JP2000515727A

JP2000515727A - 腫瘍壊死因子関連ポリペプチド

Info

Publication number: JP2000515727A
Application number: JP10500892A
Authority: JP
Inventors: ジヨンソン，マリー・ジエイ; シモネツト，ウイリアム・エス; ダニレンコ，デイミイトリー・エム
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2000-11-28
Also published as: WO1997046686A2; WO1997046686A3; CA2256464A1; EP0918860A2; AU3381097A

Abstract

(57)【要約】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの新規メンバーを同定し、炎症と壊死、特に肝臓のそれら、骨髄造血及び骨吸収に関与することを観察した。そのポリペプチドをＡＧＰ−１と命名する。ＡＧＰ−１発現用の核酸配列、ベクター及び宿主細胞を開示する。ＡＧＰ−１アンタゴニストの同定方法、ＡＧＰ−１を含む医薬製剤、及びＡＧＰ−１とＡＧＰ−１アンタゴニストを用いる治療方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍壊死因子関連ポリペプチド発明の分野本発明は、炎症、骨髄造血及び骨吸収に関与する腫瘍壊死因子関連ポリペプチドであるＡＧＰ−１に関する。ＡＧＰ−１発現のための核酸配列、ベクター及び宿主細胞を開示する。ＡＧＰ−１を含む医薬製剤、ＡＧＰ−１のアンタゴニストの同定方法及びＡＧＰ−１又はＡＧＰ−１アンタゴニストを用いる治療法も包含される。発明の背景腫瘍壊死因子ファミリーは、免疫調節、急性と慢性の炎症反応及びプログラム細胞死の仲介物質として機能するサイトカインの増大しつつある一群である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）はこのファミリーの原型メンバーである。このファミリーには、リンフォトキシン（ＬＴα，ＴＮＦβ）、リンフォトキシンβ（ＬＴβ ）、並びにＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＸ４０、４−１ＢＢ及びＦＡＳのリガンドも含まれる。このファミリーメンバー間の相同性はカルボキシ末端の１５０アミノ酸残基に制限され、オリゴマー化が起るサブユニット接触に関与するβ−ストランド領域内で相同性は最大である。分泌タンパク質であるＬＴαは例外であるが、このファミリーのリガンドの全てはII型膜タンパク質である。相同性カルボキシ末端ドメインは細胞外であり、より短い非相同性アミノ末端領域は細胞内である。ＴＮＦαの膜結合型はタンパク質分解的切断の標的でありえ、ある種の疾患状態において循環するＴＮＦαの可溶型を生じうる。ＴＮＦαが全身に行くと、毒性ショックや広範囲の組織壊死が誘導されるので、ＴＮＦαは、敗血症ショックを含む種々の感染性疾患、自己免疫疾患及び移植片対宿主病と関連した病的状態や致死性に関与しうる。ＴＮＦファミリーのサイトカインは、細胞外ドメインにおいてシステインに富んだ擬似繰返しを有するＩ型膜タンパク質として一般に特徴付けられている一ファミリーのレセプターとの相互作用により生物効果を発揮する。現在までに同定された１２種のＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバーのうち、２種のボックスウイルス遺伝子、Ｔ２とＡ５３Ｒだけが可溶性で分泌されるレセプターをコードする。ＴＮＦαの可溶型は免疫応答で重要な役割を果たしていて、膜結合リガンドと、このファミリーのレセプター、特にＴ細胞とＢ細胞上のものとの相互作用は恐らく、免疫系の細胞と細胞の会話で主要な役割を果たしているであろう。この点で、ＦａｓＬとそのレセプターを介するシグナリングはＴ細胞仲介細胞毒性に重要な役割を果たすと考えられている。恐らくこのファミリーと関連する最も興味ある活性は、Ｔ細胞発達を含む椎骨発達の多くの領域で極めて重要な現象であるアポトーシス経路を介するプログラム細胞死を誘導する能力である。既知のＴＮＦファミリーメンバーのうち、ＴＮＦα、ＬＴα及びＦａｓＬは全て、正しい条件下においてある種の細胞にアポトーシスを誘導することが示された。ＴＮＦαとＬＴαのアポトーシス効果は最少数の細胞型に限られるようであるが、Ｆａｓを介するシグナリングは多数の形質転換細胞系や慢性的活性化Ｔ細胞クローンにアポトーシスを誘導することが示された。更に、自己免疫疾患を加速し、変異マウスでリンパ節症と巨脾症を発症する２種の変異（ｌｐｒ及びｇｌｄ）は、それぞれＦａｓとＦａｓＬをコードする遺伝子内の変異に対応することが知られている。炎症、感染性疾患、免疫系疾患及びアポトーシス細胞死と関連する条件下におけるＴＮＦ及びＴＮＦ関連ファミリーメンバーの関与を考えて、更なる関連ＴＮＦファミリーメンバーを特定することが望ましい。ＴＮＦ及びＴＮＦ関連分子に関連する疾患の治療を開発するために、ＴＮＦ関連分子を特定することが本発明の目的である。ＴＮＦファミリーメンバーＦａｓＬと有意の相同性を有するポリペプチドをコードする新規遺伝子を特定した。該ポリペプチドをＡＧＰ−１と命名した。肝臓でマウスＡＧＰ−１を発現するトランスジェニックマウスは、肝臓の炎症と壊死、胆管過形成、並びに該因子の直接的又は間接的な全身的影響を支持する病理学的知見を示す。ＡＧＰ−１のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ，Wileyら，Immunity 3,673-682(1995)を参照）について報告された配列と同一であることが知見された。ＴＲＡＩＬは種々の形質転換細胞系でアポトーシスを誘導することが観察された。発明の概要ＡＧＰ−１と命名した腫瘍壊死因子ファミリーの新規メンバーをマウスｃＤＮＡライブラリーから特定し、トランスジェニックマウス系で発現させた。ＡＧＰ −１は、好中球とリンパ球増加を伴う骨髄造血、肝臓の炎症と壊死、及び骨吸収に関与する。ヒトＡＧＰ− １も同定した。本発明は、ＡＧＰ−１の生物活性の少なくとも１つを有するポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドを発現するベクターと宿主細胞、及び組換えＡＧＰ−１の製造法を提供する。特異的にＡＧＰ−１と結合する抗体又はそのフラグメントも提供する。ＡＧＰ−１の生物活性の少なくとも１つを減少又は除去するＡＧＰ−１のアンタゴニストの特定法も本発明に包含される。このようなアンタゴニストには、ＡＧＰ−１又はそのレセプターと結合し、ＡＧＰ−１レセプター活性化を妨害する、ペプチド、タンパク質、炭水化物、又は小分子量有機分子が含まれる。ＡＧＰ−１を用いて、骨髄の細胞数の減少を特徴とする造血性疾患を治療できうる。ＡＧＰ−１アンタゴニストを用いて炎症性疾患を治療できうる。ＡＧＰ− １アンタゴニストを用いて骨吸収の増加に起因する骨疾患も治療できうる。ＡＧＰ−１及びＡＧＰ−１アンタゴニストを含有する医薬製剤も本発明に包含される。図面の説明図１．マウスＡＧＰ−１のｃＤＮＡとアミノ酸配列。図２．ヒトＡＧＰ−１のｃＤＮＡとアミノ酸配列。図３．非トランスジェニックマウス＃１２（Ａ）とＨＥＡＧＰＦＩトランスジェニックマウス＃７５−１３（Ｂ）からの肝臓のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片。Ｂは、肝細胞壊死の散在する病巣（Ａにおける星印）を伴う門脈周辺の胆管過形成と炎症（Ｂにおける矢じり；Ａにおける矢じりは対照のために正常の門脈管を指す）を特徴とする顕著な増殖性朋管肝炎を示す。横棒＝５０μｍ。図４．ＨＥＡＧＰＦ１トランスジェニック（Ｂ−マウス＃７５−１３）と非トランスジェニック（Ａ−マウス＃１２）脾臓のミエロペルオキシダーゼ染色切片。Ｂは、トランスジェニック脾臓における赤牌髄造血の増大（Ｂにおける矢じりはミエロペルオキシダーゼ陽性牌髄性前駆体の凝集体を示す）による赤脾髄の膨張（星印）及び白脾髄リンパ球様道形成（Ａに対するＢにおける矢じり）によって主に引起されるトランスジェニックマウスの巨脾症を示す。横棒＝２５０ μｍ。図５．非トランスジェニック対照マウス（Ａ−マウス＃１２）及びＨＥＡＧＰＦ１トランスジェニックマウス（マウス＃７５−１３）からの骨髄のＴＲＡＰ染色切片であって、非トランスジェニック骨髄（Ａ）に対しトランスジェニック骨髄（Ｂ）における骨梁に沿って並ぶＴＲＡＰ＋の破骨細胞（矢）数の明らかな増大を示している該切片。横棒＝２５μｍ。発明の詳細な説明本発明は、ＡＧＰ−１と命名したＴＮＦレセプタースーパーファミリーの新規メンバーを提供する。ＡＧＰ−１は、哺乳動物ＡＧＰ−１又はその誘導体のアミノ酸配列及びＡＧＰ−１の生物活性の少なくとも一つを有するポリペプチドを指す。好適実施態様では、ＡＧＰ−１はマウス又はヒトＡＧＰ−１である。マウスとヒトＡＧＰ−１のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を、図１と図２にそれぞれ示す。ＡＧＰ−１の生物活性には、骨髄造血、炎症と壊死、特に肝臓におけるもの、及び骨吸収における関与が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明は、ＡＧＰ−１の生物的性質の一つ以上を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。本明細書で用いる核酸という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、全体としてもしくは部分的に合成されたＤＮＡ、又はＲＮＡを表す。本発明の核酸は、ａ）図１（配列番号１）又は図２（配列番号３）で示される核酸；ｂ）図１（配列番号１）又は図２（配列番号３）で示される核酸のポリペプチドコード領域にハイブリダイズし、高ストリンジェント条件下で該核酸と依然としてハイブリダイズしたままである核酸；及びｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸と縮重している核酸；からなる群から選択される。典型的には、核酸ハイブリダイゼーションは、一本鎖から核酸二重鎖を形成する第１のハイブリダイゼーション工程、次いで第２工程中にハイブリダイゼーションのストリンジェンシィに依存する相同性の程度を有する核酸二重鎖を選択的に保持するよりストリンジェントな条件下で行う第２のハイブリダイゼーション工程を含む多工程法を含む。第１のハイブリダイゼーション工程の条件は、第２のハイブリダイゼーション工程より高いストリンジェンシィでなければ、一般的には決定的ではない。一般的には、第２のハイブリダイゼーシヨンは高ストリンジェンシィ条件下で行う。“高ストリンジェンシィ”条件とは、配列番号１に対応する相補鎖の部分もしくは全体の完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約１２〜２０℃低い、又は配列番号３に対応する相補鎖の部分もしくは全体の完全なハイブリッドのＴｍより約１２〜２０℃低い温度及び塩の条件を指す。一実施態様では、“高ストリンジェンシィ”条件とは、約６５℃及び約１ＭＮａ⁺以下の条件を指す。塩濃度、温度及び／又はインキュベーションの長さは、本発明の核酸分子がハイブリダイズするように、第１又は第２のハイブリダイゼーション工程のどちらかで変化させうることが理解される。核酸のハイブリダイゼーション条件及び核酸ハイブリッドのＴｍの計算は、Sambrookら，Mo lecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press ，New York(1989)に記載されている。本発明の核酸は、配列番号１と配列番号３で示されるＡＧＰ−１のポリペプチドコード領域の部分又は全体にハイブリダイズでき、そのため配列番号１と配列番号３の核酸の末端切断型又は拡張型でありうる。末端切断核酸又は拡張核酸は、骨髄造血の刺激、骨吸収又は炎症反応のようなＡＧＰ−１の生物学的性質の一つ以上を保持するならば、本発明に包含される。一実施態様では、核酸は最低約１０個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする。別の実施態様では、核酸は最低約２０個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする。更に別の実施態様では、核酸は最低約５０個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする。ハイブリダイズする核酸は、ＡＧＰ−１コード領域の５ ’側及び／又は３’側に位置する非コード配列も含みうる。非コード配列には、ＡＧＰ−１発現に関与する調節領域、例えばプロモーター、エンハンサー領域、翻訳開始部位、転写終結部位などが含まれる。好適実施態様では、本発明の核酸はマウスＡＧＰ−１又はヒトＡＧＰ−１をコードする。マウスＡＧＰ−１は図１と配列番号２に示し、ヒトＡＧＰ−１は図２と配列番号４に示す。核酸は膜結合型である完全長型ＡＧＰ−１又は膜貫通領域の部分もしくは全部を欠くＡＧＰ−１の可溶型をコードしうる。ヒトＡＧＰ−１の予測膜貫通領域は配列番号４で示される残基１６〜３６を含む。これらの残基の部分又は全部の欠失により、可溶型ＡＧＰ−１が生成することが予想される。本発明の核酸は、生物活性ＡＧＰ−１を発現するように、ＤＮＡ配列と結合される。発現に必要な配列は当業者公知であり、ＲＮＡ合成開始のためのプロモーターとエンハンサー配列、転写終結部位、タンパク質合成開始のためのリポソーム結合部位、及び分泌のためのリーダー配列が含まれる。ＡＧＰ−１の発現と分泌を可能とする配列は同種（ホモロガス）、即ちＡＧＰ−１発現及び分泌に関与するゲノム内の配列、又は異種（ヘテロガス）でありうる。種々のプラスミドベクターが宿主細胞でＡＧＰ−１を発現させるために利用できる。一例はプラスミドｐＤＳＲαであり、ＰＣＴ出願第９０／１４３６３号に記載されており、哺乳動物宿主での発現に使用できる。ＡＧＰ−１コード領域はまた、所定の宿主での最適発現のために好適コドンに置換することで改変できる。細菌、植物、昆虫、及び哺乳動物宿主系でのコドン使用法は公知であり、ｍＲＮＡ翻訳を最適化するために当業者が開発できる。更に、トランスジェニック動物でＡＧＰ−１の組織特異的発現のためのベクターが利用できる。レトロウイルス及びアデノウイルスをベースとした遺伝子導入ベクターも、インビボ治療のため、ヒト細胞でＡＧＰ−１発現のために使用できる（ＰＣＴ出願第８６／００９２２号を参照）。ＡＧＰ−１を発現する原核及び真核宿主細胞も本発明で提供される。宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞などがある。ＡＧＰ−１は、マウス又はヤギなどのトランスジェニック動物でも産生されうる。本発明の核酸含有プラスミド及びベクターは、当業者公知のトランスフェクション又は形質転換技術を用いて適切な宿主細胞に導入される。宿主細胞は、図１に示す完全長ＡＧＰ−１をコードするＤＮＡ配列を含みうる。宿主細胞はまた、完全長遺伝子によってコードされたＡＧＰ−１にプロセシングを行い成熟型を産生するか、又は成熟型をコードするＤＮＡ配列の発現によって、プロセシングを行わずに成熟型を産生するであろう。ＡＧＰ−１発現のための哺乳動物宿主細胞の例には、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯｄ−細胞、２９３細胞及び３Ｔ３細胞があるが、それらに限定されない。本発明はまた、外来ＤＮＡ配列の原核又は真核発現の産物としてのＡＧＰ−１を提供する。即ち、ＡＧＰ−１は組換えＡＧＰ−１である。外来ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列などである。ＡＧＰ−１は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞発現の産物でありうる。細菌細胞で産生されたＡＧＰ−１はＮ−末端メチオニン残基を有するであろう。本発明はまた、ＡＧＰ−１の製造方法であって、ＡＧＰ−１をコードする核酸で形質転換された、又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞を増殖させ、該核酸のポリペプチド発現産物を単離することを特徴とする該方法も提供する。哺乳動物ＡＧＰ−１又はその誘導体であるポリペプチドは本発明に包含される。ＡＧＰ−１の誘導体とは、得られたポリペプチドがＡＧＰ−１の生物活性の少なくとも一つを有するように、１個以上のアミノ酸の付加、欠失、挿入又は置換を有するポリペプチドを指す。誘導体は天然起源、例えば対立遺伝子変異体のポリペプチド産物もしくはｍＲＮＡスプライス変異体でありうるし、又は核酸の操作及び合成のための当業者が利用できる技術を用いて構築できる。ＡＧＰ−１ポリペプチドは完全長ポリペプチド、又は好適実施態様では最低約１０個のアミノ酸長、最低２０個のアミノ酸長、又は最低約５０個のアミノ酸長のそのフラグメントでありうる。好ましくは、ＡＧＰ−１完全長ポリペプチド及びフラグメントは図１もしくは図２のアミノ酸配列又はその部分を有する。ポリペプチドはアミノ末端メチオニン残基を有しうるし、又は有しないかもしれない。翻訳後修飾（例えば、Ｎ−結合又はＯ−結合炭水化物鎖の付加、Ｎ−末端又はＣ−末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の付加、Ｎ−結合又はＯ −結合炭水化物鎖の化学修飾、及び原核宿主細胞発現の結果としてＮ−末端メチオニン残基の付加を受けたＡＧＰ−１ポリペプチドも本発明に包含される。マウス及びヒトＡＧＰ−１は膜貫通タンパク質としてコードされるので、ＡＧＰ−１の可溶型も予想される。このような可溶型は、該ポリペプチドの膜貫通領域の除去によって容易に構築できる。該ポリペプチドはまた、検出可能標識、例えば酵素標識、蛍光標識、アイソトープ標識又はタンパク質の検出と単離を可能とするアフィニティ標識でも修飾できる。異種アミノ酸配列と融合したＡＧＰ−１アミノ酸配列の一部又は全部を含むＡＧＰ−１キメラタンパク質も包含される。異種配列は、得られた融合タンパク質がＡＧＰ−１の活性を保持するのが可能となる任意の配列でありうる。異種配列には例えば、イミュノグロブリン融合体、例えば二量体化を可能とするＩｇＧのＦｃ領域、又は該ポリペプチドの標識となる酵素との融合体がある。本発明のポリペプチドは、ＡＧＰ−１を発現する組織や細胞から、及びＡＧＰ −１を発現する形質転換宿主細胞から分離精製されるか、又は分泌タンパク質を含有する細胞培養物から精製される。単離されたＡＧＰ−１ポリペプチドはヒトタンパク質や他の細胞構成成分を含まない。安定性の増大、循環時間の延長、又は免疫原性の減少などの更なる利点を有するＡＧＰ−１の化学修飾誘導体も本発明によって提供される（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号を参照）。誘導体化のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択されうる。本発明のポリペプチドは、分子内のランダム位置、又は分子内の予め決めた位置で修飾できるし、１個、２個、３個又はそれ以上の付加された化学部分を含みうる。天然源（例えば、通常ＡＧＰ−１を発現する組織及び細胞系）及びトランスフェクションされた宿主細胞からのＡＧＰ−１の精製方法も本発明に包含される。精製方法では、精製タンパク質を得るために、適切な順序で１種以上の標準的タンパク質精製工程を使用しうる。クロマトグラフィー工程には、イオン交換、ゲル濾過、疎水性相互作用、逆相、クロマトフォーカシング、抗ＡＧＰ−１抗体又はビオチン −ストレプトアビジンアフィニティ複合体を用いるアフィニティクロマトグラフィーなどがある。本発明はまた、ＡＧＰ−１アンタゴニスト及びそれらの獲得方法も包含する。アンタゴニストは、ＡＧＰ−１の生物活性の一つ以上を減少又は除去するであろう。例として、ＡＧＰ−１アンタゴニストは抗炎症剤として作用しうるし、又は骨吸収を阻害するように作用しうる。ＡＧＰ−１アンタゴニストには、正常のリガンド−レセプター相互作用を妨害するように、ＡＧＰ−１又はＡＧＰ−１レセプターに結合する物質、及びＡＧＰ−１の発現を調節する物質が含まれる。ＡＧＰ−１又はＡＧＰ−１レセプターと結合する物質には、タンパク質、ペプチド、炭水化物及び小分子量有機化合物などがある。タンパク質阻害剤の例には、抗ＡＧＰ−１抗体、抗ＡＧＰ−１レセプタ−抗体、及びＡＧＰ−１レセプターの細胞外ドメインの部分又は全部を含むＡＧＰ−１レセプターの可溶型などがある。典型的には、ＡＧＰ−１発現を調節する物質には、ＡＧＰ−１又はＡＧＰ− １レセプターをコードする核酸に相補的であり、発現のアンチセンス調節子として働く核酸が含まれる。ＡＧＰ−１と相互作用する化合物の特定方法も本発明に包含される。該方法は、化合物がＡＧＰ−１と結合可能な条件下、ＡＧＰ−１を化合物とインキュベーションし、結合の程度を測定することを含む。化合物は実質的に精製されうるか、又は粗混合物中に存在しうる。結合化合物は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、又は小分子量有機化合物でありうる。化合物は、ＡＧＰ−１生物活性を増加又は減少させる能力によってキャラクタリゼーションされえ、それ故ＡＧＰ−１アゴニスト又はＡＧＰ−１アンタゴニストとして働きうる。好ましくは、本方法を用いてＡＧＰ−１アンタゴニストを特定する。本発明のＡＧＰ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体も本発明に包含される。抗体は、完全長の膜結合ＡＧＰ−１、可溶性ＡＧＰ−１、又はそれらのペプチドフラグメントによる免疫化で産生されることができ、抗体はポリクローナル又はモノクローナルでありうる。更に、本発明の抗体は組換え、例えばＬ鎖とＨ鎖のマウス定常領域がヒト配列で置き換えられたキメラ抗体、又は相補的決定領域だけがマウス起源であるＣＤＲ移植抗体でありうる。本発明の抗体はまた、ヒト抗体、例えばヒト抗体を産生できるトランスジェニック動物の免疫化によって製造されたヒト抗体でありうる（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１２２２７参照）。抗体は生物サンプル中でＡＧＰ−１を検出するために有用であり、それによってＡＧＰ−１を産生する細胞又は組織の同定が可能となる。更に、ＡＧＰ−１と結合し、レセプター相互作用を防止する抗体はまた、ＡＧＰ−１の効果を阻止するのに有用でありうる。本発明はまた、治療有効量の本発明のＡＧＰ−１ポリペプチドと、医薬として許容できる希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又はアジュバントとを含む医薬製剤を提供する。本発明はまた、治療有効量のＡＧＰ−１アンタゴニストを含む医薬製剤も提供する。“治療有効量”という用語は、特定の状態と投与の特定の経路に関し治療効果を与える量を意味する。製剤は液体形態又は凍結乾燥形態でありえ、種々のｐＨ値とイオン強度を有する希釈剤（トリス緩衝液、酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液）、Tween又はPolysorbateなどの可溶化剤、ヒト血清アルブミン又はゼラチンなどの担体、thimerosal又はベンジルアルコールなどの保存剤、及びアスコルビン酸又はメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤を含む。溶解性、安定性、血漿半減期、及び生物利用性を増大させるために水溶性ポリマーで修飾したＡＧＰ−１を含む製剤も包含される。製剤はまた、拡張した時間にわたって送達の制御のために、ＡＧＰ− １のリポソーム、ミクロエマルション、ミセル又はベシクルへの導入も含む。特定の製剤の選択は、治療する疾患、投与経路及び所望の薬物動態学パラメーターを含む幾つかの因子に依存する。医薬製剤に適した成分のより広範な概説は、Re mington's Pharmaceutical Sciences，18th ed．A.R.Gennaro，ed．Mack，Easto n，PA(1980)に記載されている。本発明の製剤は、皮下、静脈内、もしくは筋肉内の注射、又は経口投与、鼻内投与、肺内投与もしくは直腸投与によって投与できる。最終的に選択される投与経路は幾つかの因子に依存し、当業者が確かめられる。本発明はまた、治療有効量の本発明の核酸と、医薬として許容できるアジュバントとを含む医薬製剤も提供する。核酸製剤は、アンチセンス治療法の一部として細胞及び組織へのＡＧＰ−１コード領域の一部又は全部及び／又は隣接領域の送達に適したものであろう。トランスジェニックマウスでのＡＧＰ−１の肝発現により、好中球とリンパ球の増加を伴う顕著な骨髄造血が起った。それ故、ＡＧＰ−１を用いて、骨髄の細胞数の減少と関連する造血性疾患を治療できる。特に、ＡＧＰ−１を用いて、低白血球細胞レベル、詳細には好中球とリンパ球のレベルの減少が起る状態を治療できる。このような状態は、病気、傷害、又は骨髄レベルを抑制することが知られているある種の環境的化学物質への暴露から起りうる。造血性疾患を治療するために、ＡＧＰ−１は単独で、又は他の因子と組合せて投与できることが理解される。一実施態様では、ＡＧＰ−１は、治療有効量の造血を刺激する因子と組合せて使用される。このような因子には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、顆粒球−マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）などがある。トランスジェニックマウスにおけるＡＧＰ−１の肝発現により、炎症及び壊死の増大、特に肝臓における増大が起った。この効果は、導入遺伝子発現中に肝臓で起る局所高濃度のＡＧＰ −１の結果でありうる。従って、ＡＧＰ−１のアンタゴニストは、炎症性疾患にかかりやすい患者又は炎症性疾患に罹患している患者に投与する抗炎症剤として使用できる。炎症性疾患には、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、全身性及び局所アミロイドーシス、シェーングレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、糸球体腎炎、並びに感染及び寄生虫疾患から起る炎症などがある。炎症を減少させるか取除くＡＧＰ−１アンタゴニストは、単独で、又は治療有効量の、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、又はシクロスポリンＡなどの抗炎症剤と組合せて投与できる。ＡＧＰ−１アンタゴニストはまた炎症性疾患と関連する壊死を減少させるか取除きうる。ＡＧＰ−１はまた、骨マトリックスの無機物化により骨吸収を促進する破骨細胞の刺激に関与する。骨形成速度を超える骨吸収速度の増加により、骨粗鬆症、骨髄炎、高カルシウム血症、手術もしくはステロイド投与によってもたらされた骨減少症、パージェット病、骨壊死、リウマチ性関節炎による骨喪失、歯周骨喪失及び溶骨性転移を含む種々の骨疾患が起りうる。ＡＧＰ−１のアンタゴニストは、破骨細胞活性の増大と骨吸収の増大が原因の疾患に罹患している患者に投与できる。ＡＧＰ−１アンタゴニストは単独で、又はＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１２と命名されている骨形態形成因子、形質転換増殖因子−βとＴＧＦ−βファミリーメンバー、インターロイキン−１インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、傍甲状腺ホルモン、Ｅ系プロスタグランジン、ビスホスホネート及びフッ化物やカルシウムなどの骨増強無機物を含む骨成長促進剤の治療有効量と組合せて投与できる。本発明を更に十分に説明するために、以下の実施例を記載するが、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。実施例１マウス及びヒトＡＧＰ−１遺伝子の同定と分離Ａ．マウスＡＧＰ-１ｃＤＮＡクローニングと解析の材料及び方法は、Sambrookら，Molecular Clon ing:A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(19 89)に記載されている。ｃＤＮＡライブラリーは、Ｃ５７／Ｂ６メスマウスからの５ＦＵ処理骨髄から処理後５日、６日及び７日に分離したｍＲＮＡを用いて構築した。マウスを、３日連続して、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）１日当り１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与で処理した。５ＦＵ処理後５日、６日及び７日に、大腿骨と脛骨の両方を採取し、プラグにＰＢＳをかけた。骨を乳鉢と乳棒で砕き、骨髄プラグと混ぜた。Fast Track mRNAキット（InVitrogen，S an Diego，CA）を用い、製造業者の推奨する方法を使用して、ポリＡ⁺ｍＲＮＡを精製した。Superscriptプラスミドシステム（Gibco BRL，Gaithersburg，MD ）を用い、ランダムプライマーによるｃＤＮＡライブラリーを作製した。第１鎖合成を開始させるために、内部ＮｏｔＩ制限部位を含むランダムｃＤＮＡプライマーを用いたが、それは以下の二本鎖配列を有した。第１鎖ｃＤＮＡ合成反応は、ｍＲＮＡ１μｇとＮｏｔＩランダムプライマー１５０ｎｇを用いて組立てた。第２鎖合成後、反応産物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液で抽出し、エタノール沈殿させた。二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡ産物を以下のｄｓオリゴヌクレオチドアダプター（Gibco BRL）に連結させた。連結後、ｃＤＮＡをＮｏｔＩで完全消化し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１比）で抽出し、エタノール沈殿させた。次いで、Superscriptプラスミドシステム（Gibco BRL）に備わった予め作製されていたカラムを製造業者が推奨するように用いて、再懸濁ｃＤＮＡをゲル濾過でサイズ分画した。最大のｃＤＮＡ産物を含有する分画をエタノール沈殿させ、次いでＮｏｔＩ及びＳａｌＩ消化ｐＭＯＢベクターＤＮＡ（Strathmannら，Science 25 2，802-808(1991)）に直接連結させた。連結されたｃＤＮＡを、エレクトロコンピテントXL1-Blue E.coli（Stratagene，LaJolla，CA）にエレクトロポレーションで導入した。約２０，０００コロニーを拾い上げ、Ｌ−ブロス２００μＬ、７．５％グリセロール、５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む９６ウエルマイクロタイタープレートに並べた。培養液を３７℃で一晩増殖させ、マイクロタイタープレートの対のセットを、滅菌９６ピン複製具を用いて作製し、次いで両方のセットを更なる解析のために−８０℃で保存した。ランダムなマウス５ＦＵ処理骨髄ｃＤＮＡクローンを配列決定するために、配列決定用鋳型を、ベクタープライマーを用いてクローン化ｃＤＮＡ挿入体のＰＣＲ増幅によって作製した。ｃＤＮＡクローンのグリセロール保存液を融解し、小アリコートを蒸留水中に１：２５で希釈した。希釈細菌培養液約３．０μＬを、以下のオリゴヌクレチドを含むＰＣＲ反応混合液（Boehringer-Hannheim）に加えた。反応液を、以下のサイクル条件（９４℃２分；９４℃５秒、５０℃５秒、７２ ℃３分を３０サイクル、次いで最終延長を７２℃４分）で、サーモサイクラー中でインキュベーションした。サーモサイクラー中でインキュベーション後、反応液を水２．０ｍＬで希釈した。増幅ＤＮＡフラグメントを、Centriconカラム（P rinceton Separations）を使用し、製造業者の推奨方法で更に精製した。幾つかの場合に、低濃度のプライマーとデオキシヌクレオシド三リン酸を増幅反応液で用いたが、それらの場合には、Centricon精製は必要ではなかった。Applied Bio systems 373A自動ＤＮＡ配列決定機で、Ｔ３プライマーとTaq dye-terminator reactions（Applied Biosystems）を、製造業者が推奨する方法に従って用い、ＰＣＲ反応産物の配列決定をした。無作為に拾い上げたｃＤＮＡクローンから得られた５’ヌクレオチド配列を翻訳し、次いでＦＡＳＴＡプログラムの改変版を用い、既知タンパク質配列の現存データベース（Pearsonら，Meth.Enzymol．183,63-98(1990)）と比較した。翻訳配列はまた、Luethyら（Protein Science 3,139-146(1994)によって改良されたG ribskovら（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 83，4355-4359(1987)）の配列プロフィール法を用いて、腫瘍壊死因子スーパーファミリーの特異的モチーフの存在についても解析した。ＦＡＳＴＡ及びプロフィールサーチデータを用い、ｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ１と命名したＥＳＴを、ＴＮＦファミリーの新規メンバーの可能性のあるものとして同定した。ｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ１クローンは、約９０個のアミノ酸の読取り枠を有する８６４ｂｐの挿入体を含んでおり、ブタリンホトキシン−α前駆体(ＴＮＦ −β)とウサギ腫瘍壊死因子前駆体（ＴＮＦ−α）（カケクチン）と有意の相同性を有することが見出された。比較した領域では、ＴＮＦ−βと６３個のアミノ酸の重複及び２７％の相同性、並びにＴＮＦ−αとは７１個のアミノ酸の重複及び３０％の相同性を示した。ＴＮＦファミリープロフィールを用いるプロフィール解析により、ｚ値１３．５が得られ、ｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ１クローンはＴＮＦファミリーの新規メンバーの可能性のあるものをコードしていることを示した。完全長クローンを得るために、内部ＥＳＴデータベースを重なり合うクローンについて検索し、他の２種のマウスＥＳＴクローンを同定した。マウス放射線照射小腸ライブラリーからのｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ２と命名した一つのＥＳＴクローンは、ｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ１クローンから得られた配列と重なり合う配列であった。次いで、ｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ２クローンを完全に配列決定した。挿入体は３０４８ｂｐであり、２９１個のアミノ酸からなる読取り枠を含んでおり、それは、完全長ＡＧＰ−１配列であると推定された。マウスＡＧＰ−１のヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列を図１に示す。Ｂ．ヒトＡＧＰ−１約９時間、ＰＭＡ２０ｎＭで刺激したヒト膀胱癌細胞系５６３７からのＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーに関し、ＲＮＡの膜結合ポリソーム分画からｍＲＮＡを分離した（Mechler，Methods in Enzymo logy 152， 241-248(1987)）。Fast Track mRNA分離キット（InVitrogen）を用い、製造業者が推奨する方法に従い、全ＲＮＡ調製物からポリＡ⁺ｍＲＮＡ分画を分離した。本質的に、上記５−ＦＵマウス骨髄ライブラリーについて記載したように、ダイレクショナルランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーを作製した。マウスｃＤＮＡクローンについて上記のように、ｃＤＮＡ挿入体の配列決定を行った。無作為に拾い上げたｃＤＮＡクローンから得られた５’ヌクレオチド配列を翻訳し、次いでＦＡＳＴＡプログラムの改変版を用い、既知タンパク質配列の現存データベース（Pearsonら，同上）と比較した。翻訳配列はまた、Luethyら（同上）によって改良されたGribskovら（同上）の配列プロフィール法を用いて、腫瘍壊死因子スーパーファミリーで見出された特異的モチーフの存在についても解析した。ＦＡＳＴＡ及びプロフィールサーチデータを用い、ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ１と命名した５６３７細胞系ｃＤＮＡからのＥＳＴを、ＴＮＦファミリーの新規メンバーの可能性のあるものとして同定した。ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ１クローンは、約８４個のアミノ酸の読取り枠を有する４４６ｂｐの挿入体を含んでいた。ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ１ヌクレオチド配列の翻訳により、ＦＡＳＴＡ解析を用い比較したときに、マウスＡＧＰ−１の演繹アミノ酸配列と７７％同一のアミノ酸配列が得られた。この高度の配列類似度により、ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ１はマウスＡＧＰ−１のヒト相同体であると同定される。完全長クローンを得るために、内部ＥＳＴデータベースを重なり合うクローンについて検索し、他の１種のマウスＥＳＴクローンを同定した。ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ２と命名したこのクローンは、ヒト末梢血巨核球ｃＤＮＡライブラリーからのものであり、ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ１クローンと重なり合う１０２８ｂｐの挿入体を有した。重なり合うクローンは２８１個のアミノ酸からなる読取り枠を有した。完全長ヒトＡＧＰ−１は、ｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ１とｈｕＡＧＰ−ＥＳＴ２クローンからの配列の合成体として得られた。ヒトＡＧＰ−１のヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列を図２に示す。実施例２トランスジェニックマウスでのＡＧＰ-1の発現Ａ．ＰＣＲ及びサブクローニングＡＰＯＥ肝特異的発現ベクター（Simonetら,J.Clin.Invest.94,1310-1319(199 4)及びＰＣＴ出願ＷＯ９４／１１６７５）にサブクローニングするために、ＴＮＦα関連クローンｍｕＡＧＰ−ＥＳＴ２を用いてコード領域をＰＣＲ増幅させた。増幅のために用いたオリゴヌクレオチドは、であった。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、次いで９４℃２０秒、６３℃３０秒、７４℃１分が２５サイクルであった。ＰＣＲ反応液は、全体積５０μＬで、１×ＰＦＵ緩衝液、５０μＭｄＮＴＰ、各オリゴ２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡ鋳型１０ｎｇ及びＰＦＵ酵素２．５ユニットを含んでいた。増幅後、サンプルをQiagen PCRカラムで精製し、ＳｐｅＩとＮｏｔＩ制限酵素で一晩消化した。消化産物を抽出し、沈殿させ、ＡｐｏＥプロモーター発現ベクターにサブクローニングした。連結体でE.coli株ＤＨ５αを形質転換し、コロニーを挿入体解析のために微量調製した。所望のサイズの挿入体を含有する２つのコロニーをＴＢ培養液１００ｍＬ中で増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した。挿入体の真正さを確認するために２つのクローンを配列決定した。微量注入のために一つを選択し、トランスジェニックマウスを作出した。この導入遺伝子をＨＥ−ＡＧＰと命名した。Ｂ．トランスジェニックマウスの作出微量注入のために、ＨＥ−ＡＧＰプラスミドをＣｓＣｌで２回精製した。プラスミドをＸｈｏＩとＡｓｅＩで消化し、３．４ｋｂ導入遺伝子挿入体を、ＮＡ４５ペーパーへの電気泳動により、０．８％ＢＲＬ ultrapure ＤＮＡアガロースゲルで精製した。精製フラグメントを、５ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４，０．２ｍＭＥＤＴＡ中に１μｇ／ｍＬに希釈した。注入針を使用前に斜めに切り、シリコーン被覆したことを除いて、本質的に記載された（Brinsterら，1985）ように、ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウスからの単細胞胚に注入した。胚をＣＯ₂インキュベーター中で一晩培養し、１５〜２０個の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１メスマウスの卵管に移した。Ｃ．トランスジェニック創始動物のスクリーニング妊娠期間後、微量注入胚の移植から１０５匹の子が得られた。耳と尾の生検から調製したＤＮＡでＨＥ−ＡＧＰ導入遺伝子をスクリーニングすることにより、１０５匹の子のうち、１７匹がトランスジェニック創始動物として同定された。ＰＣＲスクリーニングは、発現べクターに含まれるヒトＡｐｏＥイントロンの３６９ｂｐ領域の増幅を含んでいた。ＰＣＲ増幅に用いたオリゴは、であった。ＰＣＲの条件は、９４℃２分、次いで９４℃１分、６３℃２０秒、７２℃３０秒が３０サイクルであった。ＰＣＲ反応液は、全体積５０μＬで、１×Ｔａｑ緩衝液、１００μＭ各ｄＮＴＰ、各オリゴ２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡ鋳型抽出液１μＬ及びｔａｑ酵素０．５ユニットを含んでいた。Ｄ．ノーザン解析のための全ＲＮＡの調製と解析８〜１０週齢で、１７匹のトランスジェニック動物のうち８匹（＃１０、２７、５２、５３、６９、７２、７６、７７）と４匹の対照同腹子マウス（＃５５、５６、５７、５８）を検死と病理学的解析のために殺した（実施例３参照）。残りの９匹の創始動物（番号２５、４２、４４、４５、４８、５０、６７、７４、７５）から部分肝切除によって肝臓を分離した。部分肝切除のために、マウスをアベルチンで麻酔し、肝の一葉を手術で取出した。記載されたように（McDonaldら，(1987)）、全てのトランスジェニック創始動物と５匹の陰性対照同腹子マウスの肝臓から全細胞ＲＮＡを分離した。導入遺伝子発現のレベルを評価する為に、これらのサンプルでノーザンブロット解析を行った。各動物肝臓からの全ＲＮＡ約１０μｇを、電気泳動変性ゲル（Ogden ら(1987)）で分離し、次いでＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロン膜（Amersham）に移し、³² ＰｄＣＴＰ標識ｐＢ１．１挿入体ＤＮＡをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝液１ｍＬ当り、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５×Denhardt液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ及び標識プローブ２〜４×１０⁶ｃｐｍ中で、４２℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で、各５分間、２度、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で各５〜１０分間、２度洗浄した。オートラジオグラフィー後、創始動物と対照同腹子マウスで導入遺伝子の発現を測定した。ノーザンブロットデータによると、トランスジェニック創始動物の１３匹は検出できるレベルの導入遺伝子ｍＲＮＡを発現する（動物＃１０、４２、４４、４５、４８、５０、５２、５３、６７、６９、７５、７６）。陰性対照マウスは導入遺伝子関連ｍＲＮＡを発現しなかった。検死した群からの最高発現創始動物は＃５２、６９、７６であった。創始動物の残りからの最高発現動物は＃４２、４５、６７、７５であった。次いで、更なる解析のためにＦ１子を作出するために、肝切除で解析した創始動物のうち６匹を交配させた。実施例３ＡＧＰ−１発現トランスジェニックマウスの病理学的解析Ａ．検死２種の別の研究でマウスを試験した。第１の研究では、アポリポプロテインＥプロモーターにより肝臓を標的としたマウスＡＧＰ−１分子に関し創始トランスジェニック動物である５匹のＢＤＦ１メスマウス及び４匹のオスの非トランスジェニック同腹子マウスを表現形質解析について検死を行った。第２の研究では、アポリポプロテインＥプロモーターにより肝臓を標的としたマウスＡＧＰ−１分子に関しＦ１トランスジェニック動物である１２匹のＢＤＦ１マウス（９匹のメスと３匹のオス）及び４匹のメスの非トランスジェニック同腹子マウスを表現形質解析について検死を行った。両方の研究で、全てのマウスに、取得する１時間前にＢｒｄＵを注射し、そして殺害した。体重、並びに肝臓、脾臓、腎臓、胃、及び胸腺の重さを計り、血液を血液学と血清化学のために採り、肝臓、脾臓、肺、脳、心臓、腎臓、副腎、胃、小腸、膵臓、盲腸、結腸、胸間膜リンパ節、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺、傍甲状腺、唾液線、膀胱、卵巣もしくは精巣、子宮もしくは精嚢、骨、及び骨髄を、組織学的解析とＢｒｄＵ標識のために取得し、試験した。Ｂ．組織学及び組織化学ＡＧＰ−１トランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウスからの肝臓、脾臓、肺、脳、心臓、腎臓、副腎、胃、小腸、膵臓、盲腸、結腸、腸間膜リンパ節、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺、傍甲状腺、唾液線、膀胱、卵巣もしくは精巣、子宮もしくは精嚢、骨、及び骨髄の切片を、通常の組織学的検査のために、１０％中性緩衝化亜鉛ホルマリン（Anatech，Battle Creek，Michi gan）中で一晩固定化し、パラフィンに埋め込み、３μｍに切片化し、ヘマトキシリンとエオシン（H & E)で染色した。更に、骨髄スペースでの骨梁の廻りの破骨細胞を強調するために、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に関し骨切片を染色した。Ｃ．免疫組織化学自動TechMate Immunostainer（Biotek Solutions，Santa Barbara，CA）を使用して、厚さ４μｍのパラフィンに埋め込まれた切片で、免疫組織化学染色を行った。ＢｒｄＵ免疫染色のために、最初に切片を０．１％プロテアーゼ（Sigma Chemical，st.Louis，MO）で消化し、次いで２ＮＨＣｌを加えた。ＢｒｄＵ（ Accurate Chemical，Westbury，NY）に対するラットモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、次いでビオチニル化抗ウサギ／抗マウス２次カクテル（BioTek）及びアルカリ性ホスファターゼと結合したＡＢＣ３次抗体（BioTek）でＢｒｄＵを検出した。染色反応は、BioTek Red chromagen（BioTek）で可視化した。ミエロペルオキシダーゼ免疫染色のために、ヒトミエロペルオキシダーゼに対するウサギポリクローナル抗血清（Dako， Carpinteria，CA）、次いでビオチニル化抗ウサギ／抗マウス２次カクテル（Bio Tek）及び西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）３次抗体で、切片を染色した。染色反応はジアミノベンジジン（DAB，S igma）で可視化した。Ｄ．全体の病理学的知見２匹のトランスジェニック創始マウス（＃６９及び７６）と２匹のＦ１トランスジェニックマウス（＃７５−１３及び７５−１８）からの肝臓は、サイズと重量で有意に増大し（［体重の８．４２±１．２６ＳＤ％］対［非トランスジェニック対照マウスでは体重の５．３３±０．８９ＳＤ％］）、淡緑−黄褐色で、正常よりもろかった。これらの４匹はまた、脾臓重量でも有意の増加を有した（［体重の１．１４±０．１２ＳＤ％］対［非トランスジェニック対照マウスでは体重の０．４１±０．０９ＳＤ％］）。これらの結果を表１に要約する。Ｅ．臨床上の病理学的知見増大した肝臓を有する４匹のトランスジェニックマウス（創始マウス＃６９及び７６、並びにＦ１＃７５−１３及び７５−１８）は、総血清ビリルビンレベル及びアルカリ性ホスファターレベルで顕著で有意の増加を有し、肝トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））レベルで中程度だが有意の増加を有した。４匹のトランスジェニックマウスは平均の総ビリルビンレベル４．３３±５．３２ＳＤｍｇ／ｄＬを有したが、非トランスジェニック対照マウスは平均の総ビリルビンレベル０．１６±０．０５ＳＤｍｇ／ｄＬを有した。これらの４匹のトランスジェニックマウスの平均の血清アルカリ性ホスファターゼレベルは、［９９４．５±３５３．１ＳＤＩＵ／Ｌ］対［非トランスジェニック対照マウスでの１６５．３±５３．２ＳＤＩＵ／Ｌ］であった。これらの４匹のトランスジェニックマウスの平均のＡＬＴレベルは、［２４７．３±８９．８ＳＤＩＵ／Ｌ］対［非トランスジェニック対照マウスでの７８．１±４３．２ＳＤＩＵ／Ｌ］であるが、これらの４匹のトランスジェニックマウスの平均のＡＳＴレベルは、［３５０．５± １３５．６ＳＤＩＵ／Ｌ］対［非トランスジェニック対照マウスでの１３２．５±８４．９ＳＤＩＵ／Ｌ］であった。これらの結果の全てを表１に要約する。Ｆ．組織病理学的知見１７匹のＨＥ-ＡＧＰ-1トランスジェニックと８匹の非トランスジェニック対照同腹子マウスからの肝臓、脾臓、肺、脳、心臓、腎臓、副腎、胃、小腸、膵臓、盲腸、結腸、腸間膜リンパ節、皮膚、乳腺、気管、食道、甲状腺、傍甲状腺、唾液線、膀胱、卵巣もしくは精巣、子宮もしくは精嚢、骨、及び骨髄のＨ＆Ｅ及びＢｒｄＵ染色切片を検査した。全てのマウスからの脾臓と骨髄のミエロペルオキシダーゼ染色切片及び骨の酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色切片も検査した。トランスジェニックマウスの主要な組織学的変化は、トランスジェニックマウス＃６９と７６（創始マウス）及び＃７５−１３と７５−１８（Ｆ１）において、顕著な門脈周囲の炎症と胆管過形成、及び肝細胞壊死の癒合部位の散在する病巣であった（図３）。これらのトランスジェニックマウスの４匹の全てはまた、主に赤脾髄造血の増大による脾臓の増大、程度はより小さいがリンパ球様過形成を有した（図４）。これらの４匹のトランスジェニックマウスはまた、非トランスジェニック対照マウスと比較して、末梢骨髄の骨梁に沿って並んでいるＴＲＡＰ陽性破骨細胞の数の増大を有するようであった（図５）。トランスジェニックマウスはまた、血管内好中球の増加、及び小さな萎縮性／発育不全の子宮を示した（トランスジェニック創始マウス＃６９と７６のみ）。２匹のトランスジェニック創始マウス（＃６９と７６）はまた腹膜の混合型炎症性細胞湿潤をも示した。Ｇ．ＡＧＰ−１を過剰発現しているトランスジェニックマウスでの病理学的知見の要約４匹のＨＥ−ＡＧＰ−１トランスジェニックマウス（創始マウス＃６９と７６及びＦ１＃７５−１３と７５−１８）は比較的重度の表現形質の変化、特に肝臓における変化を有したが、肝臓では顕著な胆管肝炎、胆管過形成及び肝壊死があった。これらの４匹のトランスジェニックマウスでのこれらの肝の組織学的異常を伴うことは、総血清ビリルビンとアルカリ性ホスファターゼの顕著な上昇及び血清トランスアミナーゼの中程度の上昇を示す肝機能不全の兆候であった。肝臓での知見に加えて、これらの４匹のトランスジェニックマウスは、骨髄造血の増大及び顕著さは小さいが循環血小板の増加も示した。創始マウス＃６９は循環好中球を有したが、全てのトランスジェニックマウスは循環リンパ球の中程度の増加を有した。腹膜の炎症の兆候も、顕著な肝炎症と共に、２匹の創始トランスジェニックマウスで見られた。他のＨＥＡＧＰ創始トランスジェニックマウスの２匹、＃５２と５３も、軽い胆管肝炎の兆候を有し、骨髄造血と好中球の小ないし中程度の増加を示し、このことは、これらの２匹のマウスは、創始マウス＃６９と７６よりも低レベルでトランスジェニックＡＧＰ−１タンパク質を産生していることを示唆した。肝臓での知見に加えて、トランスジェニックマウスの少なくとも４匹は、脾髄造血の顕著な増加と中程度のリンパ球様過形成及び骨髄の骨梁に沿って並んでいるＴＲＡＰ＋破骨細胞の明らかな増加を示した。これらの知見の全ては、ＡＧＰタンパク質は、炎症、骨髄造血、及び骨吸収（破骨）に役割をもつことを示唆する。表１ＨＥ−ＡＧＰ−１トランスジェニックマウスにおける選択した器官の重量及び血清の化学

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 29/00 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ０７Ｋ 14/525 16/24 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/566 33/566 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者シモネツト，ウイリアム・エスアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、サウザンド・オークス、ウオータータウン・コート・2293 (72)発明者ダニレンコ，デイミイトリー・エムアメリカ合衆国、カリフオルニア・93012、カマリロ・ビスタ・コート・13082

Claims

【特許請求の範囲】１．ＡＧＰ−１の生物活性の少なくとも一つを含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、ａ）図１（配列番号１）又は図２（配列番号３）に示される核酸；ｂ）図１（配列番号１）又は図２（配列番号３）に示される核酸のボリペプチドコード領域にハイブリダイズし、高ストリンジェンシィ条件下該核酸とハイブリダイズしたままである核酸；及びｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に縮重している核酸；からなる群から選択されることを特徴とする該核酸。２．ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。３．請求項１に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。４．大腸菌（Escherichia coli)のために好適な１個以上のコドンを含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸。５．結合した検出可能標識を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸。６．図２（配列番号３）に記載のポリペプチドコード領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸。７．配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸。８．請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。９．核酸は、図１（配列番号１）又は図２（配列番号３）に示されるポリペプチドコード領域を含むことを特徴とする請求項８に記載の発現ベクター。１０．請求項８に記載の発現ベクターで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。１１．真核細胞又は原核細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の宿主細胞。１２．大腸菌であることを特徴とする請求項１１に記載の宿主細胞。１３．ＡＧＰ−１の製造方法であって、適切な栄養条件下、請求項１に記載の核酸で形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を増殖させ、該核酸の発現のポリペプチド産物を単離することを特徴とする該方法。１４．請求項１３に記載の方法で製造されたポリペプチド。１５．精製単離されたＡＧＰ−１ポリペプチド。１６．哺乳動物ＡＧＰ−１であることを特徴とする請求項１５に記載のポリペプチド。１７．図２（配列番号３）に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１５に記載のポリペプチド。１８．水溶性ポリマーで共有結合修飾されたことを特徴とする請求項１７に記載のポリペプチド。１９．ポリマーはポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１８に記載のポリペプチド。２０．ＡＧＰ−１に特異的に結合する抗体又はそのフラグメント。２１．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２０に記載の抗体。２２．生物サンプル中のＡＧＰ−１の存在の検出方法であって、抗体とＡＧＰ −１の結合を可能とする条件下、サンプルを請求項２０に記載の抗体とインキュベーションし、結合した抗体を検出することを特徴とする該方法。２３．候補化合物がＡＧＰ−１と結合する能力の評価方法であって、結合を可能とする条件下、ＡＧＰ−１と候補化合物をインキュベーションし、結合した化合物を測定することを特徴とする該方法。２４．化合物はＡＧＰ−１のアンタゴニストであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。２５．動物におけるＡＧＰ−１の発現の調節方法であって、図１（配列番号１）又は図２（配列番号３）に示される核酸に相補的な核酸を該動物に投与することを特徴とする該方法。２６．医薬として許容できる担体、アジュバント、可溶化剤、安定化剤及び／又は抗酸化剤中に、治療有効量のＡＧＰ−１を含む医薬製剤。２７．ＡＧＰ−１はヒトＡＧＰ−１であることを特徴とする請求項２６に記載の製剤。２８．治療有効量のＡＧＰ−１アンタゴニストを投与することを特徴とする炎症性疾患の治療方法。２９．コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、及びシクロスポリンからなる群から選択される、治療有効量の抗炎症剤を投与することを更に含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。３０．治療有効量のＡＧＰ−１を投与することを特徴とする造血性疾患の治療方法。３１．ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−３及びＩＬ−６からなる群から選択される、治療有効量の造血因子を投与することを更に含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。３２．治療有効量のＡＧＰ−１アンタゴニストを投与することを特徴とする骨疾患の治療方法。３３．骨形態形成因子ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１２、ＴＧＦ−βファミリーメンバー、ＩＬ−１インヒビター、ＴＮＦαインヒビター、副甲状腺ホルモン、Ｅ系プロスタグランジン、ビスホスホネート及び骨増強無機物からなる群から選択される、治療有効量の骨成長因子を投与することを更に含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。