DE60129010T2

DE60129010T2 - Ligand des zelleintritt-vermittelnden proteins von herpes simplex und methoden zu dessen verwendungen

Info

Publication number: DE60129010T2
Application number: DE60129010T
Authority: DE
Inventors: Carl F. San Diego WARE
Original assignee: La Jolla Institute for Allergy and Immunology
Current assignee: La Jolla Institute for Allergy and Immunology
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: CA2406132C; PT1674575E; ATE483807T1; CY1111293T1; DK1674575T3; EP1274840A2; EP1674575A2; EP1274840B1; ES2352742T3; CA2406132A1; EP1674575A3; DE60143231D1; AU5338701A; EP1674575B1; ATE365214T1; DE60129010D1; JP2003531152A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein Verbindungen und Verfahren, die bei der Regulierung von Immunantworten und viralen Infektionen nützlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Herpes-simplex-Viren (HSV) des Typs 1 und 2 verursachen wiederkehrende Infektionen, die in ihren Schwere von gutartig bis schwerwiegend reichen. HSV taucht aus einem latenten Zustand in den Neuronen auf, um die Haut und andere Gewebe in Gegenwart eines kompetenten zellulären Immunsystems zu infizieren. Das Glycoprotein D (gD) des HSV, ein transmembranes Protein, das in der Hülle des Virions lokalisiert ist, initiiert die Infektion, indem es an zelluläre Rezeptoren bindet (Seear et al. (1993) Viral Fusion Mechanisms, Hrsg. Bentz, CRC Press, Boca Raton). Vor kurzem wurde ein zelluläres Protein identifiziert, das von dem HSV für die Infektion benutzt wird, und es wurde als HSV-(Zell)eintritts-Vermittler (HSV entry mediator, HVEM) bezeichnet (Montgomery (1996) Cell 87:427). HVEM ist ein transmembranes Protein des Typs 1 mit einer Cystein-reichen extrazellulären Domäne, die eine signifikante Homologie zu Rezeptoren für Cytokine aufweist, die mit dem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) verwandet sind (Smith et al., (1994) Cell 76:959; Ware et al. (1995) in: Pathways of Cytolysis, Hrsg. Griffiths und Tschopp, Springer-Verlag, Basel). Viele der Mitglieder der TNF-Superfamilie initiieren eine Reihe von zellulären Antwortreaktionen, die benötigt werden, um wirksame Entzündungs- und Immunantwort-Reaktionen zu bewirken.
Der TNF ist ein transmembranes Protein des Typs 2 (Pennica (1984) Nature 312:724), das proteolytisch gespalten wird, um das sekretierte Protein zu bilden (Black (1997) Nature 385:729), wohingegen LTα keine transmembrane Domäne besitzt (Gray (1984) Nature 312:721) und ausschließlich als Homotrimer sekretiert wird (in dieser Form ist es auch als TNFβ bekannt). Wenn es als Oberflächen-Protein exprimiert wird, ist LTα mit einem 33 kDa-Protein assoziiert (Androlewicz (1992) J. Biol. Chem. 267:2542), das als LTβ bezeichnet wird (Browning (1993) Cell 72:847) und bei dem es sich ebenfalls um ein transmembranes Glycoprotein des Typs 2 handelt; dies erfolgt in Form von Heterotrimeren mit den Untereinheiten-Verhältnissen α1β2 und α2β1 (Androlewicz (1992) vorstehend; Browning (1996) J. Biol. Chem. 271:8618). Beide, LTα und der TNF, binden und übertragen Signale mittels zweier Rezeptoren, dem 55-60 kDa-TNF-Rezeptor (TNFR60; CD120a oder Typ 1) (Schall (1990) Cell 61:361; Loetscher (1990) Cell 61:351) und dem 75-80 kDa-TNFR (TNFR80; Typ 2 oder CD120b) (Smith (1990) Science 248:1019). Im Gegensatz dazu wird der LTα1β2-Oberflächen-Komplex spezifisch durch den LTβ-Rezeptor (LTβR) erkannt (Crowe (1994) Science 264:707), der weder LTα noch den TNF bindet (Crowe (1994) vorstehend), wohingegen beide TNFR das LTα2β1-Heterotrimer binden (Crowe (1994) vorstehend; Browning (1995) J. Immunol. 154:33).
Gen-Deletionen des LTα- und des LTβ-Gens in Mäusen haben Funktionen für diese beiden Gene bei der Entwicklung von Lymphknoten und der Peyer-Plaques offenbart (De Togni (1994) Science 264:703; Banks (1995) J. Immunol. 155:1685), und neben dem TNF und dem TNFR60 gibt es ebenfalls entscheidende Cytokine, die die Bildung der Keimzentren und die Umschaltung der Immunglobulin-Isotypen (z. B. die Produktion von IgA) im Verlauf von Immun-Antwortreaktionen bei Erwachsenen kontrollieren (Matsumoto (1996) Science 271:1289; Mariathasan (1995) J. Inflammation 45:72). Die meisten Untersuchungen deuteten auf LTα1β2/LTβR als entscheidendes Cytokin-Rezeptor-System hin, das diese Funktionen kontrolliert (Crowe (1994) Science 264:707; Koni (1997) Immunity 5:491; Ettinger (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13102; Rennert (1996) J. Exp. Med. 184:1999).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Ausführungsformen, wie sie in den Ansprüchen definiert werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung eines endogenen Polypeptids, das als Ligand für den HVEM fungiert, von dem bislang nur bekannt war, dass es an gD des HSV bindet. Dieser an HVEM bindende Ligand, der auch als p30 oder als LIGHT bezeichnet wird, wird bereitgestellt, sowie Nucleinsäuresequenzen, die p30 codieren, und Antikörper, die an p30 binden. Die Erfindung beschreibt ebenfalls Verfahren für die Identifizierung von Verbindungen, die eine virale Infektion modulieren, wie z. B. eine Herpesvirus- (z. B. CMV oder HSV) Infektion, und Verfahren für die Modulierung von Lymphzellen-Antwortreaktionen. Daher sind die hierin beschriebenen Verfahren nützlich für die Behandlung von Individuen mit Autoimmun-Erkrankungen, Bösartigkeiten des Lymphsystems und viralen Infektionen, die mit den Herpesviridae assoziiert sind, einschließlich zum Beispiel Herpesvirus- und Cytomegalievirus-Infektionen.
Die Beschreibung beinhaltet einen Testansatz für die Identifizierung einer Verbindung, die eine zelluläre Antwortreaktion beeinflusst, welche durch ein an den HVEM bindendes Agens vermittelt wird. Im Rahmen der Erfindung befindet sich ebenfalls ein Testansatz für die Identifizierung einer Verbindung, die eine zelluläre Antwortreaktion beeinflusst, die durch den LTβR-p30-Komplex vermittelt wird.
Die vorliegende Beschreibung stellt ein Verfahren für die Hemmung einer entzündlichen Störung in einem Individuum bereit, dies erfolgt, indem das Individuum mit einer wirksam hemmenden Menge eines Agens in Kontakt gebracht wird, das die Wechselwirkung von p30 (LIGHT) mit seinem Rezeptor verhindert. Bei dem Individuum, dem Gewebe oder der Zelle, welche bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann es sich um jede(s) beliebige Individuum, Gewebe oder Zelle handeln, einschließlich einer Säuger-Species, aber bevorzugt handelt es sich um einen Menschen. Die Agenzien können in vivo, ex vivo oder in vitro in Abhängigkeit von der Quelle (z. B. gesamter Organismus, Gewebe oder Zelle) verabreicht werden. Für eine in vivo-Verabreichung oder für das Inkontaktbringen kann die Anlieferung durch systemische Verfahren oder örtlich erfolgen. Bei dem Agens kann es sich um jedes beliebige Agens handeln, das die Wechselwirkung von p30 mit seinem Rezeptor verhindert. Beispiele für solche Agenzien umfassen Antikörper (z. B. Anti-p30-Antikörper), Peptidmimetika, Polypeptide und Fragmente des HVEM der Erfindung.
Die vorliegende Beschreibung stellt ein Fusionspolypeptid bereit, das ein HVEM-Polypeptid oder ein Fragment davon umfasst, welches mit einem Polypeptid von Interesse funktionell verknüpft ist. Das HVEM-Polypeptid kann die Aminosäuren 1 bis SER205 des HVEM umfassen und das Polypeptid von Interesse kann die Fc-Region eines Antikörpers umfassen.
Die vorliegende Beschreibung stellt eine Polynucleotidsequenz bereit, die das Fusionspolypeptid codiert, welches ein HVEM-Polypeptid oder ein Fragment davon umfasst und welches mit einem Polypeptid von Interesse funktionell verknüpft ist.
Die vorliegende Beschreibung stellt einen Vektor bereit, der die Polynucleotidsequenz enthält, welche das HVEM-Fusionspolypeptid codiert.
Die vorliegende Beschreibung stellt ein Arzneimittel bereit, welches das Fusionspolypeptid und/oder Polynucleotide sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die Beschreibung beschreibt ein isoliertes oder rekombinantes homotrimeres p30-Polypeptid, das ein monomeres Polypeptid umfasst, welches ein scheinbares Molekulargewicht (MW) von etwa 30 Kilodalton (kDa) besitzt, wobei das homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an ein Lymphotoxin-Rezeptor-(LTR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet. Das isolierte oder das rekombinante homotrimere p30-Polypeptid umfasst Isomere, die pl-Werte von etwa 7 bis etwa 8,5 aufweisen.
Die Beschreibung beschreibt ein lösliches, isoliertes oder ein rekombinantes homotrimeres p30-Polypeptid, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet.
Die Beschreibung beschreibt ein Fusionsprotein, welches das p30-Polypeptid und eine heterologe Sequenz umfasst. Die heterologe Sequenz ist eine Markierungssequenz oder eine andere nachweisbare Einheit.
Die Beschreibung beschreibt ein Liposom, das ein p30-Polypeptid, einschließlich eines homotrimeren p30-Polypeptids, eines löslichen homotrimeren p30-Polypeptid, dem eine transmembrane Domäne fehlt, eines Fusionsproteins oder einer Kombination davon, umfasst.
Die Beschreibung beschreibt ein Arzneimittel, das ein p30-Polypeptid, einschließlich eines homotrimeren p30-Polypeptids, eines löslichen homotrimeren p30-Polypeptid, dem eine transmembrane Domäne fehlt, eines Fusionsproteins, oder ein Liposom oder eine Kombination davon sowie einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfasst.
Ebenfalls beschrieben wird ein Kit, der ein Arzneimittel und eine Beschreibung umfasst, wobei das Arzneimittel ein p30-Polypeptid umfasst und wobei das p30-Polypeptid ein homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, welches ein monomeres Polypeptid umfasst, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, wobei das homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an ein Lymphotoxin-Rezeptor-(LTR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, oder ein lösliches homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das lösliche homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfasst, und wobei die Beschreibung Anweisungen für die Anwendung des Arzneimittels umfasst, wobei eine Anwendung die Hemmung des Eintritts des Virus in eine Zelle oder die Hemmung der Proliferation des Virus in der Zelle umfasst. Die Anweisungen können die Verwendung des Arzneimittels für die Hemmung des Eintritts des Virus in eine Zelle oder die Hemmung der Proliferation des Virus in der Zelle in vivo umfassen. Bei dem gehemmten Virus handelt es sich um ein Herpesvirus, ein Herpes-simplex-Virus (HSV), ein Cytomegalievirus (CMV), ein γ-Herpesvirus oder ein Epstein-Barr-Virus (EBV). Die Hemmung des Viruseintritts oder der Virusproliferation in der Zelle kann in einem Säuger, einschließlich des Menschen, erfolgen.
Die Beschreibung beschreibt einen Kit, der ein Arzneimittel und eine Beschreibung umfasst, wobei das Arzneimittel ein p30-Polypeptid umfasst und wobei das p30-Polypeptid ein homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, welches ein monomeres Polypeptid umfasst, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, wobei das homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an ein Lymphotoxin-Rezeptor-(LTR)-Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, oder ein lösliches homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das lösliche homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfasst, und wobei die Beschreibung Anweisungen für die Anwendung des Arzneimittels umfasst, wobei eine Anwendung die Modulierung von Erkrankungen mit einer unerwünschten Lymphocyten-Proliferation umfasst. Alternativ umfassen die Anweisungen die Verwendung des Arzneimittels für die Modulierung eines T- oder eines B-Zellen-Lymphoms oder einer Leukämie oder einer Autoimmunkrankheit. Bei der Autoimmunkrankheit kann es sich um rheumatoide Arthritis, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematodes oder um Myasthenia gravis handeln.
Die Beschreibung beschreibt ein Arzneimittel, das einen Expressionsvektor umfasst, der ein p30-Polypeptid codiert, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, oder der ein p30-Polypeptid codiert, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das p30-Polypeptid ein homotrimeres Polypeptid bildet, das an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet.
Die Beschreibung beschreibt einen Kit, der ein Arzneimittel und eine Beschreibung, wobei das Arzneimittel einen Expressionsvektor umfasst, der ein p30-Polypeptid codiert, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, oder der ein p30-Polypeptid codiert, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das p30-Polypeptid ein homotrimeres Polypeptid bildet, das an das Herpesvirus- Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor(LTβR)-Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfasst, und wobei die Beschreibung Anweisungen für die Verwendung des Arzneimittels umfasst, wobei eine Anwendung die gezielte Anlieferung an Tumorzellen oder an aktivierte Lymphocyten umfasst. Die Verwendung umfasst auch die Behandlung eines Tumors durch direkte Injektion des Arzneimittels in den Tumor.
Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren für die Induktion eines die Proliferation induzierenden Signals in einer Lymphzelle, umfassend (a) die Bereitstellung einer Zusammensetzung, die an den auf der Zelloberfläche exprimierten HVEM bindet, und (b) das Inkontaktbringen der Lymphzelle mit einer die Proliferation induzierenden Menge der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung umfasst einen Anti-HVEM-Antikörper oder ein Polypeptid, das eine Anti-HVEM-Antikörper-Bindestelle besitzt. Die Bereitstellung einer Zusammensetzung, die an den auf der Zelloberfläche exprimierten HVEM bindet, umfasst alternativ die Bereitstellung einer Zusammensetzung, die ein p30-Polypeptid, ein lösliches p30-Polypeptid, ein mit Liposomen assoziiertes p30-Polypeptid umfasst, oder die einen Vektor umfasst, der ein p30-Polypeptid codiert, oder die eine Zelle umfasst, die ein rekombinantes p30 in Form eines Zell-assoziierten p30-Polypeptids exprimiert. Bei diesem Verfahren kann es sich bei der Lymphzelle um eine T- oder um eine B-Zelle handeln. Der Kontakt mit der Lymphzelle kann in vivo erfolgen.
Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren für die Hemmung einer durch das p30-Polypeptid vermittelten zellulären Antwortreaktion, umfassend (a) die Bereitstellung einer Zusammensetzung, welche die Bindung eines auf der Zelloberfläche exprimierten p30-Polypeptids an den auf der Zelloberfläche exprimierten HVEM oder an den LTβR hemmt, und (b) das Inkontaktbringen der Zelle, welche das auf der Zelloberfläche exprimierte p30-Polypeptid oder den auf der Zelloberfläche exprimierten HVEM oder den LTβR exprimiert, mit einer Menge der Zusammensetzung, die ausreicht, eine durch das p30-Polypeptid vermittelte zelluläre Antwortreaktion zu hemmen. Bei diesem Verfahren kann die Zelle mit der Zusammensetzung in vivo in Kontakt gebracht werden. Die durch das p30-Polypeptid vermittelte und gehemmte zelluläre Antwortreaktion umfasst die Hemmung einer zellulären Lymphocyten-Antwortreaktion, die gehemmte Lymphocyten-Antwortreaktion ist die Lymphocyten-Proliferation und die gehemmte Lymphzelle ist eine pathogene Effektorzelle. Die gehemmte Lymphocyten-Antwortreaktion kann die Modulierung eines T- oder eines B-Zellen-Lymphoms oder einer Leukämie oder einer Autoimmunkrankheit umfassen. Bei der Autoimmunkrankheit kann es sich um rheumatoide Arthritis, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematodes oder um Myasthenia gravis handeln. Die gehemmte Lymphocyten-Antwortreaktion kann auch die Modulierung einer Reaktion gegenüber einem Transplantat umfassen.
Die kontaktierte Zelle exprimiert den HVEM und bei der Zusammensetzung handelt es sich um ein lösliches p30-Polypeptid. Alternativ kann die kontaktierte Zelle den LTβR exprimieren und die Zusammensetzung ist ein lösliches p30-Polypeptid. Alternativ kann die kontaktierte Zelle das p30-Polypeptid auf ihrer Zelloberfläche exprimieren und bei der Zusammensetzung handelt es sich um ein lösliches HVEM-Polypeptid; und die kontaktierte Zelle kann das p30-Polypeptid auf ihrer Zelloberfläche exprimieren und bei der Zusammensetzung handelt es sich um einen Anti-p30-Antikörper.
Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren für die Behandlung von Tumoren, umfassend (a) die Bereitstellung eines Arzneimittels, welches einen Expressionsvektor umfasst, der ein p30-Polypeptid codiert, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, oder ein p30-Polypeptid codiert, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das p30-Polypeptid ein homotrimeres Polypeptid bildet, das an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, und (b) die direkte Injektion des Arzneimittels in den Tumor.
Die Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren für die Modulierung einer durch den Lymphotoxin-beta-Rezeptor (LTβR) vermittelten zellulären Antwortreaktion bereit, wobei das Verfahren umfasst: (a) die Bereitstellung einer Zusammensetzung, welche die Bindung des LTβR an das p30-Polypeptid hemmt; und (b) das Inkontaktbringen einer Zelle, welche den LTβR oder das p30-Polypeptid exprimiert, mit einer Menge der Zusammensetzung, die ausreicht, um die durch den Lymphotoxin-beta-Rezeptor (LTβR) vermittelte zelluläre Antwortreaktion zu modulieren. In einer Ausführungsform exprimiert die Zelle den LTβR und die Zusammensetzung umfasst ein p30-Polypeptid, das ein homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, welches ein monomeres Polypeptid umfasst, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, wobei das homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, oder ein lösliches homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das lösliche homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet. In einer Ausführungsform exprimiert die Zelle das p30-Polypeptid und die Zusammensetzung umfasst einen Anti-p30-Antikörper. Die durch den Lymphotoxin-beta-Rezeptor (LTβR) vermittelte zelluläre Antwortreaktion kann die Bindung eines Herpesvirus an eine Zelle umfassen. Das Herpesvirus wird am Eintritt in die Zelle gehindert. Das Herpesvirus wird an der Proliferation in der Zelle gehindert. Bei dem Herpesvirus handelt es sich um ein Herpes-simplex-Virus (HSV), ein Cytomegalievirus (CMV), ein γ-Herpesvirus oder ein Epstein-Barr-Virus (EBV).
Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren für die Hemmung der Virusproduktion in einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst (a) die Bereitstellung eines p30-Polypeptids; und (b) das Inkontaktbringen einer Zelle, die mit einem Herpesvirus infiziert ist, oder einer Zelle, die gegenüber einer Infektion durch einen Herpesvirus empfänglich ist, mit einer wirksamen Menge eines p30-Polypeptids, wodurch die Produktion des Herpesvirus in der Zelle gehemmt wird. Der Eintritt des Herpesvirus in die Zelle kann gehemmt werden. Das Inkontaktbringen erfolgt in vivo und die p30-Zusammensetzung wird als Arzneimittel bereitgestellt, wobei das Arzneimittel ein homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, das ein monomeres Polypeptid umfasst, welches ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, wobei das homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an ein Lymphotoxin-Rezeptor-(LTR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, oder ein lösliches homotrimeres p30-Polypeptid umfasst, dem eine transmembrane Domäne fehlt, wobei das lösliche homotrimere Polypeptid an das Herpesvirus-Entry-Mediator-(HVEM) Polypeptid oder an das Lymphotoxin-β-Rezeptor-(LTβR) Polypeptid unter physiologischen Bedingungen bindet, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten umfasst. Bei dem Virus kann es sich um ein Herpes-simplex-Virus (HSV), ein Cytomegalievirus (CMV), ein γ-Herpesvirus oder ein Epstein-Barr-Virus (EBV) handeln. Das Inkontaktbringen kann in einem Säuger erfolgen, wie z. B. einem Menschen.
Im Falle eines Konflikts wird die vorliegende Anmeldung einschließlich der Definitionen als Kontrolle dienen. Darüber hinaus dienen die hierin beschriebenen Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Erläuterung und es wird nicht beabsichtigt, dass sie einschränkend wirken.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung, wie z. B. die Therapie für eine Reihe von Erkrankungen, werden aus der folgenden genauen Beschreibung sowie aus den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbar werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A ist Paar von durchflusscytometrischen Histogrammen, welche die Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins an II-23.D7-Zellen nach der Aktivierung durch PMA (oberes Histogramm) oder durch PMA und Ionomycin (unteres Histogramm) zeigen.
1B ist Paar von durchflusscytometrischen Histogrammen, welche die Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins an normale menschliche CD4+- (oberes Histogramm) und CD8+- (unteres Histogramm) T-Zellen zeigen.
1C ist eine Kurvendarstellung, welche die Sättigung der Bindung des HVEM:Fc-Fusionproteins an aktivierte II-23.D7-Zellen zeigt.
2A ist ein Paar von Diagrammen. Das obere Diagramm ist ein durchflusscytometrisches Histogramm, welches zeigt, dass die Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins an aktivierte II-23.D7-Zellen durch das LTβR:Fc-Fusionprotein kompetitiert wird. Das untere Diagramm ist eine Kurvendarstellung, welche die Dosis-abhängige Hemmung der Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins durch das LTβR:Fc-Fusionprotein zeigt.
2B ist ein Paar von Diagrammen. Das obere Diagramm ist ein durchflusscytometrisches Histogramm, welches zeigt, dass die Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins durch das LTα–Homotrimer kompetitiert wird. Das untere Diagramm ist eine Kurvendarstellung, welche die Dosis-abhängige Hemmung der Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins durch das LTα-Homotrimer zeigt.
3 ist ein Paar von Diagrammen. Das obere Diagramm ist ein durchflusscytometrisches Histogramm, welches zeigt, dass die Tyr108Phe-Variante des natürlich vorkommenden LTα nicht in der Lage ist, die Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins an II-23.D7-Zellen zu kompetitieren, und das untere Diagramm ist eine Kurvendarstellung, welches eine LTα- und LTα(Tyr108Phe)-Kompetitions-Bindungsanalyse zeigt.
4A ist eine Autoradiographie, die von einem 2-dimensionalen isoelektrische Fokussierung/SDS-PAGE-Gel eines Präzipitats erhalten wurde, welches durch die Behandlung eines Extrakts aus aktivierten II-23.D7-Zellen mit dem mLTβR:Fc-Fusionsprotein erhalten wurde.
4B ist eine Autoradiographie, die von einem 2-dimensionalen isoelektrische Fokussierung/SDS-PAGE-Gel eines Präzipitats erhalten wurde, welches durch die Behandlung eines Extrakts aus aktivierten II-23.D7-Zellen mit dem TNFR60:Fc-Fusionsprotein erhalten wurde.
4C ist eine Autoradiographie, die von einem 2-dimensionalen isoelektrische Fokussierung/SDS-PAGE-Gel eines Präzipitats erhalten wurde, welches durch die Behandlung eines Extrakts aus aktivierten II-23.D7-Zellen mit dem HVEM:Fc-Fusionsprotein erhalten wurde.
5 ist ein Paar von Diagrammen. Das obere Diagramm ist ein durchflusscytometrisches Histogramm, welches zeigt, dass die Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins durch das HSV-gD-1-Glycoprotein kompetitiert wird. Das untere Diagramm ist eine Kurvendarstellung, die die Dosis-abhängige Hemmung der Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins durch das HSV-gD-1-Glycoprotein zeigt.
6 ist ein Paar von Kurvendarstellungen, die zeigen, dass der Anti-HVEM-Antikörper die Dosis-abhängige Proliferation von frisch isolierten T-Zellen aus peripherem Blut (obere Kurvendarstellung) sowie von Gedächtnis-T-Zellen (untere Kurvendarstellung) stimuliert.
7 ist ein Paar von Diagrammen. Das obere Diagramm ist ein durchflusscytometrisches Histogramm, das die Expression des HVEM-Polypeptids auf lymphoblastoiden RAJI-Zellen zeigt. Das untere Diagramm ist eine Kurvendarstellung, die die Dosis-abhängige Proliferation von RAJI-Zellen als Antwortreaktion auf den Anti-HVEM-Antikörper zeigt.
8 zeigt ein SDS-PAGE-Gel, das einer Proteinfärbung unterworfen wurde und das eine deutliche Bande bei etwa 58 kDa zeigt, welche das Fusionsprotein mHVEM:Fc repräsentiert, vergleiche mit Beispiel 6.
9 ist eine Darstellung, welche die Wirkung des HVEM:Fc-Fusionsproteins auf das Anschwellen der Fußballen bei Mäusen zeigt. Es wurden verschiedene Konzentrationen an HVEM:Fc (12, 60 und 300 μg) verwendet, um eine Entzündung und die Anschwellung bei BDF1-Mäusen zu behandeln, die mit 50 μg OVA, das an 1 mg Alaun absorbiert war, immunisiert und mit Antigen herausgefordert („challenged") worden waren, vergleiche mit Beispiel 7.
10 zeigt eine Darstellung des CIA-Wertes bei durch Collagen induzierten arthritischen Mäusen, die mit PBS, mit hlgG oder mit mHVEM:Fc behandelt worden waren, vergleiche mit dem nachstehenden Beispiel B.
11 zeigt die Morphologie von Haut-Fibroblasten, die mit HCMV-F mit einer MOI von 0,05 infiziert worden waren und die in Gegenwart von 5 nM A) LTα, B) LTα + TNFR:Fc, C) LTαY108F, D) LTα1β2, E) LIGHT, F) LIGHT-G119E und G) dem Virus alleine in einem Medium angezogen worden waren. Vergleiche mit Beispiel 9.
12 zeigt die antivirale Wirkung von LIGHT und LTα auf das γ-Herpesvirus MHV68 in vivo (vergleiche mit Beispiel 9).
13 zeigt ein Gel, das die Reinheit von LIGHT-t66 demonstriert und das (A) mit Coomassieblau angefärbt wurde oder das (B) in einer Western-Blot-Analyse mit dem Anti-FLAG- (M2) Antikörper behandelt wurde, um das rekombinante Protein nachzuweisen. Molekulargewichtsmarker werden in der linken Bahn gezeigt.
14 zeigt eine Reihe von Gelen, die demonstrieren, dass die Anti-HCMV-Wirkung von LIGHT und der Lymphotoxine von der Aktivierung durch NF-κB abhängig ist.
15 zeigt die Reinigung und die biochemische Charakterisierung von LIGHT-t66 und seinen Mutanten. 15A. Reinigung von LIGHT-t66-FLAG aus dem Überstand von 293-Zellen. Obere Teilabbildung. Mit Coomassie gefärbtes SDS-PAGE-Gel (15%). Es wurden 20 μl pro Bahn geladen. Der Ausgangs-Überstand und das durch Ionenaustausch gereinigte LIGHT-t66 erscheinen als multiple Banden. Das durch Affinität gereinigte LIGHT-t66 erscheint als einzelne Bande, Mr = 27 kDa. Untere Teilabbildung. Western-Blot, der mit dem Anti-FLAG-Antikörper (M2) angefärbt wurde. Es wurden 20 μl pro Bahn geladen. LIGHT-t66-FLAG wurde mit einem Mr = 27 kDa nachgewiesen. Die relative Intensität der Banden stimmte mit den ELISA-Daten überein, was anzeigt, dass LIGHT-t66-FLAG nach dem Ionenaustausch-Verfahren 30-fach und nach der Affinitäts-Reinigung 100-fach aufkonzentriert vorlag. Die Endausbeute betrug 60-80% des Ausgangsmaterials.
15B. Reinigung der Mutanten von LIGHT-t66-FLAG aus den Überständen von 293T-Zellen. Obere Teilabbildung. Mit Silber gefärbtes SDS-PAGE-Gel. Die Mutanten von LIGHT-t66-FLAG wurden unter Verwendung von 293T-Zellen, wie beschrieben, hergestellt. Die mit FLAG markierten Proteine wurden aus den Gewebekultur-Überständen unter Verwendung des monoclonalen Anti-FLAG-Antikörpers M2, der an Affigel gekoppelt war, affinitätsgereinigt. Es wurde 100 ng gereinigtes Protein pro Vertiefung geladen. Alle vier Mutanten erschienen als einzelne Banden mit Mr = 27 kDa. Bei einigen Präparaten war eine schwache Bande mit Mr = 52 kDa vorhanden. Es wurden keine anderen kontaminierenden Proteine nachgewiesen. Untere Teilabbildung. Western-Blot, der mit dem Anti-FLAG-Antikörper M2 gefärbt wurde. LIGHT-t66-FLAG und seine Mutanten wurden mit einem Mr = 27 kDa nachgewiesen. In einigen Fällen wurde ebenfalls eine schwach reagierende Bande mit Mr = 52 kDa nachgewiesen, die der 52 kDa-Bande entsprach, welche durch die Silberfärbung nachgewiesen worden war. Bei dieser Bande handelt es sich wahrscheinlich um ein Dimer.
15C. Kreuzvernetzung von LIGHT-t66-myc. LIGHT-t66 wurde durch Zugabe von Glutaraldehyd (0,1%) oder BSCOES (5 nM) 30 Min. bei 4°C kreuzvernetzt; die Reaktion wurde durch Zugabe von TRIS (20 mM, pH-Wert 8,0) beendet. Die Proben wurden durch einen Western-Blot unter Verwendung des (Antimyc-) Antikörpers 9E1O analysiert. Es wurden 200 ng pro Vertiefung geladen. A, LIGHT-t66-myc-Kontrolle, B, Kreuzvernetzung mit Glutaraldehyd, C, Kreuzvernetzung mit BSCOES. In den kreuzvernetzten Proben wurden Banden von 52 und 76 kDa nachgewiesen, die den erwarteten Mr für ein Dimer und ein Trimer entsprachen.
15D. Gelfiltrationsanalyse von LIGHT-t66-FLAG. LIGHT-t66-FLAG und seine Mutanten wurden durch FPLC-Gelfiltration über eine Superose 12-Säule analysiert. Obere Teilabbildung. Fraktionen aus der Gelfiltration von LIGHT-t66-FLAG wurden durch einen ELISA unter Verwendung von HVEM:Fc als einfangendes Molekül und dem Anti-FLAG-Antikörper M2 als Antikörper für den Nachweis analysiert. Aktives LIGHT-t66 eluierte mit Mr = 76 kDa, was ein homotrimeres Molekül anzeigt. Untere Teilabbildung. Dot-Blot, der mit M2-Anti-FLAG gefärbt wurde. Fraktionen aus der Gelfiltrationsanalyse von LIGHT-t66-FLAG und der Mutanten wurden durch Dot-Blot-Analyse weiter untersucht (von oben nach unten, t66, G119E, Y173F, Q117T, L120Q). Anti-FLAG-reaktives Material wurde nur in denjenigen Fraktionen nachgewiesen, von denen mit dem ELISA bestimmt worden war, dass sie homotrimeres LIGHT enthielten, was demonstriert, dass die Präparate kein freies Monomer und kein aggregiertes Material enthielten.
16 zeigt Kurven, die demonstrieren, dass LIGHT-t66 für HT29-Zellen cytotoxisch ist. 16A. HT29-Zellen wurden mit Verdünnungsreihen von LIGHT-t66, LTα1β2 oder dem TNF in Gegenwart von IFNγ (80 E/ml) inkubiert. Nach 72 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen MIT-Testansatz untersucht. LIGHT-t66 hemmte das Wachstum von HT29-Zellen mit vergleichbarer Wirksamkeit wie LTα1β2.
16B. Die Cytotoxizität von LIGHT-t66 ist von IFNγ abhängig. HT29-Zellen wurden mit einer Verdünnungsreihe von LIGHT-t66 in Gegenwart oder in Abwesenheit von IFNγ (80 E/ml) inkubiert und nach 72 Stunden wurde ein MTT-Testansatz durchgeführt.
16C. Die Cytotoxizität von LIGHT-t66 wird durch gleichzeitige Inkubation mit LTβR:Fc und HVEM:Fc blockiert. LIGHT-t66 (200 pM) wurde mit verschiedenen Verdünnungen von LTβR:Fc, HVEM:Fc oder Fas:Fc 30 Minuten vor der Zugabe zu den HT29-Zellen in Gegenwart von IFNγ vorinkubiert. Der MTT-Testansatz wurde nach 72 Stunden durchgeführt. LTβR:Fc und HVEM:Fc hemmten die Cytotoxizität von LIGHT-t66 in einer Dosis-abhängigen Weise, wohingegen Fas:Fc die durch LIGHT-t66 vermittelte Cytotoxizität nicht beeinflusste.
17 sind Darstellungen, die die Rezeptor-Bindungseigenschaften von LIGHT-t66 und seinen Mutanten zeigen. LIGHT-t66-FLAG und die Mutanten wurden durch einen ELISA unter Verwendung der angegebenen Rezeptoren als einfangende Moleküle und von M2-anti-FLAG als Antikörper für den Nachweis analysiert. L120Q und Q117T banden an den menschlichen HVEM und an den LTβR mit einer Affinität, die mit der von LIGHT-t66 vergleichbar oder größer war. G119E band an menschliches HVEM:Fc mit verminderter Affinität und wies keine nachweisbare Bindung an menschliches LTβR:Fc auf. Y173F band an den menschlichen LTβR mit verminderter Affinität und G119E band schwach. L120Q zeigte eine gesteigerte Affinität für murines HVEM:Fc und LTβR-Fc. Eine Bindung von G119E und Y173 an die murinen Rezeptoren wurde in diesem System nicht nachgewiesen.
18 zeigt übereinander gelagerte Sensorgramme, die die Oberflächen-Plasmonresonanz zeigen. Es werden die übereinander gelagerten Sensorgramme für die Bindung von LIGHT-t66 und seiner Mutanten an huHVEM:Fc und an huLTβR:Fc bei einer Liganden-Konzentration von 300 nM gezeigt. Die Bindungskinetiken waren bei LIGHT-t66 und Q117T ähnlich. G119E und Y173F dissoziierten von HVEM:Fc mit erhöhten Abgangsraten relativ zu LIGHT-t66. Y173F dissoziierte von dem huLTβR mit einer gesteigerten Abgangsrate, wohingegen G119E an diesen Rezeptor nicht band.
19 zeigt die Zell-Cytotoxizität der LIGHT-t66-Mutanten in HT29-Zellen. HT29-Zellen wurden mit Verdünnungsreihen von LIGHT-t66 und seinen Mutanten in Gegenwart von IFNγ inkubiert und nach 72 Stunden wurde ein MTT-Testansatz durchgeführt. L120Q und Q117T waren für HT29-Zellen toxisch mit einer vergleichbaren Wirksamkeit wie LIGHT-t66 (50% Zelltod bei 10 μM Cytokin). Y173F war schwach cytotoxisch (50% Zelltod bei 1 nM Cytokin). G119E zeigte gegenüber diesen Zellen eine vernachlässigbare Cytotoxizität.
20 zeigt die Wirkungen von Anti-LTβR- und Anti-HVEM-Antikörpern auf HT29-Zellen. 20A. Bindung des Anti-huHVEM- und des Anti-huLTβR-Antikörpers an HT29-Zellen. Die Zellen wurden mit dem primären Antikörper (5 μg/ml) oder mit normalem Maus-IgG (ausgefüllte Flächen) 30 Min. bei 4°C inkubiert, gefolgt von Ziegen-anti-Maus-PE, und anschließend erfolgte die Analyse durch Durchflusscytometrie. Beide Anti-HVEM-Antikörper (CW1 und CW8) und beide Anti-LTβR-Antikörper (BDA8 und CDH10) färbten die Zellen an.
20B. Wirkung des Anti-huHVEM-Antikörpers auf die Bindung von LIGHT an den huHVEM. Die Vertiefungen einer ELISA-Platte, die mit huHVEM:Fc (3 pg/ml) beschichtet worden waren, wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines polyclonalen Ziegen-anti-HVEM- oder der monoclonalen Anti-HVEM-Antikörper CW1 oder CW8 30 Min. und dann mit LIGHT (0,25 nM) eine Stunde inkubiert, bevor der Nachweis des gebundenen LIGHT mit dem monoclonalen Anti-FLAG-Antikörper (M2) und Ziegen-anti-Maus-IgG-HRP erfolgte. Ziegen-anti-HVEM und CW8 hemmten die Bindung von LIGHT an den HVEM deutlich, wohingegen CW1 keine Wirkung hatte.
20C. Wirkung von Anti-LTβR-Antikörpern auf die Bindung von LIGHT an den huLTβR. Das Experiment wurde, wie in 20B beschrieben, durchgeführt. Ziegen-anti-LTβR- und der monoclonale Anti-LTβPR-Antikörper BDA8 hemmten die Bindung von LIGHT an den LTβR deutlich, wohingegen CDH10 keine Wirkung hatte.
20D. Wirkung der Antikörper-Kreuzvernetzung des huHVEM und des huLTβR auf das Wachstum von HT29-Zellen. HT29-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen des polyclonalen Anti-HVEM-, des polyclonalen Anti-LTβR-Antikörpers oder mit einem Gemisch der beiden inkubiert. Nach 72 Stunden wurde ein MTT-Testansatz durchgeführt. Die Antikörper-Kreuzvernetzung des LTβR verminderte die Zellzahl in einer Dosis-abhängigen Weise signifikant, wohingegen die Antikörper-Kreuzvernetzung des HVEM-Polypeptids keine Wirkung hatte. Die Miteinbeziehung des polyclonalen Anti-HVEM-Antikörpers hatte keine Wirkung auf die Cytotoxizität des polyclonalen Anti-LTβR-Antikörpers.
20E. Die Wirkung der polyclonalen Anti-huHVEM- und Anti-huLTβR-Antikörper auf die durch LIGHT vermittelte Cytotoxizität. HT29-Zellen wurden mit 10 pg/ml polyclonalem Ziegen-anti-huHVEM, polyclonalem Ziegen-anti-huLTβR oder den angegebenen monoclonalen Antikörpern für 10 Min. vor der Zugabe von LIGHT (0,25 nM) inkubiert. Nach 72 Stunden wurde ein MTT-Testansatz durchgeführt. LIGHT alleine führte zu einer 50%-igen Wachstumshemmung. Die Miteinbeziehung des polyclonalen Ziegen-anti-LTβR-Antikörpers und des monoclonalen anti-LTβR-Antikörpers CDH10 steigerte die durch LIGHT vermittelte Cytotoxizität deutlich, wohingegen der monoclonale Anti-LTβR-Antikörper BDA8 eine leicht schützende Wirkung hatte. Der polyclonale Ziegen-anti-huHVEM und die monoclonalen Anti-HVEM-Antikörper CW1 und CW8 beeinflussten die durch LIGHT vermittelte Cytotoxizität nicht.
21 zeigt die Wirkung von LIGHT-t66 auf die Hochregulierung der ICAM-Expression in NHDF-Zellen. NHDF-Zellen (60.000/Vertiefung) wurden mit den angegebenen Konzentrationen des Cytokins in 600:1 Gewebekulturmedium inkubiert. Nach 36 Stunden wurden die Zellen durch FACS mit dem mAk P2A4 (Chemicon International Inc.) analysiert, um die Spiegel von ICAM-1 an der Zelloberfläche zu bestimmen. Der Grad der Induktion (x-fach) stellt die spezifische Fluoreszenz der mit Cytokin behandelten Zellen gegenüber einer unbehandelten Negativ-Kontrolle dar.
22 zeigt die Rekrutierung von TRAF durch Rezeptoren. 22A. Co-Immunpräzipitation des HVEM und der mit FLAG markierten TRAF-Proteine aus den Lysaten transfizierter 293T-Zellen. Die Proteinkomplexe wurden unter Verwendung polyclonaler Ratten-anti-HVEM-spezifischer Antikörper präzipitiert. Die Immunblots wurden unter Verwendung des monoclonalen Anti-FLAG-Antikörpers aus der Maus nachgewiesen.
22B. Co-Immunpräzipitation des LTβR und der mit FLAG markierten TRAF-Proteine aus den Lysaten transfizierter 293T-Zellen. Die Proteinkomplexe wurden unter Verwendung von Anti-LTβR-spezifischen Antikörpern aus Ziegen präzipitiert. Die Immunblots wurden unter Verwendung des monoclonalen Maus-anti-FLAG-Antikörpers nachgewiesen. Die Zellen wurden mit einzelnen Vektoren oder mit Vektoren in Kombination transfiziert, wie in der Figur angegeben und in den experimentellen Verfahren beschrieben. pBABE wurde als Negativ-Kontrolle mit einbezogen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hierin wird ein neuer Ligand für den HVEM beschrieben, d. h. p30 und funktionelle Varianten und Fragmente davon. Dieser neue Ligand, der als Membranprotein vorliegt und der als Cytokin fungieren kann, wird auch als LIGHT bezeichnet, da dieses Polypeptid zu Lymphotoxinen homolog ist, eine Induzierbare Expression aufweist und mit dem Glycoprotein D des HSV um den HVEM, einen Rezeptor, der durch T-Lymphocyten exprimiert wird, kompetitiert. Da LIGHT mit dem HSV-Glycoprotein D um den HVEM kompetitieren kann, können homotrimere lösliche Formen dieses Polypeptids verwendet werden, um den Eintritt von Herpesviren in Zellen zu blockieren. Daher kann dieser neue HVEM-Ligand verwendet werden, um Herpesvirus-Infektionen zu behandeln oder zu verhindern, wie z. B. Infektionen mit dem β-Herpesvirus oder dem Cytomegalievirus.
LIGHT bindet auch an den Lymphotoxin-beta-Rezeptor (LTβR).
Experimente, welche die Hemmung der Bindung eines Fusionsproteins umfassten, das die extrazelluläre Domäne eines dem TNF-Rezeptor (TNFR) verwandten Polypeptids, HVEM, enthielt, zeigten, dass sowohl bösartige als auch normale menschliche T-Zellen LIGHT, den Zelloberflächen-Liganden für den HVEM, exprimieren.
Hierin wird ebenfalls beschrieben, dass HVEM-Polypeptide eine antagonistische Wirkung auf Entzündungen aufweisen. Insbesondere HVEM-Fusionsproteine sind in der Lage, eine Entzündung zu hemmen, wenn sie einem Individuum verabreicht werden.
DEFINITIONEN
Es sollte angemerkt werden, dass, wie hierin und in den angehängten Ansprüchen verwendet wird, die Einzahl-Formen „ein/eine", „und" und „der/die/das" den Plural mit einschließen, sofern der Zusammenhang dies nicht eindeutig anders erfordert. Daher umfasst zum Beispiel der Bezug auf „eine Zelle" eine Vielzahl solcher Zellen.
Sofern nicht anders definiert, besitzen alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie im Allgemeinen durch die Fachleute in dem Fachgebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, bei der Durchführung oder dem Austesten der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben.
Wie hierin verwendet, bedeutet „hemmen" oder „Hemmung" einer Aktivität die Verminderung dieser Aktivität um eine messbare Menge, wie z. B. um eine Verminderung um mindestens 30% oder mehr. Wenn es mehrere unterschiedliche Aktivitäten gibt, die gehemmt werden können (zum Beispiel die Verhinderung der Zell-Rekrutierung, die Produktion von entzündungsfördernden Mediatoren, der Zell- bzw. Virus-Eintritt, die Virus-Aktivierung, die Virus-Replikation oder die Ausbreitung eines Virus), reicht die Verminderung einer beliebigen einzelnen Aktivität (mit oder ohne einer anderen Aktivität) aus, um in den Rahmen dieser Definition zu fallen. Darüber hinaus gilt, dass, wenn ein einzelnes oder mehrere Agenzien verabreicht werden, um die Aktivität zu hemmen, die Verminderung einer beliebigen einzelnen Aktivität durch eine einzelnes Agens oder die Verminderung einer beliebigen einzelnen Aktivität durch eine Kombination von Agenzien ausreicht, um in den Rahmen dieser Definition zu fallen. Eine „eine die Entzündung hemmende Menge" bedeutet, die Menge eines anti-entzündlichen Agens, die nötig ist, um entzündliche Antwortreaktionen oder Symptome zu modulieren, zu hemmen oder zu unterdrücken.
Entzündung
Entzündung resultiert aus einer Reihe von individuellen und zueinander in Beziehung stehenden Kaskaden oder Reaktionen, die durch entzündungsfördernde Mediatoren verursacht werden, einschließlich Cytokine, Prostaglandine, Leukotriene, Chemokine, Adhäsionsmoleküle (z. B. LFA-1) und anderer, die den Fachleuten bekannt sind. So spielen zum Beispiel Rezeptoren eine zentrale Rolle, indem sie den Eintritt von Viren in die Zellen ermöglichen. Die Liganden für diese Rezeptoren sind ebenfalls von Bedeutung. Die Liganden sind zusammen mit entzündungsfördernden Mediatoren wie z. B. Cytokinen die Hauptstimulanzien für die Zellen, spielen aber auch eine andere Rolle bei der Amplifizierung der Entzündungs-Kaskade. Diese löslichen Vermittler von Entzündungen stammen vorwiegend von CD8+-T-Zellen.
Nachdem sie einmal produziert worden sind, können sie in parakriner und autokriner Weise wirken, um Zellen in ihrer Nähe weiter zu aktivieren und um zusätzliche T-Zellen an den Ort der Entzündung zu rekrutieren. Diese zusätzlichen Lymphocyten sind bereits aktiviert und tragen zur Amplifikation der Entzündungs-Kaskade mit bei.
„Immununterdrückende Aktivität", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Hemmung oder die Verminderung der Fähigkeit von B- und T-Zellen zu reagieren oder rekrutiert zu werden oder am Ort einer Entzündung aktiviert zu werden.
Andere Signale, welche Entzündungszellen aktivieren, umfassen die Bindung eines Adhäsions-Rezeptors, wie zum Beispiel LFA-1 (CD11a und CD18), an einen seiner Gegenrezeptoren wie z. B. ICAM-1 (CD54) (Staunton et al., 1990, Cell 61:243-254). Wenn das zweite Signal blockiert wird, werden die Antigen-spezifischen T-Zellen induziert durch Apoptose abzusterben oder einen Zustand zellulärer Anergie einzunehmen. Die Blockierung dieser Wechselwirkung durch monoclonale Antikörper gegen LFA-1 und ICAM-1 führt zu einer erhöhten Überlebensrate bei Mäusen, die ein Herz-Allotransplantat erhalten hatten (Isobe (1992) Science 255:1125-1127). Dementsprechend können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren alleine oder in Kombination mit anderen entzündungshemmenden Agenzien verwendet werden, einschließlich nicht-steroidaler entzündungshemmender Arzneistoffe, Steroide, Antikörper, Rezeptor-Antagonisten und anderer, die im Fachgebiet bekannt sind.
Wie hierin verwendet, bedeutet „Entzündung" den Vorgang oder eine Reihe von Ereignissen, der/die durch zahlreiche Reize (z. B. infektiöse Agenzien, Ischämie, Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen und thermische oder andere physikalische Verletzungen) hervorgerufen wird. Eine Entzündung ist durch eine Zunahme an Erythemen, Ödemen, Empfindlichkeit (Hyperalgesie) und Schmerzen an der entzündeten Stelle gekennzeichnet. Eine entzündliche Reaktion oder Kaskade wird im Allgemeinen dadurch erkannt, dass sie eine Reihe von unterschiedlichen Stadien aufweist, wie zum Beispiel Gefäßerweiterung und gesteigerte Durchlässigkeit der Kapillaren; eine Infiltration von Leukocyten und Phagocyten; und ein Stadium des Gewebeabbaus und der Fibrose. Wie hierin verwendet, bedeutet „entzündliche Störung" eine beliebige Zahl von Erkrankungen, die dadurch charakterisiert sind, dass ein Teil ihrer Pathogenese und entzündlichen Kaskade, oder Reaktion zu einer Entzündung führt. Solche Störungen umfassen zum Beispiel Arthritis, Psoriasis, entzündliche Darmerkrankungen, infektiöse Agenzien wie z. B. Herpes und andere, die den Fachleuten bekannt sind.
Experimente, bei denen die Hemmung der Bindung eines Fusionsproteins untersucht wurde, das die extrazelluläre Domäne eines dem TNF-Rezeptor (TNFR) verwandten Polypeptids, d. h. den HVEM, umfasste, zeigten, dass sowohl bösartige als auch normale menschliche T-Zellen einen Zelloberflächen-Liganden für den HVEM exprimierten. Kompetitive Hemmexperimente zeigten, dass der HVEM-Ligand Eigenschaften mit LTαβ-Heterotrimeren und mit LTα gemein hat, aber auch Eigenschaften aufweist, die ihn von LTα1β2 und dem TNF unterscheiden. Daher könnte LTα2β1 einen möglichen Oberflächen-Liganden darstellen, der durch den HVEM erkannt wird, mit der Einschränkung, dass die HVEM-Bindestelle auf LTα2β1 nicht die gleiche wie die des TNFR60 ist. Alternativ könnte der HVEM einen neuen Liganden erkennen. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden biochemische Untersuchungen durchgeführt.
Immunpräzipitations-Studien und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Studien zeigten, dass ein neuer 30 kDa großer Polypeptid-Ligand (p30) für den HVEM auf der Oberfläche von T-Zellen vorhanden ist, der sich in seinen antigenen Eigenschaften sowohl von LTβ als auch von LTα unterscheidet. Eine Reinigung durch Affinitäts-Chromatographie und zweidimensionale Elektrophorese zeigte, dass p30 sich von LTα und LTβ auch physikalisch unterscheidet, da es ein Molekulargewicht von 30 kDa und einen p1-Wert von etwa 7 bis 8,5 aufweist (4C). Darüber hinaus zeigten diese Untersuchungen, dass aktives p30 (z. B. seine trimere Form) auch durch den LTβR, aber nicht durch den TNFR erkannt wird. Das p30-Polypeptid wird in der neueren Literatur auch als LIGHT bezeichnet (vergleich zum Beispiel mit Mauri et al., Immunity 8(1):21-30 (Jan. 1998)). LIGHT (p30) wurde als zellulärer Ligand für TR2 beschrieben (Zhai et al., (1998) J. Clin. Invest. 102:1142). Darüber hinaus berichtet WO 99/02563 über die Verwendung von p30 für die Behandlung von Lymphzellenerkrankungen und Herpesvirus-Infektionen.
Bindungshemmungs-Experimente demonstrierten, dass lösliches gD-1 (gD aus HSV-1) und eine Mutante von gD-1, gD-1(Δ290-299t), an den HVEM, aber nicht an den LTβR oder an den TNFR60 binden. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass gD-1 sich gemeinsam mit dem HVEM spezifisch für die Bindung an den HVEM entwickelt hat, obwohl der HVEM Liganden bindet, die durch den TNFR60 und den LTβR erkannt werden. Die Befunde zeigen weiterhin, dass gD-1 ein in der Membran verankertes Virokin ist, das zu den Lymphotoxinen zu zählen ist, und die Signalübertragungsaktivität des HVEM während des Eintritts oder des Austritts des HSV in bzw. aus der infizierten Zelle modulieren kann.
In vitro-Zellkultur-Studien zeigten, dass ein Anti-HVEM-Antikörper die Proliferation sowohl von jungfräulichen als auch von Gedächtnis-T-Zellen steigern kann. Ähnliche Experimente zeigten, dass die Signalübertragung durch den HVEM einen aktivierenden Reiz für B-Zellen bereitstellt und dass ein positiver Reiz, ohne einen ausgleichenden negativen Reiz durch den TNFR, eine einzigartige Fähigkeit des HVEM-Liganden p30 darstellen könnte. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die physiologischen Funktionen des HVEM-Liganden wahrscheinlich von denen des TNF und von LTα1β2 unterscheiden. Die Identifizierung eines neuen 30 kDa großen Liganden für den HVEM wirft die Möglichkeit auf, dass dieser Ligand für physiologische Antwortreaktionen verantwortlich sein könnte, die bislang LTα oder LTβ zugeschrieben wurden. Die hier vorgestellten Entdeckungen liefern ein besseres Verständnis des LT/TNF-Cytokin-Systems und des Herpesvirus, das neue Ansätze für die Kontrolle dieser Cytokine bei Krankheitsprozessen sowie für die Beeinflussung von Entzündungen, die aufgrund von Infektionen und Verletzungen entstanden sind, aufzeigt.
Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Antagonisten und bindende Agenzien wie zum Beispiel Fc-Fusionsproteine, die den HVEM oder den LTβR enthalten, die Wirkung von LTα und des 30 kDa großen HVEM-Liganden p30 modulieren können. Die Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass Antagonisten und bindende Agenzien (z. B. Antikörper und das Fusionsprotein der Erfindung (z. B. HVEM:Fc)) ebenfalls bei der Modulierung von Entzündungen und entzündlichen Reaktionen nützlich sein können. Wie vorstehend diskutiert, aktiviert die Bindung an den HVEM B-Zellen und daher vermindert eine Modulierung der Wechselwirkung zwischen dem HVEM und seinem Liganden die Aktivierung von entzündlichen Zellen und die Aktivierung der Entzündungskaskade. In ähnlicher Weise könnte ein HVEM- Fusionsprotein verwendet werden, um spezifische Inhibitoren des Liganden-Rezeptor-Komplexes zu identifizieren, wie z. B. monoclonale Antikörper oder Peptide oder kleine organische Verbindungen. Inhibitoren der Wechselwirkung von p30 oder von LTα mit dem HVEM oder Wechselwirkungen von p30 mit dem LTβR könnten verwendet werden, um Erkrankungen zu modulieren, bei denen eine unerwünschte Proliferation von Lymphocyten stattfindet, einschließlich T- und B-Zellen-Lymphome und Leukämien, oder bei Autoimmunerkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Insulin-abhängigem Diabetes mellitus, multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematodes, Myasthenia gravis und Entzündungen wie zum Beispiel Arthritis, Psoriasis, entzündlichen Darmerkrankungen, Asthma und anderen, die im Fachgebiet bekannt sind.
Gleichfalls könnte das Herpesvirus-gD-1-Protein verwendet werden, um Immunreaktionen zu hemmen, bei denen LTα, p30 und der HVEM als Effektormoleküle an der Signalübertragung beteiligt sind. LTα oder lösliche Formen des 30 kDa großen HVEM-Liganden (erzeugt durch Deletion seiner vorhergesagten cytoplasmatischen und transmembranen Domäne, wie Z. B. das nachstehend beschriebene LIGHT-t66) können als Inhibitoren von Virusinfektionen, einschließlich zum Beispiel einer Infektion mit Herpesviridae (z. B. den Alpha-Herpesvirinae, den Beta-Herpesvirinae und den Gamma-Herpesvirinae), sowie des erneuten Ausbrechens fungieren, und zwar, indem die Fähigkeit des Virus, in eine Zielzelle einzudringen, blockiert wird.
Ähnlich wie die TNFR besitzt der HVEM eine doppelte Liganden-Spezifität, indem er LTα und die trimere Form (z. B. die 90 kDa-Form) von LIGHT, eine membrangebundene Form des Liganden p30, bindet. Die Tyr108Phe-Mutation des LTα zerstört die HVEM-Bindung, wie sie es für den TNFR60 und den TNFR80 tut. Die Unfähigkeit des TNFR60, die Bindung des HVEM an die Oberflächenform des 30 kDa-Proteins zu blockieren, weist darauf hin, dass LTα2β1 kein HVEM-Ligand ist.
Darüber hinaus unterscheidet sich LIGHT (p30) von LTα, da es andere antigene Eigenschaften aufweist und mit der Zelle assoziiert bleibt, anders als LTα, das ausschließlich sekretiert wird. Daher kann von dem an den HVEM bindenden Protein (p30) vorausgesagt werden, dass es einen Sequenzabschnitt mit hydrophoben Resten enthalten muss, die eine transmembrane Domäne bilden, die in einer transmembranen Konfiguration des Typs II angeordnet ist, ähnlich wie bei anderen Proteinen, die mit dem TNF verwandt sind. Dies schließt jedoch die Möglichkeit nicht aus, dass p30 auch auf andere Weise modifiziert sein könnte (z. B. durch Modifizierung mit einem Lipid), um die Anheftung an die Zelloberfläche zu ermöglichen. Weiterhin sollte dieses Protein Regionen mit Sequenzhomologie zu LTα und LTβ und verwandten Cytokinen gemeinsam haben, die diese Superfamilie definieren und die eine C-terminale extrazelluläre Domäne von etwa 150-160 Resten enthalten.
Die Befunde zeigen ebenfalls, dass der HVEM ein spezifischer Rezeptor für LTα ist, eine Eigenschaft, die ihn von den TNF-bindenden Rezeptoren TNFR60 und TNFR80 eindeutig unterscheidet. Diese Eigenschaft wird es einem HVEM-Fusionsprotein oder einem ähnlichen Protein ermöglichen, als spezifischer Antagonist gegenüber LTα zu wirken, ohne dass es dabei die Funktionen des TNF oder von LTα1β2 hemmt.
Die vorliegende Beschreibung beschreibt Antagonisten und bindende Agenzien wie z. B. lösliches, homotrimeres LIGHT oder ein HVEM-Fusionspolypeptid. Das HVEM-Fusionspolypeptid kann dadurch charakterisiert werden, dass es ein Molekulargewicht von etwa 58 kDa besitzt, wie durch reduzierende SDS-PAGE bestimmt werden kann und wie es in der 8 beschrieben wird, vergleiche mit Beispiel 6.
Die vorliegende Beschreibung beschreibt auch ein im Wesentlichen reines LIGHT- bzw. p30-Polypeptid. Das p30-Polypeptid ist dadurch charakterisiert, dass es ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 30 kDa aufweist, wie es durch reduzierende SDS-PAGE bestimmt werden kann, und einen p1-Wert im Bereich von etwa 7-8,5 aufweist (4C). p30 existiert in weniger als 10 wie z. B. in weniger als acht, insbesondere in weniger als sechs (z. B. drei, vier oder fünf) isomeren Formen. Die Beschreibung beschreibt auch LIGHT bzw. p30 als ein Homotrimer. Wie in den nachstehenden Beispielen demonstriert wird, kann p30 als Homotrimer exprimiert werden, und wenn es in rekombinanter, verkürzter und löslicher Form exprimiert wird, wird es ausschließlich als Homotrimer sekretiert. Das LIGHT-Polypeptid kann zellgebunden vorliegen, d. h. es wird nicht sekretiert. In seiner Zelloberflächenform bindet p30 an den HVEM und an den LTβR.
Der Ausdruck „im Wesentlichen rein", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Fachleute können solche Polypeptide und Fusionsproteine unter Verwendung von Standardverfahren für die Proteinreinigung reinigen (vergleiche z. B. mit: Protein Purification, Principles and Practice, Zweite Auflage (1987), Scopes, Springer-Verlag, N.Y.). So wird zum Beispiel ein im Wesentlichen reines HVEM:Fc-Polypeptid eine einzige Hauptbande von etwa 58 kDa in einem reduzierenden SDS-PAGE-Gel ergeben. Das LIGHT-p30-Polypeptid wird eine einzige Hauptbande von etwa 30 kDa in einem reduzierenden SDS-PAGE-Gel ergeben; in seiner homotrimeren Form bildet es eine einzige Hauptbande von etwa 90 kDa in einem nicht-reduzierenden Gel (welches die trimere Tertiärstruktur nicht zerstört).
Die Erfindung umfasst ein funktionelles Fusionspolypeptid und funktionelle Fragmente davon. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „funktionelles Polypeptid" auf ein Polypeptid, das eine biologische Funktion oder eine andere Aktivität besitzt, wie z. B. die Fähigkeit an einen Rezeptor zu binden, was durch Routing und durch definierte Funktions- sowie Rezeptor-Bindungs-Testansätze identifiziert werden kann (vergleiche z. B. mit den nachstehenden Beispielen), und das z. B. mit bestimmten biologischen, morphologischen oder phänotypischen Veränderungen in der Zelle oder mit Bindungsereignissen assoziiert ist, wie Z. B. die Fähigkeit des löslichen LIGHT-Polypeptids, den Eintritt eines Herpesvirus zu blockieren.
„Funktionelle Fragmente", wie hierin verwendet, umfassen Untersequenzen der Polypeptide mit einer biologischen Funktion, wie sie vorstehend beschrieben wurde. So können Fusionspolypeptide zum Beispiel Fragmente von z. B. LIGHT oder des HVEM enthalten. Zum Beispiel beschreibt die Beschreibung Fragmente des HVEM und eine zweite Polypeptidsequenz, sofern eine Aktivität, die im Wesentlichen die Gleiche wie diejenige des HVEM:Fc ist, erhalten bleibt, wie z. B. die Modulierung von zellulären Antwortreaktionen durch die Hemmung der Bindung des HSV an den HVEM, die Antigenität oder die Hemmung einer Entzündung. Kleinere Peptide, die die biologische Aktivität des HVEM oder der HVEM-Fusionspolypeptide aufweisen, werden ebenfalls beschrieben. Fachleute können die funktionelle Aktivität solcher Polypeptide durch Standardverfahren austesten, wie z. B. durch einen Virus-Plaque-Reduzierungs-Testansatz oder durch Zellaktivierungs-Testansätze einschließlich Cytokin-Produktions-Testansätze und der Messung der entzündlichen Reaktionen, wie sie in den Beispielen beschrieben werden. In ähnlicher Weise können funktionelle Fragmente von p30 durch einen definierten Funktions-Testansatz bestimmt werden, der mit einer bestimmten biologischen, morphologischen oder phänotypischen Veränderung in der Zelle assoziiert ist.
Die Beschreibung beschreibt Polypeptide mit kleineren Modifikationen der primären Aminosäuresequenzen von LIGHT (p30), des HVEM oder der Fusionsproteine (z. B. p30 des HVEM-Fusionsproteins). Dies kann zu Proteinen führen, die eine im Wesentlichen gleichwertige Aktivität aufweisen, z. B. im Vergleich zu p30, dem LIGHT-t66-Protein und den anderen nachstehend beschrieben Mutanten; sowie dem HVEM:Fc-Polypeptid, wie es hierin beschrieben wird. Solche Modifikationen können spezifisch konstruiert werden, z. B. durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden. Alternativ kann es sich um spontane Mutationen handeln. Alle Polypeptide, die mit diesen Modifikationen hergestellt werden können, werden hierin ebenfalls beschrieben, solange die Bindungs- oder die biologische Aktivität von LIGHT (p30) oder des HVEM:Fc vorhanden ist, wie z. B. die Modulierung zellulärer Antwortreaktionen durch die Bindung an den HVEM und an den LTβR oder die Hemmung der Bindung des HSV an den HVEM oder die Modulierung von Entzündungen. Des Weiteren kann die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren auch zu einer Modifizierung der Struktur des so erhaltenen Moleküls führen, ohne dass seine Aktivität dabei signifikant verändert wird (z. B. LIGHT-t66, siehe nachstehend).
Somit beschreibt die Beschreibung kleinere, aktive (d. h. „funktionelle") Formen von LIGHT (p30) einschließlich verkürzter, löslicher homotrimerer Formen sowie HVEM-Moleküle, die alternative Verwendungszwecke besitzen. So können zum Beispiel amino- oder carboxyterminale Aminosäuren, die für die Aktivität nicht erforderlich sind, entfernt werden. Das (nachstehend beschriebene) HVEM:Fc-Fusionspolypeptid ist zum Beispiel dadurch charakterisiert, dass es die Aminosäuren 1 bis einschließlich 205 des HVEM besitzt. Ein weiteres Beispiel umfasst ein verkürztes, lösliches homotrimeres p30-Protein, LIGHT-t66, das in Einzelheiten im nachstehenden Beispiel 12 beschrieben wird.
Die Polypeptide umfassen auch konservative Variationen, Mimetika und Peptidmimetika der Polypeptidsequenz. Der Begriff „konservative Variation", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet den Ersatz eines Aminosäurerestes durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Beispiele für konservative Variationen umfassen den Austausch eines hydrophoben Restes wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für einen anderen oder den Austausch eines polaren Restes für einen anderen wie z. B. den Austausch von Lysin durch Arginin, Asparaginsäure durch Glutaminsäure oder Asparagin durch Glutamin und ähnliche. Der Begriff „konservative Variation" umfasst auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht-substituierten Eltern-Aminosäure, vorausgesetzt, dass Antikörper, die gegen das substituierte Polypeptid erzeugt wurden, auch mit dem nicht-substituierten Polypeptid immunologisch reagieren.
Die Begriffe „Mimetika" und „Peptidmimetika" beziehen sich auf synthetische chemische Verbindungen, die im Wesentlichen die gleichen strukturellen und/oder funktionellen Eigenschaften der Polypeptide aufweisen, wie z. B. Translokations-Domänen oder Bindedomänen für Odorans-Liganden oder chimäre Rezeptoren der Erfindung. Das Mimetikum kann gänzlich aus synthetischen, nicht-natürlichen Analoga von Aminosäuren bestehen, oder es handelt sich um ein chimäres Molekül mit teilweise natürlichen Peptid-Aminosäuren und teilweise nicht-natürlichen Analoga von Aminosäuren. Das Mimetikum kann auch eine beliebige Menge an natürlichen konservativen Aminosäureaustauschen enthalten, solange solche Austausche die Struktur und/oder die Aktivität des Mimetikums nicht wesentlich verändern. Was die Polypeptide der Erfindung betrifft, bei denen es sich um konservative Varianten handelt, kann durch Routineexperimente bestimmt werden, ob ein Mimetikum sich im Rahmen der Erfindung befindet, d. h. ob seine Struktur und/oder Funktion nicht wesentlich verändert ist. Polypeptid-Mimetika-Zusammensetzungen können jede beliebige Kombination von nicht-natürlichen strukturellen Bestandteilen enthalten, für die drei Strukturgruppen typisch sind: a) Reste verbindende Gruppen, die sich von der natürlichen Verknüpfung der Amidbindung („Peptidbindung") unterscheiden; b) nicht natürliche Reste anstelle natürlich vorkommender Aminosäurereste oder c) Reste, die eine Nachbildung (Mimikry) der Sekundärstruktur induzieren, d. h. eine Sekundärstruktur induzieren oder stabilisieren, wie z. B. eine beta-Schleife, eine gamma-Schleife, ein beta-Faltblatt, eine alpha-Helix-Konformation und ähnliche. Ein Polypeptid kann als ein Mimetikum charakterisiert werden, wenn alle oder einige seiner Reste durch andere chemische Mittel als durch natürliche Peptidbindungen verbunden sind. Individuelle peptidmimetische Reste können durch Peptidbindungen, andere chemische Bindungen oder Kopplungsmittel wie z. B. durch Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimid-Ester, bifunktionelle Maleimide, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) verknüpft werden. Verbindende Gruppen, die eine Alternative gegenüber der traditionellen Verknüpfung der Amidbindung („Peptidbindung") darstellen, umfassen z. B. Ketomethylen (z. B. -C(=O)-CH₂- für -C(=O)-NH-), Aminomethylen (CH₂-NH), Ethylen, Olefin (CH=CH), Ether (CH₂-O), Thioether (CH₂-S), Tetrazol (CN₄-), Thiazol, Retroamid, Thioamid oder Ester (vergleiche Z. B. mit Spatola (1983) in: „Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", Band 7, S. 267-357, „Peptide Backbone Modifications", Marcel Dekker, NY). Ein Polypeptid kann auch dadurch als ein Mimetikum charakterisiert sein, indem es überall oder nur an einigen Stellen nicht-natürliche Reste anstelle der natürlich vorkommenden Aminosäurereste enthält; nicht-natürliche Reste werden in der wissenschaftlichen und in der Patentliteraturgut beschrieben.
Die Antagonisten und die bindenden Agenzien der Erfindung können auch Antikörper gegen p30 (LIGHT) umfassen. Antikörper und Polypeptide, die an den HVEM binden oder als Antagonist gegen ihn wirken (wie nachstehend ausführlicher diskutiert wird), sowie Fusionsproteine, werden hierin ebenfalls beschrieben.
Das Fusionsprotein umfasst die Volllängen-HVEM-Polypeptidsequenz sowie Fragmente der Sequenz, wobei bestimmte Peptidsequenzen ausgeschlossen sein können. Das LIGHT-(p30) Polypeptid umfasst gleichfalls das Volllängen-p30, homotrimere Formen, Fusionsproteine, die die p30-Sequenz enthalten, sowie Fragmente der Sequenz, bei denen bestimmte Aminosäuren, Peptide oder Sequenzbereiche ausgeschlossen sein können, sowie homo- oder heterotrimere Formen dieser Fragmente wie z. B. LIGHT-t66, wie es nachstehend beschrieben wird. Solche Fragmente können bei der Erzeugung der Antikörper der Erfindung nützlich sein, einschließlich polyclonaler und monoclonaler Antikörper.
Solche ausgeschlossenen Sequenzen können zum Beispiel Fragmente umfassen, denen die carboxyterminale Region des Volllängen-HVEM-Polypeptids fehlt. Darüber hinaus können die Fusionspolypeptide eine HVEM-Polypeptidsequenz oder ein Fragment davon umfassen.
Bei der „zweiten" Polypeptidsequenz des Fusionsproteins kann es sich um jedes beliebige Polypeptid handeln, von dem man wünscht, es mit einer Polypeptidsequenz der Erfindung zu verknüpfen (z. B. mit p30 oder der HVEM-Sequenz), solange das p30/HVEM:zweites-Polypeptid-Fusionsprotein seine Bindungsfähigkeit (z. B. Blockierung eines Virus oder Bindung an einen Rezeptor) oder seine biologische Aktivität beibehält, die im Wesentlichen ähnlich zu der Bindungsfähigkeit (z. B. an Rezeptoren) oder der biologischen Aktivität eines p30:Fc- oder eines HVEM:Fc-Fusionsproteins (d. h. Entzündungen hemmend oder modulierend) ist. Die Identifizierung und die Bestimmung der zweiten Polypeptidsequenz, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, kann durch Fachleute leicht erfolgen. So können zum Beispiel Fachleute bestimmen, ob ein Fusionskonstrukt die gewünschten Rezeptor-Bindungseigenschaften oder die biologische Aktivität beibehalten hat, indem sie die Verfahren und die Techniken anwenden, die in den Beispielen, nachstehend, beschrieben werden.
Die Beschreibung beschreibt auch isolierte Nucleinsäuresequenzen oder Polynucleotide, die das hierin beschriebene Polypeptid codieren. Nucleinsäuren, die ein beliebiges der vorstehenden Polypeptide, Fragmente, Modifikationen und Fusionsproteine codieren, werden hierin ebenfalls beschrieben. Daher umfasst der Begriff „isoliert", wie er hierin verwendet wird, Polynucleotide, die im Wesentliche frei sind von anderen Nucleinsäuren, Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien, mit denen sie in der Natur assoziiert sind. Polynucleotidsequenzen umfassen DNA-, cDNA- und RNA-Sequenzen, die Antagonisten, Bindeagenzien oder ein Fusionspolypeptid codieren. Dies sollte zum Beispiel so verstanden werden, dass alle Polynucleotide, die das gesamte oder einen Teil von LIGHT oder des HVEM oder der Fusionspolypeptide davon codieren, hierin ebenfalls mit eingeschlossen sind, solange sie ein Polypeptid codieren, das die Aktivität von LIGHT:Fc oder von HVEM:Fc besitzt, wie sie hierin beschrieben wird. Solche Polynucleotide umfassen (isolierte) natürlich vorkommende, rekombinante, synthetische und in absichtlicher Weise manipulierte Polynucleotide. So können zum Beispiel Teile der mRNA-Sequenz aufgrund alternativer RNA-Spleißmuster oder der Verwendung von alternativen Promotoren bei der RNA-Transkription verändert sein. Als weiteres Beispiel kann das Polynucleotid einer ortsgerichteten Mutagenese unterworfen werden. Die Polynucleotide umfassen auch Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes degeneriert sind. Es gibt 20 natürliche Aminosäuren, von denen die meisten durch mehr als ein Codon spezifiziert sind.
Die hierin beschriebenen Nucleinsäuren umfassen Sequenzen, die ein Polypeptid, einen Antagonisten, ein bindendes Agens oder ein Fusionsprotein (z. B. LIGHT:Fc oder HVEM:Fc) sowie Fragmente des natürlich vorkommenden LIGHT- und des HVEM-Proteins codieren, und jede beliebige Nucleotidsequenz, die mit dem Komplement dieser Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann. Die Beschreibung beschreibt auch degenerierte Varianten dieser Sequenzen sowohl für p30 als auch für die Fusionspolypeptide der Erfindung. Zum Beispiel können die LIGHT-p30-Nucleinsäuren Sequenzen umfassen, die das natürlich vorkommende p30 und beliebige Nucleotidsequenzen codieren, die mit dem Komplement der Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wie hierin beschrieben.
Der Ausdruck „stringente Bedingungen" bezieht sich auf Hybridisierungs- oder Waschbedingungen, unter denen eine Nucleinsäure wie z. B. eine Proben-Nucleinsäure oder eine Sonde primär nur mit ihrer Zielsequenz hybridisiert, welche typischerweise in einem komplexen Gemisch von Nucleinsäuren vorliegt, aber nicht mit anderen Sequenzen in signifikantem Ausmaß. Ein positives Signal (z. B. die Identifizierung einer Nucleinsäure) weist in etwa die 10-fache Stärke der Hintergrund-Hybridisierung auf. Die stringenten Bedingungen sind von der Sequenz abhängig und unterscheiden unter unterschiedlichen Bedingungen. Längere Sequenzen hybridisieren bei höheren Temperaturen spezifisch. Eine umfangreiche Anleitung für die Hybridisierung von Nucleinsäuren befindet sich in: Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen so gewählt, dass sie bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert etwa 5-10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen Sequenz liegen. Die Tm ist diejenige Temperatur (unter definierter/m Ionenstärke, pH-Wert und Konzentration der Nucleinsäure), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Sonde mit der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisiert (da die Zielsequenz im Überschuss vorliegt, sind beim Tm im Gleichgewicht 50% der Sonden besetzt).
Bei den stringenten Bedingungen handelt es sich um solche, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natrium-Ionen beträgt, typischerweise liegt die Konzentration bei etwa 0,01 bis 1,0 M Natrium-Ionen (oder anderen Salzen) bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3, und die Temperatur beträgt mindestes etwa 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nucleotide lang) und mindestens etwa 60°C bei langen Sonden (z. B. länger als 50 Nucleotide). Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z. B. Formamid erreicht werden.
Stringente Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden können, um Nucleinsäuren zu identifizieren, können die Hybridisierung in einem Puffer, der 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS enthält, bei 42°C umfassen, oder die Hybridisierung in einem Puffer, der 5 × SSC und 1% SDS enthält, bei 65°C umfassen, wobei anschießend jeweils mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C gewaschen wird. Ein Beispiel für eine stringente Hybridisierungsbedingung kann auch eine Hybridisierung in einem Puffer mit 40% Formamid, 1 M NaCl und 1% SDS bei 37°C und eine Waschung mit 1 × SSC bei 45°C umfassen. Alternativ kann eine Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 mM EDTA bei 65°C und eine Waschung mit 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C verwendet werden, um Nucleinsäuren zu identifizieren und zu isolieren. Fachleute werden rasch erkennen, dass alternative, aber vergleichbare Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen mit ähnlicher Stringenz bereitzustellen.
Die Waschbedingungen, die verwendet werden, um Nucleinsäuren zu identifizieren, umfassen z. B. eine Salzkonzentration von etwa 0,02 molar bei einem pH-Wert von 7 und eine Temperatur von mindestens etwa 50°C oder etwa 55°C bis etwa 60°C; oder eine Salzkonzentration von etwa 0,15 M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten; oder eine Salzkonzentration von etwa 0,2 × SSC bei einer Temperatur von mindestens etwa 50°C oder etwa 55°C bis etwa 60°C für etwa 15 bis etwa 20 Minuten; oder der Hybridisierungskomplex wird zweimal mit einer Lösung mit einer Salzkonzentration von etwa 2 × SSC, die 0,1% SDS enthält, bei Zimmertemperatur 15 Minuten gewaschen und dann zweimal mit 0,1 × SSC, das 0,1% SDS enthält, bei 68°C 15 Minuten gewaschen; oder äquivalente Bedingungen. Eine stringente Bedingung für die Waschung kann auch 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C sein. In den Fällen, in denen die Nucleinsäuremoleküle Desoxyoligonucleotide („Oligos") sind, können die stringenten Bedingungen die Waschung in 6 × SSC/0,05% Natriumpyrophosphat bei 37°C (für Oligos mit 14 Basen), bei 48°C (für Oligos mit 17 Basen), bei 55°C (für Oligos mit 20 Basen) und bei 60°C (für Oligos mit 23 Basen) umfassen. Vergleiche mit Sambrook, Hrsg., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2. Auflage), Bde. 1-3, Cold Spring Harbor Laborstory (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York (1997) oder mit Tijssen (1993), vorstehend, im Hinblick auf genaue Beschreibungen äquivalenter Hybridisierungs- und Waschbedingungen sowie Reagenzien und Puffer wie z. B. dem SSC-Puffer und äquivalente Reagenzien und Bedingungen.
Diese Nucleinsäuremoleküle können auch p30-Antisense-Moleküle codieren oder so wie diese wirken, und sie sind zum Beispiel bei der Regulierung des p30 nützlich (für und/oder als Antisense-Primer bei Amplifikationsreaktionen der p30-Nucleinsäuresequenzen). Weiterhin können solche Moleküle auch als Bestandteile von Durchmusterungsverfahren verwendet werden, wobei zum Beispiel die Anwesenheit eines p30-Gens nachgewiesen werden kann.
Neben den vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen können auch Volllängen-cDNA- oder genomische Sequenzen durch die im Fachgebiet wohlbekannten molekularbiologischen Verfahren identifiziert und leicht isoliert werden, ohne dass dabei umfangreiche Experimente durchgeführt werden müssen.
DNA-Sequenzen, wie sie hierin beschrieben werden, können durch mehrere Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann die DNA unter Verwendung einer Hybridisierung oder mittels auf Computern basierenden Verfahren isoliert werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Diese umfassen: (a) die Hybridisierung von genomischer DNA oder von cDNA-Genbanken mit Sonden, um homologe Nucleotidsequenzen nachzuweisen; (b) die Durchmusterung von Expressions-Genbanken mit Antikörpern, um clonierte DNA-Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Eigenschaften nachzuweisen; (c) die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit genomischer DNA oder mit cDNA unter Verwendung von Primern, die in der Lage sind, sich an die DNA-Sequenz von Interesse anzulagern; (d) die Computersuche in Sequenzdatenbanken nach ähnlichen Sequenzen; (e) die differentielle Durchmusterung einer subtrahierten DNA-Genbank und (f) die genomische Sequenzierung in großem Umfang mit Hilfe von exprimierten sequenzmarkierten Stellen (EST) einer cDNA-Genbank aus T-Zellen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Polynucleotide (z. B. das p30-Polynucleotid und das HVEM:Fc-Fusionsprotein-Polynucleotid) stammen bevorzugt aus einem Säuger-Organismus.
Durchmusterungsverfahren, die auf einer Nucleinsäure-Hybridisierung basieren, ermöglichen es, jede beliebige Gensequenz aus jedem beliebigen Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, dass eine geeignete Sonde zur Verfügung steht. Oligonucleotid-Sonden, die einem Teil der Sequenz entsprechen, die das in Frage kommende Protein codiert, können chemisch synthetisiert werden. Dies erfordert, dass kurze Oligopeptid-Sequenzbereiche der Aminosäuresequenz bekannt sein müssen. Die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, wobei jedoch die Degeneriertheit des Codes berücksichtigt werden muss. Wenn die Sequenz degeneriert ist, ist es möglich eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen. Diese umfasst ein heterogenes Gemisch aus denaturierter doppelsträngiger DNA. Bei einer solchen Durchmusterung wird die Hybridisierung bevorzugt entweder mit einzelstängiger DNA oder mit denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt. Eine Hybridisierung ist besonders nützlich beim Nachweis von cDNA-Clonen, die aus Quellen stammen, in denen nur eine sehr geringe Menge an mRNA-Sequenzen vorliegt, die dem Polypeptid von Interesse entsprechen. Mit anderen Worten ist es zum Beispiel möglich, durch Verwendung von stringenten Hybridisierungsbedingungen, die so ausgelegt werden, dass eine unspezifische Bindung vermieden wird, die autoradiographische Sichtbarmachung eines spezifischen cDNA-Clons zu erreichen, dies erfolgt durch die Hybridisierung der Ziel-DNA mit der einzigartigen Sonde in dem Gemisch, die ihr vollständiges Komplement darstellt (Wallace et al., (1981) Nucl. Acids Res. 9:879). Alternativ kann auch eine Subtraktions-Genbank nützlich sein, um unspezifische cDNA-Clone zu eliminieren.
Wenn die vollständige Sequenz der Aminosäurereste des gewünschten Polypeptids nicht bekannt ist, ist eine direkte Synthese der DNA-Sequenz nicht möglich, und das Verfahren der Wahl ist die Synthese von cDNA-Sequenzen. Unter den Standardverfahren für die Isolierung von cDNA-Sequenzen von Interesse ist die Herstellung von Plasmide oder Phagen enthaltenden cDNA-Genbanken, die durch eine reverse Transkription der mRNA erhalten werden, welche in den Spenderzellen mit einem hohen Spiegel der Genexpression in größerer Menge vorhanden ist. Wenn sie in Kombination mit der Polymerase-Kettenreaktionstechnologie verwendet wird, können sogar seltene Expressionsprodukte cloniert werden. In den Fällen, in denen signifikante Teile der Aminosäuresequenz des Polypeptids bekannt sind, kann die Herstellung von markierten einzel- oder doppelsträngigen DNA- oder RNA-Sonden-Sequenzen, wobei eine Sequenz dupliziert wird, die möglicherweise in der Ziel-cDNA vorhanden ist, bei DNA/DNA-Hybridisierungsverfahren angewendet werden, die mit den clonierten Kopien der cDNA durchgeführt werden, welche zuvor durch Denaturierung in die einzelsträngige Form überführt wurden (Jay et al., (1983) Nucl. Acids Res. 11:2325). Geeignete Oligonucleotid-Sonden und -Primer können durch eine „Rück-Übersetzung" der Aminosäuresequenz des p30-Polypeptids, welche durch N-terminale Aminosäuresequenzierung erhalten wurde, konstruiert werden.
Eine cDNA-Expressions-Genbank wie z. B. eine Lambda gt11 kann auf p30-Peptide hin, die mindestens ein Epitop besitzen, indirekt durchmustert werden, dies erfolgt unter Verwendung von Antikörpern, die für p30 spezifisch sind. Solche Antikörper können entweder in polyclonaler oder in monoclonaler Form erhalten worden sein, und sie können dazu verwendet werden, ein Expressionsprodukt nachzuweisen, das ein Indiz für die Anwesenheit einer p30-cDNA ist.
Veränderungen in der p30-Nucleinsäure umfassen intragene Mutationen (z. B. Punktmutationen, Nonsense-(Stopp), Missense-, Spleißstellen- und Leserasterverschiebungs-Mutationen) und heterozygote oder homozygote Deletionen. Der Nachweis solcher Veränderungen kann mittels Standardverfahren erfolgen, die den Fachleuten bekannt sind, einschließlich Sequenzanalyse, Southern-Blot-Analyse, auf einer PCR basierende Analysen (z. B. Multiplex-PCR, sequenzmarkierte Stellen (STS) und in situ-Hybridisierung. Die Proteine können zum Beispiel durch Standard-SDS-PAGE und/oder Immunpräzipitations-Analyse und/oder Western Blot-Analyse analysiert werden.
Die Beschreibung beschreibt ebenfalls DNA-Vektoren, die eine beliebige der vorstehend erwähnten p30 codierenden Sequenzen und/oder ihre komplementäre Sequenz (d. h. die Antisense-Sequenz) enthalten, sowie Expressionsvektoren, die eine beliebige der vorstehend erwähnten p30 codierenden Sequenzen enthalten.
Die Beschreibung beschreibt ebenfalls DNA-Vektoren, welche eine beliebige der vorstehenden Sequenzen, und die ein Fusionspolypeptid codieren, und/oder ihre komplementären Sequenzen enthalten, sowie Expressionsvektoren, die eine beliebige der vorstehend erwähnten codierenden Sequenzen enthalten. Ein Expressionsvektor besteht aus einer oder enthält eine Nucleinsäure, bei der eine Polynucleotidsequenz, die ein Peptid oder ein Polypeptid codiert, mit einem Promotor oder mit einer Kombination aus einem Promotor und einem Enhancer funktionell verknüpft ist. Ein Promotor ist ein die Transkription regulierendes Element, das aus einer Region eines DNA-Moleküls besteht, die typischerweise innerhalb von 100 Nucleotidpaaren vor (stromaufwärts) des Punktes liegt, an dem die Transkription beginnt. Ein Enhancer ist ein weiteres, die Transkription regulierendes Element. Ein Enhancer stellt hinsichtlich der Zeit, des Ortes und des Expressionsspiegels Spezifität bereit. Anders als ein Promotor kann ein Enhancer auch dann funktionieren, wenn er in einem variablen Abstand von dem Transkriptionsort lokalisiert ist, vorausgesetzt, dass ein Promotor vorhanden ist. Ein Enhancer kann auch stromabwärts der Transkriptions-Initiationsstelle lokalisiert sein. Die codierende Sequenz in einem Expressionsvektor ist auch mit einer die Transkription terminierenden Region funktionell verknüpft. Um eine codierende Sequenz unter die Kontrolle eines Promotors zu stellen, ist es nötig, die Translations-Initiationsstelle des zu translatierenden Leserasters des Peptids oder des Polypeptids zwischen einem und etwa 50 Nucleotide stromabwärts (3') des Promotors zu positionieren. Solche regulatorischen Elemente umfassen das sehr frühe Gen des Cytomegalievirus hCMV, den frühen oder den späten Promotor des SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die Haupt-Operator- und Promotor-Region des Phagen A, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für die 3-Phosphoglycerat-Kinase, den Promotor der sauren Phosphatase und die Promotoren des α-Paarungsfaktors der Hefe, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Expressionsvektoren und Verfahren für ihre Konstruktion sind den Fachleuten bekannt. Geeignete Vektoren umfassen unter anderem Plasmide und virale Vektoren wie z. B. Herpesviren, Retroviren, Kanarien-Pocken-Viren, Adenoviren und Adenoassoziierte Viren.
Die Beschreibung beschreibt geeignete Wirts-Zelllinien, die mit den Expressionsvektoren, welche die beschriebenen Nucleinsäuresequenzen enthalten, transfiziert sind. Zellen, die für die Transfektion zur Expression eines Fusionspolypeptids in seinen verschiedenen natürlichen oder veränderten Formen verwendet werden können, umfassen zum Beispiel HEK293-Zellen aus Säugern oder Sf9- und TN5-Insektenzellen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Zellen werden durch eine Vielzahl von Verfahren transfiziert, die üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, wie zum Beispiel durch Elektroporation oder durch Calciumphosphat-Präzipitation. Die Gene können in die Zellen auch durch Transduktion mit viralen Vektoren wie z. B. Retroviren eingebracht werden. Erfolgreich transfizierte Zelllinien werden durch geeignete Mittel selektiert, die den Fachleuten bekannt sind, wie z. B. durch Verwendung eines Gewebekultur-Mediums, das mit Wirkstoffen wie zum Beispiel Geneticin^TM (G418) oder Puromycin ergänzt wurde, für das der relevante Expressionsvektor ein Resistenzgen enthält. Erfolgreich transfizierte Zelllinien werden auf die Expression der Fusionsmoleküle durch eine Reihe möglicher Verfahren durchmustert, wie z. B. durch durchflusscytometrische Analyse.
„Wirtszellen" sind Zellen, in denen ein Vektor vermehrt werden kann und in denen seine DNA exprimiert wird. Der Begriff umfasst auch die gesamte Nachkommenschaft der treffenden Wirtszelle. Dies sollte so verstanden werden, dass nicht die gesamte Nachkommenschaft mit der Elternzelle identisch zu sein braucht, da Mutationen im Verlauf der Replikation auftreten können. Eine solche Nachkommenschaft ist jedoch mit eingeschlossen, wenn der Begriff „Wirtszelle" verwendet wird.
Antikörper, die antigene Epitope innerhalb der Aminosäuresequenz des p30-Polypeptids spezifisch erkennen, sind ebenfalls in die Erfindung mit eingeschlossen. Solche Antikörper umfassen polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper, menschliche, humanisierte oder chimäre Antikörper, Einzelketten-Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente und Epitop-bindende Fragmente aus einem beliebigen der vorstehenden Antikörper, sind aber nicht auf diese beschränkt. Solche Antikörper können als Antagonisten oder als bindende Agenzien bei der Modulierung einer entzündlichen Reaktion wirken. So können zum Beispiel Antikörper gegen p30 durch Wechselwirkung mit p30 und durch die Verhinderung der Bindung von p30 an seinen Rezeptor wirken. In ähnlicher Weise können Antikörper, die an den HVEM binden oder mit ihm in Wechselwirkung treten, ebenfalls so wirken, dass sie die Bindung des HVEM an seinen Liganden (z. B. p30) verhindern.
Die Antikörper der Erfindung können zum Beispiel bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und lymphocytären Bösartigkeiten verwendet werden. Sie können auch verwendet werden, um die Expression des p30 auf einer Zelle zu untersuchen und können daher als Teil eines Durchmusterungsverfahrens für die Auswahl einer geeigneten Behandlung für einen bestimmten Patienten verwendet werden. Wenn zum Beispiel die Tumorzellen eines Lymphom- oder eines Leukämie-Patienten p30 exprimieren, können Anti-p30-Antikörper oder Immuntoxin-Konjugate eines Anti-p30-Antikörpers für eine Therapie bei diesem Patienten verwendet werden. Solche Antikörper können ebenfalls bei den Durchmusterungsverfahren der Erfindung verwendet werden.
Zur Herstellung der Antikörper der Erfindung wird ein Wirtstier durch eine Injektion entweder mit dem Fusionspolypeptid, den individuellen Polypeptiden, die das Fusionspolypeptid enthalten (z. B. HVEM), mit Zellen, die das Fusionspolypeptid exprimieren, oder mit dem p30-Polypeptid immunisiert. Alternativ können Peptide, die spezifischen Regionen (d. h. antigenen Epitopen) dieser Polypeptide entsprechen, als Immunogene verwendet werden. Solche Wirtstiere können Kaninchen, Mäuse und Ratten umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Es können je nach Wirtsspecies verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die Immunantwort zu steigern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freundsches (komplettes oder inkomplettes) Adjuvanz, Mineralgele wie z. B. Aluminiumhydroxid, Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Polyclonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren der immunisierten Tiere stammen.
Um die Immunogenität weiter zu steigern, kann das Immunogen an einen Träger gebunden werden. Beispiele für solche Träger sind KLH (keyhole limpet hemocyanin) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine wie z. B. Ovalbumin, Maus-Serumalbumin oder Kaninchen-Serumalbumin können ebenfalls als Träger verwendet werden. Verfahren zur Kopplung eines Peptids an einen Träger sind im Fachgebiet wohlbekannt und umfassen die Verwendung von Glutaraldehyd, Carbodiimid und m-Maleimid-benzoyl-N-hydroxysuccinimidester.
Die Menge des Antigens, die verwendet werden soll, kann durch Fachleute ohne umfangreiche Experimente leicht bestimmt werden. Das Antigen kann über eine Reihe von Wegen verabreicht werden (z. B. subcutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion der polyclonalen Antikörper wird durch die Entnahme von Blutproben aus dem immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung überwacht. Wenn der gewünschte Spiegel des Antikörpers erreicht ist, wird dem Tier Blut entnommen und das Serum wird aufbewahrt.
Monoclonale Antiköper, die homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen darstellen, können durch jedes beliebige Verfahren erhalten werden, das die Produktion von Antikörpermolekülen durch permanente Zelllinien in Kultur ermöglicht. Diese Verfahren umfassen das Hybridom-Verfahren (Köhler und Milstein (1975) Nature 256:495-497; US-Patent Nr. 4,376,110 ; Howell und Lane (1988) Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.), das menschliche B-Zellen-Hybridom-Verfahren (Kosbor (1983) Immunology Today 4:72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026) und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.), sind aber nicht auf diese beschränkt. Solche Antikörper können jeder beliebigen Immunglobulin-Klasse angehören, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, sowie jeder beliebigen Unterklasse davon.
Darüber hinaus können Verfahren verwendet werden, die für die Herstellung von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; Neuberger (1984) Nature 312:604; Takeda (1985) Nature 314:452). Diese umfassen das Spleißen eines Teils eines Gens, das einen Maus-Antikörper mit geeigneter Antigen-Spezifität codiert, mit einem Teil eines Gens, das einen menschlichen Antikörper mit einer geeigneten biologischen Aktivität codiert. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in dem unterschiedliche Teile aus unterschiedlichen Tierarten stammen, wie z. B. solche Antikörper, die eine variable Region, welche aus einem murinen monoclonalen Antikörper stammt, und die konstante Region eines menschlichen Immunglobulins enthalten. Solche chimären Antikörper können zum Beispiel auch durch die Immunisierung von Mäusen erhalten werden, die den menschlichen Genort, der IgH codiert, und 6 und 8 für die leichte Kette enthalten.
Alternativ können Verfahren, die für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden ( US-Patent Nr. 4,946,778 ; Bird (1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5859 und Ward et al. (1989) Nature 334:544), angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen Epitope des Fusionspolypeptids der Erfindung herzustellen. Einzelketten-Antikörper werden durch die Verknüpfung des schweren und des leichten Kettenfragments der Fv-Region über eine Aminosäurenbrücke gebildet, woraus ein Einzelketten-Polypeptid entsteht. Sie können bequem durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden.
Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Solche Fragmente umfassen zum Beispiel F(ab')₂-Fragmente, die durch einen Verdau des Antikörpermoleküls mit Pepsin hergestellt werden können, und Fab-Fragmente, die durch eine Reduzierung der Disulfid-Brücken von F(ab')₂-Fragmenten hergestellt werden können, sind aber nicht auf diese beschränkt. Alternativ können Fab-Expressionsbanken konstruiert werden (Huse (1989) Science 246:1275), um eine rasche und leichte Identifizierung von monoclonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen. Verfahren für die Durchmusterung von Antikörpern auf ihre Bindungsspezifität sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Die Erfindung betrifft in vitro-Systeme, die entworfen wurden, um Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, zelluläre Antwortreaktionen zu modulieren, die durch LTβR-Rezeptor-Polypeptide vermittelt werden. „Zelluläre Antwortreaktionen" bezieht sich hierin auf die Zellaktivierung, die Aufnahme des HSV in die Zelle oder auf Veränderungen in der Aktivierung oder der Produktion von Mediatoren von Entzündungen wie z. B. Entzündungszellen, Cytokinen, Prostaglandinen und Leukotrienen. Diese zellulären Antwortreaktionen werden durch eine Wechselwirkung (a) des HVEM mit p30, gD oder LTα oder (b) des LTβR mit p30 ausgelöst.
Der Begriff „Ligand" bezieht sich auf ein Polypeptid oder eine Verbindung, das/die an ein Rezeptorprotein mit hoher Affinität und in spezifischer Weise bindet, um eine funktionelle Antwortreaktion hervorzurufen. Liganden der Erfindung umfassen zum Beispiel p30, gD oder LTα. Der Begriff „Rezeptor" bezieht sich hierin auf ein Polypeptid, das, wenn ein Ligand an es gebunden hat, eine zelluläre Antwortreaktion induziert. Rezeptoren der Erfindung umfassen den LTβR. Der Begriff „bindendes Agens" bezieht sich auf ein Polypeptid oder auf eine Verbindung, das/die an einen Rezeptor oder an einen Liganden mit hoher Affinität und in spezifischer Weise bindet und das/die eine funktionelle Antwortreaktion hervorrufen kann oder auch nicht. Bei einer Test-Verbindung kann es sich um eine definierte, isolierte und gereinigte Kandidaten-Verbindung (z. B. ein synthetisches kleines Molekül) oder um ein Mitglied einer kombinatorischen Bank handeln, oder sie kann in einer biologischen Probe vorliegen, wie z. B. in einer biologischen Flüssigkeit, einem Gewebeextrakt, einer subzellulären Fraktion oder in einem Zelllysat.
Die Beschreibung beschreibt einen Testansatz für die Identifizierung einer Verbindung, welche eine durch ein an den HVEM bindendes Agens vermittelte zelluläre Antwortreaktion beeinflusst. Dieser Testansatz umfasst: (a) die Inkubation der Verbindung mit einem HVEM-Polypeptid oder mit einer Zelle, die ein HVEM-Polypeptid exprimiert, und einem an den HVEM bindenden Agens, und zwar unter Bedingungen, die es den Komponenten ermöglichen, in Wechselwirkung zu treten; und (b) die Bestimmung der Wirkung der Verbindung auf die zelluläre Antwortreaktion, die durch das an den HVEM bindende Agens vermittelt wird. Im Rahmen der Erfindung befindet sich ein Testansatz für die Identifizierung einer Verbindung, welche eine durch den LTβR-p30-Komplex vermittelte zelluläre Antwortreaktion beeinflusst. Dieser Testansatz umfasst: (a) die Inkubation der Verbindung mit einem LTβR-Polypeptid oder mit einer Zelle, die das LTβR-Polypeptid exprimiert, und mit p30, und zwar unter Bedingungen, die es den Komponenten ermöglichen, in Wechselwirkung zu treten; und (b) die Bestimmung der Wirkung der Verbindung auf die durch den LTβR-p30-Komplex vermittelte zelluläre Antwortreaktion. In den Testansätzen der Erfindung werden Verbindungen auf ihre Fähigkeit hin durchmustert, eine Zellaktivierung zu modulieren, die durch die Wechselwirkung des LTβR mit einem Liganden vermittelt wurde.
Die Erfindung betrifft Zellantwort-Testansätze. Diese Zellantwort-Testansätze messen entweder die Zellaktivierung, die Infektion einer Zelle durch HSV oder die Modulierung einer Entzündung, indem sie Mediatoren der Entzündung wie z. B. die entzündliche Zellrekrutierung, die Aktivierung und die Produktion entzündungsfördernder Cytokine, Prostaglandine und Leukotriene beeinflussen.
Testverbindungen können auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, eine Antwortreaktion von Zellen zu modulieren, welche die Rezeptoren (z. B. den HVEM oder LTβR) exprimieren, welche durch Liganden (z. B. p30, LTα oder gD) und eine suboptimale Dosis eines Reizes, der für die Zellen geeignet ist, stimuliert wurden. Die Zellen, die den „reagierenden/antwortenden" Rezeptor exprimieren, können aus einem Individuum frisch erhalten werden, oder es kann sich um eine Zelllinie in Kultur handeln. Die Zellen können einen endogen codierten Rezeptor exprimieren oder einen Rezeptor exprimieren, der durch ein transfiziertes Gen codiert wird. Der Ligand kann den Zellantwort-Kulturen in Form eines isolierten Polypeptids oder von Kulturen von Zellen zugegeben werden, die den Liganden exprimieren, hinzugefügt werden. Die den Liganden exprimierenden Zellen können ein endogenes Gen exprimieren, das den Liganden codiert, oder sie können ein transfiziertes Gen exprimieren, das den Liganden codiert. Des Weiteren kann der Ligand an der Zelloberfläche exprimiert werden (p30 oder gD), oder er kann sekretiert werden (p30, gD oder LTα). Damit p30 oder gD sekretiert werden können, müssen aus den Genen, die sie codieren, die Regionen, welche die transmembranen Domänen codieren, deletiert werden. Die Zellaktivierung kann zum Beispiel durch die Zellproliferation, die de novo-Expression von an der Zelloberfläche befindlichen Aktivierungs-Markern oder durch die Produktion eines löslichen Faktors gemessen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zellen um Lymphocyten. Im Falle von T-Zellen können die den Rezeptor (LTβR) exprimierenden und reagierenden/antwortenden T-Zellen in Gegenwart der Testverbindung, des Liganden und einer suboptimalen Dosis eines T-Zellen-Aktivators kultiviert werden, wobei es sich z. B. um einen Anti-CD3-Antikörper, ein Lektin wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA) oder um ein Superantigen wie z. B. Staphyloccocus-Enterotoxin C (SEC) handeln kann. Als Kontrollen können Kulturen verwendet werden, welche enthalten: (a) T-Zellen alleine; (b) T-Zellen mit dem T-Zellen-Aktivator und dem Liganden, aber ohne die Testverbindung; (c) T-Zellen mit dem T-Zellen-Aktivator, ohne den Liganden und ohne die Testverbindung; (d) T-Zellen mit dem T-Zellen-Aktivator, ohne den Liganden, aber mit der Testverbindung; (e) T-Zellen ohne den T-Zellen-Aktivator, mit dem Liganden, aber ohne die Testverbindung; (f) T-Zellen ohne den T-Zellen-Aktivator, ohne den Liganden und ohne die Testverbindung; (g) T-Zellen ohne T-Zellen-Aktivator und ohne den Liganden, aber mit der Testverbindung. Die Aktivierung der T-Zellen kann durch die Proliferation der T-Zellen über den Einbau von ³H-Thymidin (vergleiche mit Beispiel 5), die Induktion von Aktivierungsmarkern wie z. B. CD69 oder CD25 oder durch die Produktion von Cytokinen wie z. B. Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4) oder Interferon-gamma (IFNγ) gemessen werden.
Im Falle von B-Lymphocyten können ähnliche Antwortreaktions-Testansätze durchgeführt werden. Bei den B-Zellen-Aktivatoren kann es sich um Mitogene wie z. B. Kermesbeeren- („pokeweed") Mitogen, Staphylococcus-Protein A oder Anti-Immunglobulin-Antikörper handeln. Die Zellaktivierung kann über die Zellproliferation (wiederum durch den Einbau von ³H-Thymidin) oder die Sekretion von Ig gemessen werden. Alternativ kann das Überleben der B-Zellen in einem suboptimalen Nährmedium gemessen werden (vergleiche mit Beispiel 5).
Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Aktivierung von Lymphocyten zu hemmen, ist ein Zeichen dafür, dass eine solche Verbindung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, an der im Wesentlichen T-Zellen beteiligt sind (zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus und multiple Sklerose) oder an der T- und B-Zellen beteiligt sind (zum Beispiel systemischer Lupus erthyematodes und Myasthenia gravis), sowie entzündlichen Störungen wie zum Beispiel Arthritis, Psoriasis und entzündliche Darmerkrankungen nützlich sein könnte. Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Lymphocyten-Aktivierung zu stimulieren, ist ein Anzeichen dafür, dass eine solche Verbindung bei der Stimulierung von immunologischen Antwortreaktionen in Individuen mit infektiösen Erkrankungen oder bei denen das Individuum immunsupprimiert ist, wie zum Beispiel bei Patienten, die eine Chemotherapie oder eine Strahlentherapie gegen Krebs erhalten, oder bei Patienten mit AIDS nützlich sein könnte.
Bei den Testansätzen für die Testverbindungen, die eine HSV-Infektion verhindern, können die Testverbindungen Kulturen mit für das HSV empfänglichen Zellen und dem HSV hinzugefügt werden. Permissive Zelllinien für die Virusinfektion umfassen menschliche Haut-Fibroblasten, periphere Blut-Lymphocyten, welche mit Agenzien behandelt wurden, die eine Aktivierung verursachen (z. B. Anti-CD3-Antikörper oder Phytohämagglutinin), sowie transformierte Zelllinien (z. B. Held-Zellen). Die Virusproduktion kann durch eine beliebige Reihe an Verfahren gemessen werden, die den Fachleuten bekannt sind, einschließlich Virus-Plaque-Testansätzen, der Produktion spezifischer Virus-Proteine, die mittels ELISA gemessen wird, oder der Verwendung eines rekombinanten Virus, das ein Indikator-Genprodukt wie z. B. β-Galactosidase codiert, d. h. ein Enzym, das durch einen kolorimetrischen Testansatz leicht nachgewiesen werden kann (Montgomery (1996) vorstehend).
Die Fähigkeit einer Testverbindung, die Infektion einer Zelle durch das HSV zu hemmen, ist ein Zeichen dafür, dass eine solche Verbindung bei der Behandlung eines Individuums mit einer HSV-Infektion nützlich sein könnte. Um zu untersuchen, ob Verbindungen, die zelluläre Antwortreaktionen beeinflussen, durch die Bindung an ein Mitglied des relevanten Rezeptor-Liganden-Paars funktionieren, können sie auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, an lösliche Formen des Rezeptors oder des Liganden zu binden; dies erfolgt durch Testansätze, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie zum Beispiel ELISAs, Western-Blot- oder Radioimmun-Testansätze. Um weiterhin auszutesten, ob die Bindung einer Testverbindung entweder an den Rezeptor oder an den Liganden zu einer Hemmung ihrer Bindung aneinander führt, kann die Testverbindung auf ihr Vermögen hin untersucht werden, die Bindung löslicher Formen des Rezeptors und des Liganden zu hemmen. Beispiele für diese Testansätze sind kompetitive ELISAs, kompetitive Western-Blot- und kompetitive Radioimmun-Testansätze.
Peptide und Polypeptide, die bei den Durchmusterungs-Testansätzen der Erfindung verwendet werden, können durch eine Reihe von Mitteln erhalten werden. Kleinere Peptide (mit einer Länge von unter 50 Aminosäuren) können bequem durch chemische Standardverfahren synthetisiert werden. Einige Polypeptide (z. B. Antikörper) können von kommerziellen Anbietern bezogen werden. Sind sie auf andere Art nicht erhältlich, können die Antikörper, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden. Für den Nachweis markierte Antikörper können entweder von kommerziellen Quellen bezogen oder leicht durch Fachleute hergestellt werden.
Polypeptide wie z. B. HVEM, LTβR, p30, gD oder LTα können aus biologischen Quellen durch den Fachleuten wohlbekannte Verfahren gereinigt werden (Protein Purification, Principles and Practice, Zweite Auflage (1987), Scopes, Springer Verlag, N.Y.). Sie können auch in ihrer natürlich vorkommenden oder in verkürzter Form oder als Fusions- oder chimäres Protein durch rekombinante DNA-Technologie unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen zum Beispiel rekombinante in vitro-DNA-Verfahren, synthetische Verfahren und die genetische Rekombination in vivo. Vergleiche zum Beispiel mit den Verfahren, die in Sambrook et al., (1989) „Molecular Cloning, A Laborstory Manual", Cold Spring Harbor Press, N.Y. und in Ausubel et al., vorstehend zitiert, beschrieben werden. Alternativ kann die RNA, welche die Proteine codiert, chemisch synthetisiert werden. Vergleiche zum Beispiel mit den Verfahren, die in „Oligonucleotide Synthesis", (1984), Gait, M.J., Hrsg., IRL Press, Oxford beschrieben werden, das hierin durch Bezugnahme vollständig enthalten ist.
Es kann eine Vielzahl von Wirts-Expressions-Systemen verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen zu exprimieren. Wenn das Peptid oder das Polypeptid löslich ist, kann es (a) aus der Kultur, d. h. aus der Wirtszelle, in den Fällen, in denen das Peptid oder das Polypeptid nicht sekretiert wird, oder (b) aus dem Kulturmedium in den Fällen, in denen das Peptid oder das Polypeptid durch die Zellen sekretiert wird, gewonnen werden. Die Expressionssysteme können auch veränderte Wirtszellen umfassen, die das Polypeptid in situ exprimieren, z. B. in der Zellemembran verankert. Die Reinigung oder die Anreicherung des Polypeptids aus einem solchen Expressionssystem kann unter Verwendung von geeigneten Detergenzien, Lipidmicellen und anderen Verfahren durchgeführt werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind. Alternativ können solche veränderten Wirtszellen selbst verwendet werden, und zwar in Situationen, in denen es wichtig ist, nicht nur die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Proteins aufrechtzuerhalten, sondern auch seine biologische Aktivität auszutesten.
Die Expressionssysteme, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, umfassen Mikroorganismen wie z. B. Bakterien (zum Beispiel E. coli und B. subtilis), die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder mit Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, welche die Nucleotidsequenzen enthalten, transformiert wurden; Hefe, die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert wurde; Insektenzellen, die mit rekombinanten viralen Expressionsvektoren (Baculovirus) infiziert wurden; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten viralen Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaik-Virus, CaMV; Tabak-Mosaik-Virus, TMV) infiziert oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren transformiert wurden; oder Säugerzellen (z. B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressionskonstrukte enthalten, welche Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. den Metallothionin-Promotor) oder aus Säugerviren stammen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
In bakteriellen Systemen kann eine Reihe von Expressionsvektoren in Abhängigkeit von dem für das exprimierte Genprodukt beabsichtigten Zweck vorteilhaft ausgewählt werden. Wenn zum Beispiel eine große Menge eines solchen Proteins hergestellt werden soll, wie z. B. für die Erzeugung von Antikörpern gegen das Protein, sind Vektoren wünschenswert, die die Expression hoher Spiegel des Fusionsproteinprodukts steuern, das leicht gereinigt werden kann. Solche Vektoren umfassen den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791), bei dem die codierende Sequenz in den Vektor individuell im Leseraster mit der lacZ-codierenden Region ligiert werden kann, so dass ein Fusionprotein hergestellt wird; plN-Vektoren (Inouye (1985) Nucl. Acids Res. 13:3101; Van Heeke (1989) J. Biol. Chem. 264:5503) und ähnliche, sind aber nicht auf diese beschränkt. Es können auch pGEX-Vektoren verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionproteine mit der Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können aus den lysierten Zellen leicht durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren wurden so konstruiert, dass sie eine Thrombin- oder eine Faktor Xa-Protease-Spaltstelle umfassen, so dass das clonierte Ziel-Genprodukt von der GST-Einheit freigesetzt werden kann. Es wird vorausgesetzt, dass die Polypeptide, die für die Durchmusterungs-Testansätze verwendet werden, entweder natürlich vorkommende Formen der Polypeptide sein können oder Fusionsproteine sein können, die die Polypeptide enthalten. Bei dem irrelevanten Teil des Fusionsproteins kann es sich zum Beispiel um den Fc-Anteil des Immunglobulins G, um einen Hexa-Histidin-Rest oder um die GST handeln.
In Säuger-Wirtszellen kann eine Reihe an auf Viren basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In den Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die Nucleotidsequenz von Interesse mit einem Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, wie z. B. dem späten Promotor und der dreiteiligen Leader-Sequenz. Diese chimäres Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch Rekombination in vitro oder in vivo eingebaut werden. Der Einbau in eine nicht essentielle Region des viralen Genoms (z. B. die Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig und in der Lage ist, das Genprodukt in infizierten Wirten zu exprimieren (vergleiche z. B. mit Logan und Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655). Für eine effiziente Translation der inserierten Nucleotidsequenzen können auch spezifische Initiations-Signale erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiations-Codon und benachbarte Sequenzen. In den Fällen, in denen ein vollständiges Gen oder eine vollständige cDNA, das/die sein/ihr eigenes Initiations-Codon und benachbarte Sequenzen enthält, in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, werden keine zusätzlichen Translations-Kontrollsignale benötigt. In den Fällen, in denen jedoch nur ein Teil der codierenden Sequenz inseriert wird, müssen exogene Translations-Kontrollsignale, die z. B. das ATG-Initiations-Codon umfassen, bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss sich das Initiations-Codon mit dem Leseraster der gewünschten codierenden Sequenz in Phase befinden, um die Translation der vollständigen Insertion sicherzustellen. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiations-Codons können aus einer Vielzahl von Quellen stammen und sowohl natürlich als auch synthetisch sein. Die Effizienz der Expression kann durch die Miteinbeziehung geeigneter Transkriptions-Enhancer-Elemente, Transkriptions-Terminatoren usw. gesteigert werden (Bittner (1987) Methods in Enzymol. 153:516).
Darüber hinaus kann ein Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen modulieren kann oder der das Genprodukt in einer gewünschten Weise spezifisch modifizieren und prozessieren kann. Solche Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können so gewählt werden, dass eine korrekte Modifizierung und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins sichergestellt ist. Säuger-Wirtszellen umfassen CHO, VERO, BHK, Held, COS, MDCK, 293, 3T3 und WI38, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Für eine langfristige Produktion rekombinanter Proteine und eine hohe Ausbeute wird die stabile Expression bevorzugt. So können zum Beispiel Zelllinien konstruiert werden, die die vorstehend beschriebenen Sequenzen stabil exprimieren. Statt Expressionsvektoren zu verwenden, die einen viralen Replikationsursprung enthalten, können die Wirtszellen mit einer DNA transformiert werden, die durch geeignete Expressions-Kontrollelemente (z. B. Promotor, Enhancer-Sequenzen, Transkriptions-Terminatoren, Polyadenylierungs-Stellen usw.) und einen selektierbaren Marker kontrolliert wird. Nach dem Einbringen der Fremd-DNA kann den veränderten Zellen erlaubt werden, 1 bis 2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, und dann werden sie in ein Selektionsmedium umgesetzt. Der Selektionsmarker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt den Zellen das Plasmid stabil in ihre Chromsomen zu integrieren, anschließend wachsen sie und bilden Wachstumsherde, welche dann wiederum cloniert und zu Zelllinien weiter vermehrt werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhaft verwendet werden, um Zelllinien zu konstruieren, die das Genprodukt exprimieren. Solche veränderten Zelllinien können insbesondere bei der Durchmusterung und der Bewertung von Verbindungen, welche die endogene Aktivität des Genprodukts beeinflussen, nützlich sein.
Ein Fusionsprotein kann unter Verwendung eines Antikörpers oder einer Einheit, die an das Fusionsprotein, das exprimiert wird, spezifisch bindet, leicht gereinigt werden. So erlaubt zum Beispiel ein System, das durch Janknecht (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972 beschrieben wurde, eine rasche Reinigung von nicht denaturierten Fusionsproteinen, die in menschlichen Zelllinien exprimiert werden. In diesem System wird das Gen von Interesse in ein Vaccinia-Rekombinations-Plasmid subcloniert, so dass das offene Leseraster des Gens mit einer aminoterminalen Markierungssequenz, die aus sechs Histidin-Resten besteht, translationell fusioniert ist. Extrakte aus Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, werden auf Ni² ⁺-Nitriloessigsäure-Agarose-Säulen geladen, und die mit Histidin markierten Proteine werden mit Imidazol enthaltenden Puffern selektiv eluiert. Wenn gewünscht, kann die Histidin-Markierungssequenz mit einem geeigneten Enzym selektiv abgespalten werden.
Chimäre Proteine können ebenfalls durch den Fachleuten bekannte Verfahren erhalten werden. Diese umfassen das Spleißen eines Teils eines Gens, das ein bestimmtes Protein codiert, mit einem oder mehreren Teilen, die aus einem oder mehreren Genen stammen, die unterschiedliche Proteine codieren. Ein chimäres Polypeptid ist ein Molekül, in dem die verschiedenen Teile aus unterschiedlichen Proteinen stammen. So kann ein chimäres Protein zum Beispiel eine Domäne des HVEM und eine andere Domäne aus dem LTβR enthalten oder eine Domäne des HVEM und eine Domäne aus der Fc-Region eines Antikörpers enthalten.
Die Beschreibung beschreibt Verfahren für die Modulierung einer durch den HVEM vermittelten zellulären Antwortreaktion; dies erfolgt durch Inkontaktbringen einer Zelle, die das Rezeptor-Polypeptid HVEM exprimiert, mit einem an den HVEM bindenden Agens. Alternativ kann eine durch den HVEM vermittelte zelluläre Antwortreaktion durch Inkontaktbringen eines Liganden für den HVEM mit einem an den Liganden bindenden Agens moduliert werden. Solche Liganden umfassen LIGHT (p30), LTα oder gD. LIGHT (p30) kann auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert werden, oder es kann löslich, d. h. in homotrimerer Form vorliegen. LTα kann sekretiert werden und gD kann auf einem HSV-Virion oder auf der Oberfläche einer mit HSV infizierten Zelle exprimiert werden.
Der Ausdruck „zelluläre Antwortreaktionen" bezieht sich hierin wiederum auf die Zellaktivierung (z. B. eine Zunahme der Produktion von Entzündungsmediatoren) oder auf die Aufnahme des HSV in die Zelle. Die Erfindung betrifft auch Verfahren für die Modulierung der durch den LTβR vermittelten zellulären Antwortreaktionen; dies erfolgt durch Inkontaktbringen einer Zelle, die den LTβR exprimiert, oder einer Zelle, die den LTβR-Liganden p30 exprimiert, mit einem bindenden Agens, das entweder an den HVEM oder an p30 bindet.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Inkontaktbringen" die Exposition des Rezeptors oder des Liganden gegenüber dem bindenden Agens und zwar in einer den Rezeptor modulierenden wirksamen Menge, so dass das bindende Agens die zelluläre Antwortreaktion, die durch die Wechselwirkung des Liganden mit dem Rezeptor initiiert wird, wirksam modulieren kann. Die Modulierung kann zur Hemmung oder zur Aktivierung der zellulären Antwortreaktion führen. Diese alternativen Eigenschaften eines bestimmten bindenden Agens für ein bestimmtes Rezeptor-Liganden-Paar können unter Verwendung der beschriebenen Durchmusterungs-Testansätze (vergleiche z. B. mit den Beispielen 6-8) vorher ausgetestet werden.
Im Hinblick auf Rezeptor-bindende Agenzien umfassen an den HVEM bindende Agenzien lösliches gD, lösliches p30 (z. B. LIGHT-t66) oder ein Peptidfragment von LTα, vorzugsweise ein Peptidfragment, das die Aminosäure Tyr an einer Position enthält, die der Position 108, gezählt ab dem N-Terminus des natürlich vorkommenden LTα, entspricht. Ein an den LTβR bindendes Agens ist das lösliche p30-Protein.
Im Hinblick auf Liganden-bindende Agenzien umfassen an p30 bindende Agenzien den löslichen HVEM, den löslichen LTβR, chimäre Konstrukte (z. B. Fusionsproteine) wie zum Beispiel HVEM:Fc oder einen Antikörper, der an p30 spezifisch bindet. Ein an LTα bindendes Agens ist der lösliche HVEM wie z. B. ein HVEM:Fc-Fusionsprotein oder ein chimäres Konstrukt.
Das Inkontaktbringen kann in vitro erfolgen, zum Beispiel durch die Zugabe eines bindenden Agens oder eines Antagonisten zu einer Kultur von Zellen, die den HVEM oder den LTβR exprimieren, wie z. B. Lymphocyten, die eine Aktivierung durch HVEM-Liganden (p30, LTα oder gD) oder durch den LTβR-Liganden p30 durchlaufen. Bindende Agenzien können zum Beispiel auch einer Kultur von HVEM-exprimierenden Zellen zugesetzt werden, die gegenüber gD auf der Oberfläche von HSV-Virionen oder auf der Oberfläche von HSV-infizierten Zellen exponiert werden. Die Fähigkeit des bindenden Agens, diese zellulären Antwortreaktionen zu modulieren, kann unter Verwendung der beschriebenen Durchmusterungsverfahren vorher ausgetestet werden. Das bindende Agens kann als isoliertes Polypeptid zugegeben werden, oder in Form von Zellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, der ein Nucleinsäuremolekül enthält, welches das bindende Agens codiert. Bei diesen in vitro-Verfahren ist eine „den Rezeptor modulierende wirksame Menge" des bindenden Agens diejenige Menge, die erforderlich ist, um eine Zellaktivierung oder eine HSV-Infektion um mehr als 20%, bevorzugt um mehr als 50%, noch bevorzugter um mehr als 80% und am stärksten bevorzugt um mehr als 95% zu modulieren.
Das Inkontaktbringen mit einem Individuum kann in vivo erfolgen. Bei dem Individuum kann es sich um einen Säuger handeln, vorzugsweise um einen Menschen mit einer Autoimmunerkrankung wie z. B. rheumatoide Arthritis, Insulinabhängigem Diabetes mellitus, multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematodes oder Myasthenia gravis, oder mit einer Bösartigkeit des Lymphsystems, einer HSV-Infektion, einer Infektion mit einem anderen Organismus als dem HSV oder einer entzündlichen Störung, oder die Verabreichung erfolgt zur Immunsuppression. Die Hemmung einer durch HVEM-p30 oder einer durch LTβR-p30 vermittelten zellulären Antwortreaktion kann bei Patienten mit Autoimmun-Erkrankungen oder mit Bösartigkeiten des Lymphsystems von Vorteil sein, weil sie eine Proliferation oder eine Aktivierung der T-Zellen (wie z. B. bei rheumatoider Arthritis, Insulin-abhängigem Diabetes mellitus, multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematodes, Myasthenia gravis und T-Zellen-Bösartigkeiten) und eine Proliferation von B-Zellen (wie z. B. bei systemischem Lupus erythematodes, Myasthenia gravis und B-Zellen-Bösartigkeiten) verhindern kann. Die Hemmung einer durch HVEM-gD vermittelten zellulären Antwortreaktion (d. h. einer Einnistung des HSV) kann für Individuen mit einer HSV-Infektion therapeutisch wirksam sein, weil sie die Ausbreitung des Virus, die durch die Aufnahme von gD exprimierenden HSV-Virionen vermittelt wird, die im extrazellulären Raum vorhanden sind, oder von HSV-infizierten Zellen, die gD an ihrer Oberfläche exprimieren, verhindern kann. Die Stimulierung einer durch HVEM-p30 oder einer durch LTβR-p30 vermittelten zellulären Antwortreaktion wäre bei der Behandlung von Individuen mit einer anderen Infektion als durch das HSV oder von immunsupprimierten Individuen (z. B. Patienten, die eine Strahlen- und/oder eine Chemotherapie gegen einen Krebs durchmachen, bei dem es sich nicht um eine Bösartigkeit des Lymphsystems handelt) nützlich, oder von AIDS-Patienten nützlich, weil sowohl die Proliferation von T- als auch von B-Zellen stimuliert werden würde. Natürlich würde man die Verwendung von bindenden Agenzien, die eine HVEM-p30 vermittelte zelluläre Antwortreaktion stimulieren, in einem Individuum mit einer HSV-Infektion vermeiden, weil ein solches Agens auch eine durch HVEM:gD vermittelte zelluläre Antwortreaktion und dadurch die Ausbreitung des HSV-Virus steigern würde. Diese Aktivität des relevanten bindenden Agens kann jedoch unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Durchmusterungs-Testansätze zuvor ausgetestet werden. Ebenso gilt, dass diese stimulierenden bindenden Agenzien nicht bei Bösartigkeiten des Lymphsystems verwendet werden, da sie das Wachstum der Tumorzellen fördern könnten.
Die bindenden Agenzien, die bei der in vivo-Modulierung zellulärer Antwortreaktionen verwendet werden, umfassen die natürlich vorkommenden Formen des HVEM, LTβR, p30, Antikörper, gD und LTα sowie hergestellte Formen wie z. B. HVEM:Fc-Konstrukte. Diese werden durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Peptide, die aus LTα abgeleitet wurden und die die HVEM-LTα-Wechselwirkung modulieren, können ebenfalls verwendet werden. Diese Peptide können etwa 205 Aminosäuren oder weniger enthalten. Zum Beispiel können sie fünf, acht, zwölf, fünfzehn oder achtzehn Aminosäuren enthalten. Die Peptide enthalten bevorzugt die Aminosäure Tyr oder einen konservativen Ersatz dafür, und zwar an einer Position, die dem Aminosäurerest 108 entspricht, gezählt ab dem N-Terminus des natürlich vorkommenden LTα.
Als bindende Agenzien sind ebenfalls Peptidmimetika der vorstehend beschriebenen Peptide mit eingeschlossen. Peptidmimetische Verbindungen sind synthetische Verbindungen, die eine dreidimensionale Struktur (d. h. ein „Peptid-Motiv") aufweisen, das auf der dreidimensionalen Struktur eines ausgewählten Peptids basiert. Das Peptid-Motiv verleiht der peptidmimetischen Verbindung die Aktivität für die Modulierung zellulärer Antwortreaktionen, wobei diese Aktivität gleich stark oder größer als die Aktivität des Peptids ist, aus dem das Peptidmimetikum abgeleitet wurde. Peptidmimetische Verbindungen können weitere Eigenschaften aufweisen, die ihre therapeutische Anwendung steigern, wie z. B. eine höhere Affinität und/oder Avidität und eine verlängerte biologische Halbwertszeit. Die Peptidmimetika der Erfindung besitzen typischerweise ein Grundgerüst, das teilweise oder vollständig kein Peptid-Grundgerüst ist, bei dem aber die Seitengruppen mit den Seitengruppen der Aminosäurereste, die in dem Peptid vorkommen, auf dem das Peptidmimetikum basiert, identisch sind. Es sind verschiedene Typen chemischer Bindungen wie z. B. Ester-, Thioester-, Thioamid-, Retroamid-, reduzierte Carbonyl-Dimethylen- und Ketomethylen-Bindungen im Fachgebiet bekannt, die allgemein als Ersatz für Peptid-Bindungen bei der Konstruktion von Protease-resistenten Peptidmimetika verwendet werden können.
Polypeptid- und Peptid-Bindeagenzien können durch die Hinzufügung eines blockierenden Agens, entweder an das amino- oder an das carboxyterminale Ende oder an beide, modifiziert werden, um das Überleben des betreffenden Polypeptids oder Peptids in vivo zu erleichtern. Dies kann in denjenigen Situationen nützlich sein, in denen die Enden des Peptids dazu tendieren, durch Proteasen degradiert („angeknabbert”) zu werden. Solche blockierenden Agenzien können ohne Einschränkung zusätzliche verwandte oder auch nicht verwandte Peptidsequenzen umfassen, die an den amino- und/oder den carboxy-terminalen Rest des Polypeptids oder des Peptids, das verabreicht werden soll, angeheftet werden. Dies kann entweder chemisch während der Synthese des Peptids oder des Polypeptids oder durch rekombinante DNA-Verfahren erfolgen. Alternativ können blockierende Agenzien wie z. B. Pyroglutaminsäure oder andere Moleküle, die den Fachleuten bekannt sind, an den amino- und/oder den carboxy-terminalen Rest angehängt werden, oder die Aminogruppe am Aminoterminus oder die Carboxygruppe am Carboxyterminus kann durch eine andere Einheit ersetzt werden. Ebenso können die bindenden Agenzien kovalent oder nicht-kovalent an pharmazeutisch verträgliche „Träger"-Proteine vor der Verabreichung gekoppelt werden.
Die Verabreichung an ein Individuum in vivo umfasst die Verabreichung entweder des bindenden Agens selbst, einer Nucleinsäure, die das bindende Agens codiert, eines Expressionsvektors, der das bindende Agens codiert, oder von Zellen, die mit dem Vektor transfiziert oder transduziert wurden.
Die bindenden Agenzien können an die Zelle eines Säugers unter Verwendung von Verfahren angeliefert werden, die im Wesentlichen die gleichen sind, wie sie nachstehend für die Anlieferung an menschliche Individuen beschrieben werden. Beispiele für geeignete Säuger umfassen Menschen, nicht-menschliche Primaten, Pferde, Kühe, Schafe, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen und Ziegen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Ein bindendes Agens kann an die Zellen eines Patienten in nicht modifizierten Zustand oder gelöst in einer geeigneten physiologischen Lösung wie z. B. in physiologischer Kochsalzlösung angeliefert werden. Natürlich ist es wünschenswert, dass diese Peptide selektiv und gezielt an die relevanten Gewebe und Zellarten angeliefert werden. Dies kann durch das direkte Inkontaktbringen der Peptide mit einem betroffenen Organ oder Gewebe erfolgen, wie z. B. durch eine lokalisierte Injektion oder Implantation. So könnten z. B. bei Autoimmunerkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis oder Insulin-abhängigem Diabetes mellitus die Peptide direkt in die betroffenen Gelenke beziehungsweise in die Bauchspeicheldrüse oder bevorzugt in das ableitende Lymphgewebe eingebracht werden, in denen die aktive Autoimmun-Antwort stattfindet.
Alternativ kann das bindende Agens in Liposomen angeliefert werden, in die Liganden für die Rezeptoren auf den relevanten Zellen (z. B. T-Zellen oder B-Zellen) oder Antikörper gegen Zelloberflächen-Marker, die durch diese Zellen exprimiert werden, mit eingeschlossen wurden. Daher kann ein Antikörper, der für den CD4-T-Zellen-Oberflächen-Marker spezifisch ist, die Liposomen, die sowohl den Anti-CD4-Antikörper als auch das relevante bindende Agens enthalten, zu einer CD4+-T-Zelle leiten. Dieser Ansatz kann sowohl bei Autoimmunerkrankungen als auch bei einer HSV-Infektion verwendet werden. Bei Autoimmunerkrankungen, bei denen der T-Zellen-Rezeptor (TCR), der durch einen dominanten pathogenen T-Zellen-Clon exprimiert wird, bereits definiert wurde, kann ein Antikörper verwendet werden, der für die relevante TCR-Komponente (z. B. Vβ) spezifisch ist. Dieses letztere Verfahren würde die ideale Form einer Immuntherapie darstellen, bei der pathogene Effektorzellen zur Hemmung spezifisch und gezielt angesteuert werden, während das Immunsystem als Ganzes und die Zellen des angezielten Organs nicht beeinträchtigt werden würden.
Bei Lymphom- oder Leukämie-Patienten werden anti-proliferative bindende Agenzien bevorzugt zu den Krebszellen geleitet. Die Peptide können zum Beispiele direkt in die Gewebe, die die Stelle eines Lymphom-Tumors umgeben, nach einer Operation zur Entfernung des Tumors injiziert werden, um das Wachstum der verbliebenen Tumorzellen zu hemmen. Statt einer Operation kann der Tumor auch durch in situ-Injektion des bindenden Agens in den Tumor behandelt werden. Das vorstehend beschriebene Liposomen-Verfahren kann ebenfalls genutzt werden. In diesem Fall würden Antikörper, die für Tumor-spezifische Antigene (TSA) oder für Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spezifisch sind, verwendet werden.
Im medizinischen Fachgebiet ist wohlbekannt, dass die Dosierung für jeden einzelnen Patienten von vielen Faktoren abhängt, sowie von der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, der Zeit und dem Weg der Verabreichung und von anderen Arzneistoffen, die gleichzeitig verabreicht werden. Die Dosierungen für die bindenden Agenzien der Erfindung werden variieren, sie können jedoch, wenn sie intravenös verabreicht werden, etwa 0,01 mg bis 10 mg/ml Blutvolumen betragen. Der Weg und die Dosis einer Verabreichung sind den geübten Pharmakologen und Ärzten wohlbekannt. Andere Wege der Verabreichung neben denjenigen, die vorstehend beschrieben wurden, umfassen intraperitoneal, intramuskulär, intrapulmonal, transmucosal, subcutan und intravenös, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Ein in vivo-Gentherapie-Ansatz erfordert die Anlieferung eines genetischen Konstrukts direkt in den Patienten, wobei bevorzugt die Zellen oder das Gewebe von Interesse angezielt werden. Die gezielte Anlieferung an Tumorzellen oder an aktivierte Lymphocyten kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Retrovirus durchgeführt werden, der vorwiegend sich teilende Zellen stabil transformiert. Bei der entzündlichen Störung kann es sich um Arthritis handeln und das Zielgewebe kann der Knorpel in einem Gelenk eines Patienten sein. In solchen Fällen kann das Fusionskonstrukt an eine Gen-aktivierte Matrix angeheftet werden (d. h. beschichtet auf ein polymeres Material), so dass eine langsame Freisetzung des Materials erfolgen kann, oder es kann direkt in das Gelenk injiziert werden.
Eine gewebsspezifische gezielte Anlieferung kann auch durch die Verwendung eines molekularen Konjugats erreicht werden, das aus einem Plasmid oder aus einem anderen Vektor besteht, das/der durch elektrostatische oder durch kovalente Kräfte an Poly-L-Lysin angeheftet wurde. Poly-L-Lysin bindet an einen Liganden, der an einen Rezeptor auf Tumorzellen binden kann (Cristiano (1995) J. Mol. Med. 73:479). Ebenso können Tumor- und zellspezifische Antikörper des vorstehend beschriebenen Typs an Vektoren gebunden werden und diese dadurch an Lymphtumore oder an Zellen wie z. B. T-Lymphocyten gezielt anliefern. Letzteres wäre bei Autoimmunerkrankungen und HSV-Infektionen nützlich. Es kann ein Promotor verwendet werden, der eine relativ Tumor-spezifische Expression induziert, um eine weitere Ebene der gezielten Anlieferung zu erreichen. Gewebsspezifische Promotoren, die bei Autoimmun- oder Transplantat-Patienten verwendet werden können, umfassen zum Beispiel den induzierbaren IL-2- (Thompson (1992) Mol. Cell. Biol. 12:1043), den IL-4- (Todd (1993) J. Exp. Med. 177:1663) und den gamma-Interferon-(Penix (1993) J. Exp. Med. 178:483) T-Zellen-Zielpromotor. Solche induzierbaren Promotoren besitzen den unschätzbaren weiteren Vorteil, dass die Expression selektiv in aktivierten T-Zellen erfolgen würde. In diese Population aktivierter T-Zellen mit eingeschlossen sind die Effektorzellen, so dass eine ideale immuntherapeutische Modalität bei Autoimmun-Patienten selektiv hemmen würde.
Die Vektoren können auch durch einen Einbau in Liposomen oder in andere Vehikel zu Anlieferung angeliefert werden, wobei sie entweder alleine oder zusammen mit zellspezifischen Antikörpern eingebaut werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
Wenn das relevante bindende Agens normalerweise an die Zellmembran gebunden wird (HVEM, LTβR, p30 oder gD), wird die Region der Nucleinsäure, die die transmembrane Domäne des bindenden Agens codiert, aus der in dem Expressionsvektor enthaltenen Nucleinsäure deletiert.
Die DNA oder die transfizierten Zellen können in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind biologisch verträgliche Vehikel, die für die Verabreichung an den Menschen geeignet sind, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge der DNA der Erfindung, die in der Lage ist, ein medizinisch erwünschtes Ergebnis in einem behandelten Tier herbeizuführen. Wie im medizinischen Fachgebiet wohlbekannt ist, hängt die Dosierung für jeden einzelnen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, des Alters, der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, des Geschlechts, der Zeit und des Wegs der Verabreichung, des allgemeinen Gesundheitszustands und anderer Arzneistoffe, die gleichzeitig verabreicht werden. Die Dosierungen können variieren, aber eine bevorzugte Dosis für eine intravenöse Verabreichung von DNA liegt zwischen 10⁶ bis 10¹² Kopien des DNA-Moleküls. Diese Dosis kann je nach Bedarf wiederholt verabreicht werden.
Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" wird hierin verwendet, um auf diejenigen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu verweisen, die nach vernünftiger medizinischer Beurteilung für eine Verwendung im Kontakt mit den Geweben von menschlichen Individuen und Tieren ohne übermäßig Toxizität, Irritation, allergische Reaktion oder andere Probleme oder Komplikationen geeignet sind und ein vernünftiges Nutzen/Risiko-Verhältnis aufweisen.
Die optimale Konzentration des Peptids, der Antikörper, der Fusionsproteine, der Nucleinsäuren oder von Derivaten davon in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung kann variieren, und zwar in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren, einschließlich der bevorzugten Dosierung der Verbindung, die verabreicht werden soll, der chemischen Eigenschaften der verwendeten Verbindungen, der Formulierung der Excipienten der Verbindung und des Wegs der Verabreichung. Die optimale Dosis eines Arzneimittels, das verabreicht werden soll, kann auch von solchen Variablen wie z. B. der Art und dem Ausmaß zum Beispiel einer entzündlichen Störung oder einer Krankheit, die behandelt werden soll, dem allgemeinen Gesundheitszustand des bestimmten Individuums und der relativen biologischen Wirksamkeit der gewählten Verbindung abhängig sein. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Zusammensetzungen für die Behandlung von entzündlichen Störungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Arthritis, Psoriasis und entzündliche Darmerkrankungen. Eine „wirksame Menge" oder eine „die Entzündung hemmende Menge" bedeutet diejenige Menge der Verbindung, die nötig ist, um entzündliche Antwortreaktionen oder Symptome zu modulieren, zu hemmen oder zu unterdrücken.
Fachleute können die folgenden Vorschriften verwenden, welche die Verfahren und die Techniken für die Bestimmung klinischer Dosierungen beschreiben: Spilker, B., „Guide to Clinical Studies and Developing Protocols", Rauen Press Books, Ltd., New York, 1984, S. 7-13 und 54-60; Spilker, B., „Guide to Clinical Trials", Rauen Press, Ltd., New York, 1991, S. 93-101; Craig, C. und R. Stitzel, Hrsg., „Modern Pharmacology", 2. Aufl., Little, Brown and Co., Boston, 1986, S. 127-133; T. Speight, Hrsg., „Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics", 3. Aufl., Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, S. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa und P. McGonigle, „Principles in General Pharmacology", Springer Verlag, New York, 1988, S. 18-20, um die geeignete Dosis für die Verwendung zu bestimmen.
Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen beschreibt die vorliegende Beschreibung dementsprechend ein Verfahren für die Behandlung oder die Hemmung einer entzündlichen Reaktion oder Störung in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Individuum. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Zelle, des Gewebes oder des Individuums, das eine entzündliche Reaktion oder eine Störung aufweist, mit einer wirksam hemmenden Menge des Fusionspolypeptids oder mit einer Zusammensetzung, die das hierin beschriebene Fusionspolypeptid enthält. Wie hierin beschrieben, können die Formulierung und die Zusammensetzungen leicht durch Fachleute unter Verwendung der hierin beschriebenen Lehren identifiziert werden, oder sie sind den Fachleuten leicht zugänglich. Ein Fusionspolypeptid kann zum Beispiel an der entzündeten Stelle eines Individuums örtlich verabreicht werden. Eine solche örtliche Verabreichung umfasst die Verabreichung des Polypeptids zum Beispiel in einer Lotion oder einer Heilsalbe. Alternativ können die Polypeptide systemisch verabreicht werden. Solche systemischen Verabreichungen umfassen zum Beispiel intraperitoneale Injektionen, subcutane Injektionen, intravenöse Injektionen oder die orale Verabreichung. Darüber hinaus können Formulierungen, die das Polypeptid enthalten, wie zum Beispiel Zäpfchen, Pillen, Liposomen-Formulierungen und andere Formulierungen, die durch Fachleute leicht identifiziert werden können, für eine systemische Verabreichung verwendet werden. Wie nachstehend in Einzelheiten beschrieben wird, wurde von den Polypeptiden (z. B. HVEM:Fc) gezeigt, dass sie entzündungshemmende Eigenschaften aufweisen.
Die folgenden Beispiele dienen dazu die Erfindung zu erläutern und nicht sie einzuschränken.
BEISPIELE
Materialien für die Beispiele
Die Konstruktion, Expression und Reinigung der bivalenten chimären Proteine, die mit der Fc-Region des menschlichen IgG1 und mit den Liganden-Bindedomänen von Fas:Fc (Brunner (1995) Nature 373:441), des TNFR60 (Crowe (1994) J. Immunol. Meth. 168:79) und des menschlichen LTβR:Fc (Crowe (1994) Science 264:707 gebildet wurden, wurden bereits beschrieben. Die extrazelluläre Region des HVEM wurde durch PCR unter Verwendung von mittels Taq-DNA-Polymerase amplifizierten Sequenzen der pBEC10-DNA erzeugt, die 1 bis K184 codiert; dies erfolgte unter Verwendung des Vorwärts-Primers:
5'-CGGAGATCTGAGTTCATCCTGCTAGCTGG-3' (SEQ ID NO:1)
und des reversen Primers:
5'-ATAGGATCCCTTGGTCTGGTGCTGACATTCC-3' (SEQ ID NO:2).
Das amplifizierte HVEM-Produkt wurde im Leseraster in den Baculovirus-Vektor pVL1392 (Pharmingen) ligiert, der die menschliche Fc-IgG1-Region enthält. Ein ähnliches Konstrukt des HVEM:Fc mit der Fc-Region des Kaninchen-IgG1 wurde in CHO-Zellen hergestellt, gereinigt und als Immunogen verwendet, um einen Kaninchen-Anti-HVEM-Antikörper herzustellen. LTβR:Fc wurde aus einem Maus-LTβR-(mLTβR) DNA-Fragment konstruiert, das die Aminosäurereste 1 bis Met221 der extrazellulären Domäne codiert (Force et al. (1996) J. Immunol. 1995.1 155:5280); dies erfolgte durch eine PCR unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase mit dem Vorwärts-Primer:
5' GACGTCAGATCTTCCCACCTTTCCTCCTA 3' (SEQ ID NO:3)
und dem reversen Primer
5' GAACAGAGATCTCATTGCTCCTGGCTCTG 3' (SEQ ID NO:4).
LTα und LTαTyr108Phe wurden in Insektenzellen unter Verwendung eines rekombinanten Baculovirus, wie beschrieben, hergestellt (Crowe et al. (1994) J. Immunol. Methods 168:79). Rekombinantes lösliches LTα1β2 (Browing et al. (1996) vorstehend zitiert), TNF (Browning und Ribolini (1989) J. Immunol. 143:1859) und monoclonale Antikörper gegen LTα (BF7) und LTβ (C37, B9 und B27) (Browning et al. (1995) vorstehend zitiert) waren großzügige Geschenke von Jeffrey Browning (Biogen, Inc.). Der für die Immunpräzipitation verwendete Anti-LTα-Antikörper (Clon 9B9) stammte von Boehringer Mannheim. Anti-CD3 (OKT3) wurde in Ascites-Flüssigkeit in BALB/c-Mäusen produziert und in einer Konzentration von 1 μg/ml Protein verwendet. Gereinigte rekombinante HSV-gD-1-Proteine und Mutanten wurden in Baculoviren hergestellt, wie bereits in Einzelheiten beschrieben wurde (Nicola et al. (1996) J. Virol. 6:3815). FITC-anti-CD4- und -anti-CD8-Antikörper wurden von Becton Dickinson bezogen.
Beispiel 1. Expression des HVEM-Liganden auf T-Zellen
Dieses Beispiel demonstriert, dass sowohl bösartige als auch normale menschliche T-Zellen einen Zelloberflächen-Liganden für den HVEM exprimieren. Es wurde ein Fusionsprotein konstruiert, das die extrazelluläre Domäne des HVEM und die Fc-Region des menschlichen IgG enthielt (HVEM:Fc). Die Experimente zeigten, dass das HVEM-Protein (als lösliches, rekombinantes HVEM:Fc) an normale (frisch isolierte) menschliche T-Zellen bindet.
Periphere mononucleäre Blutzellen wurden aus normalen Spendern mittels Ficoll-Hypaque isoliert. Sie wurden mit dem Anti-CD3-Antikörper 5 Tage in einem Medium mit IL-2 aktiviert. Die Zellen wurden erneut mit PMA oder mit PMA und Ionomycin 4 Stunden stimuliert und dann mit FITC-CD4 oder mit FITC-CD8 doppelt angefärbt, und das HVEM:Fc-Fusionsprotein wurde, wie vorstehend beschrieben, mit Anti-hulgG-PE nachgewiesen. Es wurde die FITC-Fluoreszenz mit Kompensation verwendet, um CD4- und CD8-T-Zellen-Subpopulationen einzugrenzen.
Die Bindung an den Rezeptor wurde durch die Inkubation abgestufter Konzentrationen des HVEM:Fc oder von Kontroll-IgG mit aktivierten II-23.D7-Zellen bestimmt. Die II-23.D7-Zelllinie ist ein menschliches CD4+-T-Zellen-Hybridom (Ware 1986) Lymphokine Res. 5:313) und wird in RPMI1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika aufrechterhalten. Die II-23.D7-Zellen wurden 4 Stunden bei 37°C mit Phorbol-Myristatacetat (PMA) (100 ng/ml) oder mit PMA (100 ng/ml) und Ionomycin (1 μg/ml) aktiviert. Dann wurden die Zellen gewaschen und 30 Minuten bei 4°C in Hanks-balancierter-Salzlösung (HBSS) (ergänzt mit 10% Kälberserum und 0,1% NaN₃), das HVEM:Fc, LTβR:Fc oder menschliches IgG in einer Konzentration von 5 μg/ml enthielt, inkubiert und anschließend mit Ziegen-Anti-Mensch-IgG, das mit Phycoerythrin konjugiert war (Anti-hulg-PE), gefärbt. Die angefärbten Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie (FACSCaliber, Becton-Dickinson) analysiert. Die Rezeptorbindung wurde durch die Berechnung der Fluoreszenzintensität = (mittlerer Fluoreszenzkanal) × (% positive Fluoreszenz-Ereignisse) bestimmt, wobei ein positives Ereignis einen Fluoreszenzwert >98% des Wertes von normalem IgG aufweist. Die spezifische Fluoreszenzintensität stellt die Fluoreszenzintensität nach der Subtraktion des Wertes für das Kontroll-IgG dar. Jedes Histogramm entspricht 10⁴ Ereignissen.
Diese Experimente zeigten, dass HVEM:Fc spezifisch an das menschliche CD4+-T-Zellen-Hybridom II-23.D7 (Ware et al. (1996), siehe nachstehend) nach der Aktivierung mit dem Calcium-Ionophor Ionomycin und PMA band, aber Zellen, die mit PMA alleine aktiviert worden waren, wurden durch die Durchflusscytometrie nicht nachgewiesen (1A). Die spezifische Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins wurde auch bei T-Lymphocyten nachgewiesen, die aus menschlichem peripherem Blut stammten (1B). Diese Befunde deuteten an, dass sowohl die bösartigen als auch die normalen menschlichen T-Zellen einen Zelloberflächen-Liganden für den HVEM exprimierten. Die halbmaximale Bindung des HVEM:Fc an die II-23.D7-Zellen war bei etwa 20 nM erreicht (1C), Die II-23.D7-Zelllinie kann durch PMA auch induziert werden, um LTα und β sowie den TNF zu exprimieren (vergleiche z. B. mit Ware (1992) J. Immunol. 149:3881).
Beispiel 2. Bindungscharakteristika des HVEM und seiner Liganden; der HVEM bindet LTα
Dieses Beispiel demonstriert die Bindungscharakteristika des HVEM unter Verwendung des löslichen, rekombinanten HVEM:Fc. Um zu bestimmen, ob der HVEM an den TNF oder an LTαβ-Komplexe bindet, wurden LTβR:Fc und TNFR:Fc als kompetitive Inhibitoren der Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins an aktivierte II-23.D7-Zellen verwendet. Bei diesen Experimenten wurde herausgefunden, dass das LTα-Homotrimer, aber nicht der TNF oder LTα1β2 mit HVEM:Fc (lösliches HVEM) um die Bindung kompetitieren.
Kompetition der Bindung durch LTβR:Fc. Aktivierte II-23.D7-Zellen (PMA und Ionomycin, wie in Beispiel 1 beschrieben) wurden mit LTβR:Fc oder mit TNFR60:Fc (100 μg/ml) 30 Minuten bei 4°C vorinkubiert. Dann wurde HVEM:Fc-Kaninchen (2 μg/ml) zugegeben, 30 Minuten inkubiert, und anschließend wurden die Zellen mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-PE angefärbt, um das HVEM:Fc-Kaninchen-Fusionsprotein nachzuweisen. Kaninchen-IgG wurde verwendet, um die Hintergrundfärbung zu bestimmen. Um die Bindung des HVEM:Fc an aktivierte II-23.D7-Zellen wurde mit abgestuften Konzentrationen von LTβR:Fc, TNFR60, Fas:Fc oder mit IgG, wie vorstehend beschrieben, kompetitiert.
Kompetition der Bindung durch das LTα-Homotrimer II-23.D7-Zellen wurden aktiviert und HVEM:Fc wurde mit rekombinantem LTα oder mit LTα1β2 30 Minuten bei 4°C vorinkubiert. Das Gemisch wurde aktivierten II-23.D7-Zellen zugegeben, und dann wurde mit Anti-hulgG-PE gefärbt. Die Fluoreszenz-Anfärbung bei HVEM:Fc + LTα war die Gleiche wie bei dem Hintergrund mit normalem IgG.
Um zu bestimmen, ob der HVEM an den TNF oder an LTαβ-Komplexe bindet, wurden LTβR:Fc und TNFR:Fc als kompetitive Inhibitoren der Bindung des HVEM:Fc-Fusionsproteins an II-23.D7-Zellen, die mit PMA und Ionomycin aktiviert worden waren, verwendet; dies erfolgte unter Verwendung eines HVEM:Fc-Konstrukts mit dem Kaninchen-IgG-Fc-Fragment (Montgomery (1996) vorstehend). LTβR:Fc und HVEM:Fc (Fc des menschlichen IgG1), aber nicht TNFR60:Fc kompetitierten um die Bindung des HVEM:Fc (Kaninchen) (2A). Darüber hinaus kompetitierte keines der verwandten Rezeptor-Fusionsproteine Fas:Fc und TNFR80:Fc mit HVEM:Fc um die Bindung. Überraschenderweise kompetitierte jedoch das LTα-Homotrimer, aber nicht der TNF oder LTα1β2 mit HVEM:Fc um die Bindung (2B). Eine TNFR60-Bindemutante des LTα, in der Tyrosin (Tyr) an der Position 108 durch Phenylalanin (Phe) ausgetauscht ist (Tyr108Phe) (Goh (1991) Protein Eng. 4:785) kompetitierte nicht (3). Diese Ergebnisse zeigten, dass der mögliche HVEM-Ligand mit LTαβ-Heterotrimeren und mit LTα gemeinsame Eigenschaften aufweist, aber auch Eigenschaften besitzt, die ihn von LTα1β2 und dem TNF unterscheiden. Daher könnte LTα2β1 ein möglicher Oberflächenligand sein, der durch HVEM:Fc erkannt wird, mit der Einschränkung, dass die HVEM Bindestelle(n) auf LTα2β1 nicht die Gleiche(n) wie die des TNFR60 ist/sind. Alternativ könnte HVEM:Fc einen neuen Liganden erkennen. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde ein biochemischer Ansatz verwendet.
Beispiel 3. Biochemische Charakterisierung des HVEM-Liganden (LIGHT)
Dieses Beispiel zeigt die Reinigung von LIGHT (P30) durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des löslichen, rekombinanten HVEM:Fc. Die Analyse der Proteine, die an HVEM:Fc binden, durch zweidimensionale (2D) Elektrophorese zeigte, dass p30-Polypeptide in einer breiten Bande (pl-Wert 7 bis 8,5) wandern, die sich bei niedrigerer Intensität in drei Banden auftrennt.
SDS-PAGE-Analyse. II-23.D7-Zellen wurden 2,5 Stunden mit PMA oder mit PMA und Ionomycin (wie in Beispiel 1) aktiviert; dann zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und einmal mit RPMI ohne Cystein und Methionin gewaschen und anschließend in diesem Medium, das 10% dialysiertes FBS, jeweils 250 μCi ³⁵S- Methionin und ³⁵S-Cystein sowie aktivierende Agenzien enthielt, 1,5 Stunden resuspendiert. Die Kulturüberstände wurden geerntet und die Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der 2% NP-40, HEPES, pH-Wert 7,0, 20 mM EDTA, 150 mM NaCl plus Leupeptin und Aprotinin (zu 10 μg/ml), PMSF (1 mM) und Iodacetamid (20 mM) enthielt. Der Extrakt wurde mit menschlichem IgG (10 μg/ml), wenn erforderlich, Anti-LT-Antikörpern und Protein G-Kügelchen vorgeklärt. Dann wurden die Rezeptor:Fc-Fusionsproteine (10 μg/ml) den Proben zugegeben und mit Protein G-Kügelchen präzipitiert. Die markierten Proteine wurden durch reduzierende SDS-PAGE und Phosphoabbildung (Pixelbereich 6-200) analysiert.
Zelluläre Extrakte, die wie im vorstehenden Abschnitt hergestellt worden waren, wurden zuerst mit 10 μg Maus-IgG oder mit den monoclonalen Antikörpern gegen LTα oder LTβ vorgeklärt, und dann wurde HVEM:Fc zugegeben, um die Liganden zu präzipitieren. Die Proteine, die an HVEM:Fc gebunden hatten, wurden anschließend durch eine reduzierende SDS-PAGE aufgetrennt und durch Phosphoabbildung nachgewiesen.
Reinigung des HVEM-Liganden p30. II-23.D7-Zellen wurden mit PMA (100 ng/ml) oder mit PMA und Ionomycin (1 μg/ml) 2,5 Stunden aktiviert, danach erfolgte die Markierung mit ³⁵S-Methionin und -Cystein wie in den beiden vorstehenden Abschnitten. Die Zellextrakte wurden mit menschlichem IgG (5 μG) und Protein G-Kügelchen vorgeklärt, um unspezifisch bindende Proteine zu entfernen. Dann wurde der Extrakt durch Behandlung des Extrakts mit TNFR60:Fc und Protein G-Kügelchen an LTα verarmt. Anschließend wurden HVEM:Fc und Protein G-Kügelchen dem Extrakt zugegeben und inkubiert. In jedem Fall wurden die Kügelchen dreimal gewaschen, um kontaminierende Proteine in der ungebundenen Fraktion zu entfernen. Die Kügelchen wurden mit einem Puffer, der 8 M Harnstoff enthielt, eluiert und die Analyse erfolgte in der ersten Dimension durch isolelektrische Fokussierung (der Gradient wurde mit einem Ampholin-Gemisch mit den pl-Werten 5-7 (50%), 3-10 (40%) und 2-11 (10%) gebildet) und in der zweiten Dimension durch reduzierende SDS-PAGE (15%-iges Gel).
Die Reinigung von p30 mit Hilfe des HVEM:Fc-Fusionsproteins wurde durch einen Vergleich mit Proben überwacht, die mittels LTβR:Fc oder TNFR60:Fc gereinigt worden waren. Mit Hilfe des LTβR:Fc gereinigte Proteine, d. h. LTα1β2 wurden von II-23.D7-Zellen isoliert, die mit PMA stimuliert worden waren, wie in 4A gezeigt, und Proteine, die an TNFR60:Fc gebunden hatten, das verwendet worden war, um den Extrakt an LTα zu verarmen, werden in 4B gezeigt. Das, wie vorstehend beschrieben, durch HVEM:Fc gereinigte p30 wird in 4C gezeigt. In der ersten Bahn jedes Gels werden mit ¹⁴C markierte Molekulargewichts-Marker gezeigt und in der zweiten Bahn befinden sich die Proteine, die an das Rezeptor:Fc-Fusionsprotein gebunden hatten und die nur in der zweiten Dimension gelaufen waren.
LTα wird durch II-23.D7-Zellen nach der Aktivierung mit PMA sekretiert (Ware et al. (1992), vorstehend zitiert; Crowe et al. (1994) Science 264:707). HVEM:Fc und TNFR:Fc präzipitierten sekretiertes LTα aus II-23.D7-Zellen, die mit PMA und Ionomycin stimuliert worden waren, wie die SDS-PAGE zeigt. LTα wandert aufgrund der Heterogenität in der Glycosylierung (Browning et al. (1991) vorstehend zitiert) über einen breiteren Molekulargewichtsbereich. TNFR60:Fc, aber nicht HVEM:Fc, präzipitierte den TNF (17 kDa) ebenfalls, wodurch die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Kompetitionsstudien bestätigt wurden. Wie erwartet, band LTβR:Fc an keines der sekretierten Proteine, präzipitierte jedoch den LTβ- (33 kDa) und LTα- (23-25 kDa) Komplex aus Detergenzextrakten der mit PMA aktivierten II-23.D7-Zellen. Wenn der Stimulus jedoch Ionomycin und PMA enthielt, präzipitierte LTβR:Fc eine Hauptbande von 30 kDa sowie kleine Mengen an LTβ bei 33 kDa und LTα bei 23-25 kDa. TNFR60:Fc präzipitierte ein 23 kDa-Protein, das eine identische Größe wie der LTα-Vorläufer besitzt. Im Gegensatz dazu, präzipitierte HVEM:Fc sowohl das 30 kDa- als auch das 23 kDa-Protein. Drei unterschiedliche Rezeptor-blockierende monoclonale Antikörper gegen LTβ waren nicht in der Lage, das 30 kDa-Protein aus dem Extrakt vor der Zugabe des HVEM:Fc zu entfernen, was zeigt, dass das p30-Protein hinsichtlich seiner antigenen Eigenschaften nicht mit LTβ verwandt ist. Anti-LTα-Antikörper entfernten jedoch die 23 kDa-Bande aus den Extrakten, was seine Verwandtschaft mit LTα anzeigt. Die Unfähigkeit des LTα-Antikörpers sowohl die 30 kDa- als auch die 23 kDa-Bande vorzuklären, zeigt, dass diese Proteine nicht miteinander assoziiert sind, anders als LTα und LTβ, die Heterotrimere bilden (Androlewicz et al., vorstehend zitiert).
LIGHT (p30) wurde aus II-23.D7-Zellen durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Es wurden nacheinander Schritte mit TNFR60:Fc und mit HVEM:Fc verwendet, so dass LTα aus den Extrakten durch den TNFR60 entfernt wurde und somit die Bindung von p30 an das HVEM:Fc-Fusionsprotein nicht beeinträchtigte.
Eine zweidimensionale (2D) Elektrophorese der Proteine, die an HVEM:Fc, TNFR60:Fc oder an murines LTβR:Fc banden, offenbarte, dass p30 im Vergleich zu LTα und LTβ eine unterschiedliches Ladung-zu-Masse-Verhältnis aufweist. LTβ in dem LTα1β2-Komplex, das durch LTβR:Fc präzipitiert wurde, ist sauer und besteht aus vier unterschiedlichen Ladungsisomeren, die pl-Werte von 5 bis 6,5 aufweisen, wobei eine Zunahme der Masse der sauren Formen nachweisbar ist (4A). LTα im Komplex mit LTβ oder das LTα-Homotrimer, das an den TNFR60 (4B) bindet, besitzt sieben unterschiedliche Isomere, deren pl-Werte von 7 bis 8,5 reichen; der 23 kDa-LTα-Vorläufer besitzt den am stärksten basischen pl-Wert (größer oder gleich 9). Der pl-Wert von LTα ohne Signalsequenz beträgt 8,9. Diese Ergebnisse sind charakteristisch für Glycosylierungs-Addukte und stimmen vollständig mit den bereits veröffentlichten Studien an LTα und LTβ überein (Browning et al. (1991) vorstehend zitiert). Im Gegensatz dazu wanderte p30 als eine breite Bande (p1-Wert 7-8,5), die sich bei niedrigerer Intensität in drei Banden auftrennt (4C). Diese Heterogenität in der Ladung ohne eine unterscheidbare Veränderung in der Masse von p30 ist möglicherweise das Ergebnis einer posttranslationellen Modifizierung wie z. B. der Anheftung von Phosphaten oder Phospholipiden.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass der HVEM ein neues Zelloberflächenprotein von 30 kDa bindet (isoliert aus dem menschlichen CD4+-T-Zellen-Hybridom II-23.D7), das Isomere mit pl-Werten von 7 bis 8,5 aufweist und das als p30 oder als HVEM-Ligand (oder als LIGHT) bezeichnet wird. p30 unterscheidet sich in seinen antigenen und physikalischen Eigenschaften von dem LTβ. Der HVEM-Ligand wird auch durch LTβR:Fc aber nicht durch den TNFR erkannt.
Beispiel 4. Das HSV-Hüllglycoprotein gD kompetitiert mit dem endogenen HVEM-Liganden (p30) um die Bindung an HVEM:Fc
Dieses Beispiel demonstriert die Bindung des gD-1-Proteins des Herpesvirus HSV an den HVEM und dass lösliches gD-1 mit dem HVEM-Liganden, d. h. mit p30 (LIGHT), um die Bindung an den HVEM kompetitiert. Die Daten, die zeigen, dass das gD-1-Protein des HSV ein Antagonist für die Bindung von p30 (LIGHT) an den HVEM darstellt, demonstrieren auch, dass p30 als Antagonist des Herpesvirus-gD-1-Proteins für die Bindung an den HVEM wirken kann.
HVEM:Fc (2 μg/ml) wurde 30 Minuten bei 4°C mit gD-1 (250 μg/ml) oder mit gD-1 (Δ290-299) (100 μg/ml) vorinkubiert und dann zu mit PMA und Ionomycin aktivierten II-23.D7-Zellen hinzu gegeben (wie in Beispiel 1). Die Hintergrundfärbung wurde mit hulgG bestimmt und war die Gleiche wie die für HVEM:Fc + gD-1 (Δ290-299). Um die Bindung des HVEM:Fc an aktivierte II-23.D7-Zellen wurde mit abgestuften Konzentrationen von gD-1 oder gD-1 (Δ290-299) kompetitiert (hinsichtlich des Protokolls vergleiche mit Beispiel 1).
Die Möglichkeit, dass HSV-gD als Antagonist der Bindung von HVEM-Liganden (zelluläre Liganden wie z. B. p30) an den HVEM wirken könnte, wurde durch die Bindung des HSV-gD-1-Proteins an den HVEM nahe gelegt. Lösliches gD-1 und eine Mutante des gD, gD-1 (Δ290-299t), die eine verstärkte Bindung an den HVEM aufweist, waren beide bei der Blockierung der Bindung des HVEM an die Oberfläche von aktivierten II-23.D7-Zellen (die p30 exprimierten) wirksam (5A). Die wirksam hemmende Konzentration der gD-1-Proteine korrelierte mit ihrer Affinität für den HVEM (5B). Die Bindung von LTβR:Fc oder von TNFR60:Fc an mit PMA oder mit PMA/Ionomycin aktivierte II-23.D7-Zellen wurde durch gD-1 (Δ290-299t) nicht gehemmt, was anzeigt, dass die Wechselwirkung zwischen dem HVEM und gD-1 hoch spezifisch ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass sich gD-1 spezifisch für die Bindung an den HVEM mitentwickelt hat, obwohl der HVEM auch an Liganden bindet, die durch den TNFR60 und durch den LTβR erkannt werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass gD-1 ein in der Membran verankertes Virokin darstellt und die HVEM-Signalübertragungsaktivitäten im Verlauf des Eintritts in oder der Freisetzung des HSV aus der infizierten Zelle modulieren kann.
Beispiel 5. Kreuzvernetzung des Zelloberflächen-HVEM führt zur Aktivierung von Lymphocyten
Dieses Beispiel zeigt, dass ein Anti-HVEM-Antikörper die gesteigerte Proliferation von peripheren Blut-Lymphocyten (PLBs), einschließlich T-Zellen und B-Zellen, fördert. Daten, die zeigen, dass ein Anti-HVEM-Antikörper die Proliferation von PLBs (die auch den HVEM-Liganden p30 bzw. LIGHT exprimieren) fördern kann, zeigen auch, dass Zell-assoziiertes p30 (LIGHT) als ein proliferationsinduzierendes Signal bei PLBs wirken kann. Darüber hinaus demonstriert ein Befund, bei dem ein Anti-HVEM-Antikörper, der B-Zellen-Zelllinien hinzugefügt wurde, die in niedrig konzentriertem Serummedium kultiviert wurden, ihr Wachstum in einer dosisabhängigen Weise stimulierte, ebenfalls, dass die HVEM-Signalübertragung, z. B. indem LIGHT an den HVEM bindet, die Proliferation von B-Zellen stimulieren kann.
T-Zellen-Aktivierung. Frisch isolierte periphere Blut-Lymphocyten wurden in einem Medium inkubiert, das abgestufte Verdünnungen von Kaninchen-Anti-HVEM- oder Präimmun-Serum (Montgomery (1996) vorstehend) und PMA in einer submitogenen Dosis (1 μg/ml) enthielt. Die Proliferation wurde nach 3 Tagen durch den Einbau von ³H-Thymidin in die DNA mittels β-Szintillationszählung gemessen.
Frisch isolierte periphere Blut-Lymphocyten wurden mit Phytohämagglutinin (PHA) zu 5 μg/ml aktiviert und in einem Medium mit IL-2 kultiviert. Nach 17 Tagen wurden die Zellen mit abgestuften Verdünnungen des Anti-HVEM-Antiserums und einem Anti-CD3-Antikörper (OKT3) in einer submitogenen Konzentration (1,5 μg/ml) erneut stimuliert. Die Proliferation wurde nach 3 Tagen, wie vorstehend beschrieben, gemessen.
Durchflusscytometrische Analyse der B-Zellen. Menschliche RAJI-Lymphoblastom-Zellen wurden einer durchflusscytometrischen Analyse durch Inkubation mit Anti-HVEM-Antiserum (Verdünnung 1:100) oder mit Kontroll-Kaninchen-IgG bei 4°C unterworfen und dann mit Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, das mit Phycoerythrin konjugiert war, angefärbt. Für jedes Histogramm wurden 10⁴ Zellen analysiert.
B-Zellen-Aktivierung. RAJI-Zellen wurden für 24 Stunden in ein Medium überführt, das 2% FBS enthielt, und dann 3 Tage in Gegenwart der angegebenen Verdünnungen des Kaninchen-anti-HVEM-Antikörpers oder in Medium alleine inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde, wie vorstehend beschrieben, gemessen.
Der HVEM wird auf ruhenden CD4+-T-Zellen exprimiert, was vermuten lässt, dass er als ein zusätzliches stimulierendes Molekül für die Zellproliferation während der Anfangsphase einer Immunantwort fungieren könnte. Bei suboptimalen Konzentrationen an PMA förderte der Anti-HVEM-Antikörper die gesteigerte Proliferation von peripheren Blut-Lymphocyten, wie durch eine Erhöhung der Aufnahme an ³H-Thymidin angezeigt wird, die nach 3 Tagen Kultur gemessen wurde (6A). Gedächtnis-Lymphocyten, die durch kontinuierliche Kultur über 10 bis 17 Tage nach der Aktivierung mit PHA erzeugt worden waren, wurden durch den Anti-HVEM-Antikörper in Gegenwart von suboptimalen Konzentrationen des Anti-CD3-Antikörpers ebenfalls reaktiviert (6B). Dieses Ergebnis deutet an, dass der HVEM in der Effektor-Phase einer Immunantwort wirkt. Da Antikörper die Wirkung von TNF-verwandten Liganden nachbilden können (Engelmann (1990) J. Biol. Chem. 265:14497), zeigen diese Ergebnisse, dass der Zell-assoziierte 30 kDa große HVEM-Ligand als ein Proliferations-induzierendes Signal für T-Zellen wirken könnte.
Von LTα wurde bereits gezeigt, dass es die wachstumssteigernden Aktivitäten bei B-Lymphocyten stimulieren kann, einschließlich Zelllinien, die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert worden waren (Abken (1992) J. Immunol. 149:2785; Estrov (1993) J. Exp. Med. 177:76; Kehrl (1987) Science 238:1144; Gibbons (1994) Eur. J. Immunol. 24:1879). HVEM wird auch auf B-Lymphoblastom-Linien exprimiert (7A). Wenn ein Anti-HVEM-Antikörper Kulturen von RAJI-B-Zelllinien in einem Medium mit 2% Serum hinzugefügt wurde, stimulierte er die Aufnahme von ³H-Tyhmidin in einer dosisabhängigen Weise, was zeigt, dass der HVEM die Beibehaltung der Lebensfähigkeit der B-Zellen in niedrig konzentriertem Serum signalisieren kann (7B). LTα wies bei diesem Testansatz eine 2- bis 3-fach stimulierende Wirkung auf. Die Anwesenheit des TNFR60 und des TNFR80 als negative Wachstumsfaktoren könnte zu einer geringen Antwortreaktion gegenüber LTα mit beitragen. Die positive Wirkung des Anti-HVEM-Antikörpers könnte eine Eigenschaft sein, die einzig p30 (dem HVEM-Liganden bzw. LIGHT) eigen ist.
Beispiel 6. Herstellung des Maus-HVEM:Fc
Dieses Beispiel demonstriert die Konstruktion eines rekombinanten Maus-HVEM:Fc-Konstrukts.
Die extrazelluläre Region des Maus-HVEM wurde durch PCR aus der mHVEM-cDNA (Hsu et al., 1997) amplifiziert, beginnend mit Met1 und endend bei Ser205.
Der Vorwärts-Primer war:
5'-tatGGATTCatggaacctctcccaggat-3',
und der reverse Primer war:
5'-tatGGATTCggaggagcaggtggtgtctgt-3'.
Beide Primer enthalten eine BamHI-Schnittstelle. Das 550 Bp große PCR-Produkt wurde durch Wizard-PCR-Preps (Promega) gereinigt, mit BamHI verdaut und dann im Leseraster in den mit BgIII geschnittenen Baculovirus-Vektor pVL1392 (Pharmingen) cloniert, der die Fc-Region des menschlichen IgG1 am 3'-Ende der HVEM-Insertion enthält (pVL1392-mHVEM:Fc). Das Ligierungs-Reaktionsgemisch wurde verwendet, um kompetente XL-1-Blue-Zellen (Stratagene) für die Herstellung des Plasmids zu transformieren.
TN5-Insektenzellen (1,25 × 10⁶) wurden in einer T25-Flasche mit 4 ml Excell 401-Medium (JRH Biosciences) ausplattiert und es wurde ihnen 2 Stunden erlaubt sich anzuheften. Die TN5-Zellen wurden mit 1 μg pVL1392-HVEM:Fc-Plasmid und 250 ng Baculogold^TM-DNA (Pharmingen) unter Verwendung von 14 μg Lipofectin^TM (Gibco BRL) kotransformiert. Am folgenden Tag wurde das Medium ausgetauscht und der Überstand, der das Virus enthielt, wurde nach 4 Tagen gesammelt. Das Virus wurde amplifiziert, um eine Stammlösung für die Proteinproduktion herzustellen.
Maus-HVEM:Fc wurde in TN5-Insektenzellen hergestellt und, wie beschrieben, bis zur Homogenität gereinigt (Crowe et al., 1994). Kurzgefaßt wurden die TN5-Zellen mit dem rekombinanten Baculovirus, das mHVEM:Fc enthielt, mit einer MOI von 10 infiziert. Nach 3 Tagen wurde der Überstand geerntet, von Zeilen und Trümmern gereinigt und mit Protease-Inhibitoren behandelt. Das gereinigte mHVEM:Fc-Protein wurde durch Protein A-Affinitäts-Chromatographie und saure Elution (pH-Wert 2,5) erhalten. Die Analyse des mHVEM:Fc durch SDS-PAGE zeigte unter reduzierenden Bedingungen eine einzelne Proteinbande bei 58 kDa (vergleiche mit 8). Das Präparat wurde durch den Limulus-Lysat-Test als frei von nachweisbarem Endotoxin beurteilt.
Beispiel 7. Hemmende Wirkung des Maus-HVEM:Fc auf Entzündungen (Hypersensitivität vom verzögerten Typ) in Mäusen
Dieses Beispiel demonstriert, dass das lösliche, rekombinante HVEM:Fc-Fusionsprotein der Erfindung auf Entzündungen in vivo eine hemmende Wirkung aufweist; dies erfolgte unter Verwendung eines im Fachgebiet bekannten Tiermodells.
Acht Wochen alte weibliche BDF1-Mäuse (Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan) (N=8) wurden mit 50 μg OVA, das an 1 mg Alaun adsorbiert war, durch subcutane Injektion immunisiert. Nach 7 Tagen wurde mHVEM:Fc oder Kontroll-IgG durch intraperitoneale Injektion verabreicht und die Mäuse wurden am Fußballen mit 10 μg OVA, das an 50 μg Alaun adsorbiert war, herausgefordert. Die Messung der Dicke der rechten Fußballen wurde direkt vor und 24 Stunden nach der Herausforderung durch das Antigen vorgenommen und die Schwellung (Prozent Zunahme) der Dicke der Fußballen wurde berechnet. Die Unterdrückung durch 300 μg mHVEM:Fc war statistisch signifikant (p < 0,05), wie die in 9 zusammengefassten Daten zeigen.
Beispiel B. Hemmende Wirkung des Maus-HVEM:Fc auf die durch Kollagen induzierte Arthritis in Mäusen
Dieses Beispiel demonstriert, dass das HVEM:Fc-Fusionsprotein der Erfindung eine hemmende Wirkung auf Entzündungen in vivo aufweist; dies erfolgte unter Verwendung eines im Fachgebiet bekannten Tiermodells für Arthritis.
Sechs Wochen alte DBA/1-Mäuse (Seatec Yoshitomi, Hukuoka, Japan) (N=10) wurden mit Emulsionen von 100 μg Rinder-Kollagen Typ II und 100 mg Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) in inkomplettem Freundschen Adjuvanz an der Schwanzbasis durch subcutane Injektion immunisiert, und 28 Tage später erfolgte eine Booster-Injektion mit der gleichen Emulsion. Beginnend am zweiten Tag nach der Immunisierung wurden 60 μg mHVEM:Fc oder Kontroll-IgG zweimal wöchentlich intraperitoneal verabreicht. Die klinische Bewertung jeder Pfote wurde durch Bezug auf die folgende Skala vorgenommen: 0 = normal, 1 = Schwellung und/oder Erythem einer Zehe, 2 = Schwellung und/oder Erythem von zwei oder mehr Zehen, 3 = Schwellung und/oder Erythem der gesamten Pfote, 4 = vollständige Schwellung und Erythem der gesamten Pfote und Unfähigkeit das Fußgelenk zu biegen. Die CIA-Werte wurden als kumulativer Wert für alle Pfoten mit einem Maximalwert von 16 ausgedrückt (10). Die in 10 dargestellten Daten zeigen, dass HVEM:Fc eine signifikante Wirkung auf die Entzündung des Fußballens und des Knöchels hatte.
Beispiel 9. Hemmung der Herpesvirus-Infektion durch lösliches homotrimeres LIGHT
Dieses Beispiel demonstriert, dass lösliche homotrimere LIGHT-Polypeptide der Erfindung den Eintritt des Herpesvirus in die Zellen in vivo blockieren können. Es wird auch gezeigt, dass die antivirale Aktivität von LIGHT durch seine Bindung an den LTβR und nicht an den HVEM erfolgt. Dieses Beispiel zeigt ebenfalls, das sowohl LIGHT als auch LTα die Virusinfektion von Zellen in einer dosisabhängigen Weise verhindern können (12).
Herpesviren besitzen genetische Mechanismen, die die Cytokin-Systeme 71 der TNF-Superfamilie gezielt ansteuern, was nahe legt, dass das Immunsystem spezifische Gegenmaßnahmen entwickelt hat, um die Reaktivierung oder die Ausbreitung von Herpesviren in einem Wirt zu unterdrücken.
LIGHT wurde zusammen mit anderen Cytokinen ausgetestet, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, eine Cytomegalievirus-(CMV) Infektion zu hemmen. Um die antiviralen und biologischen Eigenschaften von LIGHT zu untersuchen, wurde durch gentechnische Konstruktion eine lösliche Form hergestellt, in der der cytoplasmatische Schwanz und die transmembrane Domäne deletiert waren. Es wurde eine rekombinante lösliche Form von LIGHT hergestellt, der die N-terminalen 66 Aminosäuren fehlten, wie in Einzelheiten im nachstehenden Beispiel 12 beschrieben wird, und sie wurde als „LIGHT-t66" bezeichnet. Das durch rekombinante Verfahren hergestellte lösliche LIGHT-t66 und seine Mutanten werden ausschließlich als Homotrimere sekretiert (Wildtyp-LIGHT wird als Homotrimer exprimiert).
Normale menschliche Haut-Fibroblasten wurden mit dem klinischen Isolat des menschlichen CMV (HCMV) Fiala (HCMV-F) oder mit dem Laborstamm AD169 des HCMV mit einer niedrigen Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,05 infiziert. Cytokine, die entweder über den TNFR1 (LTα) oder über den LTβR (LTα1β2, LIGHT) ihr Signal übertragen, wurden dem Kulturüberstand hinzugefügt, und dann wurde 7 Tage inkubiert.
Die Zugabe von LTα blockierte den viralen cytopathischen Effekt (CPE) vollständig. Diese Hemmung war spezifisch, da lösliches Typ I-TNFR-Protein (TNFR:Fc) die antivirale Wirkung neutralisierte (11A und 11B). Darüber hinaus war eine Punktmutante des LTα (Y108F), die nicht mehr an den TNFR binden kann, aber die Integrität ihrer Konformation beibehalten hat, nicht. in der Lage, die Ausbreitung des HCMV zu blockieren (11C).
LTα1β2 und LIGHT, die beide an den LTβR binden, waren ebenfalls in der Lage, den viralen CPE zu blockieren (11D, 11E). Eine Punktmutante von LIGHT (G119E), die nicht in der Lage ist, an den LTβR zu binden, aber die Bindung an den HVEM beibehalten hat, war nicht in der Lage, die Ausbreitung des HCMV zu hemmen (11 F). Dies deutet an, dass die antivirale Aktivität von LIGHT wahrscheinlich durch die Bindung an den LTβR und nicht an den HVEM erfolgt.
Eine quantitative Analyse der Anti-HCMV-Aktivität von LTα, LTα1β2 und LIGHT wurde durch die Messung der Expression sowohl des sehr frühen Haupt-Proteins (IE1) als auch des späten Tegument-Proteins pp28 durch Western-Blot-Analyse durchgeführt. LTα und LIGHT zeigten ähnliche relative antivirale Aktivitäten, indem sie in der Lage waren, den cytopathischen Effekt des HCMV bei einer Konzentration von 100 pM vollständig zu hemmen, während LTα1β2 etwa 10-fach weniger wirksam war. Monoclonale Antikörper, die für den Lymphotoxin-Rezeptor (LTβR) spezifisch sind, waren ebenfalls potente Inhibitoren der Ausbreitung des HCMV.
Darüber hinaus zeigten Studien unter Verwendung des Maus-γ-Herpesvirus eine Reduktion der Plaque-bildenden Einheiten (12). Eulenaffen-Nierenzellen in Mikroplatten mit 12 Vertiefungen wurden mit 500 Plaque-bildenden Einheiten (PbE) pro Vertiefung 60 Minuten bei 37°C infiziert und mit Carboxymethylcellulose (0,75%) in einem Medium, das fötales Rinderserum (FBS) mit oder ohne LIGHT oder LTα in den angegebenen Konzentrationen enthielt, überschichtet. Nach 7 Tagen wurden die Zellen mit Methanol fixiert und mit Giemsa angefärbt. Jeder Datenpunkt in der 12 ist die mittlere Zahl an Plaques in zwei Vertiefungen. Die Daten demonstrieren deutlich, dass sowohl LIGHT als auch LTα in der Lage waren, die Zahl an infizierten Zellen in einer dosisabhängigen Weise signifikant zu vermindern.
Maus-MHV-68 ist den menschlichen γ-Herpesviren EBV und HHV-8 ähnlich. EBV wird als onkogener Faktor bei bestimmten menschlichen Krebsarten angesehen, einschließlich dem mit dem EBV assoziiertem Lymphom und dem Nasenrachen-Karzinom. HHVE ist mit dem AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkom assoziiert.
Beispiel 10. Biologische Aktivitäten des löslichen homotrimeren LIGHT
Dieses Beispiel demonstriert, dass ein rekombinantes, lösliches homotrimeres LIGHT-Polypeptid der Erfindung in verschiedenen Testansätzen für zelluläre Antwortreaktionen aktiv ist, einschließlich der Apoptose der HT29-Adenokarzinom-Zelllinie und der Induktion von ICAM-1 auf Fibroblasten. Wie im vorstehenden Beispiel 9 diskutiert, wurde eine lösliche Form, d. h. das durch rekombinante Verfahren hergestellte lösliche LIGHT-t66 (in Einzelheiten in Beispiel 12 beschrieben), hergestellt, um die biologischen Aktivitäten von LIGHT zu untersuchen. Obwohl diesem löslichen Polypeptid der cytoplasmatische Schwanz und die transmembrane Domäne des Wildtyp-p30 fehlen, hat es seine homotrimere Wildtyp-Tertiärstruktur beibehalten.
HT29-Zellen und die 293-Zelllinie wurden von der ATCC bezogen; die HT29-Zellen stammen aus dem menschlichen Adenokarzinom mit der ATCC-Nummer HTB-38 (vergleiche z. B. mit Chen (1987) Cancer Genet. Cytogenet. 27:125-134). Beide Zelllinien wurden in DMEM angezogen, das 10% FBS und Glutaminsäure sowie Penicillin/Streptomycin enthielt.
Die 293-Zellen wurden mit einer cDNA, die das menschliche lösliche LIGHT-Polypeptid codiert (vergleiche mit Beispiel 12), stabil transformiert. Clone mit einer hohen Expression des löslichen Polypeptids wurden für eine Großkultur ausgewählt. Das verbrauchte Medium der 293-LIGHT-Zellen wurde für die Reinigung geerntet; dies erfolgte durch die Kombination einer Ionenaustausch- und einer Affinitäts-Chromatographie. LIGHT wurde bis zu Homogenität aufgereinigt (vergleiche mit 13), und zwar mit einer Ausbeute von 10 bis 15 mg pro Liter und mit Spiegeln an Endotoxin, die weniger als 0,1 Endotoxin-Einheiten/mg betrugen.
Die Aktivität des gereinigten LIGHT-Proteins wurde durch einen spezifischen ELISA-Testansatz gemessen, bei dem die löslichen Formen des LTβR oder des HVEM in einer an die Platte gebundenen Form verwendet wurden. Rekombinantes lösliches LIGHT (homotrimeres LIGHT-t66) bindet gleich effizient sowohl an den Maus-HVEM als auch an den LTβR wie die homologen menschlichen Formen.
LIGHT ist in mehreren Testansätzen für zelluläre Antwortreaktionen aktiv, einschließlich der Apoptose von HT29-Zellen und der Induktion von ICAM-1 auf Fibroblasten (ICAM ist ein Zelladhäsions-Marker für Entzündungen). LIGHT ist ebenso wirksam wie LTα1β2 bei der Induktion des Todes von HT29-Zellen, aber schwächer im Vergleich zu der Fähigkeit des TNF oder des LTα bei der Induktion der Expression von ICAM-1. Dieses letztere Ergebnis legt nahe, dass LIGHT nicht entzündungsfördernd wirkt. In vivo scheint LIGHT nicht entzündungsfördernd oder toxisch zu sein, da Mäuse, in die gereinigte LIGHT injiziert worden war (die untersuchte Maximaldosis betrug 200 μg pro Maus), keine der Schocksymptome zeigten, die beobachtet werden, wenn der TNF oder LTα in dieser Dosis verabreicht werden.
Beispiel 11. NF-κB, aber nicht TRAF, wird für die durch LIGHT vermittelte antivirale Wirkung benötigt
Dieses Beispiel demonstriert, dass die antivirale Aktivität des löslichen homotrimeren LIGHT und des Lymphotoxins (LT) die Aktivität von NF-κB erfordert (Zellen, denen die NF-κB-Aktivität fehlte, waren gegenüber den Wirkungen von LIGHT resistent) (vergleiche mit 14). Daher demonstriert dieses Beispiel, dass die Aktivierung der von der NF-κB-Aktivität abhängigen apoptotischen Wege an der Anti-CMV-Aktivität von LIGHT beteiligt ist.
Bei normalen menschlichen Haut-Fibroblasten (NHDF), die mit LTα, LTα1β2 oder mit LIGHT behandelt worden waren, wurde kein Zelltod beobachtet. Dies zeigt, dass die antivirale Aktivität dieser Cytokine von dem apoptotischen Todesweg, der durch den TNFR ausgelöst werden kann, möglicherweise unabhängig ist. Dies legt nahe, dass möglicherweise ein von NF-κB abhängiger Mechanismus operativ ist, da dieser der einzige andere bedeutende Weg ist, der durch diesen Rezeptor aktiviert wird. NF-κB kontrolliert ebenfalls die Transkription verschiedener anti-apoptotischer Proteine in Fibroblasten, die somit dem Apoptose-Weg entgegenwirken.
Um diese Hypothese zu testen, wurde eine dominant negative Mutante des Inhibitors der NF-κB-α-Untereinheit (IκBαM) in NHDF-Zellen durch Transduktion mit einem retroviralen Vektor eingebracht. Diese Mutante kann nicht phosphoryliert werden und verbleibt daher in einem stabilen Komplex mit NF-κB. Dies verhindert die Transkription der von κB abhängigen Gene. TNF und LTα waren beide nicht in der Lage, die ICAM-1-Expression in NHDF-IκBαM-Zellen zu induzieren, was die Wirksamkeit (der Hemmung des NF-κB) durch die dominant negative Mutante des IκBαM demonstriert.
NHDF-IκBaM-Zellen wurden dann mit Zellen verglichen, die mit dem Vektor alleine (NHDF-LXSN) transduziert worden waren, oder mit der Fähigkeit der verschiedenen Cytokine, die Replikation des HCMV zu hemmen. Es wurde herausgefunden, dass NHDF-IκBαM-Zellen gegenüber den Wirkungen der Lymphotoxine und LIGHT resistent waren (14). Bei einer bestimmten Konzentration an Cytokin wurden in NHDF-IκBαM-Zellen im Vergleich zu NHDF-LXSN-Zellen signifikant höhere Spiegel an IE1 und an pp28 beobachtet.
Darüber hinaus wurde eine 10-fache Steigerung an infektiösem HCMV in NHDF-IκBαM-Zellen in Gegenwart eines Cytokins produziert. Interessanterweise replizierte sich das HCMV bei Abwesenheit des Cytokins in NHDF-IκBαM-Zellen gleich gut wie in NHDF-LXSN-Zellen, wie durch die Expression von IE1 und pp28 und den Titer des Virus gemessen wurde. Dieses Ergebnis zeigt, das NF-κB für eine effiziente Replikation des Virus in Fibroblasten nicht essentiell ist, obwohl der IE-Promotor mehrere NF-κB-Antwort-Elemente enthält.
TRAF3 wird von dem LTβR direkt rekrutiert, wobei es an der Apoptose-Signalübertragung, aber nicht an der Aktivierung des NF-κB beteiligt ist. Dies wurde durch dominant negative Mutanten von TRAF3 gezeigt. Dominant negative Mutanten von TRAF3 (TRAF3Δ7 und TRAF3Δ11), die ähnlich wie IκBαM durch Transduktion mit einem Retrovirus in NHDF-Zellen eingebracht worden waren, blieben gegenüber der antiviralen Aktivität von LIGHT und der Lymphotoxine sensitiv. Dies zeigt an, dass die Aktivierung des von NF-κB abhängigen Apoptose-Weges nicht an der antiviralen (anti-CMV-) Aktivität des löslichen LIGHT beteiligt ist.
Beispiel 12. Herstellung und Charakterisierung des löslichen (homotrimeren) LIGHT-t66 und der LIGHT-t66-Punktmutanten
Dieses Beispiel demonstriert die Konstruktion und die Isolierung der löslichen rekombinanten LIGHT-Polypeptide (die in den Beispielen 9 bis 11, 13 und 14 verwendet wurden), einschließlich derjenigen, in denen einzelne Reste verändert wurden (d. h. Punktmutanten), und die, wie nachstehend gezeigt, als Homotrimere sekretiert werden.
Es wurde eine rekombinante lösliche Form von LIGHT, der die N-terminalen 66 Aminosäuren fehlen (bezeichnet als LIGHT-t66), hergestellt. Das verkürzte, lösliche LIGHT wurde weiterhin so verändert, dass es die „FLAG"-Markierungssequenz für eine Reinigung durch Immunaffinität mit Hilfe eines Anti-FLAG-Antikörpers (Sigma, St. Louis, MO) enthielt. Das verkürzte, mit FLAG markierte Konstrukt wurde als LIGHT-t66-FLAG bezeichnet.
HT29- und 293-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und in DMEM angezogen, das 10% fötales Rinderserum mit Glutamin und Penicillin/Streptomycin enthielt. Neonatale normale menschliche Haut-Fibroblasten (NHDF-Zellen) wurden von Clonetics, San Diego, KA bezogen und in DMEM angezogen, das mit 10% fötalem Rinderserum, Insulin (5 pg/ml) und dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (1 pg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) ergänzt worden war.
LIGHT-t66-FLAG wurde in stabil transformierten 293-Säugerzellen hergestellt. Stabil transformierte 293-Zellen wurden in Rollflaschen-Kultur in DMEM, das 0,5% FBS enthielt, angezogen. Die Konzentration an LIGHT-t66 erreichte 10 mg/l in 7 Tage alten Kulturen. LIGHT-t66 wurde aus den 7 Tage-Überständen durch ein Ionenaustausch-Verfahren teilweise gereinigt. Der Überstand wurde 1:2 mit 20 mM Tris, pH 7,0 verdünnt, so dass die anfängliche NaCl-Konzentration 50 mM betrug, und dann auf eine SP-Hitrap^TM-Säule (Pharmacia) aufgetragen. Nach dem Waschen wurde LIGHT-t66 unter Verwendung von 20 mM Tris/500 mM NaCl, pH 7,0 eluiert. Nach einer Dialyse gegen PBS wurde LIGHT-t66 durch Affinitäts-Chromatographie über eine Säule mit einem monoclonalen Anti-FLAG-Antikörper (M2), der an Affigel^TM (Biorad) gekoppelt war, weiter gereinigt. LIGHT-t66 wurde von der Säule unter Verwendung von 20 mM Glycin, 150 mM NaCl, pH 3,0 eluiert und sofort durch Sammlung in 50 mM Tris, pH 7,4 neutralisiert.
Die lösliche Form von LIGHT (LIGHT-t66) mit dem N-terminal angefügten FLAG-Epitop wurde in stabil transformierten 293-Zellen hergestellt und bis zur Homogenität durch Ionenaustausch-Chromatographie gefolgt von einer Immunaffinitäts-Reinigung über eine Affinitätsmatrix mit dem monoclonalen Anti-FLAG-Antikörper (M2) gereinigt. Die Endausbeute des Proteins betrug 80% und die Reinheit über 95% (15A).
Mit Hilfe von Primern eingeführte Sequenzmodifikationen wurden verwendet, um lösliches LIGHT mit den folgenden einzelnen Aminosäureaustauschen zu erzeugen: G119E, L120Q, Q117T und Y173F. Kurzgefasst wurden interne Primer konstruiert, so dass eine Restriktionsschnittstelle an der Stelle der Mutation eingeführt wurde. Die Vorwärts- und die reversen Primer, welche die Mutationen enthielten, wurden in getrennten PCR-Reaktionen verwendet, um zwei Regionen des löslichen LIGHT zu amplifizieren. Die Primer waren folgende:
Die PCR-Produkte wurden an der durch den Primer eingeführten Restriktionsschnittstelle ligiert, um lösliches LIGHT zu erzeugen, das an der Aminosäure t66 beginnt und einen der 4 Aminosäureaustausche enthält. Die LIGHT-t66-Mutanten wurden in die mit FLAG markierte Kassette pBABE-FLAG ligiert, die eine V-cam-Signalsequenz enthält, welche mit dem FLAG-Epitop fusioniert war. Die mutierten V-cam-FLAG-LIGHT-Insertionen wurden in pCDNA3.1(+) (Invitrogen) cloniert. Alle Mutanten wurden sequenziert (automatisches Sequenziergerät ABI 310), um sie eindeutig zu verifizieren. Für die Herstellung der Proteine wurden 293T-Zellen (1,5 × 10⁶ Zellen/10 cm-Schale) mit 5 pg DNA transfiziert. Das Medium, welches das lösliche Protein enthielt, wurde nach 24 Stunden Kultur gesammelt.
Die LIGHT-t66-FLAG-Mutanten wurden aus dem 24 Stunden-Kulturüberstand durch ein Ein-Schritt-Immunaffinitäts-Verfahren gereinigt; dies erfolgte unter Verwendung einer Affinitätsmatrix mit dem monoclonalen Anti-FLAG-Antikörper (M2), der an Affigel^TM (5 mg Antikörper pro ml Gel) gekoppelt war. Der Kulturüberstand (50 bis 100 ml) wurde durch 0,5 ml Affinitätsmatrix durchgeleitet. Das Gel wurde mit 10 Volumina PBS gewaschen und das gebundene Protein anschließend mit 0,5 ml-Aliquoten von 10 mM Glycin/HCl, pH-Wert 3,0 eluiert und durch Sammlung in 50 mM TRIS, pH-Wert 7,4 sofort neutralisiert. Protein enthaltende Fraktionen wurden gegen PBS dialysiert.
Die vier Mutanten des mit FLAG markierten LIGHT-t66 mit den einzelnen Aminosäureaustauschen – Y173F, G119E, L120Q und Q117T – wurden in transient transfizierten 293T-Zellen hergestellt, wie hierein beschrieben wird. Y173F ist ein Analog der Y108F-Mutante des LTα, die Mutation liegt in der D-E-Schleife. Das LT-Y108F-Homotrimer kann nicht mehr an Rezeptoren binden. Q117T, G119E und L120Q sind drei benachbarte Mutationen in der A-A-Schleife, die zwischen LTβ und LIGHT konserviert ist und von der durch molekulares Modelling vorhergesagt wurde, dass sie an der Rezeptorbindung beteiligt ist.
Die Proteine wurden aus den Kulturüberständen durch ein Ein-Schritt-Verfahren gereinigt; dies erfolgte unter Verwendung des monoclonalen Anti-FLAG-Antikörpers (M2), der an Affigel gekoppelt war (15B). Die Reinheit aller Proteine lag bei >95%.
Am nächstes wurde bestimmt, ob die Punktmutanten Trimere bildeten. Die Analyse durch Kreuzvernetzung und FPLC-Gelfiltration gefolgt von einem ELISA und einer Dot-Blot-Analyse der Fraktionen zeigte, dass LIGHT-t66 und seine Mutanten ausschließlich als Homotrimere ohne nachweisbares kontaminierendes monomeres oder aggregiertes Material sekretiert werden (15C und D).
Dann wurden ELISAs verwendet, um die rekombinanten LIGHT-t66-Polypeptide (einschließlich der Punktmutanten) zu messen. Das einfangende Molekül, murines HVEM:Fc, menschliches HVEM:Fc, murines LTβR:Fc oder menschliches LTβR:Fc, wurde in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (150 ng/Vertiefung in 50 μl 20 mM Tris/150 mM NaCl, pH-Wert 9,6) 16 Stunden bei 4°C immobilisiert. Nach dem Waschen mit PBS/0,5% Tween wurden die in PBS/3% BSA verdünnten Proben zugegeben und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit dem monoclonalen Anti-FLAG-Antikörper (M2) (10 μg/ml in PBS/BSA) 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert, dann gewaschen und mit Ziegen-anti-Maus-HRP (1:5.000) 1 Stunde bei RT inkubiert. Nach einer abschließenden Waschung wurde die Färbung mit 2,2'-AZINO-bis-(3-ETHYLBENZ-THIAZOLIN-6-SULFONSÄURE) (Sigma) entwickelt. Die CD wurde bei 415 nm mit einem SpectraMax-Platten-Lesegerät (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, KA) gemessen.
Teilweise gereinigtes LIGHT wurde durch Zugabe von Bis-[2-succinimidoxycarbonyloxy)-ethyl]-sulfon (BSOCOES) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) bei einer Endkonzentrationen von 0,1 und 1 mM oder durch Zugabe von Glutaraldehyd (0,1% und 1%) 30 Minuten bei 4°C unter Rotation kreuzvernetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Tris (20 mM, pH-Wert 8,0) beendet. Kreuzvernetzte und Kontroll- Proben wurden durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des monoclonalen M2 (Anti-FLAG-) Antikörpers untersucht.
Für die Bestimmung des Molekulargewichts des nativen LIGHT-t66 wurde das gereinigte Protein durch Gelfiltration über eine Superose 12^TM-Säule unter Verwendung des FPLC 500-Systems (beide von Pharmacia, Piscataway, NJ) analysiert. Die Durchflussrate betrug 0,5 ml/min und es wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt, PBS war die mobile Phase. LIGHT in den eluierten Fraktionen wurde durch ELISA nachgewiesen. Das relative Molekulargewicht von LIGHT-t66 wurde durch einen Vergleich mit den Elutionsprofilen von Eichproteinen bestimmt.
Beispiel 13. Cytotoxizitäts-Testansätze demonstrieren, dass lösliches LIGHT die Apoptose in Zellen auslösen kann, die den Lymphotoxin-Rezeptor exprimieren
Dieses Beispiel demonstriert, dass homotrimeres LIGHT-t66 in Zellen, die den menschlichen LTβR-Rezeptor exprimieren, das Wachstum hemmen und die Apoptose auslösen kann. Diese Daten zeigten auch, dass die Kreuzvernetzung des HVEM die Apoptose nicht induziert.
HT29-Zellen (vergleiche mit dem Vorstehenden) wurden zu 5.000/Vertiefung in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in DMEM (50 μl) in Gegenwart oder in Abwesenheit des IFNγ (80 E/ml) platziert. Serielle Verdünnungen von LIGHT-t66 und anderer Cytokine wurden in 50 μl Medium hinzugefügt, wiederum in Gegenwart oder in Abwesenheit des IFNγ, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Nach 24 bis 72 Stunden wurden 20 μl 5 mg/ml MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] hinzu gegeben und die Platte wurde 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurde das Medium abgesaugt und es wurden 100 μl angesäuertes 70%-iges Isopropanol zugegeben, um das Formazin aufzulösen. Die CD wurde bei 570 nm gemessen.
LIGHT-t66 hemmte das Wachstum und verursachte die Apoptose der HT29-Zellen mit vergleichbarer Wirksamkeit wie LTα1β2 (16A). Die Cytotoxizität war von IFNγ abhängig (16B) und nach 72 Stunden maximal. Bei einer Reihe von Experimenten wurden 50% Cytotoxizität mit Dosen von 10 bis 100 pM erreicht. Die Cytotoxizität von LIGHT-t66 konnte durch Vorinkubation von LIGHT-t66 mit menschlichem LTβR:Fc oder mit HVEM:Fc in einer dosisabhängigen Weise blockiert werden; wohingegen Fas:Fc, das nicht an LIGHT bindet, keine Wirkung hatte (16C).
In Gegenwart von IFNγ waren L120Q und Q117T für HT29-Zellen in vergleichbarer Wirksamkeit wie LIGHT-t66 cytotoxisch (19). Y173F, das sowohl an den huLTβR als auch an den huHVEM bindet, zeigte bei diesen Zellen eine schwächere, aber signifikante Cytotoxizität, wohingegen G119E, das eine höhere Affinität für den HVEM als Y173F aufweist, aber nicht in der Lage ist, an den LTβR zu binden, keine signifikante Cytotoxizität zeigte.
Die Daten, die mit den LIGHT-t66-Mutanten erhalten wurden, lassen stark vermuten, dass die durch LIGHT vermittelte Apoptose der HT29-Zellen über den LTβR vermittelt wird. Um diese Hypothese zu bestätigen und um zu bestimmen, ob die durch LIGHT vermittelte Kreuzvernetzung des HVEM die durch den LTβR vermittelte Apoptose verstärkt oder hemmt, führten wir Experimente unter Verwendung einer Reihe monoclonaler und polyclonaler Anti-HVEM- und Anti-LTβR-Antikörper durch.
Neben dem polyclonalen Ziegen-HVEM-IgG und dem polyclonalen Ziegen-LTβR-IgG wurden zwei monoclonale Maus-anti-HVEM-Antikörper, CW1 und CW8, und zwei monoclonale Maus-anti-LTβR-Antikörper, BDA8 und CDH10, verwendet. Alle banden an den passenden Rezeptor auf der Oberfläche der HT29-Zellen (20A). Die Anti-HVEM-Antikörper CW1 und CW8 wurden auf der Basis von ELISA-Blockierungsstudien verwendet, bei denen CW8 die Bindung von LIGHT an den huHVEM ebenso wie der polyclonale Ziegen-Anti-HVEM-Antikörper hemmte, wohingegen CW1 keine Wirkung auf die Bindung hatte (20B).
Da von dem monoclonalen Anti-LTβR-Antikörper BDA8 gezeigt worden war, dass er die durch LTα1β2 vermittelte Apoptose von HT29-Zellen hemmt, wohingegen von CDH10 gezeigt worden war, dass er diese Wirkung steigert, wurde untersucht, ob diese Antikörper die durch LIGHT vermittelte Apoptose in gleicher Weise beeinflussen. Bei ELISA-Blockierungsstudien hemmten der polyclonale Ziegen-anti- LTβR-Antikörper und BDA8 die Bindung von LIGHT an den LTβR, wohingegen CDH10 keine Wirkung auf die Bindung hatte (20C).
Der polyclonale Ziegen-anti-LTβR-Antikörper induzierte einen langsamen apoptotischen Tod der HT29-Zellen in Gegenwart von IFNγ (20D), wohingegen der polyclonale Ziegen-anti-HVEM-Antikörper die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinflusste. Dies lässt vermuten, dass die Kreuzvernetzung des HVEM die Apoptose in dieser Zelllinie nicht induziert.
Darüber hinaus wurde der von dem polyclonalen Anti-LTβR-Antikörper abhängige Zelltod durch den polyclonalen Anti-HVEM-Antikörper weder gesteigert noch gehemmt (20D). Eine Vorinkubation mit dem polyclonalen Ziegen-anti-LTβR-Antikörper steigerte die Empfindlichkeit der HT29-Zellen gegenüber der durch LIGHT vermittelten Abtötung deutlich (20E).
CDH10, der die Abtötung durch LTα1β2 steigert, steigerte ebenfalls die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber LIGHT, wohingegen eine Vorinkubation mit dem BDA8-Antikörper, der die Abtötung durch LTα1β2 hemmt, zu einer verminderten durch LIGHT vermittelten Cytotoxizität führte (20E). Eine Vorinkubation der Zellen mit polyclonalem Ziegen-anti-HVEM oder mit den monoclonalen Anti-HVEM-Antikörpern CW1 und CW8 hatte keine Auswirkung auf ihre Empfänglichkeit gegenüber einer Abtötung durch LIGHT.
Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Kreuzvernetzung des HVEM die Apoptose nicht induziert, dass die Signalübertragung durch den HVEM mit der Signalübertragung durch den LTβR bei der Induktion der Apoptose nicht synergistisch erfolgt und dass die HVEM-Signalübertragung keine schützenden Ereignisse auslöst, die ausreichen würden, den LTβR-abhängigen Apoptose-Weg zu beeinträchtigen.
Beispiel 14. Studien zur Bindung des löslichen, homotrimeren menschlichen LIGHT-Proteins an den LTβR und an den HVEM mittels ELISA und Oberflächen-Plasmonresonanz
Die Assoziations- und die Dissoziationsraten der Wechselwirkung von LIGHT-t66 (ein lösliches, homotrimeres p30) und der LIGHT-t66-Mutanten (die vorstehend beschrieben wurden) mit dem menschlichen HVEM:Fc- und dem LTβR:Fc-Fusionsprotein wurden durch Oberflächen-Plasmonresonanz bestimmt. Die charakteristischen Eigenschaften der Rezeptorbindung wurden durch ELISA unter Verwendung des menschlichen (hu) und des murinen (mu) LTβR:Fc- und HVEM-Fc-Konstrukts als einfangende Moleküle und des Anti-FLAG-Antikörpers M2 für den Nachweis untersucht (17).
Die einfangenden Moleküle, menschliches HVEM:Fc- und LTβR:Fc-Fusionsprotein, (50 μg/ml) wurden an den CM5-Sensor-Chip des BIA-core 1000^TM-Geräts (BIAcore Inc., Piscataway, NJ) durch Amin-Kopplung bei dem pH-Wert 5,0 gekoppelt. Die Sensoroberfläche wurde mit PBS (20 mM Natriumphosphat/150 mM NaCl, pH 7,4) äquilibriert und die Sensorgramme wurden bei 25°C und einer Durchflussrate von 5 μl/min gesammelt. Es wurde eine 10 μl-Injektion von LIGHT-t66 oder einer Mutante über die Sensoroberfläche geleitet; nach der Assoziationsphase wurden 800 Sekunden lang die Dissoziationsdaten gesammelt. Die Sensoroberfläche wurde nach jedem Zyklus mit einem 10 μl-Puls von 10 mM Glycin, pH-Wert 2,0 regeneriert. Es wurden Reihen von 5 Konzentrationen des Analyten zwischen 100 bis 500 nM gesammelt und durch eine nicht-lineare Regression unter Verwendung der BIA-Evaluations-Software^TM (2.1) analysiert. Die Assoziations- und die Dissoziationsdaten wurden auf Grundlage des einfachen ABμA + B-Modells angepasst.
LIGHT-t66 band an huHVEM:Fc und an huLTβR:Fc mit vergleichbarer Affinität. LIGHT-t66 band an muHVEM:Fc und an muLTβR:Fc mit zehnfach niedrigerer Affinität. Die LIGHT-t66-Mutanten L120Q und Q117T banden an huHVEM:Fc und an huLTβR:Fc mit vergleichbarer Affinität wie LIGHT-t66. Interessanterweise zeigte L120Q eine gesteigerte Affinität für beide murinen Rezeptoren. G119E wies eine verminderte, aber signifikante Affinität für den huHVEM und eine nicht nachweisbare Bindung an den huLTβR auf, während Y173F eine verminderte, aber signifikante Bindung sowohl für den huLTβR als auch für den huHVEM zeigte. G119E und Y173F banden nicht an die murinen Rezeptoren.
Die Analyse der Bindung von LIGHT-t66 und seiner Mutanten an huLTβR:Fc und an huHVEM:Fc mittels Oberflächen-Plasmonresonanz bestätigte und erweiterte die Daten, die durch den ELISA erhalten worden waren (18). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Die Assoziations- und Dissoziationsphasen der Wechselwirkung von LIGHT-t66 mit beiden Rezeptoren passten gut mit dem einfachen A + B μAB-Modell zusammen, wobei die ka = 2,7 ± 0,5 × 10⁴ (M/s) für huLTβR:Fc und 1,2 ± 0,2 × 10⁴ (M/s) für huHVEM:Fc und die kd = 1,2 ± 0,2 × 10⁴ für huLTβR:Fc und 4,8 ± 5,1 × 10^-5 × s^-1 für huHVEM:Fc betrugen. Die intrinsischen Dissoziationsraten-Konstanten (kD), die aus dem Verhältnis kd/ka berechnet wurden, betrugen 4,5 ± 0,7 nM für huLTβR:Fc und 3,9 ± 3,9 nM für huHVEM:Fc (diese Daten sind die Mittelwerte aus 5 Messungen über einen Konzentrationsbereich von 100 bis 500 nM LIGHT-t66).
G119E zeigte keine nachweisbare Bindung an huLTβR:Fc und seine Affinität für huHVEM:Fc war etwa 30-fach niedriger als die von LIGHT-t66 (KD = 114 nM). Die Verminderung der Affinität von G119E für huHVEM:Fc wurde durch eine Steigerung der Dissoziationsrate (kd = 2,0 ± 0,4 × 10^-3s^-1) verursacht. Y173F band sowohl an huLTβR:Fc als auch an huHVEM:Fc mit verminderter Affinität, was wiederum durch erhöhte Dissoziationsraten bedingt war. Die Affinität von Y173F für den huLTβR (kd = 31 nM) war 3- bis 4-fach niedriger als die von LIGHT-t66, während die Affinität von Y173F für huHVEM:Fc mehr als 40-fach geringer war (kd = 180 nM).

Q117T band sowohl an huHVEM:Fc als auch an huLTβR:Fc mit ähnlichen Assoziationsraten wie LIGHT-t66 und mit geringeren Dissoziationsraten, so dass die Affinität dieser Mutante für die Rezeptoren relativ zu LIGHT-t66 erhöht war. Tabelle 1

	Hu HVEM:Fc			HuLTβR:Fc
	ka(M^-1s^-1)	kd (s^-1)	kD(nM)	ka (M^-1s^-1)	kd (s^-1)	kD (nM)
LIGHT t66	1.2 ± 0.2 × 10⁴	4.8 ± 5.1 × 10^-5	3.9 ± 3.9	2.7 ± 0.5 × 10⁴	1.2 ± 0.2 × 10	4.5 ± 0.7
Q117T	2.0 ± 0.7 × 10⁴	5.0 ± 4.5 × 10⁶	0.3 ± 0.3	3.2 ± 0.7 × 10^-4	4.5 ± 1.2 × 10^-3	1.5 ± 0.7
G119E	1.8 ± 0.4 × 10⁴	2.0 ± 0.4 × 10^. ³	114 ± 14	Keine Bindung
Y173F	1.9 ± 0.2 × 10⁴	3.3 ± 0.1 × 10^-3	173 ± 30	3.7 ± 0.8 × 10⁴	1.1 ± 0.4 × 10	31 ± 8

Beispiel 15. Die Hochregulierung von ICAM durch lösliches, homotrimeres menschliches LIGHT wird durch den LTβR vermittelt
Dieses Beispiel demonstriert, dass lösliches, homotrimeres LIGHT und zwei Varianten (die Punktmutanten L120Q und Q117T) die Expression von ICAM hochregulieren können.
NHDF-Zellen wurden bei der 5-ten Passage oder früher verwendet. Die Zellen (180.000/4,2 cm²-Schale) wurden mit Cytokin in vollständigem DMEM (600 μl/Vertiefung) inkubiert, das mit Insulin und dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt worden war. Nach 36 Stunden wurden die Zellen mit einem monoclonalen Anti-ICAM-Antikörper (P2A4; 10 μg/ml) gefolgt von Ziegen-anti-Maus-IgG-PE angefärbt und mittels Durchfluss-Cytometrie analysiert.
L120Q und Q117T (5 nM) induzierten die Hochregulierung der ICAM-Expression in NHDF-Zellen in einem Ausmaß, das demjenigen, welches durch LIGHT-t66 erreicht wurde (4-fache Induktion), vergleichbar war (21). Wenn sie in einer Konzentration von 5 nM verwendet wurde, verursachte die Y173F-Mutante eine schwache Induktion der ICAM-Expression, wohingegen die Induktion bei 20 mM das 2,5-fache betrug. Bei 5 nM verursachte G119E keine nachweisbare Induktion der ICAM-Expression und bei 20 nM eine schwache Induktion (<1,5-fach).
Beispiel 16. HVEM ist zusammen mit TRAF2 und TRAF5, aber nicht mit TRAF3 auf der Zellmembran lokalisiert
Dieses Beispiel demonstriert, dass der HVEM, wenn er als rekombinantes Protein in 293-Zellen gemeinsam mit TRAF-Polypeptiden exprimiert wird, zusammen mit TRAF2 und mit TRAF5 (aber nicht mit TRAF3) auf der Zellmembran lokalisiert und gebunden vorliegt.
Durch Kotransfektions-Experimente mit 293-Zellen wurde (unter Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikroskopie) gezeigt, dass der HVEM mit TRAF2 und mit TRAF5 kolokalisiert, aber nicht mit TRAF3. Der LTβR lokalisiert mit allen drei untersuchten TRAFs zusammen; die Negativ-Kontrolle bestand aus einer Kotransfektion mit dem leeren pBABE-Vektor. Mit FLAG markierte TRAFs wurden durch FITC sichtbar gemacht. Der LTβR und der HVEM wurden unter Verwendung von Texas-Rot sichtbar gemacht. Zusammen lokalisierte Proteine erschienen in Gelb. Der HVEM kolokalisierte mit TRAF2 und 5, aber nicht mit TRAF3. Der LTβR ko-lokalisierte mit den TRAF-Proteinen 2, 3 und 5.
Es wurde auch demonstriert, dass der HVEM an TRAF2 und an TRAF5 bindet; dies erfolgte durch Experimente, in denen eine Immunpräzipitation des rekombinant exprimierten HVEM (durch einen Anti-HVEM-Antikörper) TRAF2 und 5, aber nicht TRAF3 (aus Lysaten der transfizierten 293-Zellen) kopräzipitierte. Der LTβR präzipitierte nur TRAF3. Vergleiche mit den 22A und 22B.
Konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Verfahren
20 Stunden nach der Transfektion wurden 293T-Zellen in Lab-TekB^TM-Kammer-Objektträgern mit 8 Vertiefungen (Lab-Tek, Katalog-Nummer 177445) zu 3 × 10⁴ Zellen/Vertiefung ausgesät und 18 bis 36 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ angezogen. Für die Anfärbung wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS gewaschen, dann wurden die Zellen 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit frisch zubereitetem 2%-igem Parafomaldehyd in PBS, pH-Wert 7,0 fixiert, erneut zweimal mit PBS gewaschen und anschließend 2 Minuten bei Zimmertemperatur mit Methanol permeabilisiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mindestens 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit PBS, das 3% BSA enthielt, blockiert. Der polyclonale Ziegen-anti-LTβR-Antikörper wurde auf eine Endkonzentration von 20 μg/ml verdünnt und der polyclonale Ratten-anti-HVEM-Antikörper wurde auf eine Endkonzentration von 20 μg/ml verdünnt und der monoclonale Maus-anti-FLAG-Antikörper M2 (Sigma F3165) wurde auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml verdünnt. Die Antikörper wurden mit PBS, 3% BSA und 0,2% Triton X-100 (PBS/BSA/Triton) verdünnt. Die primären Antikörper wurden den Vertiefungen in einem Endvolumen von 120 μl/Vertiefung hinzugefügt und in einer angefeuchteten Kammer bei Zimmertemperatur 1 Stunde inkubiert. Dann wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS/BSA/Triton gewaschen. Mit FITC konjugierte Esel-anti-Maus-Antikörper in Kombination mit Texas-Rot-konjugiertem Esel-anti-Ziege-Antikörper (beide von Jackson Immuno-Research Laborstories) oder mit Texas-Rot konjugiertem Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (Jackson Immuno-Research Laborstories) wurden bis zu einer Endkonzentration von 1:200 mit PBS/BSA/Triton in einem Endvolumen von 120 μl/Vertiefung verdünnt. Die Objektträger wurden in einer angefeuchteten Kammer bei Zimmertemperatur eine Stunde im Dunkeln inkubiert und dann dreimal mit PBS/BSA/Triton gewaschen, und anschließend wurden die Kammer-Vertiefungen entfernt. Pro Vertiefung wurden vier Mikroliter einer Einfassungs-Lösung, die aus 80% Glycerin in PBS bestand, über die Zellen jeder Vertiefung gegeben, und dann wurden die Objektträger mit einem 24 × 55 mm großen Mikroskop-Deckglas (Fisherbrand #12-544-18) abgedeckt. Die Objektträger wurden vor der Beobachtung 1 bis 7 Tage bei 4°C im Dunkeln belassen.
Die Zellen wurden unter Verwendung des konfokalen BioRad-MRC-1024^TM-Mikroskops mit einem Krypton/Argon-Ionen-Laser und einem 60 × Nikon^TM-Objektiv beobachtet. Die Aufnahmen wurden unter Verwendung des LaserSharp^TM-Operations-Systems aufgenommen und mit Adobe-Photoshop^TM 5.0 analysiert und bearbeitet.
HT29-Zellen (10⁶/ml in DMEM/3% BSA) wurden mit dem monoclonalen Anti-HVEM- oder dem Anti-LTβR-Antikörper 30 Minuten bei 4°C gefolgt von Ziegen-anti-Maus-IgG, an das Phycoerythrin (PE) gekoppelt war, 30 Minuten bei 4°C angefärbt und mittels Durchflusscytometrie unter Verwendung des FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, KA) analysiert.
SEQUENZPROTOKOLL
Die Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche begrenzt.

Claims

In vitro-Verfahren zur Modulierung einer Lymphotoxin-beta-Rezeptor(LTβR)-vermittelten zellulären Antwort, wobei die zelluläre Antwort ausgewählt ist aus ICAM-1-Expression und NF-κb-Aktivität, wobei das Verfahren: (a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, welche die Bindung eines LTβR an ein p30-Polypeptid hemmt, und (b) Inkontaktbringen einer Zelle, welche den LTβR oder das p30-Polypetid exprimiert, mit einer Menge der Zusammensetzung, die ausreicht, um die Lymphotoxin-beta-Rezeptor(LTβR)-vermittelte zelluläre Antwort, ausgewählt aus ICAM-1-Expression und NF-κb-Aktivität, zu modulieren.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle LTβR exprimiert und die Zusammensetzung ein homotrimeres p30-Polypeptid enthält, umfassend ein monomeres p30-Polypetid, welches ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 30 kDa besitzt, wobei das homotrimere Polypetid unter physiologischen Bedingungen an ein Herpesvirus-Entry-Mediator(HVEM)-Polypeptid oder ein Lymphotoxin-beta-Rezeptor(LTβR)-Polypeptid bindet, oder ein lösliches homotrimeres p30-Polypetid, welches keine Transmembrandomäne besitzt, wobei das lösliche homotrimere Polypetid unter physiologischen Bedingungen an ein Herpesvirus-Entry-Mediator(HVEM)-Polypeptid oder ein Lymphotoxinbeta-Rezeptor(LTβR)-Polypeptid bindet.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle ein p30-Polypeptid exprimiert und die Zusammensetzung einen Anti-p30-Antikörper enthält.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Anti-p30-Antikörper monoclonal ist.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Anti-p30-Antikörper menschlich, humanisiert oder chimär ist.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Anti-p30-Antikörper ein p30-Polypeptid-bindendes Fragment ist.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 6, wobei das p30-Polypeptid-bindende Fragment ein Einzellketten-Antikörper, ein Fab-Fragment oder ein F(ab')₂-Fragment ist.
In vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das p30-Polypeptid ein Fusionsprotein umfasst.
In vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das p30-Polypeptid eine p30-Polypeptiduntersequenz umfasst.
In vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das p30-Polypeptid keine Transmembrandomäne besitzt.
In vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das p30-Polypeptid eine mutierte p30-Sequenz umfasst.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 11, wobei die mutierte p30-Sequenz eine konservative Substitution umfasst.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 11, wobei die mutierte p30-Sequenz ein Q117T, 11200 oder Y173F umfasst.