JP4435304B2 - アポトーシスを誘導するサイトカイン - Google Patents

Description

発明の背景
アポトーシスとして知られるプログラムされた細胞死は、壊死による細胞死とは異なる。アポトーシスは、胚形成、変態、内分泌依存性組織委縮、正常組織ターンオーバーおよび免疫胸腺細胞の（それらの抗原−受容体複合体によってまたはグルココルチコイドによって誘導される）死で起こる（Itohら，Cell 66:233,1991）。胸腺におけるＴ細胞の成熟中に、自己抗原を認識するＴ細胞は、アポトーシス過程によって破壊されるが、他は正に選択される。ある種の自己エピトープを認識する若干のＴ細胞（例えば、無能処理され且つある与えられた自己タンパク質の抗原決定基を与えられた）が、この排除過程を免れ、そして引続き自己免疫疾患においてある役割を果たす可能性が示唆されている（Gammonら，Immunology Today 12:193,1991）。
Ｆａｓとして知られる細胞表面抗原は、アポトーシスを媒介すると報告されており、そして自己反応性Ｔ細胞のクローン排除においてある役割を果たすと考えられる（Itohら，Cell 66:233,1991；Watanabe-Fukunagaら，Nature 356:314,1992）。Ｆａｓに対する特異的モノクローナル抗体の架橋は、種々の細胞系にアポトーシスを起こさせると報告されている（Yoneharaら，J.Exp.Med.,169:1747,1989；Trauthら，Science,245:301,1989）。しかしながら、ある種の条件下において、Ｆａｓに対する特異的モノクローナル抗体の結合は、新たに単離されたＴ細胞に対して共刺激作用を有することがある（Aldersonら，J.Exp.Med.,178:2231,1993）。
ラットＦａｓリガンド（Sudaら，Cell,75:1169,1993）およびヒトＦａｓリガンド（Takahashiら，International Immunology 6:1567,1994）をコードしているＤＮＡは単離されている。Ｆａｓ抗原を発現する細胞に対するＦａｓリガンドの結合は、アポトーシスを誘導することが実証された（Sudaら，上記、およびTakahashiら，上記）。
アポトーシスにおいてある役割を果たす他の１種類または複数の分子の存在および同定の研究が望まれる。このような分子の同定は、アポトーシスを調節する更に別の手段を提供するであろうし、更には、免疫系による自己寛容の発生および自己免疫疾患の病因の更に別の洞察を与えるであろう。
発明の概要
本発明は、新規なサイトカインタンパク質、更には、そのサイトカインをコードしている単離ＤＮＡおよびその単離ＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）系列のリガンドのメンバーである新規なサイトカインの性質には、ある種類の標的細胞のアポトーシスを誘導する能力が含まれる。したがって、このタンパク質をＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）と称する。ＴＲＡＩＬとの接触によって死滅する細胞の種類の中には、白血病、リンパ腫および黒色腫細胞などの癌細胞並びにウイルスに感染した細胞がある。
ＴＲＡＩＬポリペプチドを製造する方法は、ＴＲＡＩＬの発現に適当な条件下で、ＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡを含む組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換した後、発現されたＴＲＡＩＬポリペプチドを培養物から回収することを行う。ＴＲＡＩＬポリペプチドに対して向けられる抗体もまた提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例８で記載の検定の結果を示す。その検定は、可溶性ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドが、白血病細胞系であるジャーカット細胞の死を誘導したことを示した。
図２は、実施例１１で記載の検定の結果を示す。可溶性ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドとの接触は、サイトメガロウイルスに感染したヒト線維芽細胞の死を誘導したが、非ウイルス感染線維芽細胞を死滅させなかった。
発明の詳細な説明
ここにおいて、ＴＲＡＩＬと称される新規タンパク質を、ＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡおよびＴＲＡＩＬ ＤＮＡを含む組換え発現ベクターと一緒に提供する。組換えＴＲＡＩＬポリペプチドを製造する方法は、ＴＲＡＩＬの発現に適当な条件下において該組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、そして発現されたＴＲＡＩＬを回収することを行う。
本発明はまた、ＴＲＡＩＬタンパク質を特異的に結合する抗体を提供する。一つの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
ＴＲＡＩＬタンパク質は、制限されるわけではいが、癌細胞およびウイルス感染細胞を含む形質転換細胞などのある種類の標的細胞のアポトーシスを誘導する。以下の実施例５、８、９および１０で実証されるように、ＴＲＡＩＬは、ヒト白血病、リンパ腫および黒色腫細胞系のアポトーシスを誘導する。ＴＲＡＩＬの使用の中には、癌細胞を死滅させる場合の使用がある。ＴＲＡＩＬは、更に、ウイルス感染の治療で用いられる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の感染は、ヒト線維芽細胞を、ＴＲＡＩＬと接触した場合にアポトーシスに対して感受性にさせたが、非感染線維芽細胞は、ＴＲＡＩＬとの接触によって死滅しなかった（実施例１１を参照されたい）。
ヒトＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡの単離を、以下の実施例１で記載する。実施例１で単離されたヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１で示し、そしてそれによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：２で示す。このヒトＴＲＡＩＬタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１８）、膜貫通部分（アミノ酸１９〜３８）および細胞外ドメイン（アミノ酸３９〜２８１）を含む。細胞外ドメインは、受容体結合部分を有する。
このヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された大腸菌（E.coli）株ＤＨ１０Ｂ細胞は、１９９５年６月１４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託され、そして寄託番号69849を付与された。その寄託は、ブダペスト条約の条件に基づいて行われた。寄託された菌株中の組換えベクターは、（実施例５で記載された）発現ベクターｐＤＣ４０９である。そのベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして配列番号：１で示された完全なコード領域を含むヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡをそのベクター中に連結させた。
第二ヒトＴＲＡＩＬタンパク質をコードしているＤＮＡを実施例２で記載のように単離した。このＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：３で示し、そしてそれによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：４で示す。そのコードされたタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１８）、膜貫通部分（アミノ酸１９〜３８）および細胞外ドメイン（アミノ酸３９〜１０１）を含む。
配列番号：３のＤＮＡは、配列番号：１のＤＮＡの一部分を欠いているので、ヒトＴＲＡＩＬ欠失変異体（ｈｕＴＲＡＩＬｄｖ）クローンと称される。配列番号１：のヌクレオチド１８〜３５８は、配列番号：３のｈｕＴＲＡＩＬｄｖＤＮＡのヌクレオチド８〜３４８と同一である。配列番号１：のヌクレオチド３５９〜５０６は、配列番号：３のクローン化ＤＮＡから失われている。その欠失は、読み枠内で転位を引き起こし、その結果として、配列番号：４のアミノ酸１０１の後にインフレーム停止コドンを生じる。したがって、配列番号：３のＤＮＡは、一部切除されたタンパク質をコードしている。配列番号：２のアミノ酸１〜９０は、配列番号：４のアミノ酸１〜９０と同一である。しかしながら、その欠失のために、ｈｕＴＲＡＩＬｄｖタンパク質のＣ末端部分（配列番号：４のアミノ酸９１〜１０１）は、配列番号：２での対応する位置の残基とは異なる。完全長さｈｕＴＲＡＩＬタンパク質とは対照的に、一部切除されたｈｕＴＲＡＩＬｄｖタンパク質は、ジャーカット細胞系のＴ細胞白血病細胞のアポトーシスを誘導する能力を示さない。
マウスＴＲＡＩＬタンパク質をコードしているＤＮＡもまた、実施例３で記載のように単離された。このＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：５で示し、そしてそれによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：６で示す。そのコードされたタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１７）、膜貫通部分（アミノ酸１８〜３８）および細胞外ドメイン（アミノ酸３９〜２９１）を含む。このマウスＴＲＡＩＬは、アミノ酸レベルにおいて配列番号：２のヒトＴＲＡＩＬと６４％同一である。マウスＴＲＡＩＬヌクレオチド配列のコード領域は、配列番号：１のヒトヌクレオチド配列のコード領域と７５％同一である。
本発明の一つの実施態様は、Ｎ末端アミノ酸配列MetAlaMetMetGluValGlnGlyGlyProSerLeuGlyGlnThr（配列番号：２および４のアミノ酸１〜１５）を特徴とするヒトＴＲＡＩＬタンパク質に関する。Ｎ末端アミノ酸配列MetProSerSerGlyAlaLeuLysAspLeuSerPheSerGlnHis（配列番号：６のアミノ酸１〜１５）を特徴とするマウスＴＲＡＩＬタンパク質もまた、本明細書中において提供する。
本発明のＴＲＡＩＬタンパク質は、Ｆａｓリガンドとして知られるタンパク質とは異なる（Sudaら，Cell,75:1169,1993；Takahashiら，International Immunology 6:1567,1994）。Ｆａｓリガンドは、Ｆａｓとして知られる受容体によっていくつかの細胞種のアポトーシスを誘導する。実施例５で実証されるように、標的細胞のＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスは、Ｆａｓによって媒介されない。配列番号：２のヒトＴＲＡＩＬアミノ酸配列は、Takahashiら，上記で示されているヒトＦａｓリガンドアミノ酸配列と約２０％同一である。ヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメインは、ヒトＦａｓリガンドの細胞外ドメインと約２８．４％同一である。
本明細書中で開示されたアミノ酸配列は、ＴＲＡＩＬがＴＮＦ系列のリガンドのメンバーであることを示す（Smithら，Cell,73:1349,1993；Sudaら，Cell,75:1169,1993；Smithら，Cell,76:959,1994）。ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインアミノ酸配列とこの系列の他のタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列との間の同一性％は次の通りである。Ｆａｓリガントで２８．４％、リンホトキシン−βで２２．４％、ＴＮＦ−αで２２．９％、ＴＮＦ−βで２３．１％、ＣＤ３０リガンドで２２．１％、そしてＣＤ４０リガンドで２３．４％。
ＴＲＡＩＬを、ＴＮＦ−Ｒ系列の受容体の受容体を結合する能力について調べた。結合分析は、Gearingら（EMBO J.8:3667;1989）のスライドオートラジオグラフィー手順を用いて行われた。その分析は、ヒトＣＤ３０、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＴＮＦ−Ｒ（ｐ８０型）、ＣＤ２７またはＬＴβＲ（ＴＮＦＲ−ＲＰとしても知られる）に対するヒトＴＲＡＩＬの検出可能な結合を示さなかった。実施例５の結果は、ヒトＴＲＡＩＬがヒトＦａｓを結合しないことを示している。
本発明のＴＲＡＩＬポリペプチドには、配列番号：２および６で示されたものと異なるが、極めて相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。例として、制限されるわけではないが、他の哺乳動物種に由来する同族体、変異体（天然に存在する変異体および組換えＤＮＡ技術によって生じたもの両方）、および望まれる生物学的活性を保持しているＴＲＡＩＬフラグメントが含まれる。このようなポリペプチドは、配列番号：２および６のＴＲＡＩＬタンパク質の生物学的活性を示し、好ましくは、配列番号：２または配列番号：６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（最も好ましくは、少なくとも９０％同一）であるアミノ酸配列を含む。本発明のこれら実施態様を以下で更に詳細に記載する。
ＴＮＦ系列のタンパク質のＣ末端部分に位置する保存配列は、本明細書に援用されているSmithら（Cell,73:1349,1993，1353頁および図６を参照されたい）；Sudaら（Cell,75:1169,1993，図７を参照されたい）；Smithら（Cell,76:959,1994，図３を参照されたい）；およびGoodwinら（Eur.J.Immunol.23:2631,1993，図７および2638-39頁を参照されたい）で同定されている。保存される（少なくとも大部分のＴＮＦ系列メンバーで）ヒトＴＲＡＩＬタンパク質のアミノ酸の中には、配列番号：２の１２４〜１２５位（ＡＨ）、１３６位（Ｌ）、１５４位（Ｗ）、１６９位（Ｌ）、１７４位（Ｌ）、１８０位（Ｇ）、１８２位（Ｙ）、１８７位（Ｑ）、１９０位（Ｆ）、１９３位（Ｑ）および２７５〜２７６位（ＦＧ）のものがある。ＴＲＡＩＬのもう一つの構造的特徴は、膜貫通部分のＣ末端と、生物学的活性に最も重要であると考えられる細胞外ドメインの部分との間のスペーサー部分である。細胞外ドメインのＮ末端に位置するこのスペーサー部分は、配列番号：２のアミノ酸３９〜９４から成る。同様のスペーサーは、他の系列メンバー、例えば、ＣＤ４０リガンドで見出される。アミノ酸１３８〜１５３は、折りたたまれた（三次元）ヒトＴＲＡＩＬタンパク質のβシート間のループに相当する。
本明細書中で提供されるのは、膜結合ＴＲＡＩＬタンパク質（細胞質ドメイン、膜貫通部分および細胞外ドメインを含む）、並びに完全長さＴＲＡＩＬタンパク質の望まれる生物学的性質を保持しているＴＲＡＩＬフラグメントである。一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬフラグメントは、細胞外ドメインの全部または一部分を含むが、細胞膜上にそのポリペプチドを保持させると考えられる膜貫通部分を欠いている、可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドである。可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質は、それらが発現される細胞から分泌されることができる。好都合に、異種シグナルペプチドは、可溶性ＴＲＡＩＬが発現時に分泌されるようにＮ末端に融合される。
可溶性ＴＲＡＩＬは、所望のタンパク質を発現する自然のままの細胞を、例えば、遠心分離によって培地から分離し、そして所望のタンパク質の存在についてその培地（上澄み）を検定することによって確認できる（そしてその不溶性膜結合相対物と区別できる）。培地中のＴＲＡＩＬの存在は、そのタンパク質が細胞から分泌されたことを示し、したがって、それはＴＲＡＩＬタンパク質の可溶型である。天然に存在する可溶型のＴＲＡＩＬは、本発明によって包含される。
可溶型のＴＲＡＩＬの使用は、いくつかの用途に好都合である。組換え宿主細胞からのタンパク質の精製は、可溶性タンパク質が細胞から分泌されるので容易になる。更に、可溶性タンパク質は、概して、静脈内投与により適している。
可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドの例は、完全な細胞外ドメイン（例えば、配列番号：２のアミノ酸３９〜２８１または配列番号：６のアミノ酸３９〜２９１）を含有するものである。望まれる生物学的活性を保持している細胞外ドメインのフラグメントもまた提供する。このようなフラグメントには、好都合に、上記のようにＴＮＦ系列のリガンドのタンパク質中で保存されるＴＲＡＩＬの部分が含まれる。
可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドの更に別の例は、細胞質ドメインおよび膜貫通部分のみならず、上記のスペーサー部分の全部または一部分をも欠いているものである。したがって、可溶性ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドには、制限されるわけではないが、アミノ酸ｘ〜２８１を含むポリペプチドが含まれ、ここにおいて、ｘは、配列番号：２の３９〜９５位のアミノ酸のいずれかを表す。残基９５がＮ末端アミノ酸である実施態様では、完全なスペーサー部分が欠失していた。
可溶性ポリペプチドを含めたＴＲＡＩＬフラグメントは、多数の慣用的な技法のいずれによっても製造することができる。望まれるＴＲＡＩＬフラグメントをコードしているＤＮＡ配列は、ＴＲＡＩＬフラグメントの製造のために発現ベクター中にサブクローン化してもよい。ＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡ配列は、好都合に、適当なリーダーまたはシグナルペプチドをコードしている配列に融合される。所望のＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡフラグメントは、既知の技法を用いて経済的に合成することができる。ＤＮＡフラグメントはまた、完全長さクローン化ＮＤＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって製造され且つアガロースゲル上の電気泳動によって単離されうる。必要ならば、５′または３′末端を望まれる点まで再構成するオリゴヌクレオチドを、制限酵素消化によって生じたＤＮＡフラグメントに対して連結させてもよい。このようオリゴヌクレオチドは、所望のコード配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を更に含み、そしてコード配列のＮ末端に開始コドン（ＡＴＧ）を置くことができる。
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順もまた、望まれるタンパク質フラグメントをコードしているＤＮＡ配列を単離し且つ増幅させるのに用いることができる。そのＤＮＡ配列の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、５′および３′プライマーとして用いられる。そのオリゴヌクレオチドは、更に、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含んで、増幅されたＤＮＡフラグメントの発現ベクター中への挿入を容易にすることができる。ＰＣＲ技術は、Saikiら，Science 239:487（1988）；Recombinant DNA Methodology,Wuら監修，Academic Press,Inc.，サン・ディエゴ（1989）,189-196頁；およびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Innisら監修，Academic Press,Inc.（1990）で記載されている。
当業者によって理解されるように、上で論及された各ＴＲＡＩＬタンパク質それぞれの膜貫通部分は、疎水性ドメインのその種類を識別するための慣用的な判定基準によって識別される。膜貫通部分の正確な境界は、上で示されたものとは僅かに（おそらくは、両末端の５個以下のアミノ酸まで）異なることがありうる。このような疎水性部分を識別するのに有用なコンピュータープログラムは入手可能である。
本発明のＴＲＡＩＬ ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそれらの組合せが含まれる。ゲノムＴＲＡＩＬ ＤＮＡは、標準的な技法を用いる本明細書中で開示されたＴＲＡＩＬ ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって単離することができる。ＴＲＡＩＬ ＤＮＡから転写されたＲＮＡもまた、本発明によって包含される。
ＮＣＢＩデータバンクの探索は、ＴＲＡＩＬ ＤＮＡと同一の部分を有する５種類の発現された配列標識（ＥＳＴ）を識別した。これらＥＳＴ（ＮＣＢＩ寄託番号Ｔ90422、Ｔ82085、Ｔ10524、Ｒ31020およびＺ36726）は、全てヒトｃＤＮＡフラグメントである。ＮＣＢＩ記録は、ＥＳＴによってコードされたいずれのポリペプチドも明らかにしないし、したとしても、その読み枠が何でありうるかを示さない。しかしながら、完全なＴＲＡＩＬコード領域の開示によって本明細書中で示される読み枠の情報を用いてＥＳＴを発現させたとしても、コードされたポリペプチドには、本請求の範囲で記載されたＴＲＡＩＬポリペプチドのアポトーシス誘導性を有するものがないであろう。言い換えると、５種類のＥＳＴそれぞれを開始メチオニンコドンから下流の発現ベクター中に挿入した場合、本明細書中で説明された読み枠において、得られた発現されたポリペプチドには、ジャーカット細胞のアポトーシスを誘導するＴＲＡＩＬの細胞外ドメインの充分な部分を含むものがないであろう。
本発明のいくつかの実施態様は、配列番号：１のヌクレオチド８８〜９３３（ヒトＴＲＡＩＬコード領域）；配列番号：１のヌクレオチド２０２〜９３３（ヒトＴＲＡＩＬ細胞外ドメインをコードしている）；配列番号：５のヌクレオチド４７〜９２２（マウスＴＲＡＩＬコード領域）；および配列番号：５のヌクレオチド２６１〜９２２（マウスＴＲＡＩＬ細胞外ドメインをコードしている）から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡを提供する。配列番号：２および６のタンパク質の生物学的に活性なフラグメントをコードしているＤＮＡもまた提供する。更に別の実施態様には、配列番号：１のヌクレオチド３７０〜９３０および配列番号：５のヌクレオチド３４１〜９１９を含む配列が含まれ、それらは、実施例７で記載の特定のヒトおよびネズミ可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドをそれぞれコードしている。
遺伝コードの縮重のために、二つのＤＮＡ配列は異なることがありうるが、同じアミノ酸配列をコードしている。本発明は、したがって、天然のヒトまたはネズミＴＲＡＩＬ ｃＤＮＡのコード領域を含むＤＮＡまたはそのフラグメントおよび、天然のＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列に対して遺伝コードの結果として縮重したＤＮＡから選択される、生物学的に活性なＴＲＡＩＬをコードしている単離されたＤＮＡ配列を提供する。
本明細書中で更に提供されるのは、組換え体および非組換え体両方の精製ＴＲＡＩＬポリペプチドである。望まれる生物学的活性を保持している天然のＴＲＡＩＬタンパク質の変異体および誘導体もまた、本発明の範囲内である。一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬ変異体の生物学的活性は、天然のＴＲＡＩＬタンパク質の生物学的活性と本質的に同等である。ＴＲＡＩＬの一つの望まれる生物学的活性は、ジャーカット細胞の死を誘導する能力である。標的細胞のアポトーシスを検出するための検定法は周知である。ＤＮＡラダー（laddering）は、アポトーシスによる細胞死の特徴の中に含まれ、そしてアポトーシス細胞死を壊死細胞死と区別する観察しうる現象の一つとして認められる。標的細胞の死すなわちアポトーシスを検出するのに適当な検定技法の例としては、実施例５および８〜１１で記載されたものがある。ＴＲＡＩＬのもう一つの性質は、ジャーカット細胞に対して結合する能力である。
ＴＲＡＩＬ変異体は、例えば、天然のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。本明細書中で論及されるＴＲＡＩＬ変異体は、天然のＴＲＡＩＬと実質的に相同のポリペプチドであるが、それは、一つまたは複数の欠失、挿入または置換のために、天然のＴＲＡＩＬのものとは異なるアミノ酸配列を有する。本発明のＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡ配列は、天然のＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列と比較した場合に、一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換を含む配列であるが、天然のＴＲＡＩＬタンパク質と本質的に生物学的に同等であるＴＲＡＩＬタンパク質をコードしている該配列を包含する。
変異体アミノ酸またはＤＮＡ配列は、好ましくは、天然のＴＲＡＩＬ配列と少なくとも８０％同一、最も好ましくは、少なくとも９０％同一である。天然および突然変異体配列間の相同の度合い（同一％）は、例えば、この目的に一般的に用いられるコンピュータープログラムを用いて二つの配列を比較することによって決定することができる。一つの適当なプログラムは、Devereuxら（Nucl.Acids Res.12:387,1984）によって記載され且つウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）から入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０である。そのＧＡＰプログラムは、SmithおよびWaterman（Adv.Appl.Math 2:482,1981）によって変更されたように、NeedlemanおよびWunsch（J.Mol.Biol.48:443,1970）の並列法を用いる。簡単にいうと、ＧＡＰプログラムは、一致する並列記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数割る二つの配列の短い方の記号の全数として同一性を決定する。ＧＡＰプログラムの好ましい暗黙パラメーターには、（１）ヌクレオチドのユナリー（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対する１および非同一の０を含む）およびSchwartzおよびDayhoff監修，Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundatioｎ,353-358頁，1979によって記載のような、GribskovおよびBurgess，Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに対する３．０のペナルティーおよびギャップ毎のそれぞれの記号に対する追加の０．１０ペナルティー；および（３）末端ギャップのペナルティー無し、が含まれる。
天然のアミノ酸配列の変更は、多数の既知の技法のいずれによっても達成できる。突然変異は、天然の配列のフラグメントに対して連結できる制限部位に隣接した突然変異体配列含有オリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入することができる。連結後、得られた再構成配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
或いは、オリゴヌクレオチドに支配された部位特異的突然変異誘発プロデューサーを用いて、必要な置換、欠失または挿入によって変更された特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供することができる。このような変更を行う技術には、Walderら（Gene 42:133,1986）；Bauerら（Gene 37:73,1985）；Craik（BioTechniques,1985年１月,12-19）；Smithら（Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981）；および米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号で記載されたものが含まれ、これらは本明細書中に援用される。
変異体は、保存的に置換された配列を含むことができ、天然のＴＲＡＩＬポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸残基は異なった残基で置き換えられるが、その保存置換されたＴＲＡＩＬポリペプチドは、天然のＴＲＡＩＬポリペプチドの場合と本質的に同等の望まれる生物学的活性を保持していることが示される。保存置換の例としては、ＴＲＡＩＬの二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換がある。他の例には、所望の生物学的活性が、標的細胞上の受容体に対して結合し且つその標的細胞のアポトーシスを誘導する能力である場合の、受容体結合ドメインの外側のアミノ酸の置換が含まれる。ある与えられたアミノ酸は、同様の物理科学的特性を有する残基で置き換えることができ、例えば、１個の脂肪族残基を別のもの（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａなどを互いに）に置換できるし、または１個の極性残基を別のもの（ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎ間など）に置換できる。他のこのような保存置換、例えば、同様の疎水性を有する部分全体の置換は周知である。保存アミノ酸置換を含むＴＲＡＩＬポリペプチドは、天然のＴＲＡＩＬの望まれる生物学的活性が保持されていることを確認するための本明細書中に記載された検定の一つで試験することができる。このような保存的アミノ酸置換を含むＴＲＡＩＬポリペプチドをコードしているＤＮＡは、本発明によって包含される。
ＴＮＦ系列のタンパク質のＣ末端部分に位置し且つ生物学的活性に重要であると考えられる保存アミノ酸は同定されている。これら保存配列は、Smithら（Cell,73:1349,1993，1353頁および図６を参照されたい）；Sudaら（Cell,75:1169,1993，図７を参照されたい）；Smithら（Cell,76:959,1994，図３を参照されたい）；およびGoodwinら（Eur.J.Immunol.23:2631,1993，図７および2638-39頁を参照されたい）で論及される。好都合に、保存アミノ酸は、保存置換配列を生じた場合には変化しない。変化した場合、ＴＮＦ系列の他のメンバーの等位置で見出されるアミノ酸は置換される。
ＴＲＡＩＬはまた、グリコシル基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のような他の化学残基との共有結合または凝集結合を形成することによってＴＲＡＩＬ誘導体を生成するように修飾することができる。ＴＲＡＩＬの共有結合誘導体は、ＴＲＡＩＬアミノ酸側鎖上の官能基に対してまたはＴＲＡＩＬポリペプチド若しくはその細胞外ドメインのＮ末端若しくはＣ末端に化学残基を結合することによって製造することができる。本発明の範囲内のＴＲＡＩＬの他の誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融合のような組換え体培養での合成などによる、他のタンパク質またはポリペプチドとのＴＲＡＩＬの共有結合体若しくは凝集結合体またはそのフラグメントが含まれる。例えば、結合体は、ＴＲＡＩＬポリペプチドのＮ末端にシグナルまたはリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）のα因子リーダー）を含むことができる。そのシグナルまたはリーダーペプチドは、その合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側部位への結合体の転移を共翻訳によってまたは翻訳後に支配する。
ＴＲＡＩＬポリペプチド融合は、ＴＲＡＩＬの精製および識別を容易にするように加えられるペプチドを含むことができる。このようなペプチドには、例えば、ポリＨｉｓまたは米国特許第5,011,912号およびHoppら，Bio/Technology 6:1204,1988で記載された抗原識別ペプチドが含まれる。一つのこのようなペプチドは、ＦＬＡＧ▲Ｒ▼ペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DYKDDDDK）（配列番号：７）であり、それは、極めて抗原性であり且つ特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合したエピトープを与えるので、発現された組換えタンパク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。この配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼによってAsp-Lys対合直後の残基で特異的に切断される。このペプチドのキャップ付き融合タンパク質は、更に、大腸菌での細胞内分解に対して耐性でありうる。
４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、（米国特許第5,011,912号で記載のように）ある種の二価金属陽イオンの存在下でペプチドDYKDDDDK（配列番号：７）を結合するモノクローナル抗体を生じ、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託番号ＨＢ9259として寄託されている。ＦＬＡＧ▲Ｒ▼ペプチドに対して融合した組換えタンパク質を生じるのに有用な発現系、並びに該ペプチドを結合し且つ該組換えタンパク質を精製する場合に有用であるモノクローナル抗体は、Eastman Kodak Company，Scientific Imaging Systems，ニューヘブン，コネチカット州から入手可能である。
本発明は、更に、関連した天然パターングリコシル化を伴うまたは伴わないＴＲＡＩＬポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物発現系で発現されたＴＲＡＩＬは、発現系の選択に応じて、分子量およびグリコシル化パターンが天然のＴＲＡＩＬポリペプチドと同様であってよいしまたは有意に異なっていてよい。大腸菌などの細菌発現系でのＴＲＡＩＬポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を与える。
ＴＲＡＩＬ細胞外ドメイン中のグリコシル化部位は、酵母または哺乳動物発現系を用いて均一な減少した炭水化物類似体（ａｎａｌｏｇ）を発現させながらグリコシル化を妨げるように変更しうる。真核性ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙを特徴とし、ここにおいて、ＸはＰｒｏ以外のいずれかのアミノ酸であり且つＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。このトリプレットをコードしているヌクレオチド配列に対する適当な修飾は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加または欠失を引き起こすであろう。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を失活させる既知の方法には、米国特許第5,071,972号および欧州特許第276,846号で記載されたものが含まれる。潜在的なＮ−グリコシル化部位は、配列番号：２のヒトタンパク質中の１０９〜１１１位および配列番号：６のネズミタンパク質中の５２〜５４位で見出される。
もう一つの例において、生物学的活性に不可欠でないＣｙｓ残基をコードしている配列は、そのＣｙｓ残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸で置換させるように変更されて、復元時の不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を妨げることができる。他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系での発現を促進させる隣接した二塩基性アミノ酸残基の修飾によって製造される。欧州特許第212,914号は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位を失活させる部位特異的突然変異誘発の使用を開示している。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、Arg-Arg、Arg-LysおよびLys-Arg対を変化させるように残基を欠失、付加または置換することによって失活して、これら隣接した塩基性残基の発生を排除する。Lys-Lys対合は、ＫＥＸ２切断に対してほとんど感受性ではなく、そしてArg-LysまたはLys-ArgのLys-Lysへの変換は、ＫＥＸ２部位の失活への保守的且つ好ましいアプローチを示す。潜在的ＫＥＸ２プロテアーゼプロセッシング部位は、配列番号：２のタンパク質中の８９〜９０位および１４９〜１５０位並びに配列番号：６のタンパク質中の８５〜８６位、１３５〜１３６位および１６２〜１６３位で見出される。
天然に存在するＴＲＡＩＬ変異体もまた、本発明によって包含される。このような変異体の例は、選択的（ａｌｔｅｎａｔｉｖｅ）ｍＲＮＡスプライシング結果から（ＴＲＡＩＬは多エクソン遺伝子によってコードされるので）またはＴＲＡＩＬタンパク質のタンパク質分解切断から生じるタンパク質であり、ここにおいて、望まれる生物学的活性は保持されている。ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、例えば、天然に存在する可溶型のタンパク質などの一部切断されているが生物学的に活性なＴＲＡＩＬタンパク質を生じることができる。タンパク質分解による変異には、例えば、ＴＲＡＩＬタンパク質からの１個またはそれ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解除去による、異なった種類の宿主細胞における発現でのＮ−またはＣ末端の相違が含まれる。更に、タンパク質分解切断は、可溶型のＴＲＡＩＬを膜結合型のタンパク質から放出させることができる。対立遺伝子変異体もまた、本発明によって包含される。
オリゴマー
本発明は、二量体、三量体または高級オリゴマーなどのオリゴマーの形のＴＲＡＩＬポリペプチドを包含する。オリゴマーは、例えば、種々のＴＲＡＩＬポリペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合によって、またはＴＲＡＩＬポリペプチド鎖間の非共有結合相互作用によって形成されうる。他の実施態様において、オリゴマーは、ＴＲＡＩＬポリペプチドに対して融合したペプチド残基間の共有結合または非共有結合相互作用によって結合した２〜４種類のＴＲＡＩＬポリペプチドを含む。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であってよいし、またはオリゴマー化を促進する性質を有するペプチドであってよい。ロイシンジッパーおよび抗体に由来する若干のポリペプチドは、以下に更に詳細に記載されるように、それらに対して結合したＴＲＡＩＬポリペプチドのオリゴマー化を促進しうるペプチドの中に含まれる。好ましくは、ＴＲＡＩＬポリペプチドは可溶性である。
抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に対して融合した異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の製造は、例えば、本明細書中に援用されるAshkenaziら（PNAS USA 88:10535,1991）；Byrnら（Nature 344:667,1990）；およびHollenbaughおよびAruffo（“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”，Current Protocols in Immunology，補遺４中，10.19.1-10.19.11頁，1992）によって記載されている。本発明の一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬ二量体は、抗体に由来するＦｃ部分ポリペプチドに対してＴＲＡＩＬを融合することによって生成される。「Ｆｃポリペプチド」という用語には、天然の形および突然変異タンパク質の形、更には、二量体化を促進するヒンジ領域を含有する一部切除されたＦｃポリペプチドが含まれる。好ましくは、Ｆｃポリペプチドは、可溶性ＴＲＡＩＬ（例えば、細胞外ドメインだけを含む）に対して融合される。
ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質をコードしている遺伝子融合は、適当な発現ベクター中に挿入される。ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質は、極めて類似した抗体分子を組立てることを可能にし、その結果、Ｆｃポリペプチド間に鎖間ジスルフィド結合が形成し、二価ＴＲＡＩＬを生じる。他の実施態様において、ＴＲＡＩＬは、抗体重鎖または軽鎖の可変部に置換されてもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方を用いて製造された場合、４個ものＴＲＡＩＬ細胞外部分を含むＴＲＡＩＬオリゴマーを形成することが可能である。
一つの適当なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１に由来する天然のＦｃ部分ポリペプチドであり、これは、本明細書中に援用されるＰＣＴ出願第ＷＯ93/10151号で記載されている。もう一つの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第5,457,035号で記載されたＦｃ突然変異タンパク質である。その突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変更され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変更され、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変更されたこと以外はＷＯ93/10151号で示された天然のＦｃ配列のそれと同一である。この突然変異タンパク質Ｆｃは、免疫グロブリン受容体に対して減少した親和性を示す。
或いは、オリゴマーＴＲＡＩＬは、ペプチドリンカーによって結合した２個またはそれ以上の可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドを含んでいてよい。例として、米国特許第5,073,627号（本明細書中に援用される）で記載されたペプチドリンカーが含まれる。ペプチドリンカーによって隔てられた多数のＴＲＡＩＬポリペプチドを含む融合タンパク質は、慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。
オリゴマーＴＲＡＩＬポリペプチドを製造するもう一つの方法は、ロイシンジッパーの使用を必要とする。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、初めはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で識別されたが（Landschulzら，Science 240:1759,1988）、それ以来、種々の異なったタンパク質中で見出されている。既知のロイシンジッパーの中には、天然に存在するペプチドおよび二量体化するまたは三量体化するそれらの誘導体がある。可溶性オリゴマーＴＲＡＩＬタンパク質を製造するのに適したロイシンジッパードメインの例は、本明細書中に援用されるＰＣＴ出願第ＷＯ94/10308号で記載されたものである。溶液中で二量体化するまたは三量体化するペプチドに対して融合した可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適当な宿主細胞中で発現され、そして得られた可溶性オリゴマーＴＲＡＩＬは、培養物上澄みから回収される。
ＴＮＦ系列のタンパク質のいくつかのメンバーは、三量体の形で存在すると考えられる（BeutlerおよびHuffel，Science 264:667,1994；Bannerら，Cell 73:431,1993）。したがって、三量体ＴＲＡＩＬは、増強された生物学的活性の利点を与えることができる。好ましいロイシンジッパー部分は、三量体を優先的に形成するものである。一つの例は、本明細書中に援用されるHoppeら（FEBS Letters 344:191,1994）および米国特許出願第08/446,922号で記載のように、肺界面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在する三量体タンパク質に由来する他のペプチドは、三量体ＴＲＡＩＬを製造する場合に用いることができる。
実施例７で記載のように、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞中で発現された可溶性ＦＬＡＧ▲Ｒ▼−ＴＲＡＩＬポリペプチドは、二量体および三量体の混合物であると考えられるオリゴマーを自然に形成した。実施例８の検定におけるこの可溶性ＦＬＡＧ▲Ｒ▼−ＴＲＡＩＬの細胞毒性作用は、抗ＦＬＡＧ▲Ｒ▼抗体を包含することによって増大したが、これは、おそらくは、その抗体がＴＲＡＩＬ／受容体複合体の架橋を促進したためである。本発明の一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬの生物学的活性は、ＴＲＡＩＬに架橋しうる抗体と一緒にＴＲＡＩＬを用いることによって増大する。死滅すべき細胞は、可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドおよびこのような抗体両方と接触しうる。
一つの例として、癌細胞またはウイルスに感染した細胞を、抗ＦＬＡＧ▲Ｒ▼抗体および可溶性ＦＬＡＧ▲Ｒ▼−ＴＲＡＩＬポリペプチドと接触させる。好ましくは、Ｆｃ部分を欠いた抗体フラグメントを用いる。二価の形の抗体は、別々の二量体または三量体で見出される二つの可溶性ＦＬＡＧ▲Ｒ▼−ＴＲＡＩＬポリペプチドのＦＬＡＧ▲Ｒ▼部分を結合できる。抗体は、in vivo投与の前に、ＦＬＡＧ▲Ｒ▼−ＴＲＡＩＬポリペプチドと一緒に混合してよいしまたはインキュベートしてよい。
発現系
本発明は、ＴＲＡＩＬの発現のための組換え発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。何らかの適当な発現系を用いることができる。ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するものなどの適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に対して機能的に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）、ＴＲＡＩＬポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳の開始および終結を制御する適当な配列がある。ヌクレオチド配列は、調節配列がＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列に機能的に関係する場合に機能的に結合している。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列の転写を制御する場合にＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列に対して機能的に結合している。所望の宿主細胞中で複製する能力を与える複製起点、および形質転換細胞を識別する選択遺伝子は、概して、発現ベクター中に包含される。
更に、適当なシグナルペプチドをコードしている配列は、発現ベクター中に包含されうる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、そのシグナルペプチドを含む融合タンパク質としてＴＲＡＩＬが最初に翻訳されるように、ＴＲＡＩＬ配列に対して枠内で融合されうる。目的の宿主細胞中で機能性であるシグナルペプチドは、ＴＲＡＩＬポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からのＴＲＡＩＬの分泌時にＴＲＡＩＬポリペプチドから切断される。
ＴＲＡＩＬポリペプチドの発現に適当な宿主細胞としては、原核生物、酵母または高等真核生物細胞がある。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主と一緒に用いるのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら，Cloning Vectors:A Laboratory Manual，エルセビア，ニューヨーク（1985）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書中で開示されたＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてＴＲＡＩＬポリペプチドを製造するのに用いることができる
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性微生物、例えば、大腸菌またはバチルス属（Bacilli）が含まれる。形質転換に適当な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、並びにシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌属（Staphylococcus）内の様々な他の種が含まれる。大腸菌などの原核生物宿主細胞中において、ＴＲＡＩＬポリペプチドは、原核生物宿主細胞中の組換えポリペプチドの発現を促進するＮ末端メチオニン残基を含むことができる。Ｎ末端Ｍｅｔは、発現された組換えＴＲＡＩＬポリペプチドから切断されうる。
原核生物宿主細胞中で用いるための発現ベクターは、概して、１種類またはそれ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるかまたは独立栄養要求を与えるタンパク質をコードしている遺伝子である。原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例としては、クローニングベクターｐＢＲ322（ＡＴＣＣ37017）などの商業的に入手可能なプラスミドに由来するものがある。ｐＢＲ322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、したがって、形質転換された細胞を識別するための簡単な手段を提供する。適当なプロモーターおよびＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列は、ｐＢＲ322ベクター中に挿入される。他の商業的に入手可能なベクターとしては、例えば、ｐＫＫ223-3（Pharmacia Fine Chemicals，ウプサラ，スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotec，マディソン，ＷＩ，米国）がある。
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら，Nature 275:615,1978；およびGoeddelら，Nature 281:544,1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら，Nucl.Acids Res.8:4057,1980；およびＥＰ−Ａ−36776号）およびｔａｃプロモーター（Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,412頁，1982）がある。特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλＰ_LプロモーターおよびｃＩ857ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロモーターの誘導体を包含するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＩＭ９，ＡＴＣＣ37092に内在する）およびｐＰＬｃ28（大腸菌ＲＲ１，ＡＴＣＣ53082に内在する）が含まれる。
ＴＲＡＩＬは、代わりに、酵母宿主細胞中で、好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae））から発現させることができる。ピキア属（Pichia）またはクルイベロミセス属（Kluyveromyces）などの酵母の他の属を用いてもよい。酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列および選択可能マーカー遺伝子を有するであろう。酵母ベクターに適当なプロモーター配列には、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら，J.Biol.Chem.255:2073,1980）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Hessら，J.Adv.Enzyme Reg.7:149,1968；およびHollandら，Biochem.17:4900,1978）のプロモーターが含まれる。酵母発現で用いるための他の適当なベクターおよびプロモーターは、Hitzeman，ＥＰＡ−73,657号で更に記載されている。もう一つの選択は、Russellら，J.Biol.Chem.258:2674,1982）およびBeierら（Nature 300:724,1982）によって記載されたグルコース抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。酵母および大腸菌両方で複製可能なシャトルベクターは、大腸菌中での選択および複製のためのｐＢＲ322からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子および複製起点）を上記の酵母ベクター中に挿入することによって構築することができる。
酵母α−因子リーダー配列は、ＴＲＡＩＬポリペプチドの分泌を支配するのに用いることができる。α−因子リーダー配列は、しばしば、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入される。例えば、Kurjanら，Cell 30:933,1982およびBitterら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330,1984を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適当な他のリーダー配列は、当業者に知られている。リーダー配列は、一つまたはそれ以上の制限部位を有するようにその３′末端付近で修飾されていてもよい。これは、リーダー配列の構造遺伝子に対する融合を促進するであろう。
酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られている。一つのこのようなプロトコールは、Hinnenら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929,1978によって記載されている。Hinnenらプロトコールは、選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換細胞について選択し、ここにおいて選択培地は、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルから成る。
ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターによって形質転換された酵母宿主細胞は、「豊富な」培地中で発現を誘導するために増殖させることができる。豊富な培地の例は、１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースに８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補足したものからなる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消耗した場合に起こる。
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えＴＲＡＩＬポリペプチドを発現させるのに用いることができた。昆虫細胞中での異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers，Bio/Technology 6:47（1988）で論評されている。哺乳動物起原の樹立細胞系も用いることができる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、サル腎細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ1651）（Gluzmanら，Cell 23:175,1981）、Ｌ細胞、Ｃ127細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ163）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ10）細胞系、並びにMcMahanら（EMBO J.10:2821,1991）によって記載のアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶＩに由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ70）がある。
哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができるであろう。一般的に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起原の初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、哺乳動物宿主細胞中での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供するのに用いることができる。ウイルス初期および後期プロモーターは、両方とも、ウイルス複製起点をも有することができるフラグメントとしてウイルスゲノムから容易に得られるので、特に有用である（Fiersら，Nature 273:113,1978）。更に小さいまたは更に大きいＳＶ４０フラグメントもまた、ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位まで伸長した約２５０ｂｐ配列が包含されるという条件で用いることができる。
哺乳動物宿主細胞中で用いるための発現ベクターは、例えば、OkayamaおよびBerg（Mol.Cell.Biol.3:280,1983）によって開示されたように構築することができる。Ｃ127ネズミ乳房上皮細胞中での哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系は、実質的には、Cosmanら（Mol.Immunol.23:935,1986）によって記載のように構築することができる。Cosmanら，Nature 312:768,1984によって記載された高発現ベクターＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ39890として寄託されている。更に別の哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−0367566号およびＷＯ91/18982号で記載されている。もう一つの選択として、ベクターはレトロウイルスに由来してもよい。更に別の適当な発現系は、以下の実施例で記載される。
一つの好ましい発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＰＧ５．７と称される発現ベクターを用いる。この発現ベクターは、本明細書中に援用される1996年１月11日出願の米国特許出願第08/586,509号で記載されている。ＰＧ５．７成分には、ＣＨＯ細胞ゲノムＤＮＡのフラグメント、続いてＣＭＶ由来プロモーター、続いてアデノウイルス三部分リーダーをコードしている配列、次に続いて、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードしている配列が含まれる。これら成分は、プラスミドベクターｐＧＥＭ１（Promega，マディソン，ＷＩ）中に挿入された。ＴＲＡＩＬポリペプチド（またはＴＲＡＩＬを含有する融合タンパク質）をコードしているＤＮＡは、三部分リーダーおよびＤＨＦＲをコードしているそれぞれの配列間に挿入することができる。当該分野で認められているように、メトトレキセートを培地に加えて、発現レベルを増加させることができる。
ベクターＰＧ５．７中のＣＨＯ細胞ゲノムＤＮＡのフラグメントは、ＴＲＡＩＬの発現を促進する。ＣＨＯ細胞から単離されたゲノムＤＮＡのフラグメントを含有するファージ溶解産物は、1996年１月４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そして寄託番号ＡＴＣＣ97411を付与された。ベクターＰＧ５．７は、菌株寄託ＡＴＣＣ97411中のＣＨＯゲノムＤＮＡインサートのヌクレオチド８６７１〜１４５０７を有する。
ＴＲＡＩＬの発現のために、天然のシグナル配列、異種シグナル配列または哺乳動物宿主細胞中で機能性のリーダーを欠いたII型タンパク質を加えることができる。例として、米国特許第4,965,195号で記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Cosmanら，Nature 312:768（1984）で記載されたインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ367,566号で記載されたインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第4,968,607号で記載されたＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；およびＥＰ460,846号で記載されたII型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドがある。
好ましい発現系は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するリーダー配列を用いる。実施例７は、一つのこのようなリーダーの使用を例証する。実施例７において、哺乳動物宿主細胞は、ＦＬＡＧ▲Ｒ▼と称されるオクタペプチド（配列番号：７、上記）のＮ末端に融合し、次に、可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドのＮ末端に融合されるペプチドMet Ala Arg Arg Leu Trp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser（配列番号：９）をコードしている発現ベクターで形質転換された。配列番号：９の残基１〜２９は、ＣＭＶ由来リーダー配列を構成するが、残基３０〜３２は、実施例７で記載された発現ベクターを構築する場合に用いられるオリゴヌクレオチドによってコードされる。一つの実施態様において、ポリＨｉｓペプチド（例えば、６個のヒスチジン残基を含有するペプチド）をコードしているＤＮＡは、ＣＭＶリーダーおよびＦＬＡＧ▲Ｒ▼ペプチドをコードしているそれぞれの配列間に位置する。
このようなＣＭＶ由来リーダーペプチドを用いる発現系は、ＴＲＡＩＬ以外のタンパク質を発現させるのに有用である。配列番号：９のアミノ酸１〜２９をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを本明細書中で提供する。もう一つの実施態様において、そのベクターは、配列番号：９のアミノ酸１〜２８をコードする配列を含む。望まれる異種タンパク質をコードしているＤＮＡは、リーダーをコードしているＤＮＡの下流で、しかもそれと同じ読み枠内に位置する。更に別の残基（例えば、リンカーまたはプライマーによってコードされたもの）は、実施例７で記載されたベクターによって例証されるように、リーダーおよび所望の異種タンパク質をコードしているそれぞれの配列間に位置したＤＮＡによってコードされうる。当該分野で理解されるように、発現ベクターは、リーダーおよび異種タンパク質をコードしている配列に対して機能的に結合したプロモーターおよび何らかの他の所望の調節配列を含む。
配列番号：９で示されたリーダーペプチドは、２９位のアルギニン残基の後で切断されて、それに融合したタンパク質の成熟分泌型を生じることができる。或いは、または更に、切断は、配列番号：９のアミノ酸２０と２１との間でまたはアミノ酸２８と２９との間で起こりうる。
当業者は、シグナルペプチドが切断される１か所または複数の位置が、用いられる宿主細胞の種類、ネズミまたはヒトＴＲＡＩＬがベクターによって発現されるかどうか等のような因子によって変化しうることを理解するであろう。コンピュータープログラムによる分析は、主要な切断部位が、配列番号：９の残基２０と２１との間でありうることを示す。残基２２と２３との間および残基２７と２８との間の切断もまた可能であると予想される。例示すると、可溶性ネズミＴＲＡＩＬポリペプチドの発現および分泌は、多数の位置でのＣＭＶ由来シグナルペプチドの切断を引き起こした。分泌されたタンパク質の３種類の最も顕著な種類は（下降順で）、配列番号：９のアミノ酸２０と２１との間の切断、アミノ酸２２と２３との間の切断およびアミノ酸２７と２８との間の切断を引き起こした。
異種組換えタンパク質を製造する方法は、このような発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞を、異種タンパク質の発現および分泌を促進する条件下で培養し、そして培地からタンパク質を回収することを行う。ＣＭＶリーダーを用いる発現系は、例として、制限されるわけではないが、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、他のサイトカインおよびサイトカイン受容体が挙げられる何らかの望まれるタンパク質を製造するのに用いることができる。
精製ＴＲＡＩＬタンパク質
本発明は、上記の組換え発現系によって生産されうるしまたは天然に存在する細胞から精製されうる精製ＴＲＡＩＬタンパク質を提供する。所望の精製度は、タンパク質の目的の用途に依りうる。比較的高い精製度は、例えば、そのタンパク質をin vivoで投与する場合に望まれる。好都合に、ＴＲＡＩＬポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって他のタンパク質に該当するタンパク質バンドが検出できないように精製される。上で論及されたように、示差グリコシル化、翻訳後プロセッシングでの変動等のために、ＴＲＡＩＬタンパク質に該当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されうることは当業者によって理解されるであろう。ＴＲＡＩＬタンパク質の標品は、異なった（非ＴＲＡＩＬ）タンパク質に該当するバンドが見えなくなるまで精製されると考えられる。ＴＲＡＩＬは、最も好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で単一タンパク質バンドで示されるようにほぼ均一になるまで精製される。タンパク質バンドは、銀染色、クーマシーブルー染色または（タンパク質が放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーによって目視することができる。
ＴＲＡＩＬタンパク質を製造する一つの方法は、ＴＲＡＩＬをエンコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ＴＲＡＩＬが発現されるような条件下で培養することを含む。次に、ＴＲＡＩＬタンパク質を培養物から（培地または細胞抽出物から）回収する。当業者が理解するように、組換えＴＲＡＩＬを精製する手順は、用いられる宿主細胞の種類およびＴＲＡＩＬが培地中に分泌されるか否かのような因子によって変化しうる。
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系を用いる場合、最初に、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過装置を用いてその培地を濃縮することができる。濃縮工程後、その濃縮物をゲル濾過基剤などの精製マトリックスに対して適用することができる。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）側基を有するマトリックスまたは支持体を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において一般的に用いられる他の種類でありうる。或いは、陽イオン交換工程を用いることができる。適当な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスがある。スルホプロピル基が好ましい。最後に、ＴＲＡＩＬを更に精製するために、１回またはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ基剤（例えば、遊離の（ｐｅｄａｎｔ）メチルまたは他の脂肪族側基を有するシリカゲル）を用いて用いることができる。前述の精製工程のいくつかまたは全部を様々な組合せで用いて、精製ＴＲＡＩＬタンパク質を提供することができる。
細菌培養で製造された組換えタンパク質は、宿主細胞の最初の破壊、遠心分離、不溶性ポリペプチドの場合は細胞ペレットからまたは可溶性ポリペプチドの場合は上澄み液からの抽出、続いて１回またはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離することができる。最後に、最終精製工程としてＲＰ−ＨＰＬＣを用いることができる。微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊または細胞溶解性剤の使用を含めた何らかの好都合な方法によって破壊することができる。
形質転換された酵母宿主細胞は、好ましくは、分泌ポリペプチドとしてＴＲＡＩＬを発現するのに用いられる。これは、精製を簡単にする。酵母宿主細胞発酵からの分泌組換えポリペプチドは、Urdalら（J.Chromatog.296:171,1984）によって開示されたものと同様の方法によって精製することができる。Urdalらは、組換えヒトＩＬ−２の精製のための、分離用ＨＰＬＣカラム上での二つの逐次的な逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
或いは、ＴＲＡＩＬポリペプチドは、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ＴＲＡＩＬを結合する抗体を含有するアフィニティーカラムは、慣用法によって製造することができ、そしてＴＲＡＩＬを精製する場合に用いることができる。実施例４は、ＴＲＡＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体を生じる方法を記載している。
ＴＲＡＩＬの性質および使用
プログラムされた細胞死（アポトーシス）は、胚形成、変態、内分泌依存性組織委縮、正常組織ターンオーバーおよび免疫胸腺細胞の死の際に起こる。プログラムされた細胞死の調節は、免疫系の正常な機能にとって極めて重要である。例示すると、自己抗原を認識するＴ細胞は、胸腺におけるＴ細胞の成熟中にアポトーシス過程によって破壊されるが、他のＴ細胞は正に選択される。ある種の自己エピトープを認識する若干のＴ細胞（例えば、無能処理され且つある与えられた自己タンパク質の抗原決定基を与えられた）が、この排除過程を免れ、そして引続き自己免疫疾患においてある役割を果たす可能性が示唆されている（Gammonら，Immunology Today 12:193,1991）。
不充分なアポトーシスは、ある種の症状に関係していたが、高水準のアポトーシス細胞死は他の疾患に関係していた。このような疾患を治療する場合にアポトーシスを調節する薬剤を決定し且つ用いるのが望ましいことは理解される（Kromer，Advances in Immunology,58:211,1995；Grouxら，J.Exp.Med.175:331,1992；SachsおよびLotem，Blood 82:15,1993）。
アポトーシスを受けることに対するＴ細胞の異常な耐性は、リンパ球増加症、リンパ節症、巨脾腫症、自己反応性Ｔ細胞の蓄積、自己免疫疾患、白血病の発症およびリンパ腫の発症に関係していた（Kromer，上記；特に、214-215頁を参照されたい）。逆に、Ｔ細胞の過度のアポトーシスは、リンパ球減少症、全身性免疫不全および特異的免疫不全においてある役割を果たしていると示唆されてきたが、特殊な例は、伝染性単核細胞症およびサイトメガロウイルス感染に関係したウイルス誘導免疫不全状態、並びに腫瘍に媒介された免疫抑制である（Kromer，上記；特に、214頁を参照されたい）。ＨＩＶに感染した個体におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞の減少は、アポトーシスによる不適当な活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に起因しうる（Grouxら，J.Exp.Med.175:331,1992）。
実施例５および８で実証されるように、ＴＲＡＩＬは、ジャーカットクローンＥ６−１と称される急性Ｔ細胞白血病細胞系のアポトーシスを誘導する。したがって、ＴＲＡＩＬは、プログラムされた細胞死の調節を含めたアポトーシスの研究において有用な研究試薬である。ジャーカット細胞は、Ｔ細胞に由来する白血病細胞系であるので、本発明のＴＲＡＩＬは、Ｔ細胞に由来する他の悪性細胞種のような他の形質転換されたＴ細胞のアポトーシスにおいてＴＲＡＩＬが果たしうる役割の研究において用いられる。
ＴＲＡＩＬはジャーカット細胞を結合し、更には、それらのアポトーシスを誘導する。ＴＲＡＩＬは、新たに単離されたネズミ胸腺細胞、または健康なヒトドナーから新たに摘出された末梢血Ｔ細胞（ＰＢＴ）の死を引き起こさなかった。多数の用途は、ＴＲＡＩＬのこれらの性質から生じる。
ＴＲＡＩＬポリペプチドは、白血病細胞、またはＴＲＡＩＬが結合する何らかの他の細胞型を精製するのに用いることができる。白血病細胞は、例えば、患者の血液から単離することができる。一つの実施態様において、細胞は、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＴＲＡＩＬを結合しているクロマトグラフィーマトリックスを用いて精製される。クロマトグラフィーマトリックスに対して結合したＴＲＡＩＬは、完全長さタンパク質、細胞外ドメインを含むＴＲＡＩＬフラグメント、ＴＲＡＩＬ含有融合タンパク質または本明細書中に記載された他の適当なＴＲＡＩＬポリペプチドでありうる。一つの実施態様において、可溶性ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムに対して、Ｆｃ部分とプロテインＡまたはプロテインＧとの相互作用によって結合する。或いは、ＴＲＡＩＬは、フローサイトメトリーによって白血病細胞を単離する場合に用いることができる。
このように精製された白血病細胞は、ＴＲＡＩＬの結合後に死滅すると考えられるが、その死滅した細胞はなお細胞表面抗原を有するであろうし、そして抗白血病抗体を引き出す場合に免疫原として用いることができる。白血病細胞またはそれから単離された望まれる細胞表面抗原は、更に、ワクチン開発において用いられる。
ＴＲＡＩＬは白血病細胞（ジャーカット細胞系）を結合し且つ死滅させるので、ＴＲＡＩＬはまた、白血病を治療する場合に有用でありうる。治療法は、白血病細胞を有効量のＴＲＡＩＬと接触させることを含む。一つの実施態様において、白血病患者の血液をex vivoでＴＲＡＩＬポリペプチドと接触させる。ＴＲＡＩＬは、適当なマトリックス上に固定されていてよい。ＴＲＡＩＬは白血病細胞を結合するので、それらを患者の血液から除去した後、その血液を患者に戻す。
或いは、または更に、白血病患者から摘出された骨髄を、骨髄中の白血病細胞の死を誘導するのに有効な量のＴＲＡＩＬと接触させることができる。骨髄は、例えば、胸骨または腸骨稜から吸引され、そしてＴＲＡＩＬと接触して白血病細胞を除去することができる。このように処置された骨髄を患者に戻す。
ＴＲＡＩＬはまた、リンパ腫および黒色腫細胞に対して結合し且つそれらのアポトーシスを誘導する（実施例５、９および１０を参照されたい）。したがって、白血病細胞に関して上に記載されたものと同様のＴＲＡＩＬの使用は、リンパ腫および黒色腫細胞に応用できる。ＴＲＡＩＬポリペプチドは、制限されるわけではないが、白血病、リンパ腫および黒色腫を含めた癌を治療する場合に用いることができる。一つの実施態様において、リンパ腫はバーキットリンパ腫である。実施例９の表Ｉは、ＴＲＡＩＬがいくつかのバーキットリンパ腫細胞系に対して細胞毒性作用を有したことを示す。エプスタイン・バールウイルスは、バーキットリンパ腫の病因物質である。
ＴＲＡＩＬポリペプチドはまた、ウイルス感染を治療する場合に用いられる。ＴＲＡＩＬとの接触は、サイトメガロウイルスに感染した細胞の死を引き起こしたが、実施例１１で記載のように、感染していない場合の同様の細胞種の型を引き起こさなかった。他のウイルスに感染した細胞を死滅させるＴＲＡＩＬの能力は、実施例１１で記載された検定を用いて確証されうる。このようなウイルスには、制限されるわけではないが、脳心筋炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス水泡性口内炎ウイルス、単純疱疹ウイルス、アデノウイルス−２、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ＨＩＶおよびエプスタイン・バールウイルスがある。
有効量のＴＲＡＩＬを、ヒトを含めたウイルス感染に苦しむ哺乳動物に対して投与する。一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬは、インターフェロンと一緒に用いられてウイルス感染を治療する。実施例１１で記載された実験では、ＣＭＶに感染した細胞のγ−インターフェロンでの前処理は、ＴＲＡＩＬによって媒介された感染細胞の致死度を増加させた。ＴＲＡＩＬは、癌細胞またはウイルス感染細胞に対して細胞毒性作用を示す他の薬剤と一緒に投与することができる。
もう一つの実施態様において、ＴＲＡＩＬは、細胞調製物、組織または、移植される臓器中のウイルス感染細胞を死滅させるのに用いられる。例示すると、骨髄を受容者に移植する前に、その骨髄をＴＲＡＩＬと接触させて、その中に存在しうるウイルス感染細胞を死滅させることができる。
本発明のＴＲＡＩＬは、欠損したまたは不充分な量のＴＲＡＩＬによって（直接的にまたは間接的に）媒介される何らかの疾患の治療法を開発するのに用いることができる。治療的有効量の精製ＴＲＡＩＬタンパク質を、このような疾患に苦しむ患者に対して投与する。或いは、ＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列は、このような疾患の治療に対する遺伝子治療法を開発するのに用いることができる。天然のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列の本明細書中での開示は、欠損ＴＲＡＩＬ遺伝子の検出および正常ＴＲＡＩＬコード遺伝子でのその置換を可能にする。欠損遺伝子は、in vitro診断検定において、および本明細書中で開示された天然ＴＲＡＩＬヌクレオチド配列と、この遺伝子に欠損があると疑われる患者に由来するＴＲＡＩＬ遺伝子の配列との比較によって検出することができる。
本発明は、精製ＴＲＡＩＬおよび生理学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む薬剤組成物を提供する。適当な担体、希釈剤および賦形剤は、受容者に対して用いられる用量および濃度で無毒性である。このような組成物は、緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含めた炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート薬、グルタチオン並びに薬剤組成物中で一般的に用いられる他の安定化剤および賦形剤を含んでいてよい。中性緩衝食塩水または同種の（ｃｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）血清アルブミンと混合された食塩水は、適当な希釈剤の中に含まれる。組成物は、適当な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として用いて凍結乾燥物として製剤化することができる。
治療的使用には、本発明の精製タンパク質を患者、好ましくはヒトに対して、その指示症状に適当な方法で治療するために投与する。したがって、例えば、薬剤組成物は局所的に、静脈内注射、連続注入、植込物からの徐放または他の適当な技法によって投与することができる。適当な投薬量および投与頻度は、当然ながら、治療される指標症状の性状および重症度、所望の応答、患者の状態等のような因子に依るであろう。
薬剤組成物中で用いられるＴＲＡＩＬタンパク質は、好ましくは、ＴＲＡＩＬタンパク質が、天然のまたは内因性起原の他のタンパク質を実質的に含まない、望ましくは、製造過程からの残留タンパク質混入物を約１質量％未満しか含有しないように精製される。このような組成物は、しかしながら、安定化剤、担体、賦形剤または共治療薬として加えられた他のタンパク質を含有しうる。
本明細書中で開示されたＴＲＡＩＬコードＤＮＡは、上で論評されたように、ＴＲＡＩＬポリペプチドの製造において用いられる。ＴＲＡＩＬヌクレオチド配列のフラグメントもまた有用である。一つの実施態様において、このようなフラグメントは、本明細書中で開示されたヒトまたはネズミＴＲＡＩＬ ＤＮＡの少なくとも約１７個連続したヌクレオチド、更に好ましくは、少なくとも３０個連続したヌクレオチドを含む。本明細書中において、前記フラグメントのＤＮＡおよびＲＮＡ相補鎖を、配列番号：１、３および５のＴＲＡＩＬ ＤＮＡの一本鎖および二本鎖両方の形と一緒に提供する。
このようなＴＲＡＩＬ核酸フラグメントの使用の中には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でのプローブとしてまたはプライマーとしての使用がある。一つの例として、ＴＲＡＩＬの細胞外ドメインに相当するプローブを用いることができる。プローブは、in vitro検定並びにノーザンおよびサザンブロットなどの方法でＴＲＡＩＬ核酸の存在を検出する場合に用いられる。ＴＲＡＩＬを発現する細胞種もまた同定することができる。このような方法は周知であり、当業者は、具体的な目的の用途に応じて適当な長さのプローブを選択することができる。ＰＣＲには、望まれるＴＲＡＩＬ ＤＮＡ配列の末端に相当する５′および３′プライマーを用いて、慣用的な技法を用いてその配列を単離し且つ増幅させる。
ＴＲＡＩＬ核酸の他の有用なフラグメントは、標的ＴＲＡＩＬｍＲＮＡ（センス）またはＴＲＡＩＬ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に対して結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡかまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドである。このようなフラグメントは、概して、少なくとも約１４個のヌクレオチド、好ましくは、約１４〜約３０個のヌクレオチドを含む。ある与えられたタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを生成する能力は、例えば、SteinおよびCohen，Cancer Res.48:2659,1988およびvan der Krolら，BioTechniques 6:958,1988で記載されている。
標的核酸配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重らせんの促進された分解、転写または翻訳の未成熟終結を含めたいくつかの手段の一つによって、または他の手段によって翻訳（ＲＮＡ）または転写（ＤＮＡ）を阻止する二重らせんの形成を引き起こす。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＲＡＩＬタンパク質の発現を阻止するのに用いることができる。
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖−リン酸ジエステル主鎖（またはＷＯ91/06629号で記載されたものなどの他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここにおいて、このような糖結合は、内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。耐性糖結合を含むこのようなオリゴヌクレオチドはin vivoで安定である（すなわち、酵素的分解に耐えられる）が、標的ヌクレオチド配列に対して結合できるように配列特異性を保持している。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、ＷＯ90/10448号で記載されたものなどの有機残基、およびポリ（Ｌ−リシン）などの、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の残基に対して共有結合するオリゴヌクレオチドがある。また更に、エリプティシンなどの挿入剤およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変更することができる。
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ₄に媒介されたＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはエプスタイン・バールウイルスなどの他の遺伝子伝達ベクターを含めた何らかの遺伝子伝達法によって、標的核酸配列を含有する細胞中に導入することができる。好ましくは、適当なレトロウイルスベクター中へアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを挿入し、そしてその細胞を、挿入された配列を含有するレトロウイルスベクターとin vivoでかまたはex vivoで接触させることによって、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを標的核酸配列含有細胞中に導入する。適当なレトロウイルスベクターとしては、制限されるわけではないが、ネズミレトロウイルスＭ−ＭｕＬ Ｖ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬ Ｖに由来するレトロウイルス）、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称される二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＷＯ90/13641号を参照されたい）がある。或いは、他のプロモーター配列を用いてオリゴヌクレオチドを発現することができる。
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＷＯ91/04753号で記載のように、リガンド結合分子との結合体の形成によって標的ヌクレオチド配列含有細胞中へ導入することができる。適当なリガンド結合分子としては、制限されるわけではないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に対して結合する他のリガンドがある。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、その対応する分子若しくは受容体に対して結合するリガンド結合分子の能力をほとんど妨げないし、またはセンス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合型の細胞中への侵入をほとんど阻止しない。
或いは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ90/10448号で記載のように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって標的核酸配列含有細胞中へ導入することができる。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって細胞内で解離する。
ＴＲＡＩＬと免疫反応性の抗体
本発明のＴＲＡＩＬタンパク質またはそれらの免疫原性フラグメントは、抗体を生じさせる場合に用いることができる。本発明は、したがって、ＴＲＡＩＬを特異的に結合する抗体を提供する、すなわち、抗体は、（非特異的結合に対立するものとして）抗体の抗原結合部位によってＴＲＡＩＬに対して結合する。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、慣用的な技法によって製造することができる。例えば、Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses，Kennetら（監修），Plenum Press，ニューヨーク（1980）；およびAntibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLand（監修），Cold Spring Harbor Laboratory Press，コールド・スプリング・ハーバー，ＮＹ，（1988）を参照されたい。ＴＲＡＩＬと免疫反応性であるモノクローナル抗体は、以下の実施例４で更に例証される。
慣用的な技法によって製造することができる、このような抗体の抗原結合性フラグメントも、また、本発明によって包含される。このようなフラグメントの例としては、制限されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）およびＦ（ａｂ′）₂フラグメントがある。遺伝子工学技術によって製造された抗体フラグメントおよび誘導体もまた提供する。
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。このようなヒト化抗体は、既知の技法によって製造することができ、そして抗体をヒトに投与する場合に低下した免疫原性の利点を与える。一つの実施態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ個体の可変部（またはちょうどその抗原結合部位）およびヒト抗体に由来する不変部を含む。或いは、ヒト化抗体フラグメントは、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する（抗原結合部位を欠いた）可変部フラグメントを含んでいてよい。キメラのおよび更に工学処理されたモノクローナル抗体の製造法としては、Riechmannら（Nature 332:323,1988）、Liuら（PNAS 84:3439,1987）、Larrickら（Bio/Technology 7:934,1989）およびWinterおよびHarris（TIPS 14:139,1993年５月）で記載されたものがある。
抗体の使用のうちには、in vitroでかまたはin vivoでＴＲＡＩＬポリペプチドの存在を検出する検定での使用がある。抗体は、更に、アフィニティークロマトグラフィーによってＴＲＡＩＬを精製する場合に用いられる。
標的細胞に対するＴＲＡＩＬの結合を更に阻止することができる抗体は、ＴＲＡＩＬの生物学的活性を阻害するのに用いることができる。治療的方法は、ＴＲＡＩＬで媒介された生物学的活性を阻害する場合の有効量のこのような抗体のin vivo投与を行う。したがって、ＴＲＡＩＬによって直接的にかまたは間接的に媒介されたまたは悪化した疾患を治療する。モノクローナル抗体は、概して、このような治療的方法で用いるのに好ましい。
ＴＲＡＩＬに対して向けられた抗体は、血栓性細小血管症を治療するのに有用でありうる。一つのこのような疾患は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）である（Kwaan,H.C.，Semin.Hematol.,24:71,1987；Thompsonら，Blood,80:1890,1992）。ＴＴＰに関連した死亡率増加は、米国疾病管理センター（the U.S.Centers for Disease Control）（Torokら，Am.J.Hematol.50:84,1995）によって報告されている。
ＴＴＰに苦しむ患者（ＨＩＶ⁺およびＨＩＶ^-患者を含む）からの血漿は、皮膚微小血管由来のヒト内皮細胞のアポトーシスを誘導するが、大きい血管由来では誘導しない（Laurenceら，Blood,87:3245,1996年４月15日）。したがって、ＴＴＰ患者の血漿は、アポトーシスを直接的にまたは間接的に誘導する１種類またはそれ以上の因子を有すると考えられる。以下の実施例１３で記載された検定において、ＴＲＡＩＬに対して生じたポリクローナル抗体は、皮膚微小血管内皮細胞のＴＴＰ血漿に誘導されたアポトーシスを阻害した。実施例１３で示されたデータは、ＴＲＡＩＬがＴＴＰ患者の血清中に存在し、そして微小血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する場合にある役割を果たしうるということを示唆する。
もう一つの血栓性細小血管症は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）である（Moake,J.L.，Lancet,343:393,1994；Melnykら，（Arch.Intern.Med.,155:2077,1995；Thompsonら，上記）。本発明の一つの実施態様は、（たとえそれが小児をも襲うとしても）しばしば「成人ＨＵＳ」と称される症状を治療するための抗ＴＲＡＩＬ抗体の使用に関する。小児期／下痢関連ＨＵＳとして知られる疾患は、成人ＨＵＳとは病因が異なる。
小血管の血栓形成を特徴とする他の症状は、抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いて治療することができる。このような症状としては、制限されるわけではないが、次のものがある。小児ＡＩＤＳ患者の約５〜１０％で見られる心臓の問題は、小血管の血栓形成に関与していると考えられる。心臓内の微小血管系の故障は、多数の硬化症患者で報告されてきた。もう一つの例として、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療が考えられる。
一つの実施態様において、患者の血液または血漿を、抗ＴＲＡＩＬ抗体とex vivoで接触させる。抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、慣用法によって適当なクロマトグラフィーマトリックスに対して結合できる。患者の血液または血漿は、マトリックスに対して結合した抗体を含有するクロマトグラフィーカラムを介して流れた後、患者に戻される。固定された抗体は、ＴＲＡＩＬを結合するので、ＴＲＡＩＬタンパク質を患者の血液から除去する。
別の実施態様では、抗体をin vivoで投与し、この場合、遮断抗体を用いるのが望ましい。このような抗体は、標的細胞に対するＴＲＡＩＬの結合を阻害する能力について抗体を調べることによるなどの何らかの適当な検定法を用いて識別することができる。或いは、遮断抗体は、標的細胞に対するＴＲＡＩＬの結合の生物学的作用を阻害する能力に関する検定で識別することができる。実施例１２は、遮断抗体を識別する一つの適当な方法を例示するが、ここにおいて、抗体は、ジャーカット細胞のＴＲＡＩＬに媒介された溶解を阻害する能力について検定される。
本発明は、したがって、ＴＲＡＩＬに対して向けられた有効量の抗体の使用を含む、血栓性細小血管症を治療する方法を提供する。本発明の抗体は、in vivoまたはex vivo手順で用いられて、微小血管内皮細胞に対するＴＲＡＩＬに媒介された損傷（例えば、アポトーシス）を阻害することができる。
抗ＴＲＡＩＬ抗体は、特定の疾患を治療する場合に有用な他の薬剤と一緒に用いることができる。Laurenceら（Blood,87:3245,1996）によって報告されたin vitro実験において、微小血管内皮細胞のＴＴＰ血漿に媒介されたアポトーシスの若干の減少は、抗Ｆａｓ遮断抗体、アウリントリカルボン酸、または凍結沈降物の消耗した正常血漿を用いることによって達成された。
したがって、患者は、Ｆａｓ−リガンドに媒介された内皮細胞のアポトーシスを阻害する薬剤と、ＴＲＡＩＬに媒介された内皮細胞のアポトーシスを阻害する薬剤との組合せで治療されることができる。一つの実施態様において、抗ＴＲＡＩＬ遮断抗体および抗ＦＡＳ遮断抗体は、両方とも、ＴＴＰまたはＨＵＳなどの血栓性細小血管症を特徴とする疾患に苦しむ患者に対して投与される。Ｆａｓ抗原（ＣＤ９５）に対して向けられた遮断モノクローナル抗体の例は、本明細書に援用されるＰＣＴ出願公開第ＷＯ95/10540号で記載されている。
ＴＲＡＩＬと免疫反応性である抗体および適当な希釈剤、賦形剤または担体を含む薬剤組成物を、本明細書中において提供する。このような組成物の適当な成分は、ＴＲＡＩＬタンパク質を含有する組成物に関して上に記載された通りである。
次の実施例は、本発明の具体的な実施態様を例証するために与えられ、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
実施例１：ヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡの単離
本発明のヒトＴＲＡＩＬタンパク質をコードしているＤＮＡは、次の手順によって単離された。国立生物情報センター（the National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ）でのｄｂＥＳＴデータのＴＢＬＡＳＴＮ探索は、疑問配列LVVXXXGLYYVYXQVXF（配列番号：８）を用いて行われた。この配列は、ＴＮＦリガンド系列の最も保存された部分に基づく（Smithら，Cell,73:1349,1993）。発現された配列ｔａｇ（ＥＳＴ）ファイル、GenBank寄託番号Ｚ36726は、これら探索パラメーターを用いて識別された。GenBankファイルは、このＥＳＴが、ヒト心房ｃＤＮＡライブラリーから得られたことを示した。
このＥＳＴファイルの３′および５′末端からの配列に基づく二つの３０−ｂｐオリゴヌクレオチドを合成した。３′末端からのオリゴヌクレオチドは、配列TGAAATCGAAAGTATGTTTGGGAATAGATG（配列番号：１のヌクレオチド６３６〜６６５の相補体）を有し、そして５′オリゴヌクレオチドは、TGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTG（配列番号：１のヌクレオチド２９１〜３２０）であった。オリゴヌクレオチドは、³²Ｐγ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで５′末端に標識された。二つのλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーは、これら標識されたオリゴヌクレオチドの等モル混合物をプローブとして用いて慣用法によってスクリーニングされた。一つのライブラリーは、ヒト心臓５′伸長ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene Cloning Systems，ラホヤ，ＣＡ）であった。もう一方は、次のように製造された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ライブラリーであった。ＰＢＬは、正常ヒト志願者から得られ、そして１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）および１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２で６日間処理された。ＰＢＬ細胞を洗浄し、そして５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Calbiochem）および１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで４時間刺激した。メッセンジャーＲＮＡを、刺激されたＰＢＬ細胞から単離した。ｍＲＮＡ鋳型上で合成されたｃＤＮＡを、λｇｔ１０ファージベクター（Gigapak▲Ｒ▼，Stratagene Cloning Systems，ラホヤ，ＣＡ）中に包装した。
組換えファージを、大腸菌株Ｃ６００−ＨＦＬ上にプレーティングし、そして標準的なプラークハイブリダイゼーション技術を用いてスクリーニングした。ニトロセルロースフィルターを二重反復試験でこれらプレートから引上げ、そして³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドを用いて６０ｍＭトリスｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｘデンハート溶液、６ｘＳＳＣ、１ｍｇ／ｍｌのｎ−ラウロイルサルコシン、０．５％ ＮＰ４０および４μｇ／ｍｌのＳＳサケ精子ＤＮＡの溶液中において６７℃で一晩中ハイブリッド形成させた。次に、フィルターを３ｘＳＳＣ中において６７℃で３分間洗浄した。
心臓５′伸長ｃＤＮＡライブラリーから、一つの陽性プラークを約１００万個のプラークの中から得た。このクローンは、遺伝子の３′末端を含んでいなかった。ＰＢＬライブラリーを用いて、約５０個の陽性プラークを５００，０００個のプラークの中から得た。これら第一ラウンド陽性プラークから１５個を採取し、そして豊富なプールからのインサートを、ファージインサートを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させた。得られた生成物を、１．５％アガロースゲル電気泳動によって分割し、ニトロセルロース上にブロッティングし、そして標準的なサザンブロット技術によって、³²Ｐで標識された３０マーオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて分析した。サザン分析によって最大バンドを生じた二つのプラーク採取物を２回目のスクリーニングによって精製し、そして単離されたファージプラークを、上に記載されたのと同様の手順を用いて得た。
単離されたファージからのＤＮＡを、プレート溶解法によって製造し、そしてｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩで切取り、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液中１．５％アガロースを用いる電気泳動によって精製し、そしてpBluescript▲Ｒ▼ＳＫ（＋）プラスミド中に連結した。次に、これらインサートを、慣用法によって配列決定し、そして得られた配列を並列させた。
ヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１で示し、そしてそれによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：２で示す。このヒトＴＲＡＩＬタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１８）、膜貫通部分（アミノ酸１９〜３８）および細胞外ドメイン（アミノ酸３９〜２８１）を含む。このタンパク質の計算分子量は、３２，５０８ダルトンである。
このＴＲＡＩＬ ＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された大腸菌株ＤＨ１０Ｂ細胞は、１９９５年６月１４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そして寄託番号69849を付与された。その寄託は、ブダペスト条約の条件に基づいて行われた。寄託された菌株中の組換えベクターは、（実施例５で記載された）発現ベクターｐＤＣ４０９である。そのベクターをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして配列番号：１で示された完全なコード領域を含むヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡをその消化されたベクター中へ連結させた。
実施例２：一部切除されたＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡの単離
第二ヒトＴＲＡＩＬタンパク質をコードしているＤＮＡを次のように単離した。この一部切除されたＴＲＡＩＬは、ジャーカット細胞のアポトーシスを誘導する能力を示さない。
ＰＣＲ分析は、実施例１で記載された３０マーを５′および３′プライマーとして用いて、実施例１での第一ラウンドプラーク採取物１４個の内３個が、より短い形のＴＲＡＩＬ ＤＮＡを含有していたことを示した。短い形の遺伝子から一つを単離し、pBluescript▲Ｒ▼ＳＫ（＋）クローニングベクター（Stratagene Cloning Systems，ラホヤ，ＣＡ）中に連結し、そして配列決定した。
このＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：３で示す。それによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：４で示す。そのコードされたタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１８）、膜貫通部分（アミノ酸１９〜３８）および細胞外ドメイン（アミノ酸３９〜１０１）を含む。
配列番号：３のＤＮＡは、配列番号：１のＤＮＡのヌクレオチド３５９〜５０６を欠いているので、ヒトＴＲＡＩＬ欠失変異体（ｈｕＴＲＡＩＬｄｖ）クローンと称される。その欠失は、読み枠内での転位を引き起こし、その結果として、配列番号：４のアミノ酸１０１の後にインフレーム停止コドンを生じる。したがって、配列番号：３のＤＮＡは、一部切除されたタンパク質をコードしている。配列番号：２のアミノ酸１〜９０は、配列番号：４のアミノ酸１〜９０と同一である。しかしながら、その欠失のために、ｈｕＴＲＡＩＬｄｖタンパク質のＣ末端部分（配列番号：４のアミノ酸９１〜１０１）は、配列番号：２での対応する位置の残基とは異なる。
ｈｕＴＲＡＩＬｄｖタンパク質は、ＴＮＦ系列のタンパク質のメンバーのＣ末端で見出される上記の保存領域を欠いている。このｈｕＴＲＡＩＬｄｖタンパク質がジャーカット細胞のアポトーシスによる死を引き起こすことができないことは、更に、生物学的活性に関するこれら保存領域の重要性を確証している。
実施例３：ネズミＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡ
ネズミＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡを次の手順によって単離した。ベクターλＺＡＰ中にマウスＴ細胞系７Ｂ９に由来するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを、Mosleyら（Cell 59:335,1989）で記載のように製造した。そのライブラリーからのＤＮＡを、慣用的な技法によってニトロセルロースフィルター上に移した。
ヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡプローブを用いて、そのフィルター上のハイブリッド形成性マウスｃＤＮＡを識別した。二つの別々のプローブを２ラウンドのスクリーニングで用いた。ヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡを鋳型として用いて単離され且つ増幅された長さ約４００ｂｐのＰＣＲ反応生成物を、第一ラウンドのスクリーニングにおいてプローブとして用いた。これらＰＣＲ生成物は、ヒトＴＲＡＩＬコード領域のフラグメントから成った。第二ラウンドのスクリーニングで用いられたプローブは、配列番号：１のヒトＴＲＡＩＬ ＤＮＡの完全なコード領域から成った。ランダムプライムドＤＮＡ標識キット（Stratagene，ラホヤ，ＣＡ）を用いて、プローブを放射性標識した。
ハイブリダイゼーションを５０％ホルムアミド中において３７℃で行った後、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて５０℃で洗浄した。両方のスクリーニングラウンドで陽性であったマウスｃＤＮＡを単離した。
このＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：５で示し、そしてそれによってコードされたアミノ酸配列を配列番号：６で示す。そのコードされたタンパク質は、Ｎ末端細胞質ドメイン（アミノ酸１〜１７）、膜貫通部分（アミノ酸１８〜３８）および細胞外ドメイン（アミノ酸３９〜２９１）を含む。このマウスＴＲＡＩＬは、アミノ酸レベルにおいて配列番号：２のヒトＴＲＡＩＬと６４％同一である。マウスＴＲＡＩＬヌクレオチド配列のコード領域は、配列番号：１のヒトヌクレオチド配列のコード領域と７５％同一である。
実施例４：ＴＲＡＩＬを結合する抗体
この実施例は、ＴＲＡＩＬを特異的に結合するモノクローナル抗体の製造を例証する。このような抗体を生じさせる場合に用いることができる適当な免疫原としては、制限されるわけではないが、精製ＴＲＡＩＬタンパク質またはその免疫原性フラグメント（例えば、細胞外ドメイン）、ＴＲＡＩＬポリペプチドを含有する融合タンパク質（例えば、可溶性ＴＲＡＩＬ／Ｆｃ融合タンパク質）、および細胞表面上で組換えＴＲＡＩＬを発現する細胞がある。
モノクローナル抗体を産生させる既知の技法としては、米国特許第4,411,993号で記載されたものがある。簡単にいうと、免疫原として完全フロイントアジュバント中に乳化したＴＲＡＩＬを用いてマウスに免疫感作し且つ１０〜１００μｇの量で皮下または腹腔内に注射する。１０〜１２日後、免疫感作された被験動物に、不完全フロイントアジュバント中に乳した追加のＴＲＡＩＬを追加免疫する。その後、週１回〜週２回の免疫感作スケジュールで定期的にマウスに追加免疫する。血清試料を、ＴＲＡＩＬ抗体についてドットブロット検定またはＥＬＩＺＡ（酵素結合イムノソルベント検定）で調べるために、後眼窩出血または尾先端切開によって定期的に採取する。
適当な抗体力価の検出後、陽性動物に、食塩水中のＴＲＡＩＬの最後の静脈内注射を１回行う。３〜４日後、その被験動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞を、ＮＳＩまたは、好ましくはP3x63Ag8.653（ＡＴＣＣ ＣＲＬ1580）などのネズミ骨髄腫細胞系に融合させる。融合はハイブリドーマ細胞を生じ、それらを、多段微量滴定プレート中の、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中に入れる。
ハイブリドーマ細胞を、精製ＴＲＡＩＬに対する反応性についてＥＬＩＳＡにより、Engvallら（Immunochem.8:871,1971）でおよび米国特許第4,703,004号で開示された技法の適応によってスクリーニングする。陽性ハイブリドーマ細胞は、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせることができる。或いは、ハイブリドーマ細胞を様々な技法によってフラスコまたはローラーボトル中のin vitroで増殖させることができる。マウス腹水中で生じたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に続いてゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。或いは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを、ＴＲＡＩＬに対する結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーと同様に用いることができる。
実施例５：ＤＮＡラダーアポトーシス検定
ヒトＴＲＡＩＬを発現させ、そしてアポトーシスを誘導するその能力について調べた。ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子のコード領域の３′および５′末端に対応したオリゴヌクレオチドを合成し、そのオリゴヌクレオチドの末端にＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限部位を包含させた。ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子のコード領域を、プライマーとしてこれらオリゴヌクレオチドを用いて標準的なＰＣＲ技術によって増幅させた。ＰＣＲ反応生成物を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化した後、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化されたベクターｐＤＣ409中に挿入した。ｐＤＣ409は、哺乳動物細胞中で用いるための発現ベクターであるが、大腸菌細胞中でも複製可能である。
ｐＤＣ409は、ｐＤＣ406と称される発現ベクター（本明細書に援用されるMcMahanら，EMBO J.10:2821,1991およびＰＣＴ出願ＷＯ91/18982号で記載された）に由来する。ｐＤＣ406は、ＳＶ40、エプスタイン・バールウイルスおよびｐＢＲ322に由来する複製起点を有し、そしてDowerら，J.Immunol.142:4314（1989）によって記載されたＨＡＶ−ＥＯの誘導体である。ｐＤＣ406は、ＨＡＶ−ＥＯのアデノウイルス２三部分リーダー配列中に存在するイントロンの欠失によりＨＡＶ−ＥＯとは異なる。多重クローニング部位（多数の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む）に挿入されたＤＮＡを、ＨＩＶおよびアデノウイルスに由来する調節要素を用いて転写し且つ翻訳する。そのベクターはまた、アンピシリン耐性を与える遺伝子を有する。
ｐＤＣ409は、ｍｃｓの外側のＢｇｌII部位が欠失したためにｍｃｓＢｇｌII部位が独特であるという点でｐＤＣ406とは異なる。二つのＰｍｅ１部位および一つのＳｒｆ１部位をｍｃｓに対して加え、そして３個の停止コドン（ＴＡＧ）を、三つ全部の読み枠内で機能するようにｍｃｓの下流に配置した。ＤＮＡ配列決定工程を助けるために、Ｔ７プライマー／プロモーターを加えた。
サル腎細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ10478）は、McMahanら，上記によって記載のように、ヒトＣＭＶ中間体−初期エンハンサー／プロモーターから作動するエプスタイン・バールウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）を構成性発現するＥＢＮＡ−１をコードしている遺伝子を用いるＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ70）のトランスフェクションによって誘導された。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ＥＢＶ複製起点を有するｐＤＣ409などの発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
Falcon T175フラスコ中で増殖したＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞を、１５μｇの「中空」ｐＤＣ409かまたはヒトＴＲＡＩＬコード領域含有ｐＤＣ409でトランスフェクションした。形質転換された細胞を、３７℃および１０％ＣＯ₂で３日間培養した。次に、その細胞をＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ ＥＤＴＡ中において３７℃で２０分間インキュベートし、細胞スクレーパでフラスコから掻取り、そしてＰＢＳ中で１回洗浄した。次に、その細胞を１％パラホルムアルデヒドＰＢＳ中において４℃で１０分間固定し、そしてＰＢＳ中で３回洗浄した。
ジャーカット細胞をこの検定において標的細胞として用いて、ＴＲＡＩＬ発現性細胞がそれらのアポトーシスを誘導できたかどうか確認した。ジャーカット細胞系クローンＥ６−１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番号ＡＴＣＣ ＴＩＢ152として入手可能なヒト急性Ｔ細胞白血病細胞系であり、Weissら（J.Immunol.133:123-128,1984）で記載されている。そのジャーカット細胞を、１０％ウシ胎児血清並びに１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびペニシリンを補足されたＲＰＭＩ培地中において細胞２００，０００〜５００，０００個／ｍｌの密度まで培養した。これら細胞４００万個／ウェルを、６ウェルプレート中において培地２．５ｍｌをもちいて、以下に示されたような、固定細胞、Ｆａｓリガンドでトランスフェクションされた細胞からの上澄みおよび各種抗体の様々な組合せと一緒に同時培養した。
４時間後、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、そしてデスクトップ遠心機中において１２００ＲＰＭで５分間ペレットにした。そのペレットを再懸濁させ、そして１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５および０．２％トリトンＸ-l00から成る緩衝液５００μｌ中において４℃で１０分間インキュベートしたが、これは、細胞を溶解させるが、核はそのまま残す。次に、溶解産物を、４℃のミクロ遠心機中において１４，０００ＲＰＭで１０分間回転させた。上澄みを取出し、そして２５：２４：１のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール１ｍｌで３回抽出した後、グリコーゲン担体（Sigma）１μｇの存在下においてＮａＯＡＣおよびエタノールで沈殿させた。
得られたペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中に再懸濁させ、そしてＲＮアーゼＡ１０μｇ／ｍｌと一緒に３７℃で２０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ溶液を、トリスホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液中での１．５％アガロースゲル電気泳動によって分割し、臭化エチジウムで染色し、そして紫外線を透照させながら写真撮影した。
結果は次の通りであった。ｐＤＣ409かまたはｐＤＣ409−ＴＲＡＩＬでトランスフェクションされた固定ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞は、検出可能なＤＮＡラダーを生じなかった。ジャーカット細胞と一緒に同時培養されたｐＤＣ409−ＴＲＡＩＬ固定細胞はＤＮＡラダーを生じたが、ジャーカット細胞と一緒に同時培養されたｐＤＣ409固定細胞は生じなかった。
ＤＮＡラダーはまた、ｐＤＣ409中のヒトＦａｓリガンドをコードしているＤＮＡでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞からの濃縮上澄みと一緒にジャーカット細胞を同時培養した場合に見られた。その上澄みは、細胞表面からタンパク質分解によって放出される可溶性Ｆａｓリガンドを含有すると考えられる。Ｆａｓリガンドに誘導されたＤＮＡラダーは、Ｆａｓに対して向けられた可溶性遮断モノクローナル抗体１０μｇ／ｍｌを加えることによって阻止されることができた。この同様の抗体は、ｐＤＣ409−ＴＲＡＩＬ細胞によってジャーカットＤＮＡのラダーを阻害できなかったが、これは、ＴＲＡＩＬがＦａｓによるアポトーシスを誘導しないことを示す。
同様の検定法において、ｐＤＣ409−ＴＲＡＩＬでトランスフェクションされた固定ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞は、Ｕ937細胞中でＤＮＡラダーをもたらした。Ｕ937（ＡＴＣＣ ＣＲＬ1593）は、ヒト組織球リンパ腫細胞系である。エフェクター対標的細胞の比率は１：４であった（ジャーカット標的細胞についての検定の場合と同様）。
ＤＮＡラダーとして知られるパターンへの細胞性ＤＮＡのフラグメント化は、アポトーシスの特徴である。前述の検定において、ＴＲＡＩＬは、白血病細胞系およびリンパ腫細胞系のアポトーシスを誘導した。
実施例６：ノーザンブロット分析
多数の異なった組織種でのＴＲＡＩＬの発現を、慣用的なノーザンブロット法で分析した。様々な成人組織からのポリＡ⁺ＲＮＡを含有するノーザンブロット（多重組織ノーザンブロットＩおよびII）は、Clonetech（パロ・アルト，ＣＡ）から入手した。他のブロットは、ＲＮＡ試料を１．１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分割し、製造者（Amersham Corporation）による指示通りにHybond-N上にブロッティングし、そしてメチレンブルーで染色してＲＮＡ濃度を監視することによって作成された。ブロットは、ヒトＴＲＡＩＬの完全なコード領域に対応するアンチセンスＲＮＡリボプローブでプローブされた。
ヒトＴＲＡＩＬｍＲＮＡは、末梢血リンパ球、結腸、小腸、卵巣、前立腺、胸腺、脾臓、胎盤、肺、腎臓、心臓、すい臓および骨格筋で検出された。ＴＲＡＩＬ転写物は、大形細胞退生リンパ腫細胞系Karpas 299（Fischerら，Blood,72:234,1988）でおよび扁桃Ｔ細胞で豊富であることが判った。ＴＲＡＩＬメッセージは、Rajiと称されるバーキットリンパ腫細胞系において僅かに存在した。
ＴＲＡＩＬｍＲＮＡは、精巣、脳または肝でも、いくつかのＴ細胞系でも検出されなかった。ＴＲＡＩＬ転写物は、刺激されないかまたはＰＭＡおよびカルシウムイオノホアで２０時間刺激された新たに単離された末梢血Ｔ細胞（ＰＢＴ）中でほとんどまたは全く検出されなかった。
実施例７：可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドの製造
配列番号：２のアミノ酸９５〜２８１を含む可溶性ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドを次のように製造した。このポリペプチドは、上で論評されたスペーサー部分を欠いた細胞外ドメインのフラグメントである。
可溶性ヒトＴＲＡＩＬをコードしている発現ベクターは、次のアミノ酸配列（Ｎ末端〜Ｃ末端まで挙げられた）、すなわち、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するリーダー配列、Flag▲Ｒ▼と称される合成エピトープ、およびヒトＴＲＡＩＬのアミノ酸９５〜２８１をコードしているインフレームＤＮＡを融合することによって構築された。Flag▲Ｒ▼オクタペプチド（配列番号：７）は、上でおよびHoppら（Biotechnology 6:1204-1210,1988）で記載のように、それに対して融合したタンパク質の精製を容易にする。
ＴＲＡＩＬをコードしているＤＮＡフラグメントを単離し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列番号：２のアミノ酸９５〜２８１をコードしているＤＮＡフラグメントの末端を確定するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させた。３′プライマーは、ＴＲＡＩＬコード配列の下流にＮｏｔＩ部位を更に加えた３１マーであった。５′プライマーは、ＴＲＡＩＬコード配列の上流にＳｐｅＩ部位およびFlag▲Ｒ▼エピトープコード配列を加えた。ＰＣＲは、慣用法によって、上記のヒトＴＲＡＩＬｃＤＮＡを鋳型として用いて行われた。
反応生成物をＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断された発現ベクターｐＤＣ409（実施例５で記載された）中に挿入した。ＣＭＶ読み取り枠リーダーをコードしているＳａｌＩ−ＳｐｅＩフラグメントを形成するアニーリングされたオリゴヌクレオチドもまた、ベクター中に連結された。ＣＭＶ由来リーダーのアミノ酸配列を配列番号：９で示す。配列番号：９のアミノ酸１〜２９は、ＣＭＶ ＤＮＡによってコードされるが、アミノ酸３０〜３２は、ベクターを構築する場合に用いられたオリゴヌクレオチドによってコードされる。大腸菌細胞を連結反応混合物でトランスフェクションし、そして所望の組換え発現ベクターをそこから単離した。
ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ10478；実施例５で記載された）を、ｐＤＣ409-Flag-shＴＲＡＩＬと称される組換えベクターでトランスフェクションし、そして可溶性Flag▲Ｒ▼−ＴＲＡＩＬポリペプチドの発現および分泌を可能にするように培養した。培養物上澄みをトランスフフェクションの３日後に採取し、そして固体支持体上に固定されたＭ２と称する抗Flag▲Ｒ▼抗体を含有するカラムに入れた。次に、そのカラムをＰＢＳで洗浄した。モノクローナル抗体Ｍ２は、Hoppら、上記で記載され、そしてKodak Scientific Imaging Systems，ニューヘブン，コネチカット州から入手可能である。５０ｍＭクエン酸塩を用いてカラムから８００μｌ画分を溶離し、そして速やかに１Ｍトリス（ｐＨ８）０．４５ｍｌ中で中和した。画分を１０％グリセロールに調整し、そして必要とされるまで−２０℃で貯蔵した。
ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞中で発現されたこの可溶性組換えFlag▲Ｒ▼／ヒトＴＲＡＩＬは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析された場合、２８ｋＤの見掛けの分子量を有する。Flag▲Ｒ▼部分は、全分子量に対して推定８８０ダルトンを与えている。精製可溶性Flag▲Ｒ▼／ＴＲＡＩＬのゲル濾過分析は、その分子が、溶液中において約８０ｋＤの大きさの多量体であることを示唆する。理論によって拘束されたくはないが、そのゲル濾過分析は、可溶性組換えFlag▲Ｒ▼／ヒトＴＲＡＩＬが、二量体および三量体の組合せを自然に形成して、三量体が優先的に存在したことを示唆する。
ＣＭＶリーダー−Flag▲Ｒ▼−可溶性ネズミＴＲＡＩＬタンパク質をコードするｐＣＤ409-Flag-smＴＲＡＩＬと称される発現ベクターを、同様の手順で構築した。可溶性ネズミＴＲＡＩＬポリペプチドをコードしているＤＮＡフラグメントを単離し且つＰＣＲによって増幅させた。配列番号：６のネズミＴＲＡＩＬ配列のアミノ酸９９〜２９１をコードしているＤＮＡの末端を確定するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおいて５′および３′プライマーとして用いた。
実施例８：可溶性ＴＲＡＩＬによる白血病細胞の溶解
実施例５において、ヒトＴＲＡＩＬを発現する細胞は、ジャーカット細胞（白血病細胞系）のアポトーシスを誘導した。次の実験において、可溶性ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドはジャーカット細胞を死滅させた。
ジャーカット細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌペニシリンを補足したＲＰＭＩ培地中で培養して、細胞２００，０００〜５００，０００個／ｍｌの密度とした。その細胞（９６ウェルプレート中において１００μｌの容量で細胞５０，０００個／ウェル）を、図１で示された試薬と一緒に２０時間インキュベートした。「ＴＲＡＩＬ supe.」は、ｐＤＣ409-Flag-shＴＲＡＩＬ（実施例７を参照されたい）でトランスフェクションされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞からの条件上澄み（１０μｌ／ウェル）を意味する。「対照supe.」は、中空ベクターでトランスフェクションされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞からの上澄みを意味する。示されたところで、固定された抗Flag▲Ｒ▼抗体Ｍ２（「Imm.Ｍ２」）を、１００μｌ／ウェルの容量中１０μｇ／ｍｌの濃度で加え、そして４℃で一晩中かまたは３７℃で２時間付着させた後、ウェルは吸引され、そしてＰＢＳで２回洗浄されて非結合抗体を除去した。Ｆａｓリガンドまたは、Ｆａｓに対して向けられた遮断モノクローナル抗体であるＭ３（Aldersonら，J.Exp.Med.181:71,1995；およびＰＣＴ出願ＷＯ95/10540号）で処理されたジャーカット細胞は、検定において指示通りに包含された。
このように処理された細胞の代謝的活性を、アラマルブルー（alamar Blue）染料の代謝的変換によって次の手順で検定した。アラマルブルー変換は、アラマルブルー染料（Biosource International，カマリロ，ＣＡ）１０μｌ／ウェルを加え、そして染料が加えられた時点での５５０〜６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ）を、４時間後のＯＤ５５０〜６００ｎｍから差引くことによって測定された。染料の無変換を生存率０％とプロットし、そしてＴＲＡＩＬの不存在下の染料変換濃度を生存率１００％とプロットする。生存率％は、実験対対照培養物の染色比に１００を掛けることによって計算された。
結果を図１で示す。誤差バーは、４個の別々のウェルからの測定値の標準偏差を表し、それらの値はこれら測定値の平均である。
ＴＲＡＩＬ含有上澄みは、ジャーカット細胞の生存率の有意の減少を引き起こした。細胞生存率のより大きな減少は、ＴＲＡＩＬ含有上澄みおよび固定された抗Flag▲Ｒ▼抗体Ｍ２の組合せとの接触に起因した。一つの可能な説明は、Ｍ２が、Flag▲Ｒ▼／ＴＲＡＩＬ受容体複合体の架橋を促進することによって、シグナルを与える強さを増加させるということである。
Ｆａｓリガンドは、ジャーカット細胞を死滅させる能力を示した。抗Ｆａｓ抗体Ｍ３は、Ｆａｓリガンドの活性を阻害したが、ＴＲＡＩＬの活性を阻害しなかった。
アラマルブルー検定での染料変換の変化が細胞死のためであったことを確証するために、ＴＲＡＩＬによって引き起こされた細胞生存率の低下を、トリパンブルーで細胞を染色することによって確証した。
実施例９：白血病およびリンパ腫細胞の溶解
実施例５および８において、ＴＲＡＩＬは、白血病細胞系（ジャーカット）およびリンパ腫細胞系（Ｕ937）のアポトーシスを誘導した。次の実験は、更に、白血病およびリンパ腫細胞を死滅させるＴＲＡＩＬの能力を実証する。
表Ｉで示されたヒト細胞系を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌペニシリンを補足したＲＰＭＩ培地中で培養して、細胞２００，０００〜５００，０００個／ｍｌの密度とした。その細胞（９６ウェルプレート中において１００μｌの容量で細胞５０，０００個／ウェル）を、ｐＤＣ409-Flag-shＴＲＡＩＬでトランスフェクションされたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞からの条件上澄み（１０μｌ／ウェル）と一緒に２０時間インキュベートした。
代謝的活性を、アラマルブルー染料の変換によって、実施例８で記載された検定手順で検定した。結果を表Ｉで示す。
アラマルブルー検定での染料変換の変化が細胞死のためであったことを確証するために、ＴＲＡＩＬによって引き起こされた細胞生存率の低下を、トリパンブルーで細胞を染色することによって確証した。FlickおよびGifford（J.Immunol.Methods 68:167-175,1984）によって記載のように行われたクリスタルバイオレット染色もまた、アラマルブルー検定で見られた結果を確証した。細胞死のアポトーシス性は、トリバンブルー染色および顕微鏡によるアポトーシスフラグメント化の可視化によって確証された。
表Ｉで示されたように、多数の癌細胞系は、ＴＲＡＩＬに媒介された死滅に対して感受性であった。ＴＲＡＩＬに媒介されたアポトーシスに対する更に別の細胞種の感受性は、この実施例の項で記載された検定法を用いて確認することができる。
ＴＲＡＩＬは、細胞系ＴＨＰ−１、Ｋ562、Karpas 299およびＭＰ−１に対してほとんど細胞毒性作用を示さなかった。Karpas 299としても知られるＫ299（ＤＳＭ−ＡＣＣ31）は、高級大形細胞退生リンパ腫（Fischerら，Blood,72:234,1988）で診断された雄の末梢血から樹立された。ＭＰ−１は、自発的に誘導されるＥＢＶで形質転換されたＢ細胞系である（Goodwinら，Cell 73:447,1993）。理論によって拘束されたくはないが、これら４種類の細胞系は、ＴＲＡＩＬの受容体を発現しないことがありうるし、またはアポトーシスを阻害する遺伝子のアップレギュレーションを特徴とすることがありうる。

実施例１０：ＴＲＡＩＬの交差種活性
ヒトおよびネズミＴＲＡＩＬの種間交差反応性を次のように調べた。ネズミおよびヒトＴＲＡＩＬを、ヒト黒色腫細胞系Ａ375（ＡＴＣＣ ＣＲＬ1619）と一緒にインキュベートした。これは付着性細胞系であるので、アラマルブルーよりもむしろクリスタルバイオレット検定を用いて細胞生存率を決定した。Ａ375細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌペニシリンを補足したＤＭＥＭ中で培養した。その細胞（９６ウェルプレート中において１００μｌの容量で細胞１０，０００個／ウェル）を、実施例７で記載された可溶性ネズミＴＲＡＩＬと一緒に７２時間インキュベートした。クリスタルバイオレット染色は、FlickおよびGifford（J.Immunol.Methods 68:167-175,1984）によって記載のように行われた。その結果は、ネズミおよびヒトＴＲＡＩＬがＡ375細胞を死滅させたという点で、ヒトおよびネズミＴＲＡＩＬ両方が、これらヒト細胞に対して活性であることを示した。
ネズミ細胞に対して作用するヒトＴＲＡＩＬの能力を、不死化されたネズミ線維芽細胞系Ｌ929を用いて調べた。Ｌ929細胞のヒトかまたはネズミＴＲＡＩＬとのインキュベーションは、クリスタルバイオレット染色で低下を引き起こすので、ヒトおよびネズミＴＲＡＩＬはネズミ細胞（の誘導されたアポトーシス）に対して活性であることが示された。クリスタルバイオレットの他に、細胞死はトリバンブルー染色によって確証された。
実施例１１：ＣＭＶ感染細胞の溶解
次の実験は、実施例７で製造された可溶性Flag▲Ｒ▼−ヒトＴＲＡＩＬタンパク質が、ウイルス感染細胞に対して細胞毒性作用を有することを示す。
正常なヒト歯肉線維芽細胞を、２４ウェルプレート上において、１０％ＣＯ₂、並びに１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００μｇ／ｍｌペニシリンを補足したＤＭＥＭ培地中で密集するまで増殖させた。線維芽細胞の試料は、図２で示されたように処理された。サイトカインの濃度は、γ−インターフェロンに関して１０ｎｇ／ｍｌおよび可溶性Flag▲Ｒ▼−ヒトＴＲＡＩＬを３０ｎｇ／ｍｌであった。ＴＲＡＩＬを与えられた試料全てにも、ＴＲＡＩＬ活性を（おそらくは架橋によって）増強する抗Flag▲Ｒ▼抗体Ｍ２（上記）を２倍重量過剰与えた。
指示されたサイトカインでの細胞の前処理は２０時間であった。細胞をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染させるために、培地を吸引し、そして細胞を、ＤＭＥＭ中において近似ＭＯＩ（感染の多発性）５でＣＭＶに感染させた。２時間後、ウイルス含有培地をＤＭＥＭと取替え、そしてサイトカインを指示通り加えた。２４時間後、細胞をクリスタルバイオレット染料で記載通りに染色した（FlickおよびGifford，1984，上記）。染色された細胞を水で２回洗浄し、２％デオキシコール酸ナトリウム２００μｌで破裂させ、水で５倍に希釈し、そして５７０ｎｍでのＯＤを得た。最大染色％は、最も強い染色を示した試料に対してＯＤを標準化することによって計算された。同様の結果が、いくつかの独立した実験から得られた。
図２で示された結果は、ＴＲＡＩＬが、ＣＭＶに感染した線維芽細胞を特異的に死滅させたことを示す。この細胞死は、γ−インターフェロンでの細胞の前処理によって促進された。ウイルスに感染していない線維芽細胞がほとんど死滅しなかったことは、ＴＲＡＩＬとの接触に起因した。
実施例１２：遮断抗体を識別する検定
ＴＲＡＩＬに対して向けられた遮断抗体は、ＴＲＡＩＬの特定の生物学的活性を阻害する能力に関して抗体を調べることによって識別することができる。次の検定において、モノクローナル抗体を、ＴＲＡＩＬに媒介されたジャーカット細胞のアポトーシスを阻害する能力に関して調べた。ジャーカット細胞系は、実施例５で記載されている。
Flag▲Ｒ▼／可溶性ヒトＴＲＡＩＬ融合タンパク質に対して生じるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を、検定において用いた。ハイブリドーマ培養物からの上澄みを、９６ウェル微量滴定プレート中のＲＰＭＩ完全培地中において、４０ｎｇ／ｍｌの抗Flag▲Ｒ▼モノクローナル抗体Ｍ２と架橋した２０ｎｇ／ｍｌのFlag▲Ｒ▼／可溶性ヒトＴＲＡＩＬと一緒にインキュベートした。対照培養物に対しては、等量の新鮮ハイブリドーマ培地を加えた。Flag▲Ｒ▼／可溶性ヒトＴＲＡＩＬ融合タンパク質およびＭ２と称されるモノクローナル抗体は、実施例７で記載されている。
ハイブリドーマ上澄みは、１：５０（ｖ／ｖ）希釈（開始濃度）でおよびその２倍連続希釈で用いられた。３７℃、１０％ＣＯ₂で３０分間インキュベーション後、ジャーカット細胞５０，０００個／ウェルを加え、そしてインキュベーションを２０時間続けた。
次に、細胞生存率を、アラマルブルー染料の代謝的変換を測定して算定した。アラマルブルー変換検定法は、実施例８で記載されている。モノクローナル抗体は、Flag▲Ｒ▼／可溶性ヒトＴＲＡＩＬによって誘導されたジャーカット細胞のアポトーシスを阻害することが判った。
実施例１３：ＴＲＡＩＬ遮断実験
皮膚由来のヒト微小血管内皮細胞を、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の患者からの血漿または対照血漿を単独でかまたは抗ＴＲＡＩＬポリクローナル抗血清の存在下で用いて１６〜１８時間処理した。１：２０００希釈の抗血清を用いた。血漿は、以下の＃１および＃２で示される二人のＴＴＰ患者からであった。検定で用いられた細胞は、ＭＶＥＣ−１（ＨＭＶＥＣ 2753，Clonetics，サン・ディエゴ，ＣＡから購入された）およびＭＶＥＣ−２（ＤＨＭＶＥＣ 30282，Cell Systems，カークランド，ＷＡから購入された）であった。これら細胞の培養物は、Laurenceら（Blood,87:3245,1996）で記載のように維持することができる。
結果は次の通りであった。示されたデータは、ヨウ化プロビジウムで染色された細胞のＤＮＡヒストグラムにより、そして「Ａ₀ピーク」は、アポトーシスピークを示す（Oyaizuら，Blood,82:3392,1993；Nicolettiら，J.Immunol.Methods,139:271,1991；およびLaurenceら，Blood,75:696,1990を参照されたい）。

データは、ＴＴＰ患者に由来する血漿が、ヒト由来の微小血管内皮細胞のアポトーシスを誘導することを示す。このアポトーシスは、ＴＲＡＩＬに対して向けられたポリクローナル性抗体によって阻害された。
配列表
（2）配列情報SEQ ID NO:1:
（i）配列の特性:
（A）長さ:1751塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源:
（B）クローン名:huAIC
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:CDS
（B）存在位置:88..933
（xi）配列:SEQ ID NO:1:

（2）配列情報SEQ ID NO:2:
（i）配列の特性:
（A）長さ:281アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:2:

（2）配列情報SEQ ID NO:3:
（i）配列の特性:
（A）長さ:1521塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源:
（B）クローン名:HuAIC-dv
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:CDS
（B）存在位置:78..383
（xi）配列:SEQ ID NO:3:

（2）配列情報SEQ ID NO:4:
（i）配列の特性:
（A）長さ:101アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:4:

（2）配列情報SEQ ID NO:5:
（i）配列の特性:
（A）長さ:1366塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA to mRNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源:
（B）クローン名:MuAIC
（ix）特徴:
（A）NAME/KEY:CDS
（B）存在位置:47..919
（xi）配列:SEQ ID NO:5:

（2）配列情報SEQ ID NO:6:
（i）配列の特性:
（A）長さ:291アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直鎖状
（ii）配列の種類:タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:6:

（2）配列情報SEQ ID NO:7:
（i）配列の特性:
（A）長さ:8アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:not relevant
（D）トポロジー:not relevant
（ii）配列の種類:ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源:
（B）クローン名:FLAGペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:7:

（2）配列情報SEQ ID NO:8:
（i）配列の特性:
（A）長さ:17アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:not relevant
（D）トポロジー:not relevant
（ii）配列の種類:ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源:
（B）クローン名:conservedペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:8:

（2）配列情報SEQ ID NO:9:
（i）配列の特性:
（A）長さ:32アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（C）鎖の数:not relevant
（D）トポロジー:not relevant
（ii）配列の種類:ペプチド
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vii）直接の起源:
（B）クローン名:CMV leader
（xi）配列:SEQ ID NO:9:

Claims (29)

1. ＴＲＡＩＬポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡであって、該ＴＲＡＩＬポリペプチドが、以下：
   （ａ）配列番号：２のアミノ酸１〜２８１のアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号：６のアミノ酸１〜２９１のアミノ酸配列；
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
   （ｄ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該ＴＲＡＩＬポリペプチドがＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導できる上記単離ＤＮＡ。
2. 前記ＴＲＡＩＬポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸１〜２８１および配列番号：６のアミノ酸１〜２９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の単離ＤＮＡ。
3. 可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドをコードしている単離ＤＮＡであって、該可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドが、
   （ａ）配列番号：２のアミノ酸ｘ〜２８１のアミノ酸配列、ここにおいてｘは３９〜９５の整数である;
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および、
   （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドがＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導できる上記単離ＤＮＡ。
4. 前記可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸ｘ〜２８１の配列を含み、ここにおいてｘは３９〜９５の整数である請求項３に記載のＤＮＡ。
5. 前記可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸９５〜２８１の配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ。
6. ＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードしている単離ＤＮＡであって、該フラグメントは、
   （ａ）配列番号：２のアミノ酸１２４〜２７６のアミノ酸配列;
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および、
   （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントはＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導する上記単離ＤＮＡ。
7. ＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントが、配列番号：２のアミノ酸１２４〜２７６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載のＤＮＡ。
8. ＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードしている単離ＤＮＡであって、該フラグメントは、
   （ａ）配列番号：２の一部からなるアミノ酸配列であって、ここにおいて、そのＮ末端アミノ酸は配列番号：２の残基３９〜１２４から選択され、そしてそのＣ末端アミノ酸は配列番号：２の残基２７６〜２８１から選択される;
   （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および、
   （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
   から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントはＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導する上記単離ＤＮＡ。
9. 配列番号：２の位置１２４、１２５、１３６、１５４、１６９、１７４、１８０、１８２、１８７、１９０、１９３、２７５、および２７６のアミノ酸が保存されている、請求項８に記載のＤＮＡ。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
11. ＴＲＡＩＬポリペプチドを製造する方法であって、請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を、ＴＲＡＩＬの発現を促進する条件下で培養し、そしてＴＲＡＩＬポリペプチドを回収することを含む上記方法。
12. 精製ＴＲＡＩＬポリペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号：２のアミノ酸１〜２８１のアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号：６のアミノ酸１〜２９１のアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
    （ｄ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、該ＴＲＡＩＬポリペプチドがＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導できる上記精製ＴＲＡＩＬポリペプチド。
13. 配列番号：２のアミノ酸１〜２８１および配列番号：６のアミノ酸１〜２９１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１２に記載の精製ＴＲＡＩＬポリペプチド。
14. 菌株ＡＴＣＣ69849で寄託された組換えベクターのｃＤＮＡインサートによってコードされたヒトＴＲＡＩＬポリペプチド。
15. 精製可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドであって、
    （ａ）配列番号：２のアミノ酸ｘ〜２８１のアミノ酸配列、ここにおいてｘは３９〜９５の整数である;
    （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および、
    （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
    から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、該可溶性ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドがＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導できる上記精製可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチド。
16. 配列番号：２のアミノ酸ｘ〜２８１の配列を含み、ここにおいて、ｘは３９〜９５の整数である、請求項１５に記載の可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチド。
17. 配列番号：２のアミノ酸９５〜２８１を含む請求項１５に記載の可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチド。
18. ＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントであって、該フラグメントは、
    （ａ）配列番号：２のアミノ酸１２４〜２７６のアミノ酸配列;
    （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および、
    （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
    から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントはＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導する上記フラグメント。
19. 配列番号:２のアミノ酸１２４〜２７６のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１８に記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント。
20. ＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントであって、該フラグメントは、
    （ａ）配列番号：２の一部からなるアミノ酸配列であって、ここにおいて、そのＮ末端アミノ酸は配列番号：２の残基３９〜１２４から選択され、そしてそのＣ末端アミノ酸は配列番号：２の残基２７６〜２８１から選択される;
    （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；および、
    （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列；
    から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、該フラグメントはＴＲＡＩＬ感受性標的細胞のアポトーシスを誘導する上記フラグメント。
21. 配列番号：２の位置１２４、１２５、１３６、１５４、１６９、１７４、１８０、１８２、１８７、１９０、１９３、２７５、および２７６のアミノ酸が保存されている、請求項２０に記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント。
22. ＴＲＡＩＬ感受性標的細胞が、癌細胞およびウイルス感染細胞からなる群より選択される、請求項１８および２０に記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント。
23. ＴＲＡＩＬ感受性標的細胞が、白血病細胞、リンパ腫細胞、および黒色細胞種細胞からなる群より選択される、請求項１８および２０に記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント。
24. ＴＲＡＩＬ感受性標的細胞がジャーカット細胞である、請求項１８および２０に記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント。
25. 請求項１５〜１７のいずれかに記載の可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれかに記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、を２〜３個含むオリゴマー。
26. 請求項１５〜１７のいずれかに記載の可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチド、または請求項１８〜２４のいずれかに記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、を３個含むＴＲＡＩＬ三量体。
27. 請求項１３または１６に記載のＴＲＡＩＬポリペプチドを特異的に結合する抗体であって、前記ＴＲＡＩＬポリペプチドのアミノ酸配列は：
    （ａ）配列番号：２のアミノ酸１〜２８１；
    （ｂ）配列番号：６のアミノ酸１〜２９１；または
    （ｃ）配列番号：２のアミノ酸ｘ〜２８１、ここにおいてｘは３９〜９５の整数である；
    である、前記抗体。
28. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２７に記載の抗体。
29. 癌細胞またはウイルス感染細胞においてアポトーシスを誘導するための医薬組成物であって、請求項１５〜１７のいずれかに記載の可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチド、請求項１８〜２４のいずれかに記載のＴＲＡＩＬポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、請求項２５に記載のオリゴマー、または請求項２６に記載のＴＲＡＩＬ三量体、を含んでなる前記医薬組成物。

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