MXPA97010399A - Citocina que induce apoptosis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva citocina designada TRAIL que induce apoptosis de ciertas células objetivo, incluyendo células de cáncer y células viralmente infectadas. Las secuencias de DNA aisladas que codifican TRAIL son descritas, junto con los vectores de expresión y células huésped transformadasútiles en producir polipéptidos TRAIL. También se proporcionan los anticuerpos que específicamente ligan TRAIL.

Description

CITOCINA QUE INDUCE APOPTOSIS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La muerte celular programada conocida como apoptosis es distinta de la muerte de la célula debido a la necrosis. La apoptosis ocurre en embriogénesis, metamorfosis, atrofia de tejido dependiente endocrina, cambio de tejido normal, y muerte de inmunotimocitos (inducida a través de su complejo antígeno-receptor o por glucocorticoides)(ltoh et al. , Cell 66:233, 1991 ). Durante la maduración de células T en el timo, las células T que reconocen antígenos propios son destruidas a través del proceso apoptótico, mientras que otras son seleccionadas positivamente. La posibilidad de que algunas células T reconozcan ciertos epitopes propios (por ejemplo, determinantes antigénicos presentados y procesados ineficientemente de una proteína propia dada) escapa de este proceso de eliminación y subsecuentemente juega un papel de enfermedades autoinmunes ha sido sugerida (Gammon et al. , Immunology Today 12: 193, 1991 ). Un antígeno de superficie de célula conocido como Fas ha sido reportado para mediar la apoptosis y se cree que juega un papel en la supresión clonal de células T reactivas propias (Itoh et al. , Cell 66:233, 1991 ; Watanabe-Fukinage et al. , Nature 356:314, 1992). El enlace cruzado un anticuerpo monoclonal específico para Fas ha sido reportado que induce varias líneas de células para experimentar apoptosis (Yonehara et al. , J. Exp. Med., 169: 1747, 1989; Trauth et al. , Science, 245:301 , 1989). Sin embargo, bajo cientras condiciones, la ligación de un anticuerpo monoclonal específico a Fas puede tener un efecto coestimulatorio en células T recién aisladas (Alderson et al. , J. Exp. Med. 178:2231 , 1993). Los DNA que codifican un ligando Fas de rata (Suda et al. , Cell, 75: 1 169, 1993) y un ligando Fas humano (Takahashi et al. , International Immunology 6: 1567, 1994) han sido aislados. La ligación del ligando Fas a las células que expresan antígeno Fas ha sido demostrada por inducir apoptosis (Suda et al., supra, y Takahashi et al. , supra). La investigación en la existencia y la identidad de otra(s) molécula(s) que juega un papel en la apoptosis es deseable. La identificación de tales moléculas proporcionaría medios adicionales para regular la apoptosis, así como también proporcionar discernimiento adicional en el desarrollo de tolerancia propia por el sistema inmunológico y la etiología de las enfermedades autoinmunes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una proteína de citocina novedosa, así como también el DNA aislado que codifica la citocipa y vectores de expresión comprendiendo el DNA aislado. Las propiedades de la citocina novedosa, la cual es un miembro de la familia de factor de necrosis de tumor (TNF) de ligandos, incluyen la capacidad de inducir la apoptosis de ciertos tipos de células objetivo. De esta manera, esta proteína es designada Ligando de Inducción de Apoptosis Relacionada con TNF (TRAIL). Entre los tipos de células que mueren por el contacto con TRAIL son las células de cáncer tales como células de leucemia, linfoma y melanoma, y células infectadas con un virus. Un método para producir polipéptidos TRAIL involucra cultivar células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que contiene DNA que codifica TRAIL bajo condiciones apropiadas para la expresión de TRAIL, recuperando entonces el polipéptido TRAIL expresado del cultivo. Los anticuerpos dirigidos contra polipéptidos TRAIL también son provistos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 presenta los resultados de un ensayo descrito en el ejemplo 8. El ensayo demostró que un polipéptido TRAIL humano soluble indujo la muerte de células Jurkat, las cuales son una línea de células de leucemia. La figura 2 presenta los resultados de un ensayo descrito en el ejemplo 1 1 . El contacto con un polipéptido TRAIL humano soluble indujo la muerte de fibroblastos humanos infectados con citomegalovirus, mientras que los fibroblastos no infectados viralmente no fueron matados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una proteína novedosa designada TRAIL es proporcionada en la presente, junto con el DNA que codifica TRAIL y vectores de expresión recombinante comprendiendo DNA de TRAIL. Un método para producir polipéptidos TRAIL recombinantes involucra cultivar células huésped transformadas con los vectores de expresión recombinante bajo condiciones apropiadas para la expresión de TRAIL, y recuperar el TRAIL expresado. La presente invención también proporciona anticuerpos que ligan específicamente proteínas TRAIL. En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. La proteína TRAIL induce apoptosis de ciertos tipos de células objetivo, tales como las células transformadas que incluyen pero no están limitadas a, células de cáncer y células infectadas viralmente. Como se demostró en los ejemplos 5, 8, 9, y 10 más adelante, TRAIL indujo apoptosis de líneas de células de melanoma, linfoma y leucemia humanas. Entre los usos de TRAIL está el uso para matar células de cáncer TRAIL encuentra uso adicional en el tratamiento de infecciones virales. La infección con citomegalovirus (CMV) rindió fibroblastos humanos susceptibles a la apoptosis cuando se puso en contacto con TRAIL, mientras que los fibroblastos sin afectar no fueron matados a través del contacto con TRAI L (ver ejemplo 1 1 ). El aislamiento de un DNA que codifica TRAI L humano es descrito en el ejemplo 1 más adelante. La secuencia de nucleótidos del DNA de TRAIL humano aislado en el ejemplo 1 es presentada en la SEQ ID NO: 1 , y la secuencia de aminoácidos codificados por medio de esa es presentada en la SEQ ID NO:2. Esta proteína TRAI L humana comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1 -18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38) , y un dominio extracelular (aminoácidos 39-281 ). El dominio extracelular contiene una región que liga receptor.

Las células DH10B de la especie E. coli transformadas con un vector recombinante conteniendo DNA de TRAIL humano fueron depositadas en American Type Culture Collection el 14 de junio de 1995, y se les asignó un no. de acceso 69849. El depósito fue hecho bajo los términos del Tratado de Budapest. El vector recombinante en la especie depositada es el vector de expresión pDC409 (descrito en el ejemplo 5). El vector fue digerido con Salí y Notl, y DNA de TRAIL humano que incluye la región de ciframiento completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 fue ligada en el vector. El DNA que codifica una segunda proteína TRAIL humana fue aislado como se describe en el ejemplo 2. La secuencia de nucleótidos de este DNA se presenta en la SEQ ID NO:3, y la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo se presenta en la SEQ ID NO:4. La proteína codificada comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1 -18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-101 ). El DNA de la SEQ ID NO:3 carece de una porción de DNA de la SEQ ID NO: 1 , y de esta manera es designado el clon variante de supresión de TRAIL humano (huTRAILdv). Los nucléotidos 18 a 358 de la SEQ ID NO: 1 son idénticos a las nucleótidos 8 a 348 del DNA de huTRAILdv de la SEQ ID NO:3. Los nucleótidos 359 a 506 de la SEQ ID NO: 1 son omitidos del DNA clonado de la SEQ ID NO:3. La supresión provoca un cambio en el marco de lectura, lo cual resulta en un codón de paro dentro del marco después del aminoácido 101 de la SEQ ID NO:4. El DNA de la SEQ ID NO:3 codifica de esta manera una proteína truncada. Los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO:2 son idénticos a los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO:4. Sin embargo, debido a la supresión, la porción C-terminal de la proteína huTRAILdv (aminoácidos 91 a 101 de la SEQ ID NO:4) difiere de los residuos en las posiciones correspondientes en la SEQ ID NO:2. En contraste con la longitud completa de la proteína huTRAIL, la proteína huTRAILdv truncada no exhibe la capacidad para inducir apoptosis de las células de leucemia de célula T de la línea de células Jurkat. El DNA que codifica una proteína TRAIL de ratón también ha sido aislado, como se describe en el ejemplo 3. La secuencia de nucleótidos de este DNA es presentada en la SEQ I D NO:5 y la secuencia de aminoácidos codificada con ella es presentada en la SEQ I D NO:6. La proteína codificada comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1 -17), una región transmembrana (aminoácidos 18-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-291 ). Este TRAIL de ratón es 64% idéntico al TRAI L humano de la SEQ ID NO:2 en el nivel de aminoácidos. La región de ciframiento de la secuencia de nucleótidos TRAI L de ratón es 75% idéntica a la región de ciframiento de la secuencia de nucleótidos humana de SEQ I D NO: 1 Una modalidad de la presente invención está dirigida a la proteína TRAIL humana caracterizada por la secuencia de aminoácidos N-terminal MetAlaMetMetGluValGInGlyGlyProSerLeuGlyGInThr (aminoácidos 1 - 15 de las SEQ ID NOS:2 y 4). Las proteínas TRAIL de ratón caracterizadas por la secuencia de aminoácidos N-terminal MetProSerSerGIyAlaLeuLysAspLeuSerPheSerGInHis (aminoácidos 1 - 15 de la SEQ I D NO:6) también son proporcionadas en la presente.

El TRAIL de la presente invención es distinto de la proteína conocida como ligando Fas (Suda et al. , Cell, 75: 1 169, 1993; Takahashí et al. , International Immunology 6: 1567, 1994). El ligando Fas induce apoptosis de ciertos tipos de células, via el receptor conocido como Fas. Como se demostró en el ejemplo 5, la apoptosis inducida por TRAIL de las células objetivo no es mediada a través de Fas. La secuencia de aminoácidos de TRAIL humano de la SEQ ID NO.2 es aproximadamente 20% idéntica a la secuencia de aminoácidos de ligando Fas humano que es presentado en Takahashi et al, supra. El dominio extracelular del TRAIL humano es aproximadamente 28.4% idéntico al dominio extracelular del ligando Fas humano. Las secuencias de aminoácidos descritas en la presente revelan que TRAI L es un miembro de la familia TNF de ligandos (Smith et al. Cell, 73: 1349, 1993; Suda et al. , Cell, 75: 1 169, 1993; Smith et al. , Cell, 76:959, 1994). Las identidades en porcentaje entre la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de TRAIL humano y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de otras proteínas de esta familia son como sigue:28.4% con ligando Fas, 22.4% con linfotoxina-ß, 22.9% con TN F-a, 23.1 % con TNF-ß, 22.1 % con ligando CD30, y 23.4% con ligando CD40. El TRAIL se probó para la capacidad de ligar receptores de ia familia TNF-R de receptores. El análisis de ligación fue conducido usando el procedimiento de autoradiografía de pendiente de Gearing et al. (EMBO J. 8:3667, 1989). El análisis no reveló ninguna ligadura detectable de TRAI L humano a CD30, CD40, 4-1 BB, OX40, TNF-R (forma p80), CD27, o LTßR (también conocido como TNFR-RP) humanos. Los resultados en el ejemplo 5 indican que el TRAIL humano no liga Fas humano. Los polipéptidos de TRAIL de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de, pero son altamente homólogos a, aquellos presentados en las SEQ ID NOS:2 y 6. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, homólogos derivados de otras especies mamíferas, variantes (tanto variantes que ocurren naturalmente y aquellas generadas por tecnología de DNA recombinante), y fragmentos TRAIL que retienen una actividad biológica deseada. Tales polipéptidos exhiben una actividad biológica de las proteínas TRAIL de las SEQ ID NOS:2 y 6, y de preferencia comprenden una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% idéntica (muy preferiblemente por lo menos 90% idéntica) a la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:6. Estas modalidades de la presente invención son descritas en mayor detalle más adelante. Las secuencias conservadas ubicadas en la porción C-terminal de las proteínas en la familia TNF son identificadas en Smith et al. (Cell, 73: 1349, 1993, ver página 1353 y Figura 6); Suda et al. (Cell, 75: 1 169, 1993, ver figura 7); Smith et al. (Cell, 76:959, 1994, ver figura 3); y Goodwin et al. (Eur. J. Immunol. , 23:2631 , 1993, ver figura 7 y páginas 2638-39), incorporadas en la presente por referencia. Entre los aminoácidos en la proteína TRAIL humana que son conservados (en por lo menos una mayoría de los miembros de la familia TN F) son aquéllos en las posiciones 124- 125 (AH), 136(L), 154(W), 169(L), 174(L), 180(G), 182(Y) , 187(Q), 190(F), 1 93(Q), y 275-276(FG) de la SEQ I D NO:2. Otra característica estructural de TRAIL es una región espaciadora entre el extremo C de la región transmembrana y la porción del dominio extracelular que se cree que es más importante para la actividad biológica. Esta región espaciadora, ubicada en el extremo N del dominio extracelular, consiste de los aminoácidos 39 a 94 de la SEQ ID NO:2. Espaciadores análogos se encontraron en otros miembros de la familia, por ejemplo el ligando CD40. Los aminoácidos 138 a 153 corresponden a un lazo entre las hojas ß de la proteína TRAIL humana doblada (tridimensional). Provistas en la presente están las proteínas TRAIL ligadas a la membrana (comprendiendo un dominio citoplásmico, una región transmembrana, y un dominio extracelular) así como también fragmentos TRAIL que retienen una propiedad biológica deseada de la proteína TRAIL de longitud completa. En una modalidad, los fragmentos TRAI L son polipéptidos TRAIL solubles comprendiendo todo o parte del dominio extracelular, pero que carecen de la región transmembrana lo que provocaría la retención del polipéptido en una membrana celular. Las proteínas TRAIL solubles son capaces de ser secretadas de las células en las cuales son expresadas. De manera ventajosa, un péptido de señal heterólogo es fusionado al extremo N, de manera que el TRAI L soluble es secretado sobre la expresión. El TRAIL soluble puede ser identificado (y distinguido de sus contrapartes ligadas a la membrana no solubles) al separar células intactas las cuales expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) para la presencia de la proteína deseada. La presencia de TRAIL en el 1 medio indica que la proteína fue secretada de las células y así es una forma soluble de la proteína TRAI L. Las formas solubles que ocurren naturalmente de TRAIL son abarcadas por la presente invención. El uso de formas solubles de TRAIL es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de las proteínas de células huésped recombinantes es facilitada, ya que las proteínas solubles son secretadas de las células. Además, las proteínas solubles generalmente son más adecuadas para la administración intravenosa. Ejemplos de polipéptidos TRAIL solubles son aquellos que contienen el dominio extracelular completo (por ejemplo, aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2 o los aminoácidos 39 a 291 de la SEQ ID NO:6). Los fragmentos del dominio extracelular que retienen una actividad biológica deseada también son provistos. Tales fragmentos ventajosamente incluyen regiones de TRAIL que son conservadas en las proteínas de la familia TNF de ligandos, como se describió antes. Ejemplos adicionales de polipéptidos TRAIL solubles son aquellos que caren no solo de dominio citoplásmico y región transmembrana, sino también de toda o parte de la región espaciadora antes descrita. Los polipéptidos TRAIL humanos solubles incluyen, de esta manera pero no están limitados a, polipéptidos que comprenden aminoácidos x a 281 , en donde x representa cualquiera de los aminoácidos en las posiciones 39 a 95 de la SEQ ID NO:2. En la modalidad en la cual el residuo 95 es el aminoácido N-terminal, la región espaciadora completa ha sido suprimida.

Los fragmentos TRAIL, incluyendo polipéptidos solubles, pueden ser preparados mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales.

Una secuencia de DNA que codifica un fragmento TRAIL deseado puede ser subclonada en un vector de expresión para la producción del fragmento TRAIL. La secuencia de DNA que codifica TRAIL ventajosamente es fusionada a una secuencia que codifica un péptido de señal o líder adecuado. El fragmento de DNA que codifica TRAIL deseado puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas. Los fragmentos de DNA también pueden ser producidos mediante la digestión de endonucleasa de restricción de una secuencia de DNA clonado de longitud completa, y aislado mediante electroforesis en geles de agarosa. Si es necesario, los oligonucleótidos que reconstruyen el extremo 5' o 3' a un punto deseado pueden ser ligados a un fragmento de DNA generado por digestión de enzima de restricción. Tales oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de corte de endonucleasa de restricción corriente arriba de la secuencia de ciframiento deseada, y colocar un codón de iniciación (ATG) en el extremo N de la secuencia de ciframiento.

El bien conocido procedimiento de reacción en cadena de polimerasa (PCR) también puede ser empleado para aislar y amplificar una secuencia de DNA que codifica un fragmento de proteína deseada. Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de DNA son empleados como primarios 5' y 3'. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de DNA amplificado en un vector de expresión. Las técnicas PCR son descritas en Saiki et al. , Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al. , eds. , Academic Press, Inc. , San Diego (1989), pp. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. , Academic Press, Inc. (1990). Como será entendido por el artesano experto, la región transmembrana de cada proteína TRAI L discutida antes es identificada de acuerdo con los criterios convencionales para identificar que tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de una región transmembrana pueden variar ligeramente (muy probablemente por no más de cinco aminoácidos en cualquier extremo) de aquellos presentados antes. Los programas de computadora útiles para identificar tales regiones hidrofóbicas en las proteínas están disponibles. El DNA de TRAI L de la presente invención incluye cDNA, DNA químicamente sintetizado, DNA aislado por PCR, DNA genómico, y combinaciones de los mismos. El DNA de TRAIL genómico puede ser aislado por hibridación del cDNA de TRAIL descrito en la presente usando técnicas estándares. El RNA trascrito del DNA de TRAIL también es abarcado por la presente invención. Una búsqueda en el banco de datos NCBI identificó cinco etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) teniendo regiones de identidad con DNA de TRAIL. Estas ESTs (números de acceso NCBI T90422, T82085, T10524, R31020, y Z36726) son todos fragmentos de cDNA humanos. Los registros NCBI no describen algún polipéptido codificado por las ESTs, y no indican que marco de lectura, si hay, pudiera ser. Sin embargo, aún si el conocimiento del marco de lectura revelado en la presente por divulgación de las regiones de ciframiento de TRAI L completas es usado para expresar las ESTs, ninguno de los polipéptidos codificados tendrían la propiedad de inducir apoptosis de los polipétidos TRAIL reclamados presentemente. En otras palabras, si cada uno de las cinco ESTs fueran insertadas en los vectores de expresión corriente debajo de un codón de metionina iniciador, en el marco de lectura elucidado en la presente, ninguno de los polipéptidos expresados resultantes contendrían una porción suficiente del dominio extracelular de TRAIL para inducir la apoptosis de las células Jurkat. Ciertas modalidades de la presente invención proporcionan DNA aislado comprendiendo una secuencia de nucleótido seleccionado del grupo que consiste de nucleótidos 88 a 933 de la SEQ ID NO: 1 (región de ciframiento de TRAIL humano); los nucleótidos 202 a 933 de la SEQ ID NO: 1 (que codifican el dominio extracelular de TRAIL humano); nucleótidos 47 a 922 de la SEQ ID NO:5 (región de ciframiento de TRAIL de ratón); y nucleótidos 261 a 922 de la SEQ I D NO: 5 (que codifica el dominio extracelular de TRAIL de ratón). Los DNA que codifican fragmentos biológicamente activos de las proteínas de SEQ ID NOS:2 y 6 también son provistos. Modalidades adicionales incluyen secuencias que comprenden nucleótidos 370 a 930 de la SEQ ID NO: 1 y nucleótidos 341 a 919 de la SEQ ID NO:5, la cual codifica los polipéptidos TRIAL solubles de ratón y humano particulares, respectivamente, descritos en el ejemplo 7. Debido a la degeneración del código genético, dos secuencias de DNA pueden diferir, aunque codifiquen la misma secuencia de aminoácidos. La presente invención proporciona de esta manera secuencias de DNA aisladas que codifican TRAIL biológicamente activo, seleccionado del DNA que comprende la región de ciframiento de un cDNA de TRAIL de murino o humnao natural, o fragmentos del mismo, y DNA el cual es degenerado como un resultado del código genético para la secuencia de DNA de TRAIL. También provista en la presente están los polipéptidos TRAIL, tanto recombinantes como no recombinantes. Las variantes y derivados de las proteínas TRAIL naturales que retienen una actividad biológica deseada también están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad, la actividad biológica de una variante de TRAIL es esencialmente equivalente a la actividad biológica de una proteína TRAIL natural. Una actividad biológica deseada de TRAIL es la capacidad para inducir muerte de las células Jurkat. Los procedimientos de ensayo para detectar apoptosis de las células objetivo son bien conocidos. El escalado de DNA está entre las características de la muerte celular vía apoptosis, y es reconocido como uno de los fenómenos observables que distingen la muerte celular apoptótica de la muerte celular necrótica. Ejemplos de técnicas de ensayo adecuadas para detectar la muerte o apoptosis de las células objetivo incluyen aquellas descritos en los ejemplos 5 y 8 a 1 1 . Otra propiedad de TRAIL es la capacidad para ligarse a células Jurkat. Las variantes de TRAIL pueden ser obtenidas por mutaciones de secuencias de nucleótidos TRAI L naturales, por ejemplo, Una variante TRAI L, como es referida en la presente, es un polipéptido substancialmente homólogo para un TRAIL natural, pero el cual tiene una secuencia de aminoácidos diferente de aquella del TRAI L natural debido a una o una pluralidad de supresiones, inserciones o substituciones. Las secuencias de DNA que codifican TRAIL de la presente invención abarcan las secuencias que comprenden una o más adiciones, supresiones o substituciones de nucleótidos cuando se comparan con una secuencia de DNA de TRAIL natural, pero que codifican una proteína TRAIL que es esencialmente equivalente de manera biológica a una proteína TRAIL natural. La secuencia de DNA o aminoácidos variante de preferencia es por lo menos 80% idéntica a una secuencia TRAIL natural, muy preferiblemente por lo menos 90% idéntica. El grado de homología (porcentaje de identidad) entre una secuencia mutante y una natural puede ser determinado, por ejemplo, al comparar las dos secuencias usando programas de computadora comúnmente empleados para este propósito. Un programa adecuado es el programa de computadora GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucí. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), como se revisó por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981 ). Brevemente, el programa GAP define la identidad como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), los cuales son idénticos, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros de omisión preferidos para el programa GAP incluyen: (1 ) una matriz de comparación unaria (conteniendo un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación compensada de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, como describió Schwartz y Dayhoff, eds. Atlas of Protein Sequence and Structure, National biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una sanción de 3.0 por cada hueco y una sanción adicional de 0.10 por cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna sanción por huecos finales. Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos natural pueden ser alcanzadas mediante cualquiera de un número de técnicas conocidas. Las mutaciones pueden ser introducidas en lugares particulares al sintetizar oligonucleótidos conteniendo una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifca un análogo que tiene la inserción, substitución o supresión de aminoácidos deseada. De manera alternativa, los procedimientos de mutagénesis de sitio específico dirigida a oligonucléotidos pueden ser empleadas para proporcionar un gene alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo a la substitución, supresión o inserción requerida. Las técnicas para hacer tales alteraciones incluyen aquellas descritas por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981 ); y las patentes estadounidenses nos.4, 518, 584 y 7,737,462, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Las variantes pueden comprender secuencias substituidas de manera conservadora, significando que uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido TRAIL natural son reemplazados por diferentes residuos, pero que el polipéptido TRAIL substituido de manera conservadora retiene una actividad biológica deseada que ese esencialmente equivalente a aquella de un polipéptido TRAIL natural. Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de TRAIL. Otros ejemplos involucran la substitución de aminoácidos fuera del dominio que liga al receptor, cuando la actividad biológica deseada es la capacidad de ligar a un receptor en células objetivo e inducir apoptosis de las células objetivo. Un aminoácido dado puede ser reemplazado por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares, por ejemplo, substituyendo un residuo alifático por otro (tal como lie, Val, Leu o Ala por otro), o substitución de un residuo polar por otro (tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn). Otras de tales substituciones conservadoras, por ejemplo, las substituciones de regiones enteras que tienen características hidrofóbicas similares, son bien conocidas. Los polipéptidos TRAIL que comprenden substituciones conservadoras de aminoácidos pueden ser probadas en uno de los ensayos descritos en la presente para confirmar que una actividad biológica deseada de un TRAIL natural es retenida . Las secuencias de DNA que codifican polipéptidos TRAIL que contienen tales substituciones conservadoras de aminoácidos son abarcadas por la presente invención. Han sido identificados los aminoácidos conservados ubicados en la porción C-terminal de las proteínas en la familia TN F, y se consideran importantes por su actividad biológica. Estas secuencias conservadas se discuten en Smith et al . (Ce//, 73: 1 349, 1993, ver página 1353 y Figura 6); Suda et al. (Cell, 75: 1 169, 1993, ver figura 7); Smith et al. (Cell, 76: 959, 1994, ver figura 3); y Goodwin et al. (Eur. J. Immunol., 23:2631 , 1993, ver figura 7 y páginas 2638-39) . De manera ventajosa, los aminoácidos conservados no son alterados cuando se generan secuencias substituidas de manera conservadora. Si se altera, los aminoácidos encontrados en posiciones equivalentes en otros miembros de la familia TNF son substituidos. TRAIL también puede ser modificado para crear derivados de TRAIL al formar conjugados agregados o covalente con otras porciones químicas, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de TRAI L pueden ser preparados al enlazar las porciones químicas a grupos funcionales en cadenas laterales de aminoácidos TRAIL o en el extremo N o el extremo C de un polipéptido TRAIL o el dominio extracelular del mismo. Otros derivados de TRAI L dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados agregados o covalentes de TRAIL o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminal o C-terminal. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia de polipéptido líder o de señal (por ejemplo el líder de a-factor de Saccharomyces) en el extremo N de un polipétido TRAIL. El péptido líder o de señal dirige co-traslacionalmente o post-traslacionalmente la transferencia del conjugado de su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o pared celular. Las fusiones de polipéptido TRIAL pueden comprender péptidos adicionados para facilitar la purificación e identificación de TRAIL. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, péptidos de identificación antigénica o poli- His descritos en la patente estadounidense No. 5,011 ,912 y en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG®,Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK)ÍSEQ ID NO:7), el cual es altamente antigénico y proporciona un epitope reversiblemente ligado por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo de esta manera un rápido ensayo y fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia también es cortada específicamente por una enterocinasa de mucosa de bovino en el residuo inmediatamente siguiente al par Asp-Lys. Las proteínas de fusión cubiertas con este péptido también pueden ser resistentes a degradación intracelular en E. coli. Un hibridoma de murino designado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que liga el péptido DYKDDDDK (SEQ ID NO:7) en la presencia de ciertos cationes de metal divalente (como se describió en la patente estadounidense 5,011 ,912), y ha sido depositado con American Type Culture Collection bajo el número de acceso HB 9259. Los sistemas de expresión útiles para producir proteínas recombinantes fusionadas al péptido FLAG®, así como también anticuerpos monoclonales que ligan el péptido y son útiles para purificar las proteínas recombinantes, están disponibles de Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut. La presente invención incluye además polipéptidos TRAIL con o sin glicosilación de patrón natural asociada. El TRAIL expresado en sistemas de expresión de mamífero o levadura puede ser similar a o significativamente diferente de un polipéptido TRAIL natural en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos TRAIL en sistemas de expresión bacteriana, tal como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas. Los sitios de glicosilación en el dominio extracelular de TRAIL pueden ser modificados para evitar la glicosilación mientras que permite la expresión de un análogo de carbohidrato reducido, homogéneo, usando sistemas de expresión de mamífero o levadura. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos están caracterizados por una terna de aminoácidos Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. Las modificaciones apropiadas a ia secuencia de nucleótidos que codifica esta terna resultarán en substituciones, adiciones o supresiones que evitan la unión de residuos de carbohidrato en la cadena lateral Asn. Los procedimientos conocidos por inactivar los sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen aquellos descritos en la patente estadounidense 5,071 ,972 y EP 276,846. Un sitio de N-glicosilación potencial se encontró en las posiciones 109-11 1 en la proteína humana de la SEQ ID NO:2 y en las posiciones 52-54 en la proteína de murino de la SEQ ID NO:6. En otro ejemplo, las secuencias que codifican residuos Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden ser alteradas para provocar que los residuos de Cys sean suprimidos o remplazados con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos sobre la renaturalización. Otras variantes son preparadas mediante la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para intensificar la expresión en sistemas de levadura en los cuales la actividad de la proteasa KEX2 está presente. La EP 212,914 describe el uso de mutagénesis de sitios específicos para inactivar los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 son inactivados al suprimir, añadir o substituir residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles al corte KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa un acercamiento preferido y conservador para inactivar los sitios KEX2. Los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 potenciales son encontrados en las posiciones 89-90 y 149-150 en la proteína de la SEQ ID NO:2, y en las posiciones 85-86', 135-136, y 162-163 en la proteína de la SEQ ID NO:6. Las variantes TRAIL que ocurren naturalmente también son abarcadas por la presente invención. Ejemplos de tales variantes son las proteínas que resultan de eventos de empalme de mRNa alternativo (ya que TRAIL es codificado por un gene multi-exon) o del corte proteolítico de la proteína TRAIL, en donde es retenida una actividad biológica deseada. El empalme alternativo de mRNA puede producir una proteína TRAI L truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble que ocurre de manera natural de la proteína, por ejemplo. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N- o C- sobre la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la remoción proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína TRAIL. Además, el corte proteolítico puede liberar una forma soluble de TRAIL de una forma de membrana ligada de la proteína. Las variantes alélicas también son abarcadas por la presente invención.

Oligómeros La presente invención abarca polipéptidos TRAIL en la forma de oligómeros, tales como dímeros, trímeros u oligómeros mayores. Los oligómeros pueden formarse mediante enlaces disulfuro entre residuos de cisteína en diferentes polipéptidos TRAIL, o por interacciones no covalentes entre cadenas de polipéptidos TRAIL, por ejemplo, en otras modalidades, los oligómeros comprenden de dos a cuatro polipéptidos TRAI L unidos vía interacciones covalentes o no covalentes entre porciones de péptidos fusionados a los polipéptidos TRAIL. Tales péptidos pueden ser enlazadores de péptido (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los cierres de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de polipéptidos TRAI L unidos a ellos, como se describe en más detalle más adelante. Los polipéptidos TRAIL son solubles de preferencia. La preparación de proteínas de fusión comprendiendo polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991 ); Byrn et al. (Nature 344:667, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supplement 4, páginas 10.19.1 -10.19-1 1 , 1992), incorporados en la presente por referencia. En una modalidad de la invención, un dímero TRAIL es creado al fusionar TRAIL a un polipéptido de región Fc derivado de un anticuerpo. El término "polipéptido Fc" incluye formas de muteína y naturales, así como polipéptidos Fc truncados que contienen la región de unión que promueve la dimerización. El polipéptido Fc de preferencia es fusionado a un TRAIL soluble (por ejemplo, comprendiendo solo el dominio extracelular). Se permite que una fusión de genes que codifican la proteína de fusión TRAIL/Fc se ensablen muy similar a moléculas de anticuerpos sobre lo cual los enlaces disulfuro entre cadenas se forman entre los polipéptidos Fc, produciendo TRAIL divalente. En otras modalidades, TRAI L puede ser substituido por la porción variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Si las proteínas de fusión se hacen tanto con cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo, es posible formar un oligómero TRAIL con tantas como cuatro regiones extracelulares de TRAIL. Un polipéptido Fc adecuado es el polipéptido de región Fc natural derivado de una lgG 1 humana, que se describe en la solicitud de PCT WO 93/10151 , incorporada aquí por referencia. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la patente estadounidense 5,457,035. La secuencia de aminoácidos de la muteína es idéntica a aquella de la secuencia Fc natural presentada en WO 93/10151 , excepto que el aminoácido 19 ha sido combiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. Esta muteína Fc exhibe afinidad reducida por receptores de inmunoglobulina .

Alternativamente, el TRAIL oligomético puede comprender dos o más polipéptidos TRAIL solubles unidos a través de enlazadores de péptidos. Ejemplos incluyen aquellos enlazadores de péptido descritos en la patente estadounidense 5,073,627 (incorporada en la presente por referencia). Las proteínas de fusión comprendiendo polipéptidos TRAIL múltiples separados por enlazadores de péptidos pueden ser producidas usando tecnología de DNA recombinante convencional. Otro método para preparar polipéptidos TRAIL oligoméricos involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios de cierre de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Los cierres de leucina fueron identificados originalmente en varias proteínas que ligan DNA (Landschulz et al. , Science 240: 1759, 1988), y han sido encontradas desde entonces en una variedad de diferentes proteínas. Entre los cierres de leucina conocidos se encuentran los péptidos que ocurren naturalmente y los derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cierre de leucina adecuados para producir proteínas TRAIL oligoméricas solubles son aquellos descritos en la solicitud de PCT WO 94/10308, incorporada en la presente por referencia. Las proteínas de fusión recombinantes comprendiendo un polipéptido TRAIL soluble fusionado a un péptido que dimeriza o trimeriza en solución son expresadas en células huésped adecuadas, y el TRAIL oligomérico soluble resultante es recuperado del sobrenadante del cultivo. Ciertos miembros de la familia TNF de proteínas son considerados por existir en la forma trimérica (Beutler y Huffel, Science 264:667; 1994; Banner et al. , Cell 73:431 , 1993). Así, el TRAIL trimérico puede ofrecer la ventaja de actividad biológica intensificada. Las porciones de cierre de leucina preferidos son aquellas que preferencialmente forma trímeros. Un ejemplo es un cierre de leucina derivado de proteína surfactante de pulmón D (SPD), como se describió en Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191 , 1994) y en la solicitud de patente estadounidense serie no. 08/446,922, incorporadas en la presente por referencia. Otros péptidos derivados de proteínas triméricas que ocurren naturalmente pueden ser empleados para preparar TRAIL trimérico. Como se describe en el ejemplo 7, un polipéptido TRAI L Flag® soluble expresado en oligómeros formados espontáneamente de células CV-1/EBNA considerado por ser una mezcla de dímeros y trímeros. El efecto citotóxico de este TRAIL de Flag® soluble en el ensayo del ejemplo 8 fue intensificado al incluir un anticuerpo anti-Flag®, posiblemente porque el anticuerpo facilitó el enlace cruzado de los complejos de TRAI L/receptor. En una modalidad de la presente invención, la actividad biológica de TRAI L es intensificada al emplear TRAIL en conjunción con un anticuerpo que es capaz de enlazar cruzado a TRAIL. Las células que se van a matar pueden ser puestas en contacto tanto con un polipéptido TRAI L soluble y tal anticuerpo. Como un ejemplo, las células cancerosas o infectadas viralmente se ponen en contacto con un anticuerpo anti-Flag® y un polipéptido TRAIL Flag® soluble. De preferencia, se emplea un fragmento de anticuerpo que carece de la región Fc. Formas bivalentes del anticuerpo pueden ligarse a las porciones Flag® de dos polipéptidos TRAIL Flag® solubles que se encuentran en dímeros o trímeros separados. El anticuerpo puede ser mezclado o incubado con un polipéptido TRAIL Flag® antes de la administración in vivo.

Sistemas de expresión La presente invención proporciona vectores de expresión recombinante para la expresión de TRAIL, y células huésped transformadas con los vectores de expresión. Cualquier sistema de expresión adecuado puede ser empleado. Los vectores incluyen un DNA que codifica un polipéptido TRAIL, enlazado operablemente a secuencias de nucleótidos reguladoras transcripcionales o translacionales adecuadas, tales como aquellas derivadas de genes de mamífiero, microbianos, virales o de insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, o intensificadores, un sitio de ligadura ribosomal de mRNA, y secuencias apropiadas que controlan la injciación y terminación de transcripción y traslación. Las secuencias de nucleótidos se enlazan operablemente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente a la secuencia de DNA de TRAIL. De esta manera, una secuencia de nucleótidos promotora es enlazada operablemente a una secuencia de DNA de TRAI L si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de DNA de TRAIL. Un origen de replicación que confiere la capacidad para replicar en las células huésped deseadas, y un gene de selección por medio del cual los transformados son identificados, son incorporados generalmente en el vector de expresión.

Además, una secuencia que codifica un péptido de señal apropiada puede ser incorporada en vectores de expresión. Una secuencia de DNA para un péptido de señal (líder de secreción) puede ser fusionado en el marco a la secuencia de TRAIL de manera que el TRAIL se traduce inicialmente como una proteína de fusión comprendiendo el péptido de señal. Un péptido de señal que es funcional en las células huésped pretendidas promueve la secreción extracelular del polipéptido TRAIL. El péptido de señal se corta del polipéptido TRAIL sobre la secreción de TRAIL de la célula. Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos TRAI L incluyen procariotes, levaduras o células eucarióticas mayores. Los vectores de expresión y clonación adecuados para usarse con huéspedes celulares bacterianos, fúngales, de levadura y mamíferos son descritos, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). Los sistemas de traslación libres de células también pueden ser empleados para producir polipéptidos TRAIL usando RNAs derivados de constructos de DNA descritos en la presente. Los procariotes incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células huésped procarióticas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un polipéptido TRAIL puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polípéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met N-terminal puede ser cortada del polipéptido TRAIL recombinante expresado. Los vectores de expresión para usarse en células huésped procarióticas generalmente comprenden uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Un gene marcador seleccionable fenotípico es, por ejemplo, un gene que codifica una proteína que confiere resistencia antibiótica o que suministra un requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procarióticas incluyen aquellos derivados de los plásmidos comercialmente disponibles tal como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). El pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y tetracilina y propociona de esta manera medios simples para identificar células transformadas. Un promotor apropiado y una secuencia de DNA de TRIAL son insertados en el vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pG EM 1 (Promega Biotec, Madison, Wl , EU) . Las secuencias promotoras comúnmente usadas para los vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes incluyen ß-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al. , Nature 275:615, 1978; y Goeddel et al. , Nature 281 :544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al. , Nucí. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Srping Harbor Laboratory, p.412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procarióticas particularmente útil emplea un promotor de fagos ? PL y una secuencia represora termolábil cl857ts.

Vectores de plásmidos disponibles de American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor ? PL incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la especie E. coli JMB9, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 , ATCC 53082). De manera alternativa el TRAIL puede ser expresado en células huésped de levadura, de preferencia del género Saccharomyces (por ejemplo. , S. Cerevisiae). Otros géneros de levadura, tal como Pichia o Kluyveromyces, también pueden ser empleados. Los vectores de levadura contendrán un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura 2µ, una secuencia de replicación de manera autómoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de transcripción y un gene marcador seleccionable. Las secuencia promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen , entre otros, promotores para metalometioneina, 3-fosfogliceratocinasa (Hitzeman et al. , J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al. , J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; Holland et al . , Biochem. 17:4900, 1978), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfto deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fofoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucosinasa. Otros vectores y promotores adecuados para usarse en la expresión de levadura son descritos adicionalmente en Hitzeman, EPA-73,657. Otra alternativa es el promotor de glucosa represible ADH2 descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Los vectores "de lanzadera" replicables tanto en levadura y E. coli pueden ser construidos al insertar secuencias de DNA de pBR322 para la selección y replicación en E.coli (gene Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura antes descritos. La secuencia líder de a-factor de levadura puede ser empleada para dirigir la secreción del polipéptido TRAIL. La secuencia líder del a-factor es insertada frecuentemente entre la secuencia promotora y la secuencia de genes estructural. Ver, por ejemplo, Kurjan et al. , Cell 30:933, 1982 y Bitter et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 81 :5330, 1984. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de los huéspedes de levadura son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Una secuencia líder puede ser modificada cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gene estructural. Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Uno de tales protocolos es descrito por Hinnen et al. , Proc. Nati. Acad. Sci USA 75: 1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona los transformados Trp+ en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de base de nitrógeno de levadura, 0.5% ácidos casamino, 2% de glucosa, 10 µg/ml de adenina y 20 µg/ml de uracilo. Las células huésped de levadura transformadas por vectores que contienen una secuencia promotora ADH2 pueden hacerce crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de 1 % de extracto de levadura, 2% de peptona y 1 % de glucosa suplementada con 80 µg/ml de adenina y 80 µg/ml de uracilo. La derepresión del promotor ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio. Los sistemas de cultivo de células huésped de insecto o mamífero también podrían ser usados para expresar polipéptidos TRAIL recombinantes. Los sistemas bacculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Las líneas de célula establecidas de origen mamífero también pueden ser empleadas. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de las células de riñon de mono (ATCC CRL 1651 )(Gluzman et al. , Cell 23: 1 75, 1981 ), células L, células C 127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas de células BHD (ATCC CRL 10), y la línea de células CVI/EBNA derivada de la línea de célula de riñon de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como se describió por McMahan et al. {EMBO J. 10:2821 , 1991 ). Las secuencias de control transcripcional y traslacional para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden ser usadas de genomas virales. Las secuencias promotoras comúnmente usadas y las secuencias intensificadoras son derivadas de virus Polioma, Adenovirus 2 , Simian Virus 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor temprano y tardío, intensificador, empalme y sitios de poliadenilación pueden ser usados para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gene estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento el cual también puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al. , Nature 273: 1 13, 1978). Fragmentos SV40 menores o mayores también pueden ser usados, siempre que la secuencia de aproximadamente 250 pares de bases que se extiende del sitio Hind III ai sitio Bgl I ubicado en el origen viral SV40 del sitio de replicación esté incluida. Los vectores de expresión para usarse en células huésped de mamífero pueden ser construidas como se describió por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983), por ejemplo. Un sistema útil para expresión de nivel alto estable de cDNAs de mamífero en células epiteliales mamarias de murino C127 pueden ser construidas substancialmente como se describió por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de expresión alto, PMLSV N 1 /n4, descrito por Cosman et al. , Nature 312:768, 1984 ha sido depositado como ATCC 39380. Vectores de expresión de mamífero adicionales son descritos en EP-A-0367566, y en WO91 /18982. Como una alternativa, el vector puede ser derivado de un retrovirus. Sistemas de expresión adecuados adicionales son descritos en los ejemplos más adelante. Un sistema de expresión preferido emplea células de ovario de hámster chino (CHO) y un vector de expresión designado PG5.7. Este vector de expresión es descrito en la solicitud de patente estadounidense serie no. 08/586,509, presentada el 11 de enero de 1996, la cual se incorpora en la presente por referencia. Los componentes de PG5.7 incluyen un fragmento de DNA genómico de célula CHO, seguido por un promotor derivado de CMV, el cua es seguido por una secuencia que codifica un líder tripartito de adenovirus, el cual a su vez es seguido por una secuencia que codifica la dihidrofolato reductasa (DH FR). Estos componentes fueron insertados en el vector de plásmido pGEM1 (Promega, Madison, Wl). El DNA que codifica un polipéptido TRAIL (o proteína de fusión conteniendo TRAIL), puede ser insertado entre las secuencias que codifican el líder tripartito y DHFR. Se puede añadir metotrexato al medio de cultivo para aumentar los niveles de expresión, como es reconocido en el campo. El fragmento de DNA genómico de célula CHO en el vector PG5.7 intensifica la expresión de TRAIL. Un lisado de fago que contiene un fragmento de DNA genómico aislado de células CHO fue depositado cn American Type Culture Collection el 4 de enero de 1996, y se le asignó un número de acceso ATCC 9741 1 . El vector PG5.7 contiene los nucleótidos 8671 a 14507 de la inserción de DNA genómico de CHO en depósito de especie ATCC 9741 1 . Para la expresión de TRAIL, una proteína tipo II que carece de una secuencia de señal natural, una secuencia de señal heteróloga o líder funcional en células huésped de mamífero puede ser adicionada. Ejemplos incluyen la secuencia de señal para interleucin-7(IL-7) descrita en la patente estadounidense 4, 965, 195, la secuencia señal para el receptor interleucin-2 descrito en Cosman et al. , Nature 312:768 (1984); el péptido señal de receptor de interluekin-4 descrito en EP 367,566; el péptido señal de receptor de interleucin- 1 tipo I descrito en la patente estadounidense 4,968,607; y el péptido señal de receptor de interleucin-1 tipo II descrito en EP 460,846. Un sistema de expresión preferido emplea una secuencia líder derivada del citomegalovirus (CNV). El ejemplo 7 ilustra el uso de ese líder. En el ejemplo 7, células huésped de mamífero fueron transformadas con un vector de expresión que codifica el péptido Met Ala Arg Arg Leu Trp Me Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser (SEQ IDO NO:9) fusionado con el extremo N de un octapéptido designado FLAG® (SEQ ID NO.7, descrita antes), que a su vez es fusionada al término N de un polipéptido TRAIL soluble. Los residuos 1 a 29 de la SEQ ID NO:9 constituyen una secuencia líder derivada CMV, mientras que los residuos 30 a 32 son codificados por oligonucleótidos empleados en la construcción del vector de expresión descritos en el ejemplo 7. En una modalidad, el DNA codificado es un péptido poli-His (por ejemplo, un péptido que contiene seis residuos de histidina) es colocado entre las secuencias que codifican el líder CMV y el péptido FLAG®. Los sistemas de expresión que emplean tales péptidos líder derivados de CMV son útiles para expresar proteínas diferentes a TRAIL. Los vectores de expresión que comprenden una secuencia de DNA que codifica aminoácidos 1 a 29 de la SEQ ID NO:9 son provistos en la presente. En otra modalidad, el vector comprende una secuencia que codifica aminoácidos 1 a 28 de la SEQ ID NO:9. El DNA que codifica una proteína heteróloga deseada es colocada corriente debajo de, y en el mismo marco de lectura como, el DNA que codifica el líder. Residuos adicionales (por ejemplo, aquellos codificados por enlazadores o primarios) pueden ser codificados por el DNA posicionado entre las secuencias que codifican el líder y la proteína heteróloga deseada, como se ilustra por el vector descrito en el ejemplo 7. Como es entendido en el campo pertinente, los vectores de expresión comprenden promotores y cualquier otra secuencia reguladora deseada, enlazados operablemente a las secuencias que codifica el líder y proteína heterlóga. El péptido líder presentado en la SEQ ID NO:9 puede ser cortado después de un residuo de arginina en la posición 29 para producir la forma secretada madura de una proteína fusionada al mismo. Adicional o alternativamente, el corte puede ocurrir entre los aminoácidos 20 a 21 , o entre los aminoácidos 28 y 29, de la SEQ ID NO:9. El artesano experto reconocerá que la(las) ?osición(es) en las cuales el péptido señal es cortado puede variar de acuerdo a factores tales como el tipo de células huésped empleadas, ya sea que se exprese TRAIL humano o de murino por el vector, y similares. El análisis mediante programa de computadora revela que el sitio de corte primario puede estar entre los residuos 20 y 21 de la SEQ ID NO:9. El corte entre los residuos 22 y 23, y entre los residuos 27 y 28, también es posible predecirlo. Para ilustrar la expresión y secreción de un polipéptido TRAIL de murino soluble resultó en el corte de un péptido de señal derivado de CMV en posiciones múltiples. Las tres especies más prominentes de proteína secretada (en orden descendente) resultaron del corte entre los aminoácidos 20 y 21de la SEQ ID NO:9, el corte entre los aminoácidos 22 y 23 y el corte entre los aminoácidos 27 y 28.

Un método para producir una proteína recombinante heteróloga involucra cultivar células huésped de mamífero transformadas con tal vector de expresión bajo condiciones que promueven expresión y secreción de la proteína heteróloga, y recuperar la proteína del medio de cultivo. Los sistemas de expresión que emplean líderes CMV pueden usarse para producir cualquier proteína deseada, ejemplos de los cuales incluyen, pero no están limitados a, factores de estimulación de colonia, interferones, interleucins, otras citocinas, y receptores de citocina.

Proteína TRAI L purificada La presente invención proporciona proteínas TRAIL purificadas, las cuales pueden ser producidas por sistemas de expresión recombinantes como se describió antes o purificadas a partir de células que ocurren de manera natural. El grado deseado de pureza puede depender del uso que se pretende de la proteína. Un grado relativamente alto de pureza es deseado cuando la proteína va a ser administrada in vivo, por ejemplo. De manera ventajosa, los polipéptidos TRAIL son purificados de manera que ninguna banda de proteína correspondiente a otras proteínas sea detectable por electroforesis de gel de poliacrilamida - SDS (SDS-PAGE). El experto en el campo pertinente reconocerá que múltiples bandas correspondientes a la proteína TRAI L pueden ser detectadas por SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, variaciones en procesamiento post-traslacional, y similares, como se discutió antes. Una preparación de proteína TRAI L es considerada como purificada mientras que no se visualicen otras bandas correspondientes a proteínas diferentes (no TRAIL). TRAIL muy preferiblemente es purificada a una homogeneidad substancial, como es indicado por una sola banda de proteína sobre el análisis por SDS-PAGE. La banda de proteína puede ser visualizada por manchado con plata, manchado por azul Coomassie, o (si la proteína es radioetiquetada) por autoradiografía. Un proceso para producir la proteína TRAIL comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión comprendiendo una secuencia de DNA que codifica TRAIL bajo condiciones tales que TRAIL es expresado. La proteína TRAIL es entonces recuperada del cultivo (del medio de cultivo o extractos de células). Como el artesano experto reconocerá, los procedimientos para purificar el TRAI L recombinante variarán de acuerdo a factores tales como el tipo de células huésped empleadas y de si es secretada o no TRAIL en el medio de cultivo. Por ejemplo, cuando los sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante son empleados, el medio de cultivo primero puede ser concentrado usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Millipore Pellicon o Amicon. Siguiendo al paso de concentración, el concentrado puede ser aplicado a la matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. De manera alternativa, una resina de intercambio de aniones puede ser empleada, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos dietilaminoetil (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteína. Alternativamente, 3 una etapa de intercambio de cationes puede ser empleada. Tales intercambiadores de cationes incluyen varias matrices insolubles comprendiendo grupos carboximetilo o sulfopropilo. Se prefieren los grupo sulfopropilo. Finalmente, uno o más pasos de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) empleando medios RP-HPLC hidrofóbicos, (por ejemplo sílica gel teniendo metilo u otros grupos alifáticos pendientes) pueden ser empleados para purificar adicionalmente TRAIL. Alguno o todos de los pasos de purificación anteriores, en varias combinanciones, pueden ser empleados para proporcionar una proteína TRAIL purificada. La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede ser aislada mediante disolución inicial de las células huésped, centrifugación , extración de pellas de células si se trata de un polipéptido insoluble, o del fluido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguido por uno o más pasos de concentración, precipitación, intercambio de iones, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión de tamaño. Finalmente se puede emplear la RP-H PLC para los pasos de purificación final. Las células microbianas pueden ser disueltas por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disolución mecánica o uso de agentes de lisis celular. Las células huésped de levadura transformadas son empleadas de preferencia para expresar TRAIL como un polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado de una fermentación de célula huésped de levadura puede ser purificado por métodos análogos a aquéllos descritos por Urdal et al. ((J. Chromatog. 296: 171 , 1984). Urdal et al describen dos pasos de HPLC de fase inversa, secuenciales, para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparadora. De manera alternativa, los polipéptidos TRAIL pueden ser purificados por cromatografía por inmunoafinidad. Una columna de afinidad conteniendo un anticuerpo que liga TRAIL puede ser preparada por procedimientos convencionales y empleada en la purificación de TRAIL. El ejemplo 4 describe un procedimiento para general anticuerpos monoclonales dirigidos contra TRAIL.

Propiedades y usos de TRAIL La muerte celular programada (apoptosis) ocurre durante la embriogénesis, metamorfosis, atrofia de tejido dependiente endocrina, cambio de tejido normal y muerte de inmunotimocitos. La regulación de la muerte celular programada es vital para el funcionamiento normal del sistema inmunológico. Para ilustrar, las células T que reconocen antígenos propios son destruidas a través del proceso apoptótico durante la maduración de células T en el timo, mientras que otras células T son seleccionadas positivamente. La posibilidad de que algunas células T que reconocen ciertos epitopes propios (por ejemplo, determinantes antigénicos presentados y procesados ineficientemente de una proteína propia dada) escapen a este proceso de eliminación y subsecuentemente jueguen un papel en enfermedades autoinmunes ha sido propuesta (Gammon et al. , Immunology Today 12: 193, 1991 ).

Insuficiente apoptosis ha sido implicada en ciertas condiciones, mientras que niveles elevados de muerte celular apoptótica han sido asociados con otras enferemedades. La conveniencia de identificar y usar agentes que regulen la apoptosis en tratamientos de tales desórdenes es reconocida (Kromer, Advances in Immunology, 58:21 1 , 1995; Groux et al. , J. Exp. Med. 175:331 , 1992; Sachs and Lotem, Blood 82: 15, 1993). La resistencia anormal de células T hacia experimentar apoptosis ha sido enlazada a linfocitosis, linfadenopatía, esplenomegalia, acumulación de células T reactivas propias, enfermedad autoinmune, desarrollo de leucemia, y desarrollo de linfoma (Kromer, supra, ver especialmente páginas 214-215). A la manera inversa, la apoptosis excesiva de células T ha sido sugerida para jugar un papel en linfopenia, inmunodeficiencia sistémica, e inmunodeficiencia específica, con ejemplos específicos como estados inmunodeficientes inducidos por virus asociados con mononucleosis infecciosa e infección por citomegalovirus, e inmunosupresión mediada por tumor (Kromer, supra; ver especialmente página 214). La disminución de células CD4+T en individuos infectados por H IV puede ser atribuible a la muerte celular inducida por activación inapropiada (AICD) por apoptosis (Groux et al. , J. Exp. Med. 175:331 , 1 992) . Como se demostró en los ejemplos 5 y 8, TRAIL induce apoptosis de la línea de células de leucemia de célula T aguda designada clon Jurkat E6-1 . De esta manera, TRAI L es un reactivo de búsqueda útil en estudios de apoptosis, incluyendo la regulación de la muerte celular programada. Debido a que las células Jurkat son una línea de células de leucemia que surge de células T, el TRAIL de la presente invención encuentra uso en estudios del papel que TRAIL puede jugar en apoptosis de otras células T transformadas, tal como otros tipos de células malignas que surgen de células T. TRAIL liga células Jurkat, así como también induce apoptosis de las mismas. TRAIL no provoca la muerte de timocitos de murino recientemente aislados, o células T sanguíneas periféricas (PBTs) recientemente extraídas de un donador humano saludable. Un número de usos fluyen de estas propiedades de TRAIL. Los polipéptidos TRAIL pueden ser usados para purificar células de leucemia, o cualquier otro tipo de célula a la cual liga TRAIL. Las células de leucemia pueden ser aisladas de sangre de un paciente, por ejemplo. En una modalidad, las células son purificadas por cromatografía por afinidad, usando una matriz de cromatografía que tiene TRAIL ligada a ella. El TRAIL unido a la matriz de cromatografía puede ser una proteína de longitud completa, un fragmento TRAIL comprendiendo el dominio extracelular, una proteína de fusión conteniendo TRAIL, u otro polipéptido TRAIL adecuado descrito en la presente. En una modalidad, una proteína de fusión TRAIL/Fc soluble es ligada a una columna de Proteína A o Proteína G a través de la interacción de la porción Fc con la Proteína A o la Proteína G. De manera alternativa, TRAIL puede ser usado para aislar células de leucemia mediante citometría de flujo. Las células de leucemia purificadas de esta manera se esperan que mueran después de ligarse a TRAIL, pero las células muertas todavía soportarán antígenos de superficie de célula, y pueden ser empleados como inmunógenos para derivar anticuerpos anti-leucemia. Las células de leucemia, o un antígeno de superficie de célula deseado aislado de las mismas, encuentra uso adicional en el desarrollo de vacunas. Debido a que TRAIL liga y mata células de leucemia (la línea de células Jurkat), TRAIL también puede ser útil en tratar leucemia. Un método terapéutico involucra poner en contacto las células de leucemia con una cantidad efectiva de TRAIL. En una modalidad, la sangre de un paciente de leucemia se pone en contacto ex vivo con un polipéptido TRAIL. El TRAIL puede ser inmovilizado en una matriz adecuada. El TRAIL liga las células de leucemia, removiéndolas de esta manera de la sangre del paciente antes de que la sangre se regrese al paciente. Alternativa o adicionalmente, la médula ósea extraída de un paciente de leucemia puede ser puesta en contacto con una cantidad de TRAIL efectiva para inducir la muerte de células de leucemia en la médula ósea. La médula ósea puede ser aspirada del esternón o de los bordes iliacos, por ejemplo, y puestos en contacto con TRAIL para purgar células de leucemia. La médula tratada de esta manera se regresa al paciente. TRAIL también liga a, e induce apoptosis de, células de melanoma y linfoma (ver ejemplos 5, 9 y 10). De esta manera, los usos de TRAIL que son análogos a aquellos descritos antes para las células de leucemia son aplicables a células de melanoma y linfoma. Los polipéptidos TRAIL pueden ser empleados en tratar cáncer, incluyendo, pero no limitados a, leucemia, linfoma y melanoma. En otra modalidad, el linfoma es linfoma de Burkitt's. La Tabla I en el ejemplo 9 muestra que TRAIL tiene un efecto citotóxico en varias líneas de células de linfoma de Burkitt's. El virus Epstein-Barr es un agente etiológico de linfoma de Burkitt's. Los polipéptidos TRAIL también encuentran uso en tratar infecciones virales. El contacto con TRAIL provocó muerte de células infectadas con citomegalovirus, pero del mismo tipo de células cuando no están infectadas, como se describe en el ejemplo 11. La capacidad de TRAIL para matar células infectadas con otros virus puede ser confirmada usando el ensayo descrito en el ejemplo 11. Tales virus incluye, pero no están limitados a, virus de encefalomiocarditis, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de estomatitis vesicular, virus de herpes simplex, adenovirus-2, virus de diarrea viral de bovino, HIV, y virus Epstein-Barr. Una cantidad efectiva de TRAIL es administrada a un mamífero, incluyendo un humano, afligido con una infección viral. En una modalidad, el TRAIL es empleado en conjunción con el interferón para tratar una infección viral en el experimento descrito en el ejemplo 1 1 , el pretratamiento de células infectadas CMV con ?-interferón intensificó el nivel de matanza de las células infectadas que fue mediada por TRAIL. El TRAIL puede ser administrado en conjunción con otros agentes que ejercen un efecto citotóxico en células cancerígenas o células infectadas con virus. En otra modalidad, el TRAIL es usado para matar células viralmente infectadas en preparaciones de células, tejidos u órganos que van a ser transplantados. Para ilustrar, la médula ósea puede ser puesta en contacto con TRAIL para matar células infectadas con virus que pueden estar presentes ahí, antes de que la médula ósea sea transplantada en el recipiente. El TRAIL de la presente invención puede ser usada al desarrollar tratamiento para cualquier desorden mediado (directa o indirectamente) mediante cantidades defectuosas o insuficientes de TRAIL. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína TRAIL purificada es administrada a un paciente afligido con tal desorden. Alternativamente, las secuencias de DNA de TRAIL pueden ser empleadas en desarrollar un acercamiento de terapia de genes para tratar tales desórdenes. La divulgación en la presente de secuencias de nucleótidos de TRAIL naturales permite la detección de genes TRAIL defectuosas y el reemplazo de los mismos con genes que codifica TRAIL normales. Los genes defectuosos pueden ser detectados en ensayos diagnósticos in vitro, y mediante comparación de la secuencia de nucleótidos de TRAI L naturales divulgada en la presente con aquélla de genes TRAIL derivados de una persona que se sospecha alberga un defecto en este gene. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas comprendiendoTRAIL purificado y un portador, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable. Los portadores, diluyentes y excipientes adecuados son no tóxicos para recipientes a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Tales composiciones pueden comprender amortiguadores, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa y otros estabilizantes comúnmente empleados en composiciones farmacéuticas. La solución salina amortiguada neutral o solución salina mezclada con albúmina de suero de la misma especie están entre los diluyentes apropiados. La composición puede ser formulada como un liofilizado usando soluciones de excipiente apropiadas (por ejemplo sacarosa) como diluyentes. Para uso terapéutico, las proteínas purificadas de la presente invención son administradas a un paciente, de preferencia un humano, para el tratamiento en una manera apropiada a la indicación. Así, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas localmente, mediante inyección intravenosa, infusión continua, liberación sostenida de implantes, u otra técnica adecuada. Las dosificaciones apropiadas y la frecuencia de administración dependerán, por supuesto, en tales factores como la naturaleza y severidad de la indicación siendo tratada, la respuesta deseada, la condición del paciente y así sucesivamente. La proteína TRAIL empleada en las composiciones farmacéuticas de preferencia es purificada de manera que la proteína TRAIL esté substancialmente libre de otras proteínas de origen natural o endógeno, conteniendo de manera conveniente menos de aproximadamente 1 % en masa de residuos de contaminantes de proteína de procesos de producción. Tales composiciones, sin embargo, pueden contener otras proteínas adicionadas tales como estabilizadores, portadores, excipientes y co-terapéuticos. Los DNA que codifican TRAIL descritos en la presente encuentran uso en la producción de polipéptidos TRAIL, como se discutió antes. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de TRAIL también son útiles. En una modalidad, tales fragmentos comprenden por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente por lo menos 30 nucleótidos consecutivos, del DNA de TRAIL de murino o humano descrito en la presente. Los complementos de RNA y DNA de dichos fragmentos son provistos en la presente, junto con tanto formas de filamento sencillo o filamento doble del DNA de TRAIL de las SEQ ID NOS:1 ,3 y 5. Entre los usos de tales fragmentos de ácidos nucleicos de TRAIL se usan como una sonda o como primarios en una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Como un ejemplo, una sonda correspondiente al dominio extracelular de TRAIL puede ser empleada. Las sondas encuentran uso en detectar la presencia de ácidos nucleicos de TRAIL en ensayos in vitro y en tales procedimientos como "Northern y Southern blots". Los tipos de células que expresan TRAIL también pueden ser identificados. Tales procedimientos son bien conocidos, y el artesano experto puede escoger una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación pretendida particular. Para PCR, los primarios 5' y 3' correspondientes a los extremos de una secuencia de DNA de TRAIL deseada son empleados para aislar y amplificar esa secuencia, usando técnicas convencionales. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de TRAIL son oligonucleótidos de sentido o antisentido comprendiendo una secuencia de ácido nucleico de filamento sencillo (ya sea RNA o DNA) capaz de ligar secuencias objetivo de mRNA de TRAIL (sentido) o DNA de TRAIL (antisentido). Tal fragmento generalmente comprende por lo menos alrededor de 14 nucleótidos, de preferencia desde aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad de crear un oligonucleótido de sentido o antisentido, basado en una secuencia de cDNA para una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén, Cáncer Res. 48:2659, 1988 y van der Krol et al. , BioTechniques 6:958, 1988. La ligadura de oligonucléotidos de sentido o antisentido a secuencias objetivo de ácidos nucleicos resulta en la formación de duplos que bloquean la traslación (RNA) o trancripción (DNA) por uno de varios medios, incluyendo degradación intensificada de los duplos, terminación prematura de transcripción o traslación o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser usados de esta manera para bloquear la expresión de proteínas TRAIL. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido comprenden además oligonucleótidos que tienen esqueletos de azúcar modificado - fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar, tales como aquéllos descritos en WO91 /06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resister la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de la secuencia para ser capaces de ligarse a secuencias de nucleótidos objetivo. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos los cuales se enlazan covalentemente a porciones orgánicas, tales como aquéllos descritos en WO 90/10448, y otras porciones que aumentan la afinidad del oligonucleótido para una seucuencia objetivo de ácidos nucleicos, tal como poli-(L-lisina). Más aún, los agentes intercaladores, tales como elipticina, y agentes alquiladores o complejos de metal pueden ser unidos a oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de ligadura del oligonucleótido de sentido o antisentido para la secuencia de nucleótido objetivo. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido pueden ser introducidos en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos objetivo por un método de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección de DNA mediada por CaPO4, electroporación, u otros vectores de transferencia de genes tales como virus Epstein-Barr. Los oligonucléotidos de sentido o antisentido son introducidos de preferencia a la célula conteniendo la secuencia objetivo de ácidos nucleicos mediante la inserción del oligonucleótido de sentido o antisentido en un vector retroviral adecuado, poniendo entonces en contacto a la célula con el vector de retrovirus conteniendo la secuencia insertada, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales incluyen, pero no están limitados a, el retro virus de murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver solicitud de PCT WO 90/13641 ). Alternativamente, otras secuencias promotoras pueden ser usadas para expresar el oligonucleótido. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido también pueden ser introducidos en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula que une ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas que unen ligando adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, receptores de superficie de célula, factores de crecimiento, otras citocinas, y otros ligandos que se unen a receptores de superficie de célula. De preferencia, la conjugación de la molécula que une ligando no interfiere substancialmente con la capacidad del ligando de unir moléculas para ligarse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede ser introducido en una célula que contiene la secuencia objetivo de ácidos nucleicos mediante la formación de un complejo de lípido-oligonucleótido, como se describe en WO 90/10448. El complejo de lípido-oligonucleótido de sentido o antisentido es disociado de preferencia dentro de la célula mediante una lipasa endógena.

Anticuerpos inmunoreactivos con TRAIL Las proteínas TRAIL de la presente invención, o fragmentos inmunogénicos de los mismos, pueden ser empleados en generar anticuerpos. La presente invención proporciona de esta manera anticuerpos que ligan específicamente TRAIL, es decir, los anticuerpos ligan TRAIL via los sitios que ligan antígeno del anticuerpo (según se opone a ligadura no específica). Los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). La producción de anticuerpos monoclonales que son inmunoreactivos con TRAIL es ilustrada adicionalmente en el ejemplo 4 más adelante. Los fragmentos que ligan antígeno de tales anticuerpos, los cuales pueden ser producidos mediante técnicas convencionales, también son abarcados por la presente invención. Los ejemplos de tales fragmentos incluye, pero no están limitados a, fragmentos Fab, F(ab'), y F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética también son provistos. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de murino. Tales anticuerpos humanizados pueden ser preparados pro técncias conocidas, y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos son administrados a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de murino (o solo el sitio de ligadura de antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprenden el sitio de ligadura de antígeno de un anticuerpo monoclonal de murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio que liga antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales proyectados adicionalmente y quiméricos incluyen aquellos descritos en Riechmann et al. (Nature 322:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al (Bio/Technology 7:934, 1989), y Winter y Harris (TIPS 14:139, mayo 1993). Entre los usos de los anticuerpos está el uso en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos TRAIL, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos encuentran uso adicional en purificar TRAIL mediante cromatografía por afinidad. Aquellos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear la ligadura de TRAIL a células objetivo pueden ser usados para inhibir una actividad biológica de TRAIL. Un método terapéutico involucra la administración in vivo de tal anticuerpo en una cantidad efectiva para inhibir una actividad biológica mediada por TRAIL. Los desórdenes mediados o exacerbados por TRAIL, directa o indirectamente, son tratados de esta manera. Los anticuerpos monoclonales son generalmente preferidos para usarse en tales métodos terapéuticos. Los anticuerpos dirigidos contra TRAIL pueden ser útiles para tratar microangiopatías trombóticas. Uno de tales desórdenes es púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) (Kwaan, H.C., Semin. Hematol. , 24:71 , 1987; Thompson et al. , Blood, 80: 1890, 1992). Tasas de mortalidas asociadas con TTP en aumento han sido reportadas por los U.S. Centers for Disease Control (Torok et al., Am. J. Hematol. 50:84, 1995). El plasma de pacientes afligidos con TTP (incluyendo HIV* y pacientes HIV) induce la apoptosis de células endoteliafes humanas de origen microvascular dermal, pero no de origen de vasos grandes (Laurence et al., Blood, 87:3245, 15 de abril de 1996). Así, se considera que el plasma de pacientes TTP contiene uno o más factores que inducen directa o indirectamente la apoptosis. En el ensayo descrito en el ejemplo 13 más adelante, los anticuerpos policlonales cultivados contra TRAIL inhibieron la apoptosis inducida por plasma TTP de células endoteliales microvasculares dermales. Los datos presentados en el ejemplo 13 sugierren que TRAIL está presente en el suero de pacientes TTP, y puede jugar un papel en inducir apoptosis de células endoteliales microvasculares. Otra microangiopatía trombótica es el síndrome urémico hemolítico /HUS) (Moake, J. L., Lancet, 343:393, 1994; Meinyk et al., (Arch. Intern. Med., 155:2077, 1995; Thompson et al. , supra). Una modalidad de la invención está dirigida al uso de un anticuerpo anti-TRAIL para tratar la condición que es frecuentemente referida como "HUS de adulto" (aún cuando también puede afectar niños). Un desorden conocido como HUS asociada a diarrea de la niñez difiere en etiología del HUS de adulto. Otras condiciones caracterizadas por coagulación de pequeños vasos sanguíneos pueden ser tratadas usando anticuerpos anti-TRAIL. Tales condiciones incluyen pero no están limitadas a lo siguiente. Problemas cardiacos vistos en aproximadamente 5-10% de pacientes de AIDS pediátricos son considerados por involucrar coagulación de pequeños vasos sanguíneos. La falla de la microvasculatura en el corazón ha sido reportada en múltiples pacientes de esclerosis. Como un ejemplo adicional, el tratamiento de lupus erythematosus sistémico (SLE) es contemplado.

En una modalidad, la sangre o plasma de un paciente se pone en contacto con un anticuerpo TRAIL ex vivo. El anticuerpo (de preferencia un anticuerpo monoclonal) puede ser ligado a una matriz de cromatografía mediante procedimientos convencionales. El plasma o sangre del paciente fluye a través de una columna de cromatografía conteniendo el anticuerpo ligado a la matriz, antes de ser regresado al paciente. El anticuerpo inmovilizado liga TRAIL, removiendo de esta manera la proteína TRAIL del paciente. En una modalidad alternativa, los anticuerpos son administrados in vivo, en cuyo caso los anticuerpos de bloqueo son convenientemente empleados. Tales anticuerpos pueden ser identificados usando cualquier procedimiento de ensayo adecuado, tal como examinar a los anticuerpos por la capacidad para inhibir la ligadura de TRAIL a células objetivo. De manera alternativa, los anticuerpos de bloqueo pueden ser identificados en ensayos para la capacidad de inhibir un efecto biológico de la ligadura de TRAIL a células objetivo. El ejemplo 12 ilustra un método adecuado para identificar los anticuerpos de bloqueo, en donde los anticuerpos son ensayados por la capacidad de inhibir la lisis mediada por TRAIL de células Jurkat. La presente invención proporciona de esta manera un método para tratar una microangiopatía trombótica, involucrando el uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo dirigido contra TRAIL. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser empleados en procedimientos in vivo o ex vivo, para inhibir el daño mediado por TRAIL a por ejemplo apoptosis de) células endoteliales microvasculares.

Los anticuerpos anti-TRAIL pueden ser empleados en conjunción con otros agentes útiles en tratar un desorden particular. En un estudio in vitro reportado por Laurence et al. (Blood 87:3245, 1996), alguna reducción de apoptosis mediada por plasma TTP de células endoteliales microvasculares fue alcanzada al usar un anticuerpo de bloqueo anti-Fas, ácido aurintricarboxílico, o plasma normal disminuido de crioprecipitado. Así, un paciente puede ser tratado con un agente que inhibe la apoptosis mediada por un ligando Fas de células endoteliales. En una modalidad, un anticuerpo de bloqueo anti-TRAIL y un anticuerpo de bloqueo anti-FAS son administrados ambos a un paciente afligido con un desorden caracterizado por microangiopatia trombótica, tal como TTP u HUS. Ejemplos de anticuerpos monoclonales de bloque dirigidos contro antígeno Fas (CD95) son descritos en la publicación de solicitud de PCT número WO 95/10540, incorporada a la presente por referencia. Las composiciones farmacéuticas comprendiendo un anticuerpo que es inmunoreactivo con TRAIL, y un diluyente, excipiente o portador adecuado son provistas en la presente. Componentes de tales composiciones son descritos antes para las composiciones que contienen proteínas TRAIL. Los siguientes ejemplos son provistos para ilustrar modalidades particulares de la presente invención, y no deben ser considerados para limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 : Aislamiento de DNA de TRAIL humano El DNA que codifica una proteína TRAIL humana de la presente invención fue aislado mediante el siguiente procedimiento. Fue realizada una búsqueda TBLASTN de las base de datos dbEST en the National Center for Biological Information (NCBI), usando la secuencia de averiguación LVVXXXGLYYVYXQVXF (SEQ ID NO:8). Esta secuencia seta basada sobre la región más conservada de la familia de ligandos TNF (Smith et al., Cell, 73: 1349, 1993). Un archivo de etiqueta de secuencia expresada (EST), GenBank acceso número Z36726, fue identificado usando estos parámetros de búsqueda. El archivo GenBank indicó que este EST fue obtenido de una genoteca de cDNA de cámara de corazón humana. Dos oligonucleótidos de 30 pares de bases basados sobre las seucuencias de los extremos 3' y 5'de este archivo EST fueron sintetizados. El oligonucleótido del extremo 3' tuvo la secuencia TGAAATCGAAAGTATGTTTGGGAATAGATG (complemento de los nucleótidos 636 a 665 de la SEQ ID NO: 1) y el oligonucleótido 5' fue TGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTG (nucleótidos 291 a 320 de la SEQ ID NO:1). Los oligonucleótidos fueron etiquetados en el extremo 5' con 32P ?-ATP y polinucleótido cinasa. Dos genotecas de cDNA ?gt10 fueron clasificadas por métodos convencionales con una mezcla equimolar de estos oligonucleótidos etiquetados como sonda. Una genoteca fue una genoteca de cDNA de alargamiento 5' de corazón humano (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). La otra fue una genoteca de linfocito sanguíneo periférico (PBL) preparado como sigue: PBLs fueron otenidos de volurrtarios humanos normales y tratados con 10ng/ml de OKT3 /an anticuerpo anti-CD3) y 10 ng/ml de IL-2 humana por seis días. Las células PBL fueron lavadas y estimuladas con 500ng/ml de ionomicina (Cabiochem) y 10 ng/ml de PMA por 4 horas. El RNA mensajero fue aisaldo de las céulas PBL estimuladas. El cDNA sintetizado en la plantilla de mRNA fue empacado en vectores de fagos ?gt10 (Gigapak®, Stratagene cloning Systems, La Jolla, CA). Fagos recombinantes fueron colocados en la especie E.coli C600-HFL y se clasificaron usando técnicas de hibridación de placas estándares. Los filtros de nictrocelulosa fueron levantados de estas placas por duplicado, y se hibridaron con los oligonucleótidos etiquetados 32P durante la noche a 67°C en una solución de 60 mM de Tris pH 8.0, 2 mM de EDTA. 5x solución de Denhardt's, 6x SSC, 1 mg/ml de n-lauroil sarcosina, 0.5% de NP49, y 4 µg/ml de DNA de esperma de salmón SS. Los filtros fueron lavados entonces en 3x SSC a 67°C por treinta minutos. De la genoteca de cDNA de alargamiento 5' de corazón, una placa positiva fue obtenida fuera de aproximadamente un millón placas. Este clon no incluyó el extremo 3' del gene. Usando la genoteca PBL aproximadamente 50 placas positivas fueron obtenidas fuera de 500,000 placas. Quince de estas placas positivas de primera vuelta fueron escogidas, y los insertos de las combinaciones enriquecidas fueron amplificados usando primarios de oligonucleótidos diseñados para amplificar los insertos de fagos. Los productos resultantes fueron resueltos mediante 1.5% de electroforesis de gel de agarosa, manchados sonbre nitrocelulosa y analizado mediante técnica estándar de "Souther blot" usando los oligonucleótidos de 30 meros etiquetados 32P como sondas. Las dos selecciones de placas que produjeron las mayores bandas por el análisis Southern fueron purificadas mediante una clasificación secundaria y las placas de fagos aislada fueron obtenidas usando los mismos procedimientos descritos antes. EL DNA de los fagos aislados fue preparado por el método de lisis de placa, y los insertos de cDNA fueron experimentados con EcoRI, purificados por electroforesis usando 1.5% de agarosa en amortiguador de Tris-Borato-EDTA, y ligado en el plásmido pBluescript® SK(+). Estos insertos fueron secuenciados entonces mediante métodos convencionales, y las secuencias resultantes fueron alineadas. La secuencia de nucleótidos de un DNA de TRAIL humano es presentada en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos codificada por ella es presentada en la SEQ ID NO.2. Esta proteína TRAIL humana comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1-18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-281 ). El peso molecular caluclado de esta proteína es 32,508 daltones. Las células DH10B de especie E. coli transformadas con un vector recombinante conteniendo este DNA de TRAIL fueron depositadas con American Type culture Collection el 14 de junio de 1995, y se les asignó un acceso no. 69849. El depósito fue hecho bajo los términos del Tratado de Budapest. El vector recombinante en la especie depositada es el vector de expresión pDC409 (descrita en el ejemplo 5). El vector fue digerido con Salí y Notl, y el DNA de TRAIL humano que incluye la región de ciframiento completa mostrada en la SEQ ID NO:1 fue ligado al vector digerido.

EJEMPLO 2: Aislamiento de DNA que codifica un TRAIL truncado Un DNA que codifica una segunda proteína TRAIL humana fue aislado como sigue. Este TRAIL truncado no exhibe la capacidad de inducir apoptosis de células Jurkat. El análisis PCR, usando los 30 meros descritos en el ejemplo 1 como los primarios 5' y 3', indicó que 3 de 14 de las selecciones de placas de primera vuelta en el ejemplo 1 contenían formas más cortas del DNA de TRAIL. Una de las formas recortadas del gene fue aislada, ligada al vector de clonación pBluescript® SK(+) (Stratgene Cloning systems, La Jolla, CA) y secuenciada. La secuencia de nucleótidos de este DNA es presentada en la SEQ ID NO:3. La secuencia de aminoácidos codificada por ella es presentada en la SEQ ID NO:4. La proteína codificada comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1-18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-101 ). El DNA de la SEQ ID NO:3 carece de los nucleótidos 359 a 506 del DNA de la SEQ ID NO: 1 , y de esta manera es designado como el clon de variante de supresión de TRAIL humano (huTRAILdv). La supresión provoca un cambio en el marco de lectura, el cual resulta en un codón de paro en marco después del aminoácido 101 de la SEQ ID NO:4. El DNA de la SEQ ID NO.3 codifica de esta manera una proteína truncada. Los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO:2 son idénticos a los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO:4. Sin embargo, debido a la supresión, la porción C-terminal de la proteína huTRAILdv (aminoácidos 91 a 101 de la SEQ ID NO:4) difiere de los residuos en las posiciones correspondientes en la SEQ ID NO:2. La proteína huTRAILdv carece de las regiones conservadas antes descritas encontradas en los extremos C de los miembros de la familia TNF de proteínas. La incapacidad de esta proteína huTRAILdv para provocar la muerte apoptótica de células Jurkat confirma adicionalmente la importancia de estas regiones conservadas para la actividad biológica.

EJEMPLO 3: DNA que codifica un TRAIL de murino Un DNA que codifica un TRAIL de murino fue aislado mediante el siguiente procedimiento. Una genoteca de cDNA comprendiendo cDNA derivado de la línea de células T de ratón 7B9 en el vector ?ZAP fue preparada como se describe en Mosley et al. (Cell 59:335, 1989). El DNA de la genoteca fue transferido a filtros de nitrocelulosa mediante técnicas convencionales. Las sondas de DNA de TRAIL humano fueron usadas para identificar los cDNAs de ratón de hibridación en los filtros. Se usaron dos sondas por separado, en dos vueltas de clasificación. Los productos de reacción PCR de aproximadamente 400 pares de bases en longitud, aisladas y amplificadas usando el DNA de TRAIL humano como plantilla, fueron empleados como la sonda en la primera vuelta de clasificación. Estos productos PCR consistieron de un fragmento de la región de ciframiento de TRAIL humano. La sonda usada en la segunda vuelta de clasificación consistió de la región de ciframiento completa del DNA de TRAIL humano de la SEQ ID NO: 1. Un conjunto de etiquetado de DNA preparado aleatorio (Stratagene, La Jolla, CA) fue usado para radioetiquetar las sondas. La hibridación fue conducida a 37°C en 50% de formamida, seguido por lavado con 1 x SSC, 0.1 % de SDS a 50°C. Se aisló un cDNA de ratón que fue positivo en ambas vueltas de clasificación. La secuencia de nucleótidos de este DNA es presentado en la SEQ ID NO:5 y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma se presentó en la SEQ ID NO:6. La proteína codificada comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1- 17), una región transmembrana (aminoácidos 18-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-291 ). Este TRAI L de ratón es 64% idéntico al TRAI L humano de la SEQ ID NO:2, en el nivel de aminoácido. La región de ciframiento de la secuencia de nucleótidos TRAIL de ratón es 75% idéntica a la región de ciframiento de la secuencia de nucleótidos humana de SEQ I D NO: 1 .

EJEMPLO 4: Anticuerpos que ligan TRAIL Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que específicamente ligan TRAIL. Los inmunógenos adecuados que pueden ser empleados para generar tales anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, proteína TRAIL purificada o un fragmento inmunogénico de la misma (por ejemplo, el dominio extracelular), proteínas de fusión que contienen polipéptidos TRAIL (por ejemplo, proteínas de fusión TRAIL/Fc solubles), y células que expresan TRAIL recombinante en la superficie de la célula. Las técnicas conocidas para producir anticuerpos monoclonales incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense 4,411 ,993. Brevemente, los ratones son inmunizados con TRAIL como un inmunógeno emulsificado en el auxiliar Freund's completo e inyectados en cantidades que varían desde 10-100 µg subcutánea o intraperitonealmente. Diez a doce días después, los animales inmunizados son impulsados con TRAIL adicional emulsificado en auxiliar de Freund's incompleto. Los ratones son periódicamente impulsados de ahí en adelante en un programa de inmunización semanal o bi-semanal. Las muestras de suero son tomadas periódicamente mediante sangrado retro-orbital o excisiones de la punta de la cola para evaluar mediante ensayo de "dot blot" o ELISA (Ensayo de inmunoabosrbente enlazado a enzima) para anticuerpos TRAIL. Seguido a la detección de un título de anticuerpo apropiado, los animales positivos son provistos con una última inyección intravenosa de TRAIL en solución salina. Tres a cuatro días después, los animales fueron sacrificados, se recolectaron las células del bazo y las células de bazo son fusionadas a una línea de células de mieloma de murino tal como NS1 o, de preferencia, P3x63Ag 8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, las cuales son colocadas en placas de mícrotítulo múltiple en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Las células de hibrídoma son clasificadas por ELISA para la reactividad contra TRAIL purificado mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall et al. (Immunochem. 8:871 , 1971) y en la patente estadounidense 4,703,004. Las células de hibridoma positivas pueden ser inyectadas intraperitonealmente en ratones BAB/c singeneicos para producir ascitis conteniendo altas concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-TRAIL. De manera alternativa, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vitro en matraces o botellas de rodamiento mediante varias técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden ser purificados mediante precipitación por sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, la cromatografía por afinidad basada sobre la ligadura del anticuerpo a la proteína A o proteína G puede ser usada, como puede la cromatografía por afinidad basada sobre la ligadura a TRAIL.

EJEMPLO 5: Ensayo de apoptosis de escalado de DNA El TRAIL humano fue expresado y probado por la capacidad par inducir apoptosis. Los oligonucleótidos fueron sintetizados como aquellos que correspondieron a los extremos 3' y 5' de la región de ciframiento del gene TRAIL humano, con sitios de restricción Salí y Notl incorporados a los extremos de los oligonucleótidos. La región de ciframiento del gene TRAIL humano fue amplificada por técnicas PCR estándares, usando estos oligonucleótidos como primarios. Los productos de reacción PCR fueron digeridos con las endonucleasas de restricción Salí y Notl, entonces se insertaron al vector digerido Sall/Notl pDC409. PDC409 es un vector de expresión para usarse en células de mamífero, pero también es replicable en células de E. coli. El pDC409 es derivado de un vector de expresión designado pDC406 (descrito en McMahan et al. , EMBO J. 10:2821 , 1991 , y en la solicitud de PCT WO 91/18982, incorporado en la presente por referencia). El pDC406 contiene orígenes de replicación derivados de SV40, virus Epstein-Barr y pBR322 y es un derivado de HAV-EO descrito por Dower et al. , J. Immunol. 142:4314 (1989). El pDC406 difiere de HAV-EO por la supresión de un intrón presente en la secuencia líder tripartita de adenovirus 2 en HAV-EO. El DNA insertado en un sitio de clonación múltiple (conteniendo un número de sitios de corte de endonucleasa de restricción) es transcrito y traducido usando elementos reguladores derivados de HIV y adenovirus. El vector también contiene un gene que confiere resistencia a ampicilina. El pDC409 difiere de pDC406 en que un sitio Bgl I I fuera de "mes" ha sido suprimido de manera que el sitio Bgl II mes es único. Dos sitios Pme1 y un sitio Srf 1 han sido adicionados a los mes, y tres codones de paro (TAG) han sido colocados corriente debajo de los mes para funcionar en los tres marcos de lectura. Un promotor/primario T7 ha sido añadido para ayudar en el proceso de secuenciacióp de DNA. La línea de célula de riñon de mono CV- 1/EBNA-1 (ATCC CRL 19478) fue derivada por transfección de la línea de célula CV-1 8ATCC CCL 70) con un gene que codifica antígeno-1 nuclear de virus Epstein-Barr (EBNA-1 ) que expresa constitutivamente EBNA-1 dirigido del promotor/intensificados temprano-intermedio de CMV humano, como se describió por McMahan et al. , supra. El gene EBNA-1 permite la replicación episomal de vectores de expresión, tales como pDC409, que contienen el origen EBV de replicación. Las células CV1/EBNA crecidas en matraces Falcon T175 fueron transfectadas con 15 µg de ya sea pDC409 "vacío" o pDC409 conteniendo la región de ciframiento de TRAIL humano. Las células transformadas fueron cultivadas por tres días a 37°C y 10% de CO2. Las células se lavaron entonces con PBS, se incubaron por 20 minutos a 37°C en 50 mM de EDTA, se rasparon del matraz con un raspador de células, y se lavaron una vez en PBS. Después, las células se fijaron en 1 % de paraformaldehido PBS por 10 minutos a 4°C, y se lavaron 3x en PBS. Las células Jurkat fueron usadas como las células objetivo en este ensayo, para determinar si las células que expresan TRAIL podían inducir apoptosis de las mismas. La línea de célula Jurkat, el clon E6-1 , es una línea de células de leucemia de células T aguda humana disponible de American Type Culture Collection bajo el acceso no. ATCC TIB 152, y descrita en Weiss et al. (J. Immunol. 133: 123-128, 1984). Las células Jurkat fueron cultivadas en los medios RPMI complementados con 10% de suero de bovino fetal y 10 µg/ml de estreptomicina y penicilina a una densidad de 200,000 a 500,000 células por ml. Cuatro millones de estas células por cavidad fueron co-cultivadas en una placa de 6 cavidades con 2.5 ml de medio con varias combinaciones de células fijas, sobrenadantes de células transfectadas con ligando Fas, y varios anticuerpos, como se indica más adelante. Después de cuatro horas, las células fueron lavadas una vez en PBS y formadas en pellas a 1200 RPM por 5 minutos en una centrífuga de escritorio. Las pellas fueron vueltas a suspender e incubadas por diez minutos a 4°C en 500 µl de amortiguador consistiendo de 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA pH7.5, y 0.2% de Tritón X-100, el cual rompe las células pero deja el núcleo intacto. El lisado fue entonces girado a 4°C por diez minutos en una micro-centrífuga a 14,000 RPM. Los sobrenadantes fueron removidos y extraídos tres veces con 1 ml de alcohol fenol-cloroformo-isoamílico 25:24: 1 , seguido por la precipitación con NaOAC y etanol en la presencia de 1 µg de portador de glicógeno (Sigma).

Las pellas resultantes fueron vueltas a suspender en 10 mM de Tris-HCl, 10 mM de EDTA, pH 7.5, y se incubaron con 10 µg/ml de Rnasa A a 37°C por 20 minutos. Las soluciones de DNA fueron entonces resultas por elegroforesis de gel de agarosa 1 .5% en amortiguador Tris-Borato EDTA, manchadas con bromuro de etidio y fotografiadas mientras eran trans-iluminadas con luz UV. Los resultados fueron los siguientes. Las células CV1 /EBNA fijas transfectadas con ya sea con TRAIL de pDC409 o pDC409 produjeron escalado de DNA no detectable. Las células fijas de TRAIL de pDC409 cocultivadas con células Jurkat produjeron escalado de DNA, pero las células fijas de pDC409 co-cultivadas con células Jurkat no. El escalado de DNA también fue visto cuando las células fueron cocultivadas con sobrenadantes concentrados de células COS transfectadas con DNA que codifica ligando Fas humano en pDC409. Se cree que los sobrenadantes contienen ligando Fas soluble que es liberado proteofíticamente de la superficie de la célula. El escalado de DNA inducido por ligando Fas podía ser bloqueado al añadir 10 µg/ml de un anticuerpo monoclonal de bloque soluble dirigido contra Fas. Este mismo anticuerpo no pudo inhibir escalado de DNA de Jurkat por las células TRAIL de pDC409, lo que indica que el TRAIL no induce apoptosis a través de Fas. En el mismo procedimiento del ensayo, las células CV1/EBNA fijas transfectadas con TRAIL de pDC409 indujo escalado de DNA en células U937. La U937 (ATCC CRL 1593) es una línea de células de linfoma histiocítico. La proporción de efector para células objetivo fue 1 :4 (el mismo que en el ensayo de células objetivo Jurkat). La fragmentación de DNA celular en un patrón conocido como escalado DNA es un sello distintivo de apoptosis. En el ensayo anterior, TRAIL indujo apoptosis de una línea de célula de leucemia y una línea de célula de linfoma.

EJEMPLO 6: Análisis de "Nothern blot" La expresión de TRAIL en un número de diferentes tipos de tejidos fue analizada en un procedimiento convencional de Northern blot. Las Nothern blots conteniendo poli A+ RNA de una variedad de tejidos humanos de adulto (northern blots I y II de tejidos múltiples) fueron obtenidas de Clonetech (Palo Alto, CA). Otras blots fueran preparadas para resolver muestras de RNA en un 1.1 % de gel de agarosa-formaldehido, blotting en Hybond-N como fue recomendado por el productor (Amersham Corporation), y manchado con azul de metileno para monitorear las concentraciones de RNA. Las blots fueron probadas con una ribosonda de RNA antisentido correspondiente a la región de ciframiento completa de TRAIL humano. El mRNa de TRAIL humano fue detectado en linfocitos sanguíneos periféricos, colon, intestino delgado, ovario, próstata, timo, bazo, placenta, pulmón, riñon, corazón, páncreas y músculo esquelético. Se encontró que las copias de TRAIL eran abundantes en la línea de célula de linfoma anaplástico de célula grande Karpas 299 (Fischer et al., Blood, 72:234, 1988) y en células T tonsilares. El mensaje de TRAIL estuvo presente a un grado menor en la línea de célula de linfoma de Burkitt designada Raji. El mRNA de TRAIL no fue detectado en testes, cerebro o hígado, o en varias líneas de células T. Pocas o ninguna copia de TRAIL fueron detectadas en células T sanguíneas periféricas recientmente aisladas (PBT), ya sea sin estimular o estimuladas con PMA e ionóforo por 20 horas.

EJEMPLO 7: Producción de un polipéptido TRAIL soluble Un polipéptido TRAIL humano soluble comprendiendo los aminoácidos 95 a 281 de la SEQ ID NO:2 fueron preparados como sigue. Este polipéptido es un fragmento del dominio extracelular, que carece de la región espaciadora discutida antes. Un vector de expresión que codifica un TRAIL humano soluble fue construido al fusionar DNA en marco que codifica las siguientes secuencias de aminoácidos (listadas del extremo N al extremo C): una secuencia líder derivada de citomegalovirus humano (CMV), un epitope sintético designado Flag®, y aminoácidos 95-281 de TRAIL humano. El octapéptido Flag® (SEQ ID NO:7) facilita la purificación de proteínas fusionadas al mismo, como se describió antes y en Hopp et al. (Biotechnology &: 1204-1210, 1988). El fragmento de DNA que codifica TRAIL fue aislado y amplificado por reacción en cadena de polimerasa (PCR), usando primarios de oligonucleótidos que definieron los términos del fragmento de DNA que codifica aminoácidos 95-281 de la SEQ ID NO:2. El primario 3' fue un 31-mero que añadió adicionalmente un sitio Notl corriente debajo de la secuencia que codifica TRAIL. El primario 5' adicionó un sitio Spel y un epitope Flag® que codifica la secuencia corriente arriba de la secuencia que codifica TRAIL. La PCR fue conducida por procedimientos convencionales, usando el cDNA de TRAIL humano antes descrito como la plantilla. Los productos de reacción fueron digeridos con Spel y Notl , e insertados en el vector de expresión pDC409 (descrito en el ejemplo 5), que ha sido cortado con Salí y Notl. Los oligonucleótidos reconocidos que forma un fragmento Sall-Spel que codifican un líder de marco de lectura abierto de CMV también fueron ligados en el vector. La secuencia de aminoácidos del líder derivado de CMV es presentado como SEQ ID NO:9. Los aminoácidos 1 a 29 de SEQ ID NO:9 fueron codificados por el DNA de CMV, mientras que los aminoácidos 30 a 32 fueron codificados por los oligonucleótidos empleados en la construcción del vector. Las células de E. coli fueron transfectadas con la mezcla de ligación, y el vector de expresión recombinante deseado fue aislado de ahí.

Las células CV1-EBNA (ATCC CRL 10478; descritas en el ejemplo 5) fueron transfectadas con el vector recombinante, que es designado pDC409-Flag-shTRAIL, y cultivado para permitir la expresión y secreción del polipéptido Flag®-TRAIL soluble. Los sobrenadantes del cultivo fueron recolectados 3 días después de la transfección y aplicados a una columna conteniendo un anticuerpo anti-Flag® designado M2 inmovilizado en u soporte sólido. La columna se lavó entonces con PBS. El anticuerpo monoclonal M2 es descrito en Hopp et al., supra, y está disponible de Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut. Fracciones de 800 µl fueron extraídas de la columna con 50 mM de citrato, e inmediatamente se neutralizaron en 0.45 ml 1 M de Tris (ph 8). Las fracciones fueron ajustadas a 10% de glicerol y almacenadas a -20°C hasta que se necesitaron. Este TRAIL humano/Flag® recombinante soluble expresado en células CV1/EBNA tiene un peso molecular aparnte de 28 kD cuando se analizó mediante electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). La porción de Flag® contribuye un eestimado de 880 daltones al peso molecular total. El análisis de filtración de gel de Flag® / TRAIL soluble purificado sugiere que la molécula es multimérica en solución con un tamaño de ~80 kD. Aunque no se desea que sea ligado en teoría, el análisis de filtración en gel sugiere que el Flag® /TRAIL humano recombinante soluble naturalmente formó una combinación de dímeros y trímeros, predominando los trímeros. Un vector de expresión designado pDC409-Falg-smTRAIL, que codifica una proteína TRAIL de murino soluble Flag® líder de CMV, fue construido mediante procedimientos análogos. Un fragmento de DNA que codifica un polipéptido TRAIL de murino soluble fue aislado y amplificado por PCR. Los oligonucleótidos que definieron los términos de DNA que codifica los aminoácidos 99 a 291 de la secuencia de TRAIL de murino de SEQ ID NO:6 fueron empleados como los primarios 5' y 3' en la PCR.

EJEMPLO 8: Lisis de células de leucemia por TRAIL soluble En el ejemplo 5, las células que expresan TRAIL humano indujeron apoptosis de células Jurkat (una línea de célula de leucemia). En el siguiente estudio, un polipéptido TRAIL humano soluble mató células Jurkat. Las células Jurkat fueron cultivadas a una densidad de 200,000 a 500,000 células por ml en un medio RPMI suplementado con 10% de suero de bovino fetal, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de penicilina. Las células (en placas de 96 cavidades a 50,000 células por cavidad en un volumen de 100 µl) fueron incubadas por veinte horas con los reactivos indicados en la Figura 1. "TRAIL supe." Se refiere al sobrenadante condicionado (10 µl por cavidad) de células transfectadas CV1/EBNA con Pdc409-Falg-shTRAIL (ver ejemplo 7). "Control supe." Se refiere al sobrenadante de células CV1/EBNA transfectadas con el vector vacío. Donde es indicado, el anticuerpo anti- Flag® inmovilizado M2 ("lmm.M2") fue adicionado a una concentración de 10 µg/ml en un volumen de 100 µl por cavidad y se le permitió adherirse ya sea durante la noche a 4°C o por 2 horas a 37°C, después de lo cual las cavidades fueron aspiradas y lavadas dos veces con PBS para remover el anticuerpo sin ligar. Las células Jurkat tratadas con ligando Fas o M3, un anticuerpo monoclonal de bloqueo dirigido contra Fas (Alderson et al., J. Exp. Med. 181 :71 , 1995; y solicitud de PCT WO 95/10540) fueron incluidas en el ensayo como se indica. La actividad metabólica de las células tratadas de esta manera fueron ensayadas mediante conversión metabólica de tintura de azul alamar (Biosource international, Camarillo, CA) por cavidad, y sustrayendo la densidad óptica (OD) a 550-600 nm en el momento de que la tintura fue adicionada de la OD 550-600 nm después de cuatro horas. Ninguna conversión de tintura es graficada como 0 porciento de viabilidad, y el nivel de conversión de tintura en la ausencia de TRAIL es graficada como 100 porciento de viabilidad. El porcentaje de viabilidad fue calculado al multiplicar la proporción de manchado de los cultivos experimentales contra los cultivos de control por 100. Los resultados son presentados en la Figura 1. Las barras de error representan la desviación estándar de mediciones de cuatro cavidades independientes, y los valores son el promedio de estas mediciones. El sobrenadante que contiene TRAIL provocó una reducción importante en la viabilidad de células Jurkat. Una reducción mayor de la viabilidad de la célula resultó del contaco con una combinación de sobrenadante que contiene TRAIL y el anticuerpo anti-Flag® inmovilizado M2. Una posible explicación es que el M2 facilita el enlace cruzado de los complejos de receptor TRAIL/Flag®, incrementado por ello la fuerza de la señalización.

El ligando Fas demostró la capacidad para matar células Jurkat. El anticuerpo anti-Fas M3 inhibió la actividad del ligando Fas, pero no la actividad de TRAIL. Con el fin de confirmar que los cambios en la conversión de la tintura en el ensayo de azul alamar fuera debido a la muerte celular, el decremento en la viabilidad de la célula inducido por TRAIL fue confirmado mediante manchado de las células con azul tripan.

EJEMPLO 9: Lisis de células de leucemia v linfoma En los ejemplos 5 y 8, TRAIL indujo apoptosis de una línea de células de leucemia (Jurkat) y una línea de células de linfoma (U937). El siguiente estudio demostró además la capacidad de TRAIL para matar células de leucemia y linfoma. Las líneas de células humanas indicadas en la Tabla I fueron cultivadas a una densidad de 200,000 a 500,000 células por ml en un medio RPMI suplementado con 10% de suero de bovino fetal, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de penicilina. Las células (en placas de 96 cavidades a 50,000 células por cavidad en un volumen de 100 µl) fueron incubadas por veinte horas con sobrenadantes condicionados (10 µl por cavidad) de células CV1/EBNA transfectadas pDC409-Flag-shTRAIL. La actividad metabólica fue ensayada por conversión de tintura de azul alamar, en el procedimiento de ensayo descrito en el ejemplo 8. Los resultados se presentan en la Tabla I. Con el fin de confirmar que los cambios en la conversión de la tintura en el ensayo azul alamar fueran debido a muerte celular, el decremento en viabilidad de la célula inducido por TRAIL fue confirmado mediante manchado de las células con azul tripan. El manchado violeta cristal, realizado como se describió por Flick y Gifford (J. Immunol.

Methods 68: 167-175, 1984), también confirmaron los resultados vistos en el ensayo azul alamar. La naturaleza apoptótica de la muerte celular fue confirmada por manchado de azul tripan y visualización de fragmentación apoptótica por microscopía. Como se muestra en la Tabla I, muchas líneas de célula de cáncer fueron sensitivas a matanza mediada por TRAIL. La susceptibilidad de tipos de células adicionales a apoptosis mediada por TRAIL puede ser determinada usando los procedimientos de ensayo descritos en esta sección de ejemplos. El TRAIL no exhibió un efecto citotóxico importante en las líneas de células THP-1 , K562, Karpas 299 y MP-1. K299, también conocido como Karpas 299, (DSM-ACC31) fue establecido como sangre periférica de un macho diagnosticado con linfoma anaplástico de célula grande de grado alto (Fischer et al. , Blood, 72:234, 1988). La MP-1 es una línea de células B transformadas por EBV espontáneamente derivadas (Goodwin et al., Cell 73:447, 1993). Aunque no se deseaba que se ligara en teoría, es posible que estas cuatro líneas de células no expresen un receptor para TRAIL, o están caracterizadas por la sobreregulación de un gene que inhibe la apoptosis.

Tabla 1. Efecto de TRAIL soluble en la viabilidad de línea de célula Línea de Descripción Porcentaj e de célula viabilidad a Bjab Linfoma de Burkitt 0.5 + 3.8 Ramos Linfoma de Burkitt 12.1 + 2.1 U937 Linfoma histiocítico 25.2 + 8.2 HL60 Leucemia promielocítica 59.5 + 3.2 Raji Linfoma de Burkitt 64.9 + 4.5 Daudi Linfoma de Burkitt 70.2 + 4.2 THP-1 Línea de célula monocítica 92.3 + 6.8 K562 Leucemia mielógena crónica 97.1 + 4.8 K 299 Linfoma anaplástico de célula grande 99.0 ± 4.3 MP-1 Línea de célula B espontánea 104.9 + 11.7 a Resultados son media ± SEMs de 4 cavidades par cada punto de datos EJEMPLO 10: Actividad de especies cruzadas de TRAIL Una reactividad cruzada interespecies de TRAIL de humano y de murino fue probadas como sigue. El TRAIL humano y de murino fueron incubadas con la línea de célula de melanoma hA375 (ATCC CRL 1619). Debido que ésta es una línea de célula adherente, un ensayo de violeta cristal, en lugar de azul alamar, fue usado para determinanr la viabilidad de la célula. Células A375 fueron cultivadas en DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 µg/ml de penicilina. Las células (en placas de 96 cavidades a 10,000 células por cavidad en un volumen de 100 µl) fueron incubadas por 72 horas con el TRAIL de murino soluble descrito en el ejemplo 7. El manchado de violeta de crista fue realizado como se describió por Flick y Gifford (J. Immunol. Methods 68: 167-175, 1984). Los resultados demostraron que tanto el TRAIL humano y de murino son activos en estas células humanas, en que el TRAIL humano y de murino mató células A375.

La capacidad del TRAIL humano para actuar en células de murino fue probada, usando la línea de célula de fibroblasto de murino inmortalizada L929. La incubación de células L929 con ya sea TRAIL humano o de murino resultó en un decremento en manchado de violeta cristal, demostrando de esta manera que el TRAIL de murino y humano son activos en (apoptosis inducida de) células de murino. Además del violeta cristal, la muerte celular fue confirmada por manchado de azul tripano.

EJEMPLO 11 : Lisis de células infectadas con CMV El siguiente experimento demostró que la proteína TRAIL humana Flag® soluble preparada en el ejemplo 7 tiene un efecto citotóxico en células viralmente infectadas. Los fibroblastos gengivales humanos normales se hicieron crecen para la confluencia en placas de 24 cavidades en 10% de CO2 y medio DMEM suplementado con 10% de suero de bovino fetal, 100 µg/ml de estreptomicina, y 100 µg/ml de penicilina. Las muestras de los fibroblastos fueron tratadas como se indica en la Figura 2. Las concentraciones de citocinas fueron 10 ng/ml para ?-interferón y 30 ng/ml de TRAIL humano Flag® soluble. Todas las muestras que recibieron TRAIL también recibieron un exceso de dos veces el peso de anticuerpo M2 anti-Flag® M2 (descrito antes), lo que intensifica la actividad de TRAIL (presumiblemente por enlaces cruzados). El pretratamiento de células con las citocinas indicadas fue por 20 horas. Para infectar células con citomegalovirus (CMV), los medios de cultivo fueron aspirados y las células fueron infectadas con CMV en DMEM con un MOI aproximado (multiplicidad de infección) de 5. Después de dos horas, el medio conteniendo el virus fue reemplazado con DMEM y se adicionaron las citocina como se indica. Después de 24 horas, las células fueron manchadas con tintura de violeta cristal como se describió (Flick y Gifford, 1984, supra). Las células manchadas fueron lavadas dos veces con agua, disueltas en 200 µl de 2% de deoxicolato de sodio, diluidas 5 veces en agua, y se tomó la OD a 570 nm. El porcentaje de manchado máximo fue calculado al normalizar las OD para la muestra que mostró el mayor manchado. Se obtuvieron resultados similares de varios experimentos independientes. Los resultados presentados en la figura 2 demuestran que TRAIL mató específicamente fibroblastos infectados conCMV. Esta muerte celular fue intensificada por el pretratamiento de las células con ?-interferón. Ninguna muerte significativa de fibroblastos no infectados viralmente resultó del contacto con TRAIL.

EJEMPLO 12: Ensayo para identificar anticuerpos de bloqueo Los anticuerpos de bloque dirigidos contra TRAIL pueden ser identificados al probar anticuerpos por la capacidad de inhibir una actividad biológica particular de TRAIL. En el siguiente ensayo, un anticuerpo monoclonal fue probado por la capacidad par inhibir apoptosis mediada por TRAIL de células Jurkat. La línea de célula Jurkat es descrita en el ejemplo 5. Una línea de célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal elevada contra una proteína de fusión de TRAIL humnao soluble/Flag® fue empleada en el ensayo. Los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma fueron incubados con 20 ng/ml de TRAIL humano soluble/Flag® enlazado cruzado con 40 ng/ml de anticuerpo M2 monoclonal anti-Flag® M2, en un medio completo RPMI en una placa de microtítulo de 96 cavidades. Una cantidad equivalente de medio de cultivo de hibridoma fresco fue adicionada a cultivos de control. La proteína de fusión de TRAIL humano soluble/Flag® y el anticuerpo monoclonal designado M2 son descritos en el ejemplo 7. El sobrenadante de hiridoma fue empleado en una dilución 1 :50 (v/v) (concentración de inicio), y en diluciones seriales de dos veces del mismo. Después de la incubación a 37°C, 10% de CO2, por 30 minutos, 50,000 células Jurkat fueron adicionadas por cavidad, y la incubación fue continuada por 20 horas. La viabilidad de la célula fue entonces valorada midiendo la conversión metabólica de tintura azul alamar. Un procedimiento de ensayo de conversión azul alamar es descrito en el ejemplo 8. Se encontró que el anticuerpo monoclonal inhibe la apoptosis de células Jurkat inducidas por TRAIL humano soluble/Flag®.

EJEMPLO 13: Estudio de bloqueo de TRAIL Las células endoteliales microvasculares humanas de origen dermal fueron tratadas por 16-18 horas con plasma de pacientes con púrpura trombocitopénico trombótico (TTP) o con plasma de control, ya sea solo o en la presencia de antisuero policlonal anti-TRAIL. Una dilución 1 :2000 de antisuero fue empleada. El plasma fue de dos pacientes TTP, designados #1 y #2 más adelante. Las células empleadas en los ensayos fueron MVEC-1 (HMVEC2753, compradas a Clonetics, San Diego, CA) y MVEC-2 (DHMVEC 30292, compradas a Cell Systems, Kirkland, WA). Los cultivos de estas células pueden ser mantenidos como se describe en Laurence et al. (Blood, 87:3245, 1996). Los resultados fueron los siguientes. Los datos mostrados son de histogramas de DNA de células manchadas con yoduro de propidio, y el "pico Ao" representa el pico apoptótico (ver Oyaizu et al. , Blood, 82:3392, 1993; Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271 , 1991 ; y Laurence et al. , Blood, 75:696, 1990).

EC microvascular Plasma (1 %) Anticuerpo % de pico -Ao Experimento 1 MVEC-1 dermal Control _ 0 MVEC-1 dermal TTP (#1 ) - 19.5 MVEC-1 dermal TTP (#1) + 0.3 Experimento 2 MVEC-2 dermal Control _ 0 MVEC-2 dermal TTP (#2) - 20.0 MVEC-2 dermal TTP (#2) Control Ab 13.1 MVEC-2 dermal TTP (#2) + 0.2 Experimento 3 MVEC-1 dermal TTP (#1 ) . 50.1 MVEC-1 dermal TTP (#1 ) + 10.6 Experimento 4 MVEC-2 dermal Control .. 0 MVEC-2 dermal TTP (#1 ) - 13.9 MVEC-2 dermal TTP (#1) Control Ab 14.1 MVEC-2 dermal TTP (#1 ) + 0.6 Los datos reverlaron que el plasma derivado de los pacientes TTP induce apoptosis de células endoteliales microvasculares de origen dermal. Esta apoptosis fue inhibida mediante anticuerpos policlonales dirigidos contra TRAIL.

LISTADOS DE SECUENCIA (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: IMMUNEX CORPORATION (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Citocina que induce apoptosis (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINARIO: Kathryn A. Anderson, IMMUNEX CORPORATION (B) CALLE: 51 UNIVERSITY STREET (C) CIUDAD: SEATTLE (D) ESTADO: WA (D) PAÍS: EU (E) CÓDIGO POSTAL: 98101 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE (B) COMPUTADORA: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Apple 7.5.2 (D) PAQUETERÍA: Microsoft Word, versión 6.0.1 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: a ser asignado (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 DE JUNIO DE 1996 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/496,632 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 DE JUNIO DE 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/548,368 (D) FECHA DE PRESENTACIÓN: 01 DE NOVIEMBRE DE 1995 (E) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Anderson, Kathryn A. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32, 172 (C) NUMERO DE REFERENCIA/DOCKET: 2835-WO (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (206)5870430 (B) TELEFAX: (206)2330644 (C) TELEX: 756822 (2) IN FORMACIÓN PARA SEQ I D NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1751 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: huAIC (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 88..933 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 CCTCACTGAC TATAAAAGAA TAGAGAAGGA AGGGCTTCAG TGACCGGCTG CCTGGCTGAC 60 TTACAGCAGT CAGACTCTGA CAGGATC ATG GCT ATG ATG GAG GTC CAG GGG 111 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly 1 5 GGA CCC AGC CTG GGA CAG ACC TGC GTG CTG ATC GTG ATC TTC ACÁ GTG 159 Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys Val Leu He Val He Phe Thr Val 10 15 20 CTC CTG CAG TCT CTC TGT GTG GCT GTA ACT TAC GTG TAC TTT ACC AAC 207 Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn 25 30 35 40 GAG CTG AAG CAG ATG CAG GAC AAG TAC TCC AAA AGT GGC ATT GCT TGT 255 Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly He Ala Cys 45 50 55 TTC TTA AAA GAA GAT GAC AGT TAT TGG GAC CCC AAT GAC GAA GAG AGT 303 Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser 60 65 70 ATG AAC AGC CCC TGC TGG CAÁ GTC AAG TGG CAÁ CTC CGT CAG CTC GTT 351 Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val 75 80 85 AGA AAG ATG ATT TTG AGA ACC TCT GAG GAA ACC ATT TCT ACÁ GTT CAÁ 399 Arg Lys Met He Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gln 90 95 100 GAA AAG CAÁ CAÁ AAT ATT TCT CCC CTA GTG AGA GAA AGA GGT CCT CAG 47 Glu Lys Gln Gln Asn He Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln 105 110 115 120 AGA GTA GCA GCT CAC ATA ACT GGG ACC AGA GGA AGA AGC AAC ACÁ TTG 495 Arg Val Ala Ala His He Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 125 130 135 TCT TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA AAG GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC 543 Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys He Asn 140 145 150 TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC CTG AGC AAC TTG CAC 591 Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser ?sn Leu His 155 160 165 TTG AGG AAT GGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC 639 Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val He His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr He 170 175 180 TAT TCC CAÁ ACÁ TAC TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACÁ 687 Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu He Lys Glu Asn Thr 185 190 195 200 AAG AAC GAC AAA CAÁ ATG GTC CAÁ TAT ATT TAC AAA TAC ACÁ AGT TAT 735 Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 205 210 215 CCT GAC CCT ATA TTG TTG ATG AAA AGT GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT 783 Pro Asp Pro He Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 220 225 230 AAA GAT GCA GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAÁ GGG GGA ATA TTT 831 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser He Tyr Gln Gly Gly He Phe 235 240 245 GAG CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA ACÁ AAT GAG CAC 879 Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg He Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His 250 255 260 TTG ATA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTC GGG GCC TTT TTA GTT 927 Leu He Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 265 270 275 280 GGC TAA CTGACCTGGA AAGAAAAAGC AATAACCTCA AAGTGACTAT TCAGTTTTCA 983 Gly * GGATGATACA CTATGAAGAT GTTTCAAAAA ATCTGACCAA AACAAACAAA CAGAAAACAG 1043 AAAACAAAAA AACCTCTATG CAATCTGAGT AGAGCAGCCA CAACCAAAAA ATTCTACAAC 1103 ACACACTGTT CTGAAAGTGA CTCACTTATC CCAAGAAAAT GAAATTGCTG AAAGATCTTT 1163 CAGGACTCTA CCTCATATCA GTTTGCTAGC AGAAATCTAG AAGACTGTCA GCTTCCAAAC 1223 ATTAATGCAA TGGTTAACAT CTTCTGTCTT TATAATCTAC TCCTTGTAAA GACTGTAGAA 1283 GAAAGCGCAA CAATCCATCT CTCAAGTAGT GTATCACAGT AGTAGCCTCC AGGTTTCCTT 1343 AAGGGACAAC ATCCTTAAGT CAAAAGAGAG AAGAGGCACC ACTAAAAGAT CGCAGTTTGC 1403 CTGGTGCAGT GGCTCACACC TGTAATCCCA ACATTTTGGG AACCCAAGGT GGGTAGATCA 1463 CGAGATCAAG AGATCAAGAC CATAGTGACC AACATAGTGA AACCCCATCT CTACTGAAAG 1523 TGCAAAAATT AGCTGGGTGT GTTGGCACAT GCCTGTAGTC CCAGCTACTT GAGAGGCTGA 1583 GGCAGGAGAA TCGTTTGAAC CCGGGAGGCA GAGGTTGCAG TGTGGTGAGA TCATGCCACT 1643 ACACTCCAGC CTGGCGACAG AGCGAGACTT GGTTTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAACTT 1703 CAGTAAGTAC GTGTTATTTT TTTCAATAAA ATTCTATTAC AGTATGTC 1751 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 281 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2: Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu He Val He Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly He Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met He Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn He Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His He Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu ' 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys He Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val He 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr He Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 - Gln Glu Glu He Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro He Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser He Tyr Gln Gly Gly He Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg He 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu He Asp Met Asp His Glu^ Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly * 275 280 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1521 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (viii) FUENTE INMEDIATA: (B) 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CTCTCAAGTA GTGTATCACA GTAGTAGCCT CCAGGTTTCC 1183 TTAAGGGACA ACATCCTTAA GTCAAAAGAG AGAAGAGGCA CCACTAAAAG ATCGCAGTTT 1243 GCCTGGTGCA GTGGCTCACA CCTGTAATCC CAACATTTTG GGAACCCAAG GTGGGTAGAT 1303 CACGAGATCA AGAGATCAAG ACCATAGTGA CCAACATAGT GAAACCCCAT CTCTACTGAA 1363 AGTGCAAAAA TTAGCTGGGT GTGTTGGCAC ATGCCTGTAG TCCCAGCTAC TTGAGAGGCT 1423 GAGGCAGGAG AATCGTTTGA ACCCGG^ ^ CAGAGGTTGC AGTGTGGTGA GATCATGCCA 1483 CTACACTCCA GCCTGGCGAC AGAGCGAGAC TTGGTTTC 1521 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 101 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4: Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu He Val He Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly He Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln. Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Thr Pro Arg Met Lys Arg 85 90 95 Leu Trp Ala Ala Lys * 100 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1366 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) FILAMENTO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENSE: NO 0 (ix) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: MuAIC (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 47..919 5 (x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5: TGCTGGGCTG CAAGTCTGCA TTGGGAAGTC AGACCTGGAC AGCAGT ATG CCT TCC 55 Met Pro Ser 1 TCA GGG GCC CTG AAG GAC CTC AGC TTC AGT CAG CAC TTC AGG ATG ATG 103 Ser Gly Ala Leu Lys Asp Leu Ser Phe Ser Gln His Phe Arg Met Met 5. 10 15 GTG ATT TGC ATA GTG CTC CTG CAG GTG CTC CTG CAG GCT GTG TCT GTG 151 Val He Cys He Val Leu Leu Gln Val Leu Leu Gln Ala Val Ser Val 20 25 30 35 GCT GTG ACT TAC ATG TAC TTC ACC AAC GAG ATG AAG CAG CTG CAG GAC 199 Ala Val Thr Tyr Met Tyr Phe Thr Asn Glu Met Lys Gln Leu Gln Asp 40 * 45 50 AAT TAC TCC AAA ATT GGA CTA GCT TGC TTC TCA AAG ACG GAT GAG GAT 247 Asn Tyr Ser Lys He Gly Leu Ala Cys Phe Ser Lys Thr Asp Glu Asp 55 60 65 TTC TGG GAC TCC ACT GAT GGA GAG ATC TTG AAC AGA CCC TGC TTG CAG 295 Phe Trp Asp Ser Thr Asp Gly Glu He Leu Asn Arg Pro Cys Leu Gln . 70 75 80 GTT AAG AGG CAÁ CTG TAT CAG CTC ATT GAA GAG GTG ACT TTG AGA ACC 343 Val Lys Arg Gln Leu Tyr Gln Leu He Glu Glu Val Thr Leu Arg Thr 85 90 95 TTT CAG GAC ACC ATT TCT ACÁ GTT CCA GAA AAG CAG CTA AGT ACT CCT 391 Phe Gln Asp Thr He Ser Thr Val Pro Glu Lys Gln Leu Ser Thr Pro -100 105 110 115 CCC TTG CCC AGA GGT GGA AGA CCT CAG AAA GTG GCA GCT CAC ATT ACT 439 Pro Leu Pro Arg Gly Gly Arg Pro Gln Lys Val Ala Ala His He Thr 120 125 130 GGG ATC ACT CGG AGA AGC AAC TCA GCT TTA ATT CCA ATC TCC AAG GAT 487 Gly He Thr Arg Arg Ser Asn Ser Ala Leu He Pro He Ser Lys Asp 135 140 145 GGA AAG ACC TTA GGC CAG AAG ATT GAA TCC TGG GAG TCC TCT CGG AAA 535 Gly Lys Thr Leu Gly Gln Lys He Glu Ser Trp Glu Ser Ser Arg Lys 150 155 160 265 GGG CAT TCA TTT CTC AAC CAC GTG CTC TTT AGG AAT GGA GAG CTG GTC 583 Gly His Ser Phe Leu Asn His Val Leu Phe Arg Asn Gly Glu Leu Val 165 170 175 ATC GAG CAG GAG GGC CTG TAT TAC ATC TAT TCC CAÁ ACÁ TAC TTC CGA 631 He Glu Gln Glu Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg 180 185 190 195 TTT CAG GAA GCT GAA GAC GCT TCC AAG ATG GTC TCA AAG GAC AAG GTG 679 Phe Gln Glu Ala Glu Asp Ala Ser Lys Met Val Ser Lys Asp Lys Val 200 205 210 AGA ACC AAA CAG CTG GTG CAG TAC ATC TAC AAG TAC ACC AGC TAT CCG 727 Arg Thr Lys Gln Leu Val Gln Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro 215 220 225 GAT CCC ATA GTG CTC ATG AAG AGC GCC AGA AAC AGC TGT TGG TCC AGA 775 Asp Pro He Val Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Arg 230 235 240 GAT GCC GAG TAC GGA CTG TAC TCC ATC TAT CAG GGA GGA TTG TTC GAG 823 Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser He Tyr Gln Gly Gly Leu Phe Glu 245 250 255 CTA AAA AAA AAT GAC AGG ATT TTT GTT TCT GTG ACÁ AAT GAA CAT TTG 871 Leu Lys Lys Asn Asp Arg He Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu 260 265 270 275 ATG GAC CTG GAT CAÁ GAA GCC AGC TTC TTT GGA GCC TTT TTA ATT AAC 919 Met Asp Leu Asp Gln Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu He Asn 280 285 290 TAAATGACCA GTAAAGATCA AACACAGCCC TAAAGTACCC AGTAATCTTC TAGGTTGAAG 979 GCATGCCTGG AAAGCGACTG AACTGGTTAG GATATGGCCT GGCTGTAGAA ACCTCAGGAC 1039 AGATGTGACA GAAAGGCAGC TGGAACTCAG CAGCGACAGG CCAACAGTCC AGCCACAGAC 1099 ACTTTCGGTG TTTCATCGAG AGACTTGCTT TCTTTCCGCA AAATGAGATC ACTGTAGCCT 1159 TTCAATGATC TACCTGGTAT CAGTTTGCAG AGATCTAGAA GACGTCCAGT TTCTAAATAT 1219 TTATGCAACA ATTGACAATT TTCACCTTTG TTATCTGGTC CAGGGGTGTA AAGCCAAGTG 1279 CTCACAAGCT GTGTGCAGAC CAGGATAGCT ATGAATGCAG GTCAGCATAA AAATCACAGA 1339 ATATCTCACC TACTAAAAAA AAAAAAA 1366 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 291 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6: Met Pro Ser Ser Gly Ala Leu Lys Asp Leu Ser Phe Ser Gln His Phe 1 5 10 15 Arg Met Met Val He Cys He Val Leu Leu Gln Val Leu Leu Gln Ala 20 25 30 Val Ser Val Ala Val Thr Tyr Met Tyr Phe Thr Asn Glu Met Lys Gln 35 40 45 Leu Gln Asp Asn Tyr Ser Lys He Gly Leu Ala Cys Phe Ser Lys Thr 50 55 60 Asp Glu Asp Phe Trp Asp Ser Thr Asp Gly Glu He Leu Asn Arg Pro 65 70 75 80 Cys Leu Gln Val Lys Arg Gln Leu Tyr Gln Leu He Glu Glu Val Thr 85 90 95 Leu Arg Thr Phe Gln Asp Thr He Ser Thr Val Pro Glu Lys Gln Leu 100 105 110 Ser Thr Pro Pro Leu Pro Ar, v..y Gly Arg Pro Gln Lys Val Ala Ala 115 120 125 His He Thr Gly He Thr Arg Arg Ser Asn Ser Ala Leu He Pro He 130 135 140 Ser Lys Asp Gly Lys Thr Leu Gly Gln Lys He Glu Ser Trp Glu Ser 145 150 155 160 Ser Arg Lys Gly His Ser Phe Leu Asn His Val Leu Phe Arg Asn Gly 165 170 175 Glu Leu Val He Glu Gln Glu Gly Leu Tyr Tyr He Tyr Ser Gln Thr 180 185 190 Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Ala Glu Asp Ala Ser Lys Met Val Ser Lys 195 200 205 Asp Lys Val Arg Thr Lys Gln Leu Val Gln Tyr He Tyr Lys Tyr Thr 210 215 220 Ser Tyr Pro Asp Pro He Val Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys 225 230 235 240 Trp Ser Arg Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser He Tyr Gln Gly Gly 245 250 255 Leu Phe Glu Leu Lys Lys Asn Asp Arg He Phe Val Ser Val Thr Asn 260 265 270 Glu His Leu Met Asp Leu Asp Gln Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe 275 280 % 285 Leu He Asn 290 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: no relevante (D) TOPOLOGÍA: no relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (xii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: péptido FLAG (xi) DESCRI PCIÓN DE SF^U ENC IA: SEQ I D NO:7: Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: no relevante (D) TOPOLOGÍA: no relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (xiii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: péptido conservado (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8: Leu Val Val Xaa Xaa Xaa Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Xaa Gln Val Xaa 1 5 10 15 Phe (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: no elevante (D) TOPOLOGÍA: no relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (xiv) FUENTE INMEDIATA: (C) CLON: líder CMV (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9: Met Ala Arg Arg Leu Trp He Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr 1 - 5 10 15 Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser 20 25 30

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un DNA aislado que codifica un polipéptido TRAIL, en donde dicho polipéptido TRAIL comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ ID NO:2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ ID NO:6, en donde dicho polipéptido TRAIL es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. Un DNA aislado de la reivindicación 1 , en donde dicho polipéptido TRAIL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ ID NO:2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ ID NO:6. Un DNA aislado que codifica un polipéptido TRAIL soluble, en donde dicho polipéptido TRAIL soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: a) el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2); y b) un fragmento de dicho dominio extracelular; en donde dciho polipéptido TRAIL soluble es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. Un DNA de la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido TRAIL soluble comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de: a) el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2); y b) un fragmento de dicho dominio extracelular, en donde dicho fragmento es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. Un DNA de la reivindicación 4, en donde dicho polipéptido TRAIL soluble comprende la secuencia de aminoácidos x a 281 de la SEQ ID NO:2, en donde x representa un entero de 39 a 95. Un DNA de la reivindicación 5, en donde dicho polipéptido TRAIL soluble comprende la secuencia de aminoácidos 95 a 281 de la SEQ ID NO:2. Un DNA de la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido TRAIL soluble comprende substitución(substituciones) conservadora en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2); y b) un fragmento de dicho dominio extracelular; en donde el TRAIL substituido de manera conservadora es capaz de inducir apoptosis de las células Jurkat. Un vector de expresión comprendiendo un DNA de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. Un proceso para preparar un polipéptido TRAIL, comprendiendo cultivar una célula huésped transformada con un vector de acuerdo a la reivindicación 8 bajo condiciones que promueven la expresión de TRAIL, y recuperar el polipéptido TRAIL. Un polipéptido TRAIL purificado comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de aminoácidos 1 a 281 de la SEQ ID NO:2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ ID NO:6, en donde dicho polipéptido TRAIL es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. Un polipéptido TRAIL purificado de la reivindicación 10, comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ ID NO:2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ ID NO:6. . Un polipéptido TRAIL humano codificado por el inserto de cDNA del vector recombinante depositado en la especie ATCC 69849. . Un polipéptido TRAIL soluble purificado comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste de: a) el dominio extracelular del TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2); y b) un fragmento de dicho dominio extracelular; en donde dicho polipéptido TRAIL humano soluble es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. . Un polipéptido TRAIL de la reivindicación 13, comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2); y b) un fragmento de dicho dominio extracelular, en donde dicho fragmento es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. Un polipéptido TRAIL de la reivindicación 14, comprendiendo la secuencia de aminoácidos x a 281 de la SEQ ID NO:2, en donde x representa un entero de 39 a 95. Un polipéptido TRAIL de la reivindicación 15, comprendiendo los aminoácidos 95 a 281 de la SEQ ID NO:2. Un polipéptido TRAIL de la reivindicación 13, en donde dicho polipéptido TRAIL soluble comprende la substitución(substituciones) conservadoras en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: a) el dominio extracelular del TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO:2); y b) un fragmento de dicho dominio extracelular; en donde el TRAIL substituido de manera conservadora es capaz de inducir apoptosis de células Jurkat. Un oligómero comprendiendo de dos a tres polipéptidos TRAIL solubles de la reivindicación 13. Un trímero TRAIL comprendiendo tres polipéptidos TRAIL solubles de la reivindicación 16. Un anticuerpo que liga específicamente una proteína TRAIL de la reivindicación 11 o 15. Un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 20, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.