PT1674575E - Ligando do mediador de entrada do vírus herpes simplex e métodos de utilização - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"LIGANDO DO MEDIADOR DE ENTRADA DO VÍRUS HERPES SIMPLEX E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de uma maneira genérica, a compostos e métodos úteis na regulação das respostas imunes e infecções virais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus herpes simplex (HSV), tipos 1 e 2, causa infecções recorrentes que variam em gravidade desde benignas até graves. 0 HSV emerge da latência em neurónios para infectar a pele e outros tecidos, na presença de um sistema imunológico celular competente. A glicoproteína D (gD) do HSV, uma proteína transmembranar localizada no envelope do virião, inicia a infecção por ligação a receptores celulares (Spear et al. (1993) Virai Fusions Mechanisms. Ed. Bentz. CRC Press, Boca Raton). Recentemente, foi identificada uma proteína celular utilizada para a infecção por VHS e dada o termo mediador de entrada de HSV (HVEM) (Montgomery (1996) Cell 87:427). A HVEM é uma proteína transmembranar de tipo 1 com um domínio extracelular rico em cisteína, que exibe uma homologia significativa com os receptores de citoquinas relacionadas com o factor de necrose tumoral (TNF) (Smith et al. (1994) Cell 76:959; Ware et al. (1995) em Pathways of 2

Cytolysis. Eds. Griffiths e Tschopp. Springer Verlag, Basileia). Muitos dos membros da super família TNF iniciam uma variedade de respostas celulares necessárias para desencadear respostas inflamatórias e imunes eficazes. 0 TNF é uma proteína transmembranar de tipo 2 (Pennica (1984) Nature 312:724) que é proteolisada para formar a proteína secretada (Black (1997) Nature 385:729), enquanto que a LTa não possui um domínio transmembranar (Gray (1984) Nature 312:721) e é exclusivamente secretada como um homotrímero (nesta forma, era também conhecido como TNFP). Quando expressa como uma proteína de superfície, a LTa está associada a uma proteína de 33 kDa (Androlewicz (1992) J. Biol. Chem. 267:2542), designada LTP (Browning (1993) Cell 72:847), também uma glicoproteína transmembranar do tipo 2, em heterodímeros de proporções de subunidade αβ2 e α2βΐ, (Androlewicz (1992) supra; Browning (1996) J. Biol. Chem. 271:8618). A LTa e o TNF ligam-se e sinalizam através de dois receptores, o receptor de TNF 55-60 kDa (TNFR60; CDl20a ou tipo 1) (Schall (1990) Cell 61:361; Loetscher (1990) Cell 61:351) e o TNFR 75-80 kDa (TNFR80; tipo 2 ou CD120b) (Smith (1990) Science 248:1019). Por contraste, o complexo de superfície ττα1β2 é reconhecido especificamente pelo receptor de ΙΤβ (ΐτβρ) (Crowe (1994) Science 264:707), que não se liga à LTa nem ao TNF (Crowe (1994) supra), ao passo que ambos os TNFRs se ligam ao heterotrímero ΤΤα2β1 (Crowe (1994) supra; Browning (1995) J. Immunol. 154:33).

As deleções genéticas dos genes LTa e ΤΤβ em murganhos revelaram papéis para estes dois genes no desenvolvimento de nódulos linfáticos e placas de Peyer (De Togni (1994) Science 3

264:703; Banks (1995) J. Immunol. 155:1685), e juntamente com TNF e TNFR60, também são citocinas críticas que controlam a formação de centros germinais e a troca de isótipo da imunoglobulina (por exemplo, a produção de igA) durante as respostas imunitárias em adultos (Matsumoto (1996) Science 271:1289; Mariathasan (1995) J. Inflammatíon 45:72). A maioria dos estudos apontaram para ο ΒΤα1β2/ΒΤβκ como o sistema receptor de citocina crítico que controla estas funções (Crowe (1994) Science 264:707; Koni (1997) Immunity 5:491; Ettinger (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 93:13102; Rennert (1996) J. Exp. Med. 184:1999).

Harrop et al. (Journal of Biological Chemistry 273, 27548-27556 (1998)) descrevem o ligando mediador de entrada do herpesvírus (HVEM-L) que é um novo ligando para HVEM/TR2 e estimula a proliferação das células T e inibe o desenvolvimento das células HT29. Zhai et al. (J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)) descrevem LIGHT, um novo ligando para o receptor da linfotoxina β e TR2/HVEM que induz a apoptose e suprime a formação de tumor in vivo por meio de transferência génica. O documento WO 99/11662 descreve um gene que codifica TANGO-69 que é previsto como sendo o homólogo murino do ligando HVEM humano, LIGHT. O documento WO 99/02563 descreve p30 que funciona como um ligando para HVEM. Mauri et al. (Immunity 8, 21-30 (1998)) descrevem que LIGHT, um novo membro da super família TNF e a linfotoxina OC são ligandos para o mediador de entrada do herpesvírus. O documento WO 00/14230 descreve polipéptidos receptores de TANGO-69 e moléculas de ácido nucleico. 4

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é definida nas reivindicações e tem por base a identificação de um polipéptido endógeno que funciona como um ligando para HVEM, que era anteriormente conhecido apenas por ligar-se a HSV gD. Este ligando de ligação ao HVEM, também referido como p30 ou LIGHT, é descrito, bem como sequências de ácido nucleico que codificam p30 e anticorpos que se ligam ao p30.

As utilizações da invenção são úteis para tratar indivíduos com doenças autoimunes. A presente invenção proporciona utilizações para inibir um distúrbio inflamatório num indivíduo de um agente conforme definido nas reivindicações que impede a interacção de p30 (LIGHT) com o seu receptor. 0 indivíduo, tecido ou célula utilizado nos métodos da presente invenção pode ser qualquer indivíduo, tecido ou célula, incluindo uma espécie mamífera, mas é preferencialmente humana. Os agentes devem ser administrados in vivo, ex vivo ou in vitro, dependendo da fonte (por exemplo, organismo inteiro, tecido ou célula). Para a administração in vivo ou contacto, a administração pode ser por métodos sistémicos ou tópicos. 0 agente é um anticorpo anti-p30. A invenção proporciona um método in vitro para inibir uma resposta celular mediada pelo polipéptido p30 que compreende (a) proporcionar uma composição que inibe a ligação de um polipéptido p30 expresso na superfície celular a um HVEM ou ύτβΐΐ expresso na superfície celular e, (b) colocar a célula que expressa o polipéptido p30 expresso na superfície celular ou o HVEM ou LtPr expresso na superfície 5 celular em contacto com uma quantidade da composição suficiente para inibir uma resposta celular mediada pelo polipéptido p30. Numa utilização correspondente, pode colacar-se a célula pode em contacto com a composição in vivo. Em formas de realização alternativas, a resposta celular inibida mediada pelo polipéptido p30 compreende a inibição de uma resposta celular linfocítica, a resposta linfocitica inibida é a proliferação de linfócitos e o linfócito inibido é uma célula efectora patogénica. A resposta linfocitica inibida pode compreender a modulação de um linfoma T ou B ou leucemia ou uma doença autoimune. A doença autoimune pode ser artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico ou miastenia grave. A resposta linfocítica inibida pode compreender a modulação de uma reacção a um transplante. A célula colocada em contacto expressa o polipéptido p30 na sua superfície celular e a composição é um anticorpo anti-p30.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura IA é um par de histogramas obtidos por citometria de fluxo que apresentam a ligação da proteína de fusão HVEM:Fc a células 11-23 D7 depois de activação com PMA (histograma superior) ou PMA e ionomicina (histograma inferior). A Figura 1B é um par de histogramas obtidos por citometria de fluxo que apresentam a ligação da proteína de 6 fusão HVEM:Fc a células T CD4 + humanas normais (histograma superior) e CD8+ (histograma inferior). A Figura 1C é um gráfico de linhas que apresenta a ligação de saturação da proteína de fusão HVEM:Fc a células 11-23.D7 activadas. A Figura 2A é um par de diagramas. 0 diagrama superior é um histograma obtido por citometria de fluxo que mostra que a ligação da proteína de fusão HVEM:Fc a células 11-23.D7 activadas compete pela proteína de fusão LTPR:Fc. 0 diagrama inferior é um gráfico de linhas que apresenta a inibição dose-dependente da ligação da proteína de fusão HVEM:Fc pela proteína de fusão LTPR:Fc. A Figura 2B é um par de diagramas. 0 diagrama superior é um histograma obtido por citometria de fluxo que mostra que a ligação da proteína de fusão HVEM:Fc compete pelo homotrímero LTa. 0 diagrama inferior é um gráfico de linhas que apresenta a inibição dose-dependente da ligação da proteína de fusão HVEM:Fc pelo homotrímero LTa. A Figura 3 é um par de diagramas. 0 diagrama superior é um histograma obtido por citometria de fluxo que mostra que a variante TYR108PHE de LTa de ocorrência natural não compete pela ligação de HVEM:Fc a células 11-23.D7 e o diagrama inferior é um gráfico de linhas que mostra uma análise de ligação de competição de LTa e LTa (Tyrl08PHE). A Figura 4A é um auto-radiograma obtido de uma focagem isoeléctrica bidimensional/gel de SDS-PAGE de um precipitado obtido por meio do tratamento de um extracto de células II-23.D7 activadas com a proteína de fusão mLTPR:Fc. 7 A Figura 4B é um auto-radiograma obtido de uma focagem isoeléctrica bidimensional/gel de SDS-PAGE de um precipitado obtido por meio do tratamento de um extracto de células II-23.D7 activadas com a proteína de fusão TNFR60:Fc A Figura 4C é um auto-radiograma obtido de uma focagem isoeléctrica bidimensional/gel de SDS-PAGE de um precipitado obtido por meio do tratamento de um extracto de células II-23.D7 activadas com a proteína de fusão HVEM:Fc. A Figura 5 é um par de diagramas. 0 diagrama superior é um histograma obtido por citometria de fluxo que mostra que a ligação da proteína de fusão HVEM:F c compete pela glicoproteína HSV gD-1. 0 diagrama inferior é um gráfico de linhas que apresenta a inibição dose-dependente da ligação da proteína de fusão HVEM:Fc pela glicoproteína HSV gD-1. A Figura 6 é um par de gráficos de linhas que mostram que o anticorpo anti-HVEM estimula a proliferação dose-dependente em células T de sangue periférico recém-isoladas (gráfico de linhas superior) e células T de memória (gráfico de linhas inferior). A Figura 7 é um par de diagramas. 0 diagrama superior é um histograma obtido por citometria de fluxo que mostra a expressão de HVEM em células linfoblastóides RAJI. 0 diagrama inferior é um gráfico de linhas que mostra a proliferação dose-dependente de células RAJI em resposta ao anticorpo anti-HVEM. A Figura 8 apresenta um gel de SDS-PAGE corado para proteína que mostra uma banda definida de cerca de 58 kDa, representativa da proteína de fusão mHVEM:Fc, ver Exemplo 6. A Figura 9 é um gráfico que demonstra o efeito da proteína de fusão HVEM:F c sobre o intumescimento nas 8 almofadas plantares em murganhos. Várias concentrações de mHVEM:Fc (12, 60 e 300 pg) foram utilizadas para tratar a inflamação e o intumescimento em murganhos BDFl imunizados com 50 pg de OVA absorvidos em 1 mg de alúmen e inoculados com antigénio, ver Exemplo 7. A Figura 10 apresenta um gráfico da pontuação da CIA para murganhos com artrite induzida por colagénio tratados com PBS, hlgG ou mHVEM:Fc, ver Exemplo 8 adiante. A Figura 11 apresenta a morfologia de fibroblastos dérmicos infectados com HCMV-F a uma MOI de 0,05 e cultivados no presente ou meio com 5 nM de A) LTa, B) LTa + RNFR:Fc, C) LTOCY108F, D) 1Ταΐβ2, E) LIGHT, F) LIGHT-G119E, e G) SÓ vírus. Ver Exemplo 9. A Figura 12 apresenta o efeito antiviral de LIGHT e LTa sobre γ-herpesvírus, MHV68, ín vivo (ver Exemplo 9). A Figura 13 apresenta um gel que demonstra a pureza de LIGHTt66 (A) corado por Coomassie blue ou (B) submetido a Western blot com anti-FLAG (M2) para detectar a proteína recombinante. Os marcadores de peso molecular são apresentados na pista da esquerda. A Figura 14 apresenta vários géis que demonstram que o efeito anti-HCMV de LIGHT e Linfotoxinas são dependentes da activação do NF kb. A Figura 15 apresenta a purificação e a caracterização bioquímica de LIGHT t66 e seus mutantes.

Figura 15 A. Purificação de LIGHTt66-FLAG a partir do sobrenadante de células 293. Painel superior. Gel de SDS PAGE corado com Coomassie (15%). Foram carregados 20 pL por poço. O sobrenadante de partida e o LIGHT t66 purificado por troca iónica apareceram como bandas múltiplas. O LIGHT t66 9 purificado por afinidade apareceu como uma única banda, Mr = 27 kDa. Painel inferior. Western blot corado com anti-FLAG (M2) . Foram carregados 20 pL por poço. LIGHTt66-FLAG foi detectado com Mr = 27 kDa. A intensidade relativa das bandas concordaram com os dados por ELISA o que indica que o LIGHTt66-FLAG foi concentrado x 30 depois do procedimento de troca iónica e x 100 depois da purificação por afinidade. O rendimento final foi de 60-80% do material de partida.

Figura 15B. Purificação dos mutantes de LIGHTt66-FLAG a partir dos sobrenadantes de células 293T. Painel superior. Gel de SDS PAGE corados com prata. Mutantes de LIGHTt66-FLAG produzidos utilizando células 293T conforme descrito. As proteínas marcadas com FLAG foram purificadas por afinidade a partir de sobrenadante de cultura de tecido utilizando o anticorpo monoclonal anti-FLAG M2 acoplado a Affigel™. Foram carregados 100 ng de proteina purificada por poço. Todos os quatro mutantes apareceram como bandas únicas, Mr = 27 kDa. Em algumas preparações uma banda débil adicional Mr = 52 kDa estava presente. Não foram detectadas quaisquer outras proteínas contaminantes. Painel inferior. Western blot corado com anti-FLAG M2. O LIGHTt 66-FLAG e seus mutantes foram detectados com Mr = 27 k. Em alguns casos uma banda fracamente reactiva com Mr = 52 kDa foi também detectada, correspondendo à banda de 52 kDa detectada por coloração com prata. Provavelmente, esta banda é um dímero.

Figura 15C. Reticulação de LIGHTtββ-myc. O LIGHTt66 foi reticulado pela adição de glutaraldeído (0,1%) ou BSCOES (5 nM) por 30 min a 4 °C; a reacção foi parada pela adição de TRIS (20 mM, pH 8,0). As amostras foram analisadas por Western blot utilizando o anticorpo 9E10 (anti-myc). Foram 10 carregados 200 ng por poço. A, LIGHTt66-myc de controlo, B, reticulação com glutaraldeído, C, reticulação com BSCOES. Nas amostras reticuladas foram detectadas bandas de 52 e 76 kDa, correspondente aos Mrs esperados para dímero e trímero.

Figura 15D. Análise de LIGHTt66-FLAG por filtração em gel. LIGHT t66-FLAG e mutantes foram analisados por filtração em gel FPLC numa coluna Superose 12. Painel superior. Fracções da filtração em gel de LIGHTt66-FLAG foram analisadas por ELISA utilizando HVEM:Fc como molécula de captura e anti-FLAG M2 como anticorpo de detecção. LIGHT t6 activo eluído com Mr =76 kDa, o que indica uma molécula homotrimérica. Painel inferior. Dot blot corado com anti-FLAG M2. As fracções da análise de filtração em gel de LIGHTt66-FLAG e mutantes foram adicionalmente analisadas pela técnica dot blot (de cima para baixo, t66, G119E, Y173F, Q117T, L120Q). O material reactivo anti-FLAG só foi detectado naquelas fracções determinadas por ELISA para conter LIGHT homotrimérico, o que demonstra que as preparações não continham monómero livre e nenhuma material agregado. A Figura 16 apresenta gráficos que demonstram que o LIGHT t66 é citotóxico a células HT29.

Figura 16A. Células HT29 foram incubadas com diluições em série de LIGHT t66, ΤΤαΐβ2, ou TNF na presença de IFNy (80 U/mL). Depois de 72 horas a viabilidade celular foi avaliada por ensaio do MTT. O LIGHT t66 inibiu o desenvolvimento de HT29s com eficácia comparável a LTaip2.

Figura 16B. A citotoxicidade de LIGHT t66 é dependente de IFNy. Células HT29 foram incubadas com diluições em série de LIGHT t66 na presença ou na ausência de IFNy (80 U/mL) e ensaio do MTT foi realizado depois de 72 horas. 11

Figura 16C. A citotoxicidade de LIGHT t66 é bloqueada pela co-incubação com LTPR:Fc e HVEM:Fc. 0 LIGHT t66 (200 pM) foi pré-incubado com várias diluições de LTPR:Fc, HVEM:Fc ou Fas:Fc por 30 min antes da adição às células HT29 na presença de IFNy. O ensaio do MTT foi realizado depois de 72 horas. LTpR:Fc e HVEM:Fc, inibiram a citotoxicidade de LIGHT t66 de uma maneira dose-dependente, ao passo que Fas:Fc não afectou a citotoxicidade mediada por LIGHT t66. A Figura 17 são gráficos que apresentam as características de ligação do receptor de LIGHT t66 e seus mutantes. O LIGHTt66-FLAG e mutantes foram analisados por ELISA utilizando os receptores referidos como moléculas de captura e anti-FLAG M2 como anticorpos de detecção. L120Q e Q117T ligam-se a HVEM e LTPR humano com afinidade comparável ou superior a LIGHT t66. G119E ligou-se a HVEM:Fc humano com afinidade reduzida e não demonstrou ligação detectável para LTpR:Fc humano. Y173F ligou-se ao LTpR humano com afinidade reduzida e ligou-se fracamente a G119E. L120Q apresentou afinidade aumentada para HVEM:Fc murino e LtPr:Fc. A ligação de G119E e Y173F a receptores murinos não foi detectada nesse sistema. A Figura 18 apresenta sobreposições de sensogramas que demonstram ressonância de plasmons de superfície. Sobreposições de sensogramas para a ligação de LIGHT t66 e seus mutantes a huHVEM:Fc e huLTpR:Fc a concentração de ligando de 300 nM. A cinética da ligação foi similar para LIGHT t66 e Q117T. G119E e Y173F desassociados de HVEM:Fc com desassociação (off-rate) crescente relativa para LIGHT-t66. 12 Y173F desassociado de huLTPR com uma desassociação crescente, ao passo que G119E não se ligou a este receptor. A Figura 19 apresenta a citotoxicidade celular dos mutantes de LIGHT t66 em células HT29. Células HT29 foram incubadas com diluições em série de LIGHT t66 e seus mutantes na presença de IFNy, um ensaio de MTT foi realizado depois de 72 horas. L120Q e Q117T eram tóxicos para as células HT29 com eficácia comparável a LIGHT t66 (50% de morte celular a 10 μΜ de citocina). Y173F era fracamente tóxico (50% de morte celular a 1 nM de citocina). G199E apresentou citotoxicidade insignificante para estas células. A Figura 20 apresenta o efeito dos anticorpos anti-LTPR e anti-HVEM sobre células HT29.

Figura 20A. Ligação dos anticorpos anti-huHVEM e anti-huLTpR a células HT29. As células foram incubadas com anticorpo primário (5 pg/mL) ou IgG de murganho normal (área cheia) por 30 min a 4 °C, seguido por PE de cabra anti-murganho analisado por citometria de fluxo. Ambos os anticorpos anti-HVEM (CWl e CW8) e ambos os anticorpos anti-LtPr (BDA8 e CDH10) coraram as células.

Figura 20B. Efeito dos anticorpos anti-huHVEM na

ligação de LIGHT a huHVEM. Poços de uma placa ELISA revestidos com huHVEM:Fc (3 pg/mL) foram incubados com várias concentrações do anticorpo policlonal de cabra anti-HVEM ou os anticorpos monoclonais anti-HVEM CWl ou CW8 por 30 min e depois com LIGHT (0,25 nM) por 1 hora antes da detecção de LIGHT ligado com anti-FLAG (M2) monoclonal e IgG-HRP de cabra anti-murganho. O anti-HVEM de cabra e o CW8 inibiram de forma acentuada a ligação de LIGHT a HVEM ao passo que CWl não teve qualquer efeito. 13

Figura 20C. Efeito dos anticorpos anti-LTPR sobre a ligação de LIGHT a huLTPR. A experiência foi conduzida conforme descrito na Figura 20B. 0 anti-LTPR de cabra e anti-LT8R BDA8 monoclonal inibiram de forma acentuada a ligação de LIGHT a LTpR ao passo que o CDH10 não teve qualquer efeito.

Figura 20D. Efeito da reticulação de anticorpo de huHVEM e huLTPR sobre o desenvolvimento de células HT29. Células HT29 foram incubadas com várias doses de anti-HVEM policlonal, anti-LTPR policlonal, ou uma mistura de ambos. Ensaio de MTT foi realizado depois de 72 horas. A reticulação do anticorpos LtPr reduziu, de forma significativa o número de células de uma maneira dose-dependente, ao passo que a reticulação do anticorpo HVEM não teve qualquer efeito. A inclusão do anticorpo policlonal anti-HVEM não teve qualquer efeito sobre a citotoxicidade do anti-LTPR policlonal.

Figura 20E. Efeito do anti-huHVEM policlonal e anti-huLTpR sobre a citotoxicidade mediada por LIGHT. Células Hi29 foram incubadas com 10 pg/mL de anti-huHVEM policlonal de cabra, anti-huLTPR policlonal de cabra, ou os referidos anticorpos monoclonais por 10 min antes da adição de LIGHT (0,25 nM). Ensaio de MTT foi realizado depois de 72 horas em cultura. O LIGHT sozinho resultou em 50% de inibição do desenvolvimento. A inclusão do anti-LTPR policlonal de cabra e do monoclonal 3ηϋ-ΗΤβΒ CDH10 aumentaram de forma acentuada a citotoxicidade mediada por LIGHT, ao passo que o anti-LTPR BDA8 monoclonal teve um ligeiro efeito protector. Anti-huHVEM policlonal de cabra e os anticorpos monoclonais anti-HVEM CWl e CW8 não afectaram a citotoxicidade mediada por LIGHT. 14 A Figura 21 apresenta o efeito de LIGHT t66 sobre a regulação positiva da expressão de ICAM em células NHDF. Células NHDF (60.000/poço) foram incubadas com as referidas concentrações de citocina em 600:1 de meio de cultura de tecido. Depois de 36 horas as células foram analisadas por FACS com o mAb P2A4 (Chemicon International Inc.) para determinar os níveis de superfície de ICAM-1. A indução da expressão representa a fluorescência específica dos poços tratados com citocina em relação a um controlo negativo não tratado. A Figura 22 apresenta recrutamento de TRAF pelos receptores.

Figura 22 A. Co-imunoprecipitação de HVEM e TRAFs marcados com FLAG dos lisados de células T 293 transfectadas. Os complexos de proteína foram precipitados utilizando anticorpos policlonais específicos de rato anti-HVEM. Os imunoblots foram detectados usando anticorpos monoclonais de murganho anti-FLAG.

Figura 22B. Coimuno-precipitações de LTPR e TRAFs marcados com FLAG dos lisados de células T 293 transfectadas. Os complexos de proteína foram precipitados utilizando anticorpos específicos de cabra anti-LTPR. Os imunoblots foram detectados usando anticorpos monoclonais de murganho anti-FLAG. As células foram transfectadas com vectores simples ou com vectores em combinação conforme indicado na figura e descrito nos procedimentos experimentais; pBABE foi incluído como controlo negativo. 15

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO É descrito um novo ligando para HVEM ou p30 e suas variações funcionais e fragmentos. Este novo ligando, que pode ser encontrado com uma proteína de membrana e pode funcionar como uma citocina é também denominado LIGHT, porque este polipéptido é homólogo a Linfotoxinas, exibe expressão .Induzível e compete com a Glicoproteína D do HSV por HVEM, um receptor expresso por linfócitos T. Pelo facto do LIGHT poder competir com a glicoproteína D do HSV por HBEM, as formas solúveis homotriméricas desse polipéptido podem ser utilizadas para bloquear a entrada do herpes vírus nas células. Deste modo, este novo ligando de HVEM pode ser utilizado para tratar ou prevenir as infecções por herpesvírus, tais como β-herpesvírus e citomegalovírus. 0 LIGHT também se liga ao receptor da linfotoxina beta (LTpR). Experiências que envolvem a inibição da ligação de uma proteína de fusão que contém o domínio extracelular do polipéptido relacionado com o receptor do TNF (TNFR), o HVEM, demonstram que as células T humanas tanto malignas como normais expressam o LIGHT, o ligando de superfície celular para o HVEM. A presente invenção é também baseada na constatação de que os polipéptidos HVEM têm um efeito antagonístico sobre a inflamação. Em particular, as proteínas de fusão HVEM são capazes de inibir a inflamação quando administradas a um indivíduo. 16

DEFINIÇÕES

Deve ser observado que, tal como utilizado nesse contexto e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "e" e "o, a" incluem o plural, salvo se o contexto claramente indicar o contrário. Deste modo, por exemplo, referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células.

Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado tal como habitualmente entendidos por um especialista na técnica à qual pertence esta invenção. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados estão descritos adiante.

Tal como utilizado nesse contexto, "inibir" ou "inibição" da actividade é reduzir aquela actividade a uma quantidade mensurável, tal como uma redução de pelo menos 30% ou mais. Onde houver várias actividades diferentes que podem ser inibidas (por exemplo, evitar o recrutamento celular, a produção de mediadores pró-inflamatórios, a entrada celular ou virai, a activação virai, a replicação virai, ou a progressão virai), a redução de qualquer actividade individual (com ou sem as outras actividades) é suficiente para enquadrar-se no âmbito dessa definição. Além disso, onde um ou vários agentes são administrados para inibir a actividade, a redução por um único agente de qualquer actividade individual ou a redução por uma combinação de 17 agentes de qualquer actividade individual é suficiente para enquadrar-se no âmbito dessa definição. Uma "quantidade de inibição de inflamação" significa aquela quantidade de um agente inflamatório necessário para modular, inibir ou suprimir as respostas ou sintomas inflamatórios.

Inflamação A inflamação resulta de inúmeras cascatas ou reacções individuais ou relacionadas causadas por mediadores pró-inflamatórios que incluem citocinas, prostaglandinas, leucotrienos, quimiocinas, moléculas de adesão (por exemplo, LFA-1) e outros conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, os receptores desempenham um papel essencial na permissão da entrada virai para dentro das células. Os ligandos para estes receptores são também importantes. Os ligandos, juntamente com os mediadores pró-inflamatórios tais como as citocinas são os principais estimuladores das células mas também desempenham outro papel na amplificação das cascata inflamatória. Estes mediadores inflamatórios solúveis são derivados principalmente das células T CD8+. Uma vez produzidos os mesmos podem actuar de uma maneira parácrina e autócrina para activar adicionalmente as células na sua vizinhança e recrutar células T para o local da inflamação. Estes linfócitos adicionais são, eles próprios activados, o que contribui para a amplificação da cascata inflamatória. Tal como utilizado nesse contexto, actividade imunossupressora refere-se à inibição ou diminuição da capacidade das células B e T de reagirem ou serem recrutadas ou se tornarem activadas para um local de inflamação. 18

Outros sinais que activam as células inflamatórias incluem ligação de um receptor de adesão, por exemplo, LFA-1 (CDlla e CD18) a um dos seus contra-receptores, tais como ICAM-1 (CD54) (Staunton et al., 1990, Cell 61:243-254). Se o segundo sinal for bloqueado, as células T especificas para antigénio são induzidas a morrer por apoptose ou a entrar num estado de anergia celular. O bloqueio dessa interacção por anticorpos monoclonais a LFA-1 e ICAM-1 resulta num tempo de sobrevida aumentado para os murganhos que recebem um aloenxerto do coração (Isobe (1992) Science 255: 1125-1 127). Em concordância, as composições e métodos da invenção podem ser utilizados sós ou em combinação com outros agentes anti-inflamatórios incluindo fármacos anti-inflamatórios não esteróides, esteróides, antagonistas do receptor e outros facilmente identificáveis na técnica.

Tal como utilizado nesse contexto, "inflamação" significa o processo ou série de eventos que são suscitados por inúmeros estímulos (por exemplo, agentes infecciosos, isquemia, interacções antigénio-anticorpo e lesões térmicas ou outras lesão físicas). A inflamação é caracterizada por um aumento em eritema, edema, sensibilidade (hiperalgesia) e dor no local inflamado. Uma reacção ou cascata inflamatória é geralmente reconhecida como tendo uma variedade de etapas distintas, por exemplo, vasodilatação e aumentada permeabilidade capilar; uma infiltração de leucócitos e fagócitos; e uma etapa de degeneração de tecido e fibrose. Tal como utilizado nesse contexto, um "distúrbio inflamatório" significa qualquer número de doenças caracterizadas como tendo parte da sua patogénese uma cascata 19 ou reacção inflamatória que resulta em inflamação. Tais distúrbios incluem, por exemplo, artrite, psoriase, doença inflamatória do intestino, agentes infecciosos tais como herpes e outros conhecidos dos especialistas na técnica.

Experiências que envolvem a inibição da ligação de uma proteína de fusão contendo o domínio extracelular do polipéptido relacionado com o receptor do TNF (TNFR), HVEM, demonstraram que as células T humanas, tanto malignas como normais, expressavam um ligando de superfície celular para HVEM. Experiências de inibição competitiva demonstraram que o ligando HVEM tem características em comum com os heterotrímeros ΕΤαβ e LTOC, mas também tem características que o distinguem de ΕΤαΐβ2 e TNF: Deste modo, ο ΕΤα2βΐ poderia ser um suposto ligante de superfície reconhecido por HVEM, com a advertência de que o local de ligação de HVEM em ΕΤα2βΐ não é o mesmo que TNFR60. Alternativamente, o HVEM pode reconhecer um novo ligando. Uma abordagem bioquímica foi utilizada para distinguir entre estas possibilidades.

Estudos de imunoprecipitação e electroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) demonstraram a presença de um novo ligando polipeptídico de 30 kDa (p30) para HVEM na superfície de células T que era antigenicamente distinto tanto de ΤΒβ como ΤΒα. A purificação por cromatografia de afinidade e a electroforese bidimensional mostraram que o p30 é também fisicamente distinto de ΤΒα e ΤΒβ uma vez que tem um peso molecular de 30 kDa e um pi de cerca de 7 - 8,5 (Figura 4C) . Além disso, estes estudos demonstraram que o p30 activo (por exemplo, a 20 sua forma trimérica) é também reconhecido por LtPr, mas não por TNFR. O polipéptido p30 é também referido como LIGHT na literatura recente (ver, por exemplo, Mauri et al., Immunity, 8 (1):21-30 (Jan. 1998)) .

Experiências de inibição de ligação demonstraram que o gD-1 solúvel (gD de HSV-1) e um mutante de gD-1, gD-1 (Δ 290 - 299t) ligam-se ao HVEM, mas não ao LtPr ou TNFR60. Este resultado sugere que o gD-Ι co-evoluiu especificamente para ligação ao HVEM, embora o HVEM se ligue a ligandos que são reconhecidos por TNFR60 e LtPr. Além disso, as constatações indicam que o gD-Ι é uma virocina ancorada em membrana das linfotoxinas e podem modular as actividades de sinalização do HVEM durante a entrada ou a saida do HSV da célula infectada.

Estudos de cultura de células in vitro demonstram que o anticorpo anti-HVEM aumentou a proliferação de células T virgens e de memória. Experiências similares indicaram que a sinalização através de HVEM proporcionou um estimulo de activação para as células B e que um estimulo positivo, sem um estimulo negativo de contrapartida por meio do TNFR, pode ser uma propriedade especifica do ligando HVEM p30. Estes resultados indicam que é possível que as funções fisiológicas do ligando HVEM sejam distintas do TNF e ΐταΐβ2. A identificação de um novo ligando de 30 kDa para HVEM levanta a possibilidade de que este ligando pode ser responsável por respostas fisiológicas anteriormente atribuídas a LTa ou ΐτβ. As constatações aqui apresentadas proporcionam uma compreensão mais profunda do sistema de citocina lt/tnf e herpes vírus que sugere novas abordagens para controlar estas 21 citocinas em processos de doenças bem como para afectar a inflamação devido a infecção e lesão.

Juntos, os resultados indicam que os antagonistas e agentes de ligação tais como, por exemplo, as proteinas de fusão Fc que contêm HVEM ou ΒΤβκ modularão a acção da LTa e do ligando HVEM de 30 kDa, o p30. Os resultados também indicam que os antagonistas e agentes de ligação (por exemplo, os anticorpos e proteinas de fusão da invenção (por exemplo HVEM:Fc)) são também úteis na modulação da inflamação e respostas inflamatórias. Tal como discutido acima, a ligação ao HVEM activa as células B e, deste modo, uma modulação na interacção do HVEM com o seu ligando reduz a activação das células inflamatórias e a activação da cascata inflamatória. De modo similar, a proteína de fusão HVEM poderia ser utilizada para identificar inibidores específicos dos complexos ligando-receptor, tais como anticorpos monoclonais ou péptidos ou pequenos compostos orgânicos. Os inibidores das interacções de p30 ou LTa com HVEM, ou das interacções de p30 com LtPr, poderiam ser utilizados para modular doenças em que ocorrem a proliferação indesejada de linfócitos, incluindo linfomas T e B ou leucemias ou em doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, miastenia grave e inflamação, por exemplo, artrite, psoríase, doença inflamatória do intestino, asma e outras conhecidos na técnica.

De modo similar, o herpesvírus gD-1 poderia ser utilizado para inibir reacções imunes em que as sinalizações 22 de LTOC, p30 e HVEM estão implicadas como moléculas efectoras. A LTOC ou formas solúveis do ligando HVEM de 30 kDa (geradas pela deleção dos seus domínios citoplasmáticos e transmembranares previstos, por exemplo, LIGHT-t66 descrito adiante) podem funcionar como inibidores de infecção virai incluindo, por exemplo, infecção por Herpes viridae (por exemplo, alfa-herpes viridae, beta-herpes viridae e gama-herpes viridae) e recrudesce por bloqueio a capacidade do vírus de entrar numa célula alvo.

Como os TNFRs, o hvem tem uma especificidade de ligando dupla, ligando-se a LTOC e a forma trimérica (por exemplo, a forma de 90 kD) de LIGHT, uma forma ligada à membrana do ligando, p30. A mutação LTa Tyrl08Phe destrói a ligação HVEM como o faz para TNFR60 e TNFR80. A inabilidade de TNFR60 de bloquear a ligação de HVEM à superfície da forma de 30 kDa indica que 1Τα2βΐ de superfície não é um ligando de HVEM.

Além disso, o LIGHT (p30) difere de LTa porque é antigenicamente distinto e permanece associado à célula, ao contrário do LTa que é exclusivamente segregado. Deste modo, prevê-se que a proteína de ligação ao HVEM (p30) contenha um trecho de resíduos hidrofóbicos que formam um domínio transmembranar disposto como uma configuração de transmembrana tipo II similar a outras proteínas relacionadas ao TNF. Isto não exclui a possibilidade de que o p30 também possa ser modificado de outras maneiras (por exemplo, modificação lipídica) para permitir ligação à superfície da célula. Além disso, esta proteína deve compartilhar regiões 23 de homologia de sequência com LT(X e ΐτβ e citocinas relacionadas que definem esta super família e contêm um domínio extracelular C-terminal de aproximadamente 150-160 resíduos.

As constatações dos inventores também indicam que o HVEM é um receptor específico para LTa, uma propriedade que claramente o distingue dos receptores de ligação ao TNF, TNFR60 e TNFR80. Esta propriedade permitirá que uma proteína de fusão HVEM ou proteína similar antagonize a LTa especificamente sem inibir as funções do TNF ou ΤΤαΐβ2. São descritos antagonistas e agentes de ligação, tais como, por exemplo, um LIGHT homotrimérico solúvel ou um polipéptido de fusão HVEM. O polipéptido de fusão HVEM pode ser caracterizado como tendo um peso molecular de cerca de 58 kDa conforme determinado por SDS-PAGE redutor, conforme demonstrado na Figura 8, ver Exemplo 6. É além disso descrito um LIGHT ou polipéptido p30 substancialmente puro. O polipéptido p30 é caracterizado como tendo um peso molecular previsto de 30 kDa conforme determinado por SDS-PAGE redutor e um pi na gama de cerca de 7-8,5 (Figura 4C) . O p30 existe em menos de dez, tal como menos de oito, particularmente menos de seis (por exemplo, três, quatro ou cinco) formas isoméricas. É também descrito LIGHT ou p30 como um homotrímero. Conforme demonstrado nos exemplos, adiante, o p30 pode ser expresso como um homotrímero e, quando expresso como uma forma recombinante, truncada, solúvel, é segregado exclusivamente como um 24 homotrímero. 0 polipéptido LIGHT pode ser ligado a células, isto é, não é segregado. Na sua forma de superfície celular, o p30 liga-se a HVEM e LTpR. 0 termo "substancialmente puro", tal como utilizado nesse contexto, refere-se ao polipéptido que é substancialmente livre de outras proteínas, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais é naturalmente associado. Um especialista na técnica pode purificar tais polipéptidos e proteínas de fusão utilizando técnicas padrão para purificação de proteínas (ver, por exemplo, Protein Purification, Principies and Practice, 2a Edição (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.). Por exemplo, um polipéptido HVEM:Fc substancialmente puro produzirá uma banda principal única de cerca de 58 kDa num gel de SDS-PAGE redutor. 0 polipéptido LIGHT p30 produzirá uma banda principal única de cerca de 30 kDa num gel de SDS-PAGE redutor; na sua forma homotrimérica, o mesmo forma uma banda principal única de cerca de 90 kDa num gel não redutor (que não perturba a estrutura terciária trimérica). É descrito um polipéptido de fusão funcional e seus fragmentos funcionais. Tal como utilizado nesse contexto, o termo "polipéptido funcional" refere-se a um polipéptido que possui uma função biológica ou outra actividade, tal como a capacidade de ligar-se a um receptor, que pode ser identificado através de encaminhamento e ensaios de ligação ao receptor e funcionais definidos (ver, por exemplo, o Exemplo adiante), e que, por exemplo, estão associados a alterações biológicas, morfológicas ou fenotípicas 25 particulares na célula ou eventos de ligação, tais como a capacidade de um polipéptido LIGHT solúvel da invenção de bloquear a entrada de um herpesvirus. "Fragmentos funcionais", tal como utilizado nesse contexto, incluem subsequências dos polipéptidos da invenção que têm uma função biológica, tal como descrito acima. Por exemplo, os polipéptidos de fusão podem incluir fragmentos de, por exemplo, LIGHT ou HVEM. Exemplos são fragmentos de HVEM e uma segunda sequência de polipéptido desde que permaneça uma actividade substancialmente a mesma que a de HVEM:Fc, por exemplo, a modulação das respostas celulares pela inibição da ligação de HSV a HVEM, antigenicidade ou inibição de inflamação. São descritos péptidos mais pequenos que contêm a actividade biológica de HVEM ou polipéptidos de fusão HVEM. Um especialista na técnica pode testar quanto à actividade funcional de tais polipéptidos por meio de métodos padrão, por exemplo, ensaio de redução da placa virai ou ensaios de activação celular incluindo ensaios de produção de citocina e medição de respostas inflamatórias tal como descrito nos Exemplos. De modo similar, os fragmentos funcionais de p30 podem ser determinados através de um ensaio funcional definido e que está associado com uma alteração biológica, morfológica ou fenotípica particular na célula. São também descritos polipéptidos com pequenas modificações das sequências de aminoácidos primários do LIGHT (p30), HVEM ou proteínas de fusão (por exemplo, p30 de proteína de fusão HVEM). Isto pode resultar em proteínas que têm actividade substancialmente equivalente, por exemplo, em comparação com o p30, o LlGHT-t66 e outros mutantes descritos 26 adiante; e o polipéptido HVEM:Fc, tal com aqui descrito. Tais modificações pode ser especificamente modificadas, por exemplo, como geradas por mutagénese sítio-dirigida. Alternativamente, podem ser mutações espontâneas. Os polipéptidos produzidos por estas modificações são considerados desde que a ligação ou actividade biológica de LIGHT (p30) ou HVEM:F c esteja presente, por exemplo, a modulação das respostas celulares, por ligação ao HVEM e LtPr ou inibição da ligação do HSV ao HVEM ou modulação da inflamação. Além disso, a delação de um ou mais aminoácidos também pode resultar numa modificação da estrutura da molécula resultante sem alterar a sua actividade de forma significativa (por exemplo, LIGHT-t66, ver adiante). São também descritos LIGHT (p30) mais pequenos, activos (isto é "funcionais"), que incluem formas truncadas, solúveis homotriméricas e moléculas de HVEM que têm utilizadas alternativas. Por exemplo, os aminoácidos do terminal amino ou carboxilo que não são necessários para actividade podem ser removidos. Por exemplo, o polipéptido de fusão HVEM:Fc (descrito adiante) é caracterizado como tendo os aminoácidos 1 a 205 de HVEM. Outro exemplo inclui uma proteína p30 truncada solúvel homotrimérica, a LlGHT-t66, descrita em pormenor no Exemplo 12, diante.

Os polipéptidos também incluem variações conservadoras, miméticos e peptidomiméticos da sequência do polipéptido. O termo "variação conservadora", tal como utilizado nesse contexto indica a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar. Exemplos de variações conservadoras incluem a substituição de um resíduo 27 hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina e outros. 0 termo "variação conservadora" também inclui a utilização de um aminoácido substituído em vez de um aminoácido progenitor não substituído desde que os anticorpos produzidos para o polipéptido substituído também imuno-reajam com o polipéptido não substituído.

Os termos "mimético" e "peptidomimético" referem-se a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais dos polipéptidos, por exemplo, domínios de translocação ou domínios de ligação ao ligando odorante ou receptores quiméricos da invenção. 0 mimético pode ser totalmente composto de análogos sintéticos, não-naturais de aminoácidos ou é uma molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturais e parcialmente análogos não-naturais de aminoácidos. 0 mimético também pode incorporar qualquer quantidade de substituições conservadoras de aminoácidos naturais desde que tais substituições também não alterem, de forma substancial, a estrutura e/ou actividade do mimético. Como com os polipéptidos da invenção que são variantes conservadoras, a experimentação de rotina determinará se um mimético é útil, isto é, que a sua estrutura e/ou função não está substancialmente alterada. As composições de polipéptidos miméticos podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não-naturais, que são tipicamente de três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo que 28 não sejam as ligações de amida natural ("ligação peptídica"); b) resíduos não-naturais em vez de resíduos de aminoácidos de ocorrência natural; ou c) resíduos que induzem mimetismo estrutural secundário, isto é, para induzir ou estabilizar uma estrutura secundária, por exemplo, uma conformação volta beta, volta gama, folha beta, hélice alfa e outras. Um polipéptido pode ser caracterizado como um mimético quando alguns ou todos os seus resíduos são unidos por meios químicos que não sejam as ligações peptidicas naturais. Os resíduos peptidomiméticos individuais podem ser unidos por ligações peptidicas, outras ligações químicas ou meios de acoplamento, tais como por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidoxisuccinimida, maleimidas bifuncionais, N,Ν'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) ou N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) . Os grupos de ligação que podem ser uma alternativa às ligações de amida tradicional ("ligação peptídica") incluem, por exemplo, cetometileno (por exemplo, -C(=0)CH2- para -C(=0)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-0), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida ou éster (ver, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone

Modifications", Marcell Dekker, NY) . Um polipéptido também pode ser caracterizado como um mimético por conter todos ou alguns resíduos não-naturais em vez de resíduos de aminoácidos de ocorrência natural; os resíduos não-naturais estão descritos na literatura científica e de patente.

Os antagonistas e agentes de ligação da invenção são anticorpos para p30 (LIGHT). 29

As proteínas de fusão incluem a sequência completa de polipéptido de HVEM bem como fragmentos da sequência que podem excluir sequências de péptidos. De modo similar, o polipéptido LIGHT (p30) da invenção inclui o p30 completo, formas homotrímeras, proteínas de fusão que compreendem a sequência de p30, bem como fragmentos da sequência que podem excluir certos aminoácidos, péptidos ou sequências e formas homo ou hetero ou triméricas desses fragmentos, tais como, por exemplo, LIGHT-t66, tal como descrito adiante. Tais fragmentos podem ser úteis na criação dos anticorpos da invenção, incluindo anticorpos policlonais e monoclonais.

Por exemplo, tais sequências excluídas podem incluir fragmentos que não têm a região do terminal carboxilo do polipéptido HVEM completo. Além disso, os polipéptidos de fusão podem incluir uma sequência de polipéptido HVEM ou um seu fragmento. A "segunda" sequência de polipéptido da proteína de fusão pode ser qualquer polipéptido desejado a ser ligado a uma sequência de polipéptidos da invenção (por exemplo, sequência de p30 ou HVEM) desde que o p30/HVEM:segunda proteína de fusão do polipéptido retenha uma ligação (por exemplo, bloqueio do vírus ou ligação ao receptor) ou actividade biológica que é substancialmente similar à ligação (por exemplo, aos receptores) ou actividade biológica de uma p30:Fc ou HVEM:Fc (por exemplo, inibe ou modula a inflamação). A identificação e a determinação das segundas sequências de polipéptido úteis na presente invenção são 30 prontamente identificáveis por um especialista na técnica: por exemplo, um especialista na técnica pode determinar se uma construção de fusão retém a ligação do receptor desejado ou a actividade biológica por meio da utilização dos métodos e técnicas descritos nos Exemplos adiante. São também descritas sequências de ácidos nucleicos isoladas ou polinucleótidos que codificam o polipéptido da invenção. Os ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipéptidos, fragmentos, modificações e proteínas de fusão acima mencionados são também descritos. Deste modo, o termo "isolado", tal como utilizado nesse contexto, inclui polinucleótidos substancialmente livres de outros ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais são naturalmente associados. As sequências de polinucleótidos incluem sequências de ADN, ADNc e ARN que codificam antagonistas, agentes de ligação ou um polipéptido de fusão da invenção. Por exemplo, entende-se que todos os polinucleótidos que codificam todo ou uma porção do LIGHT ou HVEM ou seus polipéptidos de fusão são também aqui incluídos, desde que os mesmos codifiquem um polipéptido com actividade LIGHT:Fc ou HVEM:Fc, tal como aqui descrito. Tais polinucleótidos incluem polinucleótidos de ocorrência natural (isolados), recombinantes, sintéticos e intencionalmente manipulados. Por exemplo, porções da sequência de ARNm podem ser alteradas devido a padrões de splicing de RNA alternado ou a utilização de promotores para transcrição de arn. Como outro exemplo, o polinucleótido pode ser submetido à mutagénese sítio-dirigida. Os polinucleótidos da invenção incluem sequências que são degeneradas como resultado do 31 código genético. Há 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um codão. Desse modo, todas as sequências de nucleótidos degeneradas são consideradas, desde que a sequência de aminoácidos de LIGHT ou HVEM e (no caso de uma proteína de fusão) um segundo polipéptido codificado pela sequência de nucleótido estejam funcionalmente inalterados.

Os ácidos nucleicos compreendem sequências que codificam um polipéptido da invenção, um antagonista, um agente de ligação ou uma proteína de fusão (por exemplo, LIGHT:Fc ou HVEM:Fc), bem como fragmentos de LIGHT ou HVEM de ocorrência natural e qualquer sequência de nucleótido que pode hibridar ao complemento dessas sequências em condições restringentes. São também descritas variantes geradas desses em condições restringentes. São também descritas variantes degeneradas dessas sequências tanto para p30 como para os polipéptidos da invenção. Por exemplo, os ácidos nucleicos de LIGHT p30 incluem sequências que codificam p30 de ocorrência natural e quaisquer sequências de nucleótidos que hibridam com a sequência complementar das sequências em condições restringentes tal como aqui descrito. A expressão "condições restringentes" refere-se a condições de hibridação ou lavagem sob as quais um ácido nucleico, por exemplo, um ácido nucleico da amostra ou uma sonda hibridará principalmente com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácido nucleico, mas a nenhumas outras sequências em quantidades significativas. Um sinal positivo (por exemplo, a identificação de um ácido 32 nucleico da invenção) é cerca de 10 vezes a hibridação de fundo. As condições de restringência são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas mais altas. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssem, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) . De um modo geral, as condições restringentes são seleccionadas para serem cerca de 5-10 °C menos do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica a uma resistência iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob resistência iónica, pH, e concentração de ácido nucleico definidos) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridam à sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio).

Condições restringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M ião sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de ião sódio (ou outros sais) ao pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleótidos) . As condições restringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida.

Condições restringentes de hibridação que podem ser utilizadas para identificar os ácidos nucleicos no âmbito da 33 invenção podem incluir hibridação num tampão que compreende 50% de formamida, 5x SSC e SDS a 1% a 42 °C, ou hibridação num tampão que compreende 5 x SSC e SDS a 1% a 65 °C, ambos com uma lavagem de 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C. Condições restringentes de hibridação exemplificativas também podem incluir uma hibridação num tampão de formamida a 40%, NaCl 1 M e SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em 1 x SSC a 45 °C. Alternativamente, a hibridação ao ADN ligado ao filtro em NaHP04 0,5 M, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, EDTA 1 mM a 65 °C e lavagem em 0,lx SSC/ SDS a 0,1% a 68 °C pode ser utilizada para identificar e isolar ácidos nucleicos no âmbito da invenção. Os especialistas na técnica reconhecerão prontamente que condições de hibridação e lavagem alternativas mas comparáveis podem ser utilizadas para proporcionar condições similares de restringência.

No entanto, a selecção de um formato de hibridação não é determinante, como é conhecido na técnica, é a restringência das condições de lavagem que estabelece as condições que determinam se um ácido nucleico está enquadrado no âmbito da invenção. As condições de lavagem utilizadas para identificar os ácidos nucleicos no âmbito da invenção incluem, por exemplo, uma concentração de sal de cerca de 0,02 molar ao pH 7 e uma temperatura de pelo menos cerca de 50 °C ou cerca de 55 °C a cerca de 60 °C; ou uma concentração de sal de cerca de NaCl 0,15 M a 72 °C por cerca de 15 minutos; ou, uma concentração de sal de cerca de 0,2X SSC a uma temperatura de pelo menos cerca de 50 °C ou cerca de 55 °C a cerca de 60 0 C por cerca de 15 a cerca de 20 minutos; ou o complexo de hibridação é lavado duas vezes com uma 34 solução com uma concentração de sal de cerca de 2X SSC contendo SDS a 0,1% à temperatura ambiente por 15 minutos e depois lavado duas vezes por 0,lx SSC contendo SDS a 0,1% a 68 °C por 15 minutos; ou condições equivalentes. As condições restringentes de lavagem também podem ser 0,2X SSC/SDS a 0,1% a 42 °C. Nos casos em que as moléculas de ácido nucleico são desoxioligonucleótidos ("oligos"), as condições restringentes podem incluir lavagem em 6X SSC/pirofosfato de sódio a 0,05% a 37 °C (para oligos de 14 bases), 48 °C (para oligos de 17 bases), 55 °C (para oligos de 20 bases), e 60 °C (para oligos de 23 bases). Ver Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1997), ou Tijssen (1993) supra, para descrições pormenorizadas de hibridação e condições de lavagem equivalentes e para reagentes e tampões, por exemplo, tampões SSC e reagentes e condições equivalentes.

Estas moléculas de ácido nucleico podem codificar ou actuar como moléculas anti-sentido p30, úteis, por exemplo, na regulação do p30 (para e/ou como iniciadores anti-sentido nas reacções de amplificação das sequências de ácido nucleico de p30). Além disso ainda, tais moléculas podem ser utilizadas como componentes de métodos de rastreio em que, por exemplo, a presença de um gene p30 pode ser detectada.

Para além das sequências de nucleótidos acima descritas, o ADNc completo ou sequências genómicas podem ser identificados e prontamente isolados, sem experimentação 35 indevida, por meio de métodos de biologia molecular conhecidos na técnica.

As sequências de ADN podem ser obtidas por meio de vários métodos. Por exemplo, o ADN pode ser isolado utilizando técnicas de hibridação ou assistidas por computador que são conhecidos na técnica. Estas incluem, mas não são limitadas a: (a) hibridação de bibliotecas de ADNc ou genómicas com sondas para detectar sequências de nucleótidos homólogas; (b) rastreio de anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de ADN clonados com características estruturais compartilhadas; (c) reacção em cadeia da polimerase (PCR) em ADN ou ADNc genómico utilizando iniciadores capazes de emparelhamento à sequência de ADN de interesse; (d) pesquisas por computador de bases de dados para sequências similares; (e) rastreio diferencial de uma biblioteca de ADN subtraída; e (f) sequenciação genómica em grande escala por etiquetas de sequência expressa (EST) de uma biblioteca de ADNc de célula T. Preferencialmente, os polinucleótidos (por exemplo, o polinucleótido p30, e o polinucleótido de HVEM:proteína de fusão) são derivados de um organismo de um mamífero.

Os procedimentos de rastreio que dependem da hibridação do ácido nucleico possibilitam isolar qualquer sequência genética de qualquer organismo, desde que a sonda apropriada esteja disponível. As sondas nucleotídicas, que correspondem a uma parte da sequência que codifica a proteína em questão, podem ser quimicamente sintetizadas. Isto exige que trechos curtos de oligo-péptidos da sequência de aminoácidos têm de 36 ser conhecidos. A sequência de ADN que codifica a proteína pode ser deduzida do código genético, no entanto, a degenerescência do código tem de ser levada em conta. É possível realizar uma reacção de adição mista quando a sequência é degenerada. Isto inclui uma mistura heterogénea de ADN desnaturado de cadeia dupla. Para tal rastreio, a hibridação é realizada, de preferência em ADN de cadeia simples ou ADN de cadeia dupla desnaturado. A hibridação é particularmente útil na detecção de clones de ADNc derivados de fontes onde estão presentes uma quantidade extremamente baixa de sequências de ARNm relacionadas ao polipéptido de interesse. Em outras palavras, ao utilizar condições restringentes de hibridação dirigidas no sentido de evitar ligação não específica, é possível, por exemplo, permitir a visualização auto-radiográfica de um clone de ADNc específico pela hibridação do ADN alvo àquela sonda única na mistura que é o seu complemento completo (Wallace et al. (1981) Nucl. Acid Res., 9:879). Alternativamente, uma biblioteca subtractiva, é útil para a eliminação de clones de ADNc não específicos.

Quando toda a sequência de resíduos de aminoácidos do polipéptido desejado não é conhecida, não é possível a síntese directa das sequências de ADN e o método de eleição é a síntese das sequências de ADNc. Entre os procedimentos padrão para isolar as sequências de ADNc de interesse está a formação de bibliotecas de ADNc portadoras de plasmídeos ou fagos que são derivadas da transcrição reversa do ARNm que é abundante em células dadoras que têm um alto nível de expressão genética. Quando utilizados em combinação com a 37 tecnologia de reacção em cadeia da polimerase, mesmo produtos de expressão raros podem ser clonados. Nesses casos em que porções significativas da sequência de aminoácidos do polipéptido são conhecidas, a produção de sequências de sonda de ADN ou ARN de cadeia simples ou dupla marcadas que duplicam uma sequência supostamente presente no ADNc alvo pode ser utilizada em procedimentos de hibridação de ADN/ARN que são levadas a cabo em cópias clonadas do ADNc que foram desnaturadas numa forma de cadeia simples (Jay, et al., (1983) Nucl. Acid Res., 11:2325). Sondas oligonucleotidicas e iniciadores apropriados podem ser construídos pela "retro-tradução" da sequência de aminoácidos do polipéptido p30 obtido pela sequenciação do aminoácido do N-terminal. A biblioteca de expressão de ADNc, tal como lambda gtll, pode ser rastreada indirectamente quanto a péptidos p30 que têm pelo menos um epítopo, utilizando anticorpos específicos para p30. Tais anticorpos podem ser policlonalmente ou monoclonalmente derivados e utilizados para detectar o produto de expressão indicativo da presença do ADNc de p30.

Alterações no ácido nucleico de p30 incluem mutações intragénicas (por exemplo, mutações pontuais, nonsense (paragem), missense, local de splice e frameshift) e deleções heterozigóticas ou homozigóticas. As deleções de tais alterações podem ser realizadas por meio de métodos conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo análise de sequência, análise por Southern blot, análises com base em PCR (por exemplo, PCR multiplex, marcadores moleculares 38 sequence tagged sites (STSs)) e hibridação in situ. Tais proteínas podem ser analisadas por SDS-PAGE padrão e/ou análise por imunoprecipitação e/ou análise por Western blot, por exemplo. São descritos vectores de ADN que contêm qualquer uma das sequências anteriores que codificam o p30 e/ou seus complementos (isto é, anti-sentido) e vectores de expressão que contêm qualquer uma das sequências anteriores que codificam o p30. São também descritos vectores de ADN que contêm qualquer um dos polipéptidos de fusão anteriores e/ou seus complementos e vectores de expressão que contêm qualquer uma das sequências codificadoras anteriores. Um vector de expressão é composto ou contém um ácido nucleico no qual uma sequência de polipéptido que codifica um péptido ou polipéptido da invenção está operativamente ligada a um promotor ou combinação de intensificador-promotor. Um promotor é um elemento regulador transcricional composto de uma região de uma molécula de ADN tipicamente a uma distância de 100 pares de nucleótidos em frente (a montante) do ponto no qual começa a transcrição. Outro elemento regulador transcricional é um intensificador (enhancer) . Um intensificador proporciona especificidade em termos de tempo, local e nível de expressão. Ao contrário de um promotor, um intensificador pode funcionar quando localizado em distâncias variáveis do local da transcrição, desde que um promotor esteja presente. Um intensificador também pode estar localizado a jusante do local de iniciação da transcrição. 39

Uma sequência codificadora de um vector de expressão está operativamente ligada a uma região de terminação da transcrição. Para ter uma sequência codificadora sob o controlo de um promotor, é necessário posicionar o local de iniciação de tradução do quadro de leitura translacional do péptido ou polipéptido entre um e cerca de cinquenta nucleótidos a jusante (3') do promotor. Tais elementos reguladores incluem, mas não são limitados ao gene precoce imediato do citomegalovirus hCMV, os promotores precoces ou tardios do adenovirus SV4 0, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, as principais regiões operadoras e promotoras do fago A, as regiões de controlo da proteina de revestimento fd, o promotor para cinase de 3 fosfoglicerato, os promotores da fosfatase ácida e os promotores dos factores de acasalamento da levedura V.

Os vectores de expressão e métodos para a sua construção são conhecidos dos especialistas na técnica. Os vectores adequados incluem plasmideos e vectores virais tais como herpes virus, retrovirus, virus da variola do canário, adenovirus e virus adeno-associados, entre outros. São também descritas linhagens de células hospedeiras transfectadas com vectores de expressão que contêm as sequências de ácido nucleico descritas. As células a serem utilizadas para transfecção incluem, mas não são restritas a células HEK293 de origem mamífera ou células de insectos Sf9 e TN5, por exemplo, para a expressão de um polipéptido de fusão da invenção nas suas várias formas naturais ou modificadas. As células são transfectadas por meio de uma 40 variedade de métodos habitualmente utilizados na técnica, por exemplo, electroporação ou precipitação de fosfato de cálcio. Os genes também podem ser introduzidos nas células por meio de transdução com vectores virais, por exemplo, retrovírus. Linhagens celulares transfectadas com sucesso são seleccionadas por meios apropriados conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, utilizando meio de cultura de tecido suplementado com um fármaco tal como Geneticin™ (G418) ou puromicina, por exemplo, para o qual o vector de expressão relevante contém um gene de resistência. As linhas celulares transfectadas com sucesso são expressões rastreadas das moléculas de fusão por meio de uma variedade de métodos possíveis, por exemplo, análise por citometria de fluxo. "Células hospedeiras" são células nas quais um vector pode ser propagado e seu ADN expresso. O termo também inclui qualquer progénie da célula hospedeira em questão. Deve ser entendido que toda progénie pode não ser idêntica à célula progenitora uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante a replicação. No entanto, tais progénies são incluídas quando o termo "células hospedeira" é utilizado.

Os anticorpos a serem utilizados de acordo com a invenção especificamente reconhecem epítopos antigénicos numa sequência de aminoácidos de p30 ou HVEM. Estes anticorpos incluem, mas não são limitados a anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, humanos, anticorpos humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 e fragmentos ligados ao epítopo de 41 qualquer um dos acima mencionados. Tais anticorpos podem actuar como antagonistas ou agentes de ligação na modulação de uma reacção inflamatória. Por exemplo, os anticorpos para p30 podem actuar por interacção com p30 e evitar a ligação de p30 ao seu receptor. De modo similar, os anticorpos que se ligam ou interagem com HVEM também podem actuar para evitar a ligação do HVEM com o seu ligando (por exemplo, p30).

Os anticorpos são para serem utilizados, por exemplo, no tratamento de doenças autoimunes e malignidades linfociticas. Os mesmos também podem ser utilizados para testar quanto à expressão de p30 numa célula e, deste modo, podem utilizados como parte de um procedimento de rastreio para seleccionar um tratamento apropriado para um indivíduo particular. Por exemplo, se as células tumorais de um doente com linfoma ou leucemia expressam p30, anticorpos anti-p30 ou conjugados de imunotoximas de anticorpos anti-p30 ou conjugados de imunotoxinas de anticorpos anti-p30 podem ser utilizados naquele doente.

Para a produção de anticorpos, um animal hospedeiro é imunizado por injecção com o polipéptido de fusão, os polipéptidos individuais que compreendem um polipéptido de fusão (por exemplo, HVEM), com células que expressam o polipéptido de fusão ou o polipéptido p30. Alternativamente, os péptidos que correspondem a regiões específicas (isto é, epítopos antigénicos) desses polipéptidos podem ser utilizados como imunogénios. Tais animais hospedeiros podem incluir, mas não são limitados a coelhos, murganhos e ratos. Vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a 42 resposta imunológica, dependendo da espécie do hospedeiro, incluindo, mas não restrito a adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacteriuin parvum. Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpos derivadas dos soros dos animais imunizados. A fim de adicionalmente aumentar a imunogenicidade, o imunogénio pode ser acoplado a um veiculo. Exemplos de tais veículos são a hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH) e a albumina do soro bovino (BSA). Outras albuminas, tais como a ovalbumina, albumina do soro de murganho ou albumina do soro de coelho também podem ser utilizadas como veículos. Os métodos de acoplar um péptido a um veículo são conhecidos na técnica e incluem a utilização de glutaraldeído, carbodiimida e éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida. A quantidade de antigénio a ser utilizada pode ser determinada prontamente pelos especialistas na técnica sem experimentação indevida. 0 antigénio pode ser administrado por várias vias (por exemplo, via subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais é monitorizada por amostragem do sangue do animal imunizado em vários pontos no tempo depois da administração. Quando o nível desejado de anticorpo é obtido, o animal é sangrado e o soro é armazenado. 43

Os anticorpos monoclonais, que são populações homogéneas de anticorpos para um antigénio particular, podem ser obtidos por meio de qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpos por linhagens celulares continuas em cultura. Estas incluem, mas não são limitados à técnica de hibridoma (Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497; Patente U.S. N° 4.376.110; Howell e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.), The human B-cell hybridoma technique (Kosbor (1983) Immunology Today 4:72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80:2026), e a técnica EBV-hibridoma (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc.). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse das mesmas.

Além disso, podem ser usadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81:6851; Neuberger (1984) Nature 312:604; Takeda (1985) Nature 314:452). Estas envolvem unir uma porção de um gene que codifica um anticorpo de murganho de especificidade de antigénio apropriada a uma porção de um gene que codifica um anticorpo humano de actividade biológica apropriada. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de espécies de animais diferentes, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante da imunoglobulina humana. Tais anticorpos quiméricos poderiam ser gerados, por exemplo, pela imunização 44 de murganhos que contêm os loci genéticos humanos que codificam o IgH e 6 e 8 loci de cadeia leve.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patente U.S. 4.946.778; Bird (1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879; e Ward et al. (1989) Nature 334:544) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples contra epitopos do polipéptido de fusão da invenção. Os anticorpos de cadeia simples são formados pela ligação dos fragmentos da cadeia pesada e leve da região Fv por meio de uma ponte de aminoácidos, resultando num polipéptido de cadeia simples. Estes são convenientemente produzidos por técnicas de ADN recombinante.

Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não são limitados aos fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes dissulfeto dos fragmentos F(ab')2. Alternativamente, podem ser construídas bibliotecas de expressão de Fab (Huse (1989) Science 246:1275) para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos Fab com a especificidade desejada. Os métodos para o rastreio de anticorpos para especificidade de ligação são conhecidos na técnica. São também descritos sistemas in vitro concebidos para identificar compostos capazes de modular respostas celulares 45 mediadas por meio do HVEM ou polipéptidos do receptor LtPr. a expressão "respostas celulares" refere-se, neste contexto, à activação celular, internalização celular de HSV ou mudanças na activação ou produção de mediadores inflamatórios tais como células inflamatórias, citocinas, prostaglandinas e leucotrienos. Estas respostas celulares são suscitadas por uma interacção de (a) HVEM com p30, gD ou LTa; ou (b) LTPr com p30. 0 termo "ligando" refere-se a um polipéptido ou a um composto que se liga a uma proteína receptora numa alta afinidade e de maneira específica para suscitar uma resposta funcional. Por exemplo, os ligandos da invenção incluem p30, gD ou LTa. 0 termo "receptor" refere-se nesse contexto a um polipéptido que, quando ligado por um ligando, induz uma resposta celular. Os receptores da invenção incluem HVEM ou LTPr. 0 termo "agente de ligação" refere-se a um polipéptido ou a um composto que se liga a um receptor ou a um ligando numa alta afinidade e de maneira específica e pode ou não suscitar uma resposta funcional. 0 composto do teste pode ser um composto candidato definido, isolado e purificado (por exemplo, uma molécula pequena sintética), um membro de uma biblioteca combinatória ou pode estar presente numa amostra biológica tal como um fluido biológico, extracto de tecido, fracção subcelular ou lisado celular. É, além disso, descrito um ensaio para identificar um composto que afecta uma resposta celular mediada por agente de ligação ao HVEM. Este ensaio envolve: (a) incubar o composto com um polipéptido HVEM ou uma célula que expressa 46 um polipéptido HVEM, e um agente de ligação ao HVEM, em condições que permitem que os componentes interajam; e (b) determinar o efeito do composto sobre a resposta celular mediada por agente de ligação ao HVEM. É também descrito um ensaio para identificar um composto que afecta uma resposta celular mediada por ϋβϊΙ-ρ30. Este ensaio envolve: a) incubar o composto com um polipéptido LTpR ou uma célula que expressa um polipéptido LtPr, e com p30, em condições que permitem que os componentes interajam; e (b) determinar o efeito do composto sobre a resposta celular mediada por LTpR-p30. Nos ensaios da invenção os compostos são rastreados quanto à sua capacidade de modular uma activação celular mediada pela interacção de HVEM ou LTPr com um ligando ou inibir a infecção de células susceptiveis por HSV.

Os ensaios podem ser ensaios de resposta celular. Estes ensaios de resposta celular medem a activação celular, a infecção celular por HSV ou a modulação da inflamação afectando mediadores inflamatórios tais como o recrutamento de células inflamatórias, a activação e produção de citocinas pró-inflamatórias, prostaglandinas e leucotrienos.

Os compostos de teste podem ser testados quanto à sua capacidade de modular uma resposta das células que expressam os receptores (por exemplo, HVEM ou ΐτβπ) estimuladas por ligandos (por exemplo, p30, LTa ou gD) e uma dose sub-óptima de um estimulo apropriado para as células. As células que expressam o receptor "respondedor" podem ser recém-obtidas de um indivíduo ou podem ser uma linhagem celular cultivada. As 47 células podem expressar o receptor codificado endogenamente ou um receptor codificado por um agente transfectado. 0 ligando pode ser adicionado às culturas de resposta celular na forma de um polipéptido isolado ou pela adição às culturas de células que expressam os ligandos. As células que expressam o ligando podem expressar um gene endógeno que codifica o ligando ou podem expressar um gene transfectado que codifica o ligando. Além disso, o ligando pode ser expresso sobre a superfície da célula (p30 ou gD) ou pode ser segregado (p30 gD ou LTa) . A fim de que o p30 ou gD sejam segregados, o gene que o codifica necessitaria de ter a região que codifica o domínio transmembranar deletado. A activação celular pode ser medida, por exemplo, por proliferação celular, expressão de novo de marcadores de activação da superfície celular ou produção de factor solúvel.

As células podem ser linfócitos. No caso de células T, o receptor (HVEM ou ΐτβϊΐ) que expressa células T respondedoras pode ser cultivado na presença do composto de teste, o ligando e uma dose sub-óptima de um activador de células T, por exemplo, o anticorpo anti-CD3, uma lectina tal como a fito-hemoglutinina (PHA) ou um super-antigénio tal como a enterotoxina estafilocócica C (SEC). Os controlos serão culturas que contêm: (a) só células T; (b) células T com activador de células T, com ligando e sem composto de teste; (c) células T com activador de células T sem ligando e sem composto de teste; (d) células T com activador de células T, sem ligando e com composto de teste, (e) células T sem activador de células T, com ligando e sem composto de teste; 48 (f) células T sem activador de células T, sem ligando e sem composto de teste e (g) células T sem activador de células T, sem ligando e com composto de teste. A activação das células T pode ser medida em termos da proliferação das células T por incorporação de 3H-timidina (ver Exemplo 5), indução de marcadores de activação tais como CD69 ou CD25, ou produção de citocinas tais como a interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) ou interferão-γ (iFNy) .

No caso do linfócitos B podem ser realizados ensaios de resposta similares. Os activadores de células B podem ser mitogénios tais como mitogénio de pokeweed, proteina estafilocócica A ou anti-imunoglobulina. A activação celular pode ser medida por proliferação celular (uma vez mais por incorporação de 3H-timidina) ou secreção de Ig. Alternativamente, a sobrevivência das células B pode ser medida em meio nutricionalmente sub-óptimo (ver Exemplo 5). A capacidade de um composto de teste em inibir a activação linfocitica seria uma indicação que tal composto pode ser útil no tratamento de uma doença auto-imune que em grande medida envolve células T (artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente e esclerose múltipla, por exemplo, ou células T e B (lúpus eritematoso sistémico e miastenia grave, por exemplo) bem como distúrbios inflamatórios, por exemplo, artrite, psoriase e doença inflamatória do intestino. A capacidade de um composto de teste de estimular a activação linfocitica seria uma indicação de que tal composto pode ser útil em estimular respostas imunes em indivíduos com doenças infecciosas ou em 49 que o indivíduo é imunos suprimido como, por exemplo, em doentes que estão a ser submetidos a quimioterapia ou terapia de radiação para cancro ou em doentes com SIDA.

Em ensaios para os compostos de teste que evitam infecção por HSV, os compostos de teste podem ser adicionados às culturas de células susceptíveis a HSV e HSV. A linhagens celulares permissivas para infecção por vírus incluem fibroblastos dérmicos humanos, linfócitos do sangue periférico tratados com agentes que causam activação (por exemplo, anticorpos anti-CD3, ou fito-hemaglutinina), e linhagens celulares transformadas (por exemplo, células de Held). A produção de vírus pode ser medida por qualquer número de métodos conhecidos pelos especialistas na técnica incluindo ensaios de placa virai, produção de proteínas específicas para vírus medida por um ensaio ELISA ou utilização de vírus recombinante que contém um produto de gene indicador como β-galactosidase, uma enzima facilmente detectável por ensaios colorimétricos (Montgomery (1996) supra). A capacidade de um composto de teste em inibir a infecção celular por HSV seria uma indicação de que tal composto pode ser útil no tratamento de um indivíduo com uma infecção por HSV. A fim de testar se os compostos que afectam as respostas celulares funcionam pela ligação de cada membro do par receptor-ligando relevante, os mesmos podem ser testados quanto à sua capacidade de ligar-se a formas solúveis do receptor ou ligando por meio de ensaios conhecidos na técnica, por exemplo, ELlSAs, Western blot ou 50 radioimunoensaios. Além disso, para testar se a ligação de um composto de teste ao receptor ou ao ligando resulta na inibição da sua ligação entre si, o composto de teste pode ser testado quanto à sua capacidade de inibir a ligação das formas solúveis do receptor e do ligando. Exemplos desses ensaios são ELISAs competitivos, Western blot competitivo e radioimunoensaios competitivos.

Os péptidos e polipéptidos utilizados nos ensaios de rastreio da invenção podem ser obtidos por uma variedade de meios. Os péptidos mais pequenos (menos de 50 aminoácidos de comprimentos) podem ser convenientemente sintetizados por métodos químicos padrão. Alguns polipéptidos (por exemplo, anticorpos) pode ser adquiridos de fornecedores comerciais. Quando, ao contrário, não se encontram disponíveis, os anticorpos podem ser gerados tal como descrito supra. Os anticorpos marcados de forma detectável podem ser adquiridos de fornecedores comerciais ou são facilmente preparados pelos especialistas na técnica.

Os polipéptidos, tais como HVEM, LtPr, p30, gD ou LTa podem ser purificados a partir de fontes biológicas por meio de métodos conhecidos na técnica (Protein Purification, Principies and Practice, second edition (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.). Podem também ser produzidos nas suas formas de proteína de ocorrência natural, truncada, de fusão ou quimérica por tecnologia de ADN recombinante utilizando métodos conhecidas na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Ver, por 51 exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et ai. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel et ai., supra citado. Alternativamente, o ARN que codifica as proteínas pode ser quimicamente sintetizado. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Olígonucleotlde Synthesis, (1984) Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford, que é aqui dada como integralmente incorporada por citação.

Uma variedade de sistemas de vectores de expressão em hospedeiro pode ser utilizada para expressar as sequências de nucleótidos. Quando o péptido ou polipéptido é solúvel, o mesmo pode ser recuperado de: (a) a cultura, isto é, da célula hospedeira nos casos em que o péptido ou polipéptido não é segregado ou (b) do meio de cultura nos casos em que o péptido ou polipéptido é segregado pelas células. Os sistemas de expressão também abrangem células hospedeiras modificadas que expressam o polipéptido in sltu, por exemplo, ancorados na membrana celular. A purificação ou enriquecimento do polipéptido de tal sistema de expressão pode ser conseguido utilizando detergentes apropriados, micelas lipídicas e outros métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Alternativamente, as próprias células hospedeiras modificadas podem ser utilizadas em situações em que é importante não apenas reter as características estruturais e funcionais do proteína, mas também avaliar a actividade biológica.

Os sistemas de expressão que podem ser usados incluem, mas não são limitados a microrganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtllls) transformadas com ADN de 52 bacteriófagos recombinantes, vectores de expressão de DNA plasmídeo ou DNA cosmídeo contendo as sequências de nucleótidos; levedura transformada com vectores de expressão de levedura recombinante; células de insectos infectadas com vectores de expressão virai recombinante (baculovirus); sistemas de células de plantas infectadas com vectores de expressão virai recombinante (por exemplo, virus do mosaico da couve-flor, CaMV; virus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão de plasmídeo recombinante; ou células de mamíferos (por exemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que abrigam construções de expressão recombinante que contêm promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor metalotioneina) ou de vírus de mamíferos.

Nos sistemas bacterianos, inúmeros vectores de expressão podem ser vantajosamente seleccionados dependendo da utilização pretendida para o produto génico a ser expresso. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína é para ser produzida, por exemplo, para produzir anticorpos para a proteína, podem ser desejáveis vectores que dirigem a expressão de altos níveis de produto de proteína de fusão que são rapidamente purificados. Tais vectores incluem, mas não são limitados ao vector de expressão em E. coli pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791), em que a sequência codificadora pode estar ligada individualmente no vector in-frame com a região codificadora lacZ de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vectores pIN (Inouye (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101; Van Heeke (1989) J. Biol. Chem. 264:5503); e outros, vectores pGEX também podem ser 53 utilizados para expressar polipéptidos exógenos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas pela adsorção a pérolas de glutationa-agarose seguido pela eluição na presença de glutationa livre. Os vectores pGEX são concebidos para incluir trombina ou sítios de clivagem do factor Xa protease de modo que o produto do gene alvo clonado possa ser libertado da unidade GST. Deve ser entendido que os polipéptidos usados para os ensaios de rastreio podem ser as formas de ocorrência natural dos polipéptidos ou proteínas de fusão que contêm os polipéptidos. A parte irrelevante da proteína de fusão pode ser, por exemplo, a porção Fc da imunoglobulina G, hexa-histidina ou GST.

Em células hospedeiras de mamíferos, podem ser utilizados vários sistemas de expressão com base virai. Nos casos em que um adenovírus é utilizado como um vector de expressão, a sequência de nucleótidos de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, região El ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o produto do gene em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81:3655). Podem também ser necessários sinais de iniciação específicos para a tradução eficiente de sequências de nucleótidos inseridas. Estes 54 sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos em que todo um gene ou ADNc, incluindo o seu próprio codão de iniciação e sequências adjacentes, é inserido no vector de expressão apropriado, podem não ser necessários sinais de controlo translacionais adicionais. No entanto, nos casos em que apenas uma porção da sequência codificadora é inserida, os sinais de controlo translacionais exógenos, incluindo, talvez, o codão de iniciação ATG, têm de ser fornecidos. Além disso, o codão de iniciação tem de estar em fase com o quadro de leitura da sequência codificadora desejada para assegurar a tradução de todo o inserto. Estes sinais de controlo translacionais exógenos e codões de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (Bittner (1987) Methods in Enzymol. 153:516).

Além disso, pode ser seleccionada uma estirpe de célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto génico da maneira especifica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteina podem ser importantes para a função da proteina. Linhagens celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser seleccionados para assegurar uma modificação e processamento correctos da proteina exógena expressa. As células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não são limitadas a CHO, VERO, BHK, Held, COS, MDCK, 293, 3T3 e WI38. 55

Para longo prazo, é preferida a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes de expressão estável. Por exemplo, linhagens celulares que expressam de modo estável as sequências descritas acima podem ser geneticamente modificadas. Em vez de utilizar vectores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, promotor, sequências intensificadoras, terminadores da transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. Depois da introdução do ADN exógeno, as células modificadas podem ser deixadas a desenvolver por 1 a 2 dias num meio enriquecido e depois trocadas para um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem de forma estável o plasmídeo nos seus cromossomas e se desenvolvam para formar foci que, por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Este método pode ser utilizado, vantajosamente, para modificar linhagens celulares que expressam o produto génico. Tais linhagens celulares modificadas podem ser particularmente úteis no rastreio e avaliação dos compostos que afectam a actividade endógena do produto génico.

Uma proteína de fusão pode ser rapidamente purificada pela utilização de um anticorpo ou uma unidade que especificamente se liga à proteína de fusão a ser expressa. Por exemplo, um sistema descrito por Janknecht (1991) Proc. Natl. Acad. Scí. EUA 88:8972, permite a rápida purificação de proteínas de fusão não desnaturadas expressas em linhagens 56 celulares humanas. Nesse sistema, o gene de interesse é subclonado num plasmideo de recombinação do virus vaccinia de tal modo que o quadro de leitura aberto do gene é fundido de forma translacional a uma cauda amino-terminal que consiste em seis resíduos de histidina. Os extractos das células infectadas com o vírus vaccinia recombinante são carregados em colunas de Ni2+ ácido nitriloacético-agarose e proteínas com cauda de histidina são selectivamente eluídas com tampões contendo imidazol. Se desejado, a cauda de histidina pode ser selectivamente clivada com uma enzima apropriada.

Proteínas quiméricas também podem ser derivadas por métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Estes envolvem a união de uma porção de um gene que codifica uma dada proteína a uma ou mais porções derivadas de um ou mais genes que codificam proteínas diferentes. Um polipéptido quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de proteínas diferentes. Por exemplo, uma proteína quimérica pode conter um domínio de HVEM e outro domínio de ίτβκ ou um domínio de HVEM e um domínio de uma região Fc de um anticorpo. São descritos métodos para modular uma resposta celular mediada por HVEM por meio do contacto de uma célula que expressa o polipéptido receptor, HVEM, com um agente de ligação ao HVEM. Alternativamente, uma resposta celular mediada por HVEM é modulada por meio do contacto de um ligando para HVEM com um agente de ligação ao ligando. Tais ligandos incluem LIGHT (p30), LTa ou gD. 0 LIGHT (p30) pode ser expresso sobre a superfície de uma célula ou pode ser 57 solúvel, por exemplo, na forma homotrimérica. O LTOC pode ser segregado e o gD pode ser expresso sobre um virião do HSV ou sobre a superfície de uma célula infectada com HSV. A expressão "respostas celulares" refere-se, uma vez mais, nesse contexto, à activação celular (por exemplo, um aumento na produção de mediadores inflamatórios) ou à internalização do HSV pela célula. A invenção também apresenta métodos para modular respostas celulares mediadas por LTPR pelo contacto de uma célula que expressa LtPr ou uma célula que expressa o ligando de LtPr, o p30, com um agente de ligação que se liga ao HVEM ou ao p30.

Tal como usado nesse contexto, "contactar" significa expor o receptor ou o ligando ao agente de ligação, numa quantidade eficaz para modular o receptor, de modo que o agente de ligação pode eficazmente modular a resposta celular iniciada pela interacção do ligando com o receptor. A modulação pode resultar em inibição ou activação da resposta celular. Estas propriedades alternativas de um agente de ligação particular para um par receptor-ligando particular pode ser testada antecipadamente utilizando os ensaios de rastreio descritos (ver, por exemplo, Exemplos 6-8).

No que diz respeito aos agentes de ligação ao receptor, os agentes de ligação ao hvem incluem gD solúvel, p30 solúvel (por exemplo, LIGHT-t66) ou um fragmento de péptido de LTa, preferencialmente um fragmento de péptido que contém o aminoácido Tyr numa posição que corresponde à posição 108 do 58 N-terminal da LTa de ocorrência natural. Um agente de ligação ao ΕΤβϊΙ é o p30 solúvel.

No que diz respeito aos agentes de ligação ao ligando, os agentes de ligação ao p30 incluem HVEM solúvel, ΕΤβκ solúvel, construções quiméricas (por exemplo, proteínas de fusão), tais como, por exemplo, hvem:Fc ou anticorpos que se ligam especificamente ao p30. Um agente de ligação ao LTa é o HVEM solúvel, por exemplo, uma proteína de fusão HVEM:Fc ou construção quimérica. 0 contacto pode ser in vitro, por exemplo, pela adição de um agente de ligação ou antagonista a uma cultura de células que expressam HVEM ou ύτβΐΐ, por exemplo, linfócitos, que estão a ser submetidos a activação por ligantes de HVEM (p30, LTa ou gD) ou do ligando ΕΤβϊΙ, p30. Os agentes de ligação também podem ser adicionados, por exemplo, a uma cultura de HVEM que expressa células expostas a gD sobre a superfície de viriões de HSV ou sobre a superfície de células infectadas com HSV. A capacidade do agente de ligação em modular estas respostas celulares poderia ser testada antecipadamente utilizando os métodos de rastreio descritos. 0 agente de ligação pode ser adicionado como um polipéptido isolado ou como células transfectadas com um vector de expressão que contém um agente de ligação que codifica a molécula de ácido nucleico. Nesses métodos in vitro, uma "quantidade eficaz moduladora do receptor" do agente de ligação, é a quantidade necessária para modular a activação celular ou a infecção por HSV superior a 20%, 59 preferencialmente superior a 50%, mais preferencialmente superior a 80% e, mais preferencialmente, superior a 95%. O contacto pode ser in vivo num indivíduo. O indivíduo pode ser um mamífero, preferencialmente um ser humano, com uma doença autoimune tal como artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente, esclerose múltipla, lúpus sistémico eritematoso ou miastenia grave, uma malignidade linfóide (células T ou B), uma infecção por HSV, uma infecção com um organismo que não seja o HSV, um distúrbio inflamatório, ou para imunossupressão. A inibição de uma resposta celular mediada por HVEM-p30 ou uma ύτβΐΐ-ρ30 poderia ser vantajosa em doentes com doenças autoimunes ou malignidades linfóides uma vez que poderia evitar a proliferação ou a activação de células T (como em artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente, esclerose múltipla, ou miastenia grave, e malignidades da célula T) ou a proliferação de células B (como em lúpus sistémico eritematoso, miastenia grave e malignidades da célula B) . A inibição de uma resposta celular mediada por HVEM-gD (isto é, a internalização do HSV) poderia ser terapêutica para os indivíduos com uma infecção por HSV uma vez que evitaria a disseminação virai mediada pela internalização dos viriões de HSV que expressam gD presentes no espaço extracelular ou de células infectadas com HSV que expressam gD sobre a sua superfície. A estimulação de uma resposta celular mediada por HVEM-p30 ou uma Ητβκ-ρ30 seria útil no tratamento de indivíduos com uma infecção que não seja por HSV ou indivíduos imunossuprimidos (por exemplo, doentes que estão a ser submetidos a radiação e/ou quimioterapia para cancro, que 60 não sejam malignidades linfóides) ou doentes com SIDA em que a proliferação das células T e B seria estimulada. Naturalmente, evitar-se-ia a utilização de agentes de ligação que estimulam uma resposta celular mediada por HVEM-p30 num indivíduo com uma infecção por HSV uma vez que tal agente pode também aumentar uma resposta celular HVEM-gD e, deste modo, a disseminação do virus HSV. No entanto, esta actividade no agente de ligação relevante poderia ser testada antecipadamente utilizando os ensaios de rastreio descritos supra. De modo similar, estes agentes de ligação estimuladores não seriam utilizados em malignidades linfóides, uma vez que os mesmos poderiam promover o desenvolvimento das células tumorais.

Os agentes de ligação a serem utilizados para modulação in vivo das respostas celulares incluem as formas de ocorrência natural de HVEM, LTPr, p30, anticorpos, gD e LTa bem como as formas geneticamente modificadas tais como construções HVEM:Fc. Estas serão produzidas pelos métodos descritos supra. Péptidos derivados de LTa e que modulam a interacção HVEM-LTa também serão utilizados. Os péptidos conterão cerca de 205 aminoácidos ou menos. Por exemplo, os mesmos podem conter cinco, oito, doze, quinze ou dezoito aminoácidos. Os péptidos, preferencialmente, conterão o resíduo Tyr, ou uma sua substituição conservadora, numa posição correspondente ao resíduo de aminoácido 108 do N-terminal de LTa de ocorrência natural. São também incluídos como agentes de ligação os peptidomiméticos dos péptidos descritos supra. Os compostos 61 peptidomiméticos são compostos sintéticos que têm uma estrutura tridimensional (isto é, um "motivo peptídico") com base na estrutura tridimensional de um péptido seleccionado. 0 motivo peptídico proporciona o composto peptidomimético com a actividade de modular respostas celulares, isto é, a mesma ou maior do que a actividade do péptido do qual o peptidomimético foi derivado. Os compostos peptidomiméticos podem ter características adicionais que aumentam a sua aplicação terapêutica, tal como maior afinidade e/ou avidez e semi-vida biológica prolongada. Os peptidomiméticos da invenção tipicamente têm uma estrutura de base que é parcialmente ou completamente não-peptídica, mas com grupos laterais idênticos aos grupos laterais dos resíduos do aminoácido que ocorrem no péptido sobre o qual o peptidomimético é baseado. Vários tipos de ligações químicas, por exemplo, éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonilo reduzido, ligações de dimetileno e cetometileno, são conhecidas na técnica como sendo, de um modo geral, substitutos úteis para ligações peptídicas na construção de peptidomiméticos resistentes a protease.

Os agentes de ligação ao polipéptido e péptido podem ser modificados pela adição em cada ou ambas as extremidades dos terminais amino e carboxilo de um agente de bloqueio a fim de facilitar a sobrevivência do polipéptido ou péptido relevante in vivo. Isto pode ser útil naquelas situações em que os terminais peptídicos tendem a ser degradados ("mordiscados") pelas proteases. Tais agentes de bloqueio podem incluir, sem limitação, sequências peptídicas adicionais relacionadas ou não relacionados que podem ser 62 ligadas aos resíduos do terminal amino e/ou carboxilo do polipéptido ou péptido a ser administrado. Isto pode ser realizado quimicamente durante a síntese do péptido ou polipéptido ou por meio de tecnologia de ADN recombinante. Alternativamente, agentes de bloqueio, tais como ácido piroglutámico ou outras moléculas conhecidas dos especialistas na técnica podem ser ligados aos resíduos do terminal amino e/ou carboxilo, ou o grupo amino no terminal amino ou grupo carboxilo no terminal carboxilo substituído por uma unidade diferente. Do mesmo modo, os agentes de ligação podem ser acoplados de forma covalente ou não covalente a proteínas "veículo" farmaceuticamente aceitáveis antes da administração. A administração in vivo envolve administrar a um indivíduo o próprio agente de ligação, um ácido nucleico que codifica o agente de ligação, um vector de expressão que codifica o agente de ligação, ou células transfectadas ou transduzidas com o vector.

Os agentes de ligação podem ser administrados a uma célula de um mamífero utilizando técnicas que são substancialmente as mesmas àquelas descritas infra para administração a indivíduos humanos. Exemplos de mamíferos apropriados incluem mas não estão restritos a seres humanos, primatas não-humanos, cavalos, gado, ovelhas, cães, gatos, murganhos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters, coelhos e cabras. 63

Um agente de ligação pode ser administrado a células de um doente no seu estado não modificado, dissolvido numa solução fisiológica apropriada, por exemplo, soro fisiológico. Naturalmente, é desejável que estes péptidos sejam selectivamente dirigidos a tecidos e tipos de células relevantes. Isto pode ser conseguido por contacto dos péptidos directamente com o órgão ou tecido afectado, por exemplo, por injecção localizada ou implante. Deste modo, nas doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide ou diabetes mellitus insulino-dependente, os péptidos poderiam ser introduzidos directamente dentro das articulações afectadas ou no pâncreas, respectivamente, ou, de preferência, em tecido linfóide de drenagem no qual ocorre a resposta autoimune activa.

Alternativamente, os agentes de ligação podem ser administrados em lipossomas dentro dos quais foram incorporados ligandos para os receptores em células relevantes (por exemplo, células τ ou células B) ou anticorpos para marcadores de superfície celular expressos por estas células. Desse modo, um anticorpo específico para a superfície da célula T CD4 pode dirigir os lipossomas que contêm tanto o anticorpo anti-CD4 como o agente de ligação relevante para uma célula T CD4+. Esta abordagem poderia ser utilizada tanto em doenças autoimunes como em infecções por HSV. Em doenças autoimunes nas quais foi definido o receptor de células T (TCR) expresso por um clone de célula T patogénico dominante, pode ser utilizado um anticorpo específico para o componente TCR relevante (por exemplo, νβ) . A última metodologia mencionada representaria uma forma ideal 64 de imunoterapia na qual células efectoras patogénicas são especificamente dirigidas para inibição enquanto o sistema imunológico como um todo e as células do órgão alvo permanecem não comprometidas.

Em doentes com linfoma ou leucemia, os agentes de ligação anti-proliferativos são preferencialmente dirigidos a células de cancro. Os péptidos poderiam, por exemplo, ser injectados directamente dentro dos tecidos que circundam o local do tumor linfoma depois de cirurgia para remover o tumor, a fim de inibir o desenvolvimento de células tumorais residuais. Em vez de cirurgia, o tumor poderia ser tratado por injecção in situ do agente de ligação dentro do tumor. A metodologia de lipossomas descrita supra, poderia ser explorada. Nesse caso os anticorpos específicos para antigénios específicos para tumor (TSA) ou antigénio associados a tumor (TAA) seriam explorados. É bem conhecido nas artes médicas que as dosagens para qualquer doente depende de muitos factores, bem como do composto particular a ser administrado, o tempo e a via de administração e outros fármacos a serem administrados ao mesmo tempo. As dosagens para os agentes de ligação da invenção variarão, mas, quando administrados por via intravenosa, podem ser de aproximadamente 0,01 mg a 10 mg/mL do volume do sangue. As vias e doses de administração são conhecidas dos farmacologistas e médicos hábeis. Para além daquelas descritas supra, as vias incluem, mas não são restritas a: via intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, transmucosa, subcutânea e intravenosa. 65

Uma abordagem de terapia genética in vivo requer a administração de uma construção genética directamente dentro do doente, de preferência a direccionar a mesma para as células ou tecidos de interesse. 0 direccionamento para células tumorais ou linfócitos activados, por exemplo, pode ser conseguido por meio da utilização de retrovirus, que transfecta, de forma estável, as células proliferativas primárias. Em outra forma de realização, o distúrbio inflamatório pode ser artrite e o tecido alvo a cartilagem na articulação de um indivíduo. Num caso como este, a construção de fusão da invenção pode ser ligada a uma matriz activada por gene (isto é, revestida sobre um material polimérico) de modo a proporcionar um material de libertação lenta ou injectado directamente dentro da articulação. 0 direccionamento especifico para tecido também pode ser conseguido por meio da utilização de um conjugado molecular composto de um plasmídeo ou outro vector ligado a poli-L-lisina por forças electrostáticas ou covalentes. A poli-L-lisina liga-se a um ligante que pode ligar-se a um receptor sobre células tumorais (Cristiano (1995) J. Mol. Med 73:479). De forma similar, os anticorpos específicos para tumor e células do tipo descrito supra, podem ligar-se a vectores e, deste modo, dirigir os mesmos para tumores ou células linfóides ou tais como linfócitos T. Estes mencionados por último seriam úteis em doenças autoimunes e infecção por HSV. Um promotor que induz a expressão relativamente específica para tumor pode ser utilizado para atingir um outro nível de direccionamento. Os promotores 66 específicos para tecidos para utilização em doentes autoimunes ou de transplante incluem, por exemplo, a IL-2 induzível (Thompson (1992) Mol. Cell. Biol. 12:1043)), IL-4 (Todd (1993) J. Exp. Med. 177:1663) e interferão gama (Penix (1993) J. Exp. Med. 178:483) promotores do direccionamento de células T. Tais promotores induzíveis teriam uma vantagem adicional valiosa uma vez que a expressão ocorreria selectivamente em células T activadas. Incluídas nessa população de células T activadas estão as células efectoras que uma modalidade imuno-terapêutica ideal inibiria selectivamente em doentes autoimunes.

Vectores também podem ser administrados pela incorporação em lipossomas ou outros veículos de administração sejam sós ou incorporados com anticorpos específicos para células, conforme descrito supra.

Quando o agente de ligação relevante é normalmente ligado à membrana celular (HVEM, LtPr, p30 ou gD), a região do ácido nucleico que codifica o domínio transmembranar do agente de ligação será deletado do ácido nucleico contido no vector de expressão. O ADN ou células transfectadas podem ser administrados num veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são veículos biologicamente compatíveis que são adequados para administração a um ser humano, por exemplo, soro fisiológico. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade do ADN da invenção que é capaz de produzir um resultado desejável do ponto de 67 vista médico num animal tratado. Tal como é conhecido nas artes médicas, a dosagem para qualquer doente depende de muitos factores, incluindo o tamanho do doente, a área da superfície corporal, a idade, o composto particular a ser administrado, o sexo, o tempo e a via de administração, a saúde em geral, e outros fármacos a serem administras ao mesmo tempo. As dosagens irão variar, mas uma dosagem preferida para administração intravenosa do ADN é de aproximadamente 106 a 1012 cópias da molécula de ADN. Esta dose pode ser administrada repetidamente, de acordo com a necessidade. A expressão "farmaceuticamente aceitável" é utilizada nesse contexto para referir-se àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas farmacêuticas que são, no âmbito do julgamento médico sólido, adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outros problemas ou complicações comparáveis com uma proporção razoável benefício/risco. A concentração óptima do péptido, anticorpos, proteínas de fusão, ácidos nucleicos ou um seu derivado numa composição farmaceuticamente aceitável pode variar, dependendo de inúmeros factores, incluindo a dosagem preferida do composto a ser administrado, as características químicas dos compostos utilizados, a formulação dos excipientes do composto e a via de administração. A dosagem óptima de uma composição farmacêutica a ser administrada também pode depender de variáveis tais como o tipo e o grau, por exemplo, de um 68 distúrbio inflamatório, ou doença a ser tratada, o estado de saúde como um todo do indivíduo particular e a eficácia biológica relativa do composto seleccionado. Por exemplo, as composições da invenção podem ser usadas para o tratamento de distúrbios inflamatórios incluindo, mas não limitados a artrite, psoríase e doença inflamatória do intestino. Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade inibidora de inflamação" significa aquela quantidade do composto necessária para modular, inibir ou suprimir respostas ou sintomas inflamatórios.

Um especialista na técnica pode utilizar os seguinte ensinamentos que descrevem os métodos e técnicas para a determinação das dosagens clínicas Spilker B., Guide to Clinicai Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., Nova Iorque, 1984, pp. 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinicai Trials, Raven Press, Ltd., Nova Iorque, 1991, pp. 93-101; Craig C., e R. Stitzel, eds., Modern Pharmacology, 2d ed., Little, Brown and Co., Boston, 1986, pp. 127-33; T. Speight, ed., Avery’s Drug Treatment: Principies and Practice of Clinicai Pharmacology and Therapeutics, 3d ed., Williams e Wilkins, Baltimore, 1987, pp. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa e P. McGonigle, Principies in General Pharmacology, Springer-Verlag, Nova Iorque, 1988, pp. 18-20) para determinar a dosagem apropriada a ser utilizada.

Em concordância, a presente invenção proporciona utilizações para tratar ou inibir uma reacção ou distúrbio inflamatório numa célula, tecido ou indivíduo. 69

Tal como aqui descrito, a formulação e as composições podem ser rapidamente identificadas por um especialista na técnica utilizando os ensinamentos aqui descritos ou prontamente disponíveis a um especialista na técnica. Por exemplo, um polipéptido de fusão da invenção pode ser administrado topicamente a um local inflamado num indivíduo. Tal administração tópica inclui administrar o polipéptido da invenção, por exemplo, numa loção ou pomada. Alternativamente, os polipéptidos da invenção podem ser administrados sistemicamente. Tal administração sistémica inclui, por exemplo, injecções intraperitoneais, injecções subcutâneas, injecções intravenosas ou administração por via oral. Além disso, as formulações que incluem o polipéptido, tais como por exemplo, supositórios, pílulas, formulações lipossómicas e outras formulações rapidamente identificadas pelos especialistas na técnica podem ser utilizadas para administração sistémica. Tal como descrito em mais detalhes adiante, os polipéptidos (por exemplo, HVEM:Fc) demonstraram terem propriedades anti-inflamatórias.

Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar a invenção e não a limitar.

EXEMPLOS

Materiais para os Exemplos A construção, expressão e purificação das proteínas bivalentes quiméricas formadas com a região Fc da IgGl humana e os domínios de ligação ao ligando de Fas:Fc (Brunner (1995) 70

Nature 373:441), TNFR60 (Crowe (1994) J. Immunol. Methods 168:79) e LTPR:Fc humano (Crowe (1994) Science 264:707) foram descritas anteriormente. A região extracelular de HVEM foi gerada por PCR utilizando sequências amplificadas por Taq ADN polimerase a partir do ADN de pBEClO que codifica 1 a K184 utilizando o iniciador directo 5' CGGAGATCTGAGTTCATCCTGCTAGCTGG-3' (SEQ ID NO:1) e o iniciador reverso 5' ATAGGATCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3' (SEQ ID NO:2). O produto amplificado de HVEM foi ligado in-frame ao vector do baculovirus pVL pVLl392 (Pharmingen) que contém o Fc da IgGl humana. Uma construção similar de HVEM:Fc com a região Fc de IgGl de coelho foi produzida em células CHO, purificada e utilizada como imunogénio para produzir o anticorpo anti-HVEM de coelho. A LTpR:Fc foi construída a partir de um fragmento de ADN de υτβρ (mLTPR) de murganho que codifica os residuos de aminoácidos 1 a Met221 do domínio extracelular (Force et al. (1996) J. Immunol. 1995.1 155:5280) por PCR utilizando Taq ADN polimerase com o iniciador directo 5' GACGTCAGATCTTCCCACCTTTCCTCCTA 3' (SEQ ID NO:3) e O iniciador reverso 5' GAACAGAGATCTCATTGCTCCTGGCTCTG 3' (SEQ ID NO:4). LTa e ΤΤβΤγτΙΟδΡϊΐθ foram produzidas em células de insecto utilizando baculovirus recombinante conforme descrito (Crowe et al. (1994) J. Immunol. Methods 168:79). ΕΤαΐβ2 recombinante solúvel (Browning et al. (1996), citado supra), TNF (Browning e Ribolini (1989) J. Immunol. 143:1859), e anticorpos monoclonais para LTa (BF7) e ΕΤβ (C37, B9 e B27) (Browning et al. (1995), citado supra) fora ofertas generosas de Jeffrey Browning (Biogen, Inc.). O anticorpo anti-LTa de imunoprecipitação (clone 9B9) foi proveniente da Boehringer 71

Mannheim. 0 anti-CD3 (OKT3) foi produzido em ascites em murganhos BALB/c e utilizado a 1 pg/mL de proteína. Proteínas e mutantes HSV gD-1 recombinantes purificados foram produzidos em baculovírus tal como anteriormente descrito em detalhe (Nicola et al. (1996) J. Virol. 6:3815). Os anticorpos FITC-anti-CD4 e CD8 foram obtidos da Becton-Dickenson.

Exemplo 1. Expressão de um ligando HVEM em células T

Este exemplo demonstra que as células T humanas tanto malignas como normais expressam um ligando de superfície celular para HVEM. Foi construída uma proteína de fusão que contém o domínio extracelular de HVEM e da região Fc da IgG humana (HVEM:Fc). As experiências demonstraram que o HVEM (como um HVEM:Fc recombinante, solúvel) ligou-se a células T humanas normais (recém-isoladas).

As células mononucleares de sangue periférico foram obtidas de dadores normais por Ficoll-Hypaque. As mesmas foram activadas com anticorpo anti-CD3 por 5 dias em meio com IL-2. As células foram re-estimuladas com PMA ou PMA e ionomicina por 4 horas e depois coradas duplamente com FITC-CD4 ou FITC-CD8 e o HVEM:F c detectado com anti-huIgG-PE conforme descrito acima. Fluorescência FITC com compensação foi utilizada para conter as subpopulações de células T CD4 e CD8. A ligação ao receptor foi determinada pela incubação de concentrações graduadas de HVEM:F c ou IgG de controlo com 72 células 11-23.D7 activadas. A linhagem celular 11-23.D7 é um hibridoma de células T CD4+ humanas (Ware (1986) Lymphokine Res. 5:313) e é mantido em meio RPMI1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e antibióticos. As células 11-23.D7 foram activadas por 4 horas a 37 °C com acetato de forbol miristato (PMA) (100 ng/mL) , ou PMA (100 ng/mL) e ionomicina (1 g/mL) . As células foram lavadas e incubadas por 30 minutos a 4 °C em Solução Salina Balanceada de Hanks (Hanks Balance Salt Solution (HBSS)) (suplementada com 10% de soro fetal bovino e NaN3 a 0,1%) contendo HVEM:F c, LtPr:Fc ou IgG humana a 5 pg/mL e depois coradas com IgG de cabra anti-humana conjugada com ficoeritrina (anti-hulg-PE). As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCaliber, Becton-Dickenson). A ligação ao receptor foi determinada pelo cálculo da intensidade de fluorescência = (canal fluorescente médio) (% de eventos fluorescentes positivos), onde um evento positivo tem um valor de fluorescência >98% do valor para IgG normal. A intensidade de fluorescência específica representa a intensidade de fluorescência depois da subtracção do valor para o IgG de controlo. Cada histograma representa 104 eventos.

Estas experiências demonstraram que o HVEM:Fc ligou-se especificamente ao hibridoma da célula T CD4+ humana, II.23.D7 (Ware et al. (1986) ver infra) depois de activação com o ionóforo de cálcio, a ionomicina e o PMA, mas o PMA sozinho não foi detectado por citometria de fluxo (Figura IA) . A ligação especifica de HVEM:Fc foi também detectada em linfócitos T derivados de sangue periférico humano (Figura IB) . Estas constatações indicaram que as células T humanas 73 tanto malignas como normais expressam um ligando de superfície celular para HVEM. A meia ligação máxima de HVEM:Fc a II.23.D7 foi obtida a ~20 nM (Figura 1C). A linhagem celular ii.23.D7 é também induzida por PMA para expressar LTa e β e TNF (ver, por exemplo, Ware (1992) J. Immunol. 149:3881).76

Exemplo 2. Características de ligação de HVEM e seus ligandos; HVEM liga-se a LTa

Este exemplo demonstra as características de ligação do HVEM utilizando o HVEM:F c solúvel, recombinante. Para determinar se o HVEM poderia ligar-se ao TNF ou complexos de ΙιΤαβ, foram usados I^R:Fc e TNFR:Fc como inibidores competitivos da ligação de HVEM a células 11-23.D7. Estas experiências constataram que o homotrímero LTa, mas não o TNF ou ο ΤΤαΐβ2 competiram por ligação ao HVEM:Fc (HVEM solúvel).

Competição de ligação por ίΤβΚ:Εο. Células II-23.D7 activadas (PMA e ionomicina como descrito no Exemplo 1) foram pré-incubadas com ΤΤβΗ:Ρο ou TNFR60:Fc (100 pg/mL) por 30 minutos a 4 °C. Foi então adicionado HVEM:Fc-de coelho (2 pg/mL), incubado por 30 minutos e as células foram coradas com IgG-PE de cabra anti-coelho para detectar o HVEM:Fc-de coelho. IgG de coelho foi usada para determinar a coloração de fundo. A ligação de HVEM:Fc a células 11-23.D7 activadas competiu com concentrações graduadas de ΤΤβΕ:Ρσ, TNFR60, Fas:Fc, ou IgG, tal como descrito acima. 74

Competição de ligação por homotrímero LTOí. Células II-23.D7 foram activadas e HVEM:Fc foi pré-incubado com LTa recombinante ou ΐτα1β2 por 30 minutos a 4 °C. A mistura foi adicionada a células II-23.D7 activadas e depois coradas com anti-huIgG-PE. A coloração por fluorescência com HVEM:Fc + LTa foi igual ao fundo com IgG normal.

Para determinar se o HVEM poderia ligar-se ao TNF ou complexos de ίταβ, foram usados LTPR:Fc e TNFR:Fc como inibidores competitivos da ligação de TNFR:Fc a células II-23. D7 activadas com PMA e ionomicina utilizando uma construção de HVEM:Fc com IgG Fc de coelho (Montgomery (1996) supra). O LTPR:Fc e o HVEM:Fc (Fc de IgGl humana), mas não o TNFR60:Fc competiram por ligação ao HVEM:Fc (coelho) (Figura 2A) . Além disso, nenhuma das proteínas de fusão relacionadas ao receptor Fas:Fc e TNFR80:Fc competiram por ligação ao HVEM:Fc. No entanto, surpreendentemente, o homotrímero LTa, mas não o TNF ou ΤΤα1β2 competiram por ligação ao HVEM:Fc (Figura 2B). Um mutante de ligação ao TNFR60 de LTa no qual a tirosina (Tyr) na posição 108 é substituída por fenilalanina (Phe) (Tyrl08Phe) (Goh (1991) Protein Eng. 4:785) não competiu. Estes resultados indicam que o ligando putativo de HVEM tem características em comum com os heterotrímeros ίΤαβ e LTa, mas também têm características que os distinguem de τταΐβ2 e TNF. Deste modo, ΤΤα2β1 poderia ser um ligando de superfície putativo reconhecido por HVEM:Fc, com a condição de que o(s) sítio(s) de ligação ao HVEM em ΤΤα2βΐ não é(são) o mesmo que TNFR60. Alternativamente, o HVEM:Fc poderia 75 reconhecer um novo ligando. Uma abordagem bioquímica foi usada para distinguir entre estas possibilidades.

Exemplo 3. Caracterização bioquímica do ligando HVEM (LIGHT)

Este exemplo demonstra a purificação de LIGHT (p30) por cromatografia de afinidade utilizando HVEM:Fc recombinante, solúvel. Análise de proteínas que se ligam ao HVEM:Fc por electroforese bidimensional demonstrou que os polipéptidos p30 migraram como uma banda larga (pi de 7 a 8,5) e que sob intensidade mais baixa o p30 resolve em três bandas.

Análise em SDS-PAGE. Células 11-23.D7 foram activadas por 2,5 horas com PMA ou PMA e ionomicina (como no Exemplo 1); lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), uma vez com RPMI deficiente em cisteína-metionina; e depois re-suspensas nesse meio contendo 10% de FBS dialisado, 250 pCi cada de 35S-metionina e 35S-cisteína, e agentes de activação por 1,5 horas. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos e as células lisadas em tampão contendo 2% de NP40, HEPES pH 7,0, EDTA 20 mM, NaCl 150 mM com leupeptina e aprotinina (a 10 g/mL), PMSF (1 mM) e iodoacetamida (20 mM). O extracto foi pré-clarifiçado com igG humana (10 pg) , onde indicado, anticorpos anti-LT e pérolas de proteína G. As proteínas de fusão do receptor:Fc (10 g/mL) foram então adicionadas às amostras e precipitadas com pérolas de proteína G. As proteínas marcadas foram analisadas por SDS-PAGE redutora e fosfoimagem (gama de pixel 6 - 200). 76

Os extractos celulares preparados como no parágrafo acima foram primeiro pré-clarifiçados com 10 pg de IgG de murganho ou anticorpos monoclonais para LTa ou LTp e depois HVEM:Fc foi adicionado para precipitar os ligandos. As proteínas ligadas ao HVEM:Fc foram então resolvidas por SDS-PAGE redutora e detectadas por fosfoimagem.

Purificação do ligando HVEM, p30. Células II-23.D7 foram activadas com PMA (100 ng/mL) ou PMA e ionomicina (1 pg/mL) por 2,5 horas, seguido por marcação com 35S-metionina e -cisteína como nos dois parágrafos acima. Os extractos celulares foram pré-clarifiçados com IgG humana (5 pg) e pérolas de proteína G para remover as proteínas não especificamente ligadas. O extracto foi então esgotado de LTa por tratamento do extracto com TNFR60:Fc e pérolas de proteína G. O HVEM:Fc e as pérolas de proteína G foram então adicionados ao extracto e incubados. Em cada caso, as pérolas foram lavadas três vezes para remover as proteínas contaminantes na fracção não ligada. As pérolas foram eluídas em tampão contendo ureia 8 M e analisadas na primeira dimensão por focagem isoeléctrica (gradiente formado com uma mistura de anfolina de pi de 5 - 7 (50%0, 3-10 (40%), 2-11 (10%) e SDS-PAGE redutora (15% de gel) na segunda dimensão. A purificação do p30 por HVEM:Fc foi monitorizada por comparação a amostras purificadas por LtPr:Fc ou TNFR60:Fc. As proteínas purificadas LTPR:Fc, ΐταΐβ2 foram isoladas das células 11-23.D7 estimuladas com PMA e estão apresentadas na Figura 4A e as proteínas ligadas ao TNFR60:Fc que foram utilizadas para esgotar a LTa do extracto estão apresentadas 77 na Figura 4B. 0 p30 purificado por HVEM:Fc como descrito acima está apresentado na Figura 4C. Apresentados na primeira pista de cada gel estão os marcadores de peso molecular marcados com 14C e na segunda pista estão as proteínas ligadas ao receptor:Fc passadas apenas na segunda dimensão. 0 LTa é segregado por células 1123.D7 depois de activação com PMA (Ware et ai. (1992), citado supra; Crowe et al. (1994) Science 264:707). O HVEM:F c e o TNFR:Fc precipitados segregaram LTa de células 11-23.D7 estimuladas com PMA e ionomicina tal como indicado por SDS-PAGE. A LTa migra como uma variedade de pesos moleculares devido à heterogeneidade em glicosilação Browning et al. (1991), citado supra). O TNFR60:Fc, mas não o HVEM:F c também precipitaram TNF (17 kDa, desde modo confirmando os resultados dos estudos de competição descritos supra. O LTPR:Fc, conforme esperado, não ligou quaisquer proteínas segregadas, mas precipitou o complexo LTP (33 kDa) e LTa (23 - 25 kDa) dos extractos de detergentes de células 11-23.D7 activadas com PMA. No entanto, quando o estímulo incluiu ionomicina e PMA, o LTpR:Fc precipitou uma banda principal a 30 kDa, bem como uma pequena quantidade de LTP a 33 kDa e LTa a 23 - 25 kDa. O TNFR60:Fc precipitou uma proteína de 23 kDa idêntica em tamanho ao precursor de LTa. Em contraste, o HVEM:Fc precipitou ambas as proteínas 30 kDa e 23 kDa. Três receptores diferentes que bloqueiam anticorpos monoclonais para ίτβ não removeram a proteína de 30 kDa do extracto antes da adição de HVEM: F c o que indica que a proteína p30 é antigenicamente não-relacionada à ltP . No entanto, os 78 anticorpos anti-LTa removeram a banda de 23 kDa dos extractos o que indica relação dos mesmos com a LTa. A incapacidade dos anticorpos para LTa de pré-clarificar as bandas de 30 kDa e 23 kDa demonstra que estas proteínas não estão associadas entre si, ao contrário de LTa e ΐτβ que formam heterotrímeros (Androlewicz et al., citado supra). O LIGHT (p30) foi purificado a partir de células II-23.D7 por cromatografia de afinidade. Etapas sucessivas de TNFR60:Fc e HVEM:Fc foram usadas, de tal modo que a LTa é removida dos extractos por TNFR60 e, desse modo, não interfere com a ligação de p30 ao HVEM:Fc.

A electroforese bidimensional (2D) das proteínas que ligam HVEM:Fc, TNFR60:Fc ou LTpR:Fc murino revelou que o p30 tem uma proporção distinta de carga para massa quando comparado com LTa e ΙΤβ. A ΙΤβ no complexo 1Ταΐβ2 precipitada por ΐτβΕ:Ρσ é ácida com quatro isómeros de carga distintos que variam em pi de 5 - 6,5 com um aumento detectável em massa das formas ácidas (Figura 4A) . A LTa, como um complexo com ΐτβ ou o homotrímero LTa ligado ao TNFR60 (Figura 4B), tem sete isómeros distintos que variam em pi de 7 a 8,5; o precursor LTa de 23 kDa tem o pi mais básico (> ou =9). O pi de LTa sem sequência sinal é de 8,9. Estes resultados são característicos de aductos de glicosilação e estão totalmente de acordo com estudos publicados anteriormente para LTa e LTβ (Browning et al. (1991), citado supra). Em contraste, o p30 migrou como uma banda larga (pi de 7 - 8,5) que sob intensidade mais baixa resolve em três bandas (Figura 4C) . A 79 heterogeneidade da carga sem mudança discernível em massa de p30 é possivelmente o resultado da modificação pós-translacional tal como a adição de fosfatos ou fosfolipidos.

Estes resultados demonstram claramente que o HVEM liga uma nova proteína de superfície celular de 30 kDa (isolada do hibridoma de célula T CD4+ humana, II.23.D7) com isómeros com pi de 7 a 8,5, que é referido como o ligando p30 ou HVEM (ou LIGHT). O p30 é antigenicamente e fisicamente distinto da ΐτβ. O ligando HVEM é também reconhecido por LTPR:Fc, mas não por TNFR.

Exemplo 4. A glicoproteína do envelope da gD do HSV compete com o ligando HVEM endógeno (p30) para ligação ao HVEM:Fc

Este exemplo demonstra a ligação da proteína gD-Ι do herpesvirus HSV ao HVEM e que a gD-Ι solúvel compete com o ligando HVEM ou p30 (light) por ligação ao HVEM. Os dados que mostram que a proteína gD-Ι do HSV é um antagonista de p30 (LIGHT) de ligação ao HVEM também demonstram que o p30 pode actuar como um antagonista da proteína gD-Ι do herpesvirus ao HVEM. HVEM:Fc (2 pg/mL) foi pré-incubado por 30 minutos a 4 °C com gD-1 (250 pg/mL) ou gD-Ι (Δ290-299) (100 pg/mL) , e depois adicionado a células 11-23.D7 activadas com PMA e ionomicina (como no Exemplo 1) . A coloração de fundo foi determinada com huIgG e é igual a HVEM:Fc + gD-Ι (Δ290-299). A ligação de HVEM:Fc a células II-23.D7 activadas competiu 80 com concentrações graduadas de gD-1 ou gD-1 (Δ290-299) (para protocolo, ver Exemplo 1). A possibilidade de que a gD do HSV possa funcionar como um antagonista do ligando HVEM (ligandos celulares, por exemplo, p30), que se liga ao HVEM foi sugerida pela ligação da proteína gD-Ι do HSV ao HVEM. A gD-Ι solúvel e um mutante de gD, gD-Ι (Δ290 - 299t) com ligação aumentada por HVEM, foram ambos eficazes em bloquear a ligação de HVEM à superfície de células 11-23.D7 activadas (Figura 5A) (que expressam p30). A concentração inibidora das proteínas gD-1 correlacionou com a sua afinidade por HVEM (Figura 5B) . A ligação de LTPR:Fc ou TNFR60:Fc a células 11-23.D7 activadas com PMA ou PMA/ionomicina não foi inibida pela gD-Ι (Δ1290 -299t), o que indica que a interacção de HVEM:gD-l é altamente específica. Este resultado sugere que a gD-Ι co-evoluiu especificamente para ligação ao HVEM, embora o HVEM ligue-se a ligandos que são reconhecidos por TNFR60 e LtPr. Estes resultados indicam que a gD-Ι é uma virocina ancorada em membrana e pode modular as actividades de sinalização do HVEM durante a entrada ou saída do HSV da célula infectada.

Exemplo 5. Reticulação de HVEM de superfície celular resulta na activação de linfócitos

Este exemplo demonstra que o anticorpo anti-HVEM promoveu a proliferação aumentada de células linfocíticas no sangue periférico (PBLs), incluindo células T e células B. Os dados que apresentam que o anticorpo anti-HVEM pode promover a proliferação de PBLs (que também expressam o ligando HVEM 81 p30, ou LIGHT) também demonstram que o p30 (LIGHT) associado a célula pode funcionar como um sinal indutor de proliferação para PBLs. Além disso, a constatação de que o anticorpo anti-HVEM adicionado a linhagens celulares B cultivadas em meio com baixo nivel de soro estimulou o seu desenvolvimento de uma maneira dose-dependente também demonstrou que a sinalização de HVEM, por exemplo, a ligação de LIGHT a HVEM pode estimular a proliferação de células B.

Actívação de células T. Linfócitos do sangue periférico recém-isolados foram incubados em meio contendo diluições graduadas de anti-HVEM de coelho ou soros pré-imunes (Montgomery (1996) supra) e PMA a uma dose sub-mitogénica (1 pg/mL). A proliferação foi medida depois de 3 dias por incorporação de 3H-timidina dentro do ADN conforme avaliado por contagem por cintilação β.

Os linfócitos do sangue periférico recém-isolados foram activados com fito-hemaglutinina (PHA) a 5 pg/mL e cultivados em meio com IL-2. Depois de 17 dias as células foram re-estimuladas com diluições graduadas de anti-soro anti-HVEM e anticorpo anti-CD3 (0KT3) a uma concentração sub-mitogénica (1,5 pg/mL). A proliferação foi medida depois de 3 dias como acima.

Análise por citometria de fluxo de células B. Células RAJI linfoblastóides humanas foram submetidas a análise por citometria de fluxo por incubação com anti-soro anti-HVEM (diluição a 1:100) ou IgG de coelho de controlo a 4 °C e coradas com IgG de cabra anti-coelho conjugada com 82 ficoeritrina. Para cada histograma foram analisadas 104 células.

Activação de células B. Células RAJI foram transferidas para um meio contendo 2% de FBS durante 24 horas e depois incubadas por 3 dias na presença das diluições indicadas de anticorpo anti-HVEM de coelho ou só de meio de cultura. A proliferação das células foi avaliada conforme descrito acima. 0 HVEM é expresso em células T CD4+ em repouso o que sugere que poderia funcionar como uma molécula co-estimuladora para a proliferação celular durante a fase inicial de uma resposta imune. A concentrações sub-óptimas de PMA, o anticorpo anti-HVEM promoveu a proliferação aumentada de linfócitos no sangue periférico indicado por um aumento na captação de 3H-timidina medido depois de 3 dias em cultura (Figura 6A) . Os linfócitos de memória, gerados por cultura continuada durante 10 a 17 dias depois da activação com PHA, também foram reactivados com o anticorpo anti-HVEM em concentrações sub-óptimas do anticorpo anti-CD3 (Figura 6B) . Este resultado indicou que o HVEM funciona na fase efectora da resposta imune. Pelo facto de que os anticorpos podem simular a acção dos ligandos relacionados ao TNF (Engelmann (1990) J. Biol. Chem. 265:14497), estes resultados indicam que o ligando HVEM de 30 kDa associado a células pode funcionar como um sinal indutor de proliferação para as células T. 83 A LTOC demonstrou anteriormente que estimula actividades de aumento de crescimento para linfócitos B, incluindo linhagens celulares transformadas em virus Epstein-Barr (Abken (1992) J. Immunol. 149:2785; Estrov (1993) J. Exp. Med. 177:76; Kehrl (1987) Science 238:1144; Gibbons (1994) Eur. J. Immunol. 24:1879). 0 HVEM é também expresso em linhagens de linfoblastóides B (Figura 7A) . 0 anticorpo anti-HVEM, quando adicionado a culturas de linhagens celulares B de células RAJI em meio com 2% de soro, estimulou a captação de 3H-timidina de uma maneira dose-dependente, o que indica que o HVEM pode sinalizar a manutenção da viabilidade das células B em niveis baixos de soro (Figura 7B) . A LTOC exibiu um efeito estimulador de 2 a 3 vezes nesse ensaio. A presença de TNFR60 e TNFR80 como factores de crescimento negativo pode contribuir para uma baixa resposta a LTa. 0 efeito positivo do anticorpo anti-HVEM pode ser uma propriedade específica do p30 (ligando HVEM, LIGHT).

Exemplo 6. Produção de HVEM:Fc de murganho

Este exemplo demonstra a construção de uma construção recombinante de HVEM:Fc de murganho. A região extracelular do HVEM de murganho foi amplificada por PCR a partir do ADNc de HVEMm (Hsu et al., 1997) a começar com Meti e a terminar com Ser205 (iniciador directo = 5'- tatGGATTCatggaacctctcccaggat-3', e iniciador reverso = 5'-tatGGATTCggaggagcaggt ggtgtctgt-3'; ambos os iniciadores contêm um sítio BamHl. 0 produto 550 bpPCR foi purificado por Wizard PCR Preps (Promega), digerido com BamHl 84 e depois ligado in-frame ao vector pVLl392 do Baculovirus de corte BglII (Pharmingen) que contém a região Fc da IgCl humana na extremidade 3' do inserto de HVEM (pVLl392-mHVEM:Fc). A mistura de reacção de ligação foi usada para transformar células competentes XL-1 blue (Stratagene) para uma preparação de plasmideo. Células de insecto TN5 (l,25x 106) foram plaqueadas num frasco T25 em 4 mL de Meio Exceli 401 (JRH Biosciences) e deixadas a ligarem-se por 2 horas. As células TN5 foram co-transfectadas com 1 pg dos plasmideo pVLl392-HVEMFc e 250 ng de Baculogold™ DNA (Pharmingen) utilizando 14 pg de Lipofectina™ (Gibco BRL). No dia seguinte o meio foi trocado e o sobrenadante contendo o virus foi colhido depois de 4 dias. O virus foi amplificado para fazer um material para produção de proteína. HVEM:Fc de murganho foi produzido em células de insecto TN5 e purificado até a homogeneidade conforme descrito (Crowe et al., 1994). Em resumo, as células TN5 foram infectadas com baculovirus recombinante contendo HVEMm:Fc a uma MOI de 10. Depois de 3 dias o sobrenadante foi colhido, clarificado das células e detritos e tratado com inibidores de protease. A proteína do HVEMm:Fc purificada foi obtida por cromatografia de afinidade em proteína A com uma eluição ácida (pH 2,5). A análise de HVEMm:Fc por SDS-PAGE apresentou uma única banda de proteína a 58 kDa em condições de redução (ver a Figura 8). A preparação foi julgada pelo teste do lisado de Limulus para ficar livre de endotoxina detectável. 85

Exemplo 7. Efeito inibidor de HVEM:Fc de murganho sobre a inflamação (hipersensibilidade do tipo retardado) em murganhos

Este Exemplo demonstra que a proteína de fusão HVEM:Fc recombinante, solúvel da invenção tem um efeito inibidor sobre a inflamação in vivo utilizando um modelo animal reconhecido na técnica.

Murganhos BDFl fêmeas, com oito semanas de idade (Japan SLC Inc., Shizuoka, Japão) (N=8) foram imunizados com 50 pg de OVA adsorvido em 1 mg de alúmen por injecção subcutânea. Depois de 7 dias HVEMm:Fc ou IgC de controlo foi administrado por injecção intraperitoneal e os murganhos foram desafiados na almofada plantar com 50 pg de OVA absorvido em 10 pg de alúmen. As medições da espessura das almofadas plantares direitas foram realizadas imediatamente antes e 24 horas depois do desafio com o antigénio e o intumescimento (aumento percentual) da espessura da almofada plantar foi calculado. A supressão de 300 pg de HVEMm:Fc foi estatisticamente significativa (P<0,05), conforme apresentado pelos dados resumidos na Figura 9.

Exemplo 8. Efeito inibidor de HVEM:Fc de murganho sobre artrite induzida por colagénio em murganhos

Este exemplo demonstra que a proteína de fusão HVEM:Fc da invenção tem um efeito inibidor sobre a inflamação in vivo utilizando um modelo animal reconhecido na técnica para artrite. 86

Murganhos DBA/1 de seis semanas de idade (Seatec Yoshitomi, Hukuoka, Japão) (N=10) foram imunizados com emulsões de 100 pg de colagénio bovino tipo li e 100 mg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) em adjuvante incompleto de Freund na base da cauda por injecção subcutânea e reforçados 28 dias mais tarde com a mesma emulsão. Sessenta pg de HVEMm:Fc ou IgG de controlo foram administrados por via intraperitoneal duas vezes por semana a partir do segundo dia de imunização. A pontuação clinica para cada pata foi

avaliada por referência à seguinte escala: 0=normal, l=intumescimento e/ou eritema de um dedo, 2=intumescimento e/ou eritema de dois ou mais dedos, 3=intumescimento e/ou eritema de toda a pata, 4=intumescimento completo e eritema de toda a pata e incapacidade de curvar o tornozelo. A pontuação CIA foi expressa como o valor cumulativo para todas as patas, com um máximo de 16 (Figura 10). Os dados apresentados na Figura 10, demonstram que o HVEM:Fc teve um efeito significativo sobre a inflamação da almofada plantar e tornozelo.

Exemplo 9, Inibição de infecção por herpesvírus por LIGHT homotrimérico solúvel

Este exemplo demonstra que os polipéptidos LIGHT homotriméricos da invenção podem bloquear a entrada do herpesvirus em células in vivo. Demonstra também que a actividade anti-viral de LIGHT é pela sua ligação ao LTPr e não ao HVEM. Este exemplo também demonstra que tanto o LIGHT 87 como a LTOC podem evitar a infecção por vírus de células de uma maneira dose-dependente (Figura 12).

Os herpesvírus têm mecanismos genéticos que especificamente se dirigem aos sistemas de citocina da super família TNF, o que sugere que o sistema imunológico evoluiu contra-medidas específicas para suprimir a reactivação ou disseminação do herpesvírus no hospedeiro. 0 LIGHT foi testado juntamente com outras citocinas para determinar a sua capacidade de inibir a infecção por citomegalovírus (CMV). Para investigar as propriedades anti-virais e biológicas de LIGHT, foi preparada uma forma solúvel, por meio de engenharia genética, que deleta a cauda citoplasmática e os domínios transmembranares. Conforme descrito em detalhe no Exemplo 12, adiante, foi produzida uma forma recombinante solúvel de LIGHT que não tem os 66 aminoácidos do N-terminal e foi designada "LlGHTt66". 0 LIGHT solúvel produzido de forma recombinante, e seus mutantes, foram segregados exclusivamente como homotrímeros (LIGHT do tipo selvagem expresso como um homotrímero).

Fibroblastos dérmicos humanos normais foram infectados com o isolado clínico de CMV humano (HCMV) Fiala (HCMV-F) ou a estirpe de laboratório AD 169 de HCMV a uma baixa multiplicidade de infecção (MOI) de 0,05. As citocinas que sinalizam através do TNFRl (LTOC) ou LtPr (ύτα1β2, LIGHT) foram adicionadas ao sobrenadante da cultura e incubadas por 7 dias. 88 A adição de LTa bloqueou completamente o efeito citopático virai (CPE). Esta inibição foi especifica porque a proteína TNFR solúvel tipo I (TNFR:Fc) neutralizou o efeito anti-viral (Figuras 11A e 11B). Além disso, um mutante pontual de LTa (Y108F) que já não se pode ligar ao TNFR mas retém integridade de conformação, foi incapaz de bloquear a disseminação do HCMV (Fig. 11C). ΤΤαΐβ2 e LIGHT, ambos os quais se ligam ao LtPr, também foram capazes de bloquear a CPE virai (Figuras 11D, 11E) . Um mutante pontual de light (G 119E), que é incapaz de ligar-se ao LTPr, mas retém ligação ao HVEM, foi incapaz de inibir a disseminação do HCMV (Figura 11F) . Isto indica que é provável que a actividade anti-viral de LIGHT seja através da ligação ao ltPr e não ao hvem. A análise quantitativa da actividade anti-HCMV de LTa, LTaip2 e LIGHT foi obtida pela medição da expressão de ambas as proteínas precoces imediatas principais (IE1) e a proteína do tegumento tardia pp28 por Western blot. A LTa e o LIGHT apresentaram actividades anti-virais relativas similares, sendo capazes de inibir completamente o efeito citopático do HCMV a uma concentração de 100 pM, ao passo que a ΤΤαβ2 foi aproximadamente 10 vezes menos eficaz. Os anticorpos monoclonais específicos para o receptor da linfotoxina (ΗΤβΗ) também eram inibidores potentes da disseminação do HCMV.

Além disso, estudos que utilizam γ-herpesvírus de murganho apresentaram uma redução em unidades formadoras de 89 placas (Figura 12) . Células de rins de macaco coruja em micloplacas de 12 poços foram infectadas com 500 unidades formadoras de placas (PFU) por poço por 60 minutos a 37 °C e cobertas com carboximetilcelulose (0,75%) em meio de cultura contendo soro fetal bovino (FBS) com ou sem LIGHT ou LTa nas concentrações indicadas. Depois de 7 dias, as células foram fixadas com metanol e coradas com Gemisa. Cada ponto dos dados na Figura 12 é o número médio de placas em dois poços. Os dados claramente demonstram que tanto o LIGHT como a LTa foram capazes de diminuir, de forma significativa, o número de células infectadas de uma maneira dose-dependente. O MHV-68 do murganho é similar aos γ-herpesvírus humanos EBV e HHV-8. O EBV está implicado como o factor oncogénico em certos cancros humanos incluindo o linfoma associado ao EBV e o carcinoma nasofaringeano. O HHVE está ligado ao sarcoma de Kaposi associado à SIDA.

Exemplo 10. Actividades biológicas de LIGHT homotrimérico solúvel

Este exemplo demonstra que um polipéptido LIGHT recombinante, solúvel homotrimérico LIGHT da invenção é activo em vários ensaios de respostas celulares, incluindo a apoptose de linhagens celulares HT29 de adenocarcinoma e a indução de ICAM-I em fibroblastos. Tal como discutido no Exemplo 9, acima, para investigar as propriedades biológicas de LIGHT, foi preparada uma forma solúvel, o LIGHT t66 solúvel produzido de forma recombinante (descrito em detalhe no Exemplo 12) . Embora este polipéptido solúvel não tenha a 90 cauda citoplasmática e os domínios transmembranares do tipo selvagem p30, o mesmo retém a estrutura terciária do tipo selvagem homotrimérico.

As células HT29 e a linhagens celulares 293 foram obtidas da ATCC; as células HT29 foram derivadas de adenocarcinoma humano, ATCC número HTB-38 (ver, por exemplo, Chen (1987) Câncer Genet. Cytogenet. 27:125-134). Ambas as linhagens celulares foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FBS com glutamina e penicilina/estreptomicina.

As células 293 foram transfectadas de forma estável com ADNc que codifica o polipéptido LIGHT solúvel humano (ver Exemplo 12). Os clones do polipéptido solúvel com alta expressão foram seleccionados para cultura em grande escala. O meio utilizado de células 293-LIGHT foi colhido para purificação por uma combinação de cromatografia de troca iónica e de afinidade. O LIGHT foi purificado até a homogeneidade (ver Figura 13), com um rendimento de 10 a 15 mg por litro e com níveis de endotoxina inferiores a 0,1 unidades de endotoxina/mg. A actividade da proteína de LIGHT purificada foi medida por um ensaio ELISA específico que utiliza formas solúveis de LTPR ou HVEM numa forma de ligação à placa. O LIGHT solúvel recombinante (LIGHT t66 homotrimérico) liga-se ao HVEM e LTPr de murganho tão eficazmente quando as formas humanas homólogas. 91 0 LIGHT é activo em vários ensaios de resposta celular, incluindo a apoptose das células HT29 e a indução de ICAM-1 em fibroblastos (o ICAM é um marcador de adesão celular de inflamação). 0 LIGHT é tão eficaz quanto a LTaip2 na indução da morte das células HT29, mas é fraco em comparação com a capacidade do TNF ou LTOC em induzir a expressão de ICAM-1. Este último resultado sugere que o LIGHT pode não ser pró-inflamatório. In vivo, o LIGHT não parece ser pró-inflamatório ou tóxico porque os murganhos injectados com LIGHT purificado (dose máxima testada de 200 pg por murganho) não apresentam os sintomas de choque observados quando são administrados TNF ou LTOC nesta dose.

Exemplo 11. NF-κΒ, mas não TRAF, necessário para efeito anti-viral mediado por light

Este exemplo demonstra que a actividade anti-viral do LIGHT solúvel, homotrimérico e da linfotoxina (LT) requer a actividade de NF-kb (as células que não têm a actividade nf-KB eram refractárias aos efeitos de LIGHT) (ver Figura 14) . Deste modo, este exemplo demonstra que a activação das vias apoptóticas dependentes da actividade nf-kb está envolvida na actividade anti-CMV de LIGHT. Não foi observada qualquer morte celular em fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) tratados com LTOC, LT0íip2 ou LIGHT. Isto demonstra que a actividade anti-viral destas citocinas pode ser independente da via de morte apoptótica que pode ser desencadeada pelo tnfr. isto sugere 92 que um mecanismo dependente de NF-KB pode ser operativo, uma vez que esta é a outra via importante activada por este receptor. 0 NF-KB também controla a transcrição de várias proteinas anti-apoptóticas em fibroblastos, deste modo cancelando a via da apoptose. A fim de testar esta hipótese, um mutante negativo dominante do inibidor da subunidade de NF-KB(X ( ikbocm) foi introduzido dentro do NHDF por transdução com vector retroviral. Este mutante não pode ser fosforilado e deste modo permanece num complexo estável com NFKB. Isto evita a transcrição de genes dependentes de KB. Tanto o TNF como a LTa não induzem a expressão de ICAM em NHDF-IKBOCM, o que demonstra a eficácia (de inibir o NF-KB) do mutante negativo dominante IKBOCM.

As células NHDF-IKBOCM foram então comparadas a células transduzidas só com o vector (NHDF-LXSN) ou a capacidade das várias citocinas em inibir a replicação do HCMV. Constatou-se que as células NHDF-lKBccM eram refractárias aos efeitos das linfotoxinas e do LIGHT (Figura 14) . De forma significativa, niveis mais elevados de IEl e pp28 foram observados para uma dada concentração da citocina em NHDF-IKBaM em comparação com Células NHDF-LXSN.

Além disso, foi produzido um aumento de 10 vezes em HCMV infeccioso de células NHDF-lKBocM na presença de citocina. Curiosamente, o HCMV replicou igualmente bem em células NHDF-ικΒαΜ como em células nhdf-lxsn na ausência de 93 citocina, tal como testado por expressão de IEl e pp28 e titulação virai. Este resultado indica que o NF-KB não é essencial para a replicação virai eficaz em fibroblastos, embora o promotor IE contenha elementos múltiplos de resposta NF-KB. 0 TRAF3 é recrutado directamente para ο ΕΤβκ onde está envolvido na sinalização da apoptose, mas não na activação de NFKB. Isto foi demonstrado pelos mutantes negativos dominantes de TRAF3. Os mutantes negativos dominantes de TRAF3 (TRAF3A7 e TRAF3A11) introduzidos em células NHDF por transdução de retrovirus similar a IKBOtM, permaneceram sensíveis à actividade anti-vírus do LIGHT e das linfotoxinas. Isto indica que a activação da via apoptótica dependente da actividade de NFKB não está envolvida na actividade anti-viral (anti-CMV) do LIGHT solúvel.

Exemplo 12. Produção e caracterização de LlGHTt66 solúvel (homotrimérico) e mutantes pontuais de LIGHTt66

Este exemplo demonstra a construção e o isolamento de polipéptidos LIGHT solúveis, recombinantes (utilizados nos Exemplos 9 a 11, 13 e 14), incluindo aqueles com mudanças de resíduos simples (isto é, mutantes pontuais) que, tal como demonstrado adiante, são segredados como homotrímeros.

Foi produzida uma forma solúvel recombinante de LIGHT que não tem 66 aminoácidos do N-terminal (designada LlGHTt66). 0 LIGHT truncado, solúvel foi ainda modificado 94 para incluir o marcador "FLAG" para purificação por imuno-afinidade por anticorpo anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO). A construção marcada com FLAG, truncada foi designada LlGHTt66-FLAG.

As células HT29 e 293 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) e cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino com glutamina e penicilina/estreptomicina. Fibroblastos dérmicos Neonatais Humanos Normais (células NHDF) foram adquiridos da Clonetics, San Diego, CA e desenvolvidos em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, insulina (5 pg/mL) e factor de crescimento de fibroblastos (1 pg/mL) (Sigma, St Louis, MO). O LlGHTt66-FLAG foi produzido em células (293) de mamifero transfectadas de forma estável. As células 293 estavelmente transfectadas foram desenvolvidas em cultura em garrafa rotatória em DMEM contendo 0,5% de FBS. A concentração de LIGHT t66 atingiu 10 mg/L em culturas de 7 dias. O LIGHT t66 foi parcialmente purificado a partir de sobrenadantes de 7 dias por um procedimento de troca iónica. O sobrenadante diluído a 1:2 em Tris 20 mM, pH 7,0, de modo que a concentração inicial de NaCl era de 50 mM, foi carregado numa coluna SP Hitrap™ (Pharmacia). Depois de lavagem, o LIGHT t66 foi eluído utilizando Tris 20 mM/NaCl 500 mM, pH 7,0. Depois de diálise em PBS, o LIGHT t66 foi adicionalmente purificado por cromatografia de afinidade numa coluna de anti-FLAG (M2) monoclonal acoplada a Affigel™ (Biorad). O LIGHT t66 foi eluído da coluna pela utilização de 95 glicina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 3,0, e imediatamente neutralizado por colecta em Tris 50 mM, pH 7,4.

Uma forma solúvel de light (LIGHT t66) com a adição de um epitopo de FLAG na região N-terminal foi produzido em células 293 estavelmente transfectadas e purificado até a homogeneidade por troca iónica seguido por purificação por imunoafinidade numa matriz de afinidade de anti-FLAG (M2) monoclonal. O rendimento final da proteína foi de 80% e a pureza >95% (Figura 15A). A modificação de sequência introduzida por iniciador foi utilizada para gerar um LIGHT solúvel com as seguintes substituições de aminoácidos simples: G119E, L120Q Q11TT e Y173F. Em resumo, os iniciadores internos foram concebidos para introduzir um sítio de restrição no local de mutação. Os iniciadores directos e reversos contendo as mutações foram utilizados em reacções de PCR separadas para amplificar duas regiões de LIGHT solúvel. Os iniciadores eram como a seguir: Q117T: 5'ACGGGCCTGGCCTXCTGA_3', 5'_ACTCTCCCATAACAGCGGCC_3' . G119E: 5' GAGCTGGCC_ITGCTGAGGGGCCT 3", 5'_CAGCTGAGTCTCCCATAACA 3'. L120Q: 5' CAGGCC_ITCCTGAGGGGCCTCA-3 5'_GCCCAGCTGAGTCTCCCATAA_3' . Y 173F: 5' TTCCCCGAGGAGCTGGAGCT-3 5' GCGGGGTGTGCGCTTGTAGA 3'. 96

Os produtos da PCR foram ligados no sítio de enzima de restrição introduzido por iniciador para criar o LIGHT solúvel a começar no aminoácido t66 e contendo uma das 4 substituições de aminoácidos. Os mutantes de LIGHT t66 foram ligados no cassete marcado com FLAG, pBABE-FLAG que contém a sequência de sinal V-cam fundida ao epítopo de FLAG. Os insertos dos mutantes V-cam FLAG-LIGHT foram clonados em pCDNA3.1 (+) (Invitrogen). Todos os mutantes foram sequenciados (sequenciador automático ABI310) para verificação inequívoca. Para a produção de proteína, as células 293T (1,5 x 106 células/placas de 10 cm) foram transfectadas com 5 pg ADN. A proteína solúvel contida no meio foi colhida depois de 24 horas em cultura.

Os mutantes de LIGHTt66-FLAG foram purificados a partir de sobrenadantes de 24 horas de cultura num procedimento de imunoafinidade de uma etapa utilizando uma matriz de afinidade de anticorpo monoclonal anti-FLAG (M2) acoplado a Affigel™ (5 mg de anticorpo por mL de gel). O sobrenadante da cultura (50 a 100 mL) foi passado por 0,5 mL de matriz de afinidade. O gel foi lavado com 10 volumes de PBS e a proteína ligada eluída com alíquotas de 0,5 mL de glicina 10 mM/HCl, pH 3,0 e neutralizada imediatamente por colecta em TRIS 50 mM, pH 7,4. As fracções contendo proteína foram dialisadas contra PBS.

Quatro mutantes de mudança de aminoácidos de LIGHT t66 marcado com FLAG - Y173F, G119E, L120Q e Q117T foram gerados em células 293T temporariamente transfectadas, tal como aqui descrito. Y173F é o análogo do mutante Y108F de LTOC, que se 97 situa na ansa D-E. 0 homotrímero LTY 108F não se liga a receptores. Q117T, G119E e L120Q são três mutações adjacentes nas ansas A-A, conservados entre LTp e LIGHT, cuja moldagem molecular prevê que estão envolvidos em ligação ao receptor. A proteína foi purificada por imuno-afinidade a partir de sobrenadantes da cultura num procedimento de uma etapa utilizando o anticorpo monoclonal FLAG (M2) acoplado a Affigel (Figura 15B). A pureza para todas as proteínas era de >95%.

Em seguida foi determinado que os mutantes pontuais trimerizaram. Análise por reticulação e por filtração em gel FPLC seguido por ELISA e dot blot das fracções demonstrou que LIGHT t66 e seus mutantes foram segregados exclusivamente como homotrímeros, sem material monomérico ou agregado contaminante detectável (Figuras 15C e D).

Ensaios ELiSAs foram utilizados para medir os polipéptidos LIGHTt66 recombinantes (incluindo as mutações pontuais). A molécula de captura, HVEM:Fc murina, HVEM:Fc humana, LTpR:Fc murina ou LTpR:Fc humana, foi imobilizada em poços de uma placa de microtitulação (150 ng/poço em 50 μL de Tris 20 mM/NaCl 150 mM, pH 9,6) por 16 horas a 4 °C. Depois de lavagem com PBS/0,5% de Tween, as amostras foram aplicadas diluídas em PBS/3% de BSA e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente. Depois da lavagem os poços foram incubados com anti-FLAG (M2) monoclonal (10 pg/mL em PBS/BSA) por 1 hora à temperatura ambiente, lavados e incubados com HRP de cabra anti-murganho (1:5000) por 1 hora à temperatura 98 ambiente. Depois da lavagem final, cor foi desenvolvida com 2,2'-AZINO-bis (ÁCIDO 3-ETILBENZ-TIAZOLINA-6-SULFÓNICO) (Sigma) . 0 OD foi medido a 415 nm num leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). 0 LIGHT parcialmente purificado foi reticulado pela adição de bis [2-(succinimidooxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) a concentrações finais de 0,1 e 1 mM, ou pela adição de glutaraldeído (0,1% e 1%) por 30 minutos a 4 °C com rotação. A reacção foi parada pela adição de TRIS (20 mM, pH 8,0). As amostras reticuladas e de controlo foram analisadas por Western blot utilizando anticorpo monoclonal M2 (anti-FLAG).

Com a finalidade de determinar o peso molecular do LIGHT t66 nativo, a proteina purificada foi analisada por filtração em gel numa coluna Superose 12™ utilizando um sistema FPLC 500 (ambos da Pharmacia, Piscataway, NJ) . O caudal era de 0,5 mL/min, fracções e 0,5 mL foram colhidas e o PBS era a fase móvel. O LIGHT em fracções eluidas foi detectado por ELISA. O peso molecular relativo de LIGHT t66 foi determinado por comparação com os perfis de eluição de proteínas de calibração.

Exemplo 13. Ensaios de citotoxicidade demonstram que o LIGHT solúvel pode desencadear a apoptose em células que expressam o receptor da linfotoxina

Este exemplo demonstra que o LIGHT t66 homotrimérico pode inibir o desenvolvimento e causar a apoptose em células 99 que expressam o receptor LTPr humano. Estes dados também indicaram que a reticulação do HVEM não induz a apoptose. Células HT29 (ver acima), a 5.000/poço, foram colocadas em poços de uma placa de microtitulação em DMEM (50 pL) na presença ou ausência de IFNy (80 U/mL). Diluições em série de LIGHT t66 e outras citocinas foram adicionadas em 50 pL de meio, de novo na presença ou ausência de iFNy e as células foram incubadas a 37 °C. Depois de 24 a 72 horas, foram adicionados 20 pi de 5 mg/mL de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difeniltetrazólio] e a placa foi incubada por 4 horas a 37 °C. O meio foi então aspirado e 100 pL de isopropanol a 70% acidificado foram adicionados para dissolver a formazina. O OD foi quantificado a 570 nm. O LIGHT t66 inibiu o desenvolvimento e causou a apoptose de células HT29 com uma eficácia comparável a ΕΤαΐβ2 (Figura 16A) . A citotoxicidade foi dependente de IFNy (Fig. 16B) e atingiu o máximo depois de 72 horas. Ao longo de uma variedade de experiências, foram atingidos 50% de citotoxicidade com doses de 10 a 100 pM. A citotoxicidade de LIGHT t66 pôde ser bloqueada pela pré-incubação de LIGHT t66 com LTPr:Fc humano ou HVEM:Fc de uma maneira dose-dependente; ao passo que Fas:Fc, que não se liga ao LIGHT, não teve efeito (Fig. 16C).

Na presença de IFNy, L120Q e Q117T eram citotóxicos a células HT29 com eficácia comparável a LIGHT t66 (Figura 19). Y173F, que se liga tanto ao huLTpR como ao huHVEM, demonstrou 100 citotoxicidade fraca, mas significativa a estas células, ao passo que G119E, que tem uma afinidade mais alta por HVEM do que o Y173F, mas não se liga a LTpR, não demonstrou citotoxicidade significativa.

Os dados obtidos com os mutantes de LIGHT t66 sugerem fortemente que a apoptose mediada por LIGHT de células HT29 é mediada via ΐτβϊΐ. Para confirmar esta hipótese e para determinar se a reticulação de HVEM mediada por LIGHT potência ou inibe a apoptose mediada por ΗΤβϊΙ, conduzimos experiências utilizando um painel de anticorpos monoclonais e policlonais anti-HVEM e anti-LTβR.

Para além de igG de HVEM policlonal de cabra e IgG de ΒΤβΒ de cabra, foram utilizados dois anticorpos monoclonais de murganho anti-HVEM, CWl e CW8, e dois anticorpos monoclonais de murganho 3ηΡί-!ΤβΒ, BDA8 e CDHIO. Todos ligados ao receptor apropriado na superfície de células HT29 (Fig. 20A). Os anticorpos anti-HVEM, CWl e CW8, foram utilizados com base em estudos de ELISA de bloqueio nos quais o CW8 inibiu a ligação de LIGHT a huHVEM, do mesmo modo que o anticorpo policlonal de cabra anti-HVEM, ao passo que o CWl não teve efeito na ligação (Fig. 20B).

Pelo facto do anticorpo monoclonal 3η1ί-ΒΤβΒ, BDA8, ter demonstrado que inibe a apoptose mediada por ττα1β2 de células HT29, ao passo que o CDHIO tenha demonstrado que aumenta este efeito, foi investigado se estes anticorpos poderiam afectar a apoptose mediada por LIGHT da mesma 101 maneira. Em estudos de ELISA de bloqueio o anticorpo policlonal de cabra anti-LTPR e BDA8 inibiram a ligação de LIGHT a LTpR, ao passo que CDH10 não teve efeito na ligação (Fig. 20C). O anticorpo policlonal de cabra anti-LTPR induziu a lenta morte apoptótica de células HT29 na presença de iFNy (Fig. 20D) , ao passo que o anticorpo policlonal de cabra anti-HVEM não afectou a viabilidade celular. Isto sugere que a reticulação de HVEM não induz a apoptose nesta linhagem celular.

Além disso, o anti-HVEM policlonal não aumentou nem inibiu a morte celular dependente de anti-LTPR policlonal (Fig. 20D). A pré-incubação com anticorpo policlonal de cabra anti-LTPR aumentou de forma acentuada a sensibilidade das células HT29 à morte mediada por LIGHT (Fig. 20E). DH10, que aumenta a morte por ΕΤαΐβ2, também aumentou a susceptibilidade das células ao LIGHT, ao passo que a pré-incubação com BDA8, que inibe a morte por ΗΤα1β2, resultou em reduzida citotoxicidade mediada por LIGHT (Fig. 20E) . A pré-incubação das células com policlonal de cabra anti-HVEM ou com os anticorpos monoclonais anti-HVEM, CWl e CW8, não tiveram efeito na sua susceptibilidade para morte por LIGHT.

Colectivamente, estes dados indicam que a reticulação de HVEM não induziu a apoptose, e que a sinalização de HVEM não actua como sinergista com a sinalização de ΕΤβΗ na 102 indução da apoptose e que a sinalização de HVEM não desencadeou eventos protectores suficientes para interferir com a via apoptótica dependente de ΐτβϊΐ.

Exemplo 14. Estudos de ligação de LIGHT solúvel, homotrimérico, humano a LTPr e HVEM por ELISA e ressonância de plasmons de superfície

As taxas de associação e dissociação da interacção de LIGHT t66 (um p30 homotrimérico, solúvel) e os mutantes de LIGHT t66 (descritos acima) com HVEM:Fc humano e LtPr:Fc foram determinadas por ressonância de plasmons de superfície. As características de ligação ao receptor foram investigadas por ELISA utilizando construções de LTpR:Fc e HVEM:Fc humano (hu) e murino (mu) como moléculas de captura e anticorpo anti-FLAG M2 para detecção (Figure 17). A molécula de captura, HVEM:Fc e LtPr:Fc humana, (50 pg/mL) foi acoplada a um chip sensor CM5 de um BIA-core 1000™ (BIAcore Inc., Piscataway, NJ) por acoplamento de amina ao pH 5,0. A superfície do sensor foi equilibrada com PBS (fosfato de sódio 20 mM/NaC1150 mM, pH 7,4) e sensogramas foram colhidos a 25 °C e um caudal de 5 pL/min. Uma injecção de 10 pL de LIGHT t66 ou mutante foi passada sobre a superfície do sensor; depois da fase de associação foram colhidos 800 segundos de dados de dissociação. A superfície do sensor foi regenerada depois de cada ciclo com um pulso de 10 pL de glicina 10 mM, pH 2,0. Conjuntos de 5 concentrações de analito, 100 a 500 nM foram colhidos e analisados por regressão não-linear utilizando o software BIlAevaluation 103 (2.1)™. Os dados de associaçao e dissociação foram ajustados com base do modelo simples ΑΒμΑ +B. O LIGHT t66 ligou-se ao huHVEM:F c e huLTpR:Fc com afinidade comparável. LIGHT t66 ligou-se ao muHVEM:F c e muLTPR:Fc com afinidade dez vezes inferior. Os mutantes de LIGHT 166, L120Q e Q117T ligaram-se ao huHVEM:Fc e huLTpR:Fc com afinidade comparável ao LIGHT t66. Curiosamente, L120Q apresentou afinidade aumentada para ambos os receptores murinos. G119E apresentou afinidade reduzida mas significativa para hu HVEM e ligação não detectável a hu LTPR, ao passo que Y173F tinha ligação reduzida mas significativa tanto para a hu LtPr como a hu HVEM. G119E e Y 173F não se ligaram aos receptores murinos. A análise de ligação de LIGHT t66 e seus mutantes a huLTPR:Fc e huHVEM:Fc por ressonância de plasmons de superfície confirmou e estendeu os dados obtidos por ELISA (Fig. 18). Os resultados estão resumidos no Quadro 1. As fases de associação e dissociação para interacção de LIGHT t66 com ambos os receptores ajustou-se bem com o modelo A+B μΑΒ simples, com ka = 2,7 ± 0,5 x 104 (M/s) para hu LtPr:Fc e 1,2 ± 0,2 x 104 (M/s) para huHVEM:Fc, e kd s=l,2 ± 0,2 x 10“4 e 4,8 ± 5,1 x 10~5 s_1 hu LTpR: F c e huHVEM: Fc, respectivamente. As constantes da taxa de dissociação intrínseca (kD), calculada a partir da proporção kd/ka, foram de 4,5 ± 0,7 nM para hu LTpR:Fc e 3,9 ± 3,9 nM para huHVEM:Fc (estes dados são a média de 5 medições por uma gama de concentração de 100 a 500 nM de LIGHT t66). 104 G119E não apresentou ligação detectável a huLTPR:Fc e sua afinidade por huHVEM:F c era aproximadamente 30 vezes inferior à de LIGHT t66 (KD =114 nM) . A redução em afinidade de G119E para huHVEM:Fc foi devido a um aumento na taxa de dissociação (kd =2,0 ± 0,4 x 1CT3 s-1) . Y173F ligou-se tanto a huLTPR:Fc como a huHVEM:Fc com afinidade reduzida, de novo, devido a taxas de dissociação aumentadas. A afinidade de Y173F para huLT8R (kD =31 nM) foi 3 a 4 vezes inferior à de LIGHT t66, ao passo que a afinidade de Y173F para huHVEM:Fc foi mais de 40 vezes inferior (kD =180 nM). O Q117T ligou-se tanto a huHVEM:Fc como a huLTPR:Fc com taxas de associação similares a LIGHT t66, e taxas de dissociação mais lentas, de modo que a afinidade desse mutante para os receptores foi aumentada em relação a LIGHT 166.

Quadro 1:

Hu HVEM:Fc HuLiPR:Fc ka (ΝΓ1 s ^) kd (s ^) kD (nM) ka (M_1 s_1) kd (s_1) kD (nM) LIGHTt 66 1,2+0,2x10" 4,8 + 5, lxl0~b 3,9+3,9 2,7+0,5x10" 1,2+0,2x10" 4,5+0,7 Q117T 2,0+0,7x10" 5,0+4,5xlOõ 0,3+0,3 3,2+0,7x10" 4, 5 + 1,2x10~b 1,5+0,7 G119E 1,8±0,4x10" 2,0±0, 4xlO~J 114+14 Sem ligação Y173F 1,9+0,2x10" 3,3 + 0, lxl0~J 173+30 3,7+0,8x10" 11,1+0,4xlO"J 1 31 + 8 105

Exemplo 15. A regulação positiva de ICAM por LIGHT solúvel, homotrimérico humano é mediada por ltPr

Este exemplo demonstra que o LIGHT solúvel, homotrimérico e duas variações (mutações pontuais em L120Q e Q117T) podem regular positivamente a expressão de ICAM. Células NHDF foram utilizadas na passagem 5 ou antes. As células (180,000/placas de 4,2 cm2) foram incubadas com citocina em DMEM completo (600 pL/poço) suplementado com insulina e factor de crescimento de fibroblastos. Depois de 36 horas as células foram coradas com um anti-lCAM monoclonal (P2A4; 10 pg/mL) seguido por um IgG-PE de cabra anti-murganho e analisadas por citometria de fluxo. L120Q e Q117T (5 nM) induziram a regulação positiva da expressão de ICAM por células NHDF a níveis comparáveis àqueles obtidos utilizando LIGHT t66 (indução de 4 vezes) (Figura 21) . Quando utilizado a 5 nM o Y173F causou uma ligeira indução da expressão de ICAM, ao passo que a 20 nM a indução foi de 2,5 vezes. A 5 nM o G119E não causou indução detectável da expressão de ICAM e ligeira indução (<1,5 vezes) a 20 nM.

Exemplo 16. HVEM co-localiza com TRAF2 e TRAF5, mas não TRAF3 sobre a membrana celular

Este exemplo demonstra que o HVEM, quando co-expresso como uma proteína recombinante em células 293 com 106 polipéptidos TRAF, co-localizou-se e ligou-se ao TRAF2 e TRAF5 (mas não ao TRAF3) sobre a membrana celular.

Em experiências de co-transfecção em células 293, foi demonstrado (utilizando microscopia de imunofluorescência confocal) que o HVEM co-localizou-se com os TRAFs 2 e 5, mas não TRAF 3. 0 LTPR co-localizou-se com todos os três TRAFs examinados; o controlo negativo foi a co-transfecção com o vector vazio pBabe. Os TRAFs marcados com FLAG foram visualizados com FITC. O LTPr e o HVEM foram visualizados utilizando Texas Red. As proteínas co-localizadas apareceram em amarelo. O HVEM co-localizou-se com os TRAFs 2 e 5, mas não com o TRAF3. O LTpR co-localizou-se com os TRAFs 2, 3 e 5.

Foi também demonstrado que o HVEM ligou-se ao TRAF2 e TRAF 5 por experiências em que a imunoprecipitação do HVEM expresso de forma recombinante (por anticorpos anti-HVEM) co-precipitou os TRAFs 2 e 5, mas não o TRAF3 (a partir de lisados das células 293 transfectadas). O LTPr precipitou apenas o TRAF3. Ver as Figuras 22A e 22B.

Procedimentos de Microscopia de Imunofluorescência Confocal

Vinte e quatro horas depois da transfecção células 293T foram semeadas em 8 poços Lab-TekB chamber Sides (Lab-Tek catálogo número 177445) a 3 X 104 células/poço e cultivadas por 18 a 36 horas a 37 °C e 5% C02. Para coloração, os poços foram lavados duas vezes com PBS, fixados por 10 minutos à 107 temperatura ambiente em paraformaldeído a 2% recém-preparado em PBS, pH 7,0, lavados de novo duas vezes com PBS, e depois permeabilizados em metanol por 2 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas em PBS, depois bloqueadas por um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente em PBS contendo 3% de BSA. O policlonal de cabra anti-LTPR foi diluído até uma concentração final de 20 pg/mL, o policlonal de rato anti-HVEM foi diluído até uma concentração final de 20 pg/mL e monoclonal de murganho anti-FLAG M2 (Sigma F3165), foi diluído até uma concentração final de 5 pg/mL. Os anticorpos foram diluídos em PBS, 3% de BSA e 0,2% de Triton X 100(PBS/BSA/Triton). Os anticorpos primários foram adicionados aos poços para um volume final de 120 pL/poço e incubados numa câmara humidificada minutos à temperatura ambiente por 1 hora. Os poços foram então lavados três vezes em PBS/BSA/Triton. Anticorpos de burro anti-murganhos conjugados com FITC em combinação com anticorpos de burro anti-cabra conjugados com Texas Red (ambos de Jackson Immuno-Research Laboratories), ou anticorpos de burro anti-coelho conjugados com Texas Red (Jackson Immuno Research Laboratories), foram diluídos até uma concentração final de 1:200 em PBS/BSA/Triton num volume final de 120 pL/poço. As lâminas foram incubadas numa câmara humidificada à temperatura ambiente no escuro por uma hora e depois lavadas três vezes em PBSBSA/Triton e os poços foram removidos. Quatro microlitros por poço de uma solução de montagem feita de 80% de glicerol em PBS foi adicionada sobre as células de cada poço e as lâminas foram cobertas com um vidro de tampa de microscópio 24 X 55 (Fisherbrand #12-544-18). As lâminas 108 foram mantidas a 4 °C no escuro por 1 a 7 dias antes da visualização.

As células foram observadas utilizando um microscópio confocal BioRad MRC-1024™ com um Krypton/Argon ion Laser e uma objectiva 60X Nikon™. As imagens foram adquiridas utilizando o sistema de operação LaserSharp™ e foram analisadas e manipuladas em Adobe Photoshop 5,0™.

As células HT29 (106/mL em DMEM/3% de BSA) foram coradas com anticorpo monoclonal de murganho anti-HVEM ou anti-LTpR por 30 minutos a 4 °C seguido por igG de cabra anti-murganho acopladas a ficoeritrina (PE) por 30 minutos a 4 °C e analisadas por citometria de fluxo utilizando um FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA). A invenção descrita é ainda caracterizada pela seguinte lista de itens: 1. Um polipéptido p30 homotrimérico isolado ou recombinante que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do virus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor da linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas. 2. O polipéptido p30 homotrimérico isolado ou recombinante do item 1, em que o polipéptido monomérico 109 compreende isómeros que têm um pi de cerca de 7 a cerca de 8,5. 3. Um polipéptido p30 homotrimérico solúvel isolado ou recombinante que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (Ll^R) em condições fisiológicas. 4. Um lipossoma que compreende um polipéptido p30, em que o polipéptido p30 compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor da linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas, ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (ΐτβπ) em condições fisiológicas. 5. Uma proteína de fusão que compreende um polipéptido p30, em que o polipéptido p30 compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular 110 aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do virus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor de linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas, ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (LTPr) em condições fisiológicas. 6. A proteína de fusão do item 5, em que a sequência heteróloga é uma etiqueta. 7. Uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido p30, em que o polipéptido p30 compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor de linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas, ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (ΐτβπ) em condições 111 fisiológicas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 8. Um kit que compreende uma composição farmacêutica e matéria impressa, em que a composição farmacêutica compreende um polipéptido p30, em que o polipéptido p30 compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do virus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor de linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um dominio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do virus herpes (HVEM) ou a um receptor da linfotoxina β (ύτβΐΐ) em condições fisiológicas e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a matéria impressa compreende instruções para utilização da composição farmacêutica, em que uma utilização compreende inibir a entrada do virus dentro de uma célula ou a proliferação do virus numa célula. 9. Kit do item 8, em que as instruções incluem a utilização da composição farmacêutica para inibir a proliferação do virus numa célula ou a entrada do virus dentro de uma célula ín vivo. 10. O kit do item 8, em que o virus é um herpesvirus. 112 11. 0 kit do item 10, em que o virus é um virus herpes simplex (HSV), um citomegalovirus (CMV), um γ-herpesvirus ou um vírus Epstein-Barr (EBV). 12. O kit do item 11, em que a inibição da entrada do vírus na célula ou proliferação do vírus numa célula é num mamífero. 13. O kit do item 12, em que o mamífero é um ser humano. 14. Um kit que compreende uma composição farmacêutica e matéria impressa, em que a composição farmacêutica compreende um polipéptido p30, em que o polipéptido p30 compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do virus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor da linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (ΐτβϊΐ) em condições fisiológicas e um excipiente farmaceuticamente aceitável, 113 em que a matéria impressa compreende instruções para utilização da composição farmacêutica, em que uma utilização compreende modular doenças com proliferação linfocitica indesejável. 15. 0 kit do item 14, em que as instruções compreendem a utilização da composição farmacêutica para modular um linfoma T ou B ou leucemia, ou uma doença autoimune. 16. 0 do item 15, em que a doença autoimune é artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico ou miastenia grave. 17. Uma composição farmacêutica que compreende um vector de expressão que codifica um polipéptido p30 que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa ou um polipéptido p30 que não tem o dominio transmembranar, em que o polipéptido p30 forma um polipéptido que se liga a um mediador de entrada do virus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor da linfotoxina β (ΒΤβϊΙ) em condições fisiológicas. 18. Um kit que compreende uma composição farmacêutica e matéria impressa, em que a composição farmacêutica que compreende um vector de expressão que codifica um polipéptido p30 que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa ou um polipéptido p30 que não tem o dominio transmembranar, em que o polipéptido p30 forma um polipéptido 114 homotrimérico que se liga a um mediador de entrada do vírus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor da linfotoxina β (LTpR) em condições fisiológicas, e um excipiente farmaceuticamente aceitável, e em que o material impresso compreende instruções para uma utilização da composição farmacêutica, em que uma utilização compreende atingir as células tumorais ou linfócitos activados. 19. 0 kit do item 18, em que a utilização compreende o tratamento de um tumor por injecção directa da composição farmacêutica dentro do tumor. 20. Um método para induzir um sinal indutor de proliferação para um linfócito que compreende

(a) proporcionar uma composição que se liga a HVEM expresso na superfície celular, e (b) contactar o linfócito com uma quantidade indutora de proliferação da composição. 21. O método do item 20, em que a composição é um anticorpo anti-HVEM. 22. O método do item 20, em que proporcionar a composição compreende proporcionar um polipéptido p30, um polipéptido p30 solúvel, um polipéptido p30 associado a lipossoma ou um vector que codifica um polipéptido p30 ou uma célula que expressa um p30 recombinante como um polipéptido p30 associado a célula. 115 23. 0 método do item 20, em que o linfócito é uma célula T. 24. O método do item 20, em que o linfócito é uma célula B. 25. O método do item 20, em que o linfócito é contactado in vivo. 26. Um método para inibir uma resposta celular mediada pelo polipéptido p30 que compreende (a) proporcionar uma composição que inibe a ligação de um polipéptido p30 expresso na superfície celular a um HVEM ou ΐτβκ expresso na superfície celular, e (b) contactar a célula que expressa o polipéptido p30 na superfície celular ou o HVEM ou LTPr expresso na superfície celular com uma quantidade da composição suficiente para inibir uma resposta celular mediada pelo polipéptido p30. 27. O método do item 26, em que a célula é contactada com a composição in vivo. 28. O método do item 26, em que a resposta celular mediada pelo polipéptido p30 inibido compreende a inibição de uma resposta celular de linfócito. 29. O método do item 28, em que a resposta de linfócito inibido é a proliferação de linfócitos. 116 30. O método do item 28, em que o linfócito inibido é uma célula efectora patogénica. 31. 0 método do item 28, em que a resposta de linfócito inibido modula um linfoma T ou B ou leucemia ou uma doença autoimune. 32. 0 método do item 31, em que a doença autoimune é artrite reumatóide, diabetes mellitus insulino-dependente, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico ou miastenia grave. 33. O método do item 28, em que a resposta de linfócito inibido modula uma reacção a um transplante. 34. O método do item 26, em que a célula contactada expressa HVEM e a composição é um polipéptido p30 solúvel. 35. 0 método do item 26, em que a célula contactada expressa LtPr e a composição é um polipéptido p30 solúvel. 36. 0 método do item 26, em que a célula contactada expressa o polipéptido p30 na sua superfície celular e a composição é um polipéptido HVEM solúvel. 37. 0 método do item 26, em que a célula contactada expressa o polipéptido p30 na sua superfície celular e a composição é um anticorpo anti-p30. 117 38. Um método para tratar tumores que compreende (a) proporcionar uma composição farmacêutica que compreende um vector de expressão que codifica um polipéptido p30 que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa ou um polipéptido p30 que não tem o domínio transmembranar, em que o polipéptido p30 forma um polipéptido homotrimérico que se liga a um mediador de entrada do vírus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor da linfotoxina β (LTPr) em condições fisiológicas, e (b) injectar a composição farmacêutica directamente dentro do tumor. 39. Um método para modular uma resposta celular mediada pelo receptor da linfotoxina beta (LTPr) , o método compreendendo: (a) proporcionar uma composição que inibe a ligação de um LtPr a um polipéptido p30; e (b) contactar uma célula que expressa o LTPr ou o polipéptido p30 com uma quantidade da composição suficiente para modular a resposta celular mediada pelo receptor da linfotoxina beta (LTPr). 40. O método do item 39, em que a célula expressa LTPr e a composição compreende uma composição farmacêutica em que a composição farmacêutica compreende um polipéptido p30, que compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, 118 em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor de linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas, ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (ΐτβκ) em condições fisiológicas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 41. 0 método do item 39, em que a célula expressa um polipéptido p30 e a composição compreende um anticorpo anti-p30. 42. 0 método do item 39, em que a resposta celular mediada pelo receptor da linfotoxina beta (ΐτβκ) compreende a ligação de um herpesvírus a uma célula. 43. 0 método do item 42, em que o herpesvírus é bloqueado de entrar na célula. 44. 0 método do item 42, em que o herpesvírus é um vírus herpes simplex (HSV), um citomegalovírus (CMV), um γ-herpesvírus ou um vírus Epstein Barr (EBV). 45. Um método para inibir a produção de vírus numa célula, o método compreendendo (b) proporcionar um polipéptido p30; e 119 (b) colocar uma célula infectada com um herpesvírus ou uma célula susceptível a infecção por um herpesvírus em contacto com uma quantidade eficaz de um polipéptido p30, deste modo inibindo a produção de herpesvírus na célula. 46. 0 método do item 45, em que a entrada do herpesvírus dentro da célula é inibida. 47. 0 método do item 45, em que o contacto é in vivo e a composição de p30 é proporcionada como uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica compreende um polipéptido p30 homotrimérico que compreende um polipéptido monomérico que tem um peso molecular aparente de cerca de 30 kDa, em que o polipéptido homotrimérico liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou um polipéptido receptor de linfotoxina (LTR) em condições fisiológicas, ou um polipéptido p30 homotrimérico solúvel que não tem um domínio transmembranar, em que o polipéptido homotrimérico solúvel liga-se a um polipéptido mediador da entrada do vírus herpes (HVEM) ou a um polipéptido receptor da linfotoxina β (ΕΤβύ) em condições fisiológicas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 48. 0 método do item 45, em que o vírus é um vírus herpes simplex (HSV), um citomegalovírus (CMV), um γ-herpesvírus ou um vírus Epstein Barr (EBV). 120 120 num 49. O método do item 45, em que o contacto é mamífero. ser 50. O método do item 49, em que o mamífero é um humano. 121

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> La Jolla Institute for Allergy and Immunology Ware, Cari F. <120> LIGANDO DO MEDIADOR DE ENTRADA DO VÍRUS HERPES SIMPLEX E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO <130> F 3032 EP/1 <140> 01926879.6 <141> 2001-04-11 <150> PCT/US01/11857 <151> 2001-04-11 <150> 09/549,096 <151> 2000-04-12 <160> 6 <170> Patentln Ver. 3.1

<210> 1 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência do iniciador directo <400> 1

cggagatctg agttcatcct gctagctgg 29 <210> 2 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial 122 <2 2 Ο > <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência do iniciador inverso < 4 0 0 > 2

ataggatccc ttggtctggt gctgacattc c 31 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência do iniciador directo <400> 3 gacgtcagat cttcccacct ttcctccta 29

<210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência do iniciador inverso <400> 4 gaacagagat ctcattgctc ctggctctg 29

<210> 5 <211> 1169 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (49)..(771) 123 <4Ο0> 5 gaggttgaag gacccaggcg tgtcagccct gctccagaga ccttgggc atg gag gag 57

Met Glu Glu 1 agt gtc gta cgg ccc tca gtg ttt gtg gtg gat gga cag acc gac ate 105 Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gin Thr Asp Ile 5 10 15 cca ttc acg agg ctg gga cga age cac cgg aga cág teg tgc agt gtg 153 Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gin Ser Cys Ser Val 20 25 . 30 35 gcc cgg gtg ggt ctg ggt ctc ttg ctg ttg ctg atg ggg gct ggg ctg 201 Ala Arg val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly Leu 40 45 50 gcc gtc caa ggc tgg ttc ctc ctg cag ctg cac tgg cgt cta gga gag 249 Ala Val Gin Gly Trp Phe Leu Leu Gin Leu His Trp Arg Leu Gly Glu 55 60 65 atg gtc acc cgc ctg cct' gac gga cct gea ggc tcc tgg gag cag ctg 297 Met val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gin Leu 70 75 80 ata caa gag cga agg tct cac gag gtc aac cca gea gcg cat ctc aca 345 Ile Gin Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr 85 áge 90 95 ggg gcc aac tcc ttg acc ggc age ggg ggg ccg ctg tta tgg gag 393 Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu 100 105 110 115 act cag ctg ggc ctg gcc ttc ctg agg ggc ctc age tac cac gat ggg 441 Thr Gin Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly 120 125 130 gcc ctt gtg gtc acc aaa gct ggc tac tac tac ate tac tcc aag gtg 489 Ala Leu val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val 135 140 145 cag ctg ggc ggt gtg ggc tgc ccg ctg ggc ctg gcc age acc ate acc 537 Gin Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr 150 155 160 cac ggc ctc tac aag cgc aca ccc cgc tac ccc gag gag ctg gag ctg 585 His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu 124 165 170 175 ttg gtc age cag cag tea ccc tgc gga cgg gee acc age age tcc cgg 633 Leu Val Ser Gin Gin Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg 180 185 190 195 gtc tgg tgg gac age age ttc ctg ggt ggt gtg gta cac ctg gag gct 681 Vai Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala 200 205 210 ggg gag gag gtg gtc gtc cgt gtg ctg gat gaa ege ctg gtt cga ctg 729 Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu 215 220 225 cgt gat ggt acc cgg tet tac ttc ggg gct ttc atg gtg tga 771 Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val 230 235 240 aggaaggagc gtggtgcatt ggacatgggt ctgacacgtg gagaactcag agggtgcctc 831 aggggaaaga aaactcacga agcagaggct gggcgtggtg gctctcgcct gtaatcccag 891 cactttggga ggccaaggca ggcggatcac ctgaggtcag gagttcgaga ccagcctggc 951 taacatggca aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaat tagccggacg tggtggtgcc 1011 tgcctgtaat ccagctactc aggaggctga ggcaggataa ttttgcttaa acccgggagg 1071 cggaggttgc agtgagccga gatcacacca ctgcactcca acctgggaaa cgcagtgaga 1131 ctgtgcctca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1169 <210> 6 <211> 240 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 6 125

Met Glu Glu Ser Vai Vai Arg Pro Ser Vai Phe Vai Vai Asp Gly Gin 1 5 10 15 Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gin Ser 20 25 30 Cys Ser Vai Ala Arg Vai Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly 35 40 45 Ala Gly Leu Ala Vai Gin Gly Trp Phe Leu Leu Gin Leu His Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Glu Met Vai Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp 65 70 75 80 Glu Gin Leu Ile Gin Glu Arg Arg Ser His Glu Vai Asn Pro Ala Ala 85 90 95 His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu 100 105 110 Leu Trp Glu Thr Gin Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr 115 120 125 His Asp Gly Ala Leu Vai Vai Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr 130 135 140 Ser Lys Vai Gin Leu Gly Gly Vai Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser 145 150 155 160 Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu 165 170 175 Leu Glu Leu Leu Vai Ser Gin Gin Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser 180 185 190

Ser Ser Arg Vai Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Vai Vai His 195 200 205

Leu Glu Ala Gly Glu Glu Vai Vai Vai Arg Vai Leu Asp Glu Arg Leu 210 215 220

Vai Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Vai 225 230 235 240 126

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • WO 9911662 A [0005] • WO 9902563 A [0005] • WO 0014230 A [0005] • US 4376110 A [0066] • US 4946778 A [0068] • US 0111857 W [0214] • US 09549096 B [0214]

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Lisboa 26/11/2010

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para inibir uma resposta celular linfocitica mediada por um polipéptido p30 que compreende (a) proporcionar um anticorpo anti-p30, e (b) colocar uma célula que expressa um polipéptido p30 na superfície da célula em contacto com uma quantidade de um anticorpo anti-p30 suficiente para inibir a resposta celular linfocitica mediada pelo polipéptido p30.

2. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1, em que a resposta linfocitica inibida consiste na proliferação linfocitica.

3. Método in vitro de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o linfócito inibido é uma célula efectora patogénica.

4. Utilização de um anticorpo anti-p30 que inibe a ligação de um polipéptido p30 expresso na superfície de uma célula a um HVEM ou LTPr expresso na superfície de uma célula para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir uma resposta celular mediado pelo polipéptido p30. 2

5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a composição farmacêutica inclui um excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. Anticorpo anti-p30 que inibe a ligação de um polipéptido p30 expresso na superfície de uma célula a HVEM ou LTPr expresso na superfície de uma célula para utilização no tratamento de uma doença autoimune.

7. Anticorpo anti-p30 de acordo com a reivindicação 6, em que a doença autoimune é artrite reumatóide, diabetes melitus insulino-dependente, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico ou miastenia grave.

8. Anticorpo anti-p30 que inibe a ligação de um polipéptido p30 expresso na superfície de uma célula a HVEM ou LtPr expresso na superfície de uma célula para utilização no tratamento da inflamação ou de um distúrbio inflamatório.

9. Anticorpo anti-p30 de acordo com a reivindicação 8, em que o distúrbio inflamatório é artrite, psoríase ou doença inflamatória do intestino. Lisboa, 26/11/2010