ES2298905T3 - Homologos de tipo toll humanos. - Google Patents

Abstract

Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con: (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO358 que tiene los residuos de aminoácidos de 20 a 811 de la figura 8 (SEC ID N.º:13) en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-kappaB, o el complemento de la molécula de ADN; o (b) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana de tipo Toll en el n.º de depósito ATCC 209431 (ADN47361-1249), en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NFKB, o el complemento de la molécula de ADN.

Description

Homólogos de tipo Toll humanos.

La presente invención se refiere generalmente a la identificación y aislamiento de nuevos ADN, designados en la presente como y ADN47361, y a la producción recombinante de nuevos homólogos de tipo Toll humanos (designados como PRO358) codificados por dichos ADN.

Antecedentes de la invención

Las proteínas y receptores unidos a la membrana pueden desempeñar un papel importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos pluricelulares. El destino de muchas de las distintas células, por ejemplo proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, habitualmente es controlado por información recibida de otras células y/o el entorno inmediato. Esta información a menudo es transmitida por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana. Entre tales proteínas y receptores celulares unidos a la membrana se incluyen, pero no exclusivamente, receptores de citocinas, receptores quinasas, receptores fosfatasas, receptores implicados en interacciones célula-célula y moléculas de adhesina celular como las selectinas y las integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular es regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosinquinasas, enzimas que catalizan aquel proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Entre los ejemplos se incluyen el receptor del factor de crecimiento del fibroblasto y el receptor del factor de crecimiento nervioso.

Las proteínas y las moléculas receptoras unidas a la membrana tienen varias aplicaciones industriales, entre las que se incluyen de agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las inmunoadhesinas de receptores, por ejemplo, pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor-ligando. Las proteínas unidas a la membrana también pueden utilizarse para el cribado de posibles péptidos o inhibidores de molécula pequeña de la interacción relevante receptor/ligando.

Tanto la industria como el mundo universitario están llevando a cabo esfuerzos para identificar nuevas proteínas receptoras nativas. Muchos de estos esfuerzos se concentran en el cribado de genotecas de ADN recombinante para identificar las secuencias que codifican nuevas proteínas receptoras.

Hashimoto y otros, Cell 52, 289-279 (1988), describieron la clonación del gen Toll de Drosophila, un gen de efecto materno que desempeña un papel fundamental en el establecimiento del patrón embrionario dorsal-ventral. El gen Toll de Drosophila codifica una proteína incorporada en la membrana con un dominio extracitoplasmático de 803 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 269 aminoácidos. El dominio extracitoplasmático tiene un posible segmento que abarca la membrana y contiene múltiples copias de un segmento rico en leucina, un motivo estructural hallado en muchas proteínas transmembrana. La proteína Toll controla el modelado dorsal-ventral en embriones de Drosophila y activa el factor de transcripción Dorsal en la unión con su ligando Spätzle. (Morisato y Anderson, Cell 76, 677-688 (1994).) En adultos de Drosophila, la vía de señalación Toll/Dorsal participa en la respuesta inmunitaria antifúngica. (Lenaitre y otros, Cell 86, 973-983 (1996).)

Medzhitov y otros, Nature 388, 894-897 (1997), describieron un homólogo humano de la proteína Toll de Drosophila. Este Toll humano, al igual que el Toll de Drosophila, es una proteína transmembrana de tipo I, con un dominio extracelular que consiste en 21 motivos ricos en leucina repetidos en tándem (región rica en leucina, LRR), separados por una región no LRR, y un dominio citoplasmático homólogo al dominio citoplasmático del receptor humano de la interleucina 1 (IL-1). Se observó que un mutante esencialmente activo del Toll humano transfectado en estirpes celulares humanas era capaz de inducir la activación del NF-\kappaB y la expresión de genes controlados por NF-\kappaB para las citocinas inflamatorias IL-1, IL-6 e IL-8, así como la expresión de la molécula coestimuladora B7.1, que es necesaria para la activación de células T nativas. Se ha sugerido que Toll actúa en vertebrados como un receptor no clónico del sistema inmunitario, que puede inducir señales para activar tanto una respuesta inmunitaria innata como adaptativa en vertebrados. El gen Toll humano descrito por Medzhitov y otros, supra, se expresaba con mayor fuerza en el bazo y los leucocitos de sangre periférica (PBL), y los autores sugirieron que su expresión en otros tejidos puede ser debida a la presencia de macrófagos y células dendríticas, en las que podría actuar como sistema de primer aviso de infección. La base de datos pública Genbank contiene las siguientes secuencias Toll: Toll1 (ADNX n.º HSU88640.1, que es idéntico al ADNc n.º HUMRSC786-1 aleatorio secuenciado en toda su longitud); Toll2 (ADNX n.º HSU88878-1); Toll3 (ADNX n.º HSUB8879-1); y Toll4 (ADNX n.º HSU88880-1, que es idéntico a la secuencia de ADN descrita por Medzhitov y otros, supra). Una secuencia Toll parcial (Toll5) se halla disponible en GenBank bajo ADNX n.º HSU88881.1.

Recientemente se han clonado otros homólogos humanos de la proteína Toll de Drosophila, designados como receptores de tipo Toll (huTLRs1-5), y se ha observado que reflejan la estructura topográfica del homólogo de Drosophila (Rock y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-598 [1998]). La sobreexpresión de un mutante esencialmente activo de un TLR humano (homólogo de proteína Toll. Medzhitov y otros, supra; TLR4-Rock y otros, supra) conduce a la activación de NF-\kappaB y a la inducción de las citocinas inflamatorias y las moléculas coestimuladoras. Medzhitov y otros, supra.

Descripción resumida de la invención

Los solicitantes han identificado tres nuevos clones de ADNc que codifican nuevos polipéptidos Toll humanos, designados en la presente solicitud como PRO285 (codificado por ADN40021), PRO286 (codificado por ADN42668) y PRO358 (codificado por ADN47361).

En una realización, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un ADN que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con: (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO358 que tiene los aminoácidos 20 a 811 de la figura 12A-B (SEC ID N.º:13), o el complemento de la molécula de ADN. La molécula de ADN complementario preferiblemente permanece unida de manera estable a tal secuencia codificante de ácidos nucleicos por lo menos en condiciones moderadas y, opcionalmente, en condiciones muy restrictivas.

En otra realización, la molécula aislada de ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de 1 a 611 de la figura 12A-B (SEC ID N.º: 13), o el complemento de la molécula de ADN.

En una realización específica, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que codifica polipéptidos PRO358 nativos o variantes, con o sin la secuencia de señal aminoterminal, y con o sin las regiones transmembrana de las secuencias respectivas en toda su longitud. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN que codifica un polipéptido maduro PRO358 nativo en toda su longitud que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 811 de la figura 12A-B (SEC ID N.º: 13), o es complementario a tal secuencia codificante de ácidos nucleicos. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que codifica un polipéptido PRO358 nativo sin una secuencia señal aminoterminal, o es complementaria a tal secuencia codificante de ácidos nucleicos. Y aun en otra realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica formas en las que se ha inactivado o eliminado el dominio transmembrana de las proteínas PRO358 nativas en toda su longitud.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO358 que comprende ADN que hibrida el complemento del ácido nucleico entre los residuos 111 y 2.544 de las figuras 13A-B (SEC ID N.º: 14). Preferiblemente, la hibridación tiene lugar bajo condiciones estrictas de hibridación y lavado.

En otra realización, la molécula aislada de ácido nucleico de la invención comprende el clon (ADN 47361-1249) depositado el 7 de noviembre de 1997, bajo el número ATCC 209431.

Y aun en otra realización, la presente invención proporciona un vector que comprende ADN que codifica polipéptidos PRO358, o sus variantes, tal como se establece en las reivindicaciones. De este modo, el vector puede comprender cualquiera de las moléculas aisladas de ácido nucleico definidas de aquí en adelante.

En una realización específica, la presente invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos 20 a 811 de la figura 12A-B (SEC ID N.º:13), o el complemento de tal polinucleótido. En una realización particular, el vector comprende ADN que codifica el nuevo homólogo Toll (PRO358), con o sin la secuencia señal aminoterminal (aproximadamente aminoácidos 1 a 19), o una variante en la que se ha eliminado o inactivado el dominio transmembrana (aproximadamente aminoácidos 576-595) del mismo, o el dominio extracelular (aproximadamente aminoácidos 20 a 595) de la proteína madura, o una proteína que comprende cualquiera de estas secuencias. También se proporciona una célula huésped que comprende tal vector.

También se proporciona una célula huésped que comprende tal vector. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO. de E. coli o levaduras.

Además, se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos PRO358 y éste comprende el cultivo de células huésped en condiciones adecuadas para la expresión del PRO358 y la recuperación del PRO358 a partir del cultivo celular.

En otra realización, la presente invención proporciona polipéptidos PRO358 aislados. La presente invención proporciona un polipéptido PRO358 aislado de secuencia nativa, o variantes del mismo. En particular, la presente invención proporciona un polipéptido PRO358 aislado de secuencia nativa, que en determinadas realizaciones incluye la secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 20 a 575, o 20 a 811, o 1 a 811 de las figuras 12A-B (SEC ID N.º: 18).

En otra realización, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden polipéptidos PRO358 fusionados con un polipéptido heterólogo o con una secuencia de aminoácidos. Un ejemplo de tal molécula quimérica comprende un polipéptido PRO358 fusionado con una secuencia etiqueta con epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina. Un ejemplo de tal molécula quimérica comprende un polipéptido PRO358 (que incluye su péptido señal y/o variantes con dominio transmembrana eliminado y, opcionalmente, variantes con dominio intracelular eliminado) fusionado con una secuencia etiqueta con epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina. En una realización preferida, la fusión contiene el dominio extracelular del PRO358 fusionado a una región constante de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos los dominios CH2 y CH3.

En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a polipéptidos PRO358. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. La presente invención incluye específicamente anticuerpos con especificidades dobles, por ejemplo anticuerpos biespecíficos que se unen a más de un polipéptido Toll.

La presente invención se refeiere además a una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido PRO358, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, y a los usos médicos de tales anticuerpos, en particular para tratar el choque septicémico.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el patrón de expresión del receptor Toll humano 2 (huTLR2) (Rock y otros, supra). a. Análisis mediante método Northern de múltiples tejidos inmunitarios humanos explorados con una sonda TLR2. PBL, leucocitos de sangre periférica. b. Expresión enriquecida de TLR2 en macrófagos y aumento transcripcional de TLR2 en respuesta a LPS. Se utilizó RTPCR cuantitativa para determinar la expresión relativa de TLR2 en PBL, células T, macrófagos (M\Phi) y macrófagos estimulados con LPS (M\Phi+LPS).

Figura 2. El TLR2 interviene en la señalación inducida por LPS. a. células 298 que expresan de manera estable TLR2 y adquieren sensibilidad a LPS. Población de clones estables que expresan gD.TLR2 (población 1 299-TLR2) o un solo clon de células que expresan gD.TLR2 (clon 1 298-TLR2) o células control (293-MSCV) que fueron transfectadas de manera estable con el vector de expresión únicamente fueron transfectadas transitoriamente con pGL3.ELAM.tk y a continuación estimuladas con 1 \mug/ml de potenciador 055:B5 durante 6 horas o sin LBP en un medio sin suero. La activación del potenciador ELAM se cuantificó tal como se describe en los Ejemplos. Los resultados se obtuvieron de dos experimentos independientes. No se observó estimulación utilizando el plásmido indicador de control que carecía del potenciador ELAM (datos no representados). La expresión del plásmido indicador fue equivalente en células sin tratar y en células tratadas únicamente con LBP (datos no representados). b. Análisis de inmunotransferencia que muestra la expresión de TLR2 etiquetado con epítopo en células 293. c. Evolución en el tiempo de activación inducida por LPS dependiente de TLR2 y translocación de NF-xB. Los extractos nucleares se prepararon a partir de células tratadas con LPS 055:B5 (10 \mug/ml) y LBP durante los tiempos indicados (arriba), o de células pretratadas con cicloheximida (CHX) 1 \muM durante una hora y a continuación estimuladas con 1 \mug/ml de LPS durante una hora en presencia de LBP en un medio sin suero (abajo). d. Efecto de mCD14 sobre la activación NF-\kappaB de TLR2. El vector de control (193-MSCV) o las células de la población 1 (293-TLR2) fueron transfectados con el plásmido indicador, y el vector de expresión CD14 (+mCD14) o vector de control (-mCD14), respectivamente. Al cabo de 24 horas, las células transfectadas fueron estimuladas con LPS 055:B5 durante 6 horas en presencia de LBP en un medio sin suero. Los datos presentados son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 3. Función del dominio del TLR2 en la señalación. a. Ilustraciones de varios constructos TLR2. El TLR2-WT, la forma etiquetada con epítopo del TLR2 en toda su longitud, el TLR2-\Delta1 y el TLR2-\Delta2 representan un truncamiento de 18 o 141 aminoácidos en el extremo carboxílico, respectivamente. CD4-TLR2, híbrido humano CD4-TLR2 que sustituye el dominio extracelular del TLR2 con los aminoácidos 1-205 de un CD4 humano. ECD, dominio extracelular; TM, región transmembrana; ICD, dominio intracelular. b. Residuos del extremo carboxiterminal muy importantes para la transducción de señal de IL-IR y TLR2. Los números de los residuos se muestran a la derecha de cada proteína. La flecha indica la posición del truncamiento TLR2-\Delta1. *, residuos esenciales para la señalación IL-IR (Heguy y otros, J. Biol. Chem. 267, 2.605-2.609 [1992]; Croston y otros, J. Biol. Chem. 270, 16.514-16.517 [1995])1 I, aminoácido idéntico; cambios conservadores. c. Variantes TLR-R2 incapaces de inducir NF-\kappaB en respuesta a LPS y LBP. Las células 293 fueron transfectadas transitoriamente con pGL3.ELAM.tk y vectores de expresión que codifican TLR2 o variantes TLR2 en toda su longitud tal como se indica. Las células también fueron transfectadas con un plásmido de expresión CD14 (+mCD14) o con un plásmido de control (-mCD14). La expresión igual de cada proteína se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-gD o CD4 (abajo). El análisis con luciferasa se llevó a cabo tal como se describe en los Ejemplos. Los datos se obtuvieron de experimentos duplicados.

Figura 4. Potencia elevada de LPSde E. coli K12 (LCD25) y su unión a TLR2. a. Curva dosis-respuesta de varias preparaciones de LPS. b. Interacción específica de [^{3}H]-LPS (LCD25) con el dominio extracelular de TLR2. Se obbservó unión específica a TLR2-Fc, pero no a Fc sola o a proteínas de fusión que contuvieran dominios extracelulares de Rse, Ax1, Her2 o Her4. En la unión a TLR2-Fc se observó competencia específica con LPS LCD25, pero no con LPS detoxificado.

Figura 5. Se requiere TLR2 para la expresión de Il-8 inducida por LPS. El vector de control 299-MSCV y las células 293-TLR2 que expresan transitoriamente mCD14 fueron estimuladas con LBP únicamente o junto con el tipo indicado de LPS a concentraciones de 1 \mug/ml en un medio sin suero durante 6 horas. Para el análisis mediante método Northern se utilizaron cantidades iguales de ARN poli(A).

Figura 6. Secuencia de nucleótidos que codifica huTLR2 (SEC ID N.º:11).

Figura 7. Secuencia de aminoácidos de huTLR (SEC ID N.º:12).

Las figuras 8A-B muestran la secuencia de aminoácidos derivada de una proteína Toll humana de secuencia nativa, designada PRO358 (SEC ID N.º: 13). En la figura, los aminoácidos de 1 a 19 forman una supuesta secuencia señal, los aminoácidos de 20 a 575 son el supuesto dominio extracelular, teniendo los aminoácidos 20 a 54 las características de repeticiones ricas en leucina, los aminoácidos 576 a 595 son un supuesto dominio transmembrana, mientras que los aminoácidos 596 a 811 forman un dominio intracelular.

Las figuras 9A-B (SEC ID N.º: 14) muestran la secuencia de nucleótidos de un ADNc proteínico Toll humano de secuencia nativa designado ADN47361, que codifica la proteína madura Toll PRO358 en toda su longitud. Puesto que la secuencia mostrada contiene algunas secuencias extrañas, el codón de inicio ATG está subrayado y el codon de finalización TAA se encuentra dentro de un cuadro.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Las expresiones "polipéptido PRO358", "PRO358", "Homólogo Toll PRO358" y variantes gramaticales de las mismas, tal como se utilizan en la presente invención, incluyen la proteína Toll PRO358 de secuencia nativa y variantes (que se definen posteriormente en la presente). El polipéptido PRO358 puede ser aislado de una variedad de fuentes, tales como tipos de tejido humano o de otra fuente, o preparados mediante procedimientos de recombinación o de síntesis, o por cualquier combinación de éstos y técnicas parecidas.

Un "PRO358 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el PRO358 procedente de la naturaleza. Dichos polipéptidos Toll de secuencia nativa pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser producidos por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "PRO358 de secuencia nativa" incluye específicamente formas truncadas o secretadas de aparición natural del polipéptido PRO358 descrito en la presente invención (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes de aparición natural (por ejemplo formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas de aparición natural. En una realización de la invención, el PRO358 de secuencia nativa es un polipéptido PRO358 maduro de secuencia nativa en toda su longitud que comprende los aminoácidos 20 a 811 de la figura 12A-B (SEC ID N.º: 18), con o sin la secuencia señal del extremo aminoterminal (aminoácidos 1 a 19), y con o sin la metionina del extremo aminoterminal. En otra realización, el PRO358 de secuencia nativa es la forma soluble del PRO358 en toda su longitud, que conserva el dominio extracelular de la proteína en toda su longitud (aminoácido de 29 a 575), con o sin la secuencia señal del extremo aminoterminal, y con o sin la metionina del extremo aminoterminal.

La expresión "variante del PRO358" hace referencia a un polipéptido PRO358 activo, tal como se define posteriormente, que tiene por lo menos un 80%, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el PRO358 que tiene la secuencia deducida de aminoácidos que se muestra en la figura 12A-B (SEC ID N.º:13). Entre tales variantes se incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO358 en los que se han añadido, o eliminado, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo aminoterminal o carboxiterminal de la secuencia de la figura 12A-B (SEC ID N.º:13). Entre las variantes se incluyen específicamente variantes del PRO358 de secuencia nativa en las que se ha eliminado o inactivado el dominio transmembrana, que también puede tener parte o la totalidad del dominio intracelular eliminado. Las variantes preferidas son aquellas que muestran un grado elevado de identidad de secuencia con el dominio extracelular del polipéptido PRO358 de secuencia nativa. En una realización especial, las variantes PRO358 de la presente invención conservan por lo menos una parte del extremo carboxiterminal del dominio extracelular de una proteína nativa correspondiente y más preferiblemente conservan la mayor parte de los dominios intracelular y extracelular. No obstante, dependiendo del uso pretendido, tales variantes pueden presentar varias alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, deleciones y/o inserciones dentro de estas regiones.

El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias PRO358 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia de elección que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia PRO358, después de alinear las secuencias e introducir vacíos, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede conseguirse de varias maneras que forman parte de la experiencia en el estado de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático de disponibilidad pública tal como software BLAST o Megalign (DNASTAR). Los expertos en el estado de la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para cuentificar la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. El software ALIGN es el preferido para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos.

En un aspecto específico, el "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias PRO358 identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia de elección que son idénticos con los residuos de aminoácidos de la secuencia PRO358, después de alinear las secuencias e introducir vacíos, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Los valores de identidad (%) utilizados en la presente son generados mediante WU-BLAST-2 que se obtuvo en [Altschul y otros, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html]. WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayor parte de los cuales se han establecido en los valores por defecto. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: amplitud de superposición (overlap span) =1, fracción de superposición =0,125, umbral de palabras (T) =11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y de la composición de la base de datos particular frente a la cual se lleva a cabo la búsqueda de la secuencia de interés; no obstante, pueden ajustarse los valores para aumentar la sensibilidad. Un valor de identidad de la secuencia de aminoácidos (%) es determinado por el número de residuos idénticos emparejados dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que tiene la mayor parte de residuos reales en la región alineada (los vacíos introducidos por WU-Blast-2 para maximizar la puntuación de la alineación son ignorados).

El término "positivos", en el contexto de comparación de las secuencias realizada tal como se ha descrito anteriormente, incluye residuos en las secuencias comparadas que no son idénticos pero que tienen propiedades parecidas (por ejemplo, como resultado de sustituciones conservadoras). El valor de positivos (%) es determinado por la fracción de residuos cuya puntuación es un valor positivo en la matriz BLOSUM 62 dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga", tal como se ha definido anteriormente.

En un aspecto específico, el "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias ADN47361 identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia de elección que son idénticos con los residuos de aminoácidos de la secuencia ADN47361, después de alinear las secuencias e introducir vacíos, si es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede conseguirse de varias maneras que se hallan dentro de la experiencia en el estado de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático de disponibilidad pública tal como software BLAST o Megalign (DNASTAR). Los expertos en el estado de la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para cuentificar la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. El software ALIGN es el preferido para determinar la identidad de secuencia de ácidos nucleicos.

Específicamente, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a la secuencia codificante de los polipéptidos PRO358 identificados en la presente se define como el porcentaje de residuos nucleótidos en una secuencia de elección que son idénticos con los residuos de nucleótidos de la secuencia codificante PRO358. Los valores de identidad utilizados en la presente fueron generados por el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 establecido en parámetros por defecto, con una amplitud de superposición y una fracción de superposición establecidas en 1 y 0,126, respectivamente.

"Aislado", cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente, se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que habitualmente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 16 residuos de una secuencia de aminoácidos del extremo aminoterminal o internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del entorno natural del PRO358 no estará presente. Ordinariamente, no obstante, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico ADN47361 "aislada" es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual ordinariamente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico ADN47361. Una molécula de ácido nucleico ADN47362 aislada es distinta de la forma o contexto en que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico ADN47361 aisladas se diferencian por lo tanto de la molécula de ácido nucleico ADN47361 tal como existe en las células naturales. No obstante, una molécula de ácido nucleico ADN47361 incluye moléculas de ácido nucleico ADN47361 contenidas en células que ordinariamente expresan ADN47361 en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halla en una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

"Receptor Toll 2", "TLR2" y "huTLR2" se utilizan indistintamente, y se refieren a un receptor Toll humano designado como "HuTLR2" por Rock y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-693 (1998). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de huTLR2 se muestran en las figuras 10 (SEC ID N.º: 11) y 11 (SEC ID N.º: 12), respectivamente.

La expresión "vector de expresión" se utiliza para definir un vector, en el que un ácido nucleico que codifica una proteína homóloga de tipo Toll de la presente invención está unido operativamente con secuencias control capaces de influir en su expression en células huésped adecuadas. Ordinariamente los vectores llevan un sitio de replicación (aunque éste no es necesario donde tendrá lugar la integración cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen secuencias señal que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, habitualmente E. coli es transformado utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar y otros, Gene 2:95 [1977]), el pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y de este modo proporciona medios sencillos para identificar células transformadas, tanto para propósitos de clonación como de expresión. Los vectores de expresión también contendrán de manera óptima secuencias que son útiles para el control de la transcripción y la traducción, por ejemplo, promotores y secuencias Shine-Dalgarno (para procariotas) o promotores y potenciadores (para células de mamífero). Los promotores pueden ser, aunque no necesariamente, inducibles; se ha observado que incluso promotores constitutivos poderosos tales como el promotor CMV para huéspedes de mamíferos produce el LHR sin toxicidad de la célula huésped. Aunque es concebible que los vectores de expresión no es necesario que contengan algún control de expresión, secuencias replicativas o genes de selección, su ausencia puede dificultar la identificación de transformantes híbridos y que pueda conseguirse un nivel elevado de expresión de inmunoglobulina híbrida.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante vinculada operativamente a un organismo huésped en particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operativa, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico se halla "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o una líder secretora se halla unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador se halla unido operativamente a una secuencia codificante si influye en la transcripción de la secuencia: o un sitio de unión a ribosomas se halla unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionado de tal modo que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de una líder secretora, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción adecuados. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente comprende anticuerpos monoclonales anti-PRO358 únicos (incluidos anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpos anti-PRO358 con especificidad poliepitópica. La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente idénticos, es decir, cada uno de los anticuerpos comprendido en la población es idéntico excepto por posibles mutaciones de aparición natural que pueda haber en cantidades menores.

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que parcialmente o por completo bloquee, evite, inhiba o neutralice una actividad biológica de un receptor nativo Toll descrito en la presente invención. De un modo similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que emule o potencie una actividad biológica de un receptor nativo Toll descrito en la presente invención. Entre las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas se incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. receptores nativos Toll.

"Activo" o "actividad" para los propósitos de la presente invención se refiere a formas del PRO358 que conservan las actividades biológica y/o inmunológica del PRO358 nativo o de aparición natural, respectivamente. Una "actividad" preferida es la capacidad para inducir la activación del NF-\kappaB y/o la expresión de genes controlados NF-\kappaB para las citocinas inflamatorias IL-1, IL-6 e IL-8. Otra "actividad" preferida es la capacidad para activar una respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa en vertebrados. Otra "actividad" preferida es la capacidad para detectar la presencia de estructuras moleculares conservadas presentes en microbios y, específicamente, la capacidad para intervenir en la señalación de lipopolisacáridos (LPS). La misma definición de "actividad" se aplica a los agonistas (por ejemplo, anticuerpos agonistas) de los polipétidos PRO358. Tal como se ha observado anteriormente, la "actividad" de un antagonista (incluidos los anticuerpos agonistas) de un polipéptido PRO358 se define como la capacidad de contrarrestar, por ejemplo bloquear, evitar, inhibir o neutralizar parcialmente o por completo, cualquiera de las actividades identificadas anteriormente de un polipéptido PRO358.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por alguien experto en la técnica y, generalmente, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado y de la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una renaturalización adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. Generalmente la hibridación depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para renaturalizarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de la temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridada, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se desprende que temperaturas relativas más altas tendirían a hacer más rigurosas las condiciones de la reacción, mientras que temperaturas más bajas las harían menos rigurosas. Para más detalles y explicaciones sobre la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y otros, Current protocols in Molecular Biology (1995).

Las "condiciones rigurosas" o "condiciones muy rigurosas", tal como se definen en la presente, pueden ser identificadas como aquellas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina bovina sérica al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; (3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2 x (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado muy riguroso que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Pueden identificarse "condiciones moderadamente rigurosas" como las descritas por Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la técnica reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según las necesidades para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión "etiquetado con epítopo" cuando se utiliza en la presente se refiere a un polipeptido quimérico que comprende un polipéptido FIZZ fusionado a un "polipéptido etiqueta (tag)". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el cual puede crearse un anticuerpo, aunque es suficiente corto para no interferir con la actividad del polipéptido al cual está fusionado. El polipéptido etiqueta es también preferiblemente casi único de modo que el anticuerpo no puede reaccionar de forma cruzada sustancialmente con otros epítopos. Los polipétidos etiqueta adecuados generalmente tienen por lo menos seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre 10 y 20 residuos de aminoácidos).

Tal como se utiliza en la presente, el término "inmunoadhesina" designa moléculas parecidas a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de identificación y unión al antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y la secuencia de dominios constantes de la inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina habitualmente es una secuencia contigua de aminoácidos que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de los dominios constantes de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluidas IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

"Tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventativas, en las que el objetivo es evitar o reducir (disminuir) la enfermedad o el trastorno patológico tratado. Entre los que requieren tratamiento se incluyen aquellos que ya sufren el trastorno, así como aquellos con tendencia a sufrir el trastorno o aquellos en quienes el trastorno tiene que evitarse.

"Administración crónica" se refiere a la administración continuada del agente o agentes, a diferencia de la administración en una dosis única, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un período prolongado de tiempo.

"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluidos los humanos, los animales domésticos y de granja, y los del zoo, los utilizados en deportes, o animales de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

La administración "en combinación con" uno u otros más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

El término "lipopolisacárido" o "LPS" se utiliza en la presente como sinónimo de "endotoxina". Los lipopolisacáridos (LPS) son componentes característicos de la membrana externa de las bacterias gramnegativas, por ejemplo de Escherichia coli. Constan de una parte polisacárido y una grasa llamada lípido A. El polisacárido, que varía entre una y otra especie de bacteria, está compuesto por la cadena O específica (construida a partir de unidades de repetición de tres a ocho glúcidos) y el núcleo de dos partes. El lípido A prácticamente siempre incluye dos glucosaminas modificadas por fosfato y un número variable de ácidos grasos. Para más información véase, por ejemplo, Rietschel y Brade, Scientific American agosto de 1992, 54-61.

El término "choque septicémico" se utiliza en la presente en el sentido más amplio, que incluye todas las definiciones descritas en Bone. Ann. Intern Med. 114, 332-333 (1991). Específicamente, el choque septicémico empieza con una respuesta generalizada a la infección, un síndrome llamado sepsis. Cuando este síndrome produce hipotensión y disfunción orgánica, se denomina choque septicémico. El choque septicémico puede ser iniciado por organismos grampositivos y hongos, así como por organismos gramnegativos que contengan endotoxinas. Por consiguiente, la presente definición no se limita a "choque por endotoxinas".

II. Composiciones y procedimientos de la invención A. PRO358 en toda su longitud

La invención proporciona secuencias de nucleótidos recientemente identificados y aislados que codifican un polipéptido al que se hace referencia en la presente solicitud como PRO358. En particular, los solicitantes han identificado y aislado ADNc que codifica un nuevo polipéptido Toll humano (PRO358), tal como se describe con mayor detalle en los Ejemplos que aparecen posteriormente. Utilizando los programas informáticos de alineación de secuencias BLAST y FastA, los solicitantes han observado que la secuencia codificante de PRO358 muestra homología considerable con la secuencia de ADN HSU88540_1, HSUB8878_1, HSU88879_1, HSU88880_1, HS88881_1 y HSU79260_1 de la base de datos GenBank. A excepción de USU79260_1, las proteínas observadas se han identificado como receptores humanos de tipo Toll.

Por consiguiente, actualmente se cree que las proteínas PRO358 descritas en la presente solicitud son homólogas humanas identificadas recientemente de la proteína Toll de Drosophila, y es probable que desempeñen un papel importante en la inmunidad adaptativa. Más específicamente, el PRO358 puede intervenir en la inflamación, el choque septicémico y la respuesta a organismos patógenos, y desempeña papeles importantes en diversas enfermedades médicas que son agravadas por una respuesta inmunitaria, tal como, por ejemplo, diabetes, ALS, cáncer, artritis reumatoide y úlceras. La función del PRO385 como patrón de identificación de receptores patógenos, que detecta la presencia de estructuras moleculares conservadas en microbios, es además respaldada por datos descritos en la presente solicitud que muestran que un receptor humano conocido de tipo Toll, el TLR2, interviene directamente en la señalación de LPS.

B. Variantes del PRO358

Además del PRO358 de secuencia nativa en toda su longitud descrito en la presente, se contempla la preparación de variantes de estas secuencias. Las variantes del PRO358 pueden prepararse introduciendo modificaciones adecuadas en los nucleótidos del ADN del PRO358, o mediante síntesis de los polipéptidos de las variantes deseadas. Los expertos en la materia sabrán apreciar que los cambios en aminoácidos pueden alterar procesos postranscripcionales de los polipeptidos PRO358, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación o alterar las caractaerísticas de anclaje de la membrana.

Pueden hacerse variaciones en el PRO358 de secuencia nativa en toda su longitud, o en varios dominios del PRO358 descrito en la presente, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y orientaciones para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas anteriormente, por ejemplo, en la patente de EE.UU. US 5.864.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO358 que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con los correspondientes polipéptidos de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es mediante sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del PRO358. Para determinar qué residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin afectar de manera adversa la actividad deseada cabe comparar la secuencia del PRO358 con la de moléculas proteínicas homólogas conocidas y minimizar el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de homología elevada. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas parecidas, tales como la sutitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las inserciones o deleciones pueden ser opcionalmente de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probando la actividad de las variantes resultantes en el análisis in vitro descrito en los Ejemplos que aparecen posteriormente.

Las variaciones pueden hacerse utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (mutagénesis dirigida), análisis de alanina y mutagénesis mediante RCP. La mutagénesis dirigida [Carter y otros, Nucl. Acids Res., 13: 4.381 (1986); Zoller y otros, Nucl. Acids Res., 10:6.487 (1987)], la mutagénesis por inserción de un casete [Wells y otros, Gene, 34:316 (1985)], la mutagénesis por selección de restricción[Wells y otros, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas son las que pueden llevarse a cabo sobre el ADN clonado para producir el ADN del PRO286 o de una variante del PRO286.

El análisis de rastreo de aminoácidos también puede utilizarse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Los aminoácidos de rastreo preferidos son aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Entre tales aminoácidos se incluyen la alanina, la glicina, la serina y la cisteína. La alanina es habitualmente uno de los aminoácidos de rastreo preferidos entre este grupo porque elimina más allá de la cadena secundaria del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también es habitualmente preferida porque es el aminoácido más frecuente. Además, con frecuencia se encuentra tanto en posiciones ocultas como a la vista [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades suficientes de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.

Entre las variantes de las proteínas Toll PRO358 descritas en la presente se incluyen proteínas en las que los dominios transmembrana han sido eliminados o inactivados. Las regiones transmembrana son dominios sumamente hidrófobos o lipofílicos que tienen el tamaño apropiado para abarcar la bicapa lipídica de la membrana celular. Se cree que anclan los polipéptidos nativos maduros PRO285, PRO286 y PRO358 en la membrana celular. En el PRO358 el dominio transmembrana se halla entre aproximadamente la posición del aminoácido 576 y la posición del aminoácido 595.

La deleción o sustitución del dominio transmembrana facilitará la recuperación y proporcionará una forma soluble de un polipéptido PRO358 reduciendo su afinidad lipídica celular o de la membrana y mejorando su solubilidad hídrica. Si los dominios transmembrana y citoplasmáticos son eliminados, se evita la introducción de epítopos potencialmente inmunógenos, bien por exposición de polipéptidos por otro lado intracelulares que podrían ser identificados por el cuerpo como extraños o bien mediante inserción de polipéptidos heterólogos que son potencialmente inmunógenos. Una de las principales ventajas de un PRO358 en el que se haya eliminado el dominio transmembrana es que se secreta en el medio de cultivo de huéspedes recombinantes. Esta variante es soluble en líquidos corporales tales como la sangre y no tiene una afinidad apreciable por los lípidos de la membrana celular, de modo que se simplifica considerablemente su recuperación del cultivo celular recombinante.

La exposición anterior dejará suficientemente claro que las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se llevan a cabo para llegar a un constructo final. Como proposición general, las variantes solubles no tendrán un dominio transmembrana funcional y preferiblemente no tendrán una secuencia citoplasmática funcional. Generalmento esto se consigue mediante deleción del dominio relevante, aunque las variantes con inserciones o sustituciones suficientes también son efectivas para este propósito. Por ejemplo, el dominio transmembrana es sustituido por cualquier secuencia de aminoácidos, por ejemplo una secuencia aleatoria o predeterminada de aproximadamente 5 a 60 residuos de serina, treonina, lisina, arginina, glutamina, ácido aspártico y residuos de tipo hidrofílico, que en conjunto muestran un perfil de hidropatía hidrofílica. Como las variantes con deleciones (truncadas) PRO285, PRO286 y PRO358, estas variantes son secretadas en el medio de cultivo de huéspedes recombinantes.

Entre otras variantes con deleciones de los polipéptidos maduros PRO358 en toda su longitud (o con eliminación del dominio transmembrana a formas inactivadas de los mismos) se incluyen variantes en las que se ha eliminado el péptido señal del extremo aminoterminal (supuestamente identificado como aminoácidos 1 a 26 para el PRO358) y/o la metionina de inicio.La secuencia señal nativa también puede sustituirse por otro péptido señal (heterólogo), que puede ser otra proteína de tipo Toll u otra secuencia señal humana o no humana (por ejemplo, bacteriana, de levaduras o de un mamífero no humano).

Se cree que el dominio intracelular, y especialmente su parte carboxiterminal, es importante para la función biológica de estos polipéptidos. Por consiguiente, si el objetivo es hacer variantes que conserven la actividad biológica de una proteína de tipo Toll nativa correspondiente, se conserva por lo menos una parte sustancial de estas regiones o las alteraciones, si las hay, implican sustituciones y/o inserciones de aminoácidos conservadoras o de aminoácidos que sean parecidos en carácter a los presentes en la región donde se inserta el aminoácido. No obstante, si se requiere una modificación sustancial de la función biológica de un receptor Toll nativo (por ejemplo, el objetivo es preparar antagonistas de los polipéptidos Toll nativos respectivos), las alteraciones implican la sustitución y/o inserción de aminoácidos que difieren en carácter del aminoácido de la posición de destino en el polipéptido Toll nativo correspondiente.

Los aminoácidos de aparición natural se dividen en grupos según propiedades habituales de la cadena secundaria:

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(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófobos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

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Las sustituciones conservadoras implican intercambiar un elemento de un grupo por otro elemento del mismo grupo, mientras que las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un elemento de una de estas clases por otro. Las variantes obtenidas mediante sustituciones no conservadoras se espera que produzcan cambios más significativos en las propiedades biológicas/función de la variante obtenida.

Entre las inserciones de aminoácidos se incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales cuya longitud oscile entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Las inserciones dentro de la secuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína PRO358) generalmente pueden ser de aproximadamente 1 a 10 residuos, más preferiblemente de 1 a 5 residuos, más preferiblemente de 1 a 3 residuos. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen polipéptidos PRO358 con un residuo metionil aminoterminal, un artefacto de su expresión directa en cultivos bacterianos de células recombinantes, y la fusión de una secuencia señal aminoterminal heteróloga con el extremo N de la molécula PRO358 para facilitar la secreción de las proteínas maduras I-TRAF de células huésped recombinantes. Dichas secuencias señal generalmente se obtendrán a partir de las especies pretendidas de células huésped y por lo tanto serán homólogas a las mismas. Entre las secuencias adecuadas se incluyen STII o Ipp para E. coli, factor alfa para levaduras y señales víricas tales como herpes gD para células de mamíferos.

Otras variantes con inserciones de las moléculas murinas Toll nativas descritas en la presente incluyen la fusión del extremo aminoterminal o carboxiterminal de la molécula de secuencia nativa con polipéptidos inmunógenos, por ejemplo polipéptidos bacterianos tales como betalactamasa o una enzima codificada por el locus trp de E. coli, o una proteína de la levadura, y fusiones carboxiterminales con proteínas que tienen una semivida larga tal como regiones de la inmunoglobulina (preferiblemente regiones constantes de la inmunoglobulina para producir inmunoadhesinas), albúmina, o ferritina, tal como se describe en el documento WO 89/02922 publicado el 6 de abril de 1989. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas véase también patente de EE.UU. US 5.428.130 publicada el 27 de junio de 1995.

Puesto que a menudo es difícil predecir con antelación las características de una variante de proteína de tipo Toll, se podrá apreciar que el cribado es necesario para seleccionar la variante óptima. Para este propósito serán fácilmente disponibles análisis bioquímicos u otros análisis de cribado, tales como los descritos posteriormente en la presente.

C. Modificaciones de las proteínas de tipo Toll PRO358

Las modificaciones covalentes de los homólogos humanos de tipo Toll del PRO358 están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos dirigidos de la proteína PRO358 con un agente de derivación orgánica que es capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o con residuos de los extremos aminoterminal o carboxiterminal. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar el PRO358 con una matriz de sostén o una superficie insolubles en agua para utilizarlo en el procedimiento para purificar anticuerpos PRO358 y viceversa. Entre los agentes de entrecruzamiento habitualmente utilizados se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluidos ésteres disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis-(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos glutaminilo y aspariginilo a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas secundarias de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco. págs. 79-86 (1983)], acetilación de la amina aminoterminal y amidación de cualquier grupo carboxilo carboxiterminal.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para preparar agregados intramoleculares de los receptores de tipo Toll de la presente invención con polipéptidos, así como para entrecruzar estos polipéptidos con una matriz de soporte o superficie insolubles en agua para utilizarlos en análisis o en purificación de la afinidad. Además, un estudio de entrecruzamiento intercatenario proporcionará información directa sobre la estructura conformacional. Entre los agentes de entrecruzamiento utilizados habitualmente se incluyen 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida, imidoésteres homobifuncionales y maleimidas bifuncionales. Los agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos de sistemas descritos en las patentes de EE.UU. US 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.637; 4.055.635; y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización y el entrecruzamiento de proteínas.

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO358 incluída dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glucosilación nativo del polipéptido. Para los propósitos de la presente, "alterar el patrón de glucosilación nativa" significa eliminar una o más partes carbohidratos halladas en la secuencia nativa (bien eliminando el sitio de glucosilación subyacente o eliminando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los carbohidratos presentes.

La adición de sitios de glucosilación a los polipétidos PRO358 puede llevarse a cabo alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede hacerse, por ejemplo, mediante la adición de, o la sutitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia nativa (para sitios de glucosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos puede opcionalmente alterarse a través de cambios a nivel del ADN, en particular mutando el ADN que codifica los polipéptidos PRO358 en bases preseleccionadas tales que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otra manera de aumentar el número de partes carbohidrato en los polipéptidos PRO358 es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido.Dichos procedimientos están descritos en el estado de la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).

La eliminación de partes carbohidrato presentes en los polipéptidos PRO285, PRO286 y PRO358 puede llevarse a cabo química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican para residuos de aminoácidos que actúan como objetivos de la glucosilación. Las técnicas de desglucosilación química son conocidas en la técnica descrita, por ejemplo, por Hakimuddin y otros, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge y otros, Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de partes carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas tal como se describe en Thotakura y otros, Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente comprende unir los polipéptidos PRO358 a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera establecida anteriormente en las patentes de EE.UU. US 4.640.835; US 4.496.689; US 4.301.144; US 4.670.417; US 4.791.192 o US 4.179.337.

Los polipéptidos PRO358 de la presente invención también pueden ser modificados de tal modo que formen una molécula quimérica que comprenda PRO358, o un fragmento del mismo, fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO358 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta con epítopo generalmente se coloca en los extremos amínico o carboxílico de una molécula nativa o variante del PRO358. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Asimismo, la provisión de la etiqueta con epítopo permite purificar fácilmente los polipéptidos PRO358 mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta con epítopo.

Varios polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en el estado de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina; el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y otros, Mol. Cell. Biol., 8:2.159-2.165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de los mismos [Evan y otros, Molecular and Cellular Biology. 5:3.610-3.616 (1985)]; y la etiqueta glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple y sus anticuerpos [Paborsky y otros, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y otros, BioTechnology, 6:1.204-1.210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin y otros, Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido epítopo \alpha-tubulina [Skinner y otros, J. Biol. Chem., 266:15.163-15.166 (1991)]; y la etiqueta del péptido proteínico T7 del gen 10 [Lutz-Freyermuth y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6.393-6.897 (1990)].

En otra realización, la molécula quimérica puede comprender una fusion de los polipéptidos PRO358, o fragmentos de los mismos, con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, tal fusión podría ser hasta la región Fc de una Ig, tal como la molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO358 en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula de Ig. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina véase también patente de EE.UU. US 5.428.180 publicada el 27 de junio de 1995.

D. Preparación de polipéptidos PRO358

La descripción que aparece posteriormente se refiere principalmente a la producción de homólogos PRO358 de tipo Toll mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica estas proteínas (por ejemplo, ADN47361). Evidentemente, para preparar PRO358 o variantes está contemplado poder utilizar procedimientos alternativos, que son bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, puede producirse la secuencia PRO358, o partes de la misma, mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart y otros, Solid-Phase Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2.149-2.154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems (Foster City, CA) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Varias partes del PRO358 pueden sintetizarse químicamente por separado y combinadas utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el PRO358 en toda su longitud.

1. Aislamiento de ADN que codifica PRO358

Puede obtenerse el ADN que codifica el PRO358 a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del PRO358 y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, puede obtenerse convenientemente ADN del PRO358 humano a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen subyacente también puede obtenerse a partir de una genoteca genómica o por síntesis de oligonucleótidos. Además de las genotecas descritas en los Ejemplos, puede aislarse el ADN que codifica las proteínas humanas de tipo Toll de la presente invención, por ejemplo, a partir de células del bazo o de leucocitos de sangre periférica (PBL).

Las genotecas pueden cribarse con sondas (tales como anticuerpos contra la proteína PRO358 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20-80 bases) designados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El cribado de ADNc o de la genoteca genómica con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Una manera alternativa de aislar el gen que codifica el PRO358 es utilizar metodología RCP [Sambrook y otros, supra; Dieffenbach y otros, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los Ejemplos que aparecen posteriormente describen técnicas para el cribado de una genoteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener una longitud suficiente y ser lo suficientemente inequívocas de manera que se redujeran al mínimo los falsos positivos. El oligonucleótido es preferiblemente marcado de modo que pueda detectarse en la hibridación de ADN en la genoteca cribada. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en el estado de la técnica e incluyen el uso de radiomarcadores como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilización o el marcado enzimático. Las condiciones de hibridación, que son moderadamente rigurosas y muy rigurosas, se proporcionan en Sambrook y otros, supra.

Las secuencias identificadas en tales procedimientos de cribado de genotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank o en otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel del aminoácido o del nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o de un extremo a otro de la secuencia en toda su longitud puede determinarse a través de la alineación de secuencias utilizando programas informáticos con software tal como ALIGN, DNAstar e INHERIT, que utilizan varios algoritmos para cuantificar la homología/identidad de secuencia.

Puede obtenerse el ácido nucleico que tenga una secuencia codificante de proteínas mediante el cribado de ADNc seleccionado o de genotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida, descrita en la presente por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos de ampliación de cebadores convencionales tal como se describe en Sambrook y otros, supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de ARNm que pueden no haber sido transcritos inversamente a ADNc.

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped son transfectadas o transformadas con los vectores de expresión o de clonación descritos en la presente para la producción de proteínas Toll humanas y cultivadas en medio de nutrientes convencional como es conveniente para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones del cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, pueden ser seleccionadas por cualquier experto en la materia. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y otros, supra.

Los procedimientos de transfección son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio en el que se utiliza cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook y otros, supra, o electroporación se utiliza generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales en la pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas plantas, tal como se describe en Shaw y otros, Gene, 23:315 (1983) y en el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. En el caso de las células de mamíferos, que carecen de tales paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones del sistema huésped de las células de mamíferos se han descrito en la patente de EE.UU. US 4.399.216. Las transformaciones en levaduras habitualmente se llevan a cabo según el procedimiento de Van Solingen y otros, J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3.829 (1979). No obstante, para introducir ADN en células, también pueden utilizarse otros procedimientos tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión bacteriana de protoplastos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para técnicas diversas para transformar células de mamíferos, véase Keown y otros, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y otros, Nature, 386:348.352 (1988).

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de ADN en los vectores de la presente invención se incluyen procariotas, levaduras, o células eucariotas superiores. Entre los procariotas adecuados se incluyen, pero no exclusivamente, eubacterias tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas tales como E. coli. Varias cepas de E. coli se hallan públicamente disponibles, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635) de E. coli.

Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican Toll humano. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo eucariota inferior que se utiliza con frecuencia.

Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas Toll humanas glucosiladas proceden de organismos pluricelulares. Entre los ejemplos de invertebrados se incluyen células de insecto tales como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera, así como células vegetales. Entre los ejemplos de estirpes útiles de células huésped de mamíferos se incluyen las de los ovarios de hámster chino (CHO) y las células COS. Entre los ejemplos más específicos se incluyen una estirpe CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); una estirpe de riñón de embrión humano (células 293 o 293 subclonadas para hacerlas crecer en un cultivo en suspensión, Graham y otros, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad-Sci. USA, 77:4.216 (1980)); células de Sertoli murinas (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humanas (W198. ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2. HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La seleccion de la célula huésped apropiada se considera dentro las habilidades en el estado de la técnica.

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3. Selección y uso de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el PRO358 puede ser insertado en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Son diversos los vectores públicamente disponibles. El vector puede hallarse, por ejemplo, en la forma de un plásmido, un cósmido, una partícula vírica o un fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en un vector por medio de una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de una endonucleasa de restricción apropiada utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica. Entre los componentes de los vectores generalmente se incluyen, pero no exclusivamente, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. Para la construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes se utilizan técnicas estándar de ligación que son conocidas por el experto en la materia.

Las proteínas PRO358 pueden producirse de manera recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo aminoterminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede formar parte del ADN del PRO358 que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o líderes II de enterotoxina estable al calor. Para la secreción de levaduras la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la líder invertasa de levaduras, la líder del factor alfa (incluidas las líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, la última descrita en la patente de EE.UU. US 5.010.182), o la líder ácido fosfatasa, la líder glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, para la secreción directa de la proteína pueden utilizarse secuencias señal de mamíferos, tal como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como líderes secretoras víricas.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de bacterias gramnegativas, el origen 2 \mu del plásmido es adecuado para levaduras y varios orígenes de virus (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonación contendrán habitualmente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes importantes no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para bacilos.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero es el de aquellos que permiten la identificación de células competentes para introducir el ácido nucleico del PRO358, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la estirpe celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4.216 (1980). Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 [Stinchcomb y otros, Nature, 282:39 (1979); Kingsman y otros, Gene, 7:141 (1979); Tschemper y otros, Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras que no tiene capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.º 44.076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína PRO358 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores identificados por una variedad de células huésped son bien conocidos. Entre los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores \beta-lactamasa y lactosa [Chang y otros, Nature, 275:615 (1978); Goeddel y otros, Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res, 8:4.057 (1980); EP 36.776] y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores de uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el PRO358.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levaduras se incluyen los promotores para 8-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y otros, J. Biol. Chem., 265:2.073 (1980)] u otras enzimas glucolíticas [Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4.900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 8-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-8-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables del uso de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras también se describen en la EP 78.657.

La transcripción del PRO358 a partir de vectores en células huésped de mamíferos es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus de los simios 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de las inmunoglobulinas y de promotores del choque de calor, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido PRO358 mediante de eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). No obstante, habitualmente se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador SV40 en el extremo final del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador polioma en el extremo final del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede empalmarse al vector en la posición 5' o 3' de la secuencia codificante del PRO358, pero preferiblemente se localiza en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias se hallan con frecuencia disponibles en las regiones no traducidas 6' y ocasionalmente 3' de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el PRO358.

Aún otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para adaptarse a la síntesis del PRO285, PRO286, o PRO358 en cultivo celular recombinante de vertebrados se describen en Gething y otros, Nature, 293:620-625 (1981), Mantei y otros, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058.

4. Detección de la amplificación/expresión de genes

La amplificación y/o expresión de genes puede cuantificarse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante métodos convencionales como método Southern y método Northern para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 5.201-5.205 (1980)], transferencia puntual (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, a partir de las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden identificar duplicidades específicas, incluidas duplicidades de ADN, duplicidades de ARN y duplicidades híbridas ADN-ARN o ADN-proteínas. A su vez, los anticuerpos pueden ser marcados y el análisis puede llevarse a cabo en el lugar donde la duplicidad se une a la superficie, de modo que sobre la formación de duplicidad en la superficie puede detectarse la presencia de anticuerpo unido a la duplicidad.

La expresión de genes, alternativamente, puede cuantificarse mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y análisis de cultivo celular de fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de un producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el análisis de fluidos de una muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra polipéptidos PRO358 de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada al ADN del PRO358 y que codifique un epítopo específico de un anticuerpo.

5. Purificación del polipéptido

Las formas del PRO358 pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si están unidas a la membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión del PRO358 pueden alterarse por varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o agentes que lisan células.

Es posible que se desee purificar el PRO358 de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatofocalización, SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de sefarosa A para proteínas para eliminar contaminantes tales como IgG, y columnas de quelantes de metales para unir las formas etiquetadas con epítopo de las proteínas Toll. Pueden utilizarse varios procedimientos de purificación de proteínas y tales procedimientos son conocidos en el estado de la técnica y descritos, por ejemplo, en: Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y de la proteína Toll concreta producida.

E. Usos de las proteínas Toll y los ácidos nucleicos codificantes

Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican las proteínas Toll de la presente invención tienen varias aplicaciones en la técnica de biología molecular, entre las que se incluyen usos como las sondas de hibridación, en la cartografía cromosómica y genética y en la generación de ARN y ADN no codificantes. El ácido nucleico Toll también será útil para la preparación de polipéptidos PRO358 mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

Pueden utilizarse los genes ADN47361 de secuencia nativa en toda su longitud, que codifican PRO358, respectivamente, o partes del mismo, como sondas de hibridación para una genoteca de ADNc para aislar el gen en toda su longitud o para aislar incluso otros genes (por ejemplo, los que codifican variantes de aparición natural del PRO358 o sus otros homólogos humanos, u homólogos de otras especies) que tienen una secuencia de identidad deseada con la secuencia del PRO358 descrito en las figuras 1.3 y 12A-B), respectivamente. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden proceder de la secuencia de nucleótidos de la figura 13A-B (SEC ID N.º: 14), o de secuencias genómicas incluidos promotores, elementos potenciadores e intrones de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de cribado comprenderá aislar la región codificante del gen PRO358 utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con una variedad de radiomarcadores entre los que se incluyen radionucleótidos tales como ^{32}P o ^{35}S o marcadores enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen PRO358 (ADN 47361) de la presente invención pueden utilizarse para cribar genotecas de ADNc humano, ADN o ARN genómico para determinar qué elementos de tales genotecas hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con mayor detalle en los Ejemplos que aparecen posteriormente.

Las sondas también pueden utilizarse en técnicas RCP para generar un conjunto de secuencias para la identificación de secuencias Toll estrechamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína Toll de la presente invención también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para cartografiar el gen que codifica aquella proteína Toll y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. La secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención pueden ser cartografiadas para un cromosoma y para regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como hibridación in situ, análisis de recombinación frente a marcadores cromosómicos y cribado de hibridación con genotecas.

Las proteínas Toll humanas de la presente invención también pueden utilizarse en análisis para identificar otras proteínas o moléculas que intervienen en la transducción de señal mediada por Toll. Por ejemplo, los PRO358 son útiles para identificar los ligandos naturales aún desconocidos de Toll humanos, u otros factores que participan (directa o indirectamente) en la activación de la señalación y/o en la propia señalación a través de un receptor Toll humano, tal como las posibles quinasas asociadas a un receptor Toll. Además, pueden identificarse los inhibidores de la interacción de la unión receptor/ligando. Las proteínas involucradas en tales interacciones de unión también pueden utilizarse para cribar péptidos o inhibidores de molécula pequeña o agonistas de la interacción de unión. Los análisis de cribado pueden haberse diseñado para hallar los principales compuestos que emulen la actividad biológica de un polipéptido nativo Toll o de un ligando para un polipéptido nativo Toll. Dichos análisis de cribado incluirán análisis susceptibles de llevar a cabo un cribado muy rendible de genotecas químicas, que los harán particularmente adecuados para identificar posibles fármacos de molécula pequeña. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los análisis pueden realizarse en una variedad de formatos, entre los que se incluyen análisis de unión proteína-proteína, análisis de cribado bioquímico, inmunoanálisis y análisis basados en células, que están bien caracterizados en el estado de la técnica.

Los análisis in vitro utilizan una mezcla de componentes entre los que se incluye un polipéptido de receptores Toll, que puede formar parte de un producto de fusión con otro péptido o polipéptido, por ejemplo, una etiqueta para detectar o anclar, etc. Las mezclas del análisis pueden comprender además (para análisis de unión) una diana de unión Toll natural intra o extracelular (es decir, un ligando Toll, u otra molécula conocida, para activar y/o señalar a través del receptor Toll). Aunque pueden utilizarse dianas de unión nativas, con frecuencia se prefiere utilizar una parte de tales dianas de unión nativas (por ejemplo, péptidos), mientras que la parte proporcione afinidad de unión y afinidad para la proteína Toll convenientemente cuantificable en el análisis. La mezcla del análisis contiene un agente farmacológico de elección. Entre los agentes de elección se incluyen numerosas clases químicas, aunque habitualmente son compuestos orgánicos, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños, y se obtienen a partir de una variedad de fuentes entre las que se incluyen genotecas de compuestos sintéticos o naturales. En la mezcla también puede incluirse una variedad de otros reactivos, tales como sales, tampones, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, inhibidores de la proteasa, inhibidores de la nucleasa, agentes antimicrobianos, etc.

En los análisis de unión in vitro, la mezcla resultante se incuba bajo condiciones a través de las cuales, salvo por la presencia de la molécula de elección, la proteína Toll se une específicamente a la diana de unión celular, a una parte de la misma o a un análogo con una afinidad de unión de referencia. Los componentes de la mezcla pueden añadirse en cualquier orden que tenga en cuenta las uniones necesarias y las incubaciones pueden llevarse a cabo a cualquier temperatura que facilite la unión óptima. Asimismo, los períodos de incubación son seleccionados para la unión óptima pero también minimizados para facilitar el cribado de rendimiento elevado rápido.

Tras la incubación, la unión predispuesta por el agente entre la proteína Toll y una o más dianas de unión se detecta mediante cualquier técnica adecuada. Para los análisis de tipo unión sin células, a menudo se utiliza una etapa de separación para separar los componentes unidos de los que no lo están. La separación puede efectuarse mediante precipitación (por ejemplo, precipitación TCA, inmunoprecipitación, etc.), inmovilización (por ejemplo, sobre un sustrato sólido), etc., seguida de lavado mediante, por ejemplo, filtración de membrana (por ejemplo, papel Whatman de intercambio iónico P-18, membrana hidrófoba GFC de Polufiltronic, etc.), cromatografía sobre gel (por ejemplo, filtración en gel, afinidad, etc.). Para los análisis de transcripción dependientes de Toll, la unión se detecta mediante un cambio en la expresión de un indicador dependiente de Toll.

La detección puede efectuarse de cualquier modo conveniente. Para los análisis de unión sin células, uno de los componentes habitualmente comprende un marcador o está acoplado al mismo. El marcador puede tener en cuenta la detección directa como radioactividad, luminiscencia, densidad óptica o electrónica, etc. o la detección indirecta, tal como una etiqueta con epítopo, una enzima, etc. Pueden utilizarse una variedad de procedimientos para detectar la dependencia del marcador en la naturaleza del marcador y otros componentes del análisis, por ejemplo a través de densidad óptica o electrónica, emisiones radioactivas, transferencia de energía no radioactiva, etc. o detectarse indirectamente con conjugados de anticuerpos, etc.

Los ácidos nucleicos que codifican el PRO358, o sus formas modificadas también pueden utilizarse para generar animales no humanos transgénicos o animales no humanos con genes inactivados (knock out) que, a su vez, son útiles en la elaboración y el cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal no humano que tiene células que contienen un transgén, el cual transgén fue introducido al animal o al ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgén es un ADN que se halla integrado dentro del genoma de una célula a partir de la cual se crea un animal transgénico. Puede utilizarse ADNc para clonar el ADN genómico que codifica el PRO358 según técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica PRO358. Los procedimientos para generar animales transgénicos no humanos, en particular animales tales como ratones o ratas, han pasado a ser convencionales en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. US 4.736.866 y US 4.870.009. Habitualmente, debería actuarse sobre células concretas para la incorporación de transgenes con potenciadores tisulares específicos. Para analizar el efecto de una mayor expresión del ADN que codifica el PRO358, pueden utilizarse animales no humanos transgénicos que incluyan una copia de un transgén que codifique el PRO358 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria. Tales animales pueden utilizarse como animales de prueba para reactivos que se cree que confieren una forma protectora, por ejemplo, situaciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención, se trata a un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la situación patológica, comparado con animales portadores del transgén no tratados, indicaría una posible intervención terapéutica para la situación patológica.

Alternativamente, los homólogos vertebrados no humanos (por ejemplo, mamíferos) del PRO358 pueden utilizarse para construir un animal no humano con genes inactivados que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el PRO358, como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica la proteína PRO358 y el ADN genómico alterado que codifica el PRO358 introducido en una célula embrionaria del animal no humano. Por ejemplo, el ADNc que codifica el PRO358 puede utilizarse para clonar ADN genómico que codifique el PRO358 con técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica el PRO358 puede eliminarse o sustituirse por otro gen, tal como un gen que codifique un marcador seleccionable que puede utilizarse para controlar la integración. Habitualmente, se incluyen varios kilobases de ADN flanqueante sin alterar (tanto en el extremo 5' como en el 3') en el vector [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector es introducido en una estirpe de células madre embrionarias no humanas (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado de manera homóloga con el ADN endógeno [véase, por ejemplo, Li y otros, Cell 69: 915 (1922)]. Las células seleccionadas son a continuación inyectadas en un blastocisto de un animal no humano (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Pratical Approach, E.J. Robertson, ed. (JRL. Oxford. 1987), págs. 118-152]. A continuación puede implantarse un embrión híbrido no humano en una hembra no humana de acogida seudopreñada adecuada y llevar el embrión a término para crear un animal no humano con genes inactivados. La progenie que incluye el ADN recombinado de manera homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contengan el ADN recombinado homólogamente. Los animales no humanos con genes inactivado pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse ante determinadas patologías y por la aparición de patologías debidas a la ausencia de polipéptidos PRO358.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido Toll descrito en la presente también puede utilizarse en terapia génica. En las aplicaciones de la terapia génica, los genes se introducen dentro de células para conseguir la síntesis in vivo de un producto genético, terapéuticamente eficiente, por ejemplo para la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional en la que el efecto duradero se consigue mediante un único tratamiento y la administración de agentes terapéuticos genéticos, que implica la administración en una sola vez o repetida de un ADN o un ARNm terapéuticamente eficaz. Pueden utilizarse ARN y ADN no codificantes como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de determinados genes in vivo. Ya se ha mostrado que los oligonucleótidos no codificantes cortos pueden ser importados a células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus concentraciones intracelulares bajas causadas por la reabsorción limitada por la membrana celular. (Zamecnik y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 4.143-4.146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para potenciar su reabsorción, por ejemplo sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos sin carga.

Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped pretendido. Entre las técnicas adecuadas para la transferencia in vitro de ácido nucleico en células de mamífero se incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio, etc. Entre las técnicas de transferencia in vivo de genes preferidas se incluyen la transfección con vectores víricos (habitualmente retrovirales) y la transfección mediada por liposomas proteínicos de cubierta vírica (Dzau y otros, Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1998]). En algunas situaciones es deseable proporcionar a la fuente de ácidos nucleicos un agente que actúe sobre las células diana, tal como un anticuerpo específico para un una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor de la célula diana, etc. Cuando se utilizan liposomas, pueden utilizarse proteínas que se unen a la proteína de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para dirigir y/o facilitar la reabsorción, por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos trópicos de la misma para un tipo particular de célula, anticuerpos para proteínas que sufren interiorización en los ciclos, proteínas que actúan en localizaciones intracelulares y que potencian la semivida intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por receptores se describe, por ejemplo, en Wu y otros, J. Biol.Chem. 262, 4.429-4.432 (1987); y Wagner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3.410-3.414 (1990). Para una revisión de los protocolos actualmente conocidos de marcado genético y terapia génica véase Anderson y otros, Science 256, 608-813 (1992).

Los diversos usos enumerados en relación con las proteínas Toll de la presente, también se hallan disponibles para agonistas de los receptores Toll nativos, que emulan por lo menos una función biológica de un receptor Toll nativo.

F. Anticuerpos antiproteína Toll

La presente invención proporciona además anticuerpos antiproteína Toll. Entre los ejemplos de anticuerpos se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos antiproteínas Toll pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden hacerse crecer en mamíferos, por ejemplo, por medio de una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, de un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Entre los ejemplos de tales proteínas inmunógenas se incluyen pero no exclusivamente hemocianina de lapa, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse se incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trealosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por cualquier experto en la materia.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos antiproteínas Toll pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridoma tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En el procedimiento de hibridoma habitualmente se inmuniza un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfócitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unen específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.

El agente inmunizante habitualmente incluirá los polipéptidos PRO358 o una proteína de fusión de los mismos. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica (PBL) si se desean células de origen humano o células del bazo o células de los nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación se fusionan los linfocitos con una estirpe celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press. (1986), págs. 59-103]. Las estirpes celulares inmortalizadas habitualmente se transforman en células de mamíferos, en particular células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan estirpes celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo estable que preferiblemente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células paternas carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), las cuales sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las estirpes celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, sostienen un nivel elevado estable de expresión de anticuerpo mediante las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las estirpes celulares inmortalizadas preferidas son estirpes murinas de mieloma que pueden obtenerse, por ejemplo, en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, y en la American Type culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito estirpes celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-murino para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3.001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) págs. 51-63].

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma puede analizarse a continuación para ver si hay presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO358. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante análisis de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Tales técnicas y análisis son conocidos en el estado de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Una vez identificadas las células de hibridoma deseadas, pueden subclonarse los clones limtando los procedimientos de dilución y crecimiento mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo, medio modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, pueden cultivarse células de hibridoma in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o líquido ascítico mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, columna de sefarosa-proteína A, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de EE.UU. US 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que a continuación son transfectados a células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que por otro lado no producen proteína inmunoglobulínica, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [patente de EE.UU. US 4.816.567; Morrison y otros, supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulínico. Dicho polipéptido no inmunoglobulínico puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación al antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se halla truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc de modo que se impide el entrecruzamiento de las cadenas pesadas. Alternativamente, los residuos relevantes de cisteína son sustituidos por otro residuo de aminoácido o son eliminados para evitar el entrecruzamiento.

Los procedimientos in vitro son también adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, puede realizarse utilizando técnicas habituales conocidas en el estado de la técnica.

3. Anticuerpos humanizados y humanos

Los anticuerpos anti-Toll de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata o un conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de entramado Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos equivalentes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias de entramado. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, de los dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR equivalen a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de manera ótpima también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. On. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el estado de la técnica. Generalmente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que no es humana. A menudo se hace referencia a estos residuos de aminoácidos no humanos como residuos "importados", que habitualmente se han tomado de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo fundamentalmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y otros, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239:1.534-1.536 (1988)] por sustitución de las CDR o las secuencias de las CDR de roedor por las secuencias equivalentes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. US 4.816.567), en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia equivalente de una especie no humana. A la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

También pueden producirse anticuerpos humanos utilizando varias técnicas conocidas en el estado de la técnica, entre las que se incluyen genotecas fágicas [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:881 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Las técnicas de Cole y otros y de Boerner y otros también se hallan disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y otros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner y otros, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. Asimismo, pueden crearse anticuerpos humanos introduciendo locus de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de la inmunoglobulina endógena han sido parcialmente o totalmente inactivados. Ante la exposición a microbios, se observa producción de anticuerpos humanos, que recuerda mucho la observada en humanos en todos los sentidos, incluso en lo que respecta a reorganización, montaje y repertorio de anticuerpos. Este método se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. US 5.545.807; US 5.545.806; US 5.569.825; US 5.625.126; US 5.683.425; US 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas; Marks y otros, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg y otros, Nature 368 856-869 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild y otros, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En este caso, una de las especificidades de unión puede ser para la proteína PRO358, la otra para cualquier otro antígeno y preferiblemente para una proteína o un receptor o una subunidad del receptor de superficie celular. También es posible preparar anticuerpos biespecíficos que tengan especificidades para dos proteínas de tipo Toll distintas, tales como, cualquiera de los dos homólogos Toll descritos en la presente solicitud, o una proteína Toll descrita en la presente invención, y una proteína Toll conocida en el estado de la técnica, por ejemplo TLR2. Dichos anticuerpos biespecíficos podrían bloquear la identificación de distintos patrones patógenos mediante receptores Toll y, por lo tanto, se espera que tengan ventajas considerables en el tratamiento de la septicemia y el choque septicémico.

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en el estado de la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de la inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tengan especificidades distintas [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Dada la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos parecidos en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993 y en Traunecker y otros, EMBO J., 10:3.655-3.659 (1991).

Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominios constantes de la inmunoglobulina. La fusión se lleva a cabo preferiblemente con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones CH2 y CH3 de la bisagra. Se prefiere que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan a un organismo huésped adecuado. Para otros detalles sobre anticuerpos biespecíficos "gonetating" véase, por ejemplo, Suresh y otros, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se hallan dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos han sido propuestos para dirigir, por ejemplo, células del sistema inmunitario contra células no deseadas [patente de EE.UU. US 4.676.9801] y para el tratamiento de la infección del VIH [documento WO 91/00360: documento WO 921200378; EP 03089]. Está contemplado que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluidos aquellos en los que intervienen agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, puede construirse una inmunotoxina utilizando una reacción de intercambio disulfuro o formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. US 4.676.980.

G. Usos de los anticuerpos proteínicos anti-Toll

Los anticuerpos anti-Toll de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos anti-PRO358 en análisis de diagnóstico para PRO358, por ejemplo, que detectan su expresión en células, tejidos o suero específicos. Pueden utilizarse varias técnicas de análisis de diagnóstico conocidas en el estado de la técnica, tales como análisis de unión competitiva, análisis sandwich directo o indirecto y análisis de inmunoprecipitación realizados en las fases heterogénea u homogénea [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987), págs. 147-158]. Los anticuerpos utilizados en los análisis de diagnóstico pueden marcarse con una parte detectable. La parte detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la parte detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica para conjugar el anticuerpo con la parte detectable, incluidos los procedimientos descritos por Hunter y otros, Nature, 144:945, (1962); David y otros, Biochemistry, 13:1.014 (1974); Pain y otros, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos anti-PRO358 también son útiles para la purificación de afinidad de estas proteínas procedentes de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra estas proteínas Toll son inmovilizados sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o un filtro de papel, utilizando procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. A continuación se pone el anticuerpo inmovilizado en contacto con una muestra que contenga lo que hay que purificar y, a continuación, se lava el soporte con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto la proteína PRO358, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, se lava el soporte con otro solvente adecuado que liberará la proteína del anticuerpo.

El receptor anti-Toll (es decir, los anticuerpos anti-PRO358) también puede ser útil para bloquear las actividades biológicas de los respectivos receptores Toll. Se cree que la función principal de la familia de receptores Toll es actuar como receptores de identificación del modelo patógeno percibiendo la presencia de un modelo molecular conservado presente en los microbios. Los lipopolisacáridos (LPS, también conocidos como endotoxinas), moléculas potencialmente letales producidas por diversas bacterias, se unen a la proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP) en la sangre. El complejo formado activa a continuación un receptor conocido como CD14. No hay consenso en la técnica sobre qué es lo que ocurre a continuación. Según una hipótesis, el CD14 no instruye directamente a los macrófagos a producir citocinas, proteínas de adhesión celular y enzimas implicadas en la producción de mediadores proinflamatorios de bajo peso molecular, sino que más bien permite que el LPS active un segundo receptor. Alternativamente, se ha sugerido que el LPS puede activar determinados receptores directamente, sin ayuda de LBP o CD14. Los datos descritos en la presente solicitud indican que los receptores humanos de tipo Toll son receptores de señalación que son activados por LPS de un modo sensible a LBP y CD14. Puesto que en condiciones fisiopatológicas este mecanismo puede llevar a un síndrome a menudo mortal denominado choque septicémico, los anticuerpos que actúan contra los receptores Toll (igual que otros antagonistas de receptores Toll) podrían ser útiles en el tratamiento del choque septicémico. Se ha previsto que los distintos receptores Toll podrían identificar distintos microorganismos patógenos, por ejemplo, varias cepas de bacterias gramnegativas o grampositivas. Por consiguiente, en determinadas situaciones, puede ser deseable el tratamiento combinado con una mezcla de anticuerpos que se unan específicamente a distintos receptores Toll, o el uso de anticuerpos anti-Toll biespecíficos.

En la presente se ha manifestado específicamente que se cree que los anticuerpos anti-huTLR2 son útiles específicamente en el bloqueo de la inducción de este receptor por parte de LPS. Ya que se ha mostrado que la exposición a LPS puede llevar a choque septicémico (Parrillo, N. Engl. J. Med. 328, 1.471-1.477 [1998]), los anticuerpos anti-huTLR2 son potencialmente útiles en el tratamiento del choque septicémico.

Los siguientes usos terapéuticos y diagnóstico enumerados en relación con los anticuerpos que actúan contra los receptores Toll también son aplicables a otros antagonistas Toll, es decir, otras moléculas (proteínas, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc.) que bloquean la activación y/o transducción de señal de los receptores Toll mediada por receptores Toll.

En vista de sus potenciales terapéuticos, las proteínas Toll (incluidas las variantes de los homólogos Toll nativos) y sus agonistas y antagonistas (incluidos pero no exclusivamente los anticuerpos anti-Toll) se hallan incorporadas en composiciones adecuadas para uso terapéutico. Se preparan composiciones terapéuticas para almacenar mezclando el ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con los portadores, excipientes o estabilizantes optativos fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.ª ed., Osol, A. Ed. 1980) en forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos, a las dosis y concentraciones utilizadas, para los receptores, y entre ellos se incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes entre los que se incluye el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos entre los que se incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes azucarados tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tal como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween, Pluronics o PEG.

Los ingredientes activos también pueden comprimirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de polimetilmetacrilato, respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en: Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Las formulaciones que se utilicen en la administración in vivo tienen que ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y la reconstitución.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención generalmente se colocan en un contenedor que tenga un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o un vial de solución intravenosa que tenga un tapón que pueda ser agujereado por una aguja hipodérmica.

La vía de administración va de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesiva, administración tópica, o mediante sistemas de liberación prolongada.

Entre los ejemplos adecuados de preparados de liberación prolongada se incluyen matrices de polímeros semipermeables presentados como artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre las matrices de liberación prolongada se incluyen poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (patente de EE.UU. US 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (U. Sidman y otros, Biopolymers 22 (1): 547-556 [1983]), poli (2-hidroxietilmetacrilato) (R. Langer y otros, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 [1981] y R. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 [1982]), etileno vinil acetato (R. Langer y otros, Id.) o poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico (EP 133.988). Las composiciones de liberación prolongada también comprenden liposomas. Los liposomas que contienen una molécula dentro del alcance de la presente invención se preparan mediante procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3.688-3.692 (1985); Hwang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4.030-4.034 (1980); EP 52322; EP 36676A; EP 88046; EP 143949; EP 142641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de EE.UU. US 4.485.045 y US 4.544.545; y EP 102.324. Ordinariamente los liposomas son del tipo unilaminar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms) en los que el contenido en lípidos es superior a 30 mol, colesterol (%), ajustando la proporción seleccionada para el tratamiento NT-4 óptimo.

Una cantidad efectiva del ingrediente activo dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la enfermedad del paciente. Por consiguiente, será necesario que el terapeuta titule la posología y modifique la vía de administración tal como se requiere para obtener un efecto terapéutico óptimo. Una posología diaria habitual oscilaría entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Habitualmente el médico administrará una molécula de la presente invención hasta que se alcance una dosis que proporcione el efecto biológico deseado. El progreso de este tratamiento se controla fácilmente mediante análisis convencionales.

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos, y de ningún modo se pretende limitar el alcance de la presente invención.

Todas las patentes y referencias bibliográficas mencionadas en la presente memoria son incorporadas por la presente en su totalidad como referencia.

Ejemplos

Los reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a no ser que se indicara de otro modo. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la memoria, con números de adquisición ATCC es la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc que codifican PRO358 humano

Se utilizaron las secuencias de dominio extracelular (ECD) (incluida la secuencia de señal de secreción, si la había) de miembros conocidos de la familia de receptores Toll para buscar bases de datos EST. Entre las bases de datos EST se incluyeron bases de datos EST públicas (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST privada (LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 [Altschul y otros, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias de proteínas EST con 6 marcos de traducción de las secuencias EST. Aquellas comparaciones que dieron una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o mayor que no codificaba proteínas conocidas fueron agrupadas y reunidas en secuencias consenso de ADN con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington).

Se identificó una EST en la base de datos Incyte (INC3115949).

A partir de la secuencia EST, se sintetizaron oligonucleótidos para identificar mediante RCP una genoteca de ADNc que contuviera la secuencia de interés y para utilizarlos como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante en toda su longitud del PRO358.

\vskip1.000000\baselineskip

Se sintetizaron un par de cebadores RCP (directo e inverso):

TCCCACCAGGTATCATAAACTGAA

(SEC ID N.º:15)

\vskip1.000000\baselineskip

TTATAGACAATCTGTTCTCATCAGAGA

(SEC ID N.º:16)

\vskip1.000000\baselineskip

También se sintetizó una sonda:

AAAAAGCATACTTGGAATGGCCCAAGGATAGGTGTAAATG

(SEC ID N.º:17)

\vskip1.000000\baselineskip

Para cribar varias genotecas en busca de una fuente de un clon en toda su longitud, se cribó ADN de las genotecas mediante amplificación RCP con el par de cebadores RCP identificados anteriormente. A continuación se utilizó una genoteca positiva para aislar clones que codificaran el gen PRO358 utilizando los oligonucleótidos de la sonda y uno de los cebadores RCP.

El ARN para la construcción de las genotecas de ADNc se aisló de médula ósea humana (LIB256). Las genotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc fue cebado con oligo dT que contenían un sitio NotI, unido a adaptadores hemiquinasa blunt a SalI, escindido con NotI, separado por tamaño apropiadamente con electroforesis en gel y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor del pRK5D que no contiene el sitio SfiI; véase Holmes y otros, Science, 253:1.278-1.280 (1991)) en los sitios únicos Xho y NotI.

La secuenciación de ADN de los clones aislados, tal como se ha descrito anteriormente, dio la secuencia de ADN en toda su longitud para el PRO358 (figuras 13A y 13B, SEC ID N.º:14) y la secuencia de proteínas derivada para el PRO358 (figuras 12A y 12B, SEC ID N.º:13).

La secuencia de nucleótidos completa del clon identificado (ADN47361) se muestra en la figura 13A-B (SEC ID N.º:14). El clon ADN47361 contiene un solo marco de lectura abierto con un sitio de inicio de traducción aparente (señal de inicio ATG) en las posiciones de nucleótidos que aparecen subrayadas en las figuras 13A y 13B. El precursor predicho del polipéptido tiene una longitud de 811 aminoácidos, que incluye una secuencia señal supuestamente existente (aminoácidos 1 a 19), un dominio extracelular (aminoácidos 20 a 575, incluidas repeticiones ricas en leucina en la región que va de la posición 55 a la posición 575), un dominio transmembrana supuestamente existente (aminoácidos 576 a 595). El clon ADN47361 (designado ADN47361-1249) ha sido depositado con ATCC y se le ha asignado el n.º de depósito ATCC 209431.

Según un análisis de alineación de secuencia BLAST y FastA (utilizando el programa informático ALIGN) de la secuencia del PRO286 en toda su longitud, se trata de un análogo humano de la proteína Toll de Drosophila y es homólogo a las siguientes proteínas Toll humanas: Toll1 (ADNX n.º HSU88540-1, que es idéntico al ADNc n.º HUMRSC786-1 aleatorio secuenciado en toda su longitud); Toll2 (ADNX n.º HSU88878-1); Toll3 (ADNX n.º HSU88879-1); y Toll4 (ADNX n.º HSU88880-1).

Ejemplo 2 Uso de ADN PRO358 como sonda de hibridación

El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica el PRO358 como sonda de hibridación. En la siguiente descripción, se hace referencia a estas proteínas en conjunto como "homologos Toll".

El ADN que comprende la secuencia codificante de un homólogo Toll se utiliza como sonda para cribar ADN homólogos (tales como los que codifican variantes de aparición natural de estas proteínas Toll concretas en genotecas de ADNc de tejidos humanos o genotecas genómicas de tejidos humanos.

La hibridación y lavado de filtros que contienen cualquiera de los ADN de genotecas se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones elevada rigurosidad. La hibridación de una sonda derivada de homólogos Toll radiomarcada frente a los filtros se lleva a cabo en una solución de formamida al 50%, BSC 5x, SDS al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,8, solución Denhardt 2x y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se lleva a cabo en una solución acuosa de SSC 0,1x y SDS 0,1% a 42ºC.

A continuación, pueden identificarse los ADN que tienen una secuencia de identidad deseada con el ADN que codifica un homólogo Toll de secuencia nativa en toda su longitud utilizando técnicas estándar conocidas en el estado de la técnica.

Ejemplo 3 Expresión del PRO358 en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glucosilada del PRO358 ("homólogos Toll") mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica un homólogo Toll se amplifica inicialmente utilizando cebadores RCP seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios en la enzima de restricción que correspondan a los sitios en la enzima de restricción del vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector adecuado es el pBR322 (procedente de E. coli; véase Bolivar y otros, Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina. El vector es digerido con enzima de restricción y desfosforilado. A continuación se ligan las secuencias amplificadas de la RCP al vector. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifiquen un gen con resistencia a antibióticos, un promotor trp, una líder con cola poli-his (que incluye los primeros seis codones STII, una secuencia poli-his y un sitio de escisión enteroquinasa), la región codificante, el finalizador lambda de la transcripción y un gen argU.

La mezcla de ligación se utiliza a continuación para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook y otros, supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas LB y a continuación se selecionan colonias resistentes a antibiótico. El ADN plásmido puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Los clones seleccionados pueden dejarse crecer durante toda la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB complementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche puede utilizarse posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación se deja que las células crezcan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual se pone en marcha el promotor de expresión.

Después de cultivar las células durante varias horas más, pueden recogerse las células mediante centrifugación. El sedimento celular obtenido mediante centrifugación puede solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en el estado de la técnica y a continuación puede purificarse el homólogo Toll solubilizado utilizando una columna de quelantes de metales bajo condiciones que permitan la unión fuerte de la proteína.

Ejemplo 4 Expresión del PRO358 en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glucosilada del PRO358 ("homólogos Toll") mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN que codifica el homólogo Toll está unido al pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN que codifica homólogos Toll utilizando procedimientos de ligación tales como los descritos en Sambrook y otros, supra. El vector resultante se denomina pRK5-PRO358.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) son cultivadas hasta confluencia en placas de cultivo tisular en un medio tal como DMEM complementado con suero fetal de ternera y, opcionalmente, con componentes nutrientes y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN pRK5-PRO358 con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya y otros, Cell, 31:643 (1982)] y se disuelven en 600 ml de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se permite que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. Se suspende el precipitado y se añade a las células 298 y se permite que asiente durante aproximadamente cuatro horas a 87ºC. El medio de cultivo se extrae y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación se lavan las células 293 con un medio sin suero, se añade un medio fresco y se incuban las células durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se elimina el medio de cultivo y se sustituye por un medio de cultivo (solo) o por un medio de cultivo que contenga 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, se concentra en un filtro de centrifugación y se carga frente a un gel SDS al 15%. El gel procesado puede desecarse y exponerse a una película durante un período de tiempo seleccionado para confirmar la presencia de polipéptido. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a otra incubación (en medio sin suero) y el medio se prueba en bioanálisis seleccionados.

En una técnica alternativa, puede introducirse transitoriamente un ADN homólogo Toll en células 293 utilizando el procedimiento de sulfato dextrano descrito por Somparyrac y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7.575 (1981). Se cultivan las células 293 hasta una densidad máxima en un matraz de agitación y se añaden 700 mg de ADN pRK5-PRO(358). Las células se concentran en primer lugar en el matraz de agitación mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba sobre el sedimento celular durante cuatro horas. Las células son tratadas con glicerol al 20% durante 90 segundos, lavadas con medio de cultivo tisular y reintroducidas en el matraz de agitación que contiene medio de cultivo tisular, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de aproximadamente cuatro días, se centrifuga el medio condicionado y se filtra para eliminar células y residuos. A continuación puede concentrarse y purificarse la muestra que contiene el homólogo Toll expresado correspondiente mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.

En otra realización, los homólogos Toll pueden expresarse en células CHO. Los vectores pRK5 pueden transfectarse a células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio puede ser sustituido por medio de cultivo (solo) o por medio que contenga un radiomarcador tal como ^{35}S-metionina. Tras determinar la presencia del polipéptido PRO358, puede sustituirse el medio de cultivo por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y a continuación se recoge el medio condicionado. A continuación puede concentrarse y purificarse el medio que contiene el homólogo Toll expresado mediante cualquier procedimiento seleccionado.

Los homólogos Toll etiquetados con epítopo también pueden expresarse en células huésped CHO. El ADN homólogo Toll puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto de subclon puede someterse a RCP para que se fusione en marco con una etiqueta con epítopo seleccionada, tal como una cola poli-his en un vector de expresión de baculovirus. A continuación puede subclonarse el inserto etiquetado poli-his en un vector de transmisión SV40 que contenga un marcador de selección tal como DHFR para seleccionar clones estables. Por último, pueden transfectarse las células CHO (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector de transmisión SV40. Puede llevarse a cabo el marcado, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. A continuación puede concentrarse y purificarse el medio que contiene el homólogo Toll etiquetado poli-his expresado mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad quelante-Ni^{2+}.

Ejemplo 5 Expresión del PRO358 en levaduras

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante del PRO358 ("homólogos Toll") en levaduras.

En primer lugar, se construyen vectores de expresión de levaduras para la producción o secreción intracelular de un homólogo Toll a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el homólogo Toll deseado, el péptido señal seleccionado y el promotor se insertan en sitios adecuados de la enzima de restricción en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular. Para la secreción, el ADN que codifica el homólogo Toll seleccionado puede clonarse en el plásmido seleccionado junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder que secreta el factor alfa de la levadura y las secuencias enlazadoras (si son necesarias) para su expresión.

A continuación pueden transformarse células de levaduras, tales como la cepa de levadura AB110, con el plásmido de expresión descrito anteriormente y cultivado en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levaduras transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separarse mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tinción de azul de Coomassie.

Posteriormente pueden aislarse y purificarse los homólogos Toll recombinantes eliminando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y concentrando a continuación el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene el homólogo Toll puede además purificarse utilizando resinas seleccionadas de cromatografía de columna.

Ejemplo 6 Expresión del PRO358 en células de insecto infectadas con baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante del PRO358 ("homólogos Toll") en células de insecto infectadas con baculovirus.

La secuencia codificante del homólogo Toll se fusiona por encima de una etiqueta con epítopo que contiene con un vector de expresión de baculovirus. Entre tales etiquetas con epítopo se incluyen etiquetas poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de la IgG). Pueden utilizarse una variedad de plásmidos, incluidos plásmidos procedentes de un plásmido comercialmente disponible tal como pVL1393 (Novagen). En resumen, la secuencia codificante del homólogo Toll o la parte deseada de la secuencia codificante (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular) es amplificada mediante RCP con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionadas). A continuación se digiere el producto con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera cotransfectando el plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible en GIBCO.BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, se recogen los virus liberados y se utilizan para posteriores amplificaciones. La infección vírica y la expresión de proteínas se llevan a cabo tal como describieron O'Reilley y otros, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

A continuación puede purificarse el homólogo Toll etiquetado poli-his expresado mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad quelante-Ni^{2+} tal como sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9 recombinantes infectadas con virus tal como se describe en Rupert y otros, Nature, 362:175-179 (1998). En resumen, se lavan las células Sf9, se resuspenden en tampon de sonicación (25 ml HEPES, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,40 M) y se homogeneizan con ultrasonidos dos veces durante 20 segundos en hielo. Los homogeneizados con ultrasonidos se eliminan mediante centrifugación y se diluye el sobrenadante 50 veces en un tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa NTA-Ni^{2+} (comercialmente disponible en Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en una columna a 0,5 ml por minuto. Se lava la columna hasta el valor inicial A_{280} con tampón de carga, en cuyo punto inicia la recogida de fracciones. A continuación se lava la columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0) que eluye de manera inespecífica la proteína unida. Después de alcanzar nuevamente el valor inicial A_{280}, se elabora la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 600 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción de plata o análisis de inmunotransferencia con NTA-Ni^{2+} conjugada con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el polipéptido etiquetado con His_{10} eluido son agrupadas y dializadas de nuevo frente al tampón de carga.

Alternativamente, puede llevarse a cabo la purificación de los homólogos Toll etiquetados con IgG (o etiquetados con Fc) utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluidas por ejemplo, cromatografía en columna con proteína A o proteína G.

Ejemplo 7

(Ejemplo de referencia)

Análisis NF-\kappaB

Igual que la señal de las proteínas Toll a través de la vía NF-\kappaB, su actividad biológica puede comprobarse en un análisis NF-\kappaB. En este análisis la células Jurkat son transfectadas transitoriamente utilizando reactivo de lipofectamina (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante, se cotransfecta 1 \mug de plásmido gB2XLuc que contiene el gen de transmisión de la luciferasa NF-\kappaB con 1 \mug de vector de expresión pSR\alphaN con o sin el inserto que codifica el PRO285 o el PRO286. Para un control positivo, se tratan las células con PMA (forbol miristil acetato; 20 ng/ml) y PHA (fitohemaglutinina; 2 \mug/ml) durante un período de tres a cuatro horas. Al cabo de 2 o 3 días se lisan las células para cuantificar la actividad luciferasa utilizando reactivos de Promega.

Ejemplo 8 Preparación de anticuerpos que se unen al PRO358

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente al PRO358 ("homólogos Toll").

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen homólogos Toll purificados, proteínas de fusión que contienen el homólogo Toll deseado y células que expresan homólogos Toll recombinantes en la superficie celular. La selección de un inmunógeno puede llevarla a cabo cualquier experto en la materia.

Se inmuniza a ratones, tales como Balb/c, con el inmunógeno de homólogo Toll emulsionado en adyuvante completo de Freund que se les inyecta por vía subcutánea o intraperitoneal en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, se emulsiona el inmunógeno en adyuvante MPL-TDM (Ribi, Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas de las patas traseras del animal. A continuación, al cabo de 10 a 12 días, los ratones inmunizados reciben una inyección de recuerdo con más inmunógeno emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir más inyecciones de inmunización de refuerzo. Periódicamente pueden obtenerse muestras séricas de ratones mediante sangrado retroorbitario de prueba en análisis ELISA para detectar anticuerpos.

Tras la detección de un título de anticuerpos adecuado, puede inyectarse a los animales "positivos" para anticuerpos una última inyección intravenosa de homólogo Toll. Al cabo de tres o cuatro días, se sacrifican los ratones y se recogen las células del bazo. A continuación se fusionan las células del bazo (utilizando polietilenglicol al 35%) para un mieloma murino seleccionado: estirpe celular tal como P3X63AgU.1, disponible en ATCC, n.º CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que a continuación pueden colocarse en placas de cultivo celular de 96 pocillos que contengan medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Las células de hibridoma se someten a cribado en un ELISA en busca de reactividad contra el homólogo Toll correspondiente. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secreten los anticuerpos monoclonales deseados contra un homólogo Toll forma parte de las habilidades en el estado de la técnica.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse por vía intraperitoneal a ratones singeneicos Balb/c para producir ascitis que contenga anticuerpos monoclonales del homólogo anti-Toll. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraces o en botellas de rodillo de cultivo celular. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en el asicitis puede llevarse a cabo utilizando precipitación de sulfato de amonio, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a la proteína A o a la proteína G.

Ejemplo 9 Señalación celular inducida por lipopolisacáridos (LPS) mediada por HuTLR2 Procedimientos

Los reactivos marcados con ^{3}H, los no marcados, los LPS LCD25 y R595 de S. minnesota procedían de List Biochemicals (Campbell, CA) y todos los demás LPS procedían de Sigma Chemical Co, (St. Louis, MO). El LP se suministró como medio condicionado procedente de células 293 transfectadas con un vector de expresión LBP humano. La proteína de fusión TLR2-Fc se produjo mediante sistema de baculovirus y se purificó tal como se describe en Mark y otros, J. Biol. Chem. 269, 10.720-10.728 (1994).

La construcción de ADNc de plásmidos de expresión A que codifican TLR2 humano se clonó a partir de una genoteca de pulmón fetal humano. La secuencia de aminoácidos se correspondía con la secuencia publicada anteriormente (Rock y otros, supra), a excepción de una sustitución glu a asp en el aminoácido 726. La versión con etiqueta con epítopo en el aminoácido terminal de TLR2 (dG, TLR2) se construyó añadiendo un sitio de restricción XhoI inmediatamente por encima de leucina en la posición 17 (el primer aminoácido de la forma madura predicha de TLR2) y uniéndolo a aminoácidos 1-58 de una glucoproteína D de tipo 1 del virus del herpes simple tal como se describe en Mark y otros, supra. Los productos RCP se secuenciaron y subclonaron en un vector de expresión de mamíferos que contiene el gen de resistencia a la puromicina. Las variantes de truncación en carboxiterminales de gD.TLR2 se construyeron mediante digestión del ADNc en el sitio BlpI (variante \Delta1) o NeiI (variante \Delta2) presentes en la secuencia codificante del dominio intracelular y en el sitio NotI presente en el polienlazador 3' del vector de expresión seguido de ligación de enlazadores oligonucleótidos.

\bullet1:	5'-TCA GCG GTA AGC-3'	(SEC ID N.º:18) y
	5'-GGC CGC TTA CCG C-3'	(SEC ID N.º:19)
\bullet2:	5'-TAA GCT TAA CG-3'	(SEC ID N.º: 20) y
	5'-GGC CGC TTA AGC TTA TGC A-3'	(SEC ID N.º: 21).

La quimera CD4/TLR2 se construyó mediante RCP y contenía 1.205 aminoácidos (el péptido señal y dos dominios de tipo inmunoglobulina) de CD4 humano fusionados con 588.784 aminoácidos (el dominio transmembrana y el intracelular) del TLR2 humano con una valina codificada por un enlazador en la zona de unión de las secuencias CD4 y TLR2. El plásmido indicador pGL3.ELAM.tk contenía la secuencia insertada entre los sitios SacI y HindIII de la luciferasa observada en el plásmido pGL3 (Promega).

1

La versión con etiqueta con epítopo carboxiterminal de LBP (LBP-FLAG) se construyó mediante RCP a través de la adición de un sitio Asc1 en lugar del codón de terminación nativo y el subclonado de este fragmento en pRK5.FLAG que produjo la adición carboxiterminal de aminoácidos GRA DYK DDD DK (SEC ID N.º: 23).

Las células renales embrionarias 293 humanas de estirpes/agrupaciones celulares estables se cultivaron en medios LGDMEM/HAM F12 (50:50) complementados con FBS al 10%, con glutamina 2 mM y con penicilina/estreptomicina. Para la expresión estable de gD.TLR2, se transfectaron células con el vector de expresión gD.TLR2 y se seleccionaron para resistencia a puromicina a una concentración final de 1 \mug/ml. Se aisló una agrupación estable de células (293-TLR2 pop1) mediante FACS utilizando un anticuerpo contra la etiqueta gD. Tanto el clon de células agrupadas como el de una sola célula (293-TLR clon 1) se caracterizaron mediante análisis FACS y de inmunotransferencia tal como se describe en Mark y otros, supra.

Las células 29332 parentales o estables del análisis de indicador de luciferasa y del análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (2 x 10^{5} células por pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos y se transfectaron el día siguiente con plásmidos de expresión, junto con 0,5 \mug del plásmido indicador de luciferasa pGL3-ELAM.tk y 0,05 \mug del vector indicador de luciferasa Renilla como control interno. Al cabo de 24 horas, se trataron las células con LPS, con LBP o con ambos LPS y LBP y se cuantificó la actividad del gen indicador. Los datos se expresan como actividad relativa de la luciferasa dividiendo la actividad luciferasa de luciérnaga con la de la luciferasa de Renilla. En el caso de EMSA, se prepararon extractos nucleares y se utilizaron en una reacción de unión a ADN con oligonucleótidos radiomarcados con ^{32}P en el extremo 5' que contenían un sitio de unión consenso NF-\kappaB (Santa Cruz Biotechnology, sc-2511). La identidad de NF-\kappaB en el complejo se confirmó mediante ensayo "supershift" de anticuerpos NF-\kappaB (datos no representados).

Expresión de ARN. El análisis tisular mediante método Northern se obtuvo de Clontech y se hibridó con una sonda que incluía el dominio extracelular de TRL2. Se aisló el ARNm poliadenilado a partir de células 293-TLR2 y los análisis mediante método Northern se llevaron a cabo con el fragmento de ADNc humano EL-8. La expresión de TLR2 se determinó utilizando tecnología cuantitativa "taqman^{TM}" en tiempo real de PCR y se analizaron en un detector de secuencias, modelo 770, (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) fundamentalmente tal como se ha descrito (Luoh y otros, J. Mol. Endocrinol. 18, 77-85 [1997]). Los cebadores directo e inverso, 5'-GCG GGA AGG ATT TTG GGT AA-3' SEC ID N.º: 24, y 5'-GAT CCC AAC TAG ACA AAG ACT GGT C-3' SEC ID N.º: 25 se utilizaron con una sonda de hibridación, 5'-TGA GAG CTG CGA TAA AGT CCT AGG TTC CCA TAT-3' SEC ID N.º: 26 marcada en el nucleótido 5' con un tinte indicador FAM y en el nucleótido 3' con un colorante de desactivación TAMRA. Los macrófagos/monocitos se trataron durante 16 horas con 1 \mug/ml de LPS.

Análisis de unión al receptor. Para determinar la unión directa, se mezclaron 20 ng de [^{3}H]-LPS con 600 ng de TLR2Fc en 100 ml de tampón de unión (NaCl 150 mM, Hepes 20 mM, BSA al 0,03%) que contenía 15 ml de sefarosa con proteína A. Al cabo de 3 horas de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las muestras de sefarosa con proteína A con PBS frío/NP-40 al 0,1% y se resuspendieron en un tampón de unión que incluía SDS al 1% y EDTA 25 mM y se contaron.

Resultados

En Drosophila, el receptor Toll receptor es necesario para la formación del patrón embrionario dorsoventral y también participa en una respuesta inmunitaria antifúngica en la mosca adulta. Belvin y Anderson, Ann. Rev. Cell. Biol. 12, 393-416 (1996); Lemaitre y otros, Cell 86, 973-983 (1996). Toll es una proteína transmembrana de tipo I que contiene un dominio extracelular con múltiples repeticiones ricas en leucina (LRR) y un dominio citoplasmático con homología de secuencia con el receptor de la interleucina-1 (IL-1R), y varias proteínas vegetales de resistencia a enfermedades. La activación de Toll lleva a la inducción de genes a través de la activación de la vía NF-\kappaB. Tal como se ha observado anteriormente, hay varios homólogos humanos que han sido clonados, algunos de los cuales se describen como nuevas proteínas en la presente solicitud. Estas proteínas humanas reflejan la estructura topográfica de su homólogo en Drosophila. Se ha observado que la sobreexpresión de un mutante esencialmente activo de un TLR (TLR4) humano conduce a la activación de NF-\kappaB y a la inducción de las citocinas inflamatorias y las moléculas coestimuladoras (Medzhitov y otros, y Rock y otros, supra).

Para analizar si los TLR humanos podrían intervenir en la activación celular inducida por LPS, investigamos en primer lugar la expresión de los TLR en una variedad de tejidos inmunitarios. Se observó que uno de los TLR, el TLR2, se expresaba en todos los tejidos linfoides analizados con el mayor nivel de expresión en los lecucoitos de sangre periférica (figura 5a). La expresión de TLR2 es abundante en monocitos/macrófagos, las células principales que expresan CD14 y las sensibles a LPS. Curiosamente, el TLR2 aumenta en la estimulación de monocitos/macrófagos aislados con LPS (figura 5b), de un modo parecido al que se ha observado para el CD14 (Matsuura y otros, Eur. J. Immunol. 22, 1.663-1.665 [1992]; Croston y otros, J. Biol. Chem. 270, 16.514-16.517 [1995]).

Este resultado nos incitó a determinar si el TLR2 interviene en la señalación celular mediada por LPS. Manipulamos células 293 renales embrionarias humanas para que expresaran una versión del TLR2 (gD.TLR2) que contuviera una etiqueta con epítopo aminoterminal. Se aisló una agrupación estables de clones, así como un clon individual, y se observó que expresaban una proteína nueva de aproximadamente 105 kDa (figura 6b) que concordaba con el tamaño predicho del TLR2 (-89 kDa) y la presencia de 4 posibles sitios para la glucosilación unida a N. Analizamos la respuesta de células 293 o 293-TLR2 y LBP cuantificando la expresión de un gen indicado dirigido por el potenciador sensible NF-\kappaB del gen de la selectina E (Croston y otros, Aunque ni el tratamiento con LPS ni el tratamiento con LBP solos produjeron activación génica significativa, la adición de ambos LPS y LPB produjo una inducción sustancial de la actividad del gen indicador en células que expresan TLR2, pero no en células 293 de control (figura 6a). Además, utilizando un análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA), se observó que el LPS, combinado con LBP, inducía actividad NF-\kappaB en células que expresan TLR2 (figura 6c). La cinética de la actividad NF-\kappaB inducida por LPS en células 293-TLR2 recordaba la de células mieloides y no mieloides (Delude y otros, J. Biol. Chem. 269, 22.253-22.260 [1994]; Lee y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9.930-9.934 [1993]) en aquella localización nuclear de NF-\kappaB es máxima dentro de los 30 minutos posteriores a la exposición a LPS. La activación de NF-\kappaB por LPS/LBP en células 293-TLR2 no requiere síntesis de proteínas de novo, ya que el pretratamiento con cicloheximida (figura 6c) o actinomicina D (no representado) no inhibe la activación NF-\kappaB.

Se ha observado que tanto la forma unida a membrana de CD14 (mCD14), que es presente en células mieloides, como la soluble de CD14 (sCD14), que es presente en plasma (Bazil y otros, Eur. J. Immunol. 16, 1.583-1.589 [1986]), potencian la sensibilidad de las células a LPS. Observamos que las células 293 expresan poco o nada CD14 en su superficie (datos no representados). No obstante, la transfección transitoria de células 293 cuyo mCD14 aumentaba la sensibilidad y la magnitud de TLR2 mediaba la sensibilidad a LPS (figura 6d).

Los datos presentados anteriormente indicaban que el TLR2 podría actuar como transductor de señalación para LPS. Para analizar la función del dominio intracelular de TLR2 en su intervención en la respuesta a LPS, determinamos si las variantes TLR2 con truncaciones carboxiterminales de 13 (TLR-\Delta1) o 141 (TLR2-\Delta2) aminoácidos podían regular el indicador ELAM en células 293 transfectadas transitoriamente. Observamos que ambas variantes con truncaciones carboxiterminales eran defectuosas para la activación del gen indicador aunque pudimos detectar expresión de estos receptores en la superficie de las células mediante análisis FACS (no representado) y mediante análisis de inmunotransferencia (figura 7c). La región del dominio intracelular eliminada en TLR-\Delta1 tiene un parecido sorprendente con una región del dominio intracelular IL-R1 que es necesaria para la asociación con la quinasa asociada a IL-R1 (IRAK) (Croston y otros, supra) (figura 7b). También demostramos la necesidad del dominio extracelular (ECD) de TLR2 para la sensibilidad a LPS porque una variante TLR2 en la que el ECD de TLR2 era sustituido por una parte del ECD de CD4 tampoco respondió a LPS (figuras 7a y 7b).

El LPS es un glucolípido complejo que consta de una parte proximal hidrófoba de lípido A, una región polisacárida distal hidrofílica de antígeno 0 y el oligosacárido nuclear que une las estructuras lípido A y antígeno 0. A diferencia de la parte de lípido A, hay una diversidad considerable en las estructuras de antígeno 0 de distintas bacteria gramnegativas. Se requiere lípido A para las respuestas LPS, y los tratamientos que eliminan las cadenas secundarias de ácidos grasos de lípido A inactivan el LPS. Comparamos la potencia del LPS preparado a partir de varias bacterias gramnegativas, así como el LPS que había sido "detoxificado" mediante hidrólisis alcalina. Observamos que el LPS aislado a partir de serotipo LCD25 de Escherichia coli era de casi dos órdenes de magnitud más potente que el LPS 055:B5 serológicamente distinto de Escherichia coli para activar el TLR2 (figura 8a). El LPS preparado a partir de LPS R595 de S. minnesota es también un potente inductor de la actividad TLR2, mientras que el TLR2 no respondió al "LPS detoxificado".

Analizamos si el TLR2 se une a LPS determinando si una forma soluble del dominio extracelular de TLR2 (TLR2-Fc) se unía a LPS marcado con ^{3}H en un análisis in vitro. Observamos que el LPS ^{3}H-LCD25 se unía a la proteína de fusión TLR2-Fc, pero no se unía a Fc sola o a proteínas de fusión que contuvieran el ECD de otros varios receptores (figura 8b). En esta unión se observaba competencia específica con LPS LCD25 frío pero no con LPS detoxificado. El análisis preliminar de la unión de LPS a TLR2-Fc sugiere que la Kd es relativamente baja (500-700 nM) y que la cinética de unión es muy lenta (datos no representados). Especulamos con la idea de que otras proteínas, tales como LBP, podrían actuar para estimular la unión de LPS a TLR2 in vivo, de un modo muy parecido a como actúa LBP para transferir LPS de su forma agregada (micela) libre a CD14. Esto concuerda con nuestros resultados in vivo que muestran que se requiere LBP para obtener una respuesta de sensibilidad de TLR2 a LPS (figura 6a).

El tratamiento ILS de macrófagos lleva a la expresión de numerosas citocinas inflamatorias. Tiene lugar un expresión parecida de TLR2 en células 293 en una inducción 100 veces mayor de ARNm de IL-8 en respuesta a LPS/LBP, mientras que el LPS detoxificado es inactivo en este análisis (figura 9).

Estos datos indican que el TLR2 desempeña un papel de vigilancia en la respuesta inmunitaria innata, la primera línea de defensa contra los microbios patógenos. El TLR2 y el CD14 se expresan ambos en células mieloides y su inducción es inducida de manera coordinada en el tratamiento LPS. La expresión de TLR2 en células no mieloides confiere sensibilidad a LPS a células normalmente no sensibles mediante un mecanismo que es dependiente de LBP y que es potenciado por la expresión de mCD14. El tratamiento LPS de células que expresan TLR2 produce activación de NF-\kappaB y la posterior inducción de genes que inician la respuesta adaptativa tal como IL-8 (figura 9). Nuestros datos indican que el TLR2 participa en ambas detectando la presencia de LPS y transmitiendo esta información por toda la membrana plasmática porque se requieren dominios extra e intracelular intactos para respuestas a LPS. Además, para la activación NF-\kappaB es necesaria una región en la cola carboxiterminal del TLR2 que tiene homología con una parte del ILR1 requerida para la asociación con IRAK.

El Toll de Drosophila y el receptor Wheeler 18 relacionado con Toll desempeñan un papel importante en la inducción de péptidos antimicrobianos en respuesta a bacterias y hongos, respectivamente. Medzhitov y otros, supra. Datos genéticos han implicado a Spätzle como ligando para Toll en el modelado dorsoventral y han llevado a la especulación de que un homólogo de Spätzle podría ser importante para la regulación de los TLR humanos en la respuesta inmunitaria. Nuestras observaciones de que la activación de TLR2 mediante LPS no es bloqueada por la cicloheximida y de que el dominio extracelular de TLR2 es un receptor de poca afinidad para el LPS in vitro concuerda con un modelo en el que el TLR2 participaba en la identificación de LPS. Nuestros datos no excluyen la posibilidad de que otras proteínas (tales como una homóloga de Spätzle) puedan modificar la respuesta de TLR2 a LPS. Observamos que aunque los dominios extracelulares de TLR2 y Toll de Drosophila contengan LRR, comparten menos de un 20% de identidad de aminoácidos. En segundo lugar, las proteínas LRR son receptores de identificación de patrones(PRR) para una variedad de tipos de moléculas, tales como proteínas, péptidos y carbohidratos. Dangl y otros, Cell 91, 17-24 (1997). En tercer lugar, el requisito de Spätzle en la respuesta inmunitaria de Drosophila es menos claro que para Toll. A diferencia de las anomalías en Toll, los mutantes Spatzle inducen niveles normales de los péptidos antimicrobianos defensina y atacina y sólo son parcialmente anormales en la expresión de cecropina A que sigue a la exposición fúngica, y no son anormales en la activación de Dorsal en respuesta a lesión. Lemaitre y otros, Cell 86, 973-983 (1996); Lemaitre y otros, EMBO J. 14, 536-545 (1995).

Tal como se ha observado antes, el TLR2 es miembro de una familia grande de receptores humanos relacionados con Toll, entre los que se incluyen los tres nuevos receptores (codificados por ADN47361, respectivamente) descritos específicamente en la presente solicitud. Los datos presentados en este ejemplo, así como las pruebas sobre la participación del TLR4 en la activación de genes sensibles a NF-\kappaB, indican que una función primaria de esta familia de receptores es actuar como receptores de identidicación de patrones que detectan la presencia de estructuras moleculares conservadas presentes en los microbios, originalmente indicado por Janeway y colaboradores (Medzhitov y otros, supra). La familia de los TLR humanos puede ser blanco de estrategias terapéuticas para el tratamiento del choque septicémico.

Ejemplo 10 Hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica poderosa y versátil para detectar y localizar secuencias de ácidos nucleicos dentro de preparados celulares o tisulares. Puede ser de utilidad, por ejemplo, identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución tisular de la transcripción, identificar y localizar la infección vírica, hacer un seguimiento de los cambios en la síntesis de ARNm específico y ayudar en la cartografía cromosómica.

La hibridación in situ se llevó a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994), utilizando ribosondas generadas por RCP y marcadas con ^{33}P. En resumen, se fijó formalina, se obtuvieron secciones de tejidos humanos incrustados en parafina, se desparafinaron, se desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC y además se procesaron para hibridación in situ tal como se describe en Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda no codificante marcada con UTP [^{33}P] a partir de un producto RCP y se hibridó a 65ºC durante toda una noche. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión de rastreo nuclear NTB2 Kodak y se dejaron expuestos durante 4 semanas.

Síntesis de ribosondas marcadas con ^{33}P

Se desecaron con un Speed-vac 6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2.000 Ci/mmol). A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP desecado se añadieron los siguientes ingredientes:

2,0 \mul de tampón de transcripción 5x1,0 \mul de DTT (100 mM)

2,0 \mul de mezcla NTP (2,5 mM : 10 \mu; cada uno de 10 mM GTP, CTP y ATP + 10 \mul H_{2}O)

1,0 \mul UTP (50 mM)

1,0 \mum de Rnasin

1,0 \mul de molde de ADN (1 \mug)

1,0 \mul H_{2}O

1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos RCP T3= AS, T7= S, habitualmente)

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Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadieron 1,0 \mul de DNasa RQ1, seguido de incubación a 37ºC durante 15 minutos, 90 \mul TE (Tris 10 mM pH 7,6/EDTA 1 mM pH 8,0) y se pipeteó la mezcla sobre papel DE81. El resto de solución se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó utilizando el programa 2 (3 minutos). Después de la última centrifugación de recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se hizo un recuento en 6 ml de Bioflúor II.

Se dejo correr la sonda sobre un gel TBE/urea. Se añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN Mrk III a 3 \mul de tampón de carga. Después de calentar en un bloque de calor a 95ºC durante tres minutos, el gel se colocó de inmediato sobre hielo. Se nivelaron los pocillos de gel, se cargó la muestra y se dejó correr a 180-250 voltios durante 45 minutos. Se envolvió el gel en envoltura de plástico y se expuso a película XAR con una pantalla intensificante en un congelador a -70ºC durante un período de una hora a toda la noche.

Hibridación con ^{33}P

Pretratamiento de secciones congeladas. Se extrajeron los portaobjetos del congelador, se colocaron sobre bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en una incubadora a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldheído al 4% sobre hielo en la campana de extracción de humos y vapores y se lavaron en SSC 0,5 x durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de SSC 20 x + 975 ml de H_{2}O SQ). Tras la desproteinización en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de disolución en 250 ml de tampón ARNasa precalentado sin RNasa), se lavaron las secciones en SSC 0,5 x durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95% y 100%, durante 2 minutos cada una.

Pretratamiento de las secciones incrustadas en parafina. Se desparafinaron los portaobjetos, se colocaron en H_{2}O SQ y se aclararon dos veces en SSC 2 x a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en 20 \mu/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón RNasa sin RNasa; 37ºC, 15 minutos) - embrión humano o proteinasa K 8 x (100 \mul en 250 ml de tampón Rnasa, 37ºC, 30 minutos) - tejidos de formalina. El posterior aclarado en SSC 0,5 x y la deshidratación se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente.

Prehibridización. Se dispusieron los portaobjetos en caja de plástico alineada con papel de filtro saturado con tampón Box (SSC 4 x, formamida al 50%). El tejido se cubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato dextrano + 6 ml H_{2}O SQ), se agitó en el vórtex y se calentó en el microondas durante 2 minutos con el tapón aflojado. Tras enfriar sobre hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de SSC 20 x y 9 ml de H_{2}O SQ, el tejido se agitó bien con el vórtex y se incubó a 42ºC durante un período de 1 a 4 horas.

Hibridación. Se calentó una sonda 1,0 x 10^{6} cpm y 1,0 \mul de ARNt (disolución 50 mg/ml) por portaobjetos a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjeto. Después de agitar con un vórtex, se añadieron 50 \mul de mezcla marcada con ^{33}P a 50 \mul de hibridación sobre el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron a 55ºC durante toda la noche.

Lavados. El lavado se llevó a cabo dos veces durante 10 minutos con SSC 2x, EDTA a temperatura ambiente (400 ml SSC 20 x + 16 ml EDTA 0,25 M, V_{f} =4 l), seguido de tratamiento RNasa a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón Rnasa =20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos con SSC 2 x, EDTA a temperatura ambiente. Las rigurosas condiciones de lavado fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, SSC 0,1 x, EDTA (20 ml SSC 20 x + 16 ml EDTA, V_{f} =4 l).

Resultados PRO 358 (ADN47361)

Se analizó el patrón de expresión del PRO358 (ADN47361) en tejidos humanos adultos y fetales. Se utilizaron las siguientes sondas, sintetizadas a partir de la secuencia de ADN47361 en toda su longitud.

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Oligo 1:

\hskip0,2cm

GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG CAA TAA ACT GGA GAC ACT

\hskip0,2cm

(SEC ID N.º: 29)

Oligo 2:

\hskip0,2cm

CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TTG AGT TGT TCT TGG GTT GTT

\hskip0,2cm

(SEC ID N.º: 30)

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En este experimento, se halló expresión en tejido linfoide asociado a intestino y en pulpa blanca esplénica en desarrollo en el feto. Se observó un nivel reducido de expresión en la región pALS de bazo adulto normal. Aunque todos los otros tejidos eran negativos, es posible que pudieran observarse niveles bajos de expresión en otros tejidos bajo condiciones más sensibles.

Depósito del material

Los siguientes materiales han sido depositados en la American Type Culture Collection, 12801 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC): Depósito ATCC del material Fecha del n.º de depósito ADN47361-1249 209431 7 de noviembre de 1997.

Este depósito se realizó bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y sus regulaciones (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest y estará sujeto a un acuerdo entre Genentech Inc. y ATCC, que garantiza la disponibilidad pública permanente e ilimitada de la descendencia del cultivo del depósito al público desde la publicación de la patente de EE.UU. pertinente o desde la presentación pública de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o del extranjero, la que llegue primero, y garantiza la disponibilidad de la descendencia a uno determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas registradas de EE.UU. a ser autorizado a eso de acuerdo con 35 USC\NAK122 y las reglas del Comisionado conforme a eso (incluida 37 CFR\NAK1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud de patente ha acordado que si un cultivo de materiales en depósito muriera o se perdiera o destruyera habiendo sido cultivado en condiciones adecuadas, los materiales serán remplazados de inmediato tras notificación por otros de iguales. La disponibilidad del material depositado no tiene que entenderse como una autorización para poner en práctica la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes en materia de patentes.

La anterior memoria escrita se considera suficiente para permitir a un experto en la materia poner en práctica la invención. El alcance la presente invención no se ve limitado por la construcción depositada, ya que la realización depositada se considera una simple ilustración de algunos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente se halla dentro del alcance de esta invención. El depósito del material de la presente no constituye una aceptación de que la descripción escrita contenida en la presente sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluida la mejor manera de la misma, ni pretende su construcción limitar el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. En realidad, son varias modificaciones de la invención que además de las representadas y descritas en la presente serán claras para los expertos en la materia a partir de la descripción precedente y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias bibliográficas mencionada por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido una gran precaución al recopilar las referencias bibliográficas, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5864934 A [0054]

\bullet US 5545806 A [0132]

\bullet WO 8902922 A [0065]

\bullet US 5569825 A [0132]

\bullet US 5428130 A [0065]

\bullet US 5625126 A [0132]

\bullet US 3959642 A [0069]

\bullet US 5683425 A [0132]

\bullet US 3969287 A [0069]

\bullet US 5661016 A [0132]

\bullet US 3691016 A [0069]

\bullet WO 9308829 A [0134]

\bullet US 4195128 A [0069]

\bullet US 46769801 B [0136]

\bullet US 4247642 A [0069]

\bullet WO 9100360 A [0136]

\bullet US 4229637 A [0069]

\bullet WO 921200378 A [0136]

\bullet US 4055635 A [0069]

\bullet EP 03089 A [0136]

\bullet US 4330440 A [0069]

\bullet US 4676980 A [0136]

\bullet WO 8705330 A [0072]

\bullet US 3773919 A [0147]

\bullet US 4640835 A [0074]

\bullet EP 58481 A [0147]

\bullet US 4496689 A [0074]

\bullet EP 133988 A [0147]

\bullet US 4301144 A [0074]

\bullet DE 3218121 [0147]

\bullet US 4670417 A [0074]

\bullet EP 52322 A [0147]

\bullet US 4791192 A [0074]

\bullet EP 36676 A [0147]

\bullet US 4179337 A [0074]

\bullet EP 88046 A [0147]

\bullet US 5428180 A [0077]

\bullet EP 143949 A [0147]

\bullet WO 8905859 A [0085]

\bullet EP 142641 A [0147]

\bullet US 4399216 A [0085]

\bullet JP 58118008 A [0147]

\bullet US 5010182 A [0090]

\bullet US 4485045 A [0147]

\bullet EP 362179 A [0090]

\bullet US 4544545 A [0147]

\bullet WO 9013646 A [0090]

\bullet EP 102324 A [0147]

\bullet EP 36776 A [0094]

\bullet EP 307247 A [0170]

\bullet EP 78657 A [0096]

\bullet US 9821141 W [0226] [0227]

\bullet GB 2211504 A [0097]

\bullet WO 09105413 A [0226] [0227]

\bullet EP 117060 A [0100]

\bullet WO 60090863 A [0226] [0227]

\bullet EP 117058 A [0100]

\bullet WO 60083322 A [0226] [0227]

\bullet US 4736866 A [0114]

\bullet WO 60065311 A [0226] [0227]

\bullet US 4870009 A [0114]

\bullet WO 60062250 A [0226] [0227]

\bullet US 4816567 A [0127] [0127] [0131]

\bullet EP 05023238 A [0227]

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccaccagg tatcataaac tgaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatagacaa tctgttctca tcagaga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaagcata cttggaatgg cccaaggata ggtgtaaatg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagcggtaa gc

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgcttac cgc

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taagcttaac g

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgctaaa gcttatgca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: etiqueta sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: etiqueta sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggaagga ttttgggtaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcccaact agacaaagac tggtc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagagctgc gataaagtcc taggttccca tat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattctaat acgactcact atagggcaaa ctctgccctg tgatgtca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatgaaatt aaccctcact aaagggaacg agggcaattt ccacttag

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattctaat acgactcact atagggctgg caataaactg gagacact

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatgaaatt aaccctcact aaagggattg agttgttctt gggttgtt

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> GENENTECH, INC.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> HOMÓLOGOS HUMANOS DE TIPO TOLL

\vskip0.400000\baselineskip

<130> SJK/FP6335244

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 05023238.8

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1998-10-07

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US98/21141

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-10-07

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/105,413

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-06-26

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60,090,863

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-06-26

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/083,322

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-04-28

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/065,311

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-11-13

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/062,250

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1997-10-17

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ Versión 4.0 para Windows

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1049

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1041

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4199

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaagaccca gctgtgaccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccatgagc ctctgatggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttatgtct cgaggaaagg gactggttac cagggcagcc agttc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccgagacaa aaacgttctc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catccatgtt ctcatccatt agcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgacaacct catgcagagc atcaaccaaa gcaagaaaac agtatt

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2602

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 784

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 811

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccaccagg tatcataaac tgaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatagacaa tctgttctca tcagaga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaagcata cttggaatgg cccaaggata ggtgtaaatg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagcggtaa gc

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgcttac cgc

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taagcttaac g

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Enlazador sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgctaaa gcttatgca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Etiqueta sintética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

50

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<210> 23

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Etiqueta sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgggaagga ttttgggtaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcccaact agacaaagac tggtc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagagctgc gataaagtcc taggttccca tat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattctaat acgactcact atagggcaaa ctctgccctg tgatgtca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatgaaatt aaccctcact aaagggaacg agggcaattt ccacttag

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggattctaat acgactcact atagggctgg caataaactg gagacact

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatgaaatt aaccctcact aaagggattg agttgttctt gggttgtt

\hfill

48

Claims (27)

1. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con: (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO358 que tiene los residuos de aminoácidos de 20 a 811 de la figura 8 (SEC ID N.º:13) en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-\kappaB, o el complemento de la molécula de ADN; o (b) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana de tipo Toll en el n.º de depósito ATCC 209431 (ADN47361-1249), en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NFKB, o el complemento de la molécula de ADN.

2. Molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO358 que tiene los residuos de aminoácidos de 1 a 811 (SEC ID N.º:13), o el complemento de la molécula de ADN.

3. Molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 comprende el ADN que codifica un polipéptido maduro PRO358 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 811 de la figura 8 (SEC ID N.º: 13).

4. Molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende el ADN que codifica un polipéptido PRO358 que tiene los residuos de aminoácidos 20 a 575 de la figura 8 (SEC ID N.º:13).

5. Molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende el ADN que codifica un polipéptido PRO358 que tiene los residuos de aminoácidos 586-811 de la figura 8 (SEC ID N.º:13).

6. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en la que dicho ADN comprende las secuencias de nucleótidos entre la posición de nucleótidos 11 y la posición de nucleótidos 2.544 de la figura 9 (la secuencia de SEC ID N.º: 14), o su complemento.

7. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Vector de la reivindicación 7 unido operativamente con secuencias de control identificadas por una célula huésped transformada con el vector.

9. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

10. Célula huésped de la reivindicación 9 en la que dicha célula es una célula CHO.

11. Célula huésped de la reivindicación 9 en la que dicha célula es un E. coli.

12. Célula huésped de la reivindicación 9 en la que dicha célula es una célula de levadura.

13. Procedimiento para producir un polipéptido Toll que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 bajo condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y recuperar dicho polipéptido.

14. Polipéptido aislado que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 8 (SEC ID N.º:13), en el que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-KB.

15. Polipéptido de la reivindicación 14 que tiene los residuos de aminoácidos 20 a 811 de la figura 8 (SEC ID N.º: 13),

16. Polipéptido de la reivindicación 14 que tiene los residuos de aminoácidos 20 a 575 de la figura 8 (SEC ID N.º: 13).

17. Polipéptido de la reivindicación 14 que tiene los residuos de aminoácidos 596-811 de la figura 8 (SEC ID N.º: 13).

18. Polipéptido de la reivindicación 14, en el que el polipéptido es codificado por la secuencia de nucleótidos entre la posición de nucleótidos 111 y la posición de nucleótidos 2.544 de la figura 9 (SEC ID N.º: 14).

19. Molécula quimérica que comprenda un polipéptido PRO358 de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

20. Molécula quimérica de la reivindicación 19, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia etiqueta con epítopo.

\newpage

21. Molécula quimérica de la reivindicación 20, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

22. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que aparece en la figura 8 (SEC ID N.º: 13).

23. Anticuerpo de la reivindicación 22, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

24. Anticuerpo de la reivindicación 23 capaz de bloquear la identificación de un organismo gramnegativo o grampositivo mediante dicho polipéptido.

25. Anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 de uso terapéutico.

26. Uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del choque septicémico.

27. Composición que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable.