JP2003531152A - 単純ヘルペスウイルス侵入仲介物質に対するリガンド、およびその使用方法 - Google Patents

単純ヘルペスウイルス侵入仲介物質に対するリガンド、およびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 ヘルペスウイルス侵入仲介物質であるHVEMに対する新規ポリペプチドリガンド、p30、すなわちLIGHTを提供する。p30は、免疫応答をモジュレートし、ヘルペスウイルスによる感染および/またはその後の増殖を阻害するのに有用である。HVEM融合タンパク質も提供する。ヘルペスウイルスに感染したまたは感染したと思われる、リンパ球障害、腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患を患う被検体を、本発明のp30および融合タンパク質を利用して治療する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願に関する相互参照 本出願は、1997年7月30日に出願された米国特許出願第(USSN)08/898,234号(係
属中)の分割出願である、2000年3月13日に出願されたUSSN 09/524,325号の一部
継続出願である。これらは、あらゆる意味で全体が参照により本明細書に援用さ
れ、またこれらに基づき米国特許法第120条に基づき優先権を主張するものであ
る。
【０００２】政府の助成による研究に関する説明 米国政府は、保険社会福祉省(DHHS)の国立衛生保健研究所(NIH)により付与さ
れる助成金第AI33068号およびCA69381号により、本発明に対して特定の権利を有
する。
【０００３】発明の分野 本発明は、概して、免疫応答およびウイルス感染を調節するのに有用な化合物
および方法に関する。
【０００４】発明の背景 単純ヘルペスウイルス(HSV)１型および２型は、良性のものから重篤なものま
で重症度の範囲が広い再発性感染を生じる。HSVは、ニューロン中での潜伏から
発生し、コンピテントな細胞免疫系の存在下で、皮膚および他の組織を感染させ
る。HSVのＤ糖タンパク質(gD)、すなわちビリオンエンベロープに位置する膜貫
通タンパク質は、細胞受容体に結合することにより感染を開始する(Spearら (19
93) Viral Fusion Mechanisms. Ed. Bentz. CRC press, Baca Raton)。最近、HS
Vによる感染に使用される細胞性タンパク質が同定され、HSV侵入仲介物質(HVEM)
と称された(Montgomery (1996) Cell 87:427)。HVEMは、腫瘍壊死因子(TNF)関連
サイトカインに対する受容体と有意な相同性を示すシステインに富む細胞外ドメ
インを有する膜貫通１型タンパク質である(Smithら (1994) Cell 76:959；Pathw
ays of Cytolysis. GriffithsおよびTschopp編. Springer-Verlag, Baselに掲載
のWareら (1995))。TNFスーパーファミリーメンバーの多くは、効力のある炎症
および免疫応答を誘起するのに必要な様々な細胞性応答を誘導する。
【０００５】 TNFは、タンパク質分解されて分泌タンパク質を形成する膜貫通２型タンパク
質(Pennica (1984) Nature 312:724)であり(Black (1997) Nature 385:729)、LT
αは膜貫通ドメインを欠き(Gray (1984) Nature 312:721)、もっぱらホモ三量体
として分泌される(この形態ではTNFβとしても知られている)。LTαは、表面タ
ンパク質として発現されると、同じく膜貫通２型糖タンパク質であるLTβ(Brown
ing (1993) Cell 72:847)と称される33 kDaタンパク質 (Androlewicz (1992) J.
Biol. Chem. 267:2542)と、α1β2およびα2β1のサブユニット比のヘテロ三量
体として会合する(Androlewicz (1992)前掲；Browning (1996) J. Biol. Chem. 271 :8618)。LTαおよびTNFは両方とも、２つの受容体、すなわち55〜60 kDa TNF
受容体(TNFR60; CD120aまたは１型)(Schall (1990) Cell 61:361；Loetscher (1
990) Cell 61:351)および75〜80 kDa TNFR(TNFR80；２型またはCD120b)を介して
結合およびシグナル伝達する(Smith (1990) Science 248:1019)。対照的に、表
面LTα1β2複合体は、両方のTNFRがLTα2β1ヘテロ三量体と結合するのに対して
(Crowe (1994)前掲；Browning (1995) J. Immunol. 154:33)、LTαともTNFとも
結合しない(Crowe (1994) Science 264:707)LTβ受容体(LTβR)(Crowe (1994)前
掲)により特異的に認識される。
【０００６】 マウスにおけるLTαおよびLTβ遺伝子の遺伝子的欠失から、リンパ節およびパ
イアー斑の分化におけるこれらの２つの遺伝子の役割が明らかになり(De Togni
(1994) Science 264:703；Banks (1995) J. Immunol. 155:1685)、またTNFおよ
びTNFR60と共に、重要なサイトカインも成人における免疫応答の間の胚中心の形
成および免疫グロブリンアイソタイプスイッチング(例えば、IgA生成)を制御し
ていることが明らかになった(Matsumoto (1996) Science 271:1289；Mariathasa
n (1995 J. Inflammation 45:72))。大部分の研究は、LTα1β2/LTβRを、これ
らの機能を制御する重要なサイトカイン-受容体系として指摘している(Crowe (1
994) Science 264:707；Koni (1997) Immunity 5:491；Ettinger (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93:13102；Rennert (1996) J. Exp. Med. 184:1999)。
【０００７】発明の要旨 本発明は、これまでHSVgDとのみ結合することが知られていた、HVEMに対する
リガンドとして機能する内因性ポリペプチドの同定に基づく。このHVEM結合リガ
ンド(p30またはLIGHTとも称される)と共に、p30をコードする核酸配列、およびp
30に結合する抗体を提供する。本発明はまた、例えばヘルペスウイルス(例えばC
MVまたはHSV)感染などのウイルス感染をモジュレートする化合物を同定する方法
、ならびにリンパ系細胞性応答をモジュレートする方法を含む。従って、本発明
の方法は、自己免疫疾患、リンパ系悪性疾患、およびヘルペスウイルス科に関連
するウイルス感染(例えば、ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルス感染
が挙げられる)を患う被検体を治療するのに有用である。
【０００８】 本発明の一実施形態は、HVEM結合物質仲介型細胞性応答に作用する化合物を同
定するためのアッセイという特徴を有する。また、LTβR-p30-仲介型細胞性応答
に作用する化合物を同定するためのアッセイも本発明に含まれる。
【０００９】 本発明は、p30(LIGHT)とその受容体とが相互作用するのを防ぐ阻害有効量の薬
剤と被検体を接触させることにより、該被検体における炎症性障害を阻害する方
法を提供する。本発明の方法で使用する被検体、組織または細胞は、いかなる被
検体、組織または細胞でもよく、哺乳動物種のものが挙げられるが、ヒトである
ことが好ましい。薬剤は、由来源(例えば、器官全体、組織または細胞)に応じて
、in vivo、ex vivo、またはin vitroで投与され得る。in vivo投与または接触
のためには、全身的方法によるかまたは局所的に送達を行い得る。薬剤は、p30
とその受容体との相互作用を防ぐいかなる薬剤でもよい。このような薬剤として
は、本発明の抗体(例えば、抗p30抗体)、ペプチド模倣体(peptidomimetic)、ポ
リペプチド、およびHVEMの断片が挙げられる。
【００１０】 別の実施形態では、本発明は、目的のポリペプチドと機能し得る形で結合した
HVEMポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドを提供する。HVEMポリ
ペプチドは、HVEMのアミノ酸1〜SER205であり、目的のポリペプチドは抗体のFc
領域であり得る。
【００１１】 さらに別の実施形態では、本発明は、目的のポリペプチドと機能し得る形で結
合したHVEMポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド配列を提供する。
【００１２】 別の実施形態では、本発明は、HVEM融合ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列を含むベクターを提供する。
【００１３】 さらに別の実施形態では、本発明は、融合ポリペプチドおよび/またはポリヌ
クレオチド、ならびに薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】 本発明は、生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチ
ドまたはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドと結合し、約30キロダルトン(
kDa)の見かけ上の分子量(MW)を有する単量体ポリペプチドからなる単離されたま
たは組換え型のホモ三量体p30ポリペプチドを提供する。代替的な実施形態では
、単離されたまたは組換え型のホモ三量体p30ポリペプチドは、約7〜約8.5のpI
を有する異性体を含む。
【００１５】 本発明は、生理学的な条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプ
チドまたはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ド
メインを欠く可溶性の単離されたまたは組換え型のホモ三量体p30ポリペプチド
を提供する。本発明は、本発明のp30ポリペプチドおよび異種配列を含む融合タ
ンパク質を提供する。一実施形態では、異種配列は、tagまたは別の検出可能な
部分である。
【００１６】 本発明は、本発明のホモ三量体p30ポリペプチド、膜貫通ドメインを欠く可溶
性ホモ三量体p30ポリペプチド、本発明の融合タンパク質、またはそれらの組合
せを構成する本発明のp30ポリペプチドを含有するリポソームを提供する。
【００１７】 本発明は、本発明のホモ三量体p30ポリペプチド、膜貫通ドメインを欠く可溶
性ホモ三量体p30ポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明のリポソーム
、またはそれらの組合せを含む本発明のp30ポリペプチド、および薬学的に許容
され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１８】 本発明は、医薬組成物および印刷物を含むキットであって、該医薬組成物は、
生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
ンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDaの見かけの分子量
を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプチド、または生理
学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホ
トキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く可溶
性ホモ三量体p30ポリペプチドを構成するp30ポリペプチド、および薬学的に許容
され得る賦形剤を含み、前記印刷物には、細胞へのウイルス侵入または細胞中で
のウイルス増殖を阻害することを含む前記医薬組成物の使用に関する指示が含ま
れている、上記キットを提供する。指示書は、前記指示が、in vivoで細胞中の
ウイルス増殖または細胞へのウイルス侵入を阻害するための前記医薬組成物の使
用に関する指示を含むことができる。代替的な実施形態では、阻害されるウイル
スは、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(
CMV)、γ-ヘルペスウイルスまたはエプスタイン-バーウイルス(EBV)である。細
胞へのウイルス侵入または細胞中でのウイルス増殖の阻害は、ヒトを含む哺乳動
物内哺乳動物で達成されてもよい。
【００１９】 本発明は、医薬組成物および印刷物を含むキットであって、該医薬組成物は、
生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
ンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDaの見かけの分子量
を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプチド、または生理
学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホ
トキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く可溶
性ホモ三量体p30ポリペプチドを構成するp30ポリペプチド、および薬学的に許容
され得る賦形剤を含み、前記印刷物には、望ましくないリンパ球の増殖を伴う疾
患をモジュレートすることを含む前記医薬組成物の使用に関する指示が含まれて
いる、上記キットを提供する。代替的な実施形態では、指示は、ＴまたはＢリン
パ腫もしくは白血病、または自己免疫疾患をモジュレートするための医薬組成物
のに関する指示を含むことができる。自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、イン
スリン依存型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡または重症筋無力症であ
り得る。
【００２０】 本発明は、生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチ
ドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合するホモ三量体
を形成する、約30 kDaの見かけ上の分子量を有するp30ポリペプチドまたは膜貫
通ドメインを欠くp30ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、医薬組成
物を提供する。
【００２１】 本発明は、医薬組成物および印刷物を含むキットであって、該医薬組成物は、
生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
ンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合するホモ三量体を形成する、
約30 kDaの見かけ上の分子量を有するp30ポリペプチドまたは膜貫通ドメインを
欠くp30ポリペプチドをコードする発現ベクター、および薬学的に許容され得る
賦形剤を含み、前記印刷物には、腫瘍細胞または活性化リンパ球を標的化するこ
とを含む前記医薬組成物の使用に関する指示が含まれている、上記キットを提供
する。一実施形態では、使用は、医薬組成物を腫瘍に直接注射することによって
腫瘍を治療することを含む。
【００２２】 本発明は、リンパ球に対して増殖誘導シグナルを誘導する方法であって、(ａ)
細胞表面で発現されたHVEMに結合する組成物を用意すること、および(ｂ)リンパ
球を増殖誘導量の該組成物と接触させることを含む、上記方法を提供する。代替
的な実施形態では、組成物は、抗HVEM抗体、または抗HVEM抗体結合部位を含むポ
リペプチドを含む。代替的な実施形態では、細胞表面で発現されたHVEMに結合す
る組成物を用意することは、p30ポリペプチド、可溶性p30ポリペプチド、リポソ
ーム会合p30ポリペプチド、またはp30ポリペプチドをコードするベクターまたは
組換えp30を細胞結合性p30ポリペプチドとして発現する細胞を含む組成物を用意
することを含む。本方法では、リンパ球はＴ細胞またはＢ細胞であり得る。リン
パ球はin vivoで接触させることができる。
【００２３】 本発明は、p30ポリペプチド仲介型細胞性応答を阻害する方法であって、(ａ)
細胞表面で発現されたp30ポリペプチドが細胞表面で発現されたHVEMもしくはLT
βRに結合するのを阻害する組成物を用意すること、および(ｂ)細胞表面で発現
されるp30ポリペプチドまたは細胞表面で発現されるHVEMもしくはLTβRを発現す
る細胞を、p30ポリペプチド仲介型細胞性応答を阻害するのに十分な量の該組成
物に接触させることを含む、上記方法を提供する。本方法では、細胞を組成物と
in vivoで接触させてもよい。代替的な実施形態では、阻害されるp30ポリペプチ
ド仲介型細胞性応答としては、リンパ球細胞性応答の阻害が挙げられ、阻害され
るリンパ球応答はリンパ球増殖であり、また、阻害されるリンパ球は病原性エフ
ェクター細胞である。阻害されるリンパ球応答としては、ＴもしくはＢリンパ腫
もしくは白血病、または自己免疫疾患のモジュレーションが挙げられる。自己免
疫疾患は、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、多発性硬化症、全身性
紅斑性狼瘡、または重症筋無力症であり得る。阻害されるリンパ球応答としては
、移植に対する反応のモジュレーションが挙げられる。
【００２４】 一実施形態では、HVEMを発現しており、前記組成物は可溶性p30ポリペプチド
である。代替的な実施形態では、接触させる細胞はLTβRを発現しており、組成
物は可溶性p30ポリペプチドである。別の実施形態では、接触させる細胞はその
細胞表面にp30ポリペプチドを発現しており、組成物は可溶性HVEMポリペプチド
であり；接触させる細胞はその細胞表面にp30ポリペプチドを発現しており、組
成物は抗p30抗体である。
【００２５】 本発明は、腫瘍を治療する方法であって、(ａ)生理学的条件下でヘルペスウイ
ルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)
ポリペプチドに結合するホモ三量体を形成する、約30 kDaの見かけの分子量を有
するp30ポリペプチドまたは膜貫通ドメインを欠くp30ポリペプチドをコードする
発現ベクターを含む医薬的組成物を用意すること、および(ｂ)該医薬組成物を腫
瘍に直接注射することを含む、上記方法を提供する。
【００２６】 本発明は、リンホトキシンβ受容体(LTβR)仲介型細胞性応答をモジュレート
する方法であって、(ａ)LTβRがp30ポリペプチドに結合するのを阻害する組成物
を用意すること、および(ｂ)LTβRまたはp30ポリペプチドを発現する細胞を、リ
ンホトキシンβ受容体(LTβR)仲介型細胞性応答をモジュレートするのに十分な
量の組成物と接触させることを含む、上記方法を提供する。一実施形態では、細
胞はLTβRを発現しており、組成物は、生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入
仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチド
に結合する、約30 kDaの見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドからなるホ
モ三量体p30ポリペプチド、または生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介
物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチド
に結合する、膜貫通ドメインを欠く可溶性ホモ三量体p30ポリペプチドを構成す
るp30ポリペプチド、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を含
んでいる。一実施形態では、細胞はp30ポリペプチドを発現しており、組成物は
抗p30抗体を含む。別の実施形態では、リンホトキシンβ受容体(LTβR)仲介型細
胞性応答はヘルペスウイルスの細胞への結合を含む。一実施形態では、ヘルペス
ウイルスが細胞に侵入することを遮断する。別の実施形態では、ヘルペスウイル
スが細胞中で増殖することを阻害する。代替的な実施形態では、ヘルペスウイル
スは単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、γヘルペスウイ
ルスまたはエプスタイン-バーウイルス(EBV)である。
【００２７】 本発明は、細胞中でのウイルス生成を阻害する方法であって、(ａ)p30ポリペ
プチドを用意すること、および(ｂ)ヘルペスウイルスに感染した細胞またはヘル
ペスウイルスによる感染に感受性のある細胞を有効量のp30ポリペプチドと接触
させて、細胞中でのヘルペスウイルス産生を阻害することを含む、上記方法を提
供する。一実施形態では、ヘルペスウイルスが細胞へ侵入するのを阻害する。別
の実施形態では、接触はin vivoで達成され、p30組成物は、生理学的条件下でヘ
ルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホトキシン受容体
(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDaの見かけの分子量を有する単量体ポリ
ペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプチド、または生理学的条件下でヘルペ
スウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホトキシンβ受容体(L
TβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く可溶性ホモ三量体p30ポリ
ペプチド、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物として提供され
る。ウイルスは、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、γ
ヘルペスウイルス、またはエプスタイン-バーウイルス(EBV)であり得る。一実施
形態では、接触は、ヒトなどの哺乳動物内で達成される。
【００２８】 本明細書で言及する全ての文献、特許出願、特許、および他の参考文献は、そ
れらの全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本出願
が優先される。また、本明細書に記載する物質、方法、および実施例は、あくま
で例示のものであり、限定することを意図したものではない。
【００２９】 本発明の他の特徴および利点(例えば、様々なヒト疾患の治療)は、以下の詳細
な説明、図面および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３０】発明の詳細な説明 本発明は、HVEMに対する新規リガンド、すなわちp30、ならびにその機能的変
異体および断片を提供する。膜タンパク質として見い出され、サイトカインとし
て機能するこの新規リガンドは、LIGHTとも呼ばれる。なぜなら、このポリペプ
チドは、リンホトキシン(Lymphotoxins)に相同性を有し、誘導可能(Inducible)
発現を示し、Ｔリンパ球により発現される受容体であるHVEMに対してHSV糖タン
パク質(Glycoprotein)Ｄと競合するからである。LIGHTは、HVEMに対してHSV糖タ
ンパク質Ｄと競合できるため、このポリペプチドの可溶性ホモ三量体形態を使用
して、ヘルペスウイルスが細胞に侵入することを妨害できる。従って、この新規
HVEMリガンドを使用して、βヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスなど
のヘルペスウイルス感染を治療または予防できる。
【００３１】 LIGHTはまた、リンホトキシンβ受容体(LTβR)に結合する。
【００３２】 TNF受容体(TNFR)関連ポリペプチドの細胞外ドメインであるHVEMを含む融合タ
ンパク質の結合の阻害を伴う実験は、悪性および正常ヒトＴ細胞の両方が、LIGH
T、すなわちHVEMに対する細胞表面リガンドを発現することを示した。
【００３３】 本発明はまた、HVEMポリペプチドが、炎症に対してアンタゴニスト効果を有す
るという発見に基づく。特に、HVEM融合タンパク質は、被検体に投与された場合
に炎症を阻害することが可能である。
【００３４】定義 単数形の表現は、本明細書および添付の請求の範囲で使用する場合、特に文脈
上明示しない限り複数形も含むことに留意されたい。従って、例えば、「細胞」を
指す場合、該細胞が複数ある場合も含まれる。
【００３５】 特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、
本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する
。本明細書に記載するものと類似したまたは等価である方法および物質が、本発
明の実施またはテストにおいて使用できるが、適切な方法および物質を以下に記
載する。
【００３６】 本明細書で使用する活性を「阻害」することとは、該活性を測定可能な量で低減
させること(例えば、少なくとも30％以上低減させること)である。複数の異なる
阻害され得る活性(例えば、細胞の動員、炎症誘発(pro-inflammatory)仲介物質
、細胞またはウイルス侵入、ウイルス活性化、ウイルス複製、またはウイルス進
行)がある場合に、任意の単一の活性の減少(他の活性と共にまたは他の活性無し
に)もこの定義の範囲に十分に当てはまる。さらに、活性を阻害するために単一
または複数の薬剤が投与される場合、単一の薬剤による任意の単一の活性の減少
、または薬剤の組合せによる任意の単一の活性の減少も、この定義の範囲に十分
に当てはまる。「炎症阻害量」とは、炎症応答または症状を、モジュレート、阻害
または抑制するのに必要な炎症剤の量を意味する。
【００３７】炎症 炎症は、サイトカイン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ケモキネシス
、接着分子(例えば、LFA-1)、および当業者に公知の他の物質を含む炎症誘発仲
介物質により生じる多数の個々のおよび関連するカスケードまたは反応の結果生
じる。例えば、受容体は、細胞へのウイルス侵入を許可する要の役割を果たす。
これらの受容体に対するリガンドも重要である。リガンドは、サイトカインなど
の炎症誘発仲介物質と共に、細胞の主要な刺激物質であるが、また炎症カスケー
ドの増幅において別の役割も果たす。これらの可溶性炎症仲介物質は、主にCD8+
T細胞から誘導される。一旦生成されると、傍分泌および自己分泌様式で作用し
て、それらの近傍の細胞をさらに活性化し、さらなるＴ細胞を炎症部位に補充で
きる。これらの追加のリンパ球はそれ自体が活性化され、炎症カスケードが増幅
することに寄与する。本明細書で使用する免疫抑制活性とは、ＢおよびＴ細胞が
反応するかもしくは補充されるか、または炎症部位に対して活性化される能力を
阻害するかまたは減少させることを指す。
【００３８】 炎症細胞を活性化する他のシグナルとしては、例えばLFA-1(CD11aおよびCD18)
などの接着受容体が、ICAM-1(CD54)などの対向受容体の１つに結合することが挙
げられる(Stauntonら, 1990, Cell 61:243-254)。第２のシグナルが妨害される
場合、抗原特異的Ｔ細胞がアポトーシスにより死ぬか、または細胞性アネルギー
の状態に陥るように誘導される。LFA-1およびICAM-1に対するモノクローナル抗
体によりこの相互作用を妨害することで、心臓同種移植片を受けたマウスの生存
時間が延長される(Isobe (1992) Science 255:I 125-1 127)。従って、本発明の
組成物および方法は、単独で、または他の抗炎症剤(非ステロイド抗炎症剤、ス
テロイド、抗体、受容体アンタゴニスト、および当該分野で容易に同定できる他
のもの)と組み合わせられて使用され得る。
【００３９】 本明細書で使用する「炎症」とは、多数の刺激要因(例えば、感染物質、虚血、
抗原-抗体相互作用、および熱傷または他の物理的損傷)により誘発されるプロセ
スまたは一連の事象を意味する。炎症は、炎症部位における、紅斑、水腫、圧痛
(痛覚過敏)、および痛みにより特徴づけられる。炎症反応またはカスケードは、
多数の異なる段階(例えば、血管拡張および高い毛細血管透過性；リンパ球およ
び食細胞の浸潤；ならびに組織退行変化および繊維症の段階)を有することが一
般的に認識される。本明細書で使用する「炎症性障害」とは、病因の一部、および
炎症性カスケードまたは反応が炎症を生じることで特徴付けられる任意の数の疾
患を意味する。このような障害としては、例えば、関節炎、乾癬、炎症性腸疾患
、ヘルペスなどの感染物質、ならびに当業者に公知のものが挙げられる。
【００４０】 TNF受容体(TNFR)関連ポリペプチドの細胞外ドメインであるHVEMを含む融合タ
ンパク質の結合の阻害に関する実験は、悪性および正常ヒトＴ細胞の両方が、HV
EMに対する細胞表面リガンドを発現することを示した。競合的な阻害実験は、HV
EMリガンドが、LTαβヘテロ三量体およびLTαと共通する特徴を有するが、LTα
1β2およびTNFとは異なることを示す特徴を有することを示した。従って、LTα2
β1上のHVEM結合部位はTNFR60と同じではないという認識のもと、LTα2β1はHVE
Mにより認識される推定上の表面リガンドであり得る。あるいはまた、HVEMは、
新規リガンドを認識するかもしれない。生化学的アプローチを使用して、これら
の可能性を区別した。
【００４１】 免疫沈降法およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(S
DS-PAGE)実験から、LTβおよびLTαの両方と抗原性の異なるＴ細胞の表面上のHV
EMに対する新規30 kDaポリペプチドリガンド(p30)の存在が明示された。アフィ
ニティークロマトグラフィー精製および二次元電気泳動から、p30が、30 kDaの
分子量および約7〜8.5のpIを有し、LTαおよびLTβと物理的に異なることも示さ
れた(図４Ｃ)。さらに、これらの調査は、活性p30(例えば、その三量体形態)も
またLTβRにより認識されるが、TNFRにより認識されないことを示した。p30ポリ
ペプチドはまた、最近の文献においてLIGHTとも称される(例えば、Mauriら, Imm
unity, 8(1):21-30 (Jan. 1998)を参照)。
【００４２】 結合阻害実験は、可溶性gD-1(HSV-1由来のgD)およびgD-1の変異体であるgD-1(
Δ290〜299t)が、HVEMには結合するがLTβRまたはTNFR60には結合しないことを
明示した。この結果は、HVEMがTNFR60およびLTβRに認識されるリガンドに結合
するにも関わらず、HVEMがTNFR60およびLTβRに認識されるリガンドに結合する
にも関わらず、gD-1がHVEMに結合するように特異的に同時進化したことを示唆す
る。さらに、この発見は、gD-1が、リンホトキシンの膜結合型ビロカイン(virok
ine)であり、HSVが侵入する間または感染細胞から放出される間にHVEMシグナル
伝達活性をモジュレートし得ることを示す。
【００４３】 in vitro細胞培養実験は、抗HVEM抗体が、未感作(virgin)および感作済みＴ細
胞の両方の増殖を増強したことを示した。同様の実験は、HVEMを介したシグナリ
ングにより、Ｂ細胞に対する活性化刺激物質が得られ、TNFRを介して相殺する負
の刺激物質の無い正の刺激が、p30 HVEMリガンドの独特の性質であり得ることを
示した。これらの結果は、HVEMリガンドの生理学的機能が、おそらくTNFおよびL
Tα1β2と異なることを示す。HVEMに対する新規30 kDaリガンドの同定は、この
リガンドが、既にLTαまたはLTβに帰する生理学的応答に関与し得るという可能
性を提起する。ここで提示した発見は、LT/TNFサイトカイン系およびヘルペスウ
イルスのさらに深い理解を提供し、疾患進行においてこれらのサイトカインを制
御、ならびに感染および損傷による炎症に作用するための新しいアプローチを示
唆する。
【００４４】 これらの結果は総合的に、アンタゴニストおよび結合物質(例えば、HVEMまた
はLTβRを含むFc融合タンパク質)が、LTαおよび30 kDa HVEMリガンドであるp30
の活性をモジュレートすることを示す。これらの結果はまた、アンタゴニストお
よび結合物質(例えば、本発明の抗体および融合タンパク質(例えば、HVEM:Fc))
も、炎症および炎症応答をモジュレートするのに有用であることを示す。上述し
たように、HVEM結合は、Ｂ細胞を活性化し、従って、HVEMとそのリガンドとの相
互作用のモジュレーションは、炎症細胞の活性化および炎症カスケードの活性化
を低減する。同様に、融合タンパク質HVEMを使用して、モノクローナル抗体もし
くはペプチドまたは低分子有機化合物などのリガンド受容体複合体の特異的な阻
害剤を同定できる。HVEMとp30もしくはLTαとの相互作用、またはLTβRとp30と
の相互作用の阻害剤を使用して、所望でないリンパ球増殖を生ずる疾患(Ｔおよ
びＢリンパ腫または白血病を含む)、または自己免疫疾患(慢性関節リウマチ、イ
ンスリン依存型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡または重症筋無力症な
ど)、ならびに炎症(例えば、関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、喘息)、ならびに当
該分野で公知の他の疾患をモジュレートしてもよい。
【００４５】 同様に、ヘルペスウイルスgD-1を使用して、LTα、p30およびHVEMシグナル伝
達がエフェクター分子として関与する免疫反応を阻害してもよい。LTαまたは30
kDa HVEMリガンドの可溶性形態(その推定の細胞質および膜貫通ドメインの欠失
により生成される、例えば、以下に記載するLIGHT-t66)は、細胞標的に侵入する
ウイルスの能力を妨害することにより、例えばヘルペスウイルス科(例えば、α
ヘルペスウイルス科、βヘルペスウイルス科およびγヘルペスウイルス科)によ
る感染および再発を含むウイルス感染の阻害剤として機能し得る。
【００４６】 TNFRと同様、HVEMは二重リガンド特異性を有する。つまり、LTα、およびLIGH
Tの三量体形態(例えば90 kD形態)、すなわちリガンドの膜結合型形態であるp30
に結合する。LTα Tyr108Phe突然変異体は、TNFR60およびTNFR80に対するのと同
様にHVEM結合性を消失する。TNFR60が表面30 kDa形態へのHVEM結合を妨害できな
いことから、表面LTα2β1がHVEMリガンドではないことが示唆される。
【００４７】 さらに、LIGHT(p30)は、LTαと異なる。なぜなら、それは抗原性が異なり、専
ら分泌されるLTαとは違って細胞に結合したままであるからである。従って、HV
EM結合タンパク質(p30)は、TNFに関連する他のタンパク質と同様にII型膜貫通構
造として配置された膜貫通ドメインを形成する疎水性残基の配列を含むと予想さ
れる。これは、p30が他の方法(例えば、脂質修飾)により改変されて、細胞表面
に付着可能になるという可能性を排除するものではない。さらに、このタンパク
質は、LTαおよびLTβ、ならびにこのスーパーファミリーを規定する関連サイト
カインと配列相同領域を共有し、約150〜160残基のＣ末端細胞外ドメインを含む
。
【００４８】 本発明者の発見はまた、HVEMが、LTαの特異的な受容体であること、つまりTN
F結合受容体であるTNFR60およびTNFR80とは明確に異なる性質を有することを示
す。この性質は、HVEM融合タンパク質または類似のタンパク質が、TNFまたはLT
α1β2機能を阻害することなしにLTαと特異的に拮抗することを可能にする。
【００４９】 本発明は、例えば、可溶性ホモ三量体LIGHTまたはHVEM融合ポリペプチドなど
のアンタゴニストおよび結合物質を提供する。HVEM融合ポリペプチドは、還元SD
S-PAGEにより測定された場合に約58 kDaの分子量を有することにより特徴付けら
れ得る(図８に示す、実施例６を参照)。
【００５０】 本発明はまた、実質的に純粋なLIGHT、またはp30ポリペプチドを提供する。p3
0ポリペプチドは、還元SDS-PAGEにより測定された場合に30 kDaの予想分子量、
および約7〜8.5のpIを有することにより特徴付けられる(図４Ｃ)。p30は、10未
満、例えば８未満、特に６(例えば、３、４または５)未満の異性体形態で存在す
る。本発明はまた、LIGHT、すなわちp30をホモ三量体として提供する。以下の実
施例で明示するように、p30は、ホモ三量体として発現されることができ、組換
え末端切断型可溶性形態として発現される場合には、ホモ三量体として専ら分泌
される。LIGHTポリペプチドは、細胞に結合して(すなわち、分泌されなくて)も
よい。その細胞表面形態では、p30はHVEMおよびLTβRと結合する。
【００５１】 本明細書で使用する「実質的に純粋」という用語は、他のタンパク質、脂質、炭
水化物または天然では会合している他の物質を実質的に含まないポリペプチドを
指す。当業者は、このようなポリペプチドおよび融合タンパク質を、タンパク質
精製の標準的な技術を用いて精製することができる(例えば、Protein Purificat
ion, Principles and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Ver
lag, N.Y.を参照)。例えば、実質的に純粋なHVEM:Fcポリペプチドは、還元SDS-P
AGEゲル上に約58 kDaの単一の目立つバンドを形成する。LIGHT p30ポリペプチド
は、還元SDS-PAGEゲル上に約30 kDaの単一の目立つバンドを形成し、そのホモ三
量体形態では、非還元ゲル上に約90 kDaの単一の目立つバンドを形成する(三量
体三次構造を妨げられない)。
【００５２】 本発明は、機能的融合ポリペプチドおよびその機能的断片を含む。本明細書で
使用する「機能的ポリペプチド」という用語は、手順(routing)ならびに定義され
た機能および受容体結合アッセイ(例えば、以下の実施例を参照)により同定でき
、例えば、細胞において特定の生物学的、形態学的、もしくは表現型的改変、ま
たは結合事象(本発明の可溶性LIGHTポリペプチドがヘルペスウイルスの侵入を妨
害する能力など)を伴う生物学的機能または他の活性(例えば、受容体に結合する
能力)を所有するポリペプチドを指す。
【００５３】 本明細書で使用する「機能的断片」とは、上述するような生物学的機能を有する
本発明のポリペプチドの部分配列を含む。例えば、本発明の融合ポリペプチドは
、例えばLIGHTまたはHVEMの断片を含み得る。例えば、本発明は、HVEM:Fcと実質
的に同様の活性(例えば、HSVがHVEMと結合するのを阻害することによる細胞性応
答のモジュレーション、抗原性、または炎症の阻害)が残っている限り、HVEMお
よび二次ポリペプチド配列の断片を提供する。HVEMまたはHVEM融合ポリペプチド
の生物学的活性を含む小さいペプチドは本発明に含まれる。当業者は、このよう
なポリペプチドの機能的活性について、標準的方法(例えば、実施例に記載する
ような、ウイルスプラーク減少アッセイ、またはサイトカイン産生アッセイおよ
び炎症応答の測定を含む細胞活性化アッセイ)により測定できる。同様に、細胞
において特定の生物学的、形態学的、または表現型的改変を伴うp30の機能的断
片は、定義された機能アッセイにより決定できる。
【００５４】 本発明は、LIGHT(p30)、HVEMまたは融合タンパク質(例えばHVEM融合タンパク
質のp30)一次アミノ酸配列の小さな改変を有するポリペプチドを提供する。これ
は、本明細書に記載するように、例えばp30、LIGHT-t66および以下に記載する他
の変異体、ならびにHVEM:Fcポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を有す
るタンパク質を生じ得る。このような改変は、特異的に操作できる(例えば、部
位特異的突然変異により生成されるなど)。あるいはまた、自発的な突然変異で
あってもよい。これらの改変により生成される全てのポリペプチドは、LIGHT(p3
0)またはHVEM:Fcの結合活性または生物学的活性(例えば、HVEMおよびLTβRへ結
合することにより細胞性応答をモジュレートすること、HSVがHVEMに結合するの
を阻害すること、または炎症をモジュレートすること)が存在する限り本発明の
範囲にある。さらに、１以上のアミノ酸の欠失によっても、得られる分子の構造
を、その活性を変えること無く改変し得る(例えば、LIGHT-t66、以下を参照)。
【００５５】 従って、本発明は、平滑末端化可溶性ホモ三量体形態を含む小さい活性(すな
わち「機能的」)LIGHT(p30)、および代替的な利用法を有するHVEM分子を含む。例
えば、活性に必要でないアミノまたはカルボキシル末端アミノ酸は除去できる。
例えば、HVEM:Fc融合ポリペプチド(後述)は、HVEMのアミノ酸１〜205を有するこ
とにより特徴付けられる。別の実施例は、以下の実施例12に詳細に記載する、平
滑末端化可溶性ホモ三量体p30タンパク質であるLIGHT-t66を含む。
【００５６】 本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチド配列の保存的変異、模倣体、およ
びペプチド模倣体を含む。本明細書で使用する「保存的変異」とは、アミノ酸残基
を生物学的に類似の別の残基と置換することを指す。保存的変異の例としては、
イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの１つの疎水性残基を
別の疎水性残基で置換すること、または１つの極性残基で別の極性残基を置換す
ること(例えばアルギニンでリシンを、グルタミン酸でアスパラギン酸を、もし
くはグルタミンでアスパラギンを置換すること)などが挙げられる。「保存的変異
」という用語はまた、置換ポリペプチドに対して生じた抗体も非置換ポリペプチ
ドと免疫反応を生じるという前提のもとで、置換されたアミノ酸を置換していな
い親アミノ酸の代わりに使用することを含む。
【００５７】 「模倣体」および「ペプチド模倣体」という用語は、ポリペプチドと実質的に同じ
構造および/または機能的特徴(例えば、転移ドメインもしくは臭気リガンド結合
ドメイン)を有する合成化学化合物、または本発明のキメラ受容体を指す。模倣
体は、アミノ酸の合成非天然型類似体で全部構成されていてもよいし、または部
分的に天然型ペプチドアミノ酸および部分的にアミノ酸の非天然型類似体である
キメラ分子でもよい。模倣体にはまた、任意の量の天然型アミノ酸保存的置換を
、このような置換が模倣体の構造および/または活性を実質的に改変しない限り
、組み入れてもよい。保存的変異体である本発明のポリペプチドに関しては、常
套的な実験により模倣体が本発明の範囲内にある(すなわち、その構造および/ま
たは機能が実質的に変化していない)か否かを決定できる。ポリペプチド模倣体
組成物は、非天然型構造成分の任意の組合せを含むことができる。これは、典型
的に３つの構造グループ、すなわちａ)天然型アミド結合(「ペプチド結合」)によ
る連結以外の残基連鎖群、ｂ)天然型アミノ酸残基に置き換わった非天然型残基
、またはｃ)二次構造模倣を誘発して二次構造(例えば、βターン、γターン、β
シート、αヘリックスコンホメーションなど)を誘発または安定化させる残基か
らなる。ポリペプチドは、その残基の全てまたは一部が、天然型ペプチド結合以
外の化学的手段により繋げられる場合にも模倣体として特徴付けられ得る。個々
のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学結合または連結手段(例えば
、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレ
イミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)またはN,N'-ジイソプロピ
ルカルボジイミド(DIC))により連結され得る。一般のアミド結合(「ペプチド結合
」)による連結に代わり得る連結グループとしては、例えば、ケトメチレン(例え
ば、-C(=O)-CH2で-C(=O)-NH-を置換)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オ
レフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-
)、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが挙げられる(例え
ば、Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vo
l. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NYに
掲載のSpatola (1983)を参照)。ポリペプチドは、天然型アミノ酸残基の代わり
に非天然型残基を全てまたは一部を含むことにより模倣体としても特徴付けられ
得る(非天然型残基は科学文献および特許文献に詳しく説明されている)。
【００５８】 本発明のアンタゴニストおよび結合物質としてはまた、p30(LIGHT)に対する抗
体、HVEMに結合するかまたはHVEMアンタゴニストとして作用する抗体およびポリ
ペプチド(後段でより詳細に議論する)、ならびに本明細書に記載する融合タンパ
ク質が挙げられる。
【００５９】 本発明の融合タンパク質としては、完全長HVEMポリペプチド配列、ならびに特
定のペプチド配列を除いた該配列の断片が挙げられる。同様に、本発明のLIGHT(
p30)ポリペプチドとしては、完全長p30、ホモ三量体形態、p30配列を含む融合タ
ンパク質、特定のアミノ酸、ペプチドまたは配列を排除した該配列の断片、およ
び以下に記載するこれらの断片のホモ三量体またはヘテロ三量体形態(例えばLIG
HT-66t)が挙げられる。このような断片は、ポリクローナルおよびモノクローナ
ル抗体を含む本発明の抗体の作製において有用であり得る。
【００６０】 例えば、前記排除を経た配列は、完全長HVEMポリペプチドのカルボキシル末端
領域を欠く断片を含み得る。さらに、本発明の融合ポリペプチドは、HVEMポリペ
プチド配列またはその断片を含み得る。
【００６１】 融合タンパク質の「二次」ポリペプチド配列は、p30/HVEM：二次ポリペプチド融
合タンパク質が、p30:FcまたはHVEM:Fcの(例えば受容体への)結合活性または生
物学的活性(例えば、炎症を阻害またはモジュレートする)と実質的に同様の結合
活性(例えば、ウイルス妨害もしくは受容体結合)または生物学的活性を保持する
限り、本発明のポリペプチド配列(例えば、p30またはHVEM配列)に連結すること
が望ましいあらゆるポリペプチドであり得る。本発明において有用な二次ポリペ
プチド配列の同定および決定は、当業者により容易に見極められる。例えば、当
業者は、以下の実施例に記載する方法および技術を用いて、融合構築物が所望の
受容体結合活性または生物学的活性を保持するか否かを決定できる。
【００６２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸配列または
ポリヌクレオチドも提供する。前記ポリペプチド、断片、改変および融合タンパ
ク質のいずれかをコードする核酸もまた本発明に包含される。従って、本明細書
で使用する「単離」という用語は、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、また
は天然には会合している他の物質を実質的に含まないポリヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のアンタゴニスト、結合物質、または
融合ポリペプチドをコードするDNA、cDNA、およびRNA配列を含む。例えば、LIGH
TもしくはHVEM、またはそれらの融合ポリペプチドの全体または一部をコードす
るポリヌクレオチドも全て、それらが本明細書に記載するようにLIGHT:Fcまたは
HVEM:Fc活性を有するポリペプチドをコードする限り、本明細書に含まれること
が理解される。このようなポリヌクレオチドとしては、(単離された)天然型、組
換え型、合成、および意図的に操作されたポリヌクレオチドが挙げられる。例え
ば、選択的RNAスプライシングパターンまたはRNA転写用の選択的プロモーターの
使用によってmRNA配列の一部を改変してもよい。別の例として、ポリヌクレオチ
ドを部位特異的突然変異誘発に供してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、遺
伝子コードの結果縮重した配列を含む。20種の天然アミノ酸が存在し、それらの
ほとんどが１以上のコドンにより特定される。従って、ヌクレオチド配列にコー
ドされるLIGHTまたはHVEMのアミノ酸配列、および(融合タンパク質の場合には)
二次ポリペプチドが機能的に変化しない限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が本
発明に含まれる。
【００６３】 本発明の核酸は、本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、結合物質、または
融合タンパク質(例えば、LIGHT:FcもしくはHVEM:Fc)、および天然型LIGHTまたは
HVEMの断片をコードする配列、ならびにストリンジェントな条件下でこれらの配
列の相補体にハイブリダイズできる任意のヌクレオチド配列を含む。本発明はま
た、本発明のp30および融合ポリペプチドの両方について、これらの配列の縮重
変異体も含む。例えば、本発明のLIGHT p30核酸としては、天然型p30をコードす
る配列、および本明細書に記載するストリンジェントな条件下で配列の相補体と
ハイブリダイズするあらゆるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００６４】 「ストリンジェントな条件」という語句は、核酸(例えば、サンプル核酸または
プローブ)が、典型的に核酸の複合混合物に入った標的部分配列と主としてハイ
ブリダイズし、他の配列とは有意な量でハイブリダイズしないようなハイブリダ
イゼーションまたは洗浄条件を指す。正のシグナル(例えば、本発明の核酸の同
定)は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約10倍である。ストリンジ
ェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況下において異なる。長い配列ほ
ど、高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーシ
ョンについての広い手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Mole
cular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles
of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に記載
されている。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およ
びpHにおける特異的な配列の熱融点(Tm)よりも約5〜10℃低く選択される。Tmは
、標的に相補的なプローブの50％が平衡状態(equilibrium)で(標的配列は過剰に
存在するため、Tmにおいて、プローブの50％が平衡状態において占有される)標
的配列にハイブリダイズする(定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度下に
おける)温度である。
【００６５】 ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウム
イオン、典型的には0.01〜1.0 Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、
温度が、短い(例えば、10〜50ヌクレオチド)プローブについては少なくとも約30
℃、長い(例えば、50ヌクレオチドを上回る)プローブについては少なくても約60
℃のものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定剤
を添加することによっても達成され得る。
【００６６】 本発明の範囲にある核酸を同定するために使用できるストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件としては、50％ホルムアミド、５×SSC、および１％SDSを
含む緩衝液中で42℃におけるハイブリダイゼーション、または５×SSCおよび１
％SDSを含む緩衝液中で65℃におけるハイブリダイゼーションが挙げられる(両方
とも、0.2×SSCおよび0.1％SDSで65℃における洗浄を伴う)。ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件の例としてはまた、40％ホルムアミド、1M NaCl
および1% SDSの緩衝液中、37℃にてのハイブリダイゼーション、ならびに１×SS
C中、45℃にての洗浄が挙げられる。あるいはまた、0.5 M NaHPO4、7%ドデシル
硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中で65℃にてのフィルタ結合DNAに対するハイ
ブリダイゼーション、ならびに0.1×SSC/0.1% SDS中、68℃にての洗浄もまた、
本発明の範囲内にある核酸を同定および単離するために使用できる。当業者は、
他の匹敵するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、同様のストリンジェン
シーの条件を得るために利用できることを容易に認識するであろう。
【００６７】 しかし、当該分野において知られているように、ハイブリダイゼーションの方
法の選択は重大ではなく、核酸が本発明の範囲内にあるか否かを決定する条件を
決めるのは、洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲にある核酸を
同定するための洗浄条件としては、例えば、約0.02モル、pH 7の塩濃度、および
少なくとも約50℃もしくは約55℃〜約60℃の温度；または約0.15 M NaClの塩濃
度、72℃にて、約15分間；または約0.2×SSCの塩濃度、少なくとも約50℃もしく
は約55℃〜約60℃の温度にて、約15〜約20分間；または、ハイブリダイゼーショ
ン複合体を、0.1% SDSを含む約２×SSCの塩濃度を有する溶液で、室温にて15分
間２度洗浄し、その後0.1% SDSを含む約0.1×SSCの塩濃度を有する溶液で、68℃
にて15分間２度洗浄すること；または等価な条件が挙げられる。ストリンジェン
トな洗浄条件はまた、0.2×SSC/0.1% SDS、42℃であってもよい。核酸分子がデ
オキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)である場合、ストリンジェントな条件とし
ては、６×SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中で、37℃(14塩基オリゴの場合)、4
8℃(17塩基オリゴの場合)、55℃(20塩基オリゴの場合)、および60℃(23塩基オリ
ゴの場合)での洗浄が挙げられる。等価なハイブリダイゼーションおよび洗浄条
件、ならびに試薬および緩衝液の詳細な説明(例えば、SSC緩衝液および等価な試
薬および条件)については、Sambrook編, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MAN
UAL (第２版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)；CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編, John Wiley and Sons, Inc., Ne
w York (1997)、またはTijssen(1993)前掲を参照のこと。
【００６８】 これらの核酸分子は、例えば(p30核酸配列の増幅反応のため、および/または
そのアンチセンスプライマーとして)p30のレギュレーションのために有用なp30
アンチセンス分子をコードするか、またはp30アンチセンス分子として作用し得
る。さらにまた、このような分子は、例えばp30遺伝子の存在を検出できるスク
リーニング法の構成要素として使用してもよい。
【００６９】 前記ヌクレオチド配列に加えて、過度な実験を必要とせずに、当該分野で周知
の分子生物学的技術を用いて、完全長cDNAまたはゲノム配列が同定および容易に
単離され得る。本発明は、これらの核酸分子を包含する。
【００７０】 本発明のDNA配列は、いくつかの方法により得ることができる。例えば、当該
分野で周知のハイブリダイゼーションまたはコンピュータに基づく技術を用いて
、DNAは単離され得る。これらとしては、(ａ)ゲノムまたはcDNAライブラリーと
、プローブとのハイブリダイゼーションにより相同なヌクレオチド配列を検出す
ること；(ｂ)発現ライブラリーの抗体スクリーニングにより、共通の構造的特徴
を有するクローンDNA断片を検出すること；(ｃ)目的のDNA配列にアニーリング可
能なプライマーを用いたゲノムDNAまたはcDNAに対するポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)；(ｄ)類似した配列についての配列データベースのコンピュータ検索；(ｅ)サ
ブトラクションDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニング；および(
ｆ)Ｔ細胞cDNAライブラリーの発現配列タグ(EST)での大規模ゲノム配列決定が挙
げられるがこれらに限定されない。本発明のポリヌクレオチド(例えば、p30ポリ
ヌクレオチドおよびHVEM：融合タンパク質ポリヌクレオチド)は、哺乳動物から
誘導されることが好ましい。
【００７１】 核酸ハイブリダイゼーションに依存するスクリーニング手順は、適切なプロー
ブが存在するという前提のもとで、任意の遺伝子配列を任意の生物から単離する
ことを可能にする。問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブは、化学的に合成できる。これは、アミノ酸配列の短いオ
リゴペプチド配列が知られていることを必要とする。タンパク質をコードするDN
A配列は、遺伝子コードから推定できるが、コードの縮重も考慮しなければなら
ない。配列が縮重である場合、追加の混合反応を行うことが可能である。これに
は、変性二本鎖DNAの異種混合物が挙げられる。このようなスクリーニングのた
めには、ハイブリダイゼーションは、一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAのいずれか
に対して行われることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプ
チドに関係するmRNA配列が非常に少量で存在する場合に、由来源から誘導される
cDNAクローンを検出するのに特に有用である。換言すると、非特異的な結合を回
避するように仕向けるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いる
ことで、例えば、標的DNAとその完全な相補体である混合物中の単一のプローブ
とのハイブリダイゼーションにより、特異的なcDNAクローンのオートラジオグラ
フィーによる可視化が可能になる(Wallaceら (1981) Nucl. Acid Res., 9:879)
。あるいはまた、差引きライブラリーは、非特異的cDNAクローンの排除のために
有用である。
【００７２】 所望のポリペプチドのアミノ酸残基の配列全体が知られていない場合、DNA配
列の直接合成は不可能であり、選択法はcDNA配列の合成である。目的のcDNA配列
を単離するための標準的手順の中で、遺伝子発現が高レベルなドナー細胞の豊富
なmRNAの逆転写により誘導されるプラスミド-またはファージ-担持cDNAライブラ
リーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合には、
稀な発現生成物でさえもクローニングできる。ポリペプチドの有意な割合のアミ
ノ酸配列が知られている場合、標的cDNAに存在すると推定される配列を複製する
標識化一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列の生成を、一本鎖形態に変
性されたcDNAのクローンコピーに対して行うDNA/DNAハイブリダイゼーション手
順に採用できる(Jayら (1983) Nucl. Acid Res., 11:2325)。適切なオリゴヌク
レオチドプローブおよびプライマーは、Ｎ末端アミノ酸配列決定により得られる
p30ポリペプチドのアミノ酸配列を「戻し翻訳」することにより構築できる。
【００７３】 λgt11などのcDNA発現ライブラリーを、p30に特異的な抗体を用いて、少なく
とも１つのエピトープを有するp30ペプチドについて間接的にスクリーニングで
きる。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルとして誘導され
、p30 cDNAの存在を示す発現生成物を検出するために使用される。
【００７４】 p30核酸における改変としては、遺伝子内突然変異(例えば、点突然変異、ナン
センス(停止)、ミスセンス、スプライシング部位およびフレームシフト)、なら
びにヘテロ接合またはホモ接合性欠失が挙げられる。このような改変の検出は、
配列分析、サザンブロット分析、PCRに基づく分析(例えば、多重PCR、配列タグ
付け部位(STS))、およびin situハイブリダイゼーションなど当業者に公知の標
準的な方法により行うことができる。このようなタンパク質は、例えば、標準的
SDS-PAGEおよび/または免疫沈降分析および/またはウェスタンブロット分析など
で分析できる。
【００７５】 本発明はまた、前記p30コード配列のいずれかおよび/またはそれらの相補体(
すなわちアンチセンス)を含むDNAベクター、ならびに前記p30コード配列のいず
れかを含む発現ベクターを包含する。
【００７６】 本発明はまた、前記融合ポリペプチドコード配列のいずれかおよび/またはそ
れらの相補体を含むDNAベクター、ならびに前記コード配列のいずれかを含む発
現ベクターも包含する。発現ベクターは、本発明のペプチドまたはポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド配列がプロモーターまたはエンハンサー-プロモ
ーターの組合せと機能し得る形で連結した核酸からなるか、またはそのような核
酸を含む。プロモーターは、典型的に、転写が開始する点の前(上流)の100ヌク
レオチド対以内にあるDNA分子の領域からなる転写調節エレメントである。別の
転写調節エレメントはエンハンサーである。エンハンサーは、時間、場所、およ
び発現レベルの点で特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサー
は、プロモーターが存在するという前提のもとに、転写部位からさまざまな距離
に位置しても機能できる。エンハンサーは、転写開始部位の下流に配置されても
よい。発現ベクターのコード配列は、転写終結領域に機能し得る形で連結される
。コード配列をプロモーターの制御下に置くために、ペプチドまたはポリペプチ
ドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、プロモーターの下流(3'側)１
〜約50ヌクレオチドの間に配置することが必要である。このような調節エレメン
トとしては、サイトメガロウイルスhCMV極初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初
期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージＡの主要オ
ペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3ホスホ
グリセレートキナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、お
よび酵母α接合因子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】 発現ベクターおよびそれらの構築方法は、当業者に公知である。適切なベクタ
ーとしては、プラスミド、ならびにとりわけヘルペスウイルス、レトロウイルス
、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどのウイ
ルスベクターが挙げられる。
【００７８】 本発明は、記載する核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた適
切な宿主細胞系を含む。トランスフェクションに使用される細胞としては、例え
ば本発明の融合ポリペプチドを様々な天然型形態または操作型形態で発現させる
ための、哺乳動物由来源のHEK293細胞、またはSf9およびTN5昆虫細胞が挙げられ
るがそれらに限定されない。細胞は、当該分野で一般的に使用される様々な方法
(例えば、エレクトロポーレーション、またはリン酸カルシウム沈降)によりトラ
ンスフェクトされる。遺伝子は、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス)に
よる形質導入によっても細胞に導入され得る。うまくトランスフェクトされた細
胞系を、当業者によく知られた適切な手段(例えば、Geneticin（商標）(G418)ま
たはピューロマイシンなどの薬剤(関連する発現ベクターはこれらに耐性な遺伝
子を含む)を補充された組織培養培地を使用することにより選択する。うまくト
ランスフェクトされた細胞系は、様々な可能な方法(例えば、フローサイトメト
リー分析)により融合分子の発現についてスクリーニングされる。
【００７９】 「宿主細胞」は、その中でベクターが増殖され、そのDNAが発現される細胞であ
る。この用語はまた、被検体宿主細胞の任意の子孫も含む。複製の間に突然変異
が生じ得るため、全ての子孫が親細胞と同一ではないことが理解される。しかし
、「宿主細胞」という用語を使用する場合には、このような子孫も含まれる。
【００８０】 p30またはHVEMのアミノ酸配列内にある抗原性エピトープを特異的に認識する
抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラ
グメント、F(ab')2フラグメント、および前記のいずれかのエピトープ結合フラ
グメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、炎症反応
をモジュレートする際のアンタゴニスト、または結合物質として作用できる。例
えば、p30に対する抗体は、p30と相互作用することにより作用し、p30が受容体
に結合するのを防ぐことができる。同様に、HVEMと結合または相互作用する抗体
も同様に作用して、HVEMがリガンド(例えば、p30)に結合するのを防ぐことがで
きる。
【００８１】 本発明の抗体は、例えば、自己免疫疾患およびリンパ球悪性疾患の治療のため
に使用できる。これらはまた、細胞上でのp30の発現をテストするためにも使用
でき、従って、特定の被検体に対して適切な治療を選択するためのスクリーニン
グ法の一部として利用できる。例えば、リンパ腫または白血病患者の腫瘍細胞が
p30を発現する場合、抗p30抗体、または抗p30抗体の免疫毒素コンジュゲートが
、その患者の治療法として使用され得る。このような抗体はまた、本発明のスク
リーニングアッセイにおいても利用できる。
【００８２】 本発明の抗体の生成のために、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドを構成す
る個々のポリペプチド(例えば、HVEM)、融合ポリペプチドを発現する細胞、また
はp30ポリペプチドのいずれかを注射することにより宿主動物を免疫化する。あ
るいはまた、これらのポリペプチドの特異的な領域(すなわち、抗原性エピトー
プ)に対応するペプチドを免疫原として使用してもよい。このような宿主動物と
しては、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられるが、これらに限定されない
。宿主種に応じて様々なアジュバントを使用して、免疫応答を高めることができ
、アジュバントとしては、フロイント(完全および不完全)アジュバント、水酸化
アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール(plu
ronic polyol)、多価陰イオン、ペプチド、油性エマルジョン、BCG(カルメット-
ゲラン杆菌)、およびコリネバクテリウム・パルヴァム(Corynebacterium parvum)
が挙げられるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の
血清から誘導された抗体分子の異種集合である。
【００８３】 免疫原性をさらに増強させるために、免疫原を担体に連結させてもよい。この
ような担体の例としては、テンガイ(keyhole limpet)ヘモシアニン(KLH)、およ
びウシ血清アルブミン(BSA)がある。卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、
またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも担体として使用できる。ペ
プチドを担体に連結させる方法は、当該分野で周知であり、グルタルアルデヒド
、カルボジイミドおよびｍ-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミド
エステルの使用が挙げられる。
【００８４】 使用する抗原の量は、過度な実験を必要とせずに当業者により容易に決定でき
る。抗原は、多数の経路(例えば、皮下、筋内、皮内、静脈内および腹腔内)によ
り投与できる。ポリクローナル抗体の生成は、投与後の様々な時点で、免疫化動
物の血液をサンプリングすることによりモニターする。所望のレベルの抗体が得
られた場合、動物から採血し、血清を保存する。
【００８５】 特定の抗原に対する抗体の同種集合であるモノクローナル抗体は、培養中の連
続細胞系により抗体分子の生成をもたらす任意の技術により得ることができる。
これらとしては、ハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein (1975) Nature 25 6 :495-497；米国特許第4,376,110号；HowellおよびLane (1988) Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.)、ヒトＢ細胞ハイブリド
ーマ技術(Kosbor (1983) Immunology Today 4:72；Coleら (1983) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80:2026)、およびEBV-ハイブリドーマ技術(Coleら (1985), Mon
oclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc)が挙げられるが
これらに限定されない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任
意の免疫グロブリンクラス、またはそれらのサブクラスのものであり得る。
【００８６】 さらに、「キメラ抗体」の生成のために開発された技術を使用できる(Morrison
ら (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851；Neuberger (1984) Nature 31 2 :604；Takeda (1985) Nature 314:452)。これらには、適切な抗原特異性のマウ
ス抗体をコードする遺伝子の一部を、適切な生物学的活性のヒト抗体をコードす
る遺伝子の一部にスプライシングすることを伴う。キメラ抗体は、例えば、マウ
スモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を
有するなど、異なる部分が異種動物に由来する分子である。このようなキメラ抗
体は、例えば、IgHをコードするヒト遺伝子座、ならびに６および８軽鎖遺伝子
座を含むマウスを免疫化することによっても生成できる。
【００８７】 あるいはまた、一本鎖抗体の生成について記載される技術(米国特許第4,946,7
78号；Bird (1988) Science 242:423；Hustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 85:5879；およびWardら (1989) Nature 334:544)を適用して、本発明の融
合ポリペプチドのエピトープに対する一本鎖抗体を生成することもできる。一本
鎖抗体は、Fv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結す
ることにより、一本鎖ポリペプチドが生じて形成される。これらは、組換えDNA
技術により都合よく生成される。
【００８８】 特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により生成さ
れ得る。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化に
より生成され得るF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフ
ィド架橋を還元することにより生成され得るFabフラグメントが挙げられるが、
これらに限定されない。あるいはまた、Fab発現ライブラリーを構築して(Huse (
1989) Science 246:1275)、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメン
トの高速かつ容易な同定を可能にしてもよい。結合特異性について抗体をスクリ
ーニングする方法は、当該分野において周知である。
【００８９】 本発明は、HVEMまたはLTβR受容体ポリペプチドのいずれかを介して仲介され
る細胞性応答をモジュレート可能な化合物を同定するために設計されたin vitro
系に特徴付けられる。本明細書において「細胞性応答」とは、細胞活性化、HSVの
細胞内在化、または炎症細胞、サイトカイン、プロスタグランジンおよびロイコ
トリエンなどの炎症仲介物質の活性化または生成における変化を指す。これらの
細胞性応答は、(ａ)HVEMと、p30、gDもしくはLTαとの相互作用；または(ｂ)LT
βRとp30との相互作用により誘発される。
【００９０】 「リガンド」という用語は、高い親和性および特異的な様式で受容体タンパク質
に結合して、機能的応答を誘発するポリペプチドまたは化合物を指す。例えば、
本発明のリガンドとしては、p30、gDまたはLTαが挙げられる。本明細書におい
て「受容体」という用語は、リガンドに結合すると細胞性応答を誘導するポリペプ
チドを指す。本発明の受容体としては、HVEMまたはLTβRが挙げられる。「結合物
質」という用語は、高い親和性および特異的な様式で受容体またはリガンドに結
合して機能的応答を誘発するかまたは誘発しないポリペプチドまたは化合物を指
す。テスト化合物は、定義、単離および精製された候補化合物(例えば、小さい
合成分子)、コンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または生物学
的流体、組織抽出物、細胞画分、または細胞溶解産物などの生物学的サンプル中
に存在していもよい。
【００９１】 一実施形態では、本発明は、HVEM結合物質仲介型細胞性応答に作用する化合物
を同定するアッセイに特徴付けられる。このアッセイは：(ａ)化合物を、HVEMポ
リペプチドもしくはHVEMポリペプチドを発現する細胞、およびHVEM結合物質と、
これらの成分を相互作用させる条件下でインキュベートすること；ならびに(ｂ)
HVEM結合物質仲介型細胞性応答に対する化合物の影響を決定すること、を伴う。
また、本発明には、LTβR-p30仲介型細胞性応答に作用する化合物を同定するア
ッセイも含まれる。このアッセイは：(ａ)化合物を、LTβRポリペプチドまたはL
TβRポリペプチドを発現する細胞、およびp30と、これらの成分を相互作用させ
る条件下でインキュベートすること；ならびに(ｂ)LTβR-p30-仲介型細胞性応答
に対する化合物の影響を決定すること、を伴う。本発明のアッセイにおいては、
HVEMもしくはLTβRとリガンドとの相互作用により仲介される細胞活性化をモジ
ュレートするか、またはHSVによる感受性細胞の感染を阻害するかのいずれかの
能力について、化合物をスクリーニングする。
【００９２】 本発明は、細胞性応答アッセイに特徴付けられる。これらの細胞性応答アッセ
イは、炎症細胞補充、活性化、ならびに炎症誘発サイトカイン、プロスタグラン
ジンおよびロイコトリエンの生成など、細胞活性化、HSVによる細胞感染、また
は炎症性仲介物質に作用することによる炎症のモジュレーションのいずれかを測
定する。
【００９３】 テスト化合物は、リガンド(例えば、p30、LTαもしくはgD)および細胞に適し
た準最適(suboptimal)の用量の刺激剤により刺激される受容体(例えば、HVEMま
たはLTβR)を発現する細胞の応答をモジュレートする能力についてテストできる
。細胞を発現する「応答性(responder)」受容体は、被検体から新たに得られるか
、培養細胞系であってもよい。細胞は、内因的にコードされた受容体、またはト
ランスフェクトされた遺伝子にコードされる受容体を発現できる。リガンドを、
単離ポリペプチドの形態で細胞性応答培養物に添加してもよいし、またはリガン
ドを発現する細胞を培養物に添加してもよい。リガンドを発現する細胞は、リガ
ンドをコードする内因性遺伝子を発現させるか、またはリガンドをコードするト
ランスフェクト遺伝子を発現させてもよい。さらに、リガンドは、細胞表面上に
発現され得るか(p30またはgD)、または分泌され得る(p30、gDもしくはLTα)。p3
0またはgDを分泌させるためには、それをコードする遺伝子が、欠失された膜貫
通ドメインをコードする領域を有する必要がある。細胞活性化は、例えば、細胞
増殖、細胞表面活性化マーカーのde novo発現、または可溶性因子生成により測
定できる。
【００９４】 好適な実施形態では、細胞はリンパ球である。Ｔ細胞の場合、受容体(HVEMま
たはLTβR)を発現する応答性Ｔ細胞を、テスト化合物、リガンド、および最適に
は及ばない用量のＴ細胞アクチベーター(例えば、抗CD3抗体、フィトヘマグルチ
ニン (PHA)などのレクチン、またはブドウ球菌エンテロトキシンＣ(SEC)などの
スーパー抗原)の存在下で培養できる。対照は、(ａ)Ｔ細胞単独；(ｂ)Ｔ細胞(Ｔ
細胞アクチベーターは存在、リガンドは存在、テスト化合物は不在)；(ｃ)Ｔ細
胞(Ｔ細胞アクチベーターは存在、リガンドおよびテスト化合物は不在)；(ｄ)Ｔ
細胞(Ｔ細胞アクチベーターは存在、リガンドは不在、テスト化合物は存在)；(
ｅ)Ｔ細胞(Ｔ細胞アクチベーターは不在、リガンドは存在、テスト化合物は不在
)；(ｆ)Ｔ細胞(Ｔ細胞アクチベーターは不在、リガンドは不在、テスト化合物は
不在)；ならびに(ｇ)Ｔ細胞(Ｔ細胞アクチベーターは不在、リガンドは不在、テ
スト化合物は存在)を含む培養物である。Ｔ細胞活性化は、3Hチミジンの取り込
みによるＴ細胞増殖(実施例５を参照)、CD69もしくはCD25などの活性化マーカー
の誘導、またはインターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)もしくは
インターフェロン-(IFNγ)などのサイトカインの生成という形で測定できる。
【００９５】 Ｂリンパ球の場合、同様の応答アッセイを行ってもよい。Ｂ細胞アクチベータ
ーは、アメリカヤマゴボウマイトジェンなどのマイトジェン、ブドウ球菌プロテ
インＡ、または抗免疫グロブリンであり得る。細胞活性化細胞は、(同じく3H-チ
ミジン取込みによる)細胞増殖、またはIg分泌により測定できる。あるいはまた
、栄養的に最適には及ばない培地中のＢ細胞の生存率を測定してもよい(実施例
５を参照)。
【００９６】 テスト化合物にリンパ球活性化を阻害する能力がある場合それは、このような
化合物が、Ｔ細胞(例えば、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、およ
び多発性硬化症)またはＴおよびＢ細胞(例えば、全身性紅斑性狼瘡もしくは重症
筋無力症)が大いに関与する自己免疫疾患、ならびに炎症性障害(例えば、関節炎
、乾癬および炎症性腸疾患)の治療に有用であり得ることを示す。テスト化合物
にリンパ球活性化を刺激する能力がある場合それは、このような化合物が、感染
性疾患を患う被検体、または例えば癌に対する化学療法もしくは放射線療法を行
われている患者、もしくはAIDSを患う患者のような免疫抑制されている被検体に
おいて免疫応答を刺激するのに有用であり得ることを示す。
【００９７】 HSV感染を予防するテスト化合物についてのアッセイでは、テスト化合物を、H
SV感受性細胞およびHSVの培養物に添加してもよい。ウイルス感染に対する許容
細胞系としては、ヒト皮膚繊維芽細胞、活性化を惹起する物質(例えば、抗CD3抗
体、またはフィトヘマグルチニン)で処理された末梢血液リンパ球、および形質
転換細胞系(例えば、Held細胞)が挙げられる。ウイルス産生は、当業者に公知の
任意の数の方法(ウイルスプラークアッセイ、ELISAで測定される特異的なウイル
スタンパク質の生成、または比色アッセイにより容易に検出可能な酵素であるβ
ガラクトシダーゼなどの指示遺伝子産物遺伝子産物を含む組換えウイルスの使用
(Montgomery (1996)、前掲))を使って測定し得る。
【００９８】 テスト化合物がHSVによる細胞感染を阻害する能力を有する場合それは、この
ような化合物がHSV感染を患う被検体の治療において有用であり得ることを示す
。化合物が、関連する受容体-リガンド対のメンバーのどちらかと結合すること
で細胞性応答機能に作用するか否かをテストするために、当該分野で周知のアッ
セイ(ELISA、ウェスタンブロッティングまたはラジオイムノアッセイ)により、
可溶性形態の受容体またはリガンドに結合する該化合物の能力についてテストし
得る。さらに、受容体またはリガンドのいずれかとテスト化合物との結合が、受
容体とリガンド間の結合の阻害をもたらすか否かをテストするために、可溶性形
態の受容体およびリガンドの結合を阻害する能力についてテスト化合物を試験で
きる。これらのアッセイの例としては、競合ELISA、競合ウェスタンブロッティ
ング、および競合ラジオイムノアッセイがある。
【００９９】 本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用するペプチドおよびポリペプチ
ドは、様々な手段により得ることができる。より小さいペプチド(50アミノ酸未
満の長さ)は、標準的な化学的方法で都合よく合成できる。一部のポリペプチド(
例えば、抗体)は、商業的な出所から購入できる。入手できない場合には、上述
したように抗体を産生できる。検出可能に標識化した抗体は、商業的な出所から
購入できるか、または当業者により容易に調製できる。
【０１００】 HVEM、LTβR、p30、gDまたはLTαなどのポリペプチドは、当業者に周知の方法
により、生物学的由来源から精製できる(Protein Purification, Principles an
d Practice, 第２版(1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.)。これらはまた、
当該分野で周知の技術を用いた組換えDNA技法により、天然型タンパク質形態、
切断型タンパク質形態、融合タンパク質形態またはキメラタンパク質形態で作製
し得る。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、
およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Sambrookら (1989) Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；およびA
usubelら(上で引用)に記載される技術を参照のこと。あるいはまた、タンパク質
をコードするRNAを化学的に合成してもよい。例えば、Oligonucleotide Synthes
is, (1984) Gait, M.J.編, IRL Press, Oxford(その全体を参照により本明細書
に援用する)に記載される技術を参照のこと。
【０１０１】 様々な宿主-発現ベクター系が、ヌクレオチド配列を発現するために利用でき
る。ペプチドまたはポリペプチドが可溶性である場合、(ａ)ペプチドもしくはポ
リペプチドが分泌されない場合には培養物(すなわち宿主細胞)から、または(ｂ)
ペプチドもしくはポリペプチドが細胞により分泌される場合には培養培地から回
収できる。発現系はまた、ポリペプチドをin situで(例えば、細胞膜に貫入して
)発現する操作された宿主細胞も包含する。このような発現系からのポリペプチ
ドの精製または高濃度化は、適切な界面活性剤、脂質ミセル、および当業者に周
知の他の方法を用いて達成できる。あるいはまた、このような操作された宿主細
胞自体を、タンパク質の構造および機能的特徴を保持するだけではなく、生物学
的活性を評価することも重要である状況下で使用してもよい。
【０１０２】 本発明の目的のために使用できる発現系としては、ヌクレオチド配列を含む組
換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクター
で形質転換された細菌(例えば、大腸菌およびB.サブチリス(B. subtilis))など
の微生物；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現
ベクター(バキュロウイルス)による感染を受けた昆虫細胞；組換えウイルス発現
ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイ
ルス、TMV)により感染を受けた植物細胞系、もしくは組換えプラスミド発現ベク
ターで形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロ
モーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに
由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を収容する哺乳動物細胞(例えば
、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】 細菌系においては、いくつかの発現ベクターを、有利には発現させる遺伝子産
物の意図する用途に応じて選択してよい。例えば、(例えば、タンパク質に対す
る抗体を生じるために)このようなタンパク質を大量に生成する場合、精製が容
易な融合タンパク質産物の高レベルな発現を指示するベクターが望ましいことが
ある。このようなベクターとしては、lacZコード領域とインフレームでコード配
列が個々にベクターにライゲートされて融合タンパク質が生成される大腸菌発現
ベクターpUR278(Rutherら (1983) EMBO J. 2:1791)；pINベクター(Inouye (1985
) Nucleic Acids Res. 13:3101；Van Heeke (1989) J. Biol. Chem. 264:5503)
；などが挙げられるがこれらに限定されない。pGEXベクターも、外来ポリペプチ
ドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現す
るために使用できる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グ
ルタチオン-アガロースビーズへの吸着後、遊離グルタチオンの存在下での溶出
により、溶解細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、トロンビンまたは因
子Xaプロテアーゼ切断部位を含むことにより、クローニングされる標的遺伝子産
物がGST部分から放出されるように設計する。スクリーニングアッセイに使用す
るポリペプチドは、ポリペプチドの天然型形態またはポリペプチドを含む融合タ
ンパク質のいずれかであり得ると理解される。融合タンパク質の無関係な部分は
、例えば、免疫グロブリンＧのFc部分、ヘキサヒスチジン、またはGSTであり得
る。
【０１０４】 哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルス利用発現系が利用できる。アデ
ノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のヌクレオチド配列をアデ
ノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよび三部(tripart
ite)リーダー配列)とライゲートしてもよい。その後、このキメラ遺伝子を、in
vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイ
ルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)への挿入により、感染宿主に
おいて生存可能かつ遺伝子産物を発現可能な組換えウイルスが生じる(例えば、L
ogan 及び Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655を参照)。特定の
開始シグナルも、挿入されたヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために必要であ
り得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。自身の開
始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子またはcDNAの全体が適切な発現ベクターに
挿入される場合、翻訳制御シグナルはそれ以上必要ない。しかし、コード配列の
一部のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含むであろう外因性翻訳制御シグ
ナルを用意しなければならない。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳
を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していな
ければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然お
よび合成の両方の様々な由来源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エ
ンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことで、増強され得る(B
ittner (1987) Methods in Enzymol. 153:516)。
【０１０５】 さらに、所望の特定の様式で、挿入された配列の発現をモジュレートするか、
遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパ
ク質産物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば
、切断)は、タンパク質の機能のために重要であり得る。適切な細胞系または宿
主系を選択することで、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシ
ングを確実にできる。哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、Held、COS
、MDCK、293、3T3およびWI38が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】 組換えタンパク質の長期かつ高収率な産生のためには、安定した発現が好まし
い。例えば、前記配列を安定して発現する細胞系を操作してもよい。ウイルス複
製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御エレメント(例え
ば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部
位など)で制御されるDNAおよび選択可能マーカーで宿主細胞を形質転換できる。
外来DNAの導入の後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させて、そ
の後選択培地に移してもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対
する耐性を付与し、細胞が染色体にプラスミドを安定して組み込んで、成長して
、遺伝子座を形成することを可能にする。そして、該遺伝子座は、クローニング
することができ、細胞系に展開することができる。本方法は、該遺伝子産物を発
現する細胞系を操作するために有利に使用できる。このような操作された細胞系
は、遺伝子産物の内因性活性に作用する化合物のスクリーニングおよび評価のた
めに特に有用であり得る。
【０１０７】 融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に特異的に結合する抗体または
その部分を利用することにより、容易に精製できる。例えば、Janknecht (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972に記載される系は、ヒト細胞系で発現さ
れる非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする。この系では、目的の遺伝
子が、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングされて、遺伝子のオープ
ンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻
訳的に融合されるようにする。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの
抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムに充填し、ヒスチジンタグを有
するタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。所望であれば、
ヒスチジンタグは適切な酵素で選択的に切断できる。
【０１０８】 キメラタンパク質も、当業者に公知の方法により誘導できる。これは、所与の
タンパク質をコードする遺伝子の部分を、異なるタンパク質をコードする１以上
の遺伝子に由来する１以上の部分にスプライシングすることを伴う。キメラポリ
ペプチドは、異なる部分が異なるタンパク質に由来する分子である。例えば、キ
メラタンパク質は、HVEMのドメインとLTβRの別のドメイン、またはHVEMのドメ
インと抗体のFc領域のドメインとを含み得る。
【０１０９】 本発明は、受容体ポリペプチドであるHVEMを発現する細胞をHVEM結合物質に接
触させることによって、HVEM仲介型細胞性応答をモジュレートする方法を提供す
る。あるいはまた、HVEM仲介型細胞性応答を、HVEMに対するリガンドを、リガン
ド結合性物質と接触させることによりモジュレートする。このようなリガンドと
しては、LIGHT(p30)、LTαまたはgDが挙げられる。LIGHT(p30)は、細胞の表面上
で発現され得るか、例えばホモ三量体形態で可溶性であり得る。LTαは分泌され
得、gDはHSVビリオンまたはHSV感染細胞の表面上で発現され得る。
【０１１０】 「細胞性応答」というフレーズは、ここでも、細胞活性化(例えば、産生仲介物
質、炎症仲介物質の増加)、または細胞によるHSVの内部移行を指す。本発明はま
た、LTβRを発現する細胞またはLTβRリガンドであるp30を発現する細胞を、HVE
Mまたはp30のいずれかに結合する結合物質と接触させることを包含する、LTβR
仲介型細胞性応答をモジュレートする方法にも特徴付けられる。
【０１１１】 本明細書で使用する「接触」という用語は、受容体またはリガンドを、受容体の
モジュレートに有効な量の結合物質に曝して、該結合物質がリガンドと受容体と
の相互作用により開始する細胞性応答を有効にモジュレートできるようにするこ
とを意味する。モジュレーションは、細胞性応答の阻害または活性化をもたらす
ことができる。特定の受容体-リガンド対に対する特定の結合物質のこれらの他
の性質は、記載するスクリーニングアッセイを用いて予めテストできる(例えば
、実施例６〜８を参照)。
【０１１２】 受容体結合物質に関して、HVEM結合物質としては、可溶性gD、可溶性p30(例え
ば、LIGHT-t66)、またはLTαのペプチド断片、好ましくは天然型LTαのＮ末端か
ら108番目の位置に対応する位置にアミノ酸Tyrを含むペプチド断片が挙げられる
。LTβR結合物質は、可溶性p30である。
【０１１３】 リガンド結合物質に関して、p30結合物質としては、可溶性HVEM、可溶性LTβR
、例えばHVEM:Fcなどのキメラ構築物(例えば、融合タンパク質)、またはp30に特
異的に結合する抗体が挙げられる。LTα結合物質は、可溶性HVEM、例えば、HVEM
:Fc融合タンパク質またはキメラ構築物である。
【０１１４】 接触は、結合物質またはアンタゴニストを、HVEMまたはLTβRを発現する細胞(
例えばHVEMリガンド(p30、LTαもしくはgD)、またはLTβRリガンドであるp30に
より活性化されているリンパ球)の培養物に添加することにより、in vitroで行
ってもよい。結合物質はまた、例えば、HSVビリオンの表面上またはHSV感染細胞
の表面上のgDに曝されたHVEM発現細胞の培養物に添加してもよい。結合物質が、
これらの細胞性応答をモジュレートする能力は、記載されるスクリーニング法を
用いて予めテストできる。結合物質は、単離ポリペプチドとして、または結合物
質をコードする核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞とし
て添加され得る。このようなin vitro法では、「受容体のモジュレートに有効な
量」の結合物質とは、細胞活性化またはHSV感染を、20％を上回って、好ましくは
50％を上回って、より好ましくは80％を上回って、最も好ましくは95％を上回っ
てモジュレートするのに必要な量をいう。
【０１１５】 接触は、被検体内でin vivoで行ってもよい。被検体は、慢性関節リウマチ、
インスリン依存型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡もしくは重症筋無力
症などの自己免疫疾患、リンパ腫(ＴまたはＢ細胞)悪性疾患、HSV感染、HSV以外
の生物による感染、もしくは炎症性障害を患うか、または免疫抑制状態にある哺
乳動物(好ましくはヒト)であり得る。HVEM-p30またはLTβR-p30仲介型細胞性応
答の阻害は、(例えば、慢性関節リウマチ、インスリン依存型糖尿病、多発性硬
化症、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症およびＴ細胞悪性疾患における)Ｔ細胞
増殖もしくは活性化、および(例えば、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症および
Ｂ細胞悪性疾患における)Ｂ細胞増殖を予防できるという点で、自己免疫疾患ま
たはリンパ腫悪性疾患を患う患者において有利であり得る。HVEM-gD仲介型細胞
性応答(すなわち、HSVの内部移行)の阻害は、細胞外空間に存在するか、その表
面上にgDを発現するHSV感染細胞に由来するgD発現HSVビリオンの内部移行により
仲介されるウイルスの拡散が抑制されるという点で、HSV感染を患う被検体にと
って治療となり得る。HVEM-p30またはLTβR-p30仲介型細胞性応答の刺激は、Ｔ
細胞増殖およびＢ細胞増殖の両方が刺激される点で、HSV以外の感染を患う被検
体もしくは免疫抑制被検体(例えば、リンパ腫悪性疾患以外の癌に対する放射線
および/もしくは化学療法を行っている患者)またはAIDS患者を治療するのに有用
であり得る。当然、HVEM-p30仲介型細胞性応答を刺激する結合物質は、HVEM-gD
細胞性応答をも増強してHSVウイルスの拡散を増強し得るため、HSV感染を患う被
検体における使用は避ける。しかし、関連する結合物質におけるこの活性は、上
述したスクリーニングアッセイを用いて予めテストできる。同様に、これらの刺
激性結合物質は、腫瘍細胞の成長を促進する場合はリンパ腫悪性疾患には使用し
ない。
【０１１６】 細胞性応答のin vivoモジュレーションのために使用する結合物質としては、H
VEM、LTβR、p30、抗体、gDおよびLTαのような天然型形態、ならびにHVEM:Fc構
築物のような操作された形態が挙げられる。これらは、上述した方法により産生
される。LTαに由来し、HVEM-LTα相互作用をモジュレートするペプチドも使用
し得る。このペプチドは、約205以下のアミノ酸を含む。例えば、５、８、12、1
5または18のアミノ酸を含み得る。このペプチドは、残基Tyr、またはその保存的
な置換を、天然型LTαのＮ末端から108番目のアミノ酸残基に対応する位置にお
いて含むことが好ましい。
【０１１７】 結合物質として同じく挙げられるのは、上述したペプチドのペプチド模倣体で
ある。ペプチド模倣体化合物は、選択されたペプチドの三次元構造に基づく三次
元構造(すなわち、「ペプチドモチーフ」)を有する合成化合物である。このペプチ
ドモチーフは、ペプチド模倣体の基となったペプチドの活性以上の細胞性応答モ
ジュレート活性を有するペプチド模倣体化合物を提供する。ペプチド模倣体化合
物は、より高い親和性および/または結合活性、ならびに延長された生物学的半
減期など、治療的用途を増強する更なる特徴を有していてもよい。本発明のペプ
チド模倣体は、典型的には、部分的または全体的に非ペプチドであるが、ペプチ
ド模倣体の基となったペプチドに存在するアミノ酸残基の側基(side group)と同
一の側基を有する骨格を有する。いくつかの種類の化学結合(例えば、エステル
、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレン、お
よびケトメチレン結合)が、プロテアーゼ耐性ペプチド模倣体を構築する際のペ
プチド結合の代わりとして一般的に有用であることが当該分野で知られている。
【０１１８】 ポリペプチドおよびペプチド結合物質を、アミノ末端またはカルボキシル末端
のいずれかまたは両方に遮断物質を添加することにより修飾して、関連するポリ
ペプチドまたはペプチドをin vivoで残存し易くしてもよい。これは、ペプチド
末端がプロテアーゼにより分解され(「噛み取られ(nibbled)」)る傾向にある状況
において有用であり得る。このような遮断物質としては、限定するものではない
が、投与されるポリペプチドまたはペプチドのアミノおよび/またはカルボキシ
ル末端残基に付着できる追加の関連または非関連ペプチド配列が挙げられる。こ
れは、ペプチドもしくはポリペプチドの合成の間に化学的に、または組換えDNA
技術のいずれかにより行うことができる。あるいはまた、ピログルタミン酸また
は当業者に公知の他の分子などの遮断物質を、アミノおよび/もしくはカルボキ
シル末端残基、または異なる部分で置換されたアミノ末端におけるアミノ基もし
くはカルボキシル末端におけるカルボキシル基に付着させてもよい。同様に、結
合物質は、投与前に、製薬上許容可能な「担体」タンパク質と、共有結合または非
共有結合により連結し得る。
【０１１９】 in vivo送達は、結合物質自体、または結合物質をコードする核酸、結合物質
をコードする発現ベクター、または該ベクターでトランスフェクトもしくは形質
導入された細胞のいずれかを、被検体に投与することを含む。
【０１２０】 結合物質は、ヒト被検体への送達について以下に記載する技術と実質的に同じ
技術を用いて哺乳動物の細胞に送達し得る。適切な哺乳動物の例としては、ヒト
、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスター、ウサギ、およびヤギが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】 結合物質は、非修飾状態で、適切な生理学的溶液(例えば、生理学的食塩水)に
溶解して患者の細胞に送達し得る。当然、これらのペプチドは、関連する組織お
よび細胞型を選択的に標的化することが望ましい。これは、ペプチドを、害のあ
る器官または組織と(例えば、局部注射または移植により)直接接触させることに
より達成できる。従って、慢性関節リウマチまたはインスリン依存型糖尿病のよ
うな自己免疫疾患においては、このペプチドを、害のある関節もしくは膵臓にそ
れぞれ、または盛んな自己免疫応答が起きる下流リンパ組織(draining lymphoid
tissue)に直接導入してもよい。
【０１２２】 あるいはまた、結合物質を、関連細胞(例えばＴ細胞またはＢ細胞)上の受容体
に対するリガンドまたはこれらの細胞により発現される細胞表面マーカーに対す
る抗体が取り込まれたリポソームに入れて送達してもよい。従って、CD4Ｔ細胞
表面マーカーに特異的な抗体により、抗CD4抗体およびCD4+Ｔ細胞に対する関連
結合物質の両方を含むリポソームを導くことができる。このアプローチは、自己
免疫疾患およびHSV感染の両方に使用できる。優性病原性Ｔ細胞クローンにより
発現されるＴ細胞受容体(TCR)が定義された自己免疫疾患では、関連TCR成分(例
えばＶβ)に対して特異的な抗体を使用してもよい。後者の方法は、病原性エフ
ェクター細胞は特異的に標的化されて阻害され、免疫系全体および標的器官の細
胞は影響を受けない(uncompromise)ままである免疫療法の理想的な形態の一例で
ある。
【０１２３】 リンパ腫または白血病患者においては、抗増殖性結合物質が癌細胞へと導かれ
ることが好ましい。ペプチドは、例えば、腫瘍を除去する手術の後にリンパ腫腫
瘍部位を囲む組織に直接注射されて、残った腫瘍細胞の成長を阻害し得る。手術
の代わりに、腫瘍への結合物質のin situでの注射により腫瘍を治療してもよい
。前記のリポソームの方法も利用できる。この場合、腫瘍特異的抗原(TSA)また
は腫瘍会合抗原(TAA)に特異的な抗体が利用できる。
【０１２４】 任意の１名の患者に対する用量が、投与される特定の化合物、投与の時間およ
び経路、ならびに同時に投与される他の薬剤のみならず多くの要因に依存するこ
とは、医学分野では周知である。本発明の結合物質の用量は様々であるが、静脈
内投与の場合には、約0.01mg〜10 mg/ml血液量であり得る。投与の経路および用
量は、熟練の薬理学者および医師に周知である。経路としては、上述したものに
加えて、腹腔内、筋内、肺内、経粘膜(transmucosal)、皮下、および静脈内経路
が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】 In vivo遺伝子療法アプローチは、遺伝子構築物を、好ましくは目的の細胞ま
たは組織を標的化して、患者に直接送達することを必要とする。腫瘍細胞または
活性化リンパ球の標的化は、例えば、主に増殖細胞を安定してトランスフェクト
するレトロウイルスを使用することにより達成できる。別の実施形態では、炎症
性障害は関節炎で、組織標的は被検体の関節内の軟骨であり得る。このような場
合、本発明の融合構築物を、遺伝子活性化マトリックスに付着させて(すなわち
、高分子物質上にコートして)徐放性の物質を提供するか、または関節に直接注
射してもよい。
【０１２６】 組織特異的標的化はまた、静電結合または共有結合の力によりポリ-Ｌ-リシン
に付着したプラスミドまたは他のベクターからなる分子コンジュゲートの使用に
よっても達成し得る。ポリ-Ｌ-リシンは、腫瘍細胞上の受容体に結合できるリガ
ンドに結合する(Cristiano (1995) J. Mol. Med. 73:479)。同様に、上述した種
類の腫瘍および細胞特異的抗体をベクターと結合させて、それによってリンパ腫
腫瘍またはＴリンパ球などのリンパ系細胞を標的化させることができる。後者は
、自己免疫疾患およびHSV感染において有用であり得る。比較的腫瘍特異的な発
現を誘導するプロモーターを用いて、さらなるレベルの標的化を達成することも
できる。自己免疫または移植患者において使用する組織特異的プロモーターとし
ては、例えば、誘導可能なIL-2(Thompson (1992) Mol. Cell. Biol. 12:1043)、
IL-4(Todd (1993) J. Exp. Med. 177:1663)、およびγインターフェロン(Penix
(1993) J. Exp. Med. 178:483)のＴ細胞標的化プロモーターが挙げられる。この
ような誘導可能プロモーターは、活性化Ｔ細胞において発現が選択的に起きると
いう、さらなる貴重な利点を有し得る。この活性化Ｔ細胞の集合には、理想的な
免疫療法様式により自己免疫患者において選択的に阻害されるエフェクター細胞
が含まれる。
【０１２７】 ベクターはまた、上述したように、単独で、または細胞特異的抗体と共に、リ
ポソームまたは他の送達ビヒクルに取り込まれて送達され得る。
【０１２８】 通常、関連結合物質は細胞膜(HVEM、LTβR、p30またはgD)に結合するが、結合
物質の膜貫通ドメインをコードする核酸の領域は、発現ベクターに含まれる核酸
から欠失している。
【０１２９】 DNAまたはトランスフェクトされた細胞は、製薬上許容可能な担体に入れられ
て投与され得る。製薬上許容可能な担体は、ヒトへの投与に適した生物適合性の
あるビヒクル(例えば、生理学的食塩水)である。治療的に有効な量とは、治療す
る動物において医薬的に所望の結果を生じることができる本発明のDNAの量であ
る。医薬分野で周知であるとおり、任意の１名の患者に対する用量は、患者の大
きさ、身体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および
経路、全般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬剤などを含む多くの
要因に依存する。用量は様々であるが、DNAの静脈内投与の場合に好ましい用量
は、約106〜1012コピーのDNA分子である。この用量は、必要に応じて繰返し投与
されてもよい。
【０１３０】 本明細書に採用されている「製薬上許容可能」というフレーズは、過剰な毒性、
刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を起こすことなく、妥当
な利得/リスク比に相当し、有効な医療的判断の範囲内においてヒトおよび動物
の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、物質、組成物、および/また
は用量形態を指す。
【０１３１】 製薬上許容可能な組成物における、ペプチド、抗体、融合タンパク質、核酸、
またはそれらの誘導体の最適な濃度は、投与される化合物の好ましい用量、採用
する化合物の化学的特徴、化合物賦形剤の処方、および投与経路を含む多数の要
因に応じて異なり得る。投与される医薬的組成物の最適な用量はまた、例えば、
炎症性障害または治療される疾患の種類および程度、特定の被検体の全体的な健
康状態、ならびに選択された化合物の相対的な生物学的効力などの変数にも依存
する。例えば、本発明の組成物は、炎症性障害(関節炎、乾癬および炎症性腸疾
患が挙げられるがこれらに限定されない)の治療に使用し得る。「有効量」または「
炎症阻害量」とは、炎症性応答または症状を、モジュレートし、阻害し、または
抑制するのに必要な化合物の量を意味する。
【０１３２】 当業者は、臨床的用量を決定するための方法および技術を記載する以下の教示
(すなわち、Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocol
s, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, pp.7-13, 54-60；Spilker B.,
Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, pp. 93-101
；Craig C.およびR. Stitzel編, Modern Pharmacology, 第２版, Little, Brown
and Co., Boston, 1986, pp. 127-33；T. Speight編, Avery's Drug Treatment
: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 第
３版, Williams and WIlkins, Baltimore, 1987, pp. 50-56；R. Tallarida, R.
RaffaおよびP. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-V
erlag, New York, 1988, pp. 18-20)を使用して、適切な使用用量を決定するこ
とができる。
【０１３３】 従って、本発明は、本明細書に記載する方法および組成物を用いて、細胞、組
織または被検体における炎症性反応または障害を治療または阻害する方法を提供
する。この方法は、炎症性反応または障害を有する細胞、組織または被検体を、
阻害有効量の融合ポリペプチド、または本発明の融合ポリペプチドを含む組成物
と接触させることを包含する。本明細書に記載するように、剤形および組成物は
、本明細書に記載する教示を用いて当業者により容易に特定できるか、または、
当業者により容易に得ることができる。例えば、本発明の融合ポリペプチドは、
被検体の炎症部位に局部的に投与し得る。このような局部投与としては、本発明
のポリペプチドを、例えば、ローション剤または軟膏の状態で投与することが挙
げられる。あるいはまた、本発明のポリペプチドを全身投与してもよい。このよ
うな全身投与としては、例えば、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、または経
口投与が挙げられる。さらに、例えば坐剤、丸剤、リポソーム剤形、および当業
者が容易に特定できる他の剤形など、ポリペプチドを含む剤形を全身投与に使用
してもよい。以下にさらに詳細に記載するように、本発明のポリペプチド(例え
ば、HVEM:Fc)は、抗炎症性を有することが実証されている。
【０１３４】 以下の実施例は本発明を説明することを意図するものであり、限定するもので
はない。
【０１３５】実施例 実施例のための材料 ヒトIgG1のFc領域およびFas:Fcのリガンド結合ドメインで形成された二価キメ
ラタンパク質(Brunner (1995) Nature 373:441)、TNFR60(Crowe (1994) J. Immu
nol. Methods 168:79)、ならびにヒトLTβR:Fc(Crowe (1994) Science 264:707)
の構築、発現および精製は、既に説明されている。HVEMの細胞外領域は、順方向
プライマー5'CGGAGATCTGAGTTCATCCTGCTAGCTGG-3'(配列番号１)および逆方向プラ
イマー5'ATAGGATCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3'(配列番号２)を使用し、１〜K184
をコードするpBEC10 DNAから、Taq DNAポリメラーゼ増幅配列を用いたPCRにより
産生させた。増幅されたHVEM産物を、ヒトFc IgG1を含むバキュロウイルスベク
ターpVL1392(Pharmingen)に、インフレームでライゲートした。ウサギIgG1由来
のFc領域を有するHVEM:Fcの同様の構築物を、CHO細胞内で産生させ、精製し、免
疫原として使用して、ウサギ抗HVEM抗体を産生させた。LTβR:Fcは、細胞外ドメ
インのアミノ酸残基１〜Met221をコードするマウスLTβR(mLTβR)DNA断片(Force
ら (1996) J. Immunol. 1995. 1 155:5280)から、順方向プライマー5'GACGTCAGA
TCTTCCCACCTTTCCTCCTA 3'(配列番号３)および逆方向プライマー5'GAACAGAGATCTC
ATTGCTCCTGGCTCTG 3'(配列番号４)と共にTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRによ
り構築した。LTαおよびLTαTyr108Pheは、記載されるように組換えバキュロウ
イルスを用いて、昆虫細胞内で産生させた(Croweら (1994) J. Immunol. Method
s 168:79)。組換え可溶性LTα1β2(先に引用したBrowningら (1996))、TNF(Brow
ningおよびRibolini (1989) J. Immunol. 143:1859)、ならびにLTα(BF7)および
LTβ(C37、B9およびB27)に対するモノクローナル抗体(先に引用したBrowningら
(1995))は、Jeffery Browning氏(Biogen, Inc.)から寛大にも贈与された。免疫
沈降抗LTα抗体(クローン9B9)は、Boehringer Mannheimから得た。抗_CD3(OKT3)
は、BALB/cマウスの腹水中で産生させ、１μg/mlタンパク質で使用した。精製さ
れた組換えHSV gD_1タンパク質および変異体は、先に詳細に記載したように、バ
キュロウイルス中で産生させた(Nicolaら (1996) J. Virol. 6:3815)。FITC-抗-
CD4およびCD8抗体は、Becton-Dickensonから得た。
【０１３６】実施例１．Ｔ細胞上でのHVEMリガンドの発現 本実施例は、悪性および正常ヒトＴ細胞の両方が、HVEMに対する細胞表面リガ
ンドを発現することを明示する。HVEMの細胞外ドメイン、およびヒトIgGのFc領
域を含む融合タンパク質(HVEM:Fc)を構築した。実験により、(可溶性の組換えHV
EM:Fcとしての)HVEMが、(新しく単離した)正常ヒトＴ細胞に結合したことを実証
した。
【０１３７】 末梢血液単核細胞を、フィコール-ハイパーク法により、正常なドナーから得
た。これらを、抗CD3抗体で、IL-2を含む培地中で５日間活性化した。上述した
ように、細胞を、PMAまたはPMAおよびイオノマイシンで４時間再度刺激し、次い
でFITC-CD4またはFITC-CD8で二重染色し、抗huIgG-PEでHVEM:Fcを検出した。補
償されたFITC蛍光を使用して、CD4およびCD8Ｔ細胞亜集合を制限(gate)した。
【０１３８】 段階的な濃度のHVEM:Fcまたは対照IgGを、活性化II-23.D7細胞とインキュベー
トすることにより受容体結合を測定した。II-23.D7細胞系は、ヒトCD4＋Ｔ細胞
ハイブリドーマ(Ware (1986) Lymphokine Res. 5:313)であり、10％ウシ胎児血
清(FBS)および抗生物質を含むRPMI1640培地中で維持する。II-23.D7細胞は、ホ
ルボールミリステートアセテート(PMA)(100 ng/ml)、またはPMA(100 ng/ml)およ
びイオノマイシン(１μ/ml)で、４時間37℃にて活性化した。細胞を洗浄し、HVE
M:Fc、LTβR:FcまたはヒトIgGを５μg/mlで含む(10％仔ウシ血清および0.1％NaN3 を補充した)ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中で30分間４℃にてインキュベートし
、その後、フィコエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG(抗huIg-PE)で
染色した。染色細胞を、フローサイトメトリーにより分析した(FACSCaliber, Be
cton-Dickenson)。受容体結合を、蛍光強度＝(平均蛍光チャネル (mean fluores
cent channel))(正の蛍光事象の％)を計算することにより決定した。正の事象は
、正常IgGについての値の98％を上回る蛍光値を有する。比蛍光強度は、対照IgG
の値を差し引きした後の蛍光強度を示す。各ヒストグラムは、104回の事象を示
す。
【０１３９】 これらの実験は、カルシウムイオノフォア、イオノマイシンおよびPMAでの活
性化後に、HVEM:FcがヒトCD4＋Ｔ細胞ハイブリドーマであるII.23.D7(Wareら (1
986)、以下同上)に特異的に結合することを明示したが、PMA単独ではフローサイ
トメトリーにより検出されなかった(図１Ａ)。特異的なHVEM:Fcの結合はまた、
ヒト末梢血液に由来するＴリンパ球上でも検出された(図１Ｂ)。これらの発見は
、悪性ヒトＴ細胞および正常ヒトＴ細胞の両方が、HVEMに対する細胞表面リガン
ドを発現することを示した。II.23.D7細胞へのHVEM:Fcの半値結合は、約20nMに
おいて得られた(図１Ｃ)。II.23.D7細胞系はまた、PMAにより誘導されて、LTα
およびβ、ならびにTNFを発現する(例えば、Ware (1992) J. Immunol. 149:3881
を参照)。
【０１４０】実施例２．HVEMおよびそのリガンドの結合特徴；HVEMはLTαと結合する 本実施例は、可溶性組換えHVEM:Fcを用いて、HVEMの結合特徴を明示する。HVE
MがTNFまたはLTαβ複合体に結合するか否かを決定するために、LTβR:Fcおよび
TNFR:Fcを、活性化II-23.D7細胞へのHVEM:Fcの結合の競合阻害剤として用いた。
これらの実験から、LTαホモ三量体はHVEM:Fc(可溶性HVEM)結合について競合す
るが、TNFまたはLTα1β2は競合しないことが分かった。
【０１４１】LTβR:Fcによる結合の競合 ．(実施例１に記載のPMAおよびイオノマイシン)活性
化II-23.D7細胞を、LTβR:FcまたはTNFR60:Fc(100μg/ml)と30分間４℃にてプレ
インキュベートした。次いで、HVEM:Fc-ウサギ(２μg/ml)を添加し、30分間イン
キュベートし、ヤギ抗ウサギIgG-PEで細胞を染色して、HVEM:Fc-ウサギを検出し
た。ウサギIgGを用いて、バックグラウンド染色を決定した。HVEM:Fcと活性化II
-23.D7細胞との結合を、上述したように、段階的濃度のLTβR:Fc、TNFR60、Fas:
FcまたはIgGと競合させた。
【０１４２】LTαホモ三量体による結合の競合 ．II-23.D7細胞を活性化し、HVEM:Fcを組換えL
TαまたはLTα1β2と30分間４℃にてプレインキュベートした。混合物を、活性
化II-23.D7細胞に添加し、抗huIgG-PEで染色した。HVEM:Fc＋LTαの蛍光染色は
、正常IgGを有するバックグラウンドと等しかった。
【０１４３】 HVEMがTNFまたはLTαβ複合体と結合し得るか否かを決定するために、ウサギI
gG Fcを有するHVEM:Fc構築物を利用し、LTβR:FcおよびTNFR:Fcを、PMAおよびイ
オノマイシンで活性化したII-23.D7細胞へのHVEM:Fc結合の競合阻害剤として使
用した(Montgomery (1996)、前掲)。LTβR:FcおよびHVEM:Fc(ヒトIgG1のFc)は、
HVEM:Fc(ウサギ)の結合と競合したが、TNFR60:Fcは競合しなかった(図２Ａ)。さ
らに、関連受容体融合タンパク質であるFas:FcおよびTNFR80:FcのいずれもHVEM:
Fcの結合に対して競合しなかった。しかし、驚くべきことに、HVEM:Fc結合に対
して、TNFまたはLTα1β2は競合しなかったが、LTαホモ三量体は競合した(図２
Ｂ)。位置108にあるチロシン(Tyr)がフェニルアラニン(Phe)で置換された(Try10
8Phe)LTαのTNFR60結合変異体(Goh (1991) Protein Eng. 4:785)は競合しなかっ
た(図３)。これらの結果は、推定HVEMリガンドが、LTαβヘテロ三量体およびLT
αと共通する特徴を有するが、LTα1β2およびTNFとは異なる特徴を有すること
を示した。従って、LTα2β1上のHVEM結合部位はTNFR60と同じではないという注
意のもと、LTα2β1はHVEM:Fcにより認識される推定表面リガンドであり得る。
あるいはまた、HVEM:Fcは、新規のリガンドを認識するかもしれない。生化学的
アプローチを使用して、これらの可能性を見極めた。
【０１４４】実施例３．HVEMリガンド(LIGHT)の生化学的特徴 本実施例は、可溶性組換えHVEM:Fcを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーによるLIGHT(p30)の精製を明示する。二次元(2D)電気泳動によるHVEM:Fcに結
合するタンパク質の分析は、p30ポリペプチドが広いバンド(pI 7〜8.5)として移
動すること、および低い強度ではp30は３つのバンドに分離することを示した。
【０１４５】SDS-PAGE分析 ．II-23.D7細胞を、PMA、またはPMAおよびイオノマイシンで2.5時
間活性化し(実施例１に記載のように)；リン酸緩衝食塩水(PBS)で２度、システ
イン-メチオニン欠損RPMIで１度洗浄し；その後、10％透析FBS、それぞれ250μC
iの35S-メチオニンおよび35S-システイン、ならびに活性化剤を含むその培地に1
.5時間再懸濁した。培養上清を回収し、細胞を、２％ NP40、HEPES pH 7.0、20
mM EDTA、150 mM NaClを含む緩衝液中に、ロイペプチンおよびアプロチニン(10
μg/ml)、PMSF(1 mM)、ならびにヨードアセトアミド(20 mM)と共に溶解した。抽
出物を、ヒトIgG(10μg)、および表示してある場合には抗LT抗体およびプロテイ
ンＧビーズで予め不要物を取り除いた(preclear)。次いで、受容体:Fc融合タン
パク質(10μg/ml)をサンプルに添加し、プロテインＧビーズと共に沈降させた。
標識化タンパク質を、還元SDS-PAGEおよびホスホイメージ(phosphoimage)(ピク
セル範囲6〜200)により分析した。
【０１４６】 上記段落に記載したように調製した細胞抽出物を、まず、10μgのマウスIgG、
またはLTαもしくはLTβに対するモノクローナル抗体で予め不要物を取り除き、
次いでHVEM:Fcを添加してリガンドを沈降させた。次いで、HVEM:Fcに結合したタ
ンパク質を、還元SDS-PAGEにより分画し、ホスホイメージで検出した。
【０１４７】HVEMリガンドであるp30の精製 ．II-23.D7細胞を、PMA(100 ng/ml)、またはPMAお
よびイオノマイシン(１μg/ml)で2.5時間活性化し、その後、上の２段落で説明
したように、35S-メチオニンおよび35S-システインで標識化した。細胞抽出物を
、ヒトIgG(５μg)およびプロテインＧビーズで予め不要物を取り除き、非特異的
結合タンパク質を除去した。次いで、TNFR60:FcおよびプロテインＧビーズで抽
出物を処理することにより抽出物からLTαを欠乏させた。次いで、抽出物にHVEM
:FcおよびプロテインＧビーズを添加し、インキュベートした。それぞれの場合
において、ビーズを３回洗浄して、非結合画分中の混入タンパク質を除去した。
ビーズを、８Ｍ尿素を含む緩衝液に溶出し、第１の次元では等電点電気泳動によ
り(５〜７のpIのアンホライン混合物で勾配を形成(50%0、3〜10(40％)、2〜11(1
0％)))、第２の次元では還元SDS-PAGE(15％ゲル)により分析した。
【０１４８】 HVEM:Fcによるp30の精製を、LTβR:FcまたはTNFR60:Fcにより精製したサンプ
ルと比較することによりモニターした。PMAで刺激したII-23.D7細胞から単離し
たLTβR:Fc精製タンパク質、LTα1β2を図４Ａに示し、抽出物からLTαを欠乏さ
せるために使用したTNFR60:Fcに結合したタンパク質を図４Ｂに示す。上述した
ようにHVEM:Fcにより精製したp30を図４Ｃに示す。各ゲルの第１のレーンには14 C標識化分子量マーカーを示し、第２のレーンには、第２の次元でのみ流される
受容体:Fc結合タンパク質を示す。
【０１４９】 LTαは、PMAでの活性化後にII23.D7細胞により分泌される(Wareら (1992)、上
で引用；Croweら (1994) Science 264:707)。HVEM:FcおよびTNFR:Fcは、PMAおよ
びイオノマイシンで刺激されたII-23.D7細胞からの分泌LTαを沈降させたことが
SDS-PAGEで示された。LTαは、グリコシル化における不均一性により様々な分子
量として移動する(Browningら (1991)、上で引用)。TNFR60:Fcも、TNFを沈降さ
せたが(17 kDa)HVEM:Fcは沈降させなかったことから、上述した競合調査の結果
を確認した。LTβR:Fcは、予想した通り、どの分泌タンパク質とも結合しなかっ
たが、PMA活性化II-23.D7細胞の界面活性剤抽出物から、LTβ(33 kDa)およびLT
α(23〜25 kDa)複合体を沈降させた。しかし、刺激物質がイオノマイシンおよび
PMAを含んだ場合、LTβR:Fcは、30 kDaにおいて主要なバンド、ならびに33 kDa
において少量のLTβ、および23〜25 kDaにおいて少量のLTαを沈降させた。TNFR
60:Fcは、LTα前駆体と大きさが同じである23 kDaタンパク質を沈降させた。対
照的に、HVEM:Fcは、30 kDaおよび23 kDaタンパク質の両方を沈降させた。LTβ
に対する３つの異なる受容体遮断モノクローナル抗体は、HVEM:Fcの添加前には
、抽出物から30 kDaタンパク質を除去できず、p30タンパク質がLTβとは抗原的
に無関係であることを示した。しかし、抗LTα抗体は、抽出物から23 kDaのバン
ドを除去し、そのLTαとの関連性を示した。LTα抗体が、30 kDaおよび23 kDaの
バンドの両方を予め取り除くことができないことは、ヘテロ三量体を形成するLT
αおよびLTβとは異なり、これらのタンパク質が互いと会合しないことを明示す
る(Androlewiczら、上で引用)。
【０１５０】 アフィニティークロマトグラフィーにより、LIGHT(p30)をII-23.D7細胞から精
製した。連続したTNFR60:FcおよびHVEM:Fcステップを使用して、TNFR60によりLT
αが抽出物から除去されて、HVEM:Fcに結合するp30を妨害しないようにした。
【０１５１】 HVEM:Fc、TNFR60:FcまたはマウスLTβR:Fcと結合するタンパク質の二次元(2D)
電気泳動は、p30が、LTαおよびLTβと比較して、異なる電荷対質量比を有する
ことを明らかにした。LTβR:Fcにより沈降したLTα1β2複合体中のLTβは、酸性
であり、5〜6.5のpIの範囲にある４つの異なる電荷異性体を有し、酸性形態の質
量の検出可能な増加を示した(図４Ａ)。LTβとの複合体としてのLTαまたはTNFR
60と結合したLTαホモ三量体としてのLTαは、 (図４Ｂ)、pIが7〜8.5の範囲に
ある７つの異なる異性体を有し；23 kDa前駆体は最も塩基性(９以上)のpIを有す
る。シグナル配列無しのLTαのpIは8.9である。これらの結果は、グリコシル化
付加物の特徴であり、既に公開されているLTαおよびLTβに関する調査(Brownin
gら (1991)、上で引用)と完全に合致する。対照的に、p30は、幅広いバンド(pI
7〜8.5)として移動し、低い強度の下では３つのバンドに分離する(図４Ｃ)。p30
の質量に識別できる変化がない電荷不均一性は、おそらく、リン酸またはリン脂
質の添加などの翻訳後修飾の結果によるものである。
【０１５２】 これらの結果は、HVEMが、p30またはHVEMリガンド(またはLIGHT)と称するpIが
7〜8.5の異性体を有する30 kDaの(ヒトCD4＋Ｔ細胞ハイブリドーマII.23.D7から
単離された)新規の細胞表面タンパク質と結合することを明確に実証する。p30は
、LTβとは抗原的および物理的に異なる。HVEMリガンドは、LTβR:Fcによっても
認識されるが、TNFRには認識されない。
【０１５３】実施例４．HSV gDエンベロープ糖タンパク質は、HVEM:Fcへの結合について、内
因性HVEMリガンド(p30)と競合する 本実施例は、HVEMへのヘルペスウイルスHSV gD-1タンパク質の結合、および可
溶性gD-1がHVEMへの結合についてHVEMリガンドすなわちp30(LIGHT)と競合するこ
とを実証する。HSV gD-1タンパク質が、HVEMに結合するp30(LIGHT)のアンタゴニ
ストであることを示すデータもまた、p30が、HVEMに対するヘルペスウイルスgD-
1タンパク質のアンタゴニストとして作用できることを実証する。
【０１５４】 HVEM:Fc(２μg/ml)を、gD-1(250μg/ml)またはgD-1(Δ290〜299)(100μg/ml)
と共に30分間４℃にてプレインキュベートし、(実施例１と同様に)PMAおよびイ
オノマイシンで活性化したII-23.D7細胞に添加した。バックグラウンド染色を、
huIgGで決定し、これはHVEM:Fc＋gD-1(Δ290〜299)と等しかった。活性化II-23.
D7細胞へのHVEM:Fcの結合を、段階的濃度のgD-1またはgD-1(Δ290〜299)と競合
させた(プロトコールについては実施例１を参照)。
【０１５５】 HSV gDが、HVEMに結合するHVEM-リガンド(細胞リガンド、例えばp30)のアンタ
ゴニストとして機能し得るという可能性が、HSV gD-1タンパク質がHVEMに結合し
たことにより示唆された。可溶性gD-1、およびHVEMに対して増強された結合力を
有するgDの変異体であるgD-1(Δ290〜299t)は両方とも、HVEMが活性化II-23.D7
細胞の表面に結合するのを遮断するのに有効であった(図５Ａ)(p30を発現)。gD-
1タンパク質の有効阻害濃度は、HVEMに対する親和性と相関した(図５Ｂ)。PMAま
たはPMA/イオノマイシン活性化II-23.D7細胞へのLTβR:FcまたはTNFR60:Fcの結
合は、gD-1(Δ290〜299t)により阻害されず、HVEM:gD-1相互作用が高度に特異的
であることを示した。この結果は、TNFR60およびLTβRに認識されるリガンドにH
VEMが結合するにも関わらず、HVEMへ特異的に結合するようにgD-1が同時進化し
たことを示唆する。これらの結果は、gD-1が膜貫入型ビロカインであり、HSVが
感染細胞に侵入またはそこから出る間、HVEMシグナリング活性をモジュレートし
得ることを示す。
【０１５６】実施例５．細胞表面HVEMの架橋はリンパ球活性化をもたらす 本実施例は、抗HVEM抗体が、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む末梢血液リンパ球細胞
(PBL)の増強された増殖を促進することを明示する。抗HVEM抗体が、(HVEMリガン
ド、p30すなわちLIGHTをも発現する)PBLの増殖を促進できることを示すデータは
また、細胞会合p30(LIGHT)が、PBLの増殖誘導シグナルとして機能できることを
明示する。さらに、低血清培地中で培養されたＢ細胞系に添加した抗HVEM抗体が
、用量依存的に成長を刺激するという知見もまた、HVEMシグナリング(例えば、H
VEMに結合したLIGHT)がＢ細胞増殖を刺激できることを明示した。
【０１５７】Ｔ細胞活性化 ．新しく単離した末梢血液リンパ球を、ウサギ抗HVEMまたは前免疫
血清の勾配希釈液(Montgomery (1996)、前掲)、および分裂を促進する用量には
及ばない用量(１μg/ml)のPMAを含む培地中でインキュベートした。３日後に、
増殖を、βシンチレーション計数により評価されるDNAへの3H-チミジンの取り込
みによって測定した。
【０１５８】 新しく単離した末梢血液リンパ球を、５μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)
で活性化し、IL-2を含む培地中で培養した。17日後、分裂を促進する濃度には及
ばない濃度(1.5μg/ml)の抗HVEM抗血清および抗CD3(OKT3)抗体の勾配希釈液で細
胞を再度刺激した。３日後に、増殖を上述したように測定した。
【０１５９】Ｂ細胞フローサイトメトリー分析 ．ヒトリンパ芽球腫RAJI細胞を、抗HVEM抗血清
(1:100希釈)または対照ウサギIgGとの４℃でのインキュベーション、およびフィ
コエリトリンとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgGでの染色によるフローサイ
トメトリー分析に供した。各ヒストグラムについて、104細胞を分析した。
【０１６０】Ｂ細胞活性化 ．RAJIを、２％FBSを含む培地に24時間移し、その後表示したウサ
ギ抗HVEM抗体の希釈液または培地のみの存在下で３日間インキュベートした。細
胞増殖を上述のように評価した。
【０１６１】 HVEMは休止CD4＋Ｔ細胞上で発現され、免疫応答の初期における細胞増殖のた
めの同時刺激分子として機能できることが示唆された。PMAが最適濃度には及ば
ない濃度のとき、抗HVEM抗体は、培養して３日後に測定される3H-チミジン摂取
の増加により示される末梢血液リンパ球の増殖の増強を促進した(図６Ａ)。PMA
での活性化後に続けて行う10〜17日間の培養により生成される記憶リンパ球も、
抗CD3抗体が最適濃度に及ばない濃度のときに、抗HVEM抗体により再度活性化さ
れた(図６Ｂ)。この結果は、HVEMが、免疫応答の作動相(effector phase)におい
て機能することを示した。抗体はTNF関連リガンドの作用を模倣できるため(Enge
lmann (1990) J. Biol. Chem. 265:14497)、これらの結果は、細胞会合型30 kDa
HVEMリガンドがＴ細胞の増殖誘導シグナルとして機能し得ることを示す。
【０１６２】 LTαは、エプスタイン-バーウイルスで形質転換された細胞系を含むＢリンパ
球に対する増殖増強活性を刺激することが既に示されている(Abken (1992) J. I
mmunol. 149:2785；Estrov (1993) J. Exp. Med. 177:76；Kehrl (1987) Scienc
e 238:1144；Gibbons (1994) Eur. J. Immunol. 24:1879)。HVEMはまた、Ｂリン
パ芽球腫系統上でも発現される(図７Ａ)。抗HVEM抗体は、２％血清を含む培地中
のRAJI Ｂ細胞系に添加された場合、用量依存的に3H-チミジンの摂取を刺激し、
血清が低いときのＢ細胞生存度の維持をHVEMがシグナリングできることを示した
(図７Ｂ)。LTαは、このアッセイにおいて２〜３倍の刺激効果を示した。負の成
長因子としてのTNFR60およびTNFR80の存在は、LTαに対する低い応答の一因であ
り得る。抗HVEM抗体の正の効果は、p30(HVEMリガンド、LIGHT)独特の性質であり
得る。
【０１６３】実施例６．マウスHVEM:Fcの産生 本実施例は、マウスHVEM:Fc組換え構築物の構築について実証する。
【０１６４】 マウスHVEMの細胞外領域を、Met1から始まりSer205で終わるmHVEM cDNA(Hsuら
, 1997)からPCRにより増殖した(順方向プライマー＝5'-tatGGATTCatggaacctctcc
caggat-3'および逆方向プライマー＝5'-tatGGATTCggaggagcaggt ggtgtctgt-3'；
両方のプライマーともBamHI部位を含む)。Wizard PCR Preps (Promega)により55
0 bp PCR産物を精製し、BamHIで消化し、BgIII切断バキュロウイルスベクターpV
L1392(Pharmingen)にインフレームでライゲートして、ヒトIgC1のFc領域をHVEM
インサートの3'側末端に含む(pVL1392-mHVEM:Fc)ようにした。ライゲーション反
応混合物を使用して、XL-1 blueコンピテント細胞(Stratagene)を形質転換して
、プラスミドを調製した。
【０１６５】 TN5昆虫細胞(1.25×106)を、4 mL Excell 401培地(JRH Biosciences)に入れ
てT25フラスコ上にプレート化し、２時間付着させた。TN5細胞を、14μg Lipofe
ctin（商標）(Gibco BRL)を用いて、１μg pVL1392-HVEMFcプラスミドおよび250
ng Baculogold（商標）DNA(Pharmingen)で同時トランスフェクトした。翌日、
培地を交換し、４日後にウイルスを含む上清を回収した。ウイルスを増幅させて
、タンパク質産生のためのストックを作製した。
【０１６６】 記載されるように、マウスHVEM:FcをTN5昆虫細胞中で産生させ、均質になるま
で精製した(Croweら, 1994)。簡単にいうと、TN5細胞を、10のMOIでmHVEM:Fcを
含む組換えバキュロウイルスに感染させた。３日後、上清を回収し、細胞および
屑片を濾過し、プロテアーゼ阻害剤で処理した。酸性溶出(pH 2.5)でのプロテイ
ンＡアフィニティークロマトグラフィーにより、精製mHVEM:Fcタンパク質を得た
。SDS-PAGEによるmHVEM:Fcの分析は、還元条件下で58 kDaにおいてタンパク質の
単一のバンドを示した(図８を参照)。調製物は、リムルス細胞分解産物テストに
より検出可能なエンドトキシンを含まないと判断した。
【０１６７】実施例７．マウスにおける炎症(遅延型過敏症)に対するマウスHVEM:Fcの阻害効
果 本実施例は、当該分野で認められている動物モデルを使用して、本発明の可溶
性組換えHVEM:Fc融合タンパク質が炎症に対してin vivoで阻害効果を有すること
を実証する。
【０１６８】 ８週齢のメスBDF1マウス(Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan)(N=8)を、皮下注
射により、1 mgミョウバンに吸着した50μg OVAで免疫化した。７日後、mHVEM:F
cまたは対照IgGを、腹腔内注射により投与し、50μgのミョウバン吸着10μg OVA
によりマウスの足蹠に免疫誘発を行った。抗原免疫誘発の直前および24時間後に
右の足蹠の厚さを測定し、膨張した足蹠の厚さ(増加％)を計算した。300μgのmH
VEM:Fcの抑制は、図９にまとめたデータに示すように統計的に有意であった(P＜
0.05)。
【０１６９】実施例８．マウスのコラーゲン誘導型関節炎に対するマウスHVEM:Fcの阻害効果 本実施例は、当該分野で認められている関節炎用動物モデルを用いて、本発明
のHVEM:Fc融合タンパク質が炎症に対してin vivoで阻害効果を有することを実証
する。
【０１７０】 ６週齢DBA/1マウス(Seatec Yoshitomi, Hukuoka, Japan)(N=10)を、不完全フ
ロイントアジュバント中の100μgのウシII型コラーゲンおよび100 mgの結核菌(H
37Ra)のエマルジョンで、尾部の根元への皮下注射により免疫化し、28日後に同
じエマルジョンで追加免疫化した。60μgのmHVEM:Fcまたは対照IgGを、免疫化の
二日目から開始して週に２度腹腔内投与した。それぞれの足(paw)についての臨
床的スコアを、以下の段階的尺度を参照して評価した：すなわち、０＝正常、１
＝１つの足先の膨張および/または紅斑、２＝２以上の足先の膨張および/または
紅斑、３＝足全体の膨張および/または紅斑、４＝足全体の完全な膨張および/ま
たは紅斑、ならびに足根関節を曲げることができない。CIAスコアは、全ての足
について最大16の累積値として表した(図10)。図10に示すデータは、HVEM:Fcが
、足蹠および足根関節の炎症に対して有意な効果を有することを示す。
【０１７１】実施例９．可溶性ホモ三量体LIGHTによるヘルペスウイルス感染の阻害 本実施例は、本発明の可溶性ホモ三量体LIGHTポリペプチドが、細胞へのヘル
ペスウイルスの侵入をin vivoで遮断できることを実証する。LIGHTの抗ウイルス
活性が、LTβRへの結合によるものであり、HVEMへの結合によるものではないこ
とも実証する。本実施例はまた、LIGHTおよびLTαの両方が、用量依存的に細胞
のウイルス感染を予防できることも実証する(図12)。
【０１７２】 ヘルペスウイルスは、TNFスーパーファミリーのサイトカイン系を特異的に標
的化するという遺伝子的メカニズムを有し、免疫系がヘルペスウイルスの再活性
化または宿主における拡散を抑制すべく特異的な対抗手段を進化させてきたこと
を示唆する。
【０１７３】 LIGHTを、他のサイトカインと共にテストして、サイトメガロウイルス(CMV)感
染を阻害する能力について確認した。LIGHTの抗ウイルスおよび生物学的性質を
調査するために、細胞質テイルおよび膜貫通ドメインを欠失させる遺伝子操作に
より可溶性形態を作製した。以下の実施例12に詳細に記載するように、Ｎ末端66
アミノ酸を欠くLIGHTの組換えによる可溶性形態を作製し、「LIGHTt66」と名づけ
た。組換えにより作製した可溶性LIGHTt66およびその変異体は、専らホモ三量体
(野生型LIGHTはホモ三量体として発現される)として分泌された。
【０１７４】 正常ヒト皮膚繊維芽細胞を、ヒトCMV(HCMV)Fiala(HCMV-F)またはHCMVの実験用
株AD169の臨床的単離体で、0.05の低い感染多重度(MOI)で感染させた。TNFR1(Lt
α)またはLTβR(LTα1β2、LIGHT)のいずれかを介してシグナリングするサイト
カインを、培養上清に添加し、７日間インキュベートした。
【０１７５】 LTαの添加により、ウイルスの細胞変性効果(CPE)が完全に遮断された。この
阻害は特異的であった。なぜなら、可溶性Ｉ型TNFRタンパク質(TNFR:Fc)が抗ウ
イルス効果を中和したからである(図11Ａおよび11Ｂ)。さらに、TNFRと結合でき
なくなるが、コンホメーションは完全なまま保持するLTα(Y108F)の点突然変異
体は、HCMV拡散を遮断することができなかった(図11Ｃ)。
【０１７６】 LTα1β2およびLIGHT(両方ともLTβRと結合する)もまた、ウイルスのCPEを遮
断できた(図11Ｄ、11Ｅ)。LTβRと結合できないが、HVEMへの結合は保持するLIG
HTの点突然変異体(G119E)は、HCMV拡散を阻害することはできなかった(図11Ｆ)
。これは、LIGHTの抗ウイルス活性が、おそらくLTβRへの結合を介するものであ
って、HVEMへの結合を介するものではないことを示す。
【０１７７】 LTα、LTα1β2およびLIGHTの抗HCMV活性の定量分析は、主要最初期タンパク
質(IE1)および後期外皮タンパク質pp28の両方の発現をウェスタンブロットによ
り測定することにより行った。LTαおよびLIGHTは、同様の相対的抗ウイルス活
性を示し、100 pMの濃度でHCMVの細胞変性効果を完全に阻害できた。一方、LTα
β2は、効果が約10分の1であった。リンホトキシン受容体(LTβR)に特異的なモ
ノクローナル抗体もまた、HCMV拡散の強力な阻害剤であった。
【０１７８】 さらに、マウスγヘルペスウイルスを用いた調査では、プラーク形成ユニット
の減少が示された(図12)。12ウェルマイクロプレートに入ったフクロウザル腎臓
細胞を、１ウェルにつき500プラーク形成ユニット(PFU)で60分間37℃にて感染さ
せ、表示する濃度のLIGHTまたはLTαと共にまたはそれら無しに、仔ウシ血清(FB
S)を含む培地中でカルボキシメチルセルロース(0.75％)で覆った。７日後、細胞
をメタノールで固定し、ギムザ染色した。図12中の各データポイントは、２つの
ウェル中のプラークの平均数である。データは、LIGHTおよびLTαの両方が、用
量依存的に感染細胞の数を有意に減少させることができることを明確に明示して
いる。
【０１７９】 マウスMHV-68は、ヒトγヘルペスウイルスEBVおよびHHV-8に類似している。EB
Vは、EBV関連リンパ種および鼻咽頭癌を含む特定のヒト癌における腫瘍形成因子
であることが示されている。HHVEは、AIDSに伴うカポジ肉腫に関係付けられてい
る。
【０１８０】実施例１０．可溶性ホモ三量体LIGHTの生物学的活性 本実施例は、本発明の組換え体である可溶性ホモ三量体LIGHTポリペプチドが
、腺癌HT29細胞系のアポトーシス、および繊維芽細胞上でのICAM-1の誘導を含む
いくつかの細胞性応答アッセイにおいて活性であることを実証する。上記実施例
９で議論したように、LIGHTの生物学的特性を調査するために、可溶性形態、す
なわち組換えにより産生される可溶性LIGHTt66(実施例12に詳細に記載)を作製し
た。この可溶性ポリペプチドは、野生型p30の細胞質テイルおよび膜貫通ドメイ
ンを欠くが、ホモ三量体である野生型三次構造は保持する。
【０１８１】 HT29細胞および293細胞系は、ATCCから得た；HT29細胞はヒト腺癌、ATCC番号H
TB-38に由来した(例えば、Chen (1987) Cancer Genet. Cytogenet. 27:125-134
を参照)。両方の細胞系を、グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンと
共に10％FBSを含むDMEM中で培養した。
【０１８２】 293細胞は、ヒト可溶性LIGHTポリペプチドをコードするcDNAで安定してトラン
スフェクトした(実施例12を参照)。高発現可溶性ポリペプチドを有するクローン
を、大規模培養のために選択した。293-LIGHT細胞からの使用済み培地(spent me
dium)を回収して、イオン交換およびアフィニティークロマトグラフィーの組合
せにより精製した。LIGHTを、10〜15 mg/リットルの収率およびエンドトキシン
が0.1エンドトキシンユニット/mg未満のレベルで、均質になるまで精製した(図1
3を参照)。
【０１８３】 精製LIGHTタンパク質の活性を、LTβRまたはHVEMの可溶性形態をプレートに結
合した状態で利用する特異的なELISAアッセイにより測定した。組換えである可
溶性LIGHT(ホモ三量体LIGHTt66)は、マウスHVEMおよびLTβRの両方に、相同的な
ヒト型に結合するのと同じように効率的に結合する。
【０１８４】 LIGHTは、HT29細胞のアポトーシス、および繊維芽細胞上でのICAM-1の誘導(IC
AMは炎症の細胞付着マーカーである)を含むいくつかの細胞性応答アッセイにお
いて活性である。LIGHTは、HT29細胞死を誘導するのはLTα1β2と同じぐらい効
率的であるが、TNFまたはLTαがICAM-1発現を誘導する能力と比べて弱い。後者
の結果は、LIGHTが炎症誘発性でないかもしれないことを示唆する。In vivoでは
、LIGHTは、炎症誘発性または毒性であるとは思われない。なぜなら、精製LIGHT
を注射されたマウスは(テストされた最大用量はマウス１匹につき200μg)、TNF
またはLTαをこの用量で投与した際に見とめられるショック症状を示さなかった
からである。
【０１８５】実施例１１．LIGHT仲介型抗ウイルス効果のために、NF-κBは必要であるが、TRA Fは必要ではない 本実施例は、可溶性ホモ三量体LIGHTおよびリンホトキシン(LT)の抗ウイルス
活性が、NF-κB活性を必要とする(NF-κB活性を欠く細胞はLIGHTの効果に不応で
あった)ことを実証する(図14を参照)。従って、本実施例は、NF-κB活性依存性
アポトーシス経路の活性化が、LIGHTの抗CMV活性に関与することを実証する。
【０１８６】 LTα、LTα1β2またはLIGHTで処理した正常ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)におい
て、細胞死は見とめられなかった。これは、これらのサイトカインの抗ウイルス
活性が、TNFRにより誘発され得るアポトーシス死経路と無関係であり得ることを
明示する。これは、NFκB依存的メカニズムが作用し得ることを示唆した。なぜ
ならこれは、同受容体により活性化される他方の主要な経路であるからである。
NFκBはまた、繊維芽細胞中のいくつかの抗アポトーシスタンパク質の転写も制
御して、アポトーシス経路に反作用する。
【０１８７】 この仮説を検証するため、NF-κBαサブユニット(IκBαM)の阻害剤の優性ネ
ガティブ変異体を、レトロウイルスベクターを用いた形質導入によりNHDFに導入
した。この変異体は、リン酸化できないため、NFκBとの安定した複合体のまま
である。これは、κB依存性遺伝子の転写を抑制する。TNFおよびLTαの両方は、
NHDF-IκBαMにおけるICAM-1発現を誘導できず、IκBαM優性ネガティブ変異体
の(NFκBを阻害する)効率が実証された。
【０１８８】 NHDF-IκBαM細胞を、ベクター単独で形質導入した細胞(NHDF-LXSN)、またはH
CMV複製を阻害する様々なサイトカインの能力と比較した。NHDF-IκBαM細胞が
、リンホトキシンおよびLIGHTの効果に不応であることが分かった(図14)。NHDF-
LXSN細胞と比べて、有意に高いレベルのIE1およびpp28が、NHDF-IκBαM中所与
の濃度のサイトカインについて見とめられた。
【０１８９】 さらに、サイトカインの存在下で、NHDF-IκBαM細胞から、10倍増加した感染
HCMVが生成された。興味深いことに、IE1およびpp28発現およびウイルス力価に
よりアッセイしたところ、サイトカインの不在下ではHCMVは、NHDF-IκBαMにお
いてNHDF-LXSN細胞と同程度に複製した。この結果は、IEプロモーターが複数のN
F-κB応答エレメントを含むにも関わらず、NF-κBが繊維芽細胞における効率的
なウイルス複製のために必須でないことを示す。
【０１９０】 TRAF3は、LTβRに直接動員されてシグナリングアポトーシスに関与するが、NF
κBの活性化には関与しない。これは、TRAF3の優性ネガティブ変異体により実証
された。IκBαMと同様に、レトロウイルス形質導入によりNHDF細胞に導入され
たTRAF3優性ネガティブ変異体(TRAF3Δ7およびTRAF3Δ11)は、LIGHTおよびリン
ホトキシンの抗ウイルス活性に反応し易いままであった。これは、NFκB活性依
存的アポトーシス経路の活性化が、可溶性LIGHTの抗ウイルス(抗CMV)活性に関与
しないことを示す。
【０１９１】実施例１２．可溶性(ホモ三量体)LIGHTt66およびLIGHTt66点突然変異体の生成お よび特徴決定 本実施例は、以下で明示されるようにホモ三量体として分泌される、単一残基
変化(すなわち、点変異体)を含む可溶性組換えLIGHTポリペプチド(実施例９〜11
、13および14で使用)の構築および単離を実証する。
【０１９２】 Ｎ末端66アミノ酸を欠くLIGHTの可溶性組換え形態を作製した(LIGHTt66と命名
)。切断型可溶性LIGHTを、抗FLAG抗体(Sigma, St. Louis, MO)でのイムノアフィ
ニティー精製のための「FLAG」タグを含むようにさらに操作した。切断型FLAG標識
化構築物をLIGHTt66-FLAGと命名した。
【０１９３】 HT29および293細胞を、American Type Culture Collection(ATCC, Rockville,
MD)から得て、グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンと共に10％仔
ウシ血清を含むDMEM中で培養した。新生児正常ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF細胞)は
、Clonetics, San Diego, CAから購入し、10％仔ウシ血清、インスリン(5 pg/ml
)および繊維芽細胞増殖因子(1 pg/ml)(Sigma, St Louis, MO)を補充したDMEM中
で増殖させた。
【０１９４】 LIGHTt66-FLAGを、安定にトランスフェクトした哺乳動物(293)細胞中で産生さ
せた。安定にトランスフェクトした293細胞を、回転瓶培養法により0.5％FBSを
含有するDMEM中で増殖させた。LIGHTt66の濃度は、７日間の培養で10 mg/lに達
した。イオン交換の手順により、７日目の上清からLIGHTt66を部分的に精製した
。開始NaCl濃度が50 mMになるように20 mM Tris(pH 7.0)により１：２希釈した
上清を、SP Hitrap（商標）カラム(Pharmacia)上に充填した。洗浄後、20 mM Tr
is/500 mM NaCl(pH 7.0)を用いて、LIGHTt66pを溶出した。PBSへの透析後、Affi
gel（商標）(Biorad)に連結したモノクローナル抗FLAG(M2)のカラム上でのアフ
ィニティークロマトグラフィーによりLIGHTt66をさらに精製した。LIGHTt66を、
20 mMグリシン、150 mM NaCl(pH 3.0)を用いてカラムから溶出し、50 mM Tris(p
H 7.4)に回収してすぐに中和した。
【０１９５】 Ｎ末端FLAGエピトープを付加したLIGHTの可溶性形態(LIGHTt66)を、安定にト
ランスフェクトした293細胞中で産生させ、イオン交換クロマトグラフィー、お
よびその後のモノクローナル抗FLAG(M2)の親和性マトリックス上でのイムノアフ
ィニティー精製により均質になるまで精製した。タンパク質の最終的な収率は80
％、純度は＞95％であった(図15Ａ)。
【０１９６】 プライマー導入配列改変を使用して、以下の単一アミノ酸残基置換すなわち、
G119E、L120Q、Q11TTおよびY173Fを有する可溶性LIGHTを生成した。簡単に言う
と、内部プライマーを設計して、突然変異位置に制限部位を導入した。突然変異
を含む順方向および逆方向プライマーを分離PCR反応に用いて、可溶性LIGHTの２
つの領域を増幅した。プライマーは以下の通りであった： Q117T： 5' ACGCTGGGCCTGGCCTXCTGA 3' 5' ACTCTCCCATAACAGCGGCC 3' G119E： 5' GAGCTGGCC ITGCTGAGGGGCCT 3" 5' CAGCTGAGTCTCCCATAACA 3' L120Q： 5' CAGGCC ITCCTGAGGGGCCTCA 3 5' GCCCAGCTGAGTCTCCCATAA 3' Y173F： 5' TTCCCCGAGGAGCTGGAGCT 3 5' GCGGGGTGTGCGCTTGTAGA 3'。
【０１９７】 PCR産物をプライマー導入制限酵素部位にてライゲートして、アミノ酸t66から
開始され、かつ４アミノ酸置換のうちの１つを含む可溶性LIGHTを作製した。LIG
HTt66変異体を、FLAGエピトープに融合したV-camシグナル配列を含むFLAGタグ付
けカセットであるpBABE-FLAG中にライゲートした。V-cam FLAG-LIGHT変異体イン
サートを、pCDNA3.1(+)(Invitrogen)にクローニングした。全ての変異体を、明
確に確認するために配列決定した(ABI310自動シーケンサー)。タンパク質産生の
ために、293T細胞(1.5×106細胞/10cm皿)を、5 pg DNAでトランスフェクトした
。可溶性タンパク質を含む培地を、培養24時間後に回収した。
【０１９８】 LIGHTt66-FLAG変異体を、Affigel（商標）(ゲル１mlにつき5 mgの抗体)に連結
したモノクローナル抗FLAG抗体(M2)の親和性マトリックスを用いた１段階イムノ
アフィニティー手順で24時間培養後の上清から精製した。培養物の上清(50〜100
ml)を、0.5 mlの親和性マトリックスに通した。ゲルを10容量PBSで洗浄し、0.5
mlアリコートの10 mMグリシン/HCI(pH 3.0)で結合タンパク質を溶出させ、50 m
M TRIS(pH 7.4)に回収してすぐに中和した。タンパク質含有画分をPBSに対して
透析した。
【０１９９】 FLAGをタグ付けしたLIGHTt66-Y173F、G119E、L120QおよびQ117Tの４つの単一
アミノ酸変化変異体を、本明細書に記載するように、一過的にトランスフェクト
した293T細胞中で産生させた。Y173Fは、LTαのY108F変異体の類似体であり、D-
Eループに存在する。LTY 108Fホモ三量体は受容体に結合できなかった。Ql17T、
G119EおよびL120Qは、LTβとLIGHTとの間で保存されるA-Aループにおける３つの
隣接する突然変異であり、この分子モデルによる予想(predicts)は受容体結合に
関与する。
【０２００】 タンパク質を、Affigelに連結したモノクローナル抗FLAG(M2)抗体を用いた１
段階手順で、培養物の上清からイムノアフィニティー精製した(図15Ｂ)。全ての
タンパク質についての純度は95%を超えていた。
【０２０１】 次に、点変異体が三量体化されたことを確認した。架橋およびFPLCゲル濾過に
よる分析、その後の画分のELISAおよびドットブロッティングにより、LIGHTt66
およびその変異体が、検出可能な混入した単量体物質または凝集物質を伴わずに
専らホモ三量体として分泌されることが実証された(図15ＣおよびＤ)。
【０２０２】 ELISAを用いて、(点突然変異を含む)組換えLIGHTt66ポリペプチドを測定した
。捕捉分子、マウスHVEM:Fc、ヒトHVEM:Fc、マウスLTβR:FcまたはヒトLTβR:Fc
を、マイクロタイタープレートのウェル中に16時間４℃にて固定化した(50μl 2
0 mM Tris/150 mM NaCl (pH 9.6)中150 ng/ウェル)。PBS/0.5%Tweenでの洗浄後
、サンプルをPBS/3%BSA中に希釈して適用し、１時間室温にてインキュベートし
た。洗浄後、ウェルをモノクローナル抗FLAG(M2)(PBS/BSA中10μg/ml)と１時間
室温にてインキュベートした後、洗浄し、ヤギ抗マウスHTP(1:5000)と１時間室
温にてインキュベートした。最終洗浄の後、2,2'-アジノ(AZINO)-ビス(3-エチレ
ンビズ(ETHYLBENZ)-チアゾリン-6-スルホン酸)(Sigma)で発色させた。SpectraMa
xプレートリーダー(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)で、415 nmにてO
Dを測定した。
【０２０３】 部分的に精製したLIGHTを、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)
エチル]スルホン(BSOCOES)(Pierce Chemical Co, Rockford, IL)を最終濃度0.1
および1 mMで添加することにより、またはグルタルアルデヒド(0.1％および1％)
を、30分間４℃にて回転しながら添加することにより、架橋させた。TRIS(20 mM
(pH 8.0))を添加して反応をとめた。架橋および対照サンプルを、モノクローナ
ルM2(抗FLAG)抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。
【０２０４】 天然型LIGHTt66の分子量を決定するために、FPLC500システムを用いたSuperos
e12（商標）カラム上でのゲル濾過により(両方ともPharmacia, Piscataway, NJ
から入手)、精製タンパク質を分析した。流速は、0.5 ml/分で、0.5 ml画分を回
収し、PBSを移動相とした。溶出画分中のLIGHTをELISAで検出した。LIGHTt66の
相対的な分子量を、較正タンパク質の溶出プロファイルとの比較により決定した
。
【０２０５】実施例１３．細胞障害性アッセイは、可溶性LIGHTがリンホトキシン受容体を発
現する細胞に対してアポトーシスを誘発できることを実証する 本実施例は、ホモ三量体LIGHTt66が、ヒトLTβR受容体を発現する細胞の増殖
を阻害し、アポトーシスを惹起することができることを実証する。これらのデー
タはまた、HVEMの架橋がアポトーシスを誘導しないことを示した。
【０２０６】 HT29細胞(上記参照)を、5000個/ウェルで、IFNγ(80 U/ml)の存在下または不
在下で、マイクロタイタープレートのウェルにおいてDMEM(50μl)に入れた。LIG
HTt66および他のサイトカインの連続希釈液を、同じくIFNγの存在下または不在
下で、50μL培地に添加し、細胞を37℃にてインキュベートした。24〜72時間後
、20 plの5 mg/ml MTT[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)2,5ジフェニルテト
ラゾリウムブロミド]を添加し、プレートを４時間37℃にてインキュベートした
。次いで、培地を吸引し、100μl酸性化70％イソプロパノールを添加して、ホル
マジン(formazin)を溶解した。ODを570 nmにて定量した。
【０２０７】 LIGHTt66は、LTα1β2に匹敵する効率で、HT29細胞の増殖を阻害し、アポトー
シスを惹起した(図16Ａ)。細胞障害性は、IFNγに依存し(図16B)、72時間後に最
大であった。様々な実験を経て、10〜100 pMの用量で50％細胞障害性を得た。LI
GHTt66の細胞障害性は、LIGHTt66とヒトLTβR:FcまたはHVEM:Fcとのプレインキ
ュベーションにより、用量依存的に遮断され得る。一方、LIGHTと結合しないFas
:Fcは効果がなかった(図16C)。
【０２０８】 IFNγの存在下で、L120QおよびQ117Tは、LIGHTt66に匹敵する効率でHT29細胞
に対して細胞障害性を有していた(図19)。huLTβRおよびhuHVEMの両方と結合す
るY173Fは、これらの細胞に対して弱いが有意な細胞障害性を示した。一方、Y17
3FよりもHVEMに対して高い親和性を有するが、LTβRに結合しないG119Eは、有意
な細胞障害性を示さなかった。 LIGHTt66変異体で得られたデータは、HT29細胞
のLIGHT仲介型アポトーシスがLTβRに仲介されることを強く示唆した。この仮説
を確認し、HVEMのLIGHT仲介型架橋がLTβR仲介型アポトーシスを増強するかまた
は阻害するか否かを決定するために、モノクローナルおよびポリクローナル抗HV
EMおよび抗LTβR抗体のパネルを用いて実験を行った。
【０２０９】 ヤギポリクローナルHVEM IgGおよびヤギポリクローナルLTβR IgGに加えて、
２つのマウスモノクローナル抗HVEM抗体CW1およびCW8、ならびに２つのマウスモ
ノクローナル抗LTβR抗体BDA8およびCDH10を使用した。全て、HT29細胞の表面上
の適切な受容体に結合した(図20Ａ)。抗HVEM抗体であるCW1およびCW8は、ポリク
ローナルヤギ抗HVEMと同様にCW8はLIGHTがhuHVEMに結合するのを阻害したが、CW
1は結合に対して効果が無かったという遮断に関するELISAによる研究に基づき使
用した(図20Ｂ)。
【０２１０】 モノクローナル抗LTβR抗体BDA8はHT29細胞のLTα1β2仲介型アポトーシスを
阻害することが示され、他方でCDH10はこの効果を増強することが示されてきた
ため、これらの抗体がLIGHT仲介型アポトーシスに同様に作用し得るか否かを調
査した。遮断に関するELISAによる研究において、ポリクローナルヤギ抗LTβRお
よびBDA8は、LIGHTがLTβRに結合するのを阻害したが、CDHIOは結合に対して効
果が無かった(図20Ｃ)。
【０２１１】 ヤギポリクローナル抗LTβRはIFNγの存在下でHT29細胞のゆっくりとしたアポ
トーシス死を誘導した(図20Ｄ)が、ヤギポリクローナル抗HVEMは細胞生存度に作
用しなかった。これは、HVEMの架橋がこの細胞系においてアポトーシスを誘導し
ないことを示唆する。
【０２１２】 さらに、ポリクローナル抗HVEMは、ポリクローナル抗LTβR依存的細胞死を増
強も阻害もしなかった(図20Ｄ)。ポリクローナルヤギ抗LTβRでのプレインキュ
ベーションにより、LIGHT仲介型の死に対するHT29細胞の感受性が顕著に増強し
た(図20Ｅ)。
【０２１３】 LTα1β2による死を増強するDH10もまたLIGHTに対する細胞の感受性を増強し
たが、LTα1β2による死を阻害するBDA8とのプレインキュベーションは、LIGHT
仲介型細胞障害性の低下をもたらした(図20Ｅ)。細胞とポリクローナルヤギ抗HV
EM、またはモノクローナル抗HVEM抗体CW1およびCW8とのプレインキュベーション
は、LIGHTによる死に対する感受性に影響を及ぼさなかった。
【０２１４】 集合的に、これらのデータは、HVEMの架橋がアポトーシスを誘導しなかったこ
と、HVEMシグナリングがアポトーシスの誘導においてLTβRシグナリングと相乗
作用しなかったこと、ならびにHVEMシグナリングが、LTβR依存的アポトーシス
経路を妨害するのに十分な防御事象を誘発しなかったことを示す。
【０２１５】実施例１４．ELISAおよび表面プラスモン共鳴による、LTβRおよびHVEMへの可溶 性ホモ三量体ヒトLIGHTの結合についての研究 ヒトHVEM:FcおよびLTβR:Fcと、LIGHTt66(可溶性ホモ三量体p30)およびLIGHTt
66変異体(上述)との相互作用の会合速度および解離速度を、表面プラスモン共鳴
により測定した。受容体結合特性を、捕捉分子としてヒト(hu)およびマウス(mu)
LTβR:FcおよびHVEM:Fc構築物を用い、検出のためにM2抗FLAG抗体を用いてELISA
により調査した(図17)。
【０２１６】 捕捉分子であるヒトHVEM:FcおよびLTβR:Fc(50μg/ml)を、pH5.0でのアミン結
合により、BIA-core 1000（商標）(BIAcore Inc., Piscataway, NJ)のCM5センサ
チップに結合させた。センサ表面をPBS(20 mMリン酸ナトリウム/150 mM NaCl (p
H 7.4))で平衡化し、25℃にて５μl/分の流速にてセンサーグラムを収集した。L
IGHTt66または変異体の10μl注射を、センサ表面にかけた；会合期の後、800秒
間の解離データを回収した。各サイクル後にセンサ表面を、10μlパルスの10 mM
グリシン(pH 2.0)で再生した。100〜500 mMの５つの分析物濃度のセットを収集
し、BI1Aevaluationソフトウェア(2.1)（商標）を用いた非線形回帰法により分
析した。会合および解離データを、単純なABμA＋Bモデルに基づいてフィットさ
せた。
【０２１７】 LIGHTt66は、huHVEM:FcおよびhuLTβR:Fcに同等の親和性で結合した。LIGHTt6
6は、muHVEM:FcおよびmuLTβR:Fcと10分の1の親和性で結合した。LIGHTt66変異
体L120QおよびQ117Tは、LIGHTt66に匹敵する親和性で、huHVEM:FcおよびhuLTβR
:Fcと結合した。興味深いことに、L120Qは、両方のマウス受容体に対して増強さ
れた親和性を示した。G119Eは、huHVEMに対して低いが有意な親和性を示し、hu
LTβRに対して検出不可能な結合を示した。一方で、Y173Fは、hu LTβRおよびhu
HVEMの両方に対して低いが有意な結合を示した。G119EおよびY173Fは、マウス
受容体に結合しなかった。
【０２１８】 LIGHTt66およびその変異体がhuLTβR:FcおよびhuHVEM:Fcに結合することを、
表面プラスモン共鳴により分析することで、ELISAにより得られたデータを確認
し展開した(図18)。結果は、表１にまとめた。LIGHTpt66と両方の受容体との相
互作用における会合期および解離期は、単純なA＋BμABモデルとよくフィットし
たhu LTβR:Fcについてはka＝2.7±0.5×104 (M/s)、huHVEM:Fcについては1.2±
0.2×104(M/s)、ならびにhu LTβR:FcおよびhuHVEM:Fcについてそれぞれkds＝1.
2±0.2×104および4.8±5.1×10-5s-1であった。kd/ka比から計算した固有の解
離速度定数(kD)は、huLTβR:Fcについては4.7±0.7 nM、およびhuHVEM:Fcについ
ては3.9±3.9 nMであった(これらのデータは、100〜500 nMのLIGHTt66濃度の範
囲内での５つの測定の平均である)。
【０２１９】 G119Eは、huLTβR:Fcに対して検出可能な結合を示さず、huHVEM:Fcに対する親
和性はLIGHTt66のもののおよそ30分の1であった(KD=114 nM)。huHVEM:Fcに対す
るG119Eの親和性の低下は、解離速度の増加(kd＝2.0±0.4×10-3s-1)によるもの
であった。Y173Fは、同じく解離速度の増加により低い親和性で、huLTβR:Fcお
よびhuHVEM:Fcの両方と結合した。huLTβRに対するY173Fの親和性(kD=31 nM)は
、LIGHTt66の３〜４分の１であったが、huHVEM:Fcに対するY173Fの親和性は、40
分の1未満であった(kD=180 nM)。
【０２２０】 Q117Tは、LIGHTt66と同様の会合速度でhuHVEM:FcおよびhuLTβR:Fcの両方と結
合した。より遅い解離速度であったために、受容体に対するこの変異体の親和性
はLIGHTt66と比べて高かった。
【０２２１】
【表１】
【０２２２】 実施例１５．可溶性ホモ三量体ヒトLIGHTによるICAMのアップレギュレーショ
ンはLTβRにより仲介される 本実施例は、可溶性ホモ三量体LIGHTおよび２つの突然変異(L120QおよびQ117T
における点突然変異)が、ICAM発現をアップレギュレートできることを明示する
。
【０２２３】 ５代目以前(passage 5 or earlier)のNHDF細胞を用いた。細胞(180,000/4.2 c
m2皿)を、インスリンおよび繊維芽細胞増殖因子を補充した完全DMEM(600μl/ウ
ェル)中でサイトカインとインキュベートした。36時間後、モノクローナル抗ICA
M(P2A4；10μg/ml)、次いでヤギ抗マウスIgG-PEで細胞を染色し、フローサイト
メトリーにより分析した。
【０２２４】 L120QおよびQ117T(5 nM)は、NHDF細胞によるICAMの発現のアップレギュレーシ
ョンを、LIGHTt66を用いて得られるレベルに匹敵するレベルまで誘導した(４倍
誘導)(図21)。Y173Fは、5 nMで使用した場合、ICAMの発現のわずかな誘導を生じ
たが、20 nM誘導では2.5倍であった。G119Eは、5 nMではICAMの発現の検出可能
な誘導を生じず、20 nMでわずかな(1.5倍より低い)誘導を生じた。
【０２２５】実施例１６．HVEMは、細胞膜上でTRAF2およびTRAF5と共に局在化するが、TRAF3
とは局在化しない 本実施例は、293細胞において、HVEMが、組換えタンパク質としてTRAFポリペ
プチドと同時発現された場合に、細胞膜上で局在化し、かつTRAF2およびTRAF5と
結合する(TRAF3とはしない)ことを実証する。
【０２２６】 293細胞中での同時トランスフェクション実験では、HVEMがTRAF2および5と共
に局在化するが、TRAF3とは局在化しないことが(共焦点免疫蛍光顕微鏡法を用い
て)実証された。LTβRは、試験した３つのTRAF全てと共に局在化した；ネガティ
ブ対照は空のベクターpBabeと同時トランスフェクトした。FLAGによりタグ付け
したTRAFをFITCで可視化した。LTβRおよびHVEMは、テキサスレッドを用いて可
視化した。共に局在化したタンパク質は黄色で見とめられた。HVEMはTRAF2およ
び5と共に局在化したが、TRAF3とは局在化しなかった。LTβRは、TRAF2、3およ
び5と共に局在化した。
【０２２７】 組換え発現されたHVEMの(抗HVEM抗体によりる)免疫沈降により、(トランスフ
ェクトされた293細胞の溶解産物から)TRAF2および5が同時沈降したが、TRAF3は
沈降しなかった実験により、HVEMがTRAF2およびTRAF5に結合したことも実証され
た。LTβRはTRAF3のみを沈降させた。図22Ａおよび22Ｂを参照のこと。
【０２２８】共焦点免疫蛍光顕微鏡法の手順 トランスフェクションの24時間後、293T細胞を、８ウェルLab-TekB（商標）チ
ャンバーSides(Lab-Tekカタログ番号177445)に、3×104細胞/ウェルで播種し、1
8〜36時間37℃にて５％CO2の下で培養した。染色のために、ウェルをPBSで２度
洗浄し、新しく調製した２％パラホルムアルデヒド含有PBS(pH 7.0)中で10分間
室温にて固定化し、再度PBSで２度洗浄し、その後メタノール中で２分間室温に
て透過化処理した。細胞をPBS中で洗浄し、最短10分間、室温にて、３％BSAを含
有するPBS中で遮断した。ポリクローナルヤギ抗LTβRを最終濃度20μg/mlまで希
釈し、ポリクローナルラット抗HVEMを最終濃度20μg/mlまで希釈し、マウスモノ
クローナル抗FLAG、M2(Sigma F3165)を最終濃度5μg/mlまで希釈した。抗体を、
PBS、3％BSA、および0.2％Triton X 100(PBS/BSA/Triton)に希釈した。一次抗体
を、最終容量120μl/ウェルでウェルに添加し、加湿チャンバ内で室温にて１時
間インキュベートした。次いで、ウェルをPBS/BSA/Triton中で３度洗浄した。FI
TCがコンジュゲートしたロバ抗マウス抗体を、テキサスレッドとコンジュゲート
したロバ抗ヤギ抗体と組み合わせて(両方ともJackson Immuno-Research Laborat
oriesから入手)、またはテキサスレッドがコンジュゲートしたロバ抗ウサギ抗体
(Jackson Immuno-Research Laboratories)を、PBS/BSA/Triton中に最終濃度1:20
0まで希釈して、最終容量を120μl/ウェルとした。スライドを、加湿チャンバ内
で室温および暗室にて１時間インキュベートし、次いでPBS/BSA/Triton中で３度
洗浄し、ウェルを取り出した。１ウェルにつき４μlの封入液 (80％グリセロー
ル含有PBS)を、各ウェルの細胞の上に添加し、24×55顕微鏡カバーガラス(Fishe
rbrand # 12-544-18)でスライドをカバーした。可視化する前の１〜７日間、ス
ライドを４℃にて暗室で保存した。
【０２２９】 クリプトン/アルゴンイオンレーザおよび60X Nikon（商標）対物レンズを備え
たBioRad MRC-1024（商標）共焦点顕微鏡を用いて細胞を観察した。LaserSharp
（商標）オペレーションシステムを用いて画像を獲得し、Adobe Photoshop 5.0
（商標）で分析および操作した。
【０２３０】 HT29細胞(DMEM/3%BSA中106/ml)を、マウスモノクローナル抗HVEM抗体または抗
LTβR抗体で30分間４℃にて染色し、次いでフィコエリトリン(PE)に連結したヤ
ギ抗マウスIgGで30分間４℃にて染色し、FACSCAN(Becton Dickinson, Mountain
View, CA)を用いたフローサイトメトリーにより分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａは、PMA(上部ヒストグラム)、またはPMAおよびイオノマイシン(下部ヒ
ストグラム)で活性化した後の、II-23.D7細胞へのHVEM:Fc融合タンパク質の結合
を示す１対のフローサイトメトリーヒストグラムである。図１Ｂは、正常ヒトCD
4+(上部ヒストグラム)およびCD8+(下部ヒスト部Hグラム)Ｔ細胞へのHVEM:Fc融合
タンパク質の結合を示す１対のフローサイトメトリーヒストグラムである。図１
Ｃは、活性化II-23.D7細胞へのHVEM:Fc融合タンパク質の飽和結合を示す線グラ
フである。
【図２】 図２Ａは、１対の図である。上図は、活性化II-23.D7細胞へのHVEM:Fc融合タ
ンパク質結合が、LTβR:Fc融合タンパク質と競合することを示すフローサイトメ
トリーヒストグラムである。下図は、LTβR:Fc融合タンパク質による、HVEM:Fc
融合タンパク質結合の用量依存的阻害を示す線グラフである。図２Ｂは、１対の
図である。上図は、HVEM:Fc融合タンパク質結合が、LTαホモ三量体と競合する
ことを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図は、LTαホモ三量体
によるHVEM:Fc融合タンパク質結合の用量依存的阻害を示す線グラフである。
【図３】 図3は、１対の図であり、上図は、天然型LTαのTyr108Phe変異体が、II-23.D7
細胞へのHVEM:Fc結合と競合しないことを示すフローサイトメトリーヒストグラ
ムであり、下図は、LTαおよびLTα(Tyr108Phe)の競合結合分析を示す線グラフ
である。
【図４】 図４Ａは、活性化II-23.D7細胞の抽出物をmLTβR:Fc融合タンパク質で処理す
ることにより得られる沈降物の二次元等電点電気泳動/SDS-PAGEゲルから得られ
るオートラジオグラムである。図４Ｂは、活性化II-23.D7細胞の抽出物をTNFR60
:Fc融合タンパク質で処理することにより得られる沈降物の二次元等電点電気泳
動/SDS-PAGEゲルから得られるオートラジオグラムである。図４Ｃは、活性化II-
23.D7細胞の抽出物をHVEM:Fc融合タンパク質で処理することにより得られる沈降
物の二次元等電点電気泳動/SDS-PAGEゲルから得られるオートラジオグラムであ
る。
【図５】 図５は、１対の図であり、上図は、HVEM:Fc融合タンパク質結合が、HSV gD-1
糖タンパク質と競合することを示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
下図は、HSV gD-1糖タンパク質による、HVEM:Fc融合タンパク質結合の用量依存
的阻害を示す線グラフである。
【図６】 図６は、抗HVEM抗体が新たに単離された末梢血液Ｔ細胞(上部線グラフ)および
記憶Ｔ細胞(下部線グラフ)における用量依存的増殖を刺激することを示す１対の
線グラフである。
【図７】 図７は、１対の図であり、上図は、RAJIリンパ芽球細胞上でのHVEMの発現を示
すフローサイトメトリーヒストグラムである。下図は、抗HVEM抗体に応答するRA
JI細胞の用量依存的増殖を示す線グラフである。
【図８】 図８は、融合タンパク質mHVEM:Fcを表す約58 kDaの明確なバンドを示すタンパ
ク質について染色されたSDS-PAGEゲルを示す(実施例６を参照)。
【図９】 図９は、マウスの肉趾膨張に対するHVEM:Fc融合タンパク質の影響を示すグラ
フである。様々な濃度のmHVEM:Fc(12、60および300μg)を使用して、1 mgのミョ
ウバンに吸着させた50μgOVAで免疫化し、抗原で免疫誘発されたBDF1マウスにお
ける炎症および膨張を治療した(実施例７を参照)。
【図１０】 図１０は、PBS、hIgGまたはmHVEM:Fcで治療されたコラーゲン誘導関節炎マウ
スについてのCIAスコアのグラフを示す(実施例８を参照)。
【図１１】 図１１は、0.05のMOIでHCMV-Fに感染し、5 nMのＡ)LTα、Ｂ)LTα＋RNFR:Fc、
Ｃ)LTαY108F、Ｄ)LTα1β2、Ｅ)LIGHT、Ｆ)LIGHT-G119E、およびＧ)ウイルスの
みの培地の存在下で培養した皮膚繊維芽細胞の形態を示す(実施例９を参照)。
【図１２】 図１２は、γヘルペスウイルス、MHV68に対する、LIGHTおよびLTαのin vivo
での抗ウイルス効果を示す(実施例９を参照)。
【図１３】 図１３は、(Ａ)クーマシーブルーで染色、または(Ｂ)抗FLAG(M2)でウェスタン
ブロットされたLIGHTt66の純度を示し、組換えタンパク質を検出するゲルを示す
。分子量マーカーは左のレーンに示す。
【図１４】 図１４は、LIGHTおよびリンホトキシンの抗HCMV効果が、NFκBの活性化におい
て依存することを示す複数のゲルを示す。
【図１５】 図１５Ａは、LIGHTt66およびその変異体の精製および生化学的特徴を示す。29
3細胞上清からLIGHTt66-FLAGを精製した。上部パネルは、クーマシー染色SDS PA
GEゲル(15％)である。１ウェルにつき20μlを充填した。出発上清およびイオン
交換精製LIGHTt66は、複数のバンドを呈した。アフィニティー精製LIGHT t66は
、単一バンドとして現れた(Mr＝27 kDa)。下部パネルは、抗FLAG(M2)で染色され
たウェスタンブロットの結果である。１ウェルにつき20μlを充填した。LIGHTt6
6-FLAGをMr＝27 kDaで検出した。バンドの相対的な強度は、ELISAデータと合致
し、LIGHT t66-FLAGがイオン交換手順後に30倍濃縮され、アフィニティー精製後
には100倍濃縮されたことを示した。図１５Ｂは、293Ｔ細胞上清からのLIGHTt66
-FLAGの変異体の精製の結果である。上部パネルは、銀染色したSDS PAGEゲルで
ある。記載するように293Ｔ細胞を用いて生成されるLIGHTt66-FLAGの変異体。FL
AGタグ付けタンパク質を、Affigelに連結したモノクローナルM2抗FLAG抗体を用
いて組織培養上清からアフィニティー精製した。１ウェルにつき100 ng精製タン
パク質を充填した。４つの変異体の全てが、単一のバンドとして現れた(Mr＝27
kDa)。いくつかの調製物では、他の不鮮明なバンド(Mr＝52 kDa)が存在した。そ
れ以外の混入タンパク質は検出されなかった。下部パネルは、M2抗FLAGで染色さ
れたウェスタンブロットの結果である。LIGHTt66-FLAGおよびその変異体を、Mr
＝27 kDaで検出した。場合によっては、Mr＝52 kDaの位置に弱い反応性のバンド
も検出され、これは銀染色により検出された52 kDaバンドに対応した。このバン
ドは、おそらく二量体である。図１５Ｃは、LIGHTt66-mycの架橋実験の結果であ
る。グルタルアルデヒド(0.1％)またはBSCOES(5 nM)を30分間４℃にて添加する
ことによりLIGHTt66を架橋させた；反応はTRIS(20 mM、pH 8.0)を添加すること
により停止させた。9E1O(抗myc)抗体を用いたウェスタンブロッティングにより
サンプルを分析した。１ウェルにつき200 ngを充填した。Ａは、対照LIGHTt66-m
yc、Ｂはグルタルアルデヒドと架橋したもの、ＣはBSCOESと架橋したものである
。架橋サンプルでは、52および76 kDaのバンドが検出され、これらは二量体およ
び三量体について予想した分子量（Mr）に対応した。図１５Ｄは、LIGHTt66-FLA
Gのゲル濾過分析。LIGHTt66-FLAGおよび変異体を、Superose12カラム上でのFPLC
ゲル濾過により分析した。上部パネル．LIGHTt66-FLAGのゲル濾過から得た画分
を、捕捉分子としてHVEM:Fc、および検出用抗体としてM2抗FLAGを用いたELISAに
より分析した。活性LIGHTt66は、Mr＝76 kDaで溶出し、ホモ三量体分子を示した
。下部パネルは、M2抗FLAGで染色したドットブロットである。LIGHTt66-FLAGお
よび変異体のゲル濾過分析から得た画分を、ドットブロッティングによりさらに
分析した(上から下へ、t66、G119E、Y173F、Q117T、L120Q)。抗FLAG反応物質は
、ELISAによりホモ三量体LIGHTを含むと決定された画分においてのみ検出し、調
製物が遊離単量体および凝集物質を含まないことを明示した。
【図１６】 図１６Ａは、LIGHTt66が、HT29細胞に対して細胞傷害性であることを示すグラ
フを示す。HT29細胞を、IFNγ(80 U/ml)の存在下で、LIGHTt66、LTα1β2、また
はTNFの連続希釈液とインキュベートした。72時間後、MITアッセイにより、細胞
生存度を評価した。LIGHTt66は、LTα1β2に匹敵する効率でHT29の成長を阻害し
た。図１６Ｂは、LIGHTt66細胞障害性は、IFNγに依存する。HT29細胞を、IFNγ
(80 U/ml)の存在下および不在下で、LIGHTt66の連続希釈液とインキュベートし
、72時間後にMTTアッセイを行った。図１６Ｃは、ｍLIGHTt66細胞障害性は、LT
βR:FcおよびHVEM:Fcとの同時インキュベーションにより妨害される。LIGHTt66(
200 pM)を、IFNγの存在下で、LTβR:Fc、HVEM:FcまたはFas:Fcの様々な希釈液
と30分間前インキュベートし、HT29細胞を添加した。MTTアッセイを、72時間後
に行った。LTβR:FcおよびHVEM:Fcは、LIGHTt66の細胞障害性を用量依存的に阻
害したが、Fas:Fcは、LIGHTt66仲介型細胞障害性に作用しなかった。
【図１７】 図１７は、LIGHTt66およびその変異体の受容体結合特徴を示すグラフである。
LIGHTt66-FLAGおよび変異体を、捕捉分子として表記受容体、および検出用抗体
としてM2抗FLAGを用いたELISAにより分析した。L120QおよびQ117Tは、LIGHTt66
に匹敵するかまたはそれ以上の親和性で、ヒトHVEMおよびLTPRと結合した。G119
Eは、低い親和性でヒトHVEM:Fcと結合し、ヒトLTβR:Fcに対しては検出可能な結
合は示さなかった。Y173Fは、低い親和性でヒトLTβRと結合し、G119Eと弱く結
合した。L120Qは、マウスHVEM:FcおよびLTβR:Fcに対して増強された親和性を示
した。マウス受容体に対するG119EおよびY173Fの結合は、この系においては検出
されなかった。
【図１８】 図１８は、表面プラスモン共鳴を示すセンサグラムを重ねたものを示す。リガ
ンド濃度300 nMでの、huHVEM:FcおよびhuLTβR:Fcへの、LIGHTt66およびその変
異体の結合についてのセンサグラムを重ねたもの。結合の速度は、LIGHTt66およ
びQ117Tについて類似していた。G119EおよびY173Fは、LIGHT-t66と比べて高いオ
フ速度(off rate)でHVEM:Fcから解離した。Y173Fは高いオフ速度でhuLTβRから
解離したが、G119Eはこの受容体に結合できなかった。
【図１９】 図１９は、HT29細胞中におけるLIGHTt66変異体の細胞障害性を示す。HT29細胞
を、IFNγの存在下で、LIGHTt66およびその変異体の連続希釈液とインキュベー
トした。MTTアッセイを72時間後に行った。L120QおよびQ117Tは、LIGHTt66に匹
敵する効率で、HT29細胞に対して毒性であった(10μMのサイトカインで50％細胞
死)。Y173Fは、弱い細胞障害性を示した(1 nMサイトカインで50％細胞死)。G199
Eは、これらの細胞に対してごく僅かな細胞障害性を示した。
【図２０】 図２０Ａは、HT29細胞に対する抗LTβRおよび抗HVEM抗体の影響を示す。HT29
細胞への、抗huHVEMおよび抗huLTβR抗体の結合を示す。細胞を、一次抗体(５μ
g/ml)または正常マウスIgG(黒塗り領域)と30分間４℃にて、その後ヤギ抗マウス
PEとインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。両方の抗HVEM抗
体(CW1およびCW8)、ならびに両方の抗LTβR抗体(BDA8およびCDH10)が細胞を染色
した。図２０Ｂは、huHVEMへのLIGHTの結合に対する抗huHVEM抗体の影響を示す
。huHVEM:Fc(3 pg/ml)でコートしたELISAプレートのウェルを、様々な濃度のヤ
ギポリクローナル抗HVEMまたはモノクローナル抗HVEM抗体CW1もしくはCW8、次い
でLIGHT(0.25 nM)と１時間インキュベートした後に、モノクローナル抗FLAG(M2)
およびヤギ抗マウスIgG-HRPで結合LIGHTを検出した。ヤギ抗HVEMおよびCW8は、H
VEMへのLIGHTの結合を顕著に阻害したが、CW1は効果がなかった。図２０Ｃは、h
uLTβRへのLIGHTの結合に対する抗LTβR抗体の影響を示す。実験は、図２０Ｂに
ついて記載したように行った。ヤギ抗LTPRおよびモノクローナル抗LT8R BDA8は
、LTβRへのLIGHTの結合を顕著に阻害したが、CDH10は効果がなかった。図２０
Ｄは、HT29細胞の成長に対するhuHVEMおよびhuLTβRと架橋した抗体の効果を示
す。HT29細胞を、様々な用量のポリクローナル抗HVEM、ポリクローナル抗LTβR
、またはこれら２つの混合物とインキュベートした。72時間後にMTTアッセイを
行った。LTβRと架橋した抗体は、用量依存的に細胞数を有意に減少させたが、H
VEMと架橋した抗体は効果がなかった。ポリクローナル抗HVEM抗体を含むことで
、ポリクローナル抗LTβRの細胞障害性が影響を受けることはなかった。図２０
Ｅは、LIGHT仲介型細胞障害性に対するポリクローナル抗huHVEMおよび抗huLTβR
の影響を示す。Hi29細胞を、10 pg/mlのヤギポリクローナル抗huHVEM、ヤギポリ
クローナル抗huLTβR、または表記のモノクローナル抗体と10分間インキュベー
トした後に、LIGHT(0.25 nM)を添加した。培養72時間後にMTTアッセイを行った
。LIGHTのみの場合、50％成長阻害をもたらした。ヤギポリクローナル抗LTβRお
よびモノクローナル抗LTβR CDH10は、LIGHT仲介型細胞障害性を顕著に増強した
が、モノクローナル抗LTβR BDA8はわずかな防御効果を示した。ヤギポリクロー
ナル抗huHVEMおよびモノクローナル抗HVEM抗体CW1およびCW8は、LIGHT仲介型細
胞障害性に作用しなかった。
【図２１】 図２１は、NHDF細胞におけるICAM発現のアップレギュレーションに対するLIGH
Tt66の影響を示す。NHDF細胞(60,000/ウェル)を、600:1の組織培養培地中で、表
記の濃度のサイトカインとインキュベートした。36時間後、細胞を、mAb P2A4(C
hemicon International Inc.)を用いてFACSで分析し、ICAM-1の表面レベルを決
定した。誘導倍数は、未処理ネガティブコントロールと比較した、サイトカイン
で処理されたウェルの比蛍光を表す。
【図２２】 図２２Ａは、受容体によるTRAF補充を示す。トランスフェクトされた293T細胞
の溶解産物からのHVEMおよびFLAGタグ付けTRAFの同時免疫沈降を実施した。タン
パク質複合体を、ポリクローナルラット抗HVEM特異的抗体を用いて沈降させた。
マウスモノクローナル抗FLAG抗体を用いてイムノブロットを検出した。図２２Ｂ
は、トランスフェクトされた293T細胞の溶解産物からのLTPRおよびFLAGタグ付け
TRAF同時免疫沈降の結果である。ヤギ抗LTPR特異的抗体を用いて、タンパク質複
合体を沈降させた。マウスモノクローナル抗FLAG抗体を用いてイムノブロットを
検出した。単一ベクター、または図示し、実験手順に記載する組合せのベクター
で細胞をトランスフェクトした。pBABEを陰性対照として含めた。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/12 31/12 35/00 35/00 35/02 35/02 37/02 37/02 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA23 BA35 CA53 CA56 CA59 DA01 MA66 NA13 NA14 ZA022 ZA962 ZB072 ZB152 ZB262 ZB272 ZB332 ZC352 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA66 NA13 NA14 ZA02 ZA96 ZB07 ZB15 ZB26 ZB27 ZB33 ZC35 4H045 AA10 AA30 BA41 CA40 EA29

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリ
    ペプチド、またはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合し、約30 kDa
    の見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドを含む、単離されたまたは組換え
    型のホモ三量体p30ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 前記単量体ポリペプチドは、約7〜約8.5のpIを有する異性体
    を含む、請求項１に記載の単離されたまたは組換え型のホモ三量体p30ポリペプ
    チド。
  3. 【請求項３】 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリ
    ペプチドまたはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫
    通ドメインを欠く可溶性の単離されたまたは組換え型のホモ三量体p30ポリペプ
    チド。
  4. 【請求項４】 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリ
    ペプチドもしくはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kD
    aの見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプ
    チド、または 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
    ンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く
    可溶性ホモ三量体p30ポリペプチド、 を含有する、リポソーム。
  5. 【請求項５】 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリ
    ペプチドもしくはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kD
    aの見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプ
    チド、または 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
    ンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く
    可溶性ホモ三量体p30ポリペプチド、 を含む、融合タンパク質。
  6. 【請求項６】 異種配列がタグである、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 【請求項７】 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリ
    ペプチドもしくはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kD
    aの見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプ
    チド、または 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
    ンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く
    可溶性ホモ三量体p30ポリペプチド、 および薬学的に許容され得る賦形剤を含有する、医薬組成物。
  8. 【請求項８】 医薬組成物および印刷物を含むキットであって、 該医薬組成物は、生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペ
    プチドもしくはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDa
    の見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプ
    チド、または生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチ
    ドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ド
    メインを欠く可溶性ホモ三量体p30ポリペプチドを構成するp30ポリペプチド、お
    よび薬学的に許容され得る賦形剤を含み、 前記印刷物には、細胞へのウイルス侵入または細胞中でのウイルス増殖を阻害す
    ることを含む前記医薬組成物の使用に関する指示が含まれている、上記キット。
  9. 【請求項９】 前記指示が、in vivoで細胞中のウイルス増殖または細胞へ
    のウイルス侵入を阻害するための前記医薬組成物の使用に関する指示を含む、請
    求項８に記載のキット。
  10. 【請求項１０】 前記ウイルスがヘルペスウイルスである、請求項８に記載
    のキット。
  11. 【請求項１１】 前記ウイルスが単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガ
    ロウイルス(CMV)、γ-ヘルペスウイルスまたはエプスタイン-バーウイルス(EBV)
    である、請求項１０に記載のキット。
  12. 【請求項１２】 前記細胞へのウイルス侵入または細胞中でのウイルス増殖
    の阻害が哺乳動物で達成される、請求項１１に記載のキット。
  13. 【請求項１３】 前記哺乳動物はヒトである、請求項１２に記載のキット。
  14. 【請求項１４】 医薬組成物および印刷物を含むキットであって、 該医薬組成物は、生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペ
    プチドもしくはリンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDa
    の見かけの分子量を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプ
    チド、または生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチ
    ドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ド
    メインを欠く可溶性ホモ三量体p30ポリペプチドを構成するp30ポリペプチド、お
    よび薬学的に許容され得る賦形剤を含み、 前記印刷物には、望ましくないリンパ球の増殖を伴う疾患をモジュレートするこ
    とを含む前記医薬組成物の使用に関する指示が含まれている、上記キット。
  15. 【請求項１５】 前記指示が、ＴまたはＢリンパ腫もしくは白血病、または
    自己免疫疾患をモジュレートするための前記医薬組成物の使用に関する指示を含
    む、請求項１４に記載のキット。
  16. 【請求項１６】 前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、インスリン依存
    型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡または重症筋無力症である、請求項
    １５に記載のキット。
  17. 【請求項１７】 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポ
    リペプチドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合するホ
    モ三量体を形成する、約30 kDaの見かけの分子量を有するp30ポリペプチドまた
    は膜貫通ドメインを欠くp30ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、医
    薬組成物。
  18. 【請求項１８】 医薬組成物および印刷物を含むキットであって、 該医薬組成物は、生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペ
    プチドもしくはリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合するホモ三
    量体を形成する、約30 kDaの見かけの分子量を有するp30ポリペプチドまたは膜
    貫通ドメインを欠くp30ポリペプチドをコードする発現ベクター、および薬学的
    に許容され得る賦形剤を含み、 前記印刷物には、腫瘍細胞または活性化リンパ球を標的化することを含む該医薬
    組成物の使用に関する指示が含まれている、上記キット。
  19. 【請求項１９】 前記使用が、前記医薬組成物を腫瘍に直接注射することに
    よって腫瘍を治療することを含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 【請求項２０】 リンパ球に対して増殖誘導シグナルを誘導する方法であっ
    て、 (ａ)細胞表面に発現されたHVEMに結合する組成物を用意すること、および (ｂ)該リンパ球を増殖誘導量の該組成物と接触させること、 を含む、上記方法。
  21. 【請求項２１】 前記組成物が抗HVEM抗体である、請求項２０に記載の方法
    。
  22. 【請求項２２】 前記組成物を用意することは、 p30ポリペプチド、可溶性p30ポリペプチド、リポソーム結合性p30ポリペプチド
    、または p30ポリペプチドをコードするベクターまたは組換えp30を細胞結合性p30ポリペ
    プチドとして発現する細胞、 を用意することを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記リンパ球はＴ細胞である、請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記リンパ球はＢ細胞である、請求項２０に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記リンパ球をin vivoで接触させる、請求項２０に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 p30ポリペプチド仲介型細胞性応答を阻害する方法であっ
    て、 (ａ)細胞表面で発現されたp30ポリペプチドが細胞表面で発現されたHVEMもしく
    はLTβRに結合するのを阻害する組成物を用意すること、および (ｂ)細胞表面で発現されるp30ポリペプチドまたは細胞表面で発現されるHVEMも
    しくはLTβRを発現する細胞を、p30ポリペプチド仲介型細胞性応答を阻害するの
    に十分な量の該組成物に接触させること、 を含む、上記方法。
  27. 【請求項２７】 前記細胞は前記組成物とin vivoで接触させる、請求項２
    ６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 阻害されるp30ポリペプチド仲介型細胞性応答は、リンパ
    球性応答の阻害を含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 阻害されるリンパ球応答はリンパ球増殖である、請求項２
    ８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 阻害されるリンパ球は病原性エフェクター細胞である、請
    求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 阻害されるリンパ球応答が、ＴもしくはＢリンパ腫もしく
    は白血病、または自己免疫疾患をモジュレートする、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、インスリン依存
    型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡または重症筋無力症である、請求項
    ３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 阻害されるリンパ球応答が移植に対する反応をモジュレー
    トする、請求項２８に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記接触させる細胞はHVEMを発現しており、前記組成物は
    可溶性p30ポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記接触させる細胞はLTβRを発現しており、前記組成物
    は可溶性p30ポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記接触させる細胞はその細胞表面にp30ポリペプチドを
    発現しており、前記組成物は可溶性HVEMポリペプチドである、請求項２６に記載
    の方法。
  37. 【請求項３７】 前記接触させる細胞はその細胞表面にp30ポリペプチドを
    発現しており、前記組成物は抗p30抗体である、請求項２６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 腫瘍を治療する方法であって、 (ａ)生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしく
    はリンホトキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合するホモ三量体を形成す
    る、約30 kDaの見かけの分子量を有するp30ポリペプチドまたは膜貫通ドメイン
    を欠くp30ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む医薬的組成物を用意す
    ること、および (ｂ)該医薬組成物を腫瘍に直接注射すること、 を含む、上記方法。
  39. 【請求項３９】 リンホトキシンβ受容体(LTβR)仲介型細胞性応答をモジ
    ュレートする方法であって、 (ａ)LTβRがp30ポリペプチドに結合するのを阻害する組成物を用意すること、お
    よび (ｂ)LTβRまたはp30ポリペプチドを発現する細胞を、リンホトキシンβ受容体(L
    TβR)仲介型細胞性応答をモジュレートするのに十分な量の組成物と接触させる
    こと、 を含む、上記方法。
  40. 【請求項４０】 前記細胞はLTβRを発現しており、前記組成物は、生理学
    的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホト
    キシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDaの見かけの分子量を有す
    る単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプチド、または生理学的条
    件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホトキシ
    ンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く可溶性ホモ
    三量体p30ポリペプチドを構成するp30ポリペプチド、および薬学的に許容され得
    る賦形剤を含む医薬組成物を含んでいる、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記細胞はp30ポリペプチドを発現しており、前記組成物
    は抗p30抗体を含む、請求項３９に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記リンホトキシンβ受容体(LTβR)仲介型細胞性応答は
    、ヘルペスウイルスの細胞への結合を含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記ヘルペスウイルスが細胞に侵入するのを遮断する、請
    求項４２に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス(HSV)、
    サイトメガロウイルス(CMV)、γ-ヘルペスウイルスまたはエプスタイン-バーウ
    イルス(EBV)である、請求項４２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 細胞中でのウイルス生成を阻害する方法であって、 (ａ)p30ポリペプチドを用意すること、および (ｂ)ヘルペスウイルスに感染した細胞またはヘルペスウイルスによる感染に感受
    性のある細胞を有効量のp30ポリペプチドと接触させて、細胞中でのヘルペスウ
    イルス産生を阻害すること、 を含む、上記方法。
  46. 【請求項４６】 ヘルペスウイルスが細胞へ侵入するのを阻害する、請求項
    ４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記接触はin vivoで達成され、前記p30組成物は、 生理学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリ
    ンホトキシン受容体(LTR)ポリペプチドに結合する、約30 kDaの見かけの分子量
    を有する単量体ポリペプチドからなるホモ三量体p30ポリペプチド、または生理
    学的条件下でヘルペスウイルス侵入仲介物質(HVEM)ポリペプチドもしくはリンホ
    トキシンβ受容体(LTβR)ポリペプチドに結合する、膜貫通ドメインを欠く可溶
    性ホモ三量体p30ポリペプチド、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬
    組成物として提供される、請求項４５に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記ウイルスは、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメ
    ガロウイルス(CMV)、γヘルペスウイルスまたはエプスタイン-バーウイルス(EBV
    )である、請求項４５に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記接触は哺乳動物内で達成される、請求項４５に記載の
    方法。
  50. 【請求項５０】 前記哺乳動物はヒトである、請求項４９に記載の方法。
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