ES2352742T3 - Ligando para el mediador de entrada del virus del herpes simple y procedimientos de utilización. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30, que comprende (a) proporcionar un anticuerpo anti-p30, y (b) poner en contacto una célula que expresa el polipéptido p30 expresado en la superficie celular con una cantidad de un anticuerpo anti-p30 suficiente para inhibir la respuesta celular del linfocito mediada por el polipéptido p30.
Description
CAMPO DE LA INVENCIÓN
5
La invención se refiere generalmente a compuestos y procedimientos útiles en la regulación de respuestas inmunitarias y de la infección vírica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10
El virus herpético simple (VHS), tipos 1 y 2, produce infecciones recidivas que oscilan en gravedad de benignas a graves. El VHS aparece en estado latente en neuronas para infectar la piel y otros tejidos en presencia de un sistema inmunitario celular competente. La glucoproteína D (gD) del VHS, proteína transmembranaria situada en la 15 envoltura del virión, inicia la infección uniéndose a receptores celulares (Spear et al., (1993) Viral Fusion Mechanisms. Ed. Bentz. CRC press, Boca Raton). Recientemente, se identificó una proteína celular utilizada por el VHS para infección y se la denominó mediador de la entrada del VHS (MEVH) (Montgomery (1996) Cell 87: 427). El MEVH es una proteína transmembranaria de tipo 1 con un dominio extracelular rico en cisteína que 20 presenta homología significativa con los receptores para las citocinas relacionadas con el factor de necrosis tumoral (FNT) (Smith et al., (1994) Cell 76:959; Ware et al., (1995) en Pathways of Cytolysis. Eds. Griffiths y Tschopp. Springer-Verlag, Basilea). Muchos de los miembros de la superfamilia del FNT inician una variedad de respuestas celulares necesarias para montar respuestas inflamatorias e inmunitarias eficaces. 25
El FNT es una proteína transmembranaria de tipo 2 (Pennica (1984) Nature 312:724) que se proteoliza para formar la proteína segregada (Black (1997) Nature 385:729), mientras que LTα carece de dominio transmembranario (Gray (1984) Nature 312:721) y es segregada exclusivamente como homotrímero (en esta forma era también 30 conocida como FNTB. Cuando se expresa como proteína de superficie LTα está asociada a una proteína de 33 kDa (Androlewicz (1992) J. Biol. Chem. 267:2542), denominada LTβ (Browning (1993) Cell 72:847), también de tipo 2 una glucoproteína transmembranaria en heterotrímeros de relaciones de subunidad α1β2 y α2β1 (Androlewicz (1992) más arriba; Browning (1996) J. Biol. Chem 271: 8618). Tanto LTα como FNT se unen y señalan 35 mediante dos receptores, el receptor FNT de 55 a 60 kDa (RFNT60; CD120a o tipo 1) (Schall (1990) Cell 61:361; Loetscher (1990) Cell 61:351) y el RFNT de 75 a 80 kDa; tipo 2 o CD120b) (Smith (1990) Science 248:1019). En cambio, el complejo LT α1β2 de superficie es reconocido específicamente por el receptor LTβ (RLTβ) (Crowe (1994) Science 264:707), que no se une a LTα ni a FNT (Crowe (1994) anteriormente) mientras 40 que ambos RFNT se unen al heterotrímero LTα2β1 (Crowe (1994) anteriormente Browning (1995) J. Immunol. 154:33).
Las eliminaciones genéticas de los genes LTα y LTβ en ratones han dado a conocer funciones para estos dos genes en el desarrollo de nodos linfáticos y de parches 45 de Peyer (De Togni (1994) Science 264:703; Banks (1995) J. Immunol. 155:1685), y junto con FNT y RFNT60 son también citocinas críticas que controlan la formación de centros germinales y la alternación del isotipo de inmunoglobulina (por ejemplo, producción de IgA) durante las respuestas inmunitarias en adultos (Matsumoto (1996) Science 271:1289;
Mariathasan (1995) J. Inflammation 45:72). La mayoría de los estudios han apuntado hacia LTα1β2/RLTβ como sistema receptor de citocina crítico que controla estas funciones (Crowe (1994) Science 264:707; Koni (1997) Immunity 5:491; Ettinger (1996) Proc.Natl. Acad. Sci. U. 93:13102); Rennert (1996) J. Exp. Med. 184:1999).
5
Harrop et al., (Journal of Biological Chemistry 273, 27548-27556 (1998)) describen el ligando mediador de la entrada del virus herpético (L-MEVH), que es un nuevo ligando para MEVH/TR2 y estimula la proliferación de linfocitos T e inhibe el crecimiento celular de HT29. Zhai et al., (J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)) describe LIGHT, nuevo ligando para el receptor de linfotoxina β y TR2/MEVH que provoca apoptosis y suprime la 10 formación del tumor in vivo por transferencia génica. El documento WO 99/11662 describe un gen que codifica TANGO-69 que está previsto que sea el homólogo murino del ligando del MEVH humano, LIGHT. El documento WO 99/02563 describe p30 que funciona como ligando para MEVH. Mauri et al., (Immunity 8, 21-30 (1998)) describe que LIGHT, un nuevo miembro de la superfamilia del FNT y la linfotoxina α son ligandos para el mediador 15 de la entrada del virus herpético. El documento WO 00/14230 describe moléculas de polipéptidos y ácido nucleico, polipéptidos del receptor TANGO-69.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN 20
La presente invención está definida en las reivindicaciones y se basa en la identificación de un polipéptido endógeno que funciona como ligando para MEVH, que previamente era conocido solamente por unirse al gD del VHS. El ligando de la unión del MEVH, denominado también p30, o LIGHT, se describe también como secuencias de 25 ácidos nucleicos que codifican p30 y anticuerpos que se unen a p30.
Las utilizaciones de la invención sirven para tratar pacientes con enfermedades autoinmunitarias.
30
La presente invención proporciona utilizaciones para inhibir un trastorno inflamatorio en un paciente de un agente tal como se define en las reivindicaciones que evita la interacción de p30 (LIGHT) con su receptor. El paciente, el tejido o la célula utilizados en los procedimientos de la presente invención puede ser cualquier paciente, tejido o célula, incluyendo de una especie de mamífero, pero preferentemente es un 35 paciente humano. Los agentes se administran in vivo, ex vivo o in vitro, dependiendo de la fuente (por ejemplo, todo el organismo, tejidos o células). Para la administración in vivo, o la puesta en contacto, el suministro puede ser por procedimientos generales o tópicos. El agente es un anticuerpo anti-p30.
40
La invención proporciona un procedimiento in vitro para inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30, que comprende (a) suministrar una composición que inhibe el enlace de un polipéptido p30 expresado en la superficie de la célula a un MEVH o RLTβ expresado en la superficie celular, y (b) poner en contacto la célula que expresa el polipéptido p30 expresado en la superficie celular o MEVH o RLTβ expresado 45 en la superficie celular con una cantidad de composición suficiente para inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30. En una utilización correspondiente, la célula puede ponerse en contacto con la composición in vivo. En las formas de realización alternativas, la respuesta celular mediada por el polipéptido p30 inhibido comprende la
inhibición de una respuesta celular de linfocitos, la respuesta de linfocitos inhibidos es la proliferación de linfocitos, y el linfocito inhibido es una célula efectora patógena. La respuesta de linfocitos inhibidos puede comprender la modulación de un linfoma o leucemia T o B o una enfermedad autoinmunitaria. La enfermedad autoinmunitaria puede ser una artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, 5 lupus eritematoso diseminado o miastenia grave. La respuesta de linfocitos inhibidos puede comprender la modulación de una reacción para un trasplante.
La célula contactada expresa el polipéptido p30 en su superficie celular y la composición es un anticuerpo anti-p30. 10
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1A es un par de histogramas citométricos de flujo que muestran el enlace 15 de la proteína de fusión MEVH:Fc a las células II-23.D7 tras la activación con PMA (histograma superior) o PMA e ionomicina (histograma inferior).
La figura 1B es un par de histogramas citométricos de flujo que muestran el enlace de la proteína de fusión MEVH:Fc a linfocitos TCD4+humanos normales (histograma 20 superior) y CD8+ (histograma inferior).
La figura 1C es un gráfico de líneas que muestra el enlace de saturación de la proteína de fusión MEVH:Fc a las células II-23.D7 activadas.
25
La figura 2A es un par de diagramas. El diagrama superior es un histograma citométrico de flujo que demuestra que la proteína de fusión MEVH:Fc que se une a las células II-23.D7 activadas compite por la proteína de fusión RLTβ:Fc. El diagrama inferior es un gráfico de líneas que muestra la inhibición en función de la dosis de la proteína de fusión MEVH:Fc que se une mediante la proteína de fusión RLTβ: Fc. 30
La figura 2B es un par de diagramas. El diagrama superior es un histograma citométrico de flujo que demuestra que la proteína de fusión MEVH:Fc que se une compite por el homotrímero LTα. El diagrama inferior es un gráfico de líneas que muestra la inhibición en función de la dosis de la proteína de fusión MEVH:Fc que se une mediante el 35 homotrímero LTα.
La figura 3 es un par de diagramas. El diagrama superior es un histograma citométrico de flujo que demuestra que la variante Tyr108Phe de LTα natural no puede competir por el enlace MEVH:Fc a las células II-23.D7 y el diagrama inferior es un gráfico 40 de líneas que presenta un análisis de competencia de enlace de LTα y LTα (Tyr108Phe).
La figura 4A es un autorradiograma obtenido a partir de un enfoque isoeléctrico bidimensional/gel SDS-PAGE de un precipitado obtenido tratando un extracto de células II-23.D7 activadas con una proteína de fusión mRLTβ:Fc. 45
La figura 4B es un autorradiograma obtenido a partir de un enfoque isoeléctrico bidimensional/gel SDS-PAGE de un precipitado obtenido tratando un extracto de células II-23.D7 activadas con una proteína de fusión RFNT60:Fc.
La figura 4C es un autorradiograma obtenido a partir de un enfoque isoeléctrico bidimensional/gel SDS-PAGE de un precipitado obtenido tratando un extracto de células II-23.D7 activadas con una proteína de fusión MEVH:Fc.
5
La figura 5 es un par de diagramas. El diagrama superior es un histograma citométrico de flujo que demuestra que el enlace MEVH:proteína de fusión Fc compite por la glucoproteína gD-1 del VHS. El diagrama inferior es un gráfico de líneas que presenta la inhibición de pendiente de la dosis de la proteína de fusión MEVH:Fc que se une por la glucoproteína gD-1 del VHS. 10
La figura 6 es un par de gráficos de líneas que demuestra que el anticuerpo anti-MEVH estimula la proliferación en función de la dosis de linfocitos T de la sangre periférica aislados recientemente (gráfico de líneas superior) y linfocitos T con memoria (gráfico de la línea inferior). 15
La figura 7 es un par de diagramas. El diagrama superior es un histograma citométrico de flujo que presenta la expresión de MEVH en las células RAJI linfoblastoides. El diagrama inferior es un gráfico de líneas que presenta la proliferación en función de la dosis de células RAJI en respuesta al anticuerpo anti-MEVH. 20
La figura 8 presenta un gel de SDS-PAGE teñido por la proteína que presenta una banda definitiva de aproximadamente 58 kDa, representativa de la proteína de fusión mMEVH:Fc, véase el Ejemplo 6.
25
La figura 9 es un gráfico que demuestra el efecto de la proteína de fusión MEVH:Fc sobre el hinchamiento de la almohadilla del pie en ratones. Se utilizaron varias concentraciones de mMEVH:Fc (12, 60 y 300 μg) para tratar la inflamación y la hinchazón en ratones BDF1 inmunizados con 50 μg de OVA absorbida en 1 mg de alúmina y sometida a la prueba de provocación con antígeno, véase el Ejemplo 7. 30
La figura 10 presenta un gráfico de la puntuación CIA para ratones artríticos provocados con colágeno, tratados con PBS, hIgG o mMEVH:Fc, véase el Ejemplo 8, anteriormente.
35
La figura 11 presenta la morfología de fibroblastos dérmicos infectados con HCMV-F a una M.O.I de 0,05 y cultivados en presencia de medio con 5 nM de A) LTα, B) LTα + RNFR:Fc, C) LTαY108F, D) LTα1β2, E) LIGHT, F) LIGHT-G119E y G) virus solamente. Véase el Ejemplo 9.
40
La figura 12 presenta el efecto antivírico de LIGHT y LTα, sobre el virus γ herpético, MHV68, in vivo. (Véase el Ejemplo 9).
La figura 13 presenta gel que demuestra la pureza de LIGHTt66 (A) teñido con azul Coomassie o (B) transferencia Western transferida con anti-FLAG (M2) para detectar la 45 proteína recombinante. Los marcadores de peso molecular se presentan en la banda izquierda.
La figura 14 presenta numerosos geles que demuestran que el efecto anti-HCMV
de LIGHT y las linfotoxinas no dependen de la activación de NFκB.
La figura 15 presenta la purificación y caracterización bioquímica de LIGHT t66 y sus mutantes. La figura 15A. Purificación de LIGHTt66-FLAG procedente del sobrenadante de células 293. Panel superior. Gel de SDS PAGE teñido con Coomassie 5 (15%). Se cargaron 20 μl por pocillo. El sobrenadante de partida y LIGHT t66 purificado por intercambio iónico aparecían como bandas múltiples. LIGHT t66 purificado por afinidad parecía una sola banda, Mr = 27 kDa. Panel inferior. Inmunotransferencia Western teñida con anti-FLAG (M2). Se cargaron 20 μl por pocillo. Se detectó LIGHT t66-FLAG con Mr = 27 kDa. La intensidad relativa de las bandas estaba de acuerdo con los datos del ELISA lo 10 que indica que LIGHT t66-FLAG se concentró 30 veces después del procedimiento de intercambio iónico y 100 veces después de la purificación por afinidad. El rendimiento final fue del 60 al 80% del material de partida.
La figura 15B. Purificación de mutantes de LIGHTt66-FLAG de sobrenadantes de 15 linfocitos 293T. Panel superior. Gel SDS PAGE teñido con plata. Mutantes de LIGHTt66-FLAG producidos utilizando células 293T como se describe. Las proteínas activadas por FLAG eran proteínas de afinidad procedentes del sobrenadante de cultivo de tejido utilizando anticuerpo anti-FLAG M2 monoclonal acoplado a Affigel. Se cargaron 100 ng de proteína purificada por pocillo. Los cuatro mutantes aparecían como bandas individuales, 20 Mr = 27 kDa. En algunas preparaciones una banda imperceptible adicional Mr = 52 kDa estaba presente. No se detectaron otras proteínas contaminantes. Panel inferior. Inmunotransferencia Western teñida con M2 anti-FLAG. LIGHTt66-FLAG y sus mutantes se detectaron con Mr = 27 kDa. En algunos casos se detectó también una banda débilmente reactiva con Mr = 52 kDa, correspondiente a la banda de 52 kDa detectada 25 mediante tinción con plata. Esta banda es probable que sea un dímero.
La figura 15C. Reticulación de LIGHTt66-myc. Se reticuló LIGHTt66 mediante adición de glutaraldehído (0,1%) o BSCOES (5 nM) durante 30 min. a 4ºC; la reacción se interrumpió mediante la adición de TRIS (20 mM, pH 8,0). Se analizaron las muestras por 30 Inmunotransferencia Western utilizando anticuerpo 9E1O (anti-myc). Se cargaron 200 ng por pocillo. A, LIGHTt66-myc de referencia, B, reticulación con glutaraldehído, C, reticulación con BSCOES. En las muestras reticuladas se detectaron bandas de 52 y 76 kDa, correspondientes a las Mr esperadas para el dímero y el trímero.
35
La figura 15D. Análisis por filtración en gel de LIGHTt66-FLAG. LIGHTt66-FLAG y los mutantes se analizaron por filtración en gel FPLC en una columna Superose 12. Panel superior. Fracciones de la filtración en gel LIGHTt66-FLAG se analizaron por ELISA utilizando MEVH:Fc como molécula de captura y M2 anti-FLAG como anticuerpo de detección. LIGHT t66 activo eluyó con Mr=76 kDa, lo que indica una molécula 40 homotrimérica. Panel inferior. Inmunotransferencia de manchas teñida con M2 anti-FLAG. Las fracciones del análisis de filtración en gel de LIGHTt66-FLAG y los mutantes se analizaron más por inmunotransferencia de manchas (desde aproximadamente, t66, G119E, Y173F, Q117T, L120Q). Se detectó material reactivo anti-FLAG solamente en las fracciones determinadas por ELISA que contenían LIGHT homotrimérico, lo que 45 demuestra que las preparaciones no contenían ningún monómero libre y ningún agregado de material.
La figura 16 presenta gráficos que demuestran que LIGHT t66 es citotóxico para
las células HT29. La figura 16A. Se incubaron células HT29 con diluciones en serie de LIGHT t66, LTα1β2 o FNT en presencia de IFN (80 U/ml). Después de 72 h se evaluó la viabilidad celular por análisis MTT. LIGHT t66 inhibió el crecimiento de las HT29 con eficacia comparable a LTα1β2.
5
La figura 16B. La citotoxicidad de LIGHT t66 depende de IFNγ. Se incubaron células HT29 con diluciones en serie de LIGHT t66 en presencia o ausencia de IFNγ (80 U/ml) y se realizó el ensayo MTT después de 72 h.
La figura 16C. La citotoxicidad de LIGHT t66 se bloquea por incubación conjunta 10 con RLTβ:Fc y MEVH:Fc. Se incubó previamente LIGHT t66 (200 pM) con diluciones variables de RLTβ:Fc, MEVH:Fc o Fas:Fc durante 30 min antes de la adición a las células HT29 en presencia de IFNγ. El ensayo MTT se realizó después de 72 horas. RLTβ:Fc y MEVH:Fc inhibió la citotoxicidad de LIGHT t66 en función de la dosis, mientras que Fas:Fc no afectó a la citotoxicidad mediada por LIGHT t66. 15
La figura 17 son gráficos que presentan las características de fijación al receptor de LIGHT t66 y sus mutantes. LIGHT t66-FLAG y mutantes se analizaron por ELISA utilizando los receptores indicados como moléculas de captura y M2 anti-FLAG como anticuerpos detectores. L120Q y Q117T se unieron a MEVH humano y LTPR con afinidad 20 comparable a la de LIGHT t66 o mayor. G119E se une a MEVH:Fc humano con afinidad reducida y no presenta ninguna unión detectable para RLTβ:Fc humana. Y173F se une a RLTβ humana con afinidad reducida y se une a G119E débilmente. L120Q presentaba afinidad aumentada para MEVH:Fc murina y RLTβ:Fc. La unión de G119E e Y173F a receptores murinos no se detectó en este sistema. 25
La figura 18 presenta superposiciones de sensogramas que demuestran la resonancia de plasmones de superficie. Las superposiciones de sensogramas para el enlace de LIGHT t66 y sus mutantes a huMEVH:Fc y huRLTβ:Fc a 300 nM de concentración del ligando. Las cinéticas de fijación fueron similares para LIGHT t66 y 30 Q117T. G119E e Y173F se disociaron de MEVH:Fc con aumento de las constantes de disociación con relación a LIGHT-t66. Y173F se disoció de huRLTβ con un aumento de afinidad, mientras que G119E no pudo unirse a este receptor.
La figura 19 muestra la citotoxicidad de los mutantes de LIGHT t66 en células 35 HT29. Se incubaron células HT29 con diluciones en serie de LIGHT t66 y sus mutantes en presencia de IFNγ, se realizó un ensayo MTT después de 72 h. L120Q y Q127T eran tóxicos para las células HT29 con eficacia comparable a la de LIGHT t66 (50% de células muertas a citocina 10 μM). Y173F fue poco citotóxica (50% de células muertas a citocina 1 nM). G199E mostró citotoxicidad insignificante para estas células. 40
La figura 20 muestra el efecto de anticuerpos anti-RLTβ y anti-MEVH en las células HT29. La figura 20A. La fijación de anticuerpos anti-huMEVH y anti-huRLTβ a las células HT29. Se incubaron las células con anticuerpo primario (5 μg/ml) o IgG de ratón normal (área rellena) durante 30 min a 4ºC, seguido de PE antirratón desarrollada en cabra y se 45 analizó por citometría de flujo.
Ambos anticuerpos anti-MEVH (CW1 y CW8) y ambos anticuerpos anti-RLTβ (BDA8 y CDH10) tiñeron las células.
La figura 20B. Efecto de los anticuerpos anti-huMEVH en el enlace de LIGHT a huMEVH. Los pocillos de una placa de ELISA recubiertos con huMEVH:Fc (3 pg/ml) se incubaron con concentraciones variables de anti-MEVH policlonal en cabra o los anticuerpos CW1 ó CW8 anti-MEVH monoclonales durante 30 min y a continuación con 5 LIGHT (0,25 nM) durante 1 h antes de la detección de LIGHT unido con anti-FLAG (M2) monoclonal e IgG-HRP antirratón en cabra. Anti-MEVH en cabra y CW8 inhibieron notablemente la unión de LIGHT a MEVH mientras que CW1 no tuvo ningún efecto.
La figura 20C. Efecto de los anticuerpos anti-RLTβ en el enlace de LIGHT a 10 huRLTβ. El experimento se realizó tal como se describe en la figura 20B. Anti-LTPR y anti-LT8R BDA8 monoclonal inhibieron notablemente el enlace de LIGHT a RLTβ mientras que CDH10 no tuvo ningún efecto.
La figura 20D. Efecto de la reticulación con anticuerpo de huMEVH y huRLTβ sobre 15 el crecimiento de las células HT29. Se incubaron células HT29 con dosis variables de anti-MEVH policlonal, anti-RLTβ policlonal o una mezcla de las dos. Se realizó el ensayo MTT después de 72 h. La reticulación con anticuerpo de RLTβ redujo de manera significativa el número de células en función de la dosis, mientras que la reticulación con anticuerpo de MEVH no tuvo ningún efecto. La inclusión del anticuerpo anti-MEVH policlonal no tuvo 20 ningún efecto sobre la citotoxicidad del anti-RLTβ policlonal.
La figura 20E. Efecto de anti-huMEVH policlonal y anti-huRLTβ sobre la citotxicidad mediada por LIGHT. Se incubaron células HT29 con 10 pg/ml de anti-huMEVH policlonal de cabra, anti-huRLTβ policlonal de cabra o los anticuerpos monoclonales indicados 25 durante 10 min antes de la adición de LIGHT (0,25 nM). Se realizó el ensayo MTT después de 72 h en el cultivo. LIGHT produjo solo 50% de inhibición de crecimiento. La inclusión de anti-RLTβ policlonal de cabra y anti-RLTβ CDH10 monoclonal aumentó notablemente la citoxicidad mediada por LIGHT, mientras que anti-RLTβ BDA8 monoclonal tuvo un ligero efecto protector. Anti-huMEVH policlonal en cabra y los 30 anticuerpos CW1 y CW8 anti-MEVH monoclonales no tuvieron ningún efecto sobre la citotoxicidad mediada por LIGHT.
La figura 21 presenta el efecto LIGHT t66 sobre el aumento de la expresión por ICAM en las células NHDF. Se incubaron células NHDF (60.000/pocillo) con las 35 concentraciones indicadas de citocina en 600:1 de medio de cultivo tisular. Después de 36 h se analizaron las células por FACS con mAb P2A4 (Chemicon International Inc.) para determinar las concentraciones en superficie de ICAM-1. La inducción del pliegue representa la fluorescencia específica de los pocillos tratados con citocina sobre una referencia negativa sin tratar. 40
La figura 22 muestra la recuperación de TRAF por los receptores. La figura 22A. Inmunoprecipitación conjunta de MEVH y de los TRAF activados por FLAG de los lisados las células 293T transfectadas. Los complejos proteicos se precipitaron utilizando anticuerpos específicos anti-MEVH de rata policlonales. Se detectaron 45 inmunotransferencias utilizando anticuerpos anti-FLAG monoclonales de ratón.
La figura 22 B. Inmunoprecipitaciones conjuntas de los TRAF activados por LTPR y FLAG de los lisados de linfocitos 293 T infectados. Los complejos proteicos se
precipitaron utilizando anticuerpos específicos anti-LPTR en cabra. Se detectaron inmunotransferencias utilizando anticuerpos anti-FLAG monoclonales de ratón. Se transfectaron las células con vectores individuales o con vectores en combinación, tal como se indica en la figura y se describe en procedimientos experimentales. Se incluyó pBABE como referencia negativa. 5
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se describe un nuevo ligando para MEVH o p30 y variaciones funcionales y 10 fragmentos de las mismas. Este nuevo ligando, que puede encontrarse en forma de proteína de la membrana y puede funcionar como una citocina, se denomina también LIGHT, porque este polipéptido es homólogo de Linfotoxinas, presenta expresión Inducible y compite con Glucoproteína D de VHS por MEVH, receptor expresado por linfocitos T. Debido a que LIGHT puede competir con la glucoproteína D del VHS por MEVH, las 15 formas homotriméricas solubles de este polipéptido pueden utilizarse para bloquear la entrada del virus herpético en las células. De este modo este nuevo ligando de MEVH puede utilizarse para tratar o prevenir las infecciones del virus herpético tales como virus β herpético y citamegalovirus.
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LIGHT se une también al receptor de linfotoxina beta (RLTβ). Los experimentos que implican la inhibición del enlace de una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular del polipéptido relacionado con el receptor de FNT (RFNT), MEVH, demostró que tanto los linfocitos T humanos malignos como los normales expresaban LIGHT, ligando de la superficie celular para MEVH. 25
La presente invención se basa también en el descubrimiento de que los polipéptidos MEVH tienen un efecto antagonista sobre la inflamación. En particular, las proteínas de fusión MEVH son capaces de inhibir la inflamación cuando se administran a un paciente. 30
DEFINICIONES
Debe indicarse que tal como se utiliza en la presente memoria y en las 35 reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "y", "el" y "la" incluyen las plurales a menos que el contexto lo estipule claramente de otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye varias de dichas células.
A menos que se defina de otra manera, toda la terminología técnica y científica 40 utilizada en la presente memoria, tiene el mismo significado que el apreciado habitualmente por cualquier experto en la materia al que pertenece esta invención. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, pueden utilizarse en la práctica o la experimentación de la presente invención, se describen a continuación los procedimientos y materiales adecuados. 45
Tal como se utiliza en la presente memoria, "inhibir" o "actividad de inhibición" consiste en reducir esta actividad a una cantidad mensurable tal como una reducción de por lo menos el 30% o más. Cuando existan muchas actividades diferentes que pueden
inhibirse (por ejemplo, evitar la recuperación celular, producción de mediadores proinflamatorios, introducción de células o virus, activación vírica, replicación vírica o evolución vírica), la reducción de cualquier actividad individual (con o sin las demás actividades) es suficiente para que esté comprendida dentro del alcance de la presente invención. Además, cuando se administran agentes individuales o múltiples para inhibir la 5 actividad, la reducción mediante un solo agente de cualquier actividad individual o la reducción mediante una combinación de agentes de cualquier actividad individual es suficiente para que esté comprendida dentro del alcance de la presente definición. Una "cantidad inhibidora de inflamación" significa la cantidad de un agente inflamatorio necesario para modular, inhibir o suprimir respuestas o síntomas inflamatorios. 10
Inflamación
La inflamación procede de numerosas cascadas individuales y relacionadas o de las reacciones producidas por mediadores proinflamatorios que incluyen, citocinas, 15 prostaglandinas, leucotrienos, quimiocinas, moléculas de adherencia (por ejemplo, LFA-1) y otras conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los receptores desempeñan una función principal al permitir la introducción de virus dentro de las células. Los ligandos para estos receptores son también importantes. Los ligandos junto con los mediadores proinflamatorios tales como citocinas son los principales estimulantes de las células pero 20 también desempeñan otra función en la ampliación de la cascada inflamatoria. Estos mediadores inflamatorios solubles proceden principalmente de los linfocitos T CD8+, una vez producidos pueden actuar de modo paracrino y autocrino para activar más las células en su proximidad y recuperar linfocitos T adicionales para el lugar de inflamación. Estos linfocitos adicionales se activan ellos mismos, contribuyendo a la ampliación de la cascada 25 inflamatoria. La actividad inmunodepresora, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la inhibición o disminución de la capacidad de los linfocitos B y T para reaccionar o para ser recuperados o activarse en un lugar de inflamación.
Otras señales que activan las células inflamatorias incluyen el enlace de un 30 receptor de adherencia, por ejemplo, LFA-1 (CD11a y CD18), a uno de sus contrarreceptores tal como ICAM-1 (CD54) (Staunton et al., 1990, Cell 61: 243-254). Si la segunda señal se bloquea, los linfocitos T específicos para el antígeno se reducen hasta morir por apoptosis o hasta entrar en un estado de anergia celular. El bloqueo de esta interacción por anticuerpos monoclonales contra LFA-1 e ICAM-1 produce un aumento del 35 tiempo de supervivencia para los ratones que reciben un alotrasplante de corazón (Isobe (1992) Science 255: 1125-1127). Por consiguiente, las composiciones y procedimientos de la invención pueden utilizarse solos o combinados con otros agentes antiinflamatorios incluyendo fármacos antiinflamatorios no esteroideos, esteroides, anticuerpos, antagonistas del receptor y otros fácilmente identificables en la materia. 40
Tal como se utiliza en la presente memoria, "inflamación" hace referencia al procedimiento o a la serie de episodios que son producidos por numerosos estímulos (por ejemplo, agentes infecciosos, isquemia, interacciones antígeno-anticuerpo y lesiones térmicas u otras físicas). La inflamación está caracterizada por un aumento en la eritemia, 45 edema, sensibilidad anormal a la palpación (hiperalgesia) y dolor en la zona inflamada. Una reacción o cascada inflamatoria, se reconoce generalmente por tener numerosas fases distintas, por ejemplo, vasodilatación y aumento de permeabilidad capilar; inflamación de leucocitos y fagocitos; y una fase de degeneración tisular y fibrosis. Tal
como se utiliza en la presente memoria, "trastorno inflamatorio" significa cualquier número de enfermedades caracterizadas por tener parte de su patogénesis y cascada o reacción inflamatoria que produce inflamación. Dichos trastornos incluyen, artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, agentes infecciosos tales como herpes y otros conocidos por los expertos en la materia. 5
Los experimentos que implican inhibición del enlace de una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular del polipéptido relacionado con el receptor del FNT (RFNT), MEVH, demostraron que los linfocitos T humanos tanto malignos como normales expresaron un ligando de la superficie celular para MEVH. Los experimentos de inhibición 10 competitiva demostraron que el ligando MEVH tiene características en común con los heterotrímeros LTαβ y LTα, pero también posee características que le distinguen del LTα1β2 y de FNT. Por lo tanto, LTα2β1 podría ser un supuesto ligando de superficie reconocido por MEVH, con la salvedad de que la zona de fijación de MEVH en LTα2β1 no es la misma que en RFNT60. Alternativamente, MEVH podría reconocer un nuevo ligando. 15 Se utilizó un método bioquímico para distinguir entre estas posibilidades.
Los estudios de inmunoprecipitación y de electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico poliacrilamida (SDS-PAGE) demostraron la presencia de un nuevo ligando del polipéptido de 30 kDa (p30) para MEVH en la superficie de los linfocitos T, que era 20 antigénicamente distinto tanto de LTβ como de LTα. La purificación por cromatografía de afinidad y la electroforesis bidimensional, demostraron que p30 es además físicamente distinta de LTα y LTβ porque tiene un peso molecular de 30 kDa y un pI entre aproximadamente 7 y 8,5 (figura 4 C). Además, estos estudios demostraron que la p30 activa (por ejemplo su forma trimérica) es reconocida también por RLTβ pero no por 25 RFNT. El polipéptido p30 se denomina también LIGHT en la bibliografía reciente (véase, por ejemplo, Mauri et al., Immunity, 8(1): 21-30 (enero, 1998)).
Los experimentos de inhibición del enlace demostraron que gD-1 soluble (gD del VHS-1) y un mutante de gD-1, gD-1 (Δ290-299t) se une a MEVH pero no a RLTβ o a 30 RFNT60. Este resultado sugiere que gD-1 ha evolucionado conjuntamente específicamente para unirse a MEVH, aun cuando MEVH se une a los ligandos que son reconocidos por TNFR60 y RLTβ. Además, los descubrimientos indican que gD-1 es una virocina anclada a la membrana de las linfotoxinas y puede modular actividades de señalización de MEVH durante la introducción o salida del VHS de la célula infectada. 35
Los estudios en cultivos celulares in vitro demostraron que el anticuerpo anti-MEVH aumentaba la proliferación de los linfocitos T tanto vírgenes como de memoria. Los experimentos similares indicaron que la señalización mediante MEVH proporcionaba un estímulo activador a los linfocitos B y que un estímulo positivo, sin un estímulo negativo 40 contrarrestador mediante el RFNT puede ser una propiedad exclusiva del ligando MEVH de p30. Estos resultados indican que las funciones fisiológicas del ligando MEVH es probable que sean distintas de las del FNT y de LTα1β2. La identificación de un nuevo ligando de 30 kDa para MEVH aumenta la posibilidad de que este ligando, pueda ser responsable de respuestas fisiológicas atribuidas anteriormente a LTα o LTβ. Los 45 descubrimientos presentados en la presente memoria proporcionan una comprensión más profunda del sistema LT/FNT de citocina y del virus herpético, lo que sugiere nuevos métodos para controlar estas citocinas en las enfermedades así como que afectan a la inflamación debido a infecciones y lesiones.
En conjunto, los resultados indican que el antagonista y los agentes aglutinantes tales como, por ejemplo, las proteínas de fusión con Fc que contienen MEVH o RLTβ modularán la acción de LTα y el ligando p30 de MEVH de 30 kDa. Los resultados indican además que los antagonistas y los agentes aglutinantes (por ejemplo, anticuerpos y la 5 proteína de fusión de la invención (por ejemplo, MEVH:Fc)) son también útiles en la modulación de la inflamación y en respuestas inflamatorias. Como se explicó anteriormente, el enlace de MEVH activa los linfocitos B y de este modo una modulación en la interacción de MEVH con su ligando reduce la activación de las células inflamatorias y la activación de la cascada inflamatoria. Asimismo la proteína de fusión MEVH podría 10 utilizarse para identificar inhibidores específicos de los complejos ligando-receptor, tales como anticuerpos monoclonales o péptidos o compuestos orgánicos pequeños. Los inhibidores de p30 o las interacciones de LTα con MEVH, o las interacciones de p30 con RLTβ, podrían utilizarse para modular enfermedades en las que se produce proliferación de linfocitos indeseada, incluyendo los linfomas o leucemias T y B, o en enfermedades 15 autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado, miastenia grave e inflamación, por ejemplo artritis, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, asma y otras conocidas en la materia.
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Asimismo, podría utilizarse gD-1 del virus herpético para inhibir reacciones inmunitarias en las que la señalización de LTα, p30 y MEVH están implicados como moléculas efectoras. LTα o las formas solubles del ligando MEVH de 30 kDa (generado por eliminación de sus dominios citoplásmico y transmembranario previstos, por ejemplo, LIGHT-t66 descrito a continuación) pueden funcionar como inhibidores de infección vírica 25 incluyendo, por ejemplo, la infección por virus herpético (por ejemplo, virus alfa herpético, virus beta herpético y virus gamma herpético) y se recrudece bloqueando la capacidad del virus para introducirse en una diana celular.
Como los TNFR, MEVH tiene una especificidad de ligando doble, uniéndose a LTα 30 y a la forma trimérica (por ejemplo, forma de 90 kD) de LIGHT, una forma unida a la membrana del ligando, p30. La mutación LTα Tyr108Phe destruye el enlace de MEVH como lo hace para TNFR60 y TNFR80. La incapacidad de TNFR60 para bloquear el enlace de MEVH a la forma de 30 kDa en superficie, indica que LTα2β1 en superficie no es un ligando de MEVH. 35
Además, LIGHT (p30) se diferencia de LTα porque es antigénicamente distinto y permanece asociado a la célula, independientemente de que LTα se segregue exclusivamente. Por lo tanto, la proteína de fijación de MEVH (p30) está previsto que contenga un segmento de restos hidrófobos formando un dominio transmembranario 40 ordenado en forma de configuración transmembranaria de tipo II a otras proteínas relacionadas con el TNF. Esto no excluye la posibilidad que p30 pueda también modificarse de otras maneras (por ejemplo, modificación de lípidos) que permita el acoplamiento a la superficie celular. Además, esta proteína debería compartir zonas de homología de secuencia con LTα y LTβ y citocinas relacionadas que definen esta 45 superfamilia y contienen un dominio extracelular con terminal C de aproximadamente 150 a 160 restos.
Los descubrimientos indican también que MEVH es un receptor específico para
LTα, una propiedad que le distingue claramente de los receptores de fijación TNF, TNFR60 y TNFR80. Esta propiedad permitirá una proteína de fusión MEVH o una proteína similar antagonizar LTα específicamente sin inhibir las funciones de TNF o de LTα1β2.
Se describen antagonistas y agentes aglutinantes, tales como, por ejemplo, un 5 LIGHT homotrimérico, soluble o un polipéptido de fusión MEVH. El polipéptido de fusión MEVH puede caracterizarse por tener un peso molecular de aproximadamente 58 kDa determinado reduciendo SBS-PAGE, como se demuestra en la figura 8, véase el Ejemplo 6.
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Se describe además, un LIGHT sustancialmente puro, o un polipéptido p30. El polipéptido p30 se caracteriza porque tiene un peso molecular previsto de 30 kDa determinado reduciendo SDS-PAGE y un pI en el intervalo entre aproximadamente 7 y 8,5 (figura 4C). p30 existe en menos de diez, tal como menos de ocho, particularmente menos de seis (por ejemplo, tres, cuatro o cinco) formas isómeras. Se describe también LIGHT, o 15 p30, como homotrímero. Como se muestra en los ejemplos a continuación, p30 puede expresarse como homotrímero, y, cuando se expresa como forma recombinante, truncada y soluble, se segrega exclusivamente como homotrímero. El polipéptido LIGHT puede estar unido a la célula, es decir, no se segrega. En su forma de superficie celular, p30 se une a MEVH y RLTβ. 20
La expresión "sustancialmente puro" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al polipéptido que está sustancialmente exento de otras proteínas, lípidos, carbohidratos y otros materiales con los que está asociado en la naturaleza. Un experto en la materia puede purificar dichos polipéptidos y las proteínas de fusión utilizando técnicas 25 habituales para la purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Protein Purification, Principles and Practice, segunda edición (1987) Scopes, Springer, Verlag, N.Y.). Por ejemplo, un polipéptido MEVH:Fc sustancialmente puro producirá una sola banda mayor de aproximadamente 58 kDa en un gel de SDS-PAGE reductor. El polipéptido p30 de LIGHT proporcionará una sola banda principal de aproximadamente 30 kDa en un gel 30 reductor SDS-PAGE en su forma homotrimérica, forma una sola banda principal de aproximadamente 90 kDa en un gel no reductor (que no deteriora la estructura trimérica terciaria).
Se describe un polipéptido de fusión funcional y un fragmento funcional del mismo. 35 Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "polipéptido funcional" se refiere a un polipéptido que posee una función biológica u otra actividad tal como la capacidad para unirse a un receptor, que puede estar identificado por búsqueda y ensayos de fijación funcional y del receptor definidos (véase, por ejemplo, los ejemplos a continuación) y que, por ejemplo, están asociados a alteraciones biológicas, morfológicas o fenotípicas 40 específicas en la célula, o episodios de enlace, tal como la capacidad del polipéptido LIGHT soluble de la invención para bloquear la entrada de un virus herpético.
"Fragmentos funcionales" tal como se utiliza en la presente memoria, incluyen subsecuencias de los polipéptidos de la invención que tienen una función biológica, tal 45 como se describió anteriormente. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión pueden incluir fragmentos, por ejemplo, de LIGHT o MEVH. Los ejemplos son los fragmentos de MEVH y una segunda secuencia de polipéptidos con tal que una actividad de sustancialmente la misma que la de MEVH:Fc permanezca, por ejemplo, la modulación de respuestas
celulares inhibiendo el enlace de VHS a MEVH, antigenicidad, o inhibición de la inflamación. Se describen los péptidos más pequeños que contienen la actividad biológica de los polipéptidos de fusión MEVH o MEVH. Un experto en la materia puede analizar la actividad funcional de dichos polipéptidos por procedimientos normalizados, por ejemplo, análisis de reducción de placa vírica o análisis de activación celular incluyendo los análisis 5 de producción de citocinas y la medición de las respuestas inflamatorias, tal como se describe en los ejemplos. Asimismo, fragmentos funcionales de p30, pueden determinarse mediante un ensayo funcional definido y que está asociado a una alteración biológica, morfológica o fenotípica específica en la célula.
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Se describen también polipéptidos con modificaciones menores de LIGHT (p30), MEVH o secuencias primarias de aminoácidos de proteínas de fusión (por ejemplo, p30 de la proteína de fusión MEVH). Esto puede dar como resultado proteínas que tienen actividad sustancialmente equivalente, por ejemplo, en comparación con la p30, la LIGHT-t66 y otros mutantes descritos anteriormente; y, el polipéptido MEVH:Fc, como se describe 15 en la presente memoria. Dichas modificaciones pueden estar específicamente modificadas genéticamente, por ejemplo, generadas mediante mutagénesis dirigida. Alternativamente, pueden ser mutaciones espontáneas. Los polipéptidos producidos por estas mutaciones se consideran siempre que el enlace o la actividad biológica de LIGHT (p30) o MEVH:Fc está presente, por ejemplo, la modulación de respuestas celulares por el enlace a MEVH y 20 RLTβ o inhibiendo el enlace VHS a MEVH o la modulación de la inflamación. Además, la eliminación de uno o más aminoácidos puede producir además una modificación de la estructura de la molécula resultante sin alterar de manera significativa su actividad (por ejemplo, LIGHT-t66, véase a continuación).
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Se describe también LIGHT (p30), activo (es decir, "funcional") más pequeño, incluyendo las formas homotriméricas solubles y truncadas y las moléculas MEVH con utilidades alternativas. Por ejemplo, los aminoácidos con terminal amino o carboxilo que no son necesarios para la actividad pueden eliminarse. Por ejemplo, el polipéptido de fusión MEVH:Fc (descrito a continuación) se caracteriza por tener los aminoácidos 1 hasta 30 205 de MEVH. Otro ejemplo, incluye una proteína p30 homotrimérica soluble y truncada, la LIGHT-t66, descrita con detalle en el Ejemplo 12, más adelante.
Los polipéptidos incluyen además variaciones conservadoras, miméticos y péptidomiméticos de la secuencia polipeptídica. La expresión "variación conservadora", tal 35 como se utiliza en la presente memoria, indica la sustitución de un resto de aminoácido por otro, resto biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina y similares. 40 La expresión "variación conservadora", incluye también la utilización de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original insustituido con la condición de que los anticuerpos producidos por el polipéptido sustituido inmunoreaccionan también con el polipéptido insustituido.
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Los términos "mimético" y "peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos, por ejemplo, dominios de transposición o dominios de fijación de ligando oloroso o receptores híbridos de la invención. El mimético puede estar
compuesto enteramente de análogos sintéticos, no naturales de aminoácidos, o, es una molécula libre de aminoácidos de péptido parcialmente natural y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. El mimético puede incorporar además cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales siempre que dichas sustituciones también no alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. En cuanto a 5 los polipéptidos de la invención que son variantes conservadoras, la experimentación de rutina determinará si un mimético es útil, es decir, que su estructura y/o función no está alterada sustancialmente. Las composiciones miméticas de polipéptidos pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales que son por lo general de tres grupos estructurales: a) otros grupos de enlace residual aparte de los enlaces 10 amida natural ("péptido"); b) restos no naturales en lugar de los restos de aminoácidos no naturales o c) restos que provocan mimetismo estructural secundario, es decir, provocan o estabilizan una estructura secundaria, por ejemplo, una configuración en hélice alfa, espira beta, espira gamma, hoja beta, y similares. Un polipéptido puede estar caracterizado como mimético cuando todos o alguno de sus restos están unidos por medio químico aparte de 15 los enlaces péptido naturales. Los restos peptidomiméticos individuales pueden estar unidos por otros enlaces péptido, enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleinidas bifuncionales, N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces amida tradicionales 20 ("enlace péptido") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)-CH2 por -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, págs. 267-357, "Peptide Backbone Modifications", Marcell Dekker, N.Y). Un polipéptido 25 puede caracterizarse también como mimético porque contiene todos o algunos restos no naturales en lugar de restos de aminoácidos naturales; los restos no naturales están bien descritos en la bibliografía científica y de patentes.
Los antagonistas y los agentes aglutinantes de la invención son anticuerpos contra 30 p30 (LIGHT).
La proteína de fusión incluye la secuencia del polipéptido MEVH completa, así como fragmentos de la secuencia que pueden excluir determinadas secuencias peptídicas. Asimismo, el polipéptido LIGHT (p30) de la invención incluye el p30 completo, 35 formas homotrímeras, proteínas de fusión que comprenden la secuencia de p30, así como fragmentos de la secuencia que pueden excluir determinados aminoácidos, péptidos o secuencias, y las formas homotriméricas o heterotriméricas de estos fragmentos, tales como, por ejemplo, LIGHT-t66, como se describe a continuación. Dichos fragmentos pueden ser útiles en la creación de los anticuerpos de la invención, incluyendo los 40 anticuerpos policlonales y monoclonales.
Por ejemplo, dichas secuencias excluídas pueden incluir fragmentos que carecen de la zona del terminal carboxilo del polipéptido MEVH completo. Además, los polipéptidos de fusión pueden incluir la secuencia del polipéptido MEVH o un fragmento de la misma. 45
La "segunda secuencia polipeptídica" de la proteína de fusión puede ser cualquier polipéptido deseado que se una a una secuencia polipeptídica de la invención (por ejemplo, p30 o la secuencia MEVH) con tal que la proteína de fusión p30/MEVH:segundo
polipéptido conserve un enlace (por ejemplo, bloqueo del virus o enlace del receptor) o actividad biológica que es sustancialmente similar al enlace (por ejemplo, a receptores) o actividad biológica de una p30:Fc o MEVH:Fc (por ejemplo, inhibe o modula la inflamación). La identificación y determinación de las segundas secuencias del polipéptido útiles en la presente invención, pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la 5 materia. Por ejemplo, un experto en la materia puede determinar si un montaje de fusión conserva el enlace del receptor deseado o la actividad biológica utilizando los procedimientos y las técnicas descritas en Ejemplos a continuación.
Se describen también secuencias de ácido nucleico aisladas o polinucleótidos que 10 codifican el polipéptido de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican a alguno de los polipéptidos, fragmentos, modificaciones y proteínas de fusión anteriores se describen también. Por tanto, el término "aislado" tal como se utiliza en la presente memoria, incluye polinucleótidos sustancialmente exentos de otros ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que se asocia en la naturaleza. Las secuencias 15 de polinucleótidos incluyen, secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican antagonistas, agentes aglutinantes o un polipéptido de fusión de la invención. Por ejemplo, debe apreciarse que todos los polinucleótidos que codifican toda o una parte de LIGHT o MEVH o los polipéptidos de fusión de las mismas están también incluidas en la presente memoria, siempre que codifiquen un polipéptido con actividad de LIGHT:Fc o MEVH:Fc, 20 tal como se describe en la presente memoria. Dichos polinucleótidos incluyen polinucleótidos naturales (aislados), recombinantes, sintéticos y manipulados deliberadamente. Por ejemplo, las partes de la secuencia de ARNm pueden alterarse debido a modelos de corte y empalme de ARN alternativos o a la utilización de activadores alternativos para la transcripción de ARN. Como otro ejemplo, el polinucleótido puede 25 someterse a mutagénesis dirigida al sitio. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por consiguiente, todas las secuencias nucleotídicas son consideradas siempre que la secuencia de aminoácidos de LIGHT o MEVH, y (en el caso de una proteína de 30 fusión) un segundo polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica están funcionalmente inalterados.
Los ácidos nucleicos comprenden secuencias que codifican un polipéptido de la invención, un antagonista, un agente aglutinante o una proteína de fusión (por ejemplo, 35 LIGHT:Fc o MEVH:Fc) así como fragmentos de LIGHT o MEVH naturales y cualquier secuencia de nucleótidos que pueda hibridarse al complemento de estas secuencias en condiciones severas. Se describen además variantes degeneradas de estas secuencias tanto para p30 como para los polipéptidos de fusión de la invención. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de p30 de LIGHT incluyen secuencias que codifican a p30 natural y a 40 cualquier secuencia nucleotídica que hibride al complemento de las secuencias en condiciones severas tal como se describe en la presente memoria.
La frase "condiciones severas" se refiere a las condiciones de hibridación o de lavado en las que un ácido nucleico, por ejemplo, una muestra de ácido nucleico o una 45 sonda hibridará en primer lugar a su secuencia diana, por lo general en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no a otras secuencias en cantidades significativas. Una señal positiva (por ejemplo, la identificación de un ácido nucleico de la invención) es aproximadamente 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones severas dependen de
la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias mayores se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles of hibridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, se seleccionan condiciones 5 severas para que sean aproximadamente 5 a 10ºC inferiores a las del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a la fuerza iónica, pH y concentración de ácidos nucleicos definidos) a las que el 50% de las sondas complementarias a la diana hibridan a la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm el 50% de las 10 sondas están ocupadas en equilibrio).
Las condiciones severas serán las que presenten una concentración salina inferior a aproximadamente ion sodio 1,0 M, por lo general aproximadamente a una concentración de ion sodio de 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3, y la temperatura es por lo 15 menos de aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos de aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones severas pueden conseguirse también con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.
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Las condiciones de hibridación severas que pueden utilizarse para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención, pueden incluir la hibridación en un tampón que comprende 50% de formamida, 5 x SSC y 1% de SDS a 42ºC, o hibridación en un tampón que comprende 5 x SSC y 1% de SDS a 65ºC, ambos con un lavado de 0,2 x SSC y 0,1 de SDS a 65ºC. Las condiciones de hibridación severas a título de ejemplo 25 pueden incluir además una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M y SDS al 1% a 37ºC y un lavado en 1 x SSC a 45ºC. Alternativamente, la hibridación para el ADN unido al filtro en NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato sódico (SDS) al 7% y EDTA 1 mM a 65ºC y lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 68ºC pueden utilizarse para identificar y aislar ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención. El experto en la materia reconocerá 30 fácilmente que la hibridación alternativa pero comparable y las condiciones de lavado pueden utilizarse para proporcionar condiciones de severidad similar.
Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no es crítica, como es conocido en la técnica, es la severidad de las condiciones de lavado la que plantea las 35 condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención. Las condiciones de lavado utilizadas para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención incluyen, por ejemplo; una concentración salina de aproximadamente 0,02 molar, a pH 7 y a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50ºC o aproximadamente 55ºC a aproximadamente 60ºC; o una concentración salina de 40 aproximadamente 0,15 M de NaCl a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos; o una concentración salina de aproximadamente 0,2 x SSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50ºC o aproximadamente 55ºC hasta aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución que tiene una concentración salina de aproximadamente 45 2 x SSC que contiene SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y a continuación se lava dos veces mediante 0,1 X SSC que contiene SDS al 0,1% a 68ºC durante 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Las condiciones severas para el lavado pueden también ser 0,2 X SSC/SDS al 0,1% a 42ºC. En los casos en los que las
moléculas de ácido nucleico son desoxioligonucleótidos ("oligos"), las condiciones severas pueden incluir lavado en 6 x SSC/pirofosfato sódico al 0,05% a 37ºC (para oligos de 14 bases), 48ºC (para oligos de 17 bases), 55ºC (para oligos de 20 bases) y 60ºC (para oligos de 23 bases). Véase Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ª ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT 5 PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997), o Tijssen (1993) anteriormente, para descripciones detalladas de hibridación equivalente y condiciones de lavado y para reactivos y tampones, por ejemplo, tampones de SSC y reactivos y condiciones equivalentes.
10
Estas moléculas de ácido nucleico pueden codificar o actuar como moléculas complementarias de p30, útiles, por ejemplo, en la regulación de p30 (para y/o como cebadores complementarios en las reacciones de ampliación de las secuencias de ácido nucleico de p30). Aún más, dichas moléculas pueden utilizarse como componentes de identificación de procedimientos mediante la cual, por ejemplo, puede detectarse la 15 presencia de un gen de p30.
Además de las secuencias nucleotídicas descritas anteriormente, el ADNc completo o las secuencias genómicas pueden identificarse y aislarse fácilmente, sin experimentación indebida, por técnicas de biología molecular bien conocidas en la 20 materia.
Las secuencias de ADN pueden obtenerse por varios procedimientos. Por ejemplo, el ADN puede aislarse utilizando hibridación o técnicas informáticas que son bien conocidas en la materia. Éstas incluyen de manera no limitativa: (a) hibridación de bancos 25 genómicos o de ADNc con sondas para detectar secuencias nucleotídicas homólogas; (b) identificación con anticuerpos de bancos de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados que comparten características estructurales; (c) reacción en cadena de la polimerasa (RCP) en ADN genómico o ADNc utilizando cebadores capaces de hibridarse con la secuencia de ADN de interés; (d) búsquedas por ordenador de las bases de datos 30 de secuencias para las secuencias similares; (e) identificación diferencial de un banco de ADN sustraído; y (f) secuenciado genómico a gran escala mediante etiquetas de la secuencia expresada (EST) de un banco de ADNc de linfocitos T. Preferentemente los polinucleótidos (por ejemplo, el polinucleótido p30 y polinucleótido MEVH:proteína de fusión) proceden de un organismo de mamífero. 35
Los procedimientos de identificación que se basan en la hibridación del ácido nucleico hacen posible aislar cualquier secuencia génica de cualquier organismo, con la condición de que esté disponible la sonda apropiada. Las sondas de oligonucleótidos, que corresponden a una parte de la secuencia que codifica la proteína en cuestión, pueden 40 sintetizarse químicamente. Esto requiere que deben conocerse segmentos cortos de oligopéptido de las secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN que codifica la proteína puede deducirse del código genético, sin embargo, la degeneración del código debe tenerse en cuenta. Es posible realizar una reacción de adición mezclada cuando la secuencia está degenerada. Esto incluye una mezcla heterogénea de ADN bicatenario 45 desnaturalizado. Para dicha identificación, la hibridación se lleva a cabo preferentemente en un ADN monocatenario o un ADN bicatenario desnaturalizado. La hibridación es particularmente útil en la detección de los clones de ADNc procedentes de fuentes en las que una cantidad extremadamente baja de secuencias de ARNm, en relación con el
polipéptido de interés están presentes. En otras palabras, utilizando condiciones de hibridación severas dirigidas para evitar el enlace no específico, es posible, por ejemplo, permitir la observación autorradiográfica de un clon de ADNc específico mediante la hibridación de un ADN diana a esta sonda individual en la mezcla que es su complemento completo (Wallace et al. (1981) Nucl. Acid Res., 9:879). Alternativamente, un banco 5 sustractivo, es útil para la eliminación de clones de ADN no específicos.
Cuando la secuencia completa de restos de aminoácidos del polipéptido deseado no se conoce, la síntesis directa de secuencias de ADN no es posible y el procedimiento de elección es la síntesis de las secuencias de ADNc. Entre los procedimientos habituales 10 para aislar las secuencias de ADNc de interés, está la formación de bancos de ADNc que llevan plásmido o fago que proceden de la transcripción inversa del ARNm que es abundante en células donantes que tienen un alto nivel de expresión genética. Cuando se utiliza en combinación con la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa, pueden clonarse incluso los productos de expresión raros. En esos casos en los que las fracciones 15 significativas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido son conocidas, la producción de secuencias de ADN monocatenario o bicatenario marcadas o secuencias de la sonda de ARN que duplican una secuencia supuestamente presente en el ADNc diana puede utilizase en los procedimientos de hibridación de ADN/ADN que se llevan a cabo en las copias clonadas del ADNc que ha sido desnaturalizadas en forma monocatenaria (Jay et 20 al., (1983) Nucl. Acid Res., 11:2325). Pueden construirse sondas y cebadores oligonucleotídicos apropiados "volviendo a traducir" la secuencia de aminoácidos del polipéptido p30 obtenido por secuenciado del aminoácido N-terminal.
Un banco de expresión de ADNc, tal como gt11 lambda, puede cribarse 25 indirectamente para los péptidos de p30 que tienen por lo menos un epítopo, utilizando anticuerpos específicos para p30. Dichos anticuerpos pueden derivarse policlonal o monoclonalmente y utilizarse para detectar el producto de expresión indicativo de la presencia de ADNc de p30.
30
Las alteraciones en el ácido nucleico de p30 incluyen mutaciones intragénicas (por ejemplo, mutación puntual, sin sentido (terminación), sin sentido invertida, zona de corte y empalme y desplazamiento del marco) y eliminaciones heterocigóticas u homocigóticas. La detección de dichas alteraciones puede realizarse por procedimientos habituales conocidos por los expertos en la materia incluyendo el análisis de secuencia, análisis de 35 inmunotransferencia Southern, análisis basados en RCP (por ejemplo, RCP múltiple, zonas activadas de la secuencia (STS)) e hibridación in situ. Dichas proteínas pueden analizarse por SDS-PAGE normal y/o análisis de inmunoprecipitación y/o análisis de transferencia Western, por ejemplo.
40
Se describen vectores de ADN que contienen algunas de las anteriores secuencias de codificación de p30 y/o sus complementos (es decir, complementarias) y los vectores de expresión que contienen algunas de las secuencias de codificación de p30 anteriores.
Se describen también vectores de ADN que contienen algunas de las secuencias 45 de codificación de polipéptido de fusión anteriores y/o sus complementos y vectores de expresión que contienen algunas de las secuencias de codificación anteriores. Un vector de expresión se compone de o contiene un ácido nucleico en el que una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido o polipéptido de la invención está funcionalmente
unida a un activador o a una combinación potenciador-activador. Un activador es un elemento regulador de la transcripción compuesto por una zona de una molécula de ADN por lo general dentro de los 100 pares de nucleótidos en frente (corriente arriba) del punto en el que comienza la transcripción. Otro elemento regulador de la transcripción, es un potenciador. Un potenciador proporciona especificidad en relación con el tiempo, situación 5 y nivel de expresión. A diferencia de un activador, un potenciador puede funcionar cuando se sitúa a distancias variables de la zona de transcripción, con tal que esté presente un activador. Un potenciador puede situarse también corriente debajo de la zona de iniciación de la transcripción. Una secuencia de codificación de un vector de expresión está funcionalmente unida a la zona de terminación de la transcripción. Para poner una 10 secuencia de codificación bajo el control de un activador, es necesario colocar la zona de iniciación de la traducción del marco de lectura de la traducción del péptido o polipéptido entre uno y aproximadamente cuarenta nucleótidos corriente abajo (3’) del activador. Dichos elementos reguladores incluyen de manera no limitativa el gen precoz inmediato de citomegalovirus hCMV, los activadores precoz o tardío del adenovirus SV40, el sistema 15 lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el operador mayor y las zonas activadoras del fago A, las zonas de control de la proteína fd de cabra, el activador para 3-fosfoglicerato cinasa, los activadores de la fosfatasa ácida y los activadores de los factores de emparejamiento V de levadura.
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Los vectores de expresión y los procedimientos para su construcción son conocidos por aquellos que están familiarizados con la técnica. Dichos vectores incluyen plásmidos, vectores víricos tales como los virus herpético, retrovirus, virus de viruela del canario, adenovirus y virus adenoasociados, entre otros.
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Se describen también estirpes de células hospedadoras adecuadas transfectadas con vectores de expresión que contienen las secuencias de ácido nucleico descrita. Las células que han de utilizarse para la transfección incluyen de manera no limitativa las células HEK293 de origen de mamífero o las células de insecto Sf9 y TN5, por ejemplo, para la expresión de un polipéptido de fusión para la invención en sus varias formas 30 naturales o modificadas genéticamente. Las células se transfectan por varios procedimientos frecuentemente utilizados en la técnica, por ejemplo, electroporación o precipitación con fosfato cálcico. Los genes pueden introducirse también en las células por transducción con vectores víricos, por ejemplo, retrovirus. Se seleccionan estirpes celulares transfectadas con éxito por un medio apropiado conocido por los expertos en la 35 materia, por ejemplo, utilizando medio de cultivo de tejido enriquecido con un fármaco tal como GeneticinTM (G418) o puromicina, por ejemplo, para el que el vector de expresión aplicable contiene un gen de resistencia. Las estirpes celulares transfectadas con éxito son la expresión identificada de las moléculas de fusión por varios procedimientos posibles, por ejemplo, análisis de citometría de flujo. 40
Las "Células hospedadoras" son las células en las que puede propagarse un vector y expresarse su ADN. La expresión incluye también cualquier descendencia de la célula hospedadora en cuestión. Debe apreciarse que toda la descendencia puede que no sea idéntica a la de la célula original, ya que pueden existir mutaciones que ocurren durante la 45 replicación. Sin embargo, dicha descendencia está incluida cuando se utiliza el término "célula hospedadora".
Los anticuerpos que deben utilizarse según la invención reconocen de manera
específica epítopos antigénicos en una secuencia de aminoácidos de p30 o MEVH. Dichos anticuerpos incluyen pero no se limitan a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, humanizados o híbridos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab’)2 y fragmentos de fijación al epítopo de cualquiera de los anteriores. Dichos anticuerpos pueden actuar como 5 antagonistas o agentes aglutinantes en la modulación de una reacción inflamatoria. Por ejemplo, los anticuerpos contra p30 pueden actuar por interacción con p30 e impedir el enlace de p30 a su receptor. Asimismo, los anticuerpos que se unen a MEVH o interactúan con éste pueden actuar también para impedir el enlace de MEVH con su ligando (por ejemplo, p30). 10
Los anticuerpos son para su utilización, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y cánceres linfocíticos. Pueden utilizarse también para determinar la expresión de p30 en una célula y de este modo pueden utilizarse como parte de un procedimiento de identificación para seleccionar un tratamiento apropiado para un 15 sujeto específico. Por ejemplo, si las células tumorales de un paciente con linfoma o leucemia expresan p30, anticuerpo anti-p30 o conjugados de inmunotoxina del anticuerpo anti-p30, o conjugados de inmunotoxina del anticuerpo anti-p30 pueden utilizarse como terapia en este paciente. Dichos anticuerpos pueden utilizarse también en los ensayos descritos. 20
Para la producción de anticuerpos, un hospedador animal se inmuniza mediante inyección con el polipéptido de fusión, los polipéptidos individuales que comprenden el polipéptido de fusión (MEVH), con las células que expresan el polipéptido de fusión o el polipéptido p30. Alternativamente, los péptidos correspondientes a las zonas específicas 25 (es decir, epítopos antigénicos) de estos polipéptidos pueden utilizarse como inmunógenos. Dichos animales hospedadores pueden incluir pero no se limitan a conejos, ratones y ratas. Pueden utilizarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de hospedador, que comprenden de manera no limitativa adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como 30 hidróxido de aluminio, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, BCG (bacilo de Calmette Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo procedentes de los sueros de animales inmunizados.
35
Con el fin de aumentar más la inmunogenicidad, el inmunógeno puede estar acoplado a un vehículo. Los ejemplos de dichos vehículos son la hemocianina de la lapa californiana (KLH) y la albúmina de suero bovino (ASB). Pueden utilizarse también como vehículos otras albúminas tales como ovoalbúmina, albúmina de suero de ratón o albúmina de suero de conejo. Los procedimientos de acoplamiento de un péptido a un 40 vehículo son bien conocidos en la técnica e incluyen la utilización de glutaraldehído, carbodiimida y éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida.
La cantidad de antígeno que debe utilizarse puede ser determinada fácilmente por los expertos en la materia sin experimentación indebida. El antígeno puede administrarse 45 por numerosas vías (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales se controla por toma de muestras de sangre del animal inmunizado en varios tiempos puntuales después de la administración. Cuando se obtiene el nivel deseado de anticuerpo, se extrae sangre del
animal y se almacena el suero.
Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un antígeno específico, pueden obtenerse por cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por estirpes celulares continuas en cultivo. Éstas 5 incluyen de manera no limitativa, la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497; patente US nº 4.376.110; Howell y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. N.Y.), la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kosbor (1983) Inmunology Today 4:72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026), y la técnica de hibridoma del VEB (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies And 10 Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo, IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas.
Además, pueden utilizarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos híbridos" (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6851; 15 Neuberger (1984) Nature 312: 604; Takeda (1985) Nature 314: 452). Éstas implican el corte y empalme de una porción de un gen que codifica un anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada a una parte de un gen que codifica un anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo híbrido es una molécula apropiada en la que las diferentes partes proceden de diferentes especies animales, tales 20 como las que tienen una zona variable procedente de un anticuerpo monoclonal murino y una zona constante de inmunoglobulina humana. Dichos anticuerpos híbridos podrían también generarse, por ejemplo, inmunizando ratones que contienen los locus genéticos humanos que codifican IgH y los locus de cadena ligera 6 y 8.
25
Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente US nº 4.946.778; Bird (1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; y Ward et al. (1989) Nature 334: 544) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios contra epítopos del polipéptido de fusión de la invención. Los anticuerpos monocatenarios se forman uniendo los fragmentos 30 de la cadena pesada y ligera de la zona Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido monocatenario. Son producidos convenientemente por técnicas de ADN recombinante.
Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos pueden 35 generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen pero no se limitan a los fragmentos de F(ab’)2 que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab’)2. Alternativamente, pueden construirse bancos de expresión de Fab (Huse (1989) Science 246:1275) que permitan la identificación rápida 40 y fácil de los fragmentos monoclonales de Fab con la especificidad deseada. Los métodos para identificar anticuerpos para la especificidad de unión son bien conocidos en la técnica.
Se describen además sistemas in vitro concebidos para identificar compuestos 45 capaces de modular las respuestas celulares mediadas por los polipéptidos receptores MEVH o RLTβ. "Respuestas celulares" se refiere en la presente memoria a la activación celular, a la incorporación celular de VHS o a los cambios en la activación o producción de mediadores inflamatorios tales como células inflamatorias, citocinas, prostaglandinas y
leucotrienos. Estas respuestas celulares se producen mediante una interacción de (a) MEVH con p30, gD o LTα; o (b) RLTβ con p30.
El término "ligando" se refiere a un polipéptido o un compuesto que se une a una proteína del receptor con gran afinidad y de manera específica para provocar una 5 respuesta funcional. Por ejemplo, los ligandos de la invención incluyen p30, gD o LTα. El término "receptor" se refiere en la presente memoria, a un polipéptido que, cuando se une mediante un ligando, provoca una respuesta celular. Los receptores de la invención incluyen MEVH o RLTβ. La expresión "agente aglutinante" se refiere a un polipéptido o a un compuesto que se une a un receptor o a un ligando con gran afinidad y de manera 10 específica y puede o no provocar una respuesta funcional. Este compuesto puede ser un compuesto definido, aislado y un compuesto experimental purificado (por ejemplo, una pequeña molécula de síntesis), un elemento de un banco combinatorio o puede estar presente en una muestra biológica tal como un fluido biológico, extracto de tejido, fracción subcelular o lisado celular. 15
Además se describe un análisis para identificar un compuesto que afecta a una respuesta celular mediada por el agente aglutinante MEVH. Este ensayo conlleva: (a) incubar el compuesto con un polipéptido MEVH o una célula que expresa un polipéptido MEVH y un agente aglutinante MEVH, en condiciones que permitan interactuar a los 20 componentes; y (b) determinar el efecto del compuesto en la respuesta celular mediada por el MEVH-agente aglutinante. Se describe también un análisis para identificar un compuesto que afecta una respuesta celular mediada por RLTβ-p30. Este ensayo conlleva: (a) incubar el compuesto con un polipéptido RLTβ o una célula que expresa un polipéptido RLTβ, y con p30, en condiciones que permitan interactuar a los componentes y 25 (b) determinar el efecto del compuesto en la respuesta celular mediada por RLTβ-p30. En los análisis de los compuestos de la invención se identifica su capacidad para modular una activación celular mediada por interacción de MEVH o RLTβ con un ligando o para inhibir la infección de las células sensibles al VHS.
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Los análisis pueden ser análisis de respuesta celular. Estos análisis de respuesta celular miden la activación celular, a la infección celular por VHS o la modulación de la inflamación afectando los mediadores inflamatorios tales como la regeneración de las células inflamatorias, la activación y producción de citocinas proinflamatorias, prostaglandinas y leucotrienos. 35
En los compuestos experimentales puede determinarse su capacidad para modular una respuesta de los receptores que expresan células (por ejemplo, MEVH o RLTβ) estimulados por ligandos (por ejemplo, p30, LTα o gD) y una dosis subóptima de un estímulo apropiado para las células. Las células que expresan el receptor "que responde 40 al tratamiento" pueden ser recién obtenidas de un sujeto o pueden ser una estirpe celular cultivada. Las células pueden expresar de manera endógena el receptor codificado o un receptor codificado por un gen transfectado. El ligando puede añadirse a los cultivos de respuesta celular en forma de polipéptido aislado o mediante la adición de los cultivos de células que expresan los ligandos. Las células que expresan ligandos pueden expresar un 45 gen endógeno que codifica el ligando o pueden expresar un gen transfectado que codifica el ligando. Además, el ligando puede expresarse en la superficie celular (p30 o gD) o puede segregarse (p30, gD o LTα). Para que se segregue p30 o gD, sería necesario que el gen codificador hubiera eliminado la zona que codifica el dominio transmembranario. La
activación celular puede medirse, por ejemplo, por proliferación celular, expresión nueva de los marcadores de activación de la superficie celular o producción de factor soluble.
Las células pueden ser linfocitos. En el caso de linfocitos T, el receptor (MEVH o RLTβ) que expresa los linfocitos T que responden al tratamiento puede cultivarse en 5 presencia del compuesto experimental, del ligando y de una dosis subóptima de un activador de linfocitos T, por ejemplo, anticuerpo anti-CD3, una lectina tal como fitohemaglutinina (PHA) o un superantígeno tal como enterotoxina C estafilocócica (SEC). Las referencias serán cultivos que contienen: (a) linfocitos T solos; (b) linfocitos T con activador de linfocito T, con ligando y sin compuesto experimental; (c) linfocitos T con 10 activador de linfocito T, sin ligando y sin compuesto experimental; (d) linfocitos T con activador de linfocito T, sin ligando y con compuesto experimental; (e) linfocitos T sin activador de linfocito T, con ligando y sin compuesto experimental; (f) linfocitos T sin activador de linfocito T, sin ligando y sin compuesto experimental y (g) linfocitos T sin activador de linfocito T, sin ligando y con compuesto experimental. La activación del 15 linfocito T puede medirse en función de la proliferación de linfocitos T por incorporación de 3H-timidina (véase el Ejemplo 5), inducción de marcadores de activación tales como CD69 o CD25 o producción de citocinas tales como interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) o interferón-γ (IFN-γ).
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En el caso de los linfocitos B pueden realizarse ensayos con respuesta similar. Los activadores de linfocitos B pueden ser mitógenos tal como un mitógeno de la hierba carmesí, proteína A estafilocócica o antiinmunoglobulina. La activación celular puede medirse por la proliferación celular (de nuevo por incorporación de 3H-timidina) o secreción de Ig. Alternativamente, puede medirse la supervivencia de los linfocitos B en medio 25 nutricionalmente subóptimo (véase el Ejemplo 5).
La capacidad de un compuesto experimental para inhibir la activación de linfocitos sería una indicación de que dicho compuesto puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria que conlleva en gran medida linfocitos T (artritis reumatoide, 30 diabetes mellitus dependiente de insulina y esclerosis múltiple, por ejemplo) o linfocitos T y B, lupus eritematoso diseminado y miastenia grave, por ejemplo) así como trastornos inflamatorios, por ejemplo, artritis, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino. La capacidad de un compuesto experimental para estimular la activación de linfocitos sería una indicación de que dicho compuesto puede ser útil en la estimulación de respuestas 35 inmunitarias en pacientes con enfermedades infecciosas, o en las que el paciente está inmunodeprimido como, por ejemplo, en pacientes sometidos a quimioterapia o terapia de radiación por cáncer o en pacientes con SIDA.
En análisis de compuestos experimentales que evitan la infección por VHS, los 40 compuestos experimentales pueden añadirse a cultivos de células sensibles al VHS y del VHS. Las estirpes celulares optativas para la infección por virus incluyen fibroblastos dérmicos humanos, linfocitos de la sangre periférica tratados con agentes que producen activación (por ejemplo, anticuerpo anti-CD3 o fitohemaglutinina) y estirpes celulares transformadas (por ejemplo, células de Held). La producción de virus puede medirse por 45 cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la materia incluyendo los ensayos víricos en placa, la producción de proteínas específicas de virus medidas por ELISA o la utilización de virus recombinante que contiene un producto génico indicador como β-galactosidasa, una enzima fácilmente detectable por ensayos
colorimétricos (Montgomery (1996) anteriormente).
La capacidad de un compuesto experimental para inhibir la infección de las células por VHS sería una indicación de que dicho compuesto puede ser útil en el tratamiento de un paciente con una infección por VHS. Con el fin de probar si los compuestos que 5 afectan a las respuestas celulares funcionan uniendo el miembro de un par receptor-ligando aplicable, puede determinarse su capacidad para unirse a formas solubles del receptor o ligando mediante ensayos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia Western o radioinmunoanálisis. Además, para probar si la unión de un compuesto experimental al receptor o al ligando produce inhibición de su unión entre 10 sí, puede determinarse la capacidad del compuesto experimental para inhibir la unión de las formas solubles del receptor y el ligando. Los ejemplos de estos ensayos son los ELISA competitivos, inmunotransferencia Western competitiva y radioinmunoanálisis competitivos.
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Los péptidos y polipéptidos utilizados en los análisis de identificación de la invención, pueden obtenerse por varios medios. Los péptidos más pequeños ( de longitud inferior a 50 aminoácidos) pueden sintetizarse convenientemente por procedimientos químicos convencionales. Algunos polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) pueden adquirirse en los proveedores comerciales. Cuando no están disponibles de otra manera, 20 los anticuerpos pueden generarse como se describió anteriormente. Los anticuerpos marcados de manera detectable pueden adquirirse en proveedores comerciales o ser preparados fácilmente por expertos en la materia.
Los polipéptidos tales como MEVH, RLTβ, p30, gD o LTα pueden purificarse a 25 partir de las fuentes biológicas por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia (Protein Purification, Principles and Practice, segunda edición (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.). Pueden producirse también en sus formas de proteína de fusión o híbrida, natural, truncada, por tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN 30 recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. Véase las técnicas descritas en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y.; y Ausubel et al., mencionadas anteriormente. Alternativamente, el ARN que codifica las proteínas puede sintetizarse químicamente. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Oligonucleotide Synthesis (1984) Gait, M. 35 J. ed. IRL Press, Oxford, que está incorporada como referencia a la presente memoria en su totalidad.
Pueden utilizarse varios sistemas de hospedador-vector de expresión para expresar las secuencias nucleotídicas. Cuando el péptido o polipéptido es soluble, puede 40 recuperarse de: (a) el cultivo, es decir de la célula hospedadora en los casos en los que el péptido y polipéptido no se segrega o (b) a partir del medio de cultivo en los casos en los que el péptido o polipéptido es segregado por las células. Los sistemas de expresión comprenden también células hospedadoras modificadas genéticamente que expresan el polipéptido in situ, por ejemplo, ancladas en la membrana celular. La purificación o el 45 enriquecimiento del polipéptido a partir de dicho sistema de expresión puede realizarse utilizando detergentes apropiados, micelas de lípido y otros procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Alternativamente, las propias células hospedadoras modificadas genéticamente pueden utilizarse en situaciones en las que es importante no
solamente conservar las características estructurales y funcionales de la proteína, sino también evaluar la actividad biológica.
Los sistemas de expresión que pueden utilizarse incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas 5 con ADN de bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido que contienen las secuencias nucleotídicas; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante; células de insecto infectadas con vectores de expresión vírica recombinante (baculovirus); sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión vírica recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico 10 de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco (VMT) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante; o células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHA, 293, 3T3) que alojan montajes de expresión recombinante que contienen activadores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, activador de metaltioneína) o de virus de mamífero. 15
En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente numerosos vectores de expresión seleccionados en función de la utilización deseada para el producto génico que se está expresando. Por ejemplo, cuando ha de producirse una gran cantidad de dicha proteína, por ejemplo, para aumentar los anticuerpos contra la proteína, pueden 20 ser deseables los vectores que dirigen la expresión de altas concentraciones de productos de la proteína de fusión que se purifican fácilmente. Dichos vectores incluyen de manera no limitativa el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al. (1983), EMBO J. 2:1791) en el que la secuencia de codificación puede estar ligada individualmente en el vector en el marco con la zona de codificación lacZ de modo que se produce una proteína 25 de fusión; los vectores pIN (Inouye (1985) Nucleic Acids Res., 13:3101; Van Heeke (1989) J. Biol. Chem. 264:5503); y similares. Los vectores pGEX pueden utilizarse también para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de las células lisadas por adsorción a perlas de glutatión-agarosa 30 seguida de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para que incluyan trombina o secuencias de escisión del factor Xa de proteasa de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto GST. Se sobreentiende que los polipéptidos utilizados en los ensayos de identificación pueden ser formas naturales de los polipéptidos o proteínas de fusión que contienen los polipéptidos. La parte irrelevante de la 35 proteína de fusión puede ser, por ejemplo, el fragmento Fc de inmunoglobulina G, hexahistidina o GST.
En las células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse numerosos sistemas de expresión vírica. En los casos en los que se utiliza adenovirus como vector de 40 expresión, la secuencia nucleotídica de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, el activador tardío y la secuencia principal tripartita. Este gen híbrido puede insertarse a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una zona no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la zona E1 o E3) dará como resultado un virus 45 recombinante que es viable y puede expresar el producto génico en hospedadores infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655). Pueden ser necesarias además señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de las secuencias nucleotídicas insertadas. Estas señales incluyen el
codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que un gen completo o ADNc, incluyendo su propio codón de iniciación y las secuencias adyacentes, se inserta en el vector de expresión apropiado, puede no ser necesaria ninguna señal de control de la traducción adicional. Sin embargo, en los casos en los que se inserta solamente una parte de la secuencia de codificación, las señales de control de traducción 5 exógenas, incluyendo, quizás, el codón de iniciación ATG, deben proporcionarse. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales exógenas de control de la traducción y los codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión puede 10 aumentarse por inclusión de elementos apropiados mejoradores de la transcripción, terminadores de transcripción, etc. (Bittner (1987) Methods in Enzymol. 153:516).
Además, puede seleccionarse una cepa de célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en el 15 modo específico deseado. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucooxidación) y tratamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Pueden seleccionarse estirpes celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el tratamiento correctos de la proteína extraña expresada. Las células hospedadoras de mamífero incluyen pero no se 20 limitan a CHO, VERO, BHK, Held, COS, MDCK, 293; 3T3 y W138.
A largo plazo, resulta preferida la producción con alto rendimiento de proteínas recombinantes, con expresión estable. Por ejemplo, las estirpes celulares que expresan de forma estable las secuencias descritas anteriormente pueden modificarse 25 genéticamente. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, pueden transformarse células hospedadoras con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, secuencias activadoras, potenciadoras, terminadores de transcripción, zonas de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, puede dejarse que 30 las células modificadas genéticamente se desarrollen durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante proporciona resistencia a la selección y permite que las células se integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en las estirpes celulares. Este 35 procedimiento puede utilizarse de manera ventajosa para modificar genéticamente las estirpes celulares que expresan el producto génico. Dichas estirpes celulares modificadas genéticamente pueden ser particularmente útiles en la identificación y evaluación de los compuestos que afectan la actividad endógena del producto génico.
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Una proteína de fusión puede purificarse fácilmente utilizando un anticuerpo o un resto que se une específicamente a la proteína de fusión que se está expresando. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88:8972), permite la purificación fácil de las proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en estirpes celulares humanas. En este sistema, el gen de interés se subclona en un 45 plásmido de recombinación de vacunas de modo que el marco de lectura abierto del gen se fusiona para la traducción a una etiqueta con terminal amino consistente en seis restos de histidina. Los extractos de las células infectadas con virus de vacuna recombinante se cargan en columnas de ácido nitriloacético Ni2+-agarosa y las proteínas activadas con
histidina se eluyen selectivamente con tampones que contienen imidazol. Si se desea, la etiqueta de histidina puede escindirse de manera selectiva con una enzima apropiada.
Las proteínas híbridas pueden modificarse también por los métodos conocidos por los expertos en la materia. Éstas conllevan los corte y empalme de una parte de un gen 5 que codifica una proteína dada a una o más partes procedentes de uno o más genes que codifican diferentes proteínas. Un polipéptido híbrido es una molécula en la que diferentes partes proceden de diferentes proteínas. Por ejemplo, una proteína híbrida puede contener un dominio de MEVH y otro dominio de RLTβ o un dominio de MEVH y un dominio de una zona Fc de un anticuerpo. 10
Se describen procedimientos para modular una respuesta celular mediada por MEVH poniendo en contacto una célula que expresa el polipéptido receptor HVEM con un agente aglutinante MEVH. Alternativamente, se modula una respuesta celular mediada por MEVH poniendo en contacto un ligando para MEVH con un agente aglutinante del ligando. 15 Dichos ligandos incluyen LIGHT (p30), LTα o gD. LIGHT (p30) puede expresarse en la superficie de una células o puede ser soluble, por ejemplo, en forma homotrimérica. LTα puede segregarse y gD puede expresarse en un virión de VHS o en la superficie de una célula infectada por VHS.
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La expresión "respuestas celulares" se refiere otra vez en la presente memoria a la activación celular (por ejemplo, a un aumento en la producción o a mediadores inflamatorios) o a la incorporación de VHS por la célula. La invención presenta también procedimientos para modular respuestas celulares mediadas por RLTβ, poniendo en contacto una célula que expresa RLTβ o una célula que expresa el ligando RLTβ, p30, con 25 un agente aglutinante que une a MEVH o la p30.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "poner en contacto" hace referencia a la exposición al receptor o al ligando al agente aglutinante, en una cantidad eficaz para modulación del receptor de modo que el agente aglutinante puede modular de 30 manera eficaz la respuesta celular iniciada por la interacción del ligando con el receptor. La modulación puede dar como resultado la inhibición o activación de la respuesta celular. Estas propiedades alternativas de un agente aglutinante específico para un par receptor-ligando específico pueden determinarse con antelación utilizando los análisis de identificación descritos (véase, por ejemplo, ejemplos 6 a 8). 35
Con respecto a los agentes aglutinantes del receptor, los agentes aglutinantes de MEVH incluyen gD soluble, p30 soluble (por ejemplo, LIGHT-t66) o un fragmento peptídico de LTα, preferentemente un fragmento peptídico que contiene el aminoácido Tyr en una posición correspondiente a la posición 108 del terminal N de LTα natural. Un agente 40 aglutinante de RLTβ es p30 soluble.
Con respecto a los agentes aglutinantes del ligando, los agentes aglutinantes de p30 incluyen MEVH soluble, RLTβ soluble, montajes híbridos (por ejemplo, proteínas de fusión) tales como MEVH:Fc o anticuerpo que se une específicamente a p30. Un agente 45 aglutinante de LTα es MEVH soluble, por ejemplo, una proteína de fusión MEVH:Fc o un montaje híbrido.
La puesta en contacto puede ser in vitro, por ejemplo, añadiendo un agente
aglutinante o un antagonista a un cultivo de células que expresan MEVH o RLTβ, por ejemplo, linfocitos, que experimentan activación por los ligandos de MEVH (p30, LTα o gD) o por el ligando de RLTβ, p30. Pueden añadirse también agentes aglutinantes, como, por ejemplo, a un cultivo de células que expresan MEVH expuestas a gD en la superficie de los viriones VHS o en la superficie de células infectadas con VHS. La capacidad del 5 agente aglutinante para modular estas respuestas celulares podría determinarse para utilizar de antemano los métodos de identificación descritos. El agente aglutinante puede añadirse como polipéptido aislado o como células transfectadas con un vector de expresión que contiene un agente aglutinante que codifica la molécula de ácido nucleico. En estos procedimientos in vitro, una "cantidad eficaz que modula el receptor" de agente 10 aglutinante, es la cantidad requerida para modular la activación celular o la infección por VHS en más del 20%, preferentemente más del 50%, más preferentemente más del 80% y aun más preferentemente más del 95%.
La puesta en contacto puede ser in vivo en un paciente. El paciente puede ser un 15 mamífero, preferentemente una persona con una enfermedad autoinmunitaria tal como artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado o miastenia grave, un cáncer linfoide (linfocitos T o B), una infección por VHS, una infección con un organismo distinto de VHS, un trastorno inflamatorio o por inmunodepresión. La inhibición de una respuesta celular mediada por 20 MEVH-p30 o RLTβ-p30 podría ser ventajosa en pacientes con enfermedades autoinmunitarias o cánceres linfoides porque podría evitar la proliferación o activación de linfocitos T (como en la artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado, miastenia grave y cáncer de linfocitos T) y la proliferación de linfocitos B (como en el lupus eritematoso diseminado, miastenia 25 grave y cáncer de linfocitos B). La inhibición de una respuesta celular mediada por MEVH-gD (es decir, la incorporación del VHS) podría ser terapéutica para los pacientes con una infección por VHS en la que se evitaría la propagación vírica mediada por la incorporación de los viriones del VHS que expresan gD presentes en el espacio extracelular o procedentes de células infectadas por VHS que expresan gD en su superficie. La 30 estimulación de una respuesta celular mediada por MEVH-p30 o un RLTβ-p30 sería útil en el tratamiento de pacientes con una infección distinta de VHS o pacientes inmunodeprimidos (por ejemplo, pacientes que están sometidos a radiación y/o quimioterapia para el cáncer, distintos de cánceres linfoides) o pacientes de SIDA en los que la proliferación tanto de linfocitos T como B estaría estimulada. Naturalmente, se 35 evitaría utilizar agentes aglutinantes que estimulen una respuesta celular mediada por MEVH-p30 en un paciente con una infección por VHS y que dicho agente pueda además aumentar una respuesta celular por MEVH-gD y, de este modo, la propagación del virus VHS. Sin embargo, esta actividad en el agente aglutinante adecuado podría determinarse de antemano utilizando análisis de identificación descritos más arriba. Asimismo, estos 40 agentes aglutinantes estimulantes no se utilizarían en cánceres linfoides ya que podrían favorecer el crecimiento de células tumorales.
Los agentes aglutinantes que han de utilizarse para la modulación in vivo de respuestas celulares, incluyen las formas naturales de MEVH, RLTβ, p30, anticuerpos, gD 45 y LTα, así como formas modificadas genéticamente tales como los montajes MEVH:Fc. Estos serán producidos por los métodos descritos anteriormente. Se utilizarán también péptidos procedentes de LTα y que modulan la interacción MEVH-LTα. Los péptidos contendrán aproximadamente 205 aminoácidos o menos. Por ejemplo, pueden contener
cinco, ocho, doce, quince o dieciocho aminoácidos. Los péptidos contendrán preferentemente el resto Tyr o una sustitución conservadora del mismo, en una posición correspondiente al resto 108 del aminoácido del terminal N de LTα natural.
Están incluidos además como agentes aglutinantes los peptidomiméticos descritos 5 anteriormente. Los compuestos peptidomiméticos son compuestos sintéticos que tienen una estructura tridimensional (es decir, un "motivo peptídico") basada en la estructura tridimensional de un péptido seleccionado. El motivo peptídico suministra el compuesto peptidomimético con actividad de modulación de las respuestas celulares que es la misma o mayor que la actividad del péptido del que procede el peptidomimético. Los compuestos 10 peptidomiméticos pueden tener características adicionales que mejoran su aplicación terapéutica tales como mayor afinidad y/o actividad y vida media biológica prolongada. Los peptidomiméticos de la invención por lo general tienen un eje central que es en parte o completamente no peptídico, pero con grupos laterales idénticos a los grupos laterales de los restos de aminoácidos que se producen en el péptido sobre el que se basa el 15 peptidomimético. Varios tipos de enlaces químicos, por ejemplo, enlaces éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonilo reducido, dimetileno y cetometileno, se conocen en la técnica por ser sustitutos generalmente útiles para los enlaces peptídicos en la construcción de peptidomiméticos resistentes a la proteasa.
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Los agentes aglutinantes de polipéptidos y de péptidos pueden modificarse por adición a uno de los dos o a ambos extremos del terminal amino y carboxilo, de un agente de bloqueo con objeto de facilitar la supervivencia de polipéptido o péptido adecuado in vivo. Esto puede ser útil en aquellas situaciones en las que los terminales peptídicos tienden a ser degradados ("mordisqueados") por las proteasas. Dichos agentes de 25 bloqueo pueden incluir sin limitación, secuencias peptídicas adicionales relacionadas o no relacionadas que pueden acoplarse a los restos terminales amino y/o carboxilo del polipéptido o péptido que ha de ser administrado. Esto puede realizarse químicamente durante la síntesis del péptido o polipéptido o por tecnología de ADN recombinante. Alternativamente, agentes de bloqueo tales como el ácido piroglutámico u otras moléculas 30 conocidas por los expertos en la materia pueden acoplarse a los restos terminales amino y/o carboxilo, o al grupo amino en el terminal amino, o al grupo carboxilo en el terminal carboxilo reemplazado con un resto diferente. Asimismo, los agentes aglutinantes pueden acoplarse por enlace covalente o no covalente a proteínas "portadoras" farmacéuticamente aceptables antes de su administración. 35
La administración in vivo conlleva administrar a un paciente el propio agente aglutinante, un ácido nucleico que codifica el agente aglutinante, un vector de expresión que codifica el agente aglutinante o células transfectadas o transducidas con el vector.
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Los agentes aglutinantes pueden administrarse a una célula de un mamífero utilizando sustancialmente las mismas técnicas que las descritas a continuación para la administración a pacientes humanos. Los ejemplos de mamíferos apropiados incluyen pero no se limitan a seres humanos, primates no humanos, caballos, vacas, ovejas, perros, gatos, ratones, ratas, cobayas, hámsteres, conejos y cabras. 45
Un agente aglutinante puede administrase a las células de un paciente en su estado inalterado, disuelto en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo, solución salina fisiológica. Naturalmente, es deseable que estos péptidos sean dirigidos de manera
selectiva a los tejidos y a los tipos de célula adecuados. Esto puede conseguirse poniendo en contacto a los péptidos directamente con el órgano o tejido afectado, por ejemplo, por inyección localizada o implantación. De este modo, en las enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide o la diabetes mellitus dependiente de insulina, los péptidos podrían introducirse directamente en las articulaciones afectadas o el páncreas, 5 respectivamente, o preferentemente en el tejido linfoide drenante en el que se produce la respuesta autoinmunitaria activa.
Alternativamente, pueden administrarse agentes aglutinantes en liposomas en los que se han incorporado ligandos para los receptores en las células adecuadas (por 10 ejemplo, linfocitos T o linfocitos B) o anticuerpos contra marcadores de la superficie celular expresados por estas células. Por tanto un anticuerpo específico para el marcador de la superficie de los linfocitos CD4 T puede dirigir los liposomas que contienen tanto el anticuerpo anti-CD4 como el agente aglutinante adecuado para un linfocito CD4+ T. Este método puede utilizarse tanto en enfermedades autoinmunitarias como en la infección por 15 VHS. En las enfermedades autoinmunitarias en las que se ha definido el receptor de linfocitos T (TCR) expresado por un clon de linfocito T patógeno dominante, puede utilizarse un anticuerpo específico para el componente de TCR adecuado (por ejemplo, Vβ). La última metodología representaría una forma ideal de inmunoterapia en la que las células efectoras patógenas están específicamente dirigidas para la inhibición mientras 20 que el sistema inmunitario en conjunto y las células del órgano diana continúan sin estar inmunodeprimidas.
En los pacientes de linfoma o leucemia, los agentes aglutinantes antiproliferantes se dirigen preferentemente a las células cancerosas. Los péptidos podrían inyectarse, por 25 ejemplo, directamente en los tejidos que rodean la zona del tumor de linfoma tras la intervención quirúrgica para eliminar el tumor, con objeto de inhibir el crecimiento de las células tumorales residuales. En lugar de la intervención quirúrgica, el tumor podría tratarse mediante inyección in situ del agente aglutinante en el tumor. Podría aprovecharse también la metodología de liposomas descrita más arriba. En este caso se 30 aprovecharían anticuerpos específicos para antígenos específicos para el tumor (TSA) o para antígenos asociados al tumor (TAA).
Es bien conocido en las técnicas médicas que las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, así como el compuesto específico que ha de 35 administrarse, el tiempo y la vía de administración y otros fármacos que se administran simultáneamente. Las dosis para los agentes aglutinantes de la invención variarán, pero puede ser, cuando se administran por vía intravenosa, aproximadamente 0,01 mg a 10 mg/ml de volumen de sangre. Las vías y dosis de administración son bien conocidas por farmacólogos y médicos expertos. Las vías, además de las descritas anteriormente, 40 incluyen de manera no limitativa la: intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, a través de las mucosas, subcutánea e intravenosa.
Un método de terapia génica in vivo requiere la administración de un montaje genético directamente al paciente, preferentemente dirigiéndola a las células o tejidos de 45 interés. La focalización de las células tumorales o de los linfocitos activados, por ejemplo, puede ejecutarse mediante la utilización de un retrovirus, que transfecta de manera estable ante todo células proliferantes. En otra forma de realización, el trastorno inflamatorio puede ser la artritis, y el tejido diana el cartílago en la articulación de un
paciente. En tal caso el montaje de fusión de la invención puede estar unido a una matriz activada por el gen (es decir, recubierta sobre un material polimérico) a fin de proporcionar un material de liberación lenta o inyectado directamente en la articulación.
La focalización específica al tejido puede conseguirse también mediante la 5 utilización de un conjugado molecular compuesto por un plásmido u otro vector acoplado a poli-L-lisina por fuerzas electrostáticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor en las células tumorales (Cristiano (1995), J. Mol. Med. 73:479). Asimismo, los anticuerpos específicos para el tumor y la célula del tipo descrito anteriormente pueden unirse a vectores y de este modo dirigirlos a tumores o células 10 linfoides tales como linfocitos T. Esto último sería útil en enfermedades autoinmunitarias e infección por VHS. Un activador que produce expresión relativamente específica del tumor puede utilizarse para conseguir un nivel adicional de dirección. Los activadores específicos para el tejido para su utilización en pacientes autoinmunitarios o de trasplante incluyen, por ejemplo, la IL-2 inducible (Thompson (1992) Mol. Cell. Biol. 12:1043), IL-4 (Todd 15 (1993) J. Exp. Med. 177:1663) e interferón gamma (Penix (1993) J. Exp. Med. 178:483) activadores que se dirigen al linfocito T. Dichos activadores invisibles tendrían una ventaja adicional inestimable porque la expresión ocurriría selectivamente en los linfocitos T activados. Están incluidas en esta población de linfocitos T activados las células efectoras que inhibiría selectivamente una modalidad inmunoterapéutica ideal en pacientes 20 autoinmunes.
Pueden suministrarse también vectores por incorporación en los liposomas o en otros vehículos de administración ya sean solos o incorporados conjuntamente con anticuerpos específicos de la célula como se describió anteriormente. 25
Cuando el agente aglutinante adecuado está normalmente unido a la membrana celular (MEVH, RLTβ, p30 o gD), la zona del ácido nucleico que codifica el dominio transmembranario del agente aglutinante se eliminará del ácido nucleico contenido en el vector de expresión. 30
El ADN o las células transfectadas pueden administrarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículos farmacéuticamente aceptables son los vehículos biológicamente compatibles que son adecuados para la administración a un ser humano, por ejemplo, solución salina fisiológica. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una 35 cantidad de ADN de la invención que es capaz de producir un resultado médicamente deseable en un animal tratado. Como es bien sabido en las técnicas médicas, la dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto específico que ha de administrarse, el sexo, la duración y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se están 40 administrando simultáneamente. Las dosis variará, pero una dosis preferida para la administración intravenosa del ADN es desde aproximadamente 106 hasta 1012 copias de la molécula de ADN. Esta dosis puede administrarse reiteradamente según se necesite.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente memoria para 45 referirse a los compuestos materiales, composiciones y/o formas galénicas que, dentro del alcance del criterio médico válido, son adecuadas para su utilización en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, proporcionada con una relación beneficio/riesgo
razonable.
La concentración óptima del péptido, anticuerpos, proteínas de fusión, ácidos nucleicos o un derivado de los mismos en una composición farmacéuticamente aceptable puede variar, dependiendo de numerosos factores incluyendo la dosis preferida del 5 compuesto que va a administrarse, de las características químicas de los compuestos empleados, de la formulación de los excipientes del compuesto y de la vía de administración. La dosis óptima de una composición farmacéutica que va a administrarse, puede depender de dichas variables como el tipo y el alcance de, por ejemplo, un trastorno inflamatorio, o una enfermedad que va a tratarse, del estado de salud general 10 del paciente en concreto y de la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de trastornos inflamatorios incluyendo pero sin limitarse a artritis, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino. Una "cantidad eficaz" o "cantidad inhibidora de la inflamación" significa la cantidad de compuesto necesaria para modular, inhibir o suprimir las 15 respuestas o síntomas inflamatorios.
Cada uno de los expertos en la materia pueden utilizar las siguientes enseñanzas que describen los procedimientos y técnicas para determinar las dosis clínicas (Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., Nueva York, 20 1984, págs. 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., Nueva York, 1991, págs. 93-101; Craig C., y R. Stitzel, eds., Modern Pharmacology, 2ª ed., Little, Brown y Co., Boston, 1986, págs. 127-33; T. Speight, ed., Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3ª ed.; Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, págs. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa and P. McGonigle, Principles 25 in General Pharmacology, Springer-Verlag, Nueva York, 1988, págs. 18-20) para determinar la dosis apropiada de utilización.
Por consiguiente, la presente invención proporciona utilizaciones para tratar o inhibir y la reacción o transporte inflamatorio en una célula, tejido o paciente. 30
Tal como se describe en la presente memoria, la formulación y las composiciones pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia utilizando las enseñanzas descritas en la presente memoria o resultan evidentes para una persona experta en la materia. Por ejemplo, un polipéptido de fusión de la invención puede administrarse por vía 35 tópica a una zona inflamada de un paciente. Dicha administración tópica incluye la administración del polipéptido de la invención, por ejemplo, en una loción o bálsamo. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden administrarse por vía general. Dicha administración general incluye, por ejemplo, inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas o por vía oral. Además, las 40 formulaciones que incluyen el polipéptido, tales como, por ejemplo, supositorios, píldoras, formulaciones liposómicas y otras formulaciones fácilmente identificadas por los expertos en la materia pueden utilizarse para la administración general. Tal como se describe con mayor detalle a continuación, los polipéptidos (por ejemplo, MEVH:Fc) se ha demostrado que tienen propiedades antiinflamatorias. 45
Los siguientes ejemplos se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo de la invención.
EJEMPLOS
Materiales para los ejemplos
La construcción, expresión y purificación de las proteínas híbridas, bivalentes, 5 formadas con la zona Fc de la IgG1 humana y los dominios de fijación del ligando de Fas:Fc (Brunner (1995) Nature 373:441), RFNT60 (Crowe (1994) J. Immunol. Methods 168:79) y RLTβ:Fc humano (Crowe (1994) Science 264:707) se han descrito anteriormente. La zona extracelular de MEVH se generó por RCP utilizando las secuencias ampliadas por Taq ADN polimerasa procedentes de pBEC10 ADN que codifica 10 1 a K184 utilizando el cebador anterior 5’ CGGAGATCTGAGTTCATCCTGCTAGCTGG-3’ (SEC ID nº: 1) y el cebador complementario 5’ ATAGGATCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3’ (SEC ID nº: 2). El producto de MEVH ampliado se ligó en el marco en el vector del baculovirus pVL1392 (Pharmingen) que contiene el Fc IgG1 humano. Un montaje similar de MEVH:Fc con la zona Fc de la IgG1 15 de conejo se produjo en las células CHO, se purificó y se utilizó como inmunógeno para producir anticuerpo anti-MEVH de conejo. Se construyó RLTβ:Fc procedente de un fragmento RLTβ (mRLTβ) de ADN de ratón que codifica los restos de aminoácidos 1 a Met221 de un dominio extracelular (Force et al. (1996) J. Immunol. 1995.1 155:5280) por RCP utilizando Taq ADN polimerasa con el cebador anterior 5’ 20 GACGTCAGATCTTCCCACCTTTCCTCCTA 3’ (SEC ID nº: 3) y el cebador complementario 5’ GAACAGAGATCTCATTGCTCCTGGTCTG 3’ (SEC ID nº: 4). Se produjeron LTα y LTαTyr108Phe en células de insecto utilizando báculovirus recombinante (Crowe et al. (1994) J. Immunol. Methods 168:79). LTα1β2 recombinante soluble (Browning et al. (1996), citado más arriba), FNT (Browning y Ribolini (1989), J. Immunol. 25 143:1859) y anticuerpos monoclonales contra LTα (BF7) y LTβ (C37, B9 y B27) (Browning et al. (1995), citado más arriba) fueron donaciones gentiles de Jeffrey Browning (Biogen, Inc.). El anticuerpo anti-LTα inmunoprecipitador (clon 9B9) era de Boehringer Mannhein. Se produjo anti_CD3 (OKT3) en ascitis en ratones BALB/c y se utilizó a razón de 1 μg/ml de proteína. Se produjeron proteínas gD_1 de VHS recombinante purificadas y mutantes 30 en baculovirus como se describió anteriormente con detalle (Nicola et al. (1996) J. Virol. 6:3815). Los anticuerpos FITC-anti-CD4 y CD8 se adquirieron en Becton-Dickenson.
EJEMPLO 1. Expresión de un ligando de MEVH en los linfocitos T 35
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T humanos tanto malignos como normales expresan un ligando de la superficie celular para MEVH. Se construyó una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de MEVH y la zona Fc de IgG humana (MEVH:Fc). Los experimentos demostraron que MEVH, (como una MEVH:Fc 40 recombinante, soluble) se une a linfocitos T humanos normales (recién aislados).
Se extrajeron células mononucleares de la sangre periférica de donantes normales por Ficoll-Hypaque. Se activaron con el anticuerpo anti-CD3 durante 5 días en medio con IL-2. Las células se volvieron a estimular con PMA o PMA e ionomicina durante 4 horas y 45 a continuación se tiñeron dos veces con FITC-CD4 o FITC-CD8 y se detectó MEVH:Fc con anti-hulgG-PE tal como se describió anteriormente. Se utilizó fluorescencia FITC con compensación para controlar las subpoblaciones de linfocitos T CD4 y CD8.
Se determinó el enlace del receptor incubando concentraciones escalonadas de MEVH:Fc o IgG de referencia con células II-23.D7 activadas. La estirpe celular II-23.D7 es un hibridoma de linfocitos T CD4+ (Ware (1986) Lymphokine Res. 5:313) y se mantiene en un medio RPMI1640 con suero bovino fetal al 10% (SBF) y antibióticos. Se activaron las células II-23.D7 durante 4 horas a 37ºC con miristato acetato de forbol (PMA) (100 5 ng/ml) o PMA (100 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml). Se lavaron las células y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (enriquecida con suero bovino de ternera al 10% y 0,1% de NaN3) que contenía MEVH:Fc, RLTβ:Fc o IgG humana a 5 μg/ml, y a continuación se tiñeron con IgG anti-humana en cabra conjugada con ficoeritrina (anti-huIgPE). Se analizaron las células teñidas por citometría 10 de flujo (FACSCaliber, Becton-Dickenson). El enlace del receptor se determinó calculando la intensidad de fluorescencia = (canal de fluorescencia media) (% de casos fluorescentes positivos), en los que un episodio positivo tiene un valor de fluorescencia > 98% del valor para IgG normal. La intensidad específica de fluorescencia representa la intensidad de fluorescencia después de la sustracción del valor para IgG de referencia. Cada histograma 15 representa 104 casos.
Estos experimentos demostraron que MEVH:Fc unido específicamente al hibridoma humano de linfocitos T CD4+, II.23.D7 (Ware (1986), véase a continuación) después de la activación con el calcio ionóforo, ionomicina y PMA, pero no PMA solo se 20 detectó por citometría de flujo (figura 1A). El enlace específico de MEVH:Fc se detectó también en linfocitos T procedentes de la sangre periférica humana (figura 1B). Estos descubrimientos indicaban que los linfocitos T humanos tanto malignos como normales expresaban un ligando de la superficie celular para MEVH. El enlace medio-máximo de MEVH:Fc a células II.23.D7 se consiguió a ~ 20 nM (figura 1C). La estirpe celular II.23.D7 25 es producida también por PMA para expresar LTα y β y FNT (véase, por ejemplo, Ware (1992), J. Immunol. 149:3881).
EJEMPLO 2. Características del enlace de MEVH y sus ligandos; MEVH se une a LTα 30
Este ejemplo demuestra las características de enlace de MEVH utilizando MEVH:Fc recombinante soluble. Para determinar si MEVH puede unirse a los complejos de FNT o LTαβ, se utilizaron LTβ:Fc y RFNT:Fc como inhibidores competitivos del enlace MEVH:Fc para las células II.23.D7 activadas. Estos experimentos descubrieron que el 35 homotrímero LTα, pero no FNT ni LTα1β2 competían por el enlace de MEVH:Fc (MEVH soluble).
Competición del enlace por RLTβ:Fc. Se incubaron previamente células II.23.D7 activadas (PMA e ionomicina tal como se describe en el Ejemplo 1) con RLTβ:Fc o 40 RFNT60:Fc (100 μg/ml) durante 30 minutos a 4ºC. Se añadió a continuación MEVH:Fc de conejo (2 μg/ml), se incubó durante 30 minutos y las células teñidas con IgG-PE anticonejo desarrollada en cabra para detectar MEVH:Fc de conejo. Se utilizó IgG de conejo para determinar la tinción de fondo. El enlace de MEVH:Fc a las células II-23.D7 activadas compitió con concentraciones escaladas de RLTβ:Fc, RFNT60, Fas:Fc o IgG 45 como se describió anteriormente.
Competición de enlace por el homotrímero LTα. Se activaron células II-23.D7 y se incubó previamente MEVH:Fc con LTα recombinante o LTα1β2 durante 30 minutos a 4ºC.
La mezcla se añadió a células células II-23.D7 activadas y a continuación se tiñó con anti-hulgG-PE. La tinción de fluorescencia con MEVH:Fc+LTα fue igual al fondo con IgG normal.
Para determinar si MEVH puede unirse a FNT o a complejos de LTαβ se utilizaron 5 RLTβ:Fc y TNRF:Fc como inhibidores competitivos de enlace de MEVH:Fc para células II-23.D7 activadas con PMA e ionomicina utilizando un montaje MEVH:Fc con Fc de IgG de conejo (Montgomery (1996) más arriba). El RLTβ:Fc y MEVH:Fc (Fc de la IgG1 humana) pero no TNRF60:Fc compitieron para el enlace de MEVH:Fc (conejo) (figura 2A). Además, ninguna de las dos proteínas de fusión del receptor mencionado, Fas:Fc ni RFNT80:Fc 10 compitieron por el enlace de MEVH:Fc. Sin embargo, de manera inesperada, el homotrímero Lt, pero no TNF o LT12 compitió por la unión HVEM:Fc (figura 2B). Un mutante del enlace de RFNT60 de LTα en el que la tirosina (Tyr) en la posición 108 se sustituye con fenilalanina (Phe) (Tyr108Phe) (Goh (1991), Protein Eng. 4:785) no compitió (figura 3). Estos resultados indican que el supuesto ligando MEVH tiene características en 15 común con los heterotrímeros LTαβ y LTα, pero también tiene características que le distinguen del LTα1β2 y de FNT. Por tanto LTα2β1 podría ser un supuesto ligando de superficie reconocido por MEVH:Fc, con la salvedad de que la(s) zona(s) de enlace de MEVH en LTα2β1 no es la misma que en RFNT60. Alternativamente, MEVH:Fc podría reconocer un nuevo ligando. Se utilizó un método bioquímico para distinguir entre estas 20 posibilidades.
EJEMPLO 3. Caracterización bioquímica del ligando MEVH (LIGHT)
25
Este ejemplo demuestra la purificación de LIGHT (p30) por cromatografía de afinidad utilizando MEVH:Fc recombinante, soluble. El análisis de las proteínas que unen MEVH:Fc por electroforesis bidimensional (2D) demostró que los polipéptidos p30 migraban como una banda ancha (pI 7 a 8,5) y que a menor intensidad p30 se resuelve en tres bandas.
30
Análisis SDS-PAGE. Las células II-23.D7 se activaron durante 2,5 horas con PMA o PMA y ionomicina (como en el Ejemplo 1); se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), una vez con RPMI insuficiente en cisteína-metionina y a continuación se volvieron a poner en suspensión en este medio que contenía 10% de FBS dializado, 250 μCi de 35S-metionina y de 35S-cisteína y activando los agentes durante 1,5 35 horas. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y las células se lisaron en tampón que contenía NP40 al 2%, HEPES pH 7,0, EDTA 20 mM, NaCl 150 mM con leupeptina y aprotinina (a 10 μg/ml), PMSF (1 mM) y yodoacetamida (20 mM). El extracto se clarificó previamente con IgG humana (10 μg) donde se indica, anticuerpos anti-LT y perlas de proteína G. Se añadieron a continuación las proteínas de fusión receptor:Fc (10 μg/ml) a 40 las muestras y se precipitaron con perlas de proteína G. Las proteínas marcadas se analizaron por SDS-PAGE reductor y fosfoimagen (intervalo de pixel 6-200).
Los extractos celulares preparados como en el párrafo anterior se clarificaron previamente en primer lugar con 10 μg de IgG de ratón o anticuerpos monoclonales contra 45 LTα o LTβ y a continuación se añadió MEVH:Fc para precipitar los ligandos. Las proteínas unidas a MEVH:FC se resolvieron a continuación por SDS-PAGE de reducción y se detectaron por fosfoimagen.
Purificación del ligando de MEVH, p30. Se activaron las células II-23.D7 con PMA (100 ng/ml) o PMA y ionomicina (1 μg/ml) durante 2,5 horas, seguido de marcaje con 35S-metionina y 35S-cisteína como en los dos párrafos anteriores. Los extractos celulares se clarificaron previamente con IgG humana (5 μg) y perlas de proteína G para eliminar de manera inespecífica las proteínas de unión. El extracto se eliminó a continuación de LTα 5 por tratamiento del extracto por RFNT60:Fc y perlas de proteína G. MEVH:Fc y las perlas de proteína G se añadieron a continuación al extracto y se incubaron. En cada caso, se lavaron las perlas tres veces para eliminar las proteínas contaminantes y la fracción no unida. Se eluyeron las perlas en tampón que contenía urea 8 M y se analizaron en la primera dimensión por enfoque isoeléctrico (gradiente formado con una mezcla de 10 anfolina de pI de 5-7 (50%), 0,3-10 (40%), 2-11 (10%) y SDS-PAGE reductor (15% gel) en la segunda dimensión.
La purificación de p30 por MEVH:Fc se controló por comparación con las muestras purificadas por RLTβ:Fc o RFNT60:Fc. Las proteínas purificadas RLTβ:Fc, LTα1β2, se 15 aislaron de las células II-23.D7 estimuladas con PMA se presentan en la figura 4A, y las proteínas unidas a RFNT60:Fc que se utilizó para eliminar LTα del extracto se presentan en la figura 4B. La p30 purificada por MEVH:Fc como se describió anteriormente se muestra en la figura 4C. En la primera banda de cada gel se muestran los marcadores de peso molecular marcados con 14C y en la segunda banda están la serie de proteínas 20 unidas al receptor:Fc en la segunda dimensión solamente.
LTα es segregada por las células II-23.D7 después de la activación con PMA (Ware et al. (1992) citado más arriba, Crowe et al. (1994), Science 264:707). MEVH:Fc y RFNT:Fc precipitadas segregaron LTα de las células II-23.D7 estimuladas con PMA y ionomicina 25 como se indica por SDS-PAGE. LTα migra en un intervalo de pesos moleculares debido a la heterogeneidad en la glucosilación (Browning et al. (1991) mencionado anteriormente). RFNT60:Fc, pero no MEVH:Fc precipitaron también FNT (17 kDa, confirmando de este modo los resultados de los estudios de competición descritos más arriba. RLTβ:Fc, como era de esperar, no se unió a ninguna proteína segregada, pero precipitó el complejo de 30 LTβ (33 kDa) y LTα (23-25 kDa) procedente de extractos detergentes de células II-23.D7 activadas con PMA. Sin embargo, cuando el estímulo incluía ionomicina y PMA, RLTβ:Fc precipitó una banda mayor de 30 kDa, así como una pequeña cantidad de LTβ a 33 kDa y LTα entre 23 y 25 kDa. RFNT60:Fc precipitó una proteína de 23 kDa idéntica en tamaño al precursor LTα. En cambio, MEVH:Fc precipitó las proteínas tanto de 30 kDa como de 23 35 Kda. Tres anticuerpos monoclonales diferentes que bloquean el receptor contra LTβ no pudieron eliminar la proteína de 30 kDa del extracto antes de la adición de MEVH:Fc, lo que indica que la proteína p30 no está relacionada antigénicamente con LTβ. Sin embargo, los anticuerpos anti-LTα eliminaron la banda de 23 kDa procedente de los extractos, lo que indica relevancia de ella para LTα. La incapacidad de los anticuerpos de 40 LTα para clarificar previamente las bandas tanto de 30 kDa como de 23 kDa demuestran que estas proteínas no están asociadas entre sí, a diferencia de LTα y LTβ que forman heterotrímeros (Androlewicz et al., citado más arriba).
Se purificó LIGHT (p30) procedentes de las células II-23.D7 por cromatografía de 45 afinidad. Se utilizaron etapas sucesivas de RFNT60:Fc y MEVH:Fc, de modo que RFNT60 elimina LTα de los extractos y de este modo no interfiere con el enlace de p30 a MEVH:Fc.
La electroforesis bidimensional (2D) que une MEVH:Fc, RFNT60:Fc o RLTβ:Fc
murina dio a conocer que p30, tiene una relación carga a masa distinta en comparación con LTα y LTβ. LTβ en el complejo LTα1β2 precipitada por RLTβ:Fc es ácido con cuatro isómeros de carga distinta que oscilan en pI entre 5 y 6,5 con un aumento detectable de masa de las formas ácidas (figura 4A). Ltα, como complejo con LTβ o el homotrímero LTα unido a RFNT60 (figura 4B), tiene siete isómeros distintos que oscilan en pI entre 7 y 8,5; 5 el precursor de LTα de 23 kDa tiene el pI más básico (≥ 9). El pI de LTα sin secuencia señal es 8,9. Estos resultados son característicos de los aductos de glucosilación y concuerdan completamente con los estudios publicados anteriormente para LTα y LTβ (Browning et al. (1991) mencionado anteriormente). En cambio, p30 migró como una banda ancha (pI 7- 8,5) que bajo menor intensidad se resuelve en tres bandas (figura 4C). 10 La heterogeneidad de la carga sin cambio discernible en la masa de p30 es posiblemente el resultado de la modificación tras la traducción tal como la adición de fosfatos o fosfolípidos.
Estos resultados demuestran claramente que MEVH se une a una nueva proteína de 15 la superficie celular de 30 kDa (aislada del hibridoma II.23.D7 de los linfocitos CD4+ T humanos) con isómeros de pI 7 a 8,5, que se cita como p30 o ligando MEVH (o LIGHT). p30 es antigénica y físicamente distinta de LTβ. El ligando MEVH es también reconocido por RLTβ:Fc pero no por RFNT.
20
EJEMPLO 4. La glucoproteína con envoltura de gD de VHS compite con el ligando MEVH endógeno (p30) por el enlace a MEVH:Fc.
Este ejemplo demuestra el enlace de la proteína gD-1 del virus herpético VHS a 25 MEVH y que gD-1 soluble compite con el ligando MEVH, o p30 (LIGHT) por el enlace a MEVH. Los datos demuestran que la proteína gD-1 del VHS es un antagonista de p30 (LIGHT) que se une a MEVH, también demuestran que p30 puede actuar como antagonista de la proteína gD-1 del virus herpético a MEVH.
30
MEVH:Fc (2 μg/ml) se incubó previamente durante 30 minutos a 4ºC con gD-1 (250 μg/ml) o gD-1 (Δ290-299) (100 μg/ml) y a continuación se añadió a PMA y células II-23.D7 activadas por ionomicina (como en el Ejemplo 1). La tinción de fondo se determinó con huIgG y es igual a MEVH:Fc+ gD-1 (Δ290-299). El enlace de MEVH:Fc a las células II-23-D7 activadas se comparó con concentraciones escalonadas de gD-1 o gD-1 (Δ290-35 299) (para el protocolo, véase el Ejemplo 1).
La posibilidad de que gD del VHS pueda funcionar como antagonista del enlace del ligando MEVH (ligandos celulares, p. ej, p30) a MEVH fue sugerida por el enlace de la proteína gD-1 del VHS a MEVH. gD-1 soluble y un mutante de gD, gD-1 (Δ1290-299t) con 40 enlace aumentado para MEVH, fueron ambas eficaces en el bloqueo del enlace de MEVH a la superficie de las células II-23.D7 activadas (figura 5A) (que expresan a p30). La concentración inhibidora eficaz de las proteínas gD-1 se correlaciona con su afinidad por MEVH (figura 5B). El enlace de RLTβ:Fc o el enlace de RFNT60:Fc con PMA o PMA/ionomicina activó las células II-23.D7 no fue inhibido por gD-1 (Δ290-299t), lo que 45 indica que la interacción MEVH:gD-1 es muy específica. Este resultado sugiere que gD-1 ha coproducido específicamente el enlace a MEVH aún cuando MEVH se une a ligandos que son reconocidos por RFNT60 y RLTβ. Estos resultados indican que gD-1 es una virocina anclada a la membrana y puede modular las actividades de señalización de
MEVH durante la introducción o ingreso del VHS procedente de la célula infectada.
EJEMPLO 5. Reticulación de MEVH de la superficie celular produce activación de linfocitos 5
Este ejemplo demuestra que el anticuerpo anti-MEVH favorecía el aumento de proliferación de los linfocitos en la sangre periférica (PBL) inclutendo los linfocitos T y los linfocitos B. Los datos demuestran que el anticuerpo anti-MEVH puede favorecer la proliferación de los PBL (que también expresan MEVH-ligando, p30 o LIGHT) también 10 demuestra que p30 asociada a la célula (LIGHT) puede funcionar como señal que produce proliferación para los PBL. Además, el descubrimiento de que el anticuerpo anti-MEVH añadido a las estirpes de linfocitos B cultivadas en un medio bajo en suero estimuló su crecimiento en función de la dosis, también demostró que la señalización de MEVH, por ejemplo, LIGHT que se une a MEVH, puede estimular la proliferación de linfocitos B. 15
Activación de linfocitos T. Los linfocitos de la sangre periférica recién aislados se incubaron en un medio que contenía diluciones escalonadas de anti-MEVH de conejo o suero preinmunitario (Montgomery (1996) más arriba) y PMA a una dosis submitógena (1 μg/ml). Se midió la proliferación después de 3 días por incorporación de 3H-timidina en 20 ADN evaluado por recuento de β-centelleo.
Los linfocitos de la sangre periférica recién aislados se activaron con fitohemoaglutinina (PHA) a 5 μg/ml y se cultivaron en medio con IL-2. Después de 17 días las células se volvieron a estimular con diluciones escalonadas de antisuero anti-MEVH y 25 anticuerpo anti-CD3 (OKT3) a una concentración submitógena (1,5 μg/ml). Se midió la proliferación después de 3 días como anteriormente.
Análisis citométrico de flujo de linfocito B. Células RAJI linfoblastoides humanas se sometieron a análisis citométrico de flujo mediante incubación con antisuero anti-MEVH 30 (dilución 1:100) o IgG de conejo de referencia a 4ºC y se tiñeron con IgG anticonejo desarrollada en cabra conjugada con ficoeritrina. Se analizaron 104 células para cada histograma.
Activación de linfocitos B. Se transfirió RAJI al medio que contenía FBS al 2% durante 35 24 horas y a continuación se incubó durante 3 días en presencia de las diluciones indicadas de anticuerpo-anti-MEVH de conejo o medio solo. Se evaluó la proliferación celular tal como se describió anteriormente.
El MEVH se expresa en linfocitos CD4+ T lo que sugiere que podría funcionar como 40 una molécula coestimulante para la proliferación celular durante la fase inicial de una respuesta inmunitaria. A concentraciones subóptimas de PMA el anticuerpo anti-MEVH favorecía el aumento de proliferación de linfocitos de la sangre periférica indicada por un aumento de absorción de 3H-timidina medido después de 3 días de cultivo (figura 6A). Los linfocitos con memoria, generados por cultivo continuado de 10 a 17 días después de la 45 activación con PHA, se reactivaron también con anticuerpo anti-MEVH a concentraciones subóptimas de anticuerpo anti-CD3 (figura 6B). Este resultado indicó que MEVH funciona en la fase efector de la respuesta inmunitaria. Debido a que los anticuerpos pueden simular la acción de los ligandos relacionados con FNT (Engelmann (1990), J. Biol. Chem.
265:14497), estos resultados indican que el ligando MEVH de 30 kDa asociado a las células puede funcionar como señal que provoca proliferación para linfocitos T.
Se ha demostrado anteriormente que LTα estimula las actividades de mejora del crecimiento para los linfocitos B, incluyendo las estirpes celulares transformadas por el 5 virus de Epstein-Barr (Abken (1992) J. Immunol. 149: 2785; Estrov (1993) J. Exp. Med. 177:76; Kehrl (1987) Science 238: 1144, Gibbons (1994) Eur. J. Immunol. 24:1879). MEVH se expresa también en estirpes linfoblastoides B (figura 7A). Anti-MEVH cuando se añade a cultivos de estirpes de células RAJI B en medio con suero al 2%, estimulaban la absorción de 3H-timidina en función de la dosis, lo que indica que MEVH puede señalizar 10 el mantenimiento de la viabilidad de linfocitos B en suero bajo (figura 7B). LTα presentó un efecto estimulante de 2 a 3 veces en este ensayo. La presencia de RFNT60 y RFNT80 como factores de crecimiento negativos puede contribuir a una baja respuesta a LTα. El efecto positivo del anticuerpo anti-MEVH puede ser una propiedad exclusiva de p30 (ligando MEVH, LIGHT). 15
EJEMPLO 6. Producción de MEVH:Fc de ratón
Este ejemplo demuestra la construcción de un montaje recombinante MEVH:Fc de 20 ratón.
La zona extracelular de MEVH de ratón se amplió por RCP procedente del ADNc de mMEVH (Hsu et al., 1997) partiendo de MetI y finalizando en Ser205 (cebador anterior = 5’-tatGGATTCatggaacctctcccaggat-3’, y cebador complementario 5’-25 tatGGATTCggaggagcaggt ggtgtctgt-3’; ambos cebadores contienen un secuencia BamHI. El producto de RCP de 550 pb se purificó por Wizard PCR Preps (Promega), se digirió con BamHI y a continuación se ligó en el marco en el vector pVL1392 (Pharmingen) de baculovirus cortado con BgIII que contiene la zona Fc de la IgC1 humana en el extremo 3’ de la inserción MEVH (pVL1392-mMEVH:Fc). La mezcla de reacción de ligadura se utilizó 30 para transformar las células competentes XL-1 azul (Stratagene) para la preparación del plásmido.
Se colocaron en placas células TN5 de insecto (1,25 x 106) en un matraz T25 en 4 ml de medio Excell 401 (JHR Biosciences) y se dejó atacar durante 2 horas. Las células TN5 35 se transfectaron conjuntamente con 1 μg de plásmido pVL1392-MEVH:Fc y 250 ng de ADN BaculogoldTM (Pharmingen) utilizando 14 μg de LipofectinTM (Gibco BRL). Al día siguiente se cambió el medio y se recogió el sobrenadante que contiene virus durante 4 días. Se amplió el virus para preparar una solución madre para la producción de proteínas.
40
Se produjo MEVH:Fc de ratón en células TN5 de insecto y se purificó hasta la homogeneidad como se describe (Crowe et al., 1994). En resumen, se infectaron células TN5 con baculovirus recombinante que contenía mMEVH:Fc a una M.O.I. de 10. Después de 3 días se recogió el sobrenadante, se clarificó de células y deshechos y se trató con inhibidores de proteasa. Se obtuvo la proteína mMEVH:Fc purificada por cromatografía de 45 afinidad con la proteína A con una elución ácida (pH 2,5). El análisis de mMEVH:Fc por SDS-PAGE presentaba una sola banda de proteína a 58 kDa en condiciones reductoras (véase la figura 8). La preparación fue interpretada por la prueba de lisado de Limulus hasta estar exenta de endotoxina detectable.
EJEMPLO 7. Efecto inhibidor de MEVH:Fc de ratón sobre la inflamación (hipersensibilidad de tipo retardado en ratones)
5
Este ejemplo demuestra que la proteína de fusión MEVH:Fc recombinante, soluble de la invención tiene efecto inhibidor sobre la inflamación in vivo utilizando un modelo animal reconocido por la técnica.
Se inmunizaron ratones BDF1 hembra de ocho semanas de vida (Japan SLC Inc., 10 Shizuoka, Japon) (N = 8) con 50 μg de OVA absorbida en 1 mg de alúmina por inyección subcutánea. Después de 7 días se administró mMEVH:Fc o IgG de referencia por inyección intraperitoneal y los ratones se sometieron a la prueba de provocación en la almohadilla del pie con 10 μg de OVA absorbida en 50 μg de alúmina. Se realizaron mediciones del espesor de las almohadillas del pie derecho justo antes y 24 horas 15 después de la prueba de provocación con antígeno, y se calculó la hinchazón (porcentaje de aumento) de la almohadilla del pie. La supresión de 300 μg de mMEVH:Fc fue estadísticamente significativa (P< 0,05) como muestran los datos resumidos en la figura 9.
20
EJEMPLO 8. Efecto inhibidor de MEVH:Fc de ratón sobre la artritis provocada por colágeno en ratones
Este ejemplo demuestra que la proteína de fusión MEVH:Fc de la invención tiene un efecto inhibidor sobre la inflamación in vivo utilizando un modelo de animal reconocido por 25 la técnica para artritis.
Se inmunizaron ratones DBA/1 de 6 semanas de vida (Seatec Yoshitomi, Hukuoka, Japón) (N=10) con emulsiones de 100 μg de colágeno bovino de tipo II y 100 mg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) en adyuvante incompleto de Freund en la base de la 30 cola por inyección subcutánea y se reforzaron 28 días después con la misma emulsión. Se administraron por vía intraperitoneal sesenta μg MEVH:Fc o IgG de referencia dos veces a la semana comenzando el segundo día de inmunización. La puntuación clínica para cada pata se evaluó por referencia con la escala siguiente: 0 = normal, 1 = hinchazón y/o eritema de un dedo, 2 = hinchazón y/o eritema de dos o más dedos, 3 = hinchazón y/o 35 eritema de la pata completa, 4 = hinchazón y eritema completos de la pata entera e incapacidad para doblar el tobillo. La puntuación CIA se expresó como valor acumulado para todas las patas, con un máximo de 16 (figura 10). Los datos presentados en la figura 10, demuestran que MEVH:Fc tenía un efecto significativo sobre la inflamación de la almohadilla del pie y del tobillo. 40
EJEMPLO 9. Inhibición de la infección por virus herpético por LIGHT homotrimérico soluble
45
Este ejemplo demuestra que los polipéptidos LIGHT homotriméricos solubles de la infección pueden bloquear la entrada del virus herpético en las células in vivo. Se demuestra además que la actividad antivírica de LIGHT es por su enlace a RLTβ y no a MEVH. Este ejemplo demuestra además que tanto LIGHT como LTα pueden evitar la
infección por virus de las células en función de la dosis (figura 12).
Los virus herpético tienen mecanismos genéticos que dirigen específicamente los sistemas de citocinas de la superfamilia FNT, lo que sugiere que el sistema inmunitario ha producido mediciones de contador específicas para suprimir la reactivación del virus 5 herpético o para propagarse en el hospedador.
Se probó LIGHT junto con otras citocinas para determinar su capacidad para inhibir la infección por citomegalovirus (CMV). Para investigar las propiedades antivíricas y biológicas de LIGHT, se preparó una forma soluble por modificación genética que eliminó 10 los dominios de la cola citoplásmicos y transmembranarios. Una forma recombinante soluble de LIGHT que carece de los 66 aminoácidos con terminal N se produjo, tal como se describe con detalle en el Ejemplo 12, a continuación, y se denomino "LIGHTt66". LIGHTt66 soluble producida de manera recombinante y sus mutantes fueron segregadas exclusivamente como homotrímeros (LIGHT natural de expresada como homotrímero). 15
Se infectaron fibroblastos dérmicos humanos normales con la cepa clínica de CMV humano (HCMV) Fiala (HCMV-F) o la cepa de laboratorio AD169 de HCMV a baja multiplicidad de infección (MOI) de 0,05. Las citocinas que señalan por la RFNT1 (Ltα) o la RLTβ (LTα1β2, LIGHT) se añadieron al sobrenadante de cultivo y se incubaron durante 7 20 días.
La adición del efecto citopático vírico completamente bloqueado por LTα (CPE). Esta inhibición era específica porque la proteína RFNT de tipo I soluble (RFNT:Fc) neutralizó el efecto antivírico (figura 11A y 11B). Además, un mutante puntual de LTα (Y108F) que no 25 puede unirse ya a RFNT pero que conserva integridad de configuración, fue capaz de bloquear la propagación de HCMV (figura 11C).
LTα1β2 y LIGHT, los cuales se unen a la RLTβ, fueron capaces también de bloquear el CPE vírico (figura 11D, 11E). Un mutante puntual de LIGHT (G119E) es incapaz de 30 unirse a la RLTβ, pero que conserva el enlace a MEVH, fue incapaz de inhibir la propagación de HCMV (figura 11F). Esto indica que la actividad antivírica de LIGHT es probable que sea por unión a la RLTβ y no a la MEVH.
EL análisis cuantitativo de la actividad anti-HCMV de LTα, LTα1β2 y LIGHT se realizó 35 midiendo la expresión tanto de la proteína precoz inmediata mayor (IE1) y la proteína pp28 de tegumento tardío por inmunotransferencia Western. LTα y LIGHT presentaban actividades antivíricas relativas similares, pudiendo inhibir completamente el efecto citopático de HCMV a una concentración de 100 pM, mientras que LTαβ2 fue aproximadamente 10 veces menos eficaz. Los anticuerpos monoclonales específicos para 40 el receptor de linfotoxina (RLTβ) eran también potentes inhibidores de la extensión de HCMV.
Además, los estudios que utilizan virus herpético γ de ratón presentaban una reducción en las unidades de formación de placa (figura 12). Las células de riñón de mono 45 búho en microplacas de 12 pocillos se infectaron con 500 unidades formadoras de placa (UFP) por pocillo durante 60 minutos a 37ºC y se cubrieron con carboximetilcelulosa (0,75%) en medio que contiene suero bovino fetal (SBF) con o sin LIGHT o LTα a las concentraciones indicadas. Después de 7 días, las células se fijaron con metanol y se
tiñeron con Genisa, cada dato puntual en la figura 12 es el número promedio de placas en dos pocillos. Los datos demuestran claramente que tanto LIGHT como LTα fueron capaces de disminuir significativamente el número de células infectadas en función de la dosis.
5
El MHV-68 de ratón es similar al VEB y HHV-8 de los virus de herpes γ humanos. VEB está implicado como factor oncógeno en determinados canceres humanos incluyendo el linfoma asociado a VEB y el carcinoma nasofaríngeo. HHVE se une al sarcoma de Kaposi asociado al SIDA.
10
EJEMPLO 10. Actividades biológicas de LIGHT homotrimérico soluble
Este ejemplo demuestra que un polipéptido LIGHT homotrimérico recombinante y soluble de la invención es activo en varios ensayos de respuesta celular, incluyendo la 15 apoptosis de la estirpe de las células HT29 de adenocarcinoma y la inducción de ICAM-1 en fibroblastos.
Como se expuso en el Ejemplo 9 anterior, para investigar las propiedades biológicas de LIGHT t66 se realizó una forma soluble, LIGHT t66 producida de manera recombinante 20 (descrita con detalle en el Ejemplo 12) se preparó. Aunque este polipéptido soluble carece de dominios, de cola citoplasmática y transmembranarios del p30 natural, conserva la estructura terciaria homotrimérica natural.
Las células HT29 y las estirpes celulares 293 se adquirieron en ATCC; las células 25 HT29 procedían de adenocarcinoma humano, ATCC número HTB-38 (véase, por ejemplo, Chen, (1987) Cancer Genet. Cytogenet. 27:125-134). Ambas estirpes celulares se cultivaron en MEM que contenía FBS al 10% con glutamina y penicilina/estreptomicina.
Se transfectaron células 293 de forma estable con ADNc que codifica el polipéptido 30 LIGHT humano soluble (véase Ejemplo 12). Los clones con polipéptidos soluble de gran expresión se seleccionaron para el cultivo a gran escala. El medio gastado de células 293-LIGHT se recogió por purificación mediante una combinación de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. Se purificó LIGHT hasta homogeneidad (véase la figura 13) con un rendimiento de 10 a 15 mg/l y con niveles de endotoxina inferiores a 0,1 unidades de 35 endotoxina/mg.
La actividad de la proteína LIGHT purificada se midió mediante un ensayo ELISA específico que utiliza formas solubles de RLTβ o MEVH en una forma unida a la placa. LIGHT soluble recombinante (LIGHT t66 homotrimérica) se une eficazmente a MEVH de 40 ratón y RLTβ como formas humanas homólogas.
LIGHT es activa en varios ensayos de respuesta celular, incluyendo la apoptosis de las células HT29 y la inducción de ICAM-1 en fibroblastos (ICAM es un marcador de adherencia celular de inflamación). LIGHT es tan eficaz como LTα1β2 en provocar la 45 muerte de células HT29, pero débil en comparación con la capacidad de FNT o LTα para provocar la expresión de ICAM-1. Este último resultado sugiere que LIGHT puede no ser proinflamatorio. LIGHT in vivo no parece ser proinflamatorio o tóxico porque los ratones inyectados con LIGHT purificado (dosis máxima probada de 200 μg por ratón), no pudo
presentar los síntomas de choque observados cuando se administran FNT o LTα a esta dosis.
EJEMPLO 11. NF-κB, pero no TRAF, es necesario para el efecto antivírico mediado 5 por LIGHT
Este ejemplo demuestra que la actividad antivírica de LIGHT homotrimérica y soluble y linfotoxina (LT) requiere la actividad de NF-κB (células que carecen de actividad NF-κB eran refractarias a los efectos de LIGHT) (véase la figura 14). De este modo este ejemplo 10 demuestra que la activación de la actividad de NF-κB dependiente de la ruta apoptósica que está implicada en la actividad anti-CMV de LIGHT.
No se observó muerte celular en los fibroblastos dérmicos humanos normales (FDHN) tratados con LTα, LTα1β2 o LIGHT. Esto demuestra que la actividad antivírica de estas 15 citocinas puede ser independiente de la ruta de muerte apoptósica que puede ser desencadenada por la RFNT. Esto sugiere que un mecanismo dependiente de NF-κB puede ser operativo, ya que éste es la otra ruta principal activada por este receptor. NF-κB controla también la transcripción de varias proteínas antiapoptósicas en fibroblastos contrarrestando de este modo la ruta apoptósica. 20
Para probar esta hipótesis, un mutante dominante negativo del inhibidor de la sub unidad NF-κBα (IκBαM) se introdujo en NHDF por transducción con vector retrovírico. Este mutante no puede fosforilarse y por tanto continúa siendo un complejo estable con NFκB. Esto evita la transcripción de los genes dependientes de κB. Tanto FNT como LTα no 25 pudieron provocar la expresión de ICAM-1 en NHDF-IκBαM, demostrando la eficacia (de inhibición de NFκB) del mutante negativo dominante IκBαM.
Las células NHDF-IκBαM se compararon a continuación con las células transducidas con vector solo (NHDF-LXSN) o la capacidad de varias citocinas para inhibir la replicación 30 de HCMV. Se descubrió que las células NHDF-IκBαM eran refractarias a los efectos de linfotoxinas y LIGHT (figura 14). Niveles significativamente mayores de IE1 y pp28 se observan para una concentración de citocina dada en NHDF-IκBαM en comparación con NHDF-LXSN.
35
Además, aumentó 10 veces el HCMV infeccioso procedente de las células NHDF-IκBαM en presencia de citocina. Significativamente, HCMV se replicó asimismo bien en NHDF-IκBαM que en las células NHDF-LXSN en ausencia de citocina, analizada mediante la expresión de IE1 y pp28 y valor vírico. Este resultado indica que NF-κB no es esencial para la replicación vírica eficaz en fibroblastos, aunque el activador IE contiene múltiples 40 elementos de respuesta de NF-κB.
TRAF3 se recupera directamente de la RLTβ donde está implicada en la señalización de la apoptosis, pero no en la activación de NFκB. Esto se demostró por mutantes dominantes negativos de TRAF3. Los mutantes dominantes negativos de TRAF3 45 (TRAF3Δ7 y TRAF3Δ11) introducidos en las células NHDF por transducción retrovírica similar a IκBαM, permanecieron sensibles a la actividad antivírica de LIGHT y linfotoxinas. Esto indica la activación de la ruta apoptósica dependiente de la actividad de NFκB no está implicada en la actividad antivírica (anti-CMV) de LIGHT soluble.
EJEMPLO 12. Producción y caracterización de LIGHTt66 soluble (homotrimérico) y mutantes puntuales de LIGHTt66
5
Este ejemplo demuestra la construcción y el aislamiento de polipéptidos LIGHT recombinantes y solubles (utilizados en los Ejemplos 9 a 11, 13 a 14), incluyendo aquellos con cambios de un solo resto (es decir, mutantes puntuales), que, como se demuestra a continuación se segregan como homotrímeros.
10
Una forma soluble recombinante de LIGHT que carece de 66 aminoácidos con terminal N se produjo, (denominada LIGHTt66). La LIGHT truncada, soluble se modificó genéticamente más para incluir la etiqueta "FLAG" para la purificación por inmunoafinidad por al anticuerpo anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO). El montaje truncado y marcado con FLAG se denominó LIGHTt66-FLAG. 15
Las células HT29 y 293 se adquirieron en la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% con glutamina y penicilina/estreptomicina. Los fibroblastos dérmicos humanos normales neonatales (células NHDF) se adquirieron en Clonetics, San Diego, CA y se cultivaron en 20 DMEM enriquecido con suero bovino fetal al 10%, insulina (5 pg/ml) y factor de crecimiento de fibroblastos (1 pg/ml) (Sigma, St. Louis, MO).
Se produjo LIGHTt66-FLAG en células de mamífero (293) transfectadas de manera estable. Se cultivaron células 293 transfectadas de manera estable en cultivos en frascos 25 rodantes en DMEM que contenía FBS al 0,5%. La concentración de LIGHTt66 alcanzó 10 mg/l en cultivos de 7 días. LIGHTt66 se purificó en parte en sobrenadantes de 7 días por un procedimiento de intercambio iónico. El sobrenadante se diluyó 1:2 en Tris 20 mM, pH 7,0, de modo que la concentración inicial de NaCl fue 50 mM, se cargó en una columna SP HitrapTM (Pharmacia). Después del lavado, LIGHT t66 se eluyó utilizando Tris 30 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,0. Después de la diálisis en PBS, LIGHT t66 se purificó más por cromatografía de afinidad en una columna de anti-FLAG (M2) monoclonal acoplada a AffigelTM (Biorad). LIGHT t66 se eluyó de la columna utilizando glicina 20 mM, NaCl 150 mM y se neutralizó inmediatamente mediante recogida en Tris 50 mM, pH 7,4.
35
Una forma soluble de LIGHT (LIGHT t66) con adición de epítopo FLAG del terminal N se produjo en las células 293 transfectadas de formas estable y se purificó hasta la homogeneidad por intercambio iónico seguido de purificación por inmunoafinidad en una matriz de afinidad de anti-FLAG (M2) monoclonal. El rendimiento final de la proteína fue del 80% y la pureza > 95% (figura 15A). 40
La modificación de la secuencia introducida por el cebador se utilizó para LIGHT soluble con las siguientes sustituciones de un solo aminoácido: G119E, L120Q, Q117T e Y173F. En resumen, se diseñaron cebadores internos para introducir una secuencia de restricción en la posición de la mutación. Los cebadores anterior y complementario que 45 contienen las mutaciones se utilizaron en reacciones RCP por separado para ampliar dos zonas de LIGHT soluble. Los cebadores fueron los siguientes:
- Q117T:
- 5’ACGGGCCTGGCCTXCTGA_3’,
- 5’_ACTCTCCCATAACAGCGGCC_3’.
- G119E:
- 5’GAGCTGGCC_ITGCTGAGGGGCCT_3’, 5’CAGCTGAGTCTCCCATAACA_3’
- L120Q:
- 5’CAGGCC_ITCCTGAGGGGCCTCA_3 5’_GCCCAGCTGAGTCTCCCATAA_3’.
- Y173F:
- 5’TTCCCCGAGGAGCTGGAGCT_3’ 5’_GCGGGGTGTGCGCTTGTAGA_3’.
Se ligaron los productos de la RCP a la secuencia de la enzima de restricción introducida por el cebador para crear LIGHT soluble comenzando en el aminoácido t66 y que contiene una de las cuatro sustituciones de aminoácidos. Los mutantes de LIGHT t66 se ligaron en la casete activada por FLAG, pBABE-FLAG que contiene la secuencia señal 5 V-cam fusionada al epítopo FLAG. Las inserciones mutantes de FLAG-LIGHT de V-cam se clonaron en pCDNA3.1 (+) (Invitrogen). Todos los mutantes se secuenciaron (secuenciador automático ABI310) para verificación inequívoca. Para la producción de proteínas, se transfectaron células 293T (1,5 x 106 células/placa de 10 cm) con 5 pg de ADN. Se recogió medio que contenía proteína soluble después de 24 h de cultivo. 10
Los mutantes de LIGHTt66-FLAG se purificaron en sobrenadante de cultivo de 24 h en un procedimiento de inmunoafinidad en una etapa utilizando una matriz de afinidad de anticuerpo anti-FLAG monoclonal (M2) acoplada a AffigelTM (5 mg de anticuerpo por ml de gel). El sobrenadante del cultivo (50 a 100 ml) se pasó sobre 0,5 ml de matriz de afinidad. 15 El gel se lavó con 10 volúmenes de PBS y la proteína ligada se eluyó con alícuotas de 0,5 ml de glicina 10 mM/HCl, pH 3,0 y se neutralizó inmediatamente por recogida en TRIS 50 mM pH 7,4. Se dializaron las fracciones que contenían la proteína frente a PBS.
Cuatro mutantes por cambio de un solo aminoácido de LIGHT t66 activada por FLAG, 20 Y173F, G119E, L120Q y Q117T se generaron en células 293T transfectadas temporalmente, como se describe en la presente memoria. Y173F es el análogo del mutante Y108F de LTα, que está situado en el bucle D-E. El homotrímero 108F de LTY no puede unir receptores. Q117T, G119E y L120Q son tres mutaciones adyacentes en los bucles A-A, conservados entre LTβ y LIGHT, que el modelado molecular predice están 25 implicadas en el enlace del receptor.
La proteína se purificó por inmunoafinidad en sobrenadantes de cultivo en un procedimiento de una etapa utilizando anticuerpo anti-FLAG (M2) monoclonal, acoplado a Affigel (figura 15B). La pureza para todas las proteínas fue > 95%. 30
Se determinaron a continuación los mutantes puntuales trimerizados. El análisis por reticulación y por filtración en gel FPLC, seguido de ELISA y transferencia de manchas de las fracciones, demostraron que LIGHT t66 y sus mutantes se segregaron exclusivamente como homotrímeros, sin ningún material monomérico contaminante detectable o agregado 35 (figura 15 C y D).
Se utilizaron ensayos ELISA para cuantificar polipéptidos LIGHT t66 recombinantes (incluyendo las mutaciones puntuales). La molécula de captura, MEVH:Fc murina, MEVH:Fc humana, LTβR:Fc murina o LTβR:Fc humana, se inmovilizó en los pocillos de 40 una placa del microvalorador (150 ng/pocillo en 50 μl de Tris 20 mM/NaCl 150 mM, pH 9,6) durante 16 h a 4ºC. Después del lavado con PBS/Tween al 0,5%, se aplicaron
muestras diluidas en PBS/BSA al 3% y se incubaron durante 1 h a t.a. Después los pocillos de lavado se incubaron con anti-FLAG (M2) monoclonal (10 μg/ml en PBS/BSA) durante 1 h a t.a., se lavó y se incubó con HRP antirratón desarrollada en cabra (1:5000) durante 1 h a t.a. Tras el lavado final, se desarrolló el color con 2,2'.AZINO-bis (ÁCIDO 3-ETILBENZOTIAZOLIN-6-SULFÓNICO) (Sigma). La D.O. se midió a 415 nm en un lector 5 de placas SpectraMax (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA).
LIGHT parcialmente purificado se reticuló mediante la adición de bis[2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) a concentraciones finales de 0,1 y 1 mM o por adición de glutaraldehído (0,1% y 1%) 10 durante 30 min a 4ºC con rotación. La reacción se interrumpió por la adición de TRIS (20 mM, pH 8,0). Se analizaron muestras reticuladas y de referencia por inmunotransferencia Western utilizando anticuerpo (anti-FLAG) M2 monoclonal.
Para determinar el peso molecular de LIGHT t66 natural, se analizó la proteína 15 purificada por filtración en gel en una columna Superose 12TM utilizando un sistema FPLC 500 (ambos de Pharmacia, Piscataway, NJ). El caudal fue de 0,5 ml/min, se recogieron fracciones de 0,5 ml y PBS fue la fase móvil. Se detectó por ELISA LIGHT en fracciones eluidas. Se determinó el peso molecular relativo de LIGHT t66 por comparación con los perfiles de elución de las proteínas de calibración. 20
EJEMPLO 13. Los ensayos de citotoxicidad demuestran que LIGHT soluble puede activar la apoptosis en las células que expresan receptor de linfotoxina.
25
Este ejemplo demuestra que LIGHT t66 homotrimérico puede inhibir el crecimiento y producir apoptosis en las células que expresan el receptor RLTβ humano. Estos datos indican además que la reticulación de MEVH no provoca apoptosis.
Las células HT29 (véase anteriormente) a razón de 5.000/pocillo, se colocaron en 30 los pocillos de una placa de microvalorador en DMEM (50 μl) en presencia o ausencia de IFNγ (80 U/ml). Diluciones en serie de LIGHT t66 y de otras citocinas se añadieron en 50 μl de medio, de nuevo en presencia o ausencia de IFNγ, y se incubaron las células a 37ºC. Después de 24 a 72 h, se añadieron 20 pl de 5 mg/ml de MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difeniltetrazolio] y se incubó la placa durante 4 h a 37ºC. El medio se 35 aspiró a continuación y se añadieron 100 μl de isopropanol acidificado al 70% añadido para disolver la formacina. Se cuantificó la D.O. a 570 nm.
LIGHT t66 inhibió el crecimiento y produjo apoptosis de las células HT29 con eficacia comparable con LTα1β2 (figura 16A). La citotoxicidad estaba en función de IFNγ 40 (Fig. 16B) y fue máxima después de 72 h. En un intervalo de experimentos, se consiguió 50% de citotoxicidad con dosis de 10 a 100 presente memoria. La citotoxicidad de LIGHT t66 pudo bloquearse por preincubación de LIGHT t66 con RLTβ:Fc o MEVH:Fc humanas en función de la dosis; mientras que Fas:Fc, que no se une a LIGHT, no tuvo efectos (Fig. 16C). 45
En presencia de IFNγ, L120Q y Q117T eran citotóxicas para las células HT29 con eficacia comparable a la de LIGHT t66 (figura 19). Y173F se une tanto a RLTβ hu y MEVH hu, demostró ser más débil, pero la citotoxicidad significativa para estas células, mientras
que G119E, que tiene mayor afinidad para MEVH que Y173F, pero no puede unirse a RLTβ, no presentaba citotoxicidad significativa.
Los datos obtenidos con los mutantes de LIGHT t66 sugieren de manera acusada que la apoptosis de las células HT29 mediada por LIGHT está mediada por RLTβ. Para 5 confirmar esta hipótesis, y para determinar si la reticulación de MEVH mediada por LIGHT potencia o inhibe la apoptosis mediada por RLTβ, se realizaron experimentos utilizando un panel de anticuerpos anti-MEVH y anti-RLTβ monoclonales y policlonales.
Además, de IgG de MEVH policlonal de cabra e IgG de RLTβ policlonal de cabra, 10 dos anticuerpos anti-MEVH monoclonales de ratón, CW1 y CW8, y dos anticuerpos anti-RLTβ monoclonales de ratón, BDA8 y CDH10 se utilizaron. Todos enlace al receptor apropiado en la superficie de las células HT29 (Fig. 20A). Los anticuerpos anti-MEVH, CW1 y CW8 se utilizaron basándose en los estudios de bloqueo de ELISA, en los que CW8 inhibía la unión de LIGHT a huMEVH, como lo hizo anti-MEVH de cabra policlonal, 15 mientras que CWI no tuvo efecto en el enlace (figura 20B).
A causa de que el anticuerpo BDA8 anti-RLTβ monoclonal se ha demostrado que inhibe la apoptosis de las células HT29 mediada por LTα1β2, mientras que CDH10 se ha demostrado que aumenta este efecto, se investigó si estos anticuerpos pueden afectar la 20 apoptosis mediada por LIGHT de la misma manera. En los estudios de bloqueo de ELISA anti-RLTβ en cabra policlonal y enlace inhibido por BDA8 de LIGHT a RLTβ, mientras que CDH10 no tuvo ningún efecto en el enlace (Fig. 20C).
Anti-RLTβ policlonal en cabra provocó muerte apoptósica lenta de células HT29 en 25 presencia de IFNγ (Fig. 20D), mientras que anti-MEVH policlonal en cabra no afectó la viabilidad celular. Esto sugiere que la reticulación de MEVH no provoca apoptosis en esta estirpe celular.
Además, anti-MEVH policlonal ni mejoró ni inhibió la muerte celular dependiente de 30 anti-RLTβ policlonal (Fig. 20D). La preincubación con anti-RLTβ en cabra policlonal mejoró la sensibilidad de las células HT29 para la destrucción mediada por LIGHT (figura 20E).
DH10, que aumenta la destrucción por LTα1β2, aumentaba también la sensibilidad de las células a LIGHT, mientras que la preincubación con BDA8, que inhibe la 35 destrucción por LTα1β2, dio como resultado citotoxicidad mediada por LIGHT reducida (Fig.20E). La preincubación de las células con anti-MEVH en cabra policlonal o con los anticuerpos anti-MEVH monoclonales CW1 y CW8 no tuvo efecto sobre la sensibilidad para la destrucción por LIGHT.
40
En conjunto, estos datos indican la reticulación de MEVH no provocaron apoptosis, esta señalización de MEVH no se sinergizó con la señalización de RLTβ en la inducción de apoptosis, y que la señalización de MEVH no desencadenó episodios protectores suficientes para interferir con la ruta apoptósica dependiente de RLTβ.
45
EJEMPLO 14. Estudios de fijación de LIGHT a RLTβ humano homotrimérico soluble y MEVH por ELISA y resonancia de plasmón en superficie
Las velocidades de asociación y disociación de la interacción de LIGHT 166 (p30 homotrimérico, soluble) y de los mutantes de LIGHT t66 (descritos anteriormente) con 5 MEVH:Fc humana y RLTβ:Fc se determinaron por resonancia en plasmón de superficie. Se investigaron las características del enlace al receptor por ELISA utilizando los montajes RLTβ:Fc y MEVH:Fc humano (hu) y murino (mu) como moléculas de captura y anticuerpo M2 anti-FLAG para detección (figura 17).
10
La molécula de captura, MEVH:Fc y RLTβ:Fc humanas (50 μg/ml) se acopló a un chip detector CM5 de BIA-core 1000TM (BIAcore Inc., Piscataway, NJ) por acoplamiento de amina a pH 5,0. La superficie del detector se equilibró con PBS (fosfato sódico 20 mM/NaCl 150 mM, pH 7,4) y se recogieron sensorgramos a 25ºC y un caudal de 5 μl/min. Una inyección de 10 μl de LIGHT t66 o de mutante se pasaron sobre la superficie del 15 detector; después de la fase asociación 800 segundos de datos de disociación se recogieron. La superficie del detector se regeneró después de cada ciclo con una pulsación de 10 μl de glicina 10 mM, pH 2,0. Las series de 5 concentraciones de analito, 100 a 500 nM se recogieron y se analizaron por regresión no lineal utilizando el programa informático de BI1A evaluation (2.1TM). La asociación y disociación se fijaron basándose 20 en el modelo ABμA+B sencillo.
LIGHT t66 se une a huMEVH:Fc y huRLTβ:Fc con afinidad comparable. LIGHT t66 se une a muMEVH:Fc y muRLTβ:Fc con afinidad diez veces menor. Los mutantes L120Q y Q117T de LIGHT t66 se unen huMEVH:Fc y huRLTβ:Fc con afinidad comparable a 25 LIGHT t66. Significativamente, L120Q presentó aumento de afinidad para ambos receptores murinos. G119E presentó afinidad reducida pero significativa por huMEVH y unión indetectable a huRLTβ, mientras que Y173F presentó unión reducida pero significativa tanto a huRLTβ como a huMEVH. G119E e Y173F no unieron los receptores murinos. 30
El análisis de la unión de LIGHT t66 y sus mutantes a huRLTβ:Fc y huMEVH:Fc por resonancia de plasmón en superficie confirmó y amplió los datos obtenidos por ELISA (Fig.18). Los resultados se resumen en la Tabla 1. Las fases de asociación y disociación por interacción de LIGHT t66 con ambos receptores bien adaptados con el modelo A+B 35 μAB simple, con ka = 2,7 ± 0,5 x 104 (M/s) para huRLTβ:Fc y 1,2 ± 0,2 x 104 (M/s) para huMEVH:Fc, y kd s = 1,2 ± 0,2 x 10-4 y 4,8 ± 5,1 x 10-5 s-1 huRLTβ:Fc y huMEVH:Fc, respectivamente. Las constantes del índice de disociación intrínseco (kD), calculadas a apartir de la relación kd/ka fueron 4,5 ± 0,7 nM para huRLTβ:Fc y 3,9 ± 3,9 nM para huMEVH:Fc (estos datos son la media de 5 mediciones en un intervalo de concentración 40 de 100 a 500 nM de LIGHT t66).
G119E no presentaba ninguna unión detectable a huRLTβ:Fc y su afinidad por huMEVH:Fc fue aproximadamente 30 veces menor que la de LIGHT t66 (kd = 11 mM). La reducción en la afinidad de G119E por huMEVH:Fc fue debida a un aumento en la 45 velocidad de disociación (kd = 2,0 ± 0,4 x 10-3 s-1). Y173F unió tanto a huRLTβ:Fc como a huMEVH:Fc con afinidad reducida, debido otra vez al aumento de las velocidades de disociación. La afinidad de Y173F por huLT8R (kD = 31 nM) fue de 3 a 4 veces menor que la de LIGHT t66, mientras que la afinidad de Y173F por huMEVH:Fc fue mas de 40 veces
menor (kD = 180 nM).
Q117T unió tanto a huMEVH:Fc como a huRLTβ:Fc, con velocidades de asociación similares a LIGHT t66, y velocidades de disociación más lentas, de modo que la afinidad de este mutante por los receptores aumentó en comparación con LIGHT t66. 5
TABLA 1
- huMEVH:Fc huRLTβ:Fc
- ka (M-1 s-1) kd (s-1) kD (nM) ka (M-1 s-1) kd (s-1) kD (nM)
- LIGHT 166
- 1,2 ± 0,2 x 104 4,8 ± 5,1 x 10-5 3,9 ± 3,9 2,7 ± 0,5 x 104 1,2 ± 0,2 x 10-4 4,5 ± 0,7
- Q117T
- 2,0 ± 0,7 x 104 5,0 ± 4,5 x 106 0,3 ± 0,3 3,2 ± 0,7 x 104 4,5 ± 1,2 x 10-5 1,5 ± 0,7
- G119E
- 1,8 ± 0,4 x 104 2,0 ± 0,4 x 10-3 114 ± 14 Sin enlace
- Y173F
- 1,9 ± 0,2 x 104 3,3 ± 0,1 x 10-3 173 ± 30 3,7 ± 0,8 x 104 1,1 ± 0,4 x 10-3 1 31 ± 8
10
EJEMPLO 15. Regulación por aumento de ICAM por LIGHT humana homotrimérica es mediada por RLTβ
Este ejemplo demuestra que LIGHT homotrimérica, soluble y dos variaciones 15 (mutaciones puntuales en L120Q y Q117T) pueden regular por aumento la expresión de ICAM.
Se utilizaron células NHDF en el paso 5 o anteriores. Se incubaron células (180.000/placa de 4,2 cm2) con citocina en DMEM completo (600 μl/pocillo) enriquecido 20 con insulina y factor de crecimiento de fibroblastos. Después de 36 h se tiñeron las células con un anti-ICAM monoclonal (P2A4; 10 μg/ml) seguido de un IgG-PE antirratón desarrollado en cabra y se analizó por citometría de flujo.
L120Q y Q117T (5 nM) provocó regulación por aumento de la expresión de ICAM 25 por las células NHDF a concentraciones comparables con las conseguidas utilizando LIGHT t66 (inducción al cuádruple) (figura 21). Cuando se utilizó en Y173F 5 nM produjo una ligera inducción de la expresión de ICAM, mientras que a 20 nM la inducción fue de 2,5 veces. A 5 nM G119E no produjo ninguna inducción detectable de la expresión de ICAM y una ligera inducción (<1,5 veces) a 20 nM. 30
EJEMPLO 16. MEVH se localiza junto con TRAF2 y TRAF5, pero no con TRAF3 en la membrana celular
35
Este ejemplo demuestra que MEVH cuando se expresa conjuntamente como proteína recombinante en células 293 con polipéptidos TRAF, se localiza conjuntamente y se une a TRAF2 y TRAF5 (pero no a TRAF3) en la membrana celular.
En los experimentos de transfección conjunta en células 293, se demostró 40 (utilizando microscopia de inmunofluorescencia confocal) que MEVH se localiza junto con TRAF2 y 5, pero no con TRAF3. RLTβ se localizó conjuntamente con las tres TRAF examinadas; la referencia negativa se transfectó conjuntamente con el vector pBabe
vacío. Las TRAF activadas por FLAG se observaron con FITC. RLTβ y MEVH se observaron utilizando rojo de Texas. Las proteínas localizadas conjuntamente aparecían amarillas. MEVH se localizó conjuntamente con las TRAF2 y 5, pero no con TRAF3. RLTβ se localizó conjuntamente con las TRAF 2, 3 y 5.
5
Se demostró también que, MEVH unida a TRAF2 y TRF5 por experimentos en los que la inmunoprecipitación de la MEVH expresada de manera recombinante (por el anticuerpo anti-MEVH) precipitó conjuntamente las TRAF 2 y 5, pero no la TRAF3 (procedente de lisados de células 293 transfectadas). RLTβ precipitó solamente a TRAF3. Véanse las figuras 22a y 22B. 10
Procedimientos de microscopia de inmunofluorescencia confocal
Veinticuatro horas después de la transfección se sembraron células 293T en la cámara Sides de Lab-TekBTM de 8 pocillos (número 177445 del catálogo de Lab-Tek) a 15 razón de 3 x 104 células/pocillo y se cultivaron durante 18 a 36 horas a 37ºC y 5% de CO2. Para la tinción, los pocillos se lavaron dos veces con PBS, se fijaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en paraformaldehído al 2% recién preparado en PBS pH 7,0, se lavaron otra vez dos veces con PBS, y a continuación se permeabilizaron en metanol durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células en PBS, a continuación 20 se bloquearon durante un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente en PBS que contenía BSA al 3%. Anti-RLTβ policlonal desarrollado en cabra se diluyó hasta una concentración final de 20 μg/ml, anti-MEVH policlonal de rata se diluyó hasta una concentración final de 20 μg/ml, y anti-FLAG M2 (Sigma F3165) monoclonal de ratón, se diluyó hasta una concentración final de 5 μg/ml. Los anticuerpos se diluyeron en PBS, 25 BSA al 3% y Triton X 100 al 0,2% (PBS/BSA/Triton). Se añadieron anticuerpos primarios a los pocillos para un volumen final de 120 μl/pocillo y se incubaron en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron a continuación los pocillos tres veces en PBS/BSA/Triton. Los anticuerpos antirratón desarrollados en mono, conjugados con FITC en combinación con anticuerpos anti-cabra desarrollados en mono, 30 conjugados con rojo de Texas (ambos de Jackson immuno Research Laboratories), o anticuerpos anticonejo en mono conjugados con rojo de texas, se diluyeron hasta una concentración final de 1:200 en PBS/BSA/Triton en un volumen final de 120 μl/pocillo. Las secciones se incubaron en una cámara humidificada a temperatura ambiente en la oscuridad durante una hora y a continuación se lavaron tres veces en PBS/BSA/Triton y 35 se eliminaron los pocillos. Se añadieron cuatro microlitros por pocillo de una solución de montaje preparada con 80% de glicerol en PBS sobre las células de cada pocillo y las secciones se cubrieron con portaobjetos de vidrio de microscopio de 24 x 55 (Fisherbrand nº 12-544-18). Los cubreobjetos se mantuvieron a 4ºC en la oscuridad durante 1 a 7 días antes de la observación. 40
Se observaron las células utilizando un microscopio confocal MRC-1024TM de BioRad, con un láser iónico de kriptón/argón y un objetivo de 60x de NikonTM. Se obtuvieron imágenes utilizando el sistema operativo LaserSharpTM y se analizaron y manipularon en Adobe Photoshop 5.0TM. 45
Se tiñeron células HT29 (106/ml en DMEM/3% de BSA) con anticuerpo anti-MEVH o anti-RLTβ monoclonal de ratón durante 30 min a 4ºC seguido de IgG antirratón desarrollada en cabra acoplada a ficoeritrina (PE) durante 30 min a 4ºC y se analizaron
por citometría de flujo utilizando un FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
La invención descrita se caracteriza por la siguiente lista de apartados:
1. Polipéptido p30 homotrimérico aislado o recombinante que comprende un 5 polipéptido monomérico que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que polipéptido homotrimérico se une al polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas.
10
2. Polipéptido p30 homotrimérico aislado o recombinante del apartado 1, en el que el polipéptido monómero comprende isómeros con un pI de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5.
3. Polipéptido p30 homotrimérico aislado o recombinante soluble que carece de 15 un dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas.
4. Liposoma que comprende un polipéptido p30, en el que el polipéptido p30 20 comprende
un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monómero que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que polipéptido homotrimérico se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) 25 o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas, o,
un polipéptido p30 homotrimérico soluble que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de 30 linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas.
5. Proteína de fusión que comprende un polipéptido p30, en el que el polipéptido p30 comprende
35
un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monómero que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que polipéptido homotrimérico se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas, o,
40
un polipéptido p30 homotrimérico soluble que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas.
45
6. Proteína de fusión del apartado 5, en la que la secuencia heteróloga es una etiqueta.
7. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido p30, en el que el
polipéptido p30 comprende
un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monómero que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que polipéptido homotrimérico se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) 5 o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas, o,
un polipéptido p30 homotrimérico soluble que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de 10 linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Kit que comprende una composición farmacéutica y material impreso,
15
en el que la composición farmacéutica comprende un polipéptido p30, en el que el polipéptido p30 comprende un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monomérico que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que polipéptido homotrimérico se une al polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones 20 fisiológicas, o, un polipéptido p30 homotrimérico soluble que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, 25
en el que el material impreso comprende instrucciones para la utilización de la composición farmacéutica, en el que una utilización comprende la inhibición de la introducción del virus en una proliferación celular o vírica en una célula.
30
9. Kit del apartado 8, en el que las instrucciones incluyen la utilización de la composición farmacéutica para inhibir la proliferación del virus en una célula o la entrada en una célula in vivo.
10. Kit del apartado 8, en el que el virus es un virus herpético. 35
11. Kit del apartado 10, en el que el virus es un virus del herpes simple (VHS), un citomegalovirus (CMV), un virus herpético γ o un virus de Epstein-Barr (VEB).
12. Kit del apartado 11, en el que la inhibición de la entrada del virus en la 40 proliferación celular o vírica en una célula es en un mamífero.
13. Kit del apartado 12, en el que el mamífero es un ser humano.
14. Kit que comprende una composición farmacéutica y material impreso, 45
en el que la composición farmacéutica comprende un polipéptido p30, en el que el polipéptido p30 comprende un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monomérico que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30
kDa, en el que polipéptido homotrimérico se une al polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas, o, un polipéptido p30 homotrimérico soluble que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de 5 linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable,
en el que el material impreso comprende instrucciones para la utilización de la composición farmacéutica, en el que una utilización comprende modular enfermedades 10 con proliferación de linfocitos no deseada.
15. Kit del apartado 14, en el que las instrucciones comprenden la utilización de la composición farmacéutica para modular un linfoma o leucemia T o B o una enfermedad autoinmunitaria. 15
16. Kit del apartado 15, en el que la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado o miastenia grave.
20
17. Composición farmacéutica que comprende un vector de expresión que codifica un polipéptido p30 que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa o un polipéptido p30 que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido p30 forma un polipéptido homotrimérico que se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en 25 condiciones fisiológicas.
18. Kit que comprende una composición farmacéutica y material impreso,
en el que la composición farmacéutica comprende un vector de expresión que 30 codifica un polipéptido p30, que presenta un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa o un polipéptido p30 que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido forma un polipéptido homotrimérico que se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y un excipiente farmacéuticamente 35 aceptable,
en el que el material impreso comprende instrucciones para la utilización de la composición farmacéutica, en el que una utilización comprende la focalización de las células tumorales o de los linfocitos activados. 40
19. Kit del apartado 18, en el que la utilización comprende el tratamiento de un tumor por inyección directa de la composición farmacéutica en el tumor.
20. Procedimiento para producir una señal que produce proliferación para un 45 linfocito que comprende
(a) suministrar una composición que se une a MEVH expresado en la superficie celular, y
(b) poner en contacto el linfocito con una cantidad de la composición productora de proliferación.
21. Procedimiento del apartado 20, en el que la composición es un anticuerpo anti-5 MEVH.
22. Procedimiento del apartado 20, en el que el suministro de la composición comprende suministrar
10
un polipéptido p30, un polipéptido p30 soluble, un polipéptido p30 soluble asociado a liposomas, o
un vector que codifica a un polipéptido p30 o una célula que expresa un p30 recombinante como polipéptido p30 asociado a la célula. 15
23. Procedimiento del apartado 20, en el que el linfocito es un linfocito T.
24. Procedimiento del apartado 20, en el que el linfocito es un linfocito B.
20
25. Procedimiento del apartado 20, en el que el linfocito es contactado in vivo.
26. Procedimiento para inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30, que comprende
25
(a) suministrar una composición que inhibe el enlace de un polipéptido p30 expresado en la superficie de la célula a un MEVH o RLTβ expresado en la superficie celular, y
(b) poner en contacto la célula que expresa el polipéptido p30 expresado en la 30 superficie celular o MEVH o RLTβ expresado en la superficie celular con una cantidad de composición suficiente para inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30.
27. Procedimiento del apartado 26, en el que la célula se pone en contacto con la 35 composición in vivo.
28. Procedimiento del apartado 26, en el que la respuesta celular mediada por el polipéptido p30 comprende la inhibición de una respuesta celular de linfocitos.
40
29. Procedimiento del apartado 28, en el que la respuesta de linfocitos inhibidos es la proliferación de linfocitos.
30. Procedimiento del apartado 28, en el que el linfocito inhibido es una célula efectora patógena. 45
31. Procedimiento del apartado 28, en el que la respuesta de linfocitos inhibidos modula un linfoma o leucemia T o B o una enfermedad autoinmunitaria.
32. Procedimiento del apartado 31, en el que la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso diseminado o miastenia grave.
33. Procedimiento del apartado 28, en el que la respuesta de linfocitos inhibidos 5 modula una reacción para un trasplante.
34. Procedimiento del apartado 26 en el que la célula contactada expresa MEVH y la composición es un polipéptido p30 soluble.
10
35. Procedimiento del apartado 26, en el que la célula contactada expresa RLTβ y la composición es un polipéptido p30 soluble.
36. Procedimiento del apartado 26, en el que la célula contactada expresa el polipéptido p30 en su superficie celular y la composición es un polipéptido MEVH soluble. 15
37. Procedimiento del apartado 26, en el que la célula contactada expresa el polipéptido p30 en su superficie celular y la composición es un anticuerpo anti-p30.
38. Procedimiento para tratar tumores que comprende 20
(a) suministrar una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión que codifica un polipéptido p30 que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa o un polipéptido p30 que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido p30 forma un polipéptido homotrimérico 25 que se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y
(b) inyectar directamente la composición farmacéutica en el tumor.
30
39. Procedimiento de modulación de una respuesta celular mediada por el receptor de linfotoxina beta (RLTβ), procedimiento que comprende:
(a) suministrar una composición que inhibe el enlace de un RLTβ a un polipéptido p30; y 35
(b) poner en contacto una célula que o el polipéptido p30 con una cantidad de la composición suficiente para modular la respuesta celular mediada por el receptor de linfotoxina beta (RLTβ).
40
40. Procedimiento del apartado 39, en el que la célula expresa el RLTβ y la composición comprende una composición farmacéutica
en el que la composición farmacéutica comprende un polipéptido p30 que comprende un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monomérico 45 que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que el polipéptido homotrimérico se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas, o, a un polipéptido p30 homotrimérico soluble que carece de dominio
transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
5
41. Procedimiento del apartado 39, en el que la célula expresa un polipéptido p30 y la composición comprende un anticuerpo anti-p30.
42. Procedimiento del apartado 39, en el que la respuesta celular mediada por el receptor de linfotoxina beta (RLTβ) comprende el enlace de un virus herpético a una 10 célula.
43. Procedimiento del apartado 42, en el que el virus herpético está bloqueado desde la entrada en la célula.
15
44. Procedimiento del apartado 42, en el que el virus herpético es un virus del herpes simple (VHS), un citomegalovirus (CMV), un virus herpético γ o un virus de Epstein-Barr (VEB).
45. Procedimiento para inhibir la producción de virus en una célula, procedimiento 20 que comprende
(a) suministrar un polipéptido p30; y,
(b) poner en contacto una célula infectada con un virus herpético o con una célula 25 sensible a la infección por un virus herpético con una cantidad eficaz de un polipéptido p30, inhibiendo de este modo la producción de virus herpético en la célula.
46. Procedimiento del apartado 45, en el que se inhibe la entrada del virus 30 herpético en la célula.
47. Procedimiento del apartado 45, en el que la puesta en contacto es in vivo y se suministra la composición p30 como composición farmacéutica,
35
en el que la composición farmacéutica comprende un polipéptido p30 homotrimérico que comprende un polipéptido monomérico que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 30 kDa, en el que el polipéptido homotrimérico se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina (RLT) en condiciones fisiológicas, o, a un polipéptido p30 homotrimérico 40 soluble que carece de dominio transmembranario, en el que el polipéptido homotrimérico soluble se une a un polipéptido mediador de la entrada del virus herpético (MEVH) o a un polipéptido receptor de linfotoxina β (RLTβ) en condiciones fisiológicas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
45
48. Procedimiento del apartado 45, en el que el virus es un virus del herpes simple (VHS), un citomegalovirus (CMV), un virus herpético γ o un virus de Epstein-Barr (VEB).
49. Procedimiento del apartado 45, en el que la puesta en contacto es en un
mamífero.
50. Procedimiento del apartado 49, en el que el mamífero es un ser humano.
5
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> La Jolla Institute for Allergy and Immunology Ware, Carl F.
<120> LIGANDO PARA EL MEDIADOR DE LA ENTRADA DEL VIRUS DEL HERPES 10 SIMPLE Y PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACIÓN
<130> F 3032 EP/1
<140> 01926879.6 15
<141> 2001-04-11
<150> PCT/US01/11857
<151> 2001-04-11
20
<150> 09/549,096
<151> 2000-04-12
<160> 6
25
<170> PatentIn Ver. 3.1
<210> 1
<211> 29
<212> ADN 30
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador anterior
35
<400> 1
cggagatctg agttcatcct gctagctgg 29
<210> 2 40
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 45
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador posterior
<400> 2
ataggatccc ttggtctggt gctgacattc c 31
<210> 3
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 5
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador anterior
<400> 3 10
gacgtcagat cttcccacct ttcctccta 29
<210> 4
<211> 29 15
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia del cebador posterior 20
<400> 4
gaacagagat ctcattgctc ctggctctg 29
25
<210> 5
<211> 1169
<212> ADN
<213> Homo sapiens
30
<220>
<221> CDS
<222> (49)..(771)
<400> 5 35
<210> 6
<211> 240
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6 5
Claims (10)
- REIVINDICACIONES
- 1. Procedimiento in vitro para inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30, que comprende 5(a) proporcionar un anticuerpo anti-p30, y(b) poner en contacto una célula que expresa el polipéptido p30 expresado en la superficie celular con una cantidad de un anticuerpo anti-p30 suficiente para inhibir 10 la respuesta celular del linfocito mediada por el polipéptido p30.
- 2. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que la respuesta del linfocito inhibida es la proliferación de linfocitos.15
- 3. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1 ó 2, en el que el linfocito inhibido es una célula efectora patógena.
- 4. Utilización de un anticuerpo anti-p30 que inhibe la unión de un polipéptido p30 expresado en la superficie celular a un MEVH o un RLTβ expresado en la superficie 20 celular para la preparación de una composición farmacéutica destinada a inhibir una respuesta celular mediada por el polipéptido p30.
- 5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 25
- 6. Anticuerpo anti-p30 que inhibe la unión de un polipéptido p30 expresado en la superficie celular a un MEVH o un RLTβ expresado en la superficie celular para su utilización en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.30
- 7. Anticuerpo anti-p30 según la reivindicación 6, en el que la enfermedad autoinmunitaria es la artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso diseminado o la miastenia grave.
- 8. Anticuerpo anti-p30 que inhibe la unión de un polipéptido p30 expresado en la 35 superficie celular a un MEVH o un RLTβ expresado en la superficie celular para su utilización en el tratamiento de la inflamación o de un trastorno inflamatorio.
- 9. Anticuerpo anti-p30 según la reivindicación 8, en el que el trastorno inflamatorio es la artritis, la psoriasis o la enfermedad inflamatoria del intestino. 40
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