出願でPRO285および8PRO286と称されるポリペプチドをコードする、新しく同定、単離された塩基配列を提供する。特に、出願人は下記の実施例でさらに詳細に開示されるPRO285およびPRO286ポリペプチドをコードするcDNAを同定し、単離した。BLASTおよびFastA配列アライメントコンピュータプログラムを用いて、出願人は、PRO285およびPRO286のコード配列が、GenBankデータベース中のDNA配列HSU88540_1、HSU88878_1、HSU88879_1、HSU88880_1およびHSU88881_1に対して高度に相同性のあることを発見した。
ここに記載された全長の天然配列PRO285、PRO286およびPRO358に加えて、これらの配列の変異体を調製できることが意図される。PRO285、PRO286およびPRO358変異体は、適当なヌクレオチド変化をPRO285、PRO286またはPRO358DNAに導入することにより、または所望の変異体ポリペプチドの合成により調製することができる。当業者は、PRO285、PRO286またはPRO358ポリペプチドの翻訳後プロセスを、例えばグリコシル化部位の数や位置を変えることにより、または膜固定特性を変更する等により変更できることを理解しよう。
(2)中性疎水性:システイン、セリン、スレオニン;
(3)酸性:アスパラギン酸、グルタミン酸;
(4)塩基性:アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン;
(5)鎖の配向に影響を与える残基:グリシン、プロリン;および(6)芳香性:トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
PRO285、PRO286およびPRO358ヒトトール相同体の共有結合による修飾が本発明の範囲に含まれる。一つの種類の共有修飾は、PRO285、PRO286およびPRO358タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはNまたはC末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることによる。二官能剤による誘導体化が、例えば、PRO285、PRO286またはPRO358を抗PRO285、抗PRO286または抗PRO358抗体の精製法に用いられる非水溶性の支持体マトリックスまたは表面に対して架橋させるか、またはその逆にマトリックスまたは表面を該タンパク質に架橋させるために有用である。
以下の説明は、主に、これらのタンパク質をコードする核酸(例えば、DNA40021、DNA42663およびDNA47361のそれぞれ)を有するベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトした細胞を培養することによるPRO285、PRO286およびPRO358トール相同体の生産に関する。勿論、当分野で当業界で公知である別法を用いてPRO285、PRO286、PRO358またはそれらの変異体を調製することも意図される。例えば、PRO285、PRO286またはPRO358配列、またはそれらの一部を、固相技術を用いる直接のペプチド合成により作ってもよい[例えば、Stewartら,Solid−Phase Peptide Synthesis,W.H.Freeman Co.,San Fransisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2154(1963)を参照されたい]。インビトロのタンパク質合成は手動による技術を用いて、または自動化により行ってもよい。自動化された合成は例えばApplied Biosystemsペプチド合成機(米国、カリフォルニア州、フォスター市)を製造業者の指示にしたがって用いて行ってもよい。PRO285、PRO286またはPRO358の多様な部分は個々に化学合成し、それらを化学的または酵素的合成法を用いて組み合わせて全長PRO285、PRO286またはPRO358を作ってもよい。
PRO285、PRO286またはPRO358をコードするDNAはPRO285、PRO286またはPRO358mRNAを有し、それを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製されたcDNAライブラリーから得てもよい。したがって、PRO285、PRO286またはPRO358DNAは、実施例に記載されるようにヒト組織から調製されたcDNAライブラリーから便利に得ることができる。内在する遺伝子は染色体ライブラリーから、またはオリゴヌクレオチド合成によって得てもよい。実施例に記載のライブラリーに加えて、本発明のヒトトールタンパク質をコードするDNAは例えば脾臓細胞または抹消血液白血球(PBL)から単離することができる。
ヒトトールタンパク質の生産のためにここに記載された発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換し、プロモータを誘導し、形質転換体を選択し、かつ所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改良された慣用の栄養培地で培養する。培地、温度、pH等の培養条件は当業者らにより過度な実験なしに選択することができる。通常、細胞培養物の生産性を最大化する原理、方法および実用的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach,M.Butler,編(IRLプレス、1991)および上記のSambrookらに見ることができる。
PRO285、PRO286またはPRO358をコードする核酸(例えばcDNAまたは染色体DNA)はクローニング(DNAの増幅)用または発現用の複製可能なベクターに挿入してよい。多様なベクターが一般に利用できる。例えば、ベクターはプラスミド、コスミド、ウイルス粒子またはファージの形であってよい。適当な核酸配列はベクターに多様な方法により挿入してよい。一般的に、DNAは公知の方法を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入させる。通常、ベクター成分としてはシグナル配列、複製開始部位、一種類以上のマーカー遺伝子、エンハンサエレメント、プロモータおよび転写終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらの成分を一つ以上を有する適当なベクターの構築は当業者に公知の標準的な連結技術を用いる。
試料中の遺伝子増幅および/または発現は、ここに提供される配列に基づく適当に標識されたプローブを用いて、例えば、mRNAの転写を定量する慣用のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング[Thomas,Proc.Natl.Acad Sci.USA,77:5201−5205(1980)]、ドットブロッティング(DNA合成)、またはin situハイブリダイゼーションにより直接測定してもよい。もしくは、特定の二本鎖、例えばDNA二本鎖、RNA二本鎖およびDNA−RNAハイブリッド二本鎖またはDNA−タンパク質二本鎖を認識できる抗体を用いてもよい。さらに、該抗体を標識してもよく、アッセイを行って二本鎖を表面に結合させ、該表面上での二本鎖の形成によって、二本鎖に結合した抗体の存在が検出できる。
PRO285、PRO286またはPRO358の形態は培養培地または宿主細胞溶解物から回収してよい。膜に結合している場合、適当な変性溶液(例えば、Triton−X100)または酵素による切断を用いて膜から放出させることができる。PRO285、PRO286またはPRO358の発現に用いられる細胞は、凍結/解凍の繰返し、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤等の多様な物理的または化学的手段により破壊することができる。
本発明のトールタンパク質をコードする塩基配列(またはそれらの相補物)は、ハイブリダイゼーションプローブとして、染色体および遺伝子地図作成において、およびアンチセンスRNAおよびDNAの生成における使用等、分子生物学の技術において多様な利用性を有する。トール核酸は、ここに記載の組換え技術によるPRO285、PRO286およびPRO358ポリペプチドの調製にも有用であろう。
ここでトールタンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて、該トールタンパク質をコードする遺伝子の地図作成および遺伝病を有する個人の遺伝的分析のためにハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。ここで提供されるヌクレオチド配列は、公知の技術、例えばin situハイブリダイゼーション、公知の染色体マーカーに対する連結分析およびライブラリーに対するハイブリダイゼーションスクリーニングを用いて染色体および染色体の特別な領域に対して地図を作成してよい。
トールタンパク質に関連してここで挙げた多様な利用は、天然トールレセプタの少なくとも一つの生物学的機能に似た、天然トールレセプタのアゴニストにも利用できる。
さらに、本発明は抗トールタンパク質抗体を提供する。例示的な抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二特異性およびヘテロ複合抗体が挙げられる。
抗トールタンパク質抗体はポリクローナル抗体からなってもよい。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者で公知である。ポリクローナル抗体は、例えば免疫剤および所望であればアジュバントの一回以上の注射により哺乳類中に生じさせることができる。典型的には、免疫剤および/またはアジュバントを複数回の皮下または腹腔内注射により哺乳類に注射する。免疫剤はPRO285およびPRO286ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含有してよい。免疫剤を、免疫される哺乳動物で免疫原性のあることが公知のタンパク質に複合させることが有用であろう。そのような免疫原性タンパク質の具体例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロビンおよび大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。使用できるアジュバントの具体例としてはフロイントの完全アジュバントおよびMPL−TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)が挙げられる。免疫法は当業者によって過度な実験なしに選択できよう。
もしくは、抗トールタンパク質抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、KohlerとMilstein,Nature,256:495(1975)によって記載されたようなハイブリドーマ法を用いて調製してよい。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を典型的には免疫剤で免疫して、該免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、もしくは産生することのできるリンパ球を誘引する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫しうる。
インビトロ方法も一価抗体の調製に適する。抗体を消化し、その断片、特にFab断片を作るのは日常的な公知の方法を用いて行うことができる。
本発明の抗トール抗体はさらにヒト化抗体またはヒト抗体からなってよい。非ヒト(例えば、ネズミ)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を有するキメラ免系グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはその断片(例えば、抗体のFv、Fab、Fab’、F(ab’)2または他の抗原結合副配列)である。ヒト化抗体としては、受容者の相補性決定部位(CDR)の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギ等の非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(受容者抗体)が挙げられる。ある場合では、ヒト免疫グロブリンのFv枠残基が対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体は、受容者抗体にも移入CDRにも枠配列にも見られない残基からなってもよい。一般的に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものと対応し、すべてまたは実質的にすべてのFR領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも一つまたは二つの実質的にすべての可変ドメインからなるだろう。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常部(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの該領域からなってもよいであろう[Jonesら,Nature,321:522−525(1986);Reichmannら,Nature,332:323−329(1988);およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596(1992)]。
二特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはPRO285、PRO286またはPRO358タンパク質に対するものであり、別のものは他の抗原に対するもので、好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプタまたはレセプタサブユニットに対するものである。二つの異なるトール様タンパク質、例えば本出願で開示されたトール相同体のいずれか二つ、またはここに開示されたトールタンパク質、および公知のトールタンパク質、例えばTLR2に対して特異性を有する二特異性抗体を調製することも可能である。そのような二特異性抗体はトールレセプタによる異なる病原体パターンの認識をブロックすることができるために、敗血症または敗血症性ショックの治療に顕著な利点を有することが期待される。
ヘテロ複合抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は二つの共有結合した抗体からなる。例えば、そのような抗体は免疫系細胞の標的を不要な細胞に向けさせるために[米国特許第4,676,980号]、およびHIV感染の治療のために[WO91/00360;WO92/200373;EP03089]報告されている。該抗体は、合成タンパク質化学の公知の方法、例えば架橋剤をともなう方法を用いてインビトロで調製してよい。例えば、免疫毒素はジスルフィド交換反応を用いるか、またはチオエーテル結合を形成することにより構築してよい。この目的に適する試薬の具体例としてはイミノチオレートおよびメチル−4−メルカプトブチリミデートおよび米国特許第4,676,980号に開示のものが挙げられる。
本発明の抗トール抗体は多様な有用性を有する。例えば、抗PRO285、抗PRO286、抗PRO358および抗TLR2抗体は、PRO285、PRO286、PRO358またはTLR2に関して、例えば特定細胞、組織または血清中でのその発現を検出する診断アッセイに用いることができる。不均一相または均一相のいずれかで行われる競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈殿アッセイ等の公知の多様な診断アッセイ技術を用いてよい[Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)pp.147−158]。診断アッセイで用いられる抗体は検出可能な部分で標識してよい。検出可能な部分とは直接的または間接的に検出可能なシグナルを作ることのできるものでなければならない。例えば、検出可能な部分とは、放射性同位元素、例えば3H、14C、32P、35Sまたは125I、蛍光または化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン、または酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビパーオキシダーゼであってよい。Hunterら,Nature,144:945(1962)、Davidら,Biotechnology,13:1014(1974)、Painら,J.Immunol.Meth.40:219(1981)およびNygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)により記載された公知のいずれかの方法により抗体を該検出可能な部分に複合化させてよい。
抗トールレセプタ抗体と関連して挙げた上記の治療および診断利用も他のトールアンタゴニスト、すなわち、トールレセプタ活性化および/またはトールレセプタにより仲介されるシグナル変換をブロックする他の分子(タンパク質、ペプチド、小有機分子等)に対しても適用することができる。
ここでの治療組成物は、滅菌アクセス孔を有する容器、例えば、皮下注射針で穴が開けられるストッパーを有する静脈内溶液バックまたはバイアルに入れる。
投与経路は、例えば注射または静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内または病変内の経路、局所投与、または徐放システム等の公知の方法にしたがう。
本発明の明細書で引用されるすべての特許および文献の参照は、その全てが参照としてここに取り込まれる。
ヒトPRO285をコードするcDNAクローンの単離
私有の発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(商標)、Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を検索し、ショウジョウバエ トールたんぱく質に相同性を示すEST(#2243209)を同定した。 ESTに基づき、PCRプライマーのペア(フォワードおよびリバース)
TAAAGACCCAGCTGTGACCG(配列番号5)
ATCCATGAGCCTCTGATGGG(配列番号6)
と、プローブ
ATTTATGTCTCGAGGAAAGGGACTGGTTACCAGGGCAGCCAGTTC(配列番号7)
を合成した。
ヒトPRO286をコードするcDNAクローンの単離
所有されている発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(商標)、Incyte Pharmaceutical,Palo Alto,CA)を検索し、ショウジョウバエ トールたんぱく質に相同性を示すEST(#694401)を同定した。 ESTに基づき、PCRプライマーのペア(フォワードおよびリバース)
GCCGAGACAAAAACGTTCTCC(配列番号8)
CATCCATGTTCTCATCCATTAGCC(配列番号9)
と、プローブ
TCGACAACCTCATGCAGAGCATCAACCAAAGCAAGAAAACAGTATT(配列番号10)
を合成した。
このRNAは、Life Technologies,Gaithersburg,MD(Super Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターpRK5D中にオリゴdTプライム化cDNAを生成させるために用いた。pRK5Dはsp6転写開始部位、それに続くSfiI制源酵素部位、さらにそれに続くXhoI/NotI cDNAクローニング部位を有するクローニングベクターである。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTにより開始し(prime)、ブラントでSalIヘミキナーゼ化(hemikinased)アダプターに連結し、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおおよそ1000bpを超えるサイズを合わせ、定められた方向でXhoI/NotI開裂pRK5Dにクローン化した。
クローンDNA42663は、ATCCに寄託され(表示DNA42663-1154)、ATCC寄託番号ATCC209386が付与されている。
ヒトトール受容体ファミリーの既知のメンバーからの細胞外ドメイン(ECD)配列(存在する場合、分泌シグナル配列を含む)をESTデータベースの検索に用いた。ESTデータベースはパブリックデータべース(例えば、GenBank)、および所有されているデータベース(例えばLIFESEQ(商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA)を含んでいた。検索は、コンピュータープログラムBLASTまたはBLAST2(Altschul、およびGish、Methods in Enzymology 266:460-80(1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDたんぱく質配列の比較として行なわれた。既知のたんぱく質をコードしていない70(あるいは、あるケースでは90)以上のBlastスコアとのそれらの比較を、プログラム”pharap”を用いて、コンセンサスDNA配列に集めて組み立てた。(Phil Green、ワシントン大学、シアトル、ワシントン)。
そのEST配列に基づき、PCRにより対象の配列を含むcDNAライブラリーを同定し、PRO358の全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
プローブも合成した:
AAAAAGCATACTTGGAATGGCCCAAGGATAGGTGTAAATG(配列番号17)
同定されたクローン(DNA47361)の全ヌクレオチド配列を、図21〜22(配列番号14)に示す。クローンDNA47361は、図21と22の下線のヌクレオチド位置に明らかな翻訳開始部位(ATG開始シグナル)を有するシングルオペロンリーディングフレームを含む(図2と3)。予想されるポリペプチド前駆体は、811アミノ酸の長さであり、推定シグナルペプチド(アミノ酸1-19)、細胞外ドメイン(アミノ酸20-575、位置55から位置575までの領域のロイシンリッチ反復を含む)、推定膜間ドメイン(アミノ酸576-595)を含む。クローンDNA47361は、ATCCに寄託され(表示DNA47361-1249)、ATCC寄託番号ATCC209431が付与されている。
PRO285、PRO286およびPRO358DNAの、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用。
以下の方法は、PRO285、PRO286またはPRO358ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載している。
トール相同体のコード配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同性DNA(例えばこれらの特定のトールたんぱく質の天然由来の変異体をコードするもの)をスクリーニングするためのプローブとして用いることができる。
大腸菌(E.coli)内でのPRO285、PRO286およびPRO358の発現
この実施例は、大腸菌内での組換発現による、PRO285、PRO286またはPRO358(”トール相同体”)の非グリコシル化形態での調製を例示するものである。
トール相同体をコードするDNA配列をまず、選択したPCRプリマーを使用して増幅させる。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含む必要がある。種々の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、pBR322(大腸菌由来;Bolivarら、Gene, 2:95(1977)を参照)であって、アンピシリン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子を含むものである。ベクターは、制限酵素で消化して脱リン酸化する。PCRで増幅した配列を次いでベクターへ連結する。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhis配列、及びエンテロキナーゼ開裂部位を含む)、PRO285コード領域、ラムダ転写終了符号、及びargU遺伝子をコードする配列を含むであろう。
ほ乳類細胞におけるPRO285、PRO286およびPRO358の発現
本実施例は、ほ乳類細胞内での組換え発現による、PRO285、PRO286およびPRO358(“トール相同体”)のグリコシル化された形態での調製を例示するものである。
酵母中でのPRO285、PRO286およびPRO358の発現
以下の方法は、酵母内での、PRO285、PRO286またはPRO358(”トール相同体”)の組換発現を記載したものである。
まず、酵母発現ベクターを、ADH2/GAPDHプロモーターから、トール相同体を細胞内生産又は分泌させるために構築する。所望のトール相同体をコードするDNA、選択したシグナルペプチド、及びプロモーターを選択したプラスミド中の適切な制限酵素部位に挿入して、細胞内発現をさせる。分泌用には、選択したトール相同体をコードするDNAを選択したプラスミドへ、ADH2/GAPDHプロモーター、酵母アルファ因子分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)発現用のリンカー配列とともにクローニングすることができる。
バキュロウイルス感染昆虫細胞内におけるPRO285、PRO286およびPRO358の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPRO285、PRO286またはPRO358(”トール相同体”)の組換発現を記載している。
トール相同体コード配列を、バキュロウイルス発現ベクターで含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエイトープタグには、ポリ−hisタグや(IgGのFc領域のような)免疫グロブリンタグがある。種々のプラスミドを使用することができるが、これには商業的に入手可能なプラスミド、例えばpVL1393(Novagen)などに由来するものがある。簡潔にいうと、トール相同体コード配列またはコード配列の所望の部分(例えば細胞外ドメインをコードする配列等)を5’及び3’領域に相補的なプライマーでPCRにより増幅させる。5’プライマーは、フランキング(選択した)制限酵素部位を含むことができる。その産物を次いで、それらの選択した制限酵素で消化し、発現ベクター中へサブクローニングする。
NF-κBアッセイ NF-κB経路を介したトールたんぱく質シグナルとして、それらの生理活性は、NF-κBアッセイでテストすることができる。このアッセイにおいて、Jurkat細胞は、製造者の指示に従って、Lipofectamine試薬(Gibco BRL)を用いて一過性形質導入される。NF-κB駆動ルシフェラーゼ遺伝子を含む、1μgのpB2XLucプラスミドを、PRO285またはPRO286をコードする挿入を有するあるいは有していない、1μgのpSRαN発現ベクターを用いて構築する。陽性対照として、細胞はPMA(酢酸フォルボールミリスチル;20ng/ml)とPHA(フィトヘマグルチニン(phytohaemaglutinin))を用いて、3から4時間処理される。細胞は、Promegaからの試薬を用いてルシフェラーゼ活性の測定のために2から3日後に溶解させる。
PRO285、PRO286またはPRO358に結合する抗体の調製
この実施例は、PRO285、PRO286またはPRO358(”トール相同体”)に特異的に結合することができるモノクローナル抗体の調製を例証する。
モノクローナル抗体を生産する技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Goding(上掲)に記載されている。用いられる免疫原は、精製されたトール相同体、トール相同体を含む融合タンパク、および細胞表面に組み換えトール相同体を発現するトール相同体を含む。免疫原の選択は、過度の実験を要することなく当業者によって実施されることができる。
陽性ハイブリドーマ細胞は、抗トール相同体モノクローナル抗体を含む腹水を産生するために同系のBalb/cマウスに腹膜内接種されてもよい。あるいは、このハイブリドーマ細胞は、組織培養フラスコまたはローラーボトルで生育することもできる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫安沈殿、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて実施することができる。あるいは、プロテインAまたはプロテインGに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。
HuTLR2は、リポ多糖(LPS)誘導細胞シグナルの媒体となる。
方法試薬 [3H]標識化、非標識化、LCD25およびS.minnesotaR595LPSは、List Biochemicals(キャンベル、CA)から、および他のすべてのLPSはSigma Chemical Co.(セントルイス、MO)から得た。LPは、ヒトLBP発現ベクターでトランスフェクトされた293細胞からの条件付培地として供給された。TLR2-Fc融合たんぱく質は、バキュロウィルス系で生産し、上述したように精製した。Markら,J.Biol.Chem 269,10720-10728(1994)。
Δ2:5'-TAA GCT TAA CG-3'(配列番号20)および 5'-GGC CGC TTA AGC TTA TGC A-3'(配列番号21)
を含んでいた。
29332の親または安定な細胞(ウェル当たり2×105細胞)を6ウェルプレート中にシードし、後日、0.5μgのルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3-ELAM.tkと内部コントロールとして0.05μgのRenillaルシフェラーゼレポート化ベクターと共に発現プラスミドで形質導入した。24時間後、細胞はLPS、LBP、またはLPSとLBPの両方で処理し、レポーター遺伝子活性を測定した。データを、蛍光ルシフェラーゼ活性をRenilla Luciferaseのそれで除した相対ルシフェラーゼ活性として示す。EMSAとしては、核抽出物を調製し、コンセンサスNF-κB結合部位を含む5’-[32P]-放射標識化オリゴヌクレオチドとのDNA-結合反応に用いた(Santa Cruz Biotechnology,sc-2511)。複合体中のNF-κBの同定は、NF-κBに対する抗体によるスーパーシフトにより確かめた(データは示さず)。
組織ノザンブロットは、Clontechより購入し、TLR2の細胞外ドメインを囲むプローブにハイブリダイズさせた。ポリアデニル化mRNAを293細胞または293−TLR2細胞より単離し、ノザンブロットをヒトIL-8 cDNAフラグメントでプローブさせた。TLR2発現を、定量的PCRで、実質的に に記載されているリアルタイム”taqman(商標)”技術を用いて測定し、モデル770配列検出器(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で、実質的に(Luohら、J.Mol.Endocrinol.18,77―85[1997])に記載されているように分析した。
5'-GAT CCC AAC TAG ACA AAG ACT GGT C-3'(配列番号25)
を、レポーター染色FAMで5’ヌクレオチドを、消光(quenching)染色TAMRAで3’ヌクレオチドを標識したハイブリダイゼーションプローブ5'-TGA GAG CTG CGA TAA AGT CCT AGG TTC CCA TAT-3'(配列番号26)
と共に用いた。
マクロファージ/単球を1μg/mlのLPSで16時間処理した。
ショウジョウバエで、トール受容体は、胚芽の背腹方向の(dorso-vental)パターン形成に必要であり、成ハエ(adult fly)での抗真菌免疫反応にも関与する。BelvinおよびAnderson,Ann.Rev.Cell.Biol.12,393-416(1996);Lemaitreら、Cell 86,973-983(1996)。トールは、多重ロイシンリッチ反復(LRRs)を有する細胞外ドメインと、インターロイキン1受容体(IL-1R)に配列相同性を有するサイトプラスマドメインを含むタイプIの膜間たんぱく質であり、いくつかの植物病耐性たんぱく質である。トールの活性化は、NF-κB経路の活性化を通して遺伝子の誘導を引き起こす。前述の通り、クローン化されたいくつかのヒト相同体があり、それらのいくつかは、本出願中に新規たんぱく質として開示されている。これらのヒトたんぱく質は、それらのショウジョウバエ複製(counterpart)の局所的構造を反映している。1つのヒトTLR(TLR4)の構成的活性変異体の過剰発現が、NF-κBの活性化と、炎症性サイトカインとコンスティミュラトリー(constimulatory)分子の誘導をもたらすことが示されている(Medzhitovら、およびRockら、上述)。
in situハイブリダイゼーション in situハイブリダイゼーションは、細胞または組織調製物内における核酸配列の検出および位置決定のための強力かつ用途の広い技術である。例えば、遺伝子発現部位を同定するため、転写の組織分布を分析するため、ウイルス感染を同定および位置決定するため、特異的なmRNA合成の変化を追求するため、並びに染色体地図作製を支援するために使用できる。
2.0μl NTP混合物(2.5mM:10μ;それぞれ10mMのGTP、CTP&ATP+10μl H2O)
1.0μl UTP(50μM)
1.0μl Rnasin 1.0μl DNA鋳型(1μg)
1.0μl H2O 1.0μl RNAポリメラーゼ(通常、PCR産物T3=AS、T7=S)
このスライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムのトレイに移し、室温で5分間解凍した。このトレイを、凝縮を下げるために、5分間55℃のインキュベーターに置いた。このスライドをフュームフードにおいて氷上で4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、0.5xSSCで5分間、室温で洗浄した(25ml 20xSSC+975ml SQH2O)。10分間37℃で0.5μg/mlのプロテイナーゼK中で脱タンパクした後(250mlの予め温められたRNアーゼを含まないRNAバッファー中の10mg/mlストックの12.5μl)、この切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。この切片を70%、95%、100%のエタノール、2分間でそれぞれ脱水した。
このスライドを脱パラフィン化し、SQ H2Oに移し、2xSSC、室温、5分間でそれぞれ二回洗浄した。この切片を、20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNアーゼを含まないRNアーゼバッファー中の10mg/mlの500μl;37℃、15分)−ヒト胎芽、あるいは、8xのプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中の100μl;37℃、30分)−ホルマリン組織において脱タンパク化した。次いで、上述したように0.5xSSCですすぎ、脱水を行った。
このスライドを、Boxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和フィルターペーパーを備えたプラスチックボックスに配置した。この組織を50μlのハイブリダイゼーションバッファー(3.75g デキストランスルファート+6mlSQ H2O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを緩めて2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSCおよび9mlのSQ H2Oを添加し、組織をよくボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。
スライド当たり、1.0x106cpmプローブと1.0μltRNA(50mg/mlストック)を3分間95℃で加熱した。このスライドを氷冷し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスした後、50μlの33P混合物を、スライドの50μlのプレハイブリダイゼーションに添加した。このスライドを55℃で一晩インキュベートした。
洗浄を2x10分間、2xSSC、EDTAを用いて室温で行い(400ml 20xSSC+16ml 0.25M EDTA、Vf=4L)、その後に37℃で30分間RNアーゼA処理した(250mlのRNアーゼバッファー中の10mg/mlの500μl=20μg/ml)。このスライドを2x10分間、2xSSC、EDTAを用いて室温で洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は、55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20ml 20xSSC+16ml EDTA、Vf=4L)であった。
ヒト成人および胎児組織でのPRO285(DNA40021)の発現パターンを調べた。全長DNA40021配列に基づき合成した以下のプローブを用いた:オリゴ1:GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAA CTC TGC CCT GTG ATG TCA(配列番号27)オリゴ2:CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA ACG AGG GCA ATT TCC ACT TAG (配列番号28)
ヒト成人および胎児組織でのPRO358(DNA47361)の発現パターンを調べた。全長DNA47361配列に基づき合成した以下のプローブを用いた:オリゴ1:GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG CAA TAA ACT GGA GAC ACT (配列番号29)オリゴ2:CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TTG AGT TGT TCT TGG GTT GTT(配列番号30)
以下の材料は、American Type Culture Collection, 2301 Parklawn Drive, Rockville, MD,USA (ATCC)に寄託されている。
材料 ATCC寄託番号 寄託日DNA40021-1154 209389 1997年10月17日(PRO285をコードしている)
DNA42663-1154 209386 1997年10月17日(PRO286をコードしている)
DNA47361-1249 209431 1997年11月7日
Claims (21)
- (a)配列番号13のアミノ酸残基1から811からなり、かつNF−κBの活性化を誘導する能力を有するPRO358ポリペプチドをコードするDNA分子、または上記DNA分子の相補体;あるいは、
(b)配列番号14のヒトトール蛋白質cDNAによりコードされ、かつNF−κBの活性化を誘導する能力を有する同じポリペプチドをコードするDNA分子、または上記DNA分子の相補体;
を含む、単離された核酸分子。 - 配列番号13のアミノ酸残基1から575及び596から811からなるPRO358ポリペプチドをコードするDNAを含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 上記DNAが配列番号14のヌクレオチド位置111から始まり、ヌクレオチド位置2544で終結するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、請求項1記載の核酸分子。
- 請求項1から3のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
- 上記ベクターで形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に操作可能に結合された、請求項4記載のベクター。
- 請求項4または5記載のベクターを含む宿主細胞。
- 上記細胞がCHO細胞である、請求項6記載の宿主細胞。
- 上記細胞が大腸菌である、請求項6記載の宿主細胞。
- 上記細胞が酵母細胞である、請求項6記載の宿主細胞。
- 請求項6から9のいずれか一項記載の宿主細胞を、請求項1から3のいずれか一項記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、上記ポリペプチドを回収することを含むトールポリペプチドの製造方法。
- 配列番号13で示されるアミノ酸配列における一もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入によって得られるアミノ酸からなり、かつNF−κBの活性化を誘導する能力を有する、単離されたポリペプチド。
- 配列番号13のアミノ酸残基1から811からなる、請求項11記載のポリペプチド。
- 配列番号13のアミノ酸残基20から811からなる、請求項11記載のポリペプチド。
- 配列番号13のアミノ酸残基20から575からなる、請求項11記載のポリペプチド。
- 配列番号13のアミノ酸残基1から575及び596から811からなる、請求項11記載のポリペプチド。
- 配列番号14のヌクレオチド位置111から始まるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項11記載のポリペプチド。
- ヘテロなアミノ酸配列に融合している、請求項11から16のいずれか一項記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
- 上記ヘテロなアミノ酸配列がエピトープタグ配列である、請求項17記載のキメラ分子。
- 上記ヘテロなアミノ酸配列が免疫グロブリンのFc領域である、請求項17記載のキメラ分子。
- 配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 上記抗体がモノクローナル抗体である、請求項20記載の抗体。
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