JPH08507684A

JPH08507684A - 腫瘍細胞死誘導法

Info

Publication number: JPH08507684A
Application number: JP6520146A
Authority: JP
Inventors: ウォン，グレース・エイチ・ダブリュー
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-02
Publication date: 1996-08-20
Also published as: EP0689600B1; DE69427290D1; ZA941422B; CA2157010A1; DE69427290T2; IL108776A; AU6357894A; AU685095B2; IL108776A0; EP0689600A1; WO1994020625A1

Abstract

(57)【要約】本発明は１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）とＦａｓ抗原との双方を発現する悪性腫瘍細胞の細胞溶解または成長阻止方法に関する。本発明はさらに、ＴＮＦ−Ｒ１およびＦａｓ抗原に特異的に結合する双特異性分子、およびＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓ抗原との双方を発現する標的細胞を殺すためにこの双特異性分子を使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍細胞死誘導法発明の背景Ｉ．本発明の技術分野本発明は細胞溶解方法または望ましくない細胞の成長阻止方法に関する。殊に、本発明はＦａｓ抗原およびＩ型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）の双方を発現する腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を死滅させることまたは成長阻止に関する。ＩＩ．技術的背景および関連技術ここ何十年か、ある種の細胞には発達のある時点で死滅すること、すなわち、「アポトーシス」と命名された過程がプログラムされていることが判ってきた。アポトーシスにより死滅しつつある細胞は細胞質の濃縮、原形質膜微絨毛消失、細胞核断片化および約１８０ｂｐオリゴマーへの染色体ＤＮＡの徹底的分解のような一連の特徴的な形態学的および生化学的変化によって容易に確認できる。アポトーシスは胚の発達と免疫系でのクローン選択と［Ｉｔｏｈなど、Ｃｅｌｌ、６６巻：２３３〜２４３頁（１９９１年）］を含む多数の生理学的過程において必須であり、未成熟胸腺細胞での糖質コルチコイドホルモンおよびある種の成長因子の除去［Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻：３１４〜３１７頁（１９９２年）］のような種々の刺激により開始される。ｂｃｌ−２・Ｐ５３またはｃ−ｍｙｃの過剰発現はアポトーシスを調節すると思われる。アポトーシスは腫瘍細胞退行に有用なことが観察されており、アポトーシスの人工的な誘導により腫瘍細胞を破壊できることが提案された。事実、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子−ベータ（ＴＮＦ−β、リンホトキシン）のような細胞毒性薬と放射線とが感受性腫瘍細胞のアポトーシス死を誘導することが示された［Ｓｃｈｍｉｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻：１８８１頁（１９８６年）；Ｄｅａｌｔｒｙなど、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻：６８９頁（１９８７年）］。ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βが仲介する種々の細胞応答誘導の第一段階は特異的細胞表面受容体へのそれらの結合である。約５５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ１）および約７５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ２）の異なる２種のＴＮＦ受容体が確認されており［Ｈｏｈｍａｎ，Ｈ．Ｐ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻：１４９２７〜１４９３４頁（１９８９年）；Ｂｒｏｃｋｈａｕs，Ｍ．など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：３１２７〜３１３１頁（１９９０年）］、両型受容体に対応するヒトおよびマウスのｃＤＮＡが分離され、配列決定されている［Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，Ｈ．など、Ｃｅｌｌ、６１巻：３５１頁（１９９０年）、Ｓｃｈａｌｌ，Ｔ．Ｊ．など、Ｃｅｌｌ、６１巻：３６１頁（１９９０年）（１１〜１５）；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．など、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：１０１９頁（１９９０年）；Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：２８３０〜２８３４頁（１９９１年）；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｇ．など、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１巻：３０２０〜３０２６頁（１９９１年）］。まだ組織的には研究されていないが、大多数の細胞型と組織とは両ＴＮＦ受容体を発現していると思われる。ＴＮＦ受容体２種の各役割を理解しようとして、数群の研究者がＴＮＦ−Ｒ１かＴＮＦ−Ｒ２かのいずれかに特異的なポリおよびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作成した。ＴＮＦ−Ｒ１に対して特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体は双方ともこの受容体に対する特異的アゴニストとして行動すること、および細胞毒性、繊維芽細胞増殖、対クラミジア耐性、プロスタグランジンＥ₂合成および抗ウイルス作用［Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｈ．など、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１４４９７〜１４５０４頁（１９９０年）；Ｅｓｐｅｖｉｋ，Ｔ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７１巻：４１５〜４２６頁（１９９０年）；Ｓｈａｌａｂｙ，Ｍ．Ｒ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７２巻：１５１７〜１５２０頁（１９９０年）；Ｗｏｎｇ，Ｇ．など、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻：３３５０〜３３５３頁（１９９２年）］のようなＴＮＦ作用数種を引出すことができることが観察されている。ＴＮＦ−Ｒ１へのアゴニスト抗体の持つ抗ウイルス活性はＷｏｎｇなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻：３３５０〜３３５３頁（１９９２年）に開示がある。加えるに、ネズミＴＮＦ−Ｒ１とＴＮＦ−Ｒ２との双方に対するポリクローナル抗体が作成され、各々特異的受容体アゴニストとして作用し、ネズミＴＮＦ作用のサブセットを誘導することが証明されている。ネズミＴＮＦ−Ｒ１は細胞毒性のシグナル伝達および遺伝子数種の誘導を招く一方、ネズミＴＮＦ−Ｒ２は一次胸腺細胞と細胞毒性Ｔ細胞系の増殖シグナル伝達［Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：９２９２〜９２９６頁（１９９１年）］をすることができることが示された。Ｆａｓ抗原（ＡＰＯ−１またはＦａｓ受容体とも言う）は細胞表面分子で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体−神経成長因子（ＮＧＦ）受容体スーパーファミリーに属し、最近、胸腺で自己応答性Ｔ細胞に負の選択を行うことが示唆されている。５５ｋＤａのＴＮＦ−Ｒ１がシグナル伝達するものと同様なアポトーシス細胞死をＦａｓ受容体はシグナル伝達できる［Ｉｔｏｈなど、Ｃｅｌｌ、６６巻：２３３〜２４３頁（１９９１年）］。Ｆａｓ抗原に特異的に結合するアゴニストマウスモノクローナル抗体はＴＮＦ−αのものと区別できない細胞致死活性を示すと報告されており、ＴＮＦ−αの細胞溶解活性はＴＮＦ−Ｒ１と共同するＦａｓ抗原により仲介されると示唆された。細胞をＴＮＦ−αか抗Ｆａｓマウスモノクローナル抗体かのいずれかで処理した時にはＦａｓ抗原の発現はＴＮＦ−Ｒ１とともにダウンレギュレーションされることが報告された。細胞をインターフェロン−αと共処理するとＴＮＦ−αおよび抗Ｆａｓ抗体の細胞溶解作用は増大した［Ｙｏｎｅｈａｒａなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻：１７４７〜１７５６頁（１９８９年）］。これらの発見を文献はＦａｓ受容体とＴＮＦ−Ｒ１受容体とを共発現する細胞系は共通のシグナル伝達経路を経た細胞致死を仲介することを予測させるものであると解釈している。ＴＮＦと抗Ｆａｓモノクローナル抗体とがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染細胞に細胞致死的であることが示されたが、しかしながら、抗Ｆａｓ抗体でなく、ＴＮＦがＨＩＶ複写を増大した［Ｋｏｂａｙａｓｈｉなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：９６２０〜９６２４頁（１９９０年）］。発明の要約本発明はＦａｓ抗原とＴＮＦ−Ｒ１とが異なるシグナル経路を通して細胞の死をシグナル伝達するという予想されなかった発見に基づく。ＴＮＦ−α耐性およびＴＮＦ−α感受性細胞系多数をアゴニスト抗Ｆａｓ抗体による細胞致死についてスクリーニングすることにより、機能的なＦａｓおよびＴＮＦ−Ｒ１受容体双方を共発現するある種の腫瘍細胞は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−Ｒ１に特異的に結合するアゴニスト抗体ではなくて、Ｆａｓ抗原に特異的に結合するアゴニスト抗体により殺されることが観察されている。ＴＮＦ−αおよび抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体に高度に感受性の別種細胞系はアゴニスト抗Ｆａｓ抗体に感受性を示さなかった。例えば、ＦａｓアゴニストはＦａｓ抗原を高水準で発現する時でも正常な繊維芽細胞やリンパ球細胞は殺さない。さらにＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストの組合せは腫瘍細胞致死能について相乗的相互作用を示すことが観察されている。ＴＮＦ−Ｒ１、ＩＬ−１（多分、保護蛋白質の誘導による）またはシクロヘキシミド（活性細胞致死性蛋白質合成を阻害しうる）を特異的に結合するアゴニスト抗体であるＴＮＦ−αによる前処置は、後続するＴＮＦ−αによる細胞致死作用に対して保護したが、抗Ｆａｓアゴニスト抗体によるものは保護しなかったことが観察された。最後に、ＴＮＦ−αは多様な生物学的作用をシグナル伝達できる一方、Ｆａｓによるシグナル伝達はもっと特異的に細胞致死に導く。前記観察をまとめると予想できなかったことにＦａｓ抗原とＴＮＦ−Ｒ１とが異なるシグナル伝達経路を経て腫瘍細胞致死を誘導していることを示す。一側面では、本発明はＦａｓ抗原と１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）とを発現する細胞をＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストとの有効量で処置することによる細胞溶解または細胞成長阻止の方法に関する。ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストは、好ましくはＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αと細胞毒作用が似ている抗ＴＮＦ −Ｒ１抗体である。Ｆａｓアゴニストは、好ましくは細胞致死作用を示す抗体である。別の側面では、本発明はＴＮＦ−Ｒ１を特異的に結合する第一の連続的アミノ酸配列とＦａｓ抗原を特異的に結合する第二の連続的アミノ酸配列とを含む双特異性分子に関する。好適な態様では、双特異性分子は少なくともヒンジ領域およびＩｇＧ−１、ＩＧｇ−２、ＩＧｇ−３免疫グロブリンのＣ_M２およびＣ_M３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列のような免疫グロブリン配列を含む。治療的有用性に加え、本発明の双特異性分子は、殊にＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓ抗原とを発現する悪性腫瘍での細胞型の確認と標識のためにも有用である。さらに本発明は前記に定義した双特異性分子をコードするヌクレオチド配列に関する。さらに別の側面では、本発明はヌクレオチド配列を含み、かつ適当な宿主細胞中で発現することのできる複製可能な発現ベクターに関する。さらに他の側面では、本発明は該発現ベクターで形質転換した宿主細胞および双特異性分子を発現するように形質転換した宿主細胞の培養法に関する。本発明はまた細胞溶解または細胞成長阻止誘導可能量の前記双特異性分子を医薬的に許容できる担体と混合して含む医薬組成物に関する。さらに別の面では、本発明はＦａｓ抗原と１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）とを含む細胞を前記双特異性分子の有効量で処理することによる細胞溶解法または細胞成長阻止法に関する。図面の簡単な説明図１はＦａｓ抗原とＴＮＦ−Ｒ１との各構造の模式図である。これにはＦａｓ抗原とＴＮＦ−Ｒ１とにより仲介される下流の異なるシグナル伝達経路も示す。ＴＮＦ−Ｒ１は細胞毒性、繊維芽細胞増殖、ＭｎＳＯＤ誘導、ＨＬＡおよびＩＣＡＭ発現、酸素フリーラジカル増加、細胞耐性誘導および抗ウイルス作用を仲介することが証明されているが、Ｆａｓ抗原の生物学的作用は細胞毒性の仲介に限定されていると思われる。図２ａと２ｂとはＦａｓおよびＴＮＦ−Ｒ１アゴニストのＨＵＴ−７８（ａ）およびＭＥ−１８０（ｂ）細胞への効果を示す。細胞をＴＮＦ−α（１μｇ／ｍＬ）かＦａｓ、ＴＮＦ−Ｒ１またはＴＮＦ−Ｒ２に対するウサギ血清（１：２０希釈）かいずれかで、または免疫前血清で、ＣＨＩ存在下に２４時間処理した。次に細胞生存率を表１の説明文に記載したようにして測定した。相対生存率％は反復６回の平均値±標準偏差を示す。図３ａと３ｂとはＴＮＦ−Ｒ１アゴニストではなく、ＦａｓによるＳＷ−４８０細胞致死作用を示す。細胞致死作用検定法（ａ）は表１に記載したものと同一方法で実施した。細胞をＦａｓアゴニストに（ｂ）に示す種々の時間接触させ、ＰＢＳで５回洗浄し、さらにＣＨＩ（１μｇ／ｍＬ）と１７時間インキュベーションした後、表１の説明文に記載したようにして細胞生存率を測定した。図４はＴＮＦ−Ｒ１へのおよびＦａｓ抗原へのアゴニスト抗体の相乗的な細胞毒性を示し、Ｔ２４細胞（ａ）、ヒトＦａｓ抗原を発現するネズミＬ９２９細胞（ｂ）、およびＡ１７２細胞（ｃ）をアゴニスト抗Ｆａｓかアゴニスト抗ヒトＴＮＦ−Ｒ１抗体かの単独または組合せで、シクロヘキシミド（ＣＨＩ：１０μｇ／ｍＬ）の存在下に処理し、実施例に記載のようにして分析した。生存百分率は３回〜６回の反復から得た平均値である。Ｌ９２９細胞では抗ネズミＲ１抗体を抗ヒトＴＮＦ−Ｒ１抗体の代わりに使用した。免疫前血清（１レーン）、抗ＴＮＦ−Ｒ１（２レーン）、抗Ｆａｓ（３レーン）および抗ＴＮＦ−Ｒ１と抗Ｆａｓとの組合せ（４レーン）の１／１００希釈で処理した細胞から核のＤＮＡを分離した。分子量マーカーとしてラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄ・ＩＩＩ消化物を用いた（５レーン）。図５（ａ）はＦａｓアゴニストではなくＴＮＦ−Ｒ１での前処理がＭＡ−１細胞をＴＮＦ−α＋ＣＨＩの細胞致死作用に対して保護すること、（ｂ）ＴＮＦ− α誘導保護蛋白質はＦａｓアゴニストの細胞致死作用に対して保護しないこと、（ｃ）ＣＨＩ前処理はＴＮＦの細胞致死作用に対して保護するが、Ｆａｓアゴニストの細胞致死作用からは保護しないことを示す。致死作用の検定はすべて表１の説明文に記載したようにして行った。表１．ＦａｓアゴニストまたはＴＮＦ−Ｒ１アゴニストの種々の腫瘍細胞致死作用５％ＦＢＳ添加Ｆ１２培地中、細胞２×１０⁵個／ｍＬの懸濁液１００μＬを９６穴プレートの各穴に入れ、２４時間後に検定した。被検検体（ＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストまたはＦａｓアゴニストを種々の用量で含む）を第一カラムに加え、検体をＦＢＳ不含シクロヘキシミド（ＣＨＩ）を含む培地で順次に２倍希釈した。所定濃度のＣＨＩ含有検体適量を付着細胞に添加した。２４時間後、穴を鏡検して９０〜１００％細胞溶解を確認した。全穴から液体を流去し、付着した生存細胞を０．５％クリスタルバイオレット２０％メタノール溶液で１０〜１５分間常温で染色した。０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム／０．１Ｍ−クエン酸と５０％エタノールとで染料を着色細胞から溶出し、５４０ｎｍでの吸光度を測定して細胞生存率を定量した。記号（＋／−、＋、＋＋、＋＋＋）は各々約２５、５０、７５および１００％の細胞毒性を示し、記号（−）は１０％以下の細胞毒性を示す。ＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓ抗原水準の染色測定法はＴＮＦ−Ｒ１かＦａｓ抗原かに対する精製ウサギポリクローナル抗体を利用して前記同様に実行した。全細胞系は最初はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手したもので、マイコプラズマ不含である。全培地には５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。細胞は５％ＣＯ₂大気中、３７℃でインキュベーションした。組み換えヒトＴＮＦ−α（４×１０⁷Ｕ／ｍｇ）はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ製造グループから入手した。ヒトＴＮＦ−Ｒ１に対するウサギ抗血清は前報と同じで［Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｌ．Ａ．とＧｏｅｄｄｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻：４３０４〜４３０７頁（１９９２年）］、可溶性ＩｇＧ−ヒトＦａｓ抗原に対するウサギ抗血清はＧ．Ｂｅｎｎｅｔｔ氏（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）からの恵与品で、Ａ蛋白質カラム精製品である。発明の詳細な説明１．定義用語「ＴＮＦ−Ｒ１」は欧州特許４１７５６３（１９９１年３月２０日発行）に開示されたアミノ酸配列を持つヒト１型ＴＮＦ受容体およびこのＴＮＦ−Ｒ１受容体の天然起源対立遺伝子および変異型のような、いかなる種からのいかなるＴＮＦ−Ｒ１全長自然型アミノ酸配列をも含むポリペプチド分子の一員を示す。この定義は殊に天然起源、試験管内合成または組み換えＤＮＡ技術法を含む遺伝子操作から得られた可溶性のＴＮＦ−Ｒ１受容体ならびに様々な糖鎖付加型および非糖鎖付加型自然型ＴＮＦ−Ｒ１を包含する。非ヒト哺乳類（ネズミ、ウシ、ウマ、ブタなど）種からのＴＮＦ−Ｒ１受容体は、例えばハイブリド化プローブとしてヒトＤＮＡ配列から得たプローブを用いる種間ハイブリド化により各非ヒト哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＴＮＦ−Ｒ・ｃＤＮＡを分離して取得することができる。用語「Ｆａｓ受容体」、「Ｆａｓ抗原」、「Ｆａｓ」および「ＡＰＯ−１」は互換的に使用され、いかなる種からのいかなるＦａｓ全長自然型アミノ酸配列をも含む一群のポリペプチド分子を示し、Ｉｔｏｈなど、Ｃｅｌｌ、６６巻：２３３〜２４３頁（１９９１年）が開示したヒトＦａｓ抗原およびＷａｔａｎａｂｅ −Ｆｕｋｕｎａｇａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻：１２７４〜１２７９頁（１９９２年）が報告したマウスＦａｓ抗原アミノ酸配列および自然型Ｆａｓ抗原の天然起源対立遺伝子および変異型を包含する。この定義は、殊に天然起源、試験管内合成または組み換えＤＮＡ技術を含む遺伝子操作から得た自然型配列Ｆａｓ受容体および様々な糖鎖付加型および非糖鎖付加型の自然型Ｆａｓ受容体を包含する。非ヒト哺乳類（ネズミ、ウシ、ウマ、ブタなど）からのＦａｓ抗原は、例えばハイブリド化プローブとしてヒトＤＮＡ配列から得たプローブを用いる種間ハイブリド化により各非ヒト哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＦａｓ・ｃＤＮＡを分離して取得することができる。用語「アゴニスト」は本発明の目的のための定義では、ＴＮＦ−Ｒ１およびＦａｓ受容体の各々に特異的に結合し、また、結合時には標的細胞致死または成長阻止を誘導できる抗体および他の分子を包含する。この用語は特異的にＴＮＦ− α、ＴＮＦ−β（一緒にしてＴＮＦと記載）のようなＴＮＦ−Ｒ１の天然起源および変異型リガンドおよびＴＮＦに細胞毒性が似ているアゴニスト抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体ならび業界公知または以下に記述するＦａｓ受容体の天然起源および変異型リガンドおよび標的細胞を溶解または成長阻止することのできるアゴニスト抗Ｆａｓ抗体を含む。「相乗作用」、「相乗的」およびこれらの文言の文法的変異型は本発明の文脈では権威のある定義［Ｇｏｏｄｍａｎなど、「治療薬の薬理学的基礎」、ＭｃＭｉｌｌａｎ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ・Ｃｏ．Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ（１９８０年）］に従って定義する。これはＸとＹ軸にそって成分２種各々の所定の生物学的応答に必要な用量をプロットする「イソボログラム」構築の立場から最も容易に理解できる。単なる相加的効果は一成分が減少すると、他成分が増加する直線を形成する一方、相乗的効果は一成分の小さな増加が他成分量の急激な増加を補償するような凹曲線の形成により認識することができる。用語「腫瘍壊死因子」と「ＴＮＦ」とはギリシャ文字の接辞がない時はＴＮＦ −αとＴＮＦ−β（リンホトキシン）との双方の集合的呼称で、Ｐｅｎｎｉｃａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：７２１頁（１９８４年）により開示されたアミノ酸配列を持つヒトＴＮＦ−α、Ｇｒａｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：７２４頁（１９８４年）に記載されたリンホトキシンとも呼ばれるヒトＴＮＦ−β、および、厳格条件下に対応自然型アミノ酸配列とハイブリド化することができる限り、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β分子のアミノ酸配列変異型を包含するいかなる種からのいかなるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βの全長自然型アミノ酸配列をも含む一群のポリペプチド分子を示す。この定義には殊に、天然起源、試験管内合成または組み換えＤＮＡ技術を含む遺伝子操作で得た自然型配列ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βも包含する。アミノ酸配列変異型は、好ましくは配列相同性少なくとも約６５％、さらに好ましくは配列相同性少なくとも約７５％を自然型ＴＮＦ −αまたはＴＮＦ−βアミノ酸配列のいかなるドメインとも共有する。この定義には特異的に自然型および変異型ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの様々な糖鎖付加型および非糖鎖付加型を包含する。非ヒト哺乳類（ネズミ、ウシ、ウマ、ブタなど）種からのＴＮＦ分子は、例えばヒトＤＮＡ配列から得たプローブをハイブリド化プローブとして用いる種間ハイブリド化により各非ヒト哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＦａｓ・ｃＤＮＡを分離して取得できる。ＴＮＦは１個またはそれ以上の結合部位を持っていてもよい。例えばヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）は受容体相互作用部位３個所を持つと記載されている［ＶａｎＯｓｔａｄｅなど、Ｔｈｅ・ＥＭＢＯ・Ｊ．、１０巻：８２７頁（１９９１年）］。本発明ではＴＮＦ−Ｒ１への全受容体結合部位の結合は不要であるが、受容体結合部位１個以上との相互作用は結合と生物学的作用とを最大にするためには好適である。「厳密条件」は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１５ｍＭ−クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび変性剪断鮭精子ＤＮＡ２０ μｇ／ｍＬを含む溶液中、４２℃で一夜インキュベーションする。続いてフィルターを約６５℃の０．１×ＳＳＣで洗浄する。用語「アミノ酸」はすべての天然起源Ｌ−α−アミノ酸を示す。アミノ酸は一文字または三文字表記法で示される：ＡｓｐＤアスパラギン酸ＩｌｅＩイソロイシンＴｈｒＴスレオニンＬｅｕＬロイシンＳｅｒＳセリンＴｙｒＹチロシンＧｌｕＥグルタミン酸ＰｈｅＦフェニルアラニンＰｒｏＰプロリンＨｉｓＨヒスチジンＧｌｙＧグリシンＬｙｓＫリジンＡｌａＡアラニンＡｒｇＲアルギニンＣｙｓＣシステインＴｒｐＷトリプトファンＶａｌＶバリンＧｌｎＱグルタミンＭｅｔＭメチオニンＡｓｎＮアスパラギンこれらのアミノ酸は化学構造およびそれらの側鎖の性質に従って分類しうる。それらは荷電および非荷電の２群に分類される。これらの群はそれぞれアミノ酸をもっと詳細に類別するサブグループに分類される。Ｉ．荷電アミノ酸酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジンＩＩ．非荷電アミノ酸親水性残基：セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン用語「アミノ酸配列変異型」は自然型アミノ酸配列と比べてアミノ酸配列がいくらか異なる分子を示す。「相同性」は自然型対応アミノ酸配列内での残基と同一な、対象アミノ酸配列内での残基の百分率として定義されるが、要すれば配列を相同性百分率が最大になるように並べ、さらに間隙を入れた後に比較する。この並べ方とコンピュータプログラムは当業者によく公知である。変換変異型は自然型配列内のアミノ酸残基少なくとも１個を除去し、その代わりに異なるアミノ酸を同じ位置に挿入したものである。変換は単一、すなわち分子内のアミノ酸１個のみが変換されたもの、または多重、すなわち同一分子内のアミノ酸２個またはそれ以上が変換されているものでありうる。挿入変異型は自然型配列内の特定位置にあるアミノ酸に直接隣接してアミノ酸１個またはそれ以上が導入されたものである。アミノ酸に直接隣接するとは、アミノ酸のα−カルボキシかα−アミノ官能基かに結合していることを意味する。欠失変異型は自然型アミノ酸配列内のアミノ酸１個またはそれ以上を欠失したものである。通常、欠失変異型は分子の特定領域内でアミノ酸１個か２個かを欠失したものである。用語「糖鎖付加変異型」は糖鎖付加形が自然型対応物のそれとは異なる糖蛋白質を示すために使用する。ポリペプチドの糖鎖付加は典型的にはＮ−結合かＯ− 結合かである。Ｎ−結合はアスパラギン残基側鎖への炭水化物基の付加を示す。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン［式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸である］のトリペプチド配列はアスパラギン側鎖への炭水化物基の酵素的付加のための認識配列である。Ｏ−結合糖鎖付加は糖の一種であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのヒドロキシアミノ酸、最も通常には、セリンまたはスレオニンへの付加を示すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもＯ−結合糖鎖付加に関与しうる。自然型対応物と比較して炭水化物基の位置および／または性質が相違するＴＮＦ− Ｒ１またはＦａｓアゴニスト蛋白質もこの発明の範囲内である。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は同じ構造的特性を有する糖蛋白質である。抗体は特定の抗原に結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を持たない他の抗体様分子との双方を含む。後者に属する種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低水準で、また骨髄腫により高水準で産生される。自然型抗体と免疫グロブリンとは通常、同一軽（Ｌ）鎖２個と同一重（Ｈ）鎖２個とからなる約１５００００ダルトンのヘテロテトラマー糖蛋白質である。各軽鎖は重鎖にジスルフィド共有結合１個で結合する一方、アイソタイプの異なる免疫グロブリン重鎖の間ではジスルフィド結合の数は異なっている。各重鎖および軽鎖は規則的な間隔を置いて鎖内ジスルフィド橋を持つ。各重鎖は一端に可変ドメイン（Ｖ_H）１個、続いていくつかの定常ドメインを持つ。各軽鎖は一端に可変ドメイン（Ｖ_L）を、他端に定常ドメインを持ち、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定アミノ酸残基が軽鎖および重鎖にある各可変ドメインの間のインターフェースを形成すると信じられる［Ｃｌｏｔｈｉａなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８６巻：６５１〜６６３頁（１９８５年）；ＮｏｖｏｔｎｙとＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：４５９２〜４５９６頁（１９８５年）］。可変性は抗体の可変領域全体に均一に分布しているのではない。それは軽鎖と重鎖と双方の可変領域内にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる部分３個に集中している。可変ドメインにある高度に保存された部分は枠組構造領域（ＦＲ）と呼ばれる。自然型重軽両鎖の可変ドメインは各々ＦＲ領域４個を含み、多くはＣＤＲ３個で結合されてβ−シート配置を取り、そのＣＤＲは、ものによってはβ−シートの一部を構成しながら、β−シート構造を結合して環状結合を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により互に近傍位置に保たれ、他鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位形成に役立っている［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、「免疫学的有意蛋白質の配列」、Ｎａｔｉｏｎａｌ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・ｏｆ・Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７年）］。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与はしないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を示す。抗体のパパイン消化でＦａｂと命名された同一の抗原結合断片２個ができる。そのＦａｂは抗原結合部位１個と容易に結晶する能力に因んで「Ｆｃ」と名付けられた断片１個とを持つ。ペプシン処理は抗原結合部位２個を持ち、なお抗原を交差結合できるＦ（ａｂ’）₂断片を与える。「Ｆｖ」は完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は重鎖１個および軽鎖１個の可変ドメインが堅固で非共有的に会合している二量体から構成される。各可変ドメインにあるＣＤＲ３個づつが相互作用をしてＶ_H−Ｖ_L二量体表面の抗原結合部位を決めるのはこの配位である。総合的には、このＣＤＲ６個が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、可変ドメイン１個（または、Ｆｖの半分で、抗原特異性ＣＤＲを３個しか含まないもの）でさえ全結合部位よりも親和性は低いが抗原を認識して結合する能力がある。Ｆａｂ断片も軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（Ｃ_H１）とを含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片とは重鎖Ｃ_H１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域からのシステイン１個またはそれ以上を含む数残基が付加されている点で異なっている。この文では、Ｆａｂ’−ＳＨは定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’である。Ｆ（ａｂ’）₂抗体断片は元来、断片間にヒンジシステインを持つＦａｂ’断片のペアとして生産された。抗体断片が異なる化学結合をしたものも公知である。いかなる脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の軽鎖もその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて明らかに異なる型２種であるカッパとラムダ（λ）のうち１種に分類できる。重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンには主なクラスが５個：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあるが、これらのうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３とＩｇＧ−４；ＩｇＡ− １とＩｇＡ−２に分割しうる。異なるクラスに属する免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は各々α、デルタ、イプシロン、γ、μと呼ばれる。異なるクラスに属する免疫グロブリンのサブユニット構造と３次元配位とはよく公知である。ＩｇＡ−１とＩｇＡ−２とは通常二量体または多量体の型をとるＩｇＡの単量体サブクラスである。腸管中の免疫細胞は主にＩｇＡ多重体（二量体と多量体ポリマーを含めて、ポリＩｇＡと呼ばれる）を生産する。このポリＩｇＡは「結び付け」または「Ｊ」鎖と呼ばれるジスルフィド結合したポリペプチドを含み、サブユニット５個からなるＪ鎖含有多重体ＩｇＭ（ポリＩｇＭ）と共に絨毛を通して輸送されることができる。用語「抗体」は最広義に使用し、特に単一抗ＴＮＦ−Ｒ１および抗Ｆａｓアゴニストモノクローナル抗体およびポリエピトープ特異性を持つ抗ＴＮＦ−Ｒ１および抗Ｆａｓアゴニスト抗体組成物も含む。用語「モノクローナル抗体」はここでは実質的に均一な抗体、すなわちその集団を構成する個々の抗体が、僅かに存在しうる天然起源の可能性ある変異を除いて同一である集団から得られた抗体を示す。モノクローナル抗体は高度に特異性があり、単一の抗原性部位に対して特異的である。さらに、典型的には異なる決定因子（エピトープ）に対して特異性のある異なる抗体を含む通常（ポリクローナル）抗体処理物とは対照的に、各モノクローナル抗休は抗原上の単一決定因子に対して特異的である。その特異性に加え、モノクローナル抗体はそれらがハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンを夾雑しない点で有利である。ここにモノクローナル抗体には起源である種または免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスにかかわらず、それらが所期の生物学的作用を示す限り抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ）と同様、抗ＴＮＦ−Ｒ１または抗Ｆａｓ抗体の可変（超可変を含む）ドメインと定常ドメイン（たとえば「ヒト株化」抗体）（それらの内１個だけがＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓに対するものである）を、または軽鎖と重鎖を、またはある種からの鎖と他種からの鎖をスプライシングすることにより、または非異種蛋白質との融合により、製造したハイブリッドおよび組み換え抗体を含む［たとえばＣａｂｉｌｌｙなど、米国特許４８１６５６７；ＭａｇｅとＬａｍｏｙｉ、「モノクローナル抗体生産技術および応用」中、７９〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｋｋｅｒ・Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、１９８７年）参照］。こうして修飾辞「モノクローナル」は実質的均一な抗体集団から得られる抗体の特性を示すもので、特定製法による抗体生産が要件であると解釈すべきではない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）により初めて記載されたハイブリドーマ法により製造されてもよく、または組み換えＤＮＡ法［Ｃａｂｉｌｌｙなど、米国特許４８１６５６７］により製造されてもよい。ここに抗体は、好ましくはＴＮＦ−Ｒ１およびＦａｓ抗原の細胞外ドメイン中のエピトープに対するものである。本発明の範囲内に包含される抗体はＴＮＦ−Ｒ１受容体およびＦａｓ受容体と錯体形成後、各々標的細胞の致死作用または成長阻止作用を誘導するサブクラスまたはアイソタイプに属する。本発明の実施に好適なモノクローナル抗ＴＮＦ− Ｒ１アゴニスト抗体はＷｏｎｇなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻：３３５０〜３３５３頁（１９９２年）が記載し、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９９３、９９４、１００２、１０１１、１０１５および１０２１と命名し、ヒトＴＮＦ−Ｒ１へのアフィニティーで精製したモノクローナル抗体１２種を含む。これらの抗体は超免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス後跂足蹠内でＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩ・ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）中、可溶性ＴＮＦ−Ｒ１（ｓＴＮＦ−Ｒ１）で生産し、排出する鼠径および膝窩リンパ節細胞とマウス筋原細胞系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３［Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．など、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３巻：１５４８〜１５５０頁（１９７９年）］とを融合させた。抗体を蛋白質Ａ−セファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ・Ｃｏｒｐ．ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭＡ）と確立されたアフィニティークロマトグラフィー法［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０巻：２４１〜２５３頁（１９７８年）］とを用いて腹水液から精製した。抗ＴＮＦ−Ｒ１モノクローナル抗体９８１および９８２を生産する細胞系は１９９３年２月１１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ・Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に各々寄託番号ＡＴＣＣ・ＨＢ１１２６６とＨＢ１１２６７の下に寄託した。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約とそれに付随する規則（ブダペスト条約）の規定の下に行った。細胞致死活性（細胞溶解性）を持つ抗Ｆａｓモノクローナル抗体は業界公知である［例えばＹｏｎｅｈａｒａなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻：１７４７頁（１９８９年）およびＫｏｂａｙａｓｈｉなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻：９６２０〜９６２４頁（１９９０年）；Ｋｏｅｈｌｅｒなど、Ｕｌｔｒａｔｒｕｃｔ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４巻：５１３〜５１８頁（１９９０年）参照］。「双特異性分子」は特異性２種を持つポリペプチドを定義するために用いる。特異性（「結合ドメイン」）２種を提供するアミノ酸配列は互いに直接融合させるか、または「リンカー」でつなげてもよい。このリンカーはつなげる各ドメイン２種が受容体を結合する能力またはその交差リンカー剤が誘導するリンケージを損なわずにリンクできる交差共有リンカー剤の残基であればよい。試薬選択法および製造法の指針を含む交差共有リンカー剤の総説はＴａｅ，Ｈ．Ｊｒ．、によるＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、５８０〜６０９頁（１９８３年）とその引用文献に記載がある。入手可能な交差リンカー剤多種からの特定目的用最適試薬の選択は当業者の技術範囲内にある。一般にゼロ長のホモまたはヘテロ双機能性交差リンカー剤が本発明の双特異性分子製造用には好適である。ゼロ長交差リンカー剤は付帯的物質の導入なしに両結合ドメインを直接的につなげる。ジスルフィド結合形成を触媒する試薬はこのカテゴリーに属する。他の例にはカルボキシと一級アミノ基との縮合を誘導してアミド結合を形成するカルボジイミド、クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬Ｋ１、カルボニルジイミダゾールなどのような試薬がある。ホモ双機能試薬は同一官能基２個を持ち、ヘテロ双官能試薬は不同官能基２個を含む。無数のヘテロ双官能交差リンカー剤には一級アミン反応性基とチオール反応性基とを含む。ホルミルからチオールへの結合用新規ヘテロ双官能リンカーがＨｅｉｎｄｅｌ，Ｎ．Ｄ．など、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ・Ｃｈｅｍ．、２巻：４２７〜４３０頁（１９９１年）］に開示した。好適な態様では交差共有リンカー剤はジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、グリコール（−ＣＨ［ＯＨ］ −ＣＨ［ＯＨ］−）、アゾ（−Ｎ＝Ｎ−）、スルホン（−Ｓ［＝Ｏ₂］−）またはエステル（−Ｃ［＝Ｏ］−Ｏ−）橋を形成できる試薬中から選択される。他の解決法では、結合ドメインをオリゴサッカライドで結合する。ポリペプチドリガンド上のオリゴサッカライドからアルデヒドへの化学的または酵素的酸化は分子上に独特な基を与え、これが例えばアミン、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジドを含む化合物と反応することができる。ポリペプチド分子内の糖鎖付加部位は解明されており、酸化オリゴサッカライド基を経る選択的なカップリング法は他のカップリング法より均一な生産物を与え、リガンドの受容体結合性能への悪影響が少ないと期待される。炭水化物基特異的ヘテロ双官能的交差リンカー剤は、例えば４−（４−マレイミノロフェニル）酪酸ヒドラジドである。ＨＣｌ（ＭＰＢＨ）および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）はＰｉｅｒｃｅ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ・Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓから商業的に購入できる。ＭＰＢＨもＣｈａｍｏｗなど荷より、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻：１５９１６〜１５９２２頁（１９９２年）に開示された。結合配列２個以上と種々のリンカー配列とのカップリング、たとえば交差リンカー剤も可能であって、本発明範囲内にあると理解する。さらに別の態様では、本発明の双特異的分子では結合ドメインがポリペプチドリンカー配列で結合しており、それ故にそれらの受容体に対して一本鎖多機能ポリペプチド分子として提示される。ポリペプチドリンカーは機能的結合ドメインをそれらが独立に固有の三次元配位を決められるように離れさせる機能を持っている「スペーサー」として機能する。ポリペプチドリンカーは通常約５から約２５残基の間、好ましくは少なくとも約１０、さらに好ましくは少なくともアミノ酸１５個を含み、親水性の比較的非構造領域を与えるアミノ酸残基群からなる。二次的構造が殆どまたは全くないアミノ酸配列リンカーはよく機能する。所望ならば特異的切断剤（たとえばプロテアーゼ）により認識される独特の切断部位１個またはそれ以上をポリペプチドリンカー内に含める。スプーサー内の特定のアミノ酸は変えられるが、しかしながら、システインは避けるべきである。スペーサー配列は螺旋構造のように所期構造を絞って設計することができる。適当なポリペプチドリンカーとこのリンカーを含む多機能蛋白質の製法とは、例えばＷＯ８８／０９３４４（１９８８年１２月１日発行）に開示されている。さらに別の特別の態様では、結合ドメインを両親媒性の螺旋構造により結合する。遺伝子制御蛋白質内のアミノ酸ロイシン（Ｌｅｕ）の反復コピーが蛋白質分子２個を一緒に「閉じこめめる」歯として役立ち、二量体を与えることができることが知られている。ロイシンジッパーは蛋白質Ｃ／ＥＢＰの小さいセグメントを仮想的なα螺旋に適合させた時に初めて発見された。驚いたことに、この蛋白質のアミノ酸７個毎に構成していたロイシンはカラムを作った。続いて、Ｃ／ＥＢＰ関連蛋白質２個の構造が確認されて同様な機能を持つことが証明された。その一つＧＣＮ４は酵母の遺伝子制御蛋白質であり、他方はプロトオンコジーンｊｕｎの産物である。ジッパー領域は結合する時平行に会合し、すなわち分子上に並んでいるロイシンは交互に並ぶことが証明された。また、非同一蛋白質がジッパーになってヘテロ二量体を与えることも見出された。このようなロイシンジッパーは本発明範囲内の双特異性分子を製造するためには殊に適当である。別に、両親媒性螺旋構造の配列は本質的にＰａｃｋ，Ｐ．とＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．が、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：１５７９〜１５８４頁（１９９２年）に記載した螺旋４本の束構造を取りうる。本発明の目的のためのリンカーとして役立つことのできる分子、たとえばロイシンジッパーのような分子ジッパーに関するさらに詳細は、例えばＬａｎｄｓｃｈｕｌｚ，Ｗ．Ｈ．など、Ｓｃｉｅｎｃ e、２４０巻：１７５９〜１７６４頁（１９８８年）；Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｅ．Ｋ．など、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻：５３８〜５４２頁（１９８９年）；ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ・Ａｍｅｒｉｃａｎ、５４〜６４頁、１９９１年４月；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｄｏｒｒ，Ｔ．など、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：９６５７〜９６６４頁（１９９１年）；Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ａ．とＢｅｄｏｕｅｌｌｅ，Ｈ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４巻：４５７〜４６１頁（１９９１年）；Ｐａｃｋ，Ｐ．とＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、前出、およびこれらの報告中の引用文献を参照のこと。好適な態様において、リンカーは、好ましくは双特異的抗体または免疫アデシンになる免疫グロブリン配列を含む。ここで用いる用語「免疫アデシン（ａｄｈｅｓｉｎ）」は免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ非相同性蛋白質の結合特異性を結合する抗体様分子（「アデシン」の一種）を示す。構造的に免疫アデシンは抗原認識以外の所期結合特異性と抗体結合部位（すなわち「非相同性」）とを持つアミノ酸配列および免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。免疫アデシン分子のアデシン部分は典型的には、少なくとも受容体またはリガンの結合部位を含む連続的アミノ酸配列である。免疫アデシン内にある免疫グロブリン定常ドメイン配列はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ −１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのようないかなる免疫グロブリンからも得られうる。ここで用いる文言「双特異性免疫アデシン」は結合特異性少なくとも２種を持つ免疫アデシンを示し、その一つは抗体の抗原結合部位でありうる。双特異的免疫アデシンはＷＯ８９／０２９２２（１９８９年４月６日発行）またはＥＰ３１４３１７（１９８９年５月３日公開）に本質的に記載されているように一般にはヘテロ多重体、殊にヘテロ−二量体、−三量体または−四量体、に会合できる。本発明の双特異性分子内の所期特異性２種を与える結合ドメインは、好ましくは免疫グロブリンの可変ドメインと置き換わる一方で、それらをキメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように免疫グロブリン重鎖および軽鎖の配列の間に挿入することもできる。この態様では、各免疫グロブリンの各アーム内のヒンジ部とＣＨ２ドメインとの間かＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間かのどちらかで免疫グロブリン重鎖の３’−末端に結合配列は融合している。同様な構築はＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．などが、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：１０２７〜１０３７頁（１９９１年）に報告している。用語「双特異的抗体」はここでは異なる抗原結合部位２種を含む抗体分子を示すために使用する。双特異的抗体は双特異性免疫アデシンについて前記したようにヘテロ多重体、殊にヘテロ−二量体、−三量体または−四量体として会合しうる。単一および双特異性免疫アデシンの可能な構造の図示はその構築で単量体を会合させるために利用しうる種々の構造の鎖または塩基性ユニットおよび免疫グロブリンのヘテロおよびホモ多重体とともに、例えば１９９２年５月２６日発行の米国特許５１１６９６４に開示されている。双特異的免疫アデシンおよび抗体は１９９０年２月２１日公開のＥＰ３５５０６８および１９９１年５月２日公表のＰＣＴ出願公表ＷＯ９１／０５８７１に開示されている。場合によっては、Ｙ形免疫グロブリンのアームの一つで第一重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を欠失するか、または免疫グロブリン軽鎖に共有結合する性能が除かれるように変化させる（すなわち軽鎖結合部位を欠失するか不活性化する）、一方、別のアームではＣＨ１ドメイン内の軽鎖結合部位を維持して免疫グロブリン軽鎖に共有結合させる双特異性免疫アデシン三量体を製造するのが有利である。各アーム内では互いに異なる重鎖定常ドメイン配列を融合して「結合ドメイン」（重鎖可変ドメインに代わって）とする。結合ドメインの一つはＴＮＦ−Ｒ１アゴニストからであり、他の結合ドメインは前記Ｆａｓアゴニストである。得られる構造は第一結合ドメインに融合した免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列と異なる結合ドメインに融合し、免疫グロブリン軽鎖に共有結合した第二免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列とから構成される異なる結合特異性２種を持つ三重体（ヘテロ三量体）である。この双特異性三重体構造はヘテロ三重体構造よりも製造と精製とが有利である。ヘテロ三量体２個またはそれ以上が相互に共有結合的にリンクして多重体構造を形成しうる。一般にこれらの会合した双特異性免疫アデシンは公知のユニット構造を持つであろう。３鎖ユニットが同様に反復すればさらに高分子量の免疫グロブリンとなる。表現「（免疫グロブリン）軽鎖結合部位を欠失した免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列」は正常には軽鎖が結合する配列エレメントが欠失したか、またはその結合が不可能なまで十分に変化（変異）した免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列を示すために使用される。好適な態様では全ＣＨＩドメインを欠失するが、正常には軽鎖がジスルフィド結合するか相互作用で非共有結合する部分が欠落すれば免疫グロブリン定常ドメインの短い切れ端も適当である。あるいは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの軽鎖結合領域を免疫グロブリン軽鎖と共有または非共有結合できないように変異（変換または挿入）してもよい。ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストまたはＦａｓ受容体アゴニストアミノ酸配列の免疫グロブリン配列への融合を含む二重特異性を持っている直線状融合蛋白質は実質的にＴｒａｕｎｅｃｋｅｒなどが、ＥＭＢＯ、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に記載したようにして製造しうる。用語「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」および「をコードするＤＮＡ」はデオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を示す。これらデオキシリボヌクレオチドの順序がポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。それで、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。核酸が他の核酸配列と機能的関係に配置されている時には、核酸は「操作可能にリンク」している。例えば、もしポリペプチドの分泌に関与する前蛋白質として発現されれば前配列または分泌リーダー用のＤＮＡはポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に結合しており、もし配列の転写に影響するならプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に操作可能に結合しており、また、もし翻訳を促進するように配置されていればリボソーム結合部位はコード配列に操作可能に結合している。一般に、「操作可能にリンク」するとはリンクしているＤＮＡ配列が連続的であって、分泌リーダーの場合は、連続的であって読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的でなくてもよい。リンクは適当な制限部位で連結反応により行われる。この部位が存在しなければ、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを常法に従って使用する。用語「複製可能な発現ベクター」と「発現ベクター」とは外来ＤＮＡ断片が挿入されていてもよい、通常は二本鎖のＤＮＡを示す。外来ＤＮＡは宿主細胞には天然には見当たらないＤＮＡである非相同ＤＮＡとして定義される。ベクターは外来または非相同性ＤＮＡを適当な宿主細胞内に輸送するために使用する。宿主細胞に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することができ、ベクターを数コピーとその挿入（外来）ＤＮＡとが作成されうる。加えて、ベクターは外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳するために必要なエレメントを含む。こうして外来ＤＮＡがコードするポリペプチド分子多数が迅速に合成される。本発明では表現「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」は互換的に使用され、これらはすべて子孫を含む。すべての子孫のＤＮＡ成分が故意または偶然の変異のために必ずしも正確に同一ではないこともありうることも理解される。初めに形質転換した細胞について検索したものと同一の機能または生物学的性質を持つ変異子孫も含まれる。２．ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストの入手ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βとはＴＮＦ−Ｒ１の天然起源リガンドであり、当業者に公知で商業的に購買できる。例えばＴＮＦ−αはＥＰ１６８２１４にその組み換え宿主細胞培養物内での合成法とともに記載がある。ＴＮＦ−β（以前はリンホトキシンと呼ばれていた）と適当な組み換え合成法とはＥＰ１６４９６５に記載がある。これらの出願に記載されているＴＮＦ−αとＴＮＦ−βとは本願でも使用する細胞毒性アミノ酸配列と糖鎖付加変異型とも含む。ＴＮＦ−Ｒ１を特異的に結合し、ＴＮＦに細胞毒作用が似ているポリおよびモノクローナル抗体は記載をされており［たとえば、Ｅｎｇｅｌｍａｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１４４９７〜１４５０４頁（１９９０年）参照］、ＡＴＣＣや他の寄託機関から入手できる。Ｆａｓ抗原を特異的に結合し、感受性癌細胞でアポトーシス細胞死を促進する抗体は当分野で公知である［たとえば、Ｙｏｎｅｈａｒａなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６９巻：１７４７〜１７５６頁（１９８９年）参照］。以下にこのような抗体調製に使用できる常用技術を概説する。これらと類似技術との詳細は、例えばＣａｂｉｌｌｙなど、米国特許４８１６５６７；ＭａｇｅとＬａｍｏｙｉ、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、「分子クローニング：実験室指針」、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、１９８９年；および「分子生物学における最近のプロトコール」、Ａｕｓｕｂｅｌなど編、Ｇｒｅｅｎ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ・Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ・ａｎｄ・Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年のような一般的教科書に見出される。抗ＴＮＦ−Ｒ１および抗Ｆａｓ受容体抗体は、これら受容体により仲介される細胞致死作用または細胞成長阻止作用のアゴニストとして作用し、当業界公知のいかなる方法によっても生産しうる。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ法または組み換えＤＮＡ法［Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出］により調製しうる。ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターのような他の適当な宿主動物をヒトＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓ受容体蛋白質で皮下、腹腔内、または筋肉内経路で免疫して免疫に使用した蛋白質に特異的に結合して抗体を生産するか生産することのできるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は試験管内でも免疫しうる。次にリンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．「モノクローナル抗体：原理と実践」、５９〜１０３頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ、１９８６年］。こうして調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合していない骨髄腫親細胞の成長または生存を阻止する物質１種またはそれ以上を含む適当な培地内に植種、成育させる。例えば、もし骨髄腫親細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損していれば、ハイブリドーマ培養用の培地に典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含め（ＨＡＴ培地）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。好適な骨髄腫細胞は効率的に融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定で高水準な発現を支持するもので、ＨＡＴ培地のような培地に感受性である。これらの中で、好適な骨髄腫細胞系はＳａｌｋ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ細胞配布センター、Ｓａｎ・Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたものおよびアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＡ、ＵＳＡから入手できるＳＰ−２細胞のようなネズミの骨髄腫系である。ヒトモノクローナル抗体生産用ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も記載されている。Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒなど、「モノクローナル抗体製造技術および応用」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、１９８７年）。ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地をＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓ受容体に対して特異的なモノクローナル抗体の生産について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞が生産するモノクローナル抗体の結合特異性は放射免疫検定（ＲＩＡ）または酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）のような免疫沈降反応または試験管内結合検定により測定する。本発明の方法または組成物中で使用するモノクローナル抗体は検体中に存在するＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓ受容体と優先的に免疫沈降反応するものか、結合検定でＴＮＦ−Ｒ１またはＦａｓ受容体に優先的に結合するもので、感受性標的細胞内で細胞毒作用を示すものである。ハイブリドーマ細胞が所期の特異性、親和性および作用を示す抗体を生産することを確認した後、クローンを限定希釈法によりサブクローンし、標準法で成育させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．、前出）。この目的のために適当な培養培地には、例えばダルベッコの修正イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。さらに、このハイブリドーマ細胞を動物内での腹水癌のように生体内で成育させてもよい。サブクローンが分泌するモノクローナル抗体は適当に培養培地、腹水液または血清から、例えば蛋白質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製操作で適当に分離する。モノクローナル抗体の精製法は当業者公知であって、例えば「分子生物学における最近のプロトコール」、前出、の１１．１１章とその引用文献に開示されている。ハイブリドーマ上清液中に存在する特異的な抗体の量は固相放射免疫検定（ＲＩＡ）か直接的な酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）かのいずれかによって定量できる。固相放射免疫検定では予めＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−γ受容体で被覆したマイクロタイター穴中で順次希釈した抗血清をインキュベーションする。結合した抗体を¹²⁵Ｉ標識抗免疫グロブリン抗体を採用して検出する。次に抗血清内の特異的な抗体の量を既知濃度の特異的抗体で作成した標準曲線から定量する。未知抗血清および標準抗体を平行して検定する。アイソタイプを定量するために用いるＲＩＡ操作およびＥＬＩＳＡ操作のプロトコールは、例えば「分子生物学における最近のプロトコール」、前出、Ｖ章およびその引用文献に見出される。本発明の方法に使用するモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは常法（たとえば、ネズミ抗体の重鎖と軽鎖とをコードする遺伝子を特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）を用いて容易に分離し、配列決定される。前記ハイブリドーマ細胞は好適なＤＮＡ源として役立つ。分離したＤＮＡは発現ベクターに入れ、これをサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞のような通常は免疫グロブリン蛋白質を生産しない宿主細胞に移入して組み換え宿主細胞内のモノクローナル抗体合成を行う。ＴＮＦのようないかなる自然型または組み換えＴＮＦ−Ｒ１アゴニスト種のアミノ酸配列、糖鎖付加変異型および共有結合誘導体も業界公知の方法により調製される。一般に、ＴＮＦをコードするＤＮＡの特定の領域または部位は変位誘発の標的にされ、これを達成するために採用する一般的方策は部位特異的変位誘発と呼ばれる。変異は制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡを特定位置で切断）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解）および／またはポリメラーゼ（ＤＮＡ合成）のようなＤＮＡ修飾酵素を使用して行われる。ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化に続き、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、前出、の１５．３章に記載されているような連結反応を用いれば欠失体を作成しうる。オリゴヌクレオチド特異的変位誘発はＴＮＦの変換変異型を生産するための好適な方法である。これは本発明で使用することのできる欠失および挿入変異型の便利な調製のためにも使用しうる。この技術はＡｄｅｌｍａｎなど（ＤＮＡ、２巻：１８３頁［１９８３年］）が記載したように当業者によく知られている。オリゴヌクレオチドはＣｒｅａなど（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻：５７６５頁［１９７８年］）が記載したような当業界でよく公知の技術を用いて容易に合成される。この技術で使用する一本鎖鋳型の生産はＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、の４．２１〜４．４１章に記載されている。ＰＣＲ変位誘発も本発明方法で使用できるＴＮＦ変異型を作成するために適当である。ＰＣＲ技術は、例えば１９８７年７月２８日発行の米国特許４６８３１９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、「分子クローニング：実験室指針」、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、１９８９年の１４章；または「分子生物学における最近のプロトコール」、Ａｕｓｕｂｅｌなど編、Ｇｒｅｅｎｅ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ・Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ・ａｎｄ・Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年の１５章に開示されている。ここでＴＮＦ変異型をコードするＤＮＡを以後のクローニングと発現とのために複製可能な発現ベクターに挿入する。多数のベクターが入手可能であるが、適当なベクターの選択は（１）ＤＮＡ増幅（クローニング）に使用するか発現に使用するか、（２）ベクターに挿入すべきＤＮＡの大きさ、および（３）そのベクターで形質転換する宿主細胞、に依存して決まる。各ベクターはその機能と適合性のある宿主細胞に依存して種々の成分を含む。ベクター成分は、これに限定されるものではないが、一般に次の１個またはそれ以上を含む：シグナル配列、複写開始点、マーカー遺伝子１個またはそれ以上、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列。適当なベクターは標準的組み換えＤＮＡ操作を使用して調製される。分離したプラスミドとＤＮＡ断片とを切断し、仕立て（ｔａｉｌｏｒｅｄ）、所定の順序で連結して所期ベクターを作成する。連結後、外来遺伝子を挿入したベクターを適当な宿主細胞内に形質転換する。ベクター上のｔｅｔおよび／またはａｍｐ耐性遺伝子があって耐性化されていれば、通常は形質転換細胞をテトラサイクリン（ｔｅｔ）またはアンピシリン（ａｍｐ）抗生物質上での成育により選択する。もし連結混合物が真核宿主細胞内に形質転換されていれば、形質転換細胞は前記ＤＨＦＲ／ＭＴＸ系で選択しうる。形質転換細胞を培地上で成育させ、次にプラスミドＤＮＡ（プラスミドは目的外来遺伝子に連結したベクターを示す）を分離する。このプラスミドＤＮＡを次に制限地図作成および／またはＤＮＡ配列決定により分析する。ＤＮＡ配列決定は一般にＭｅｓｓｉｎｇなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、９巻：３０９頁（１９８１年）の方法かＭａｘａｍなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｏｆ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５巻：４９９頁（１９８０年）の方法かのどちらかで行う。多細胞生物は変異型ＴＮＦを生産する宿主として好適である。無脊椎動物も脊椎動物も双方とも細胞培養は可能であるが、脊椎動物細胞培養、殊に哺乳類培養物は好適である。多細胞真核細胞に加え、糸状菌または酵母のような真核細胞微生物は変異型ＴＮＦを生産するために適当である。サッカロミセスセレビシエまたは通常イーストは低級真核細胞宿主微生物の中で最も普通に用いられる。原核細胞は殊にＤＮＡ多量の迅速生産、部位特異的変位誘発に使う一本鎖ＤＮＡ鋳型の生産、多数変異体の同時検索のため、および作成した変異体ＤＮＡ配列決定のためには有用である。適当な原核宿主細胞は、これに限定するものでないが、種々の大腸菌株を含む。ここに変異型ＴＮＦアミノ酸配列を調製するために適当な技術と材料との詳細は、例えば１９９２年４月２８日発行の米国特許５１０８９０１および欧州公開１４６３５４に開示されている。自然型ＴＮＦの糖鎖付加変異型およびそのアミノ酸配列変異型も当業界公知の技術により生産される。ポリペプチドの糖鎖付加は典型的にはＮ−結合またはＯ −結合である。Ｏ−結合糖鎖付加部位は、例えばポリペプチドアミノ酸配列へのセリンまたはスレオニン残基１個またはそれ以上の付加または変換により修飾しうる。簡単のために変化は通常はＤＮＡ段階で、実質的には変異型アミノ酸配列調製用公知技術を用いて行う。ＴＮＦまたはその変異型アミノ酸配列への化学的または酵素的なグリコシドの結合も炭水化物置換基の数またはプロファイルの修正または増加のために使用しうる。これらの操作はＯ−結合（またはＮ−結合）糖鎖付加ができるポリペプチドを調製する必要がない点で有利である。使用する結合様式に依存して、糖を（イ）アルギニンとヒスチジン、（ロ）遊離カルボキシル基、（ハ）システインのそれらのような遊離ヒドロキシル基、（ニ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのそれのようなスルフヒドリル基、（ホ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのような芳香族残基、または（ヘ）グルタミンのアミド基、に結合させる。これらの方法はＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公表）およびＡｐｌｉｎとＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ・Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載されている。ＴＮＦまたはその変異型アミノ酸配列上に存在する炭水化物部分は化学的または酵素的に除去しうる。化学的脱糖鎖にはトリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物との接触を要する。この処理は結合糖類を除き全部または殆どの糖が切断されるが、ポリペプチドは無傷のままに残る。化学的脱糖鎖はＨａｋｉｍｕｄｄｉｎなど、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻：５２頁（１９８７年）とＥｄｇｅなど、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻：１３１頁（１９８１年）とによって記載されている。Ｔｈｏｔａｋｕｒａなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻：３５０頁（１９８７年）が記載しているように、炭水化物部分は種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼによって除去できる。Ｄｕｓｋｉｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７巻：３１０５頁（１９８２年）が記載しているように糖鎖付加はツニカマイシンによって抑制される。ツニカマイシンは蛋白質−Ｎ−グリコシダーゼ結合形成を阻害する。糖鎖付加変異型も適当な宿主細胞の選択により生産できる。例えば、酵母は糖鎖の付加を導入するが、これは哺乳類系のそれとは明らかに異なる。同様に、種（たとえば、ハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）または組織（たとえば、肺、肝臓、リンパ系、間葉または表皮）の異なる起源を持つ哺乳類細胞は選択変異型の起源よりも糖鎖付加変異型を導入する能力について日常的に検討される。アゴニスト抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体のアミノ酸配列および糖鎖付加変異型は同様な方法で作ることができる。ＴＮＦの共有結合誘導体およびそのアミノ酸配列および糖鎖付加変異型の使用は本発明の範囲内にある。これらの修飾はＴＮＦまたは変異ＴＮＦの標的アミノ酸残基を所望の側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることにより、または所望の組み換え宿主細胞内で機能する翻訳後修飾結合機構により導入される。共有結合誘導体化は分子の半減期、安定性などのような性質を改良し、または改良するかもしれない。この修飾は当業者技術の範囲内であって過重な実験なしに実施できる。翻訳後誘導体化のいくつかは発現したポリペプチドへの組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基とアスパラギニル残基とは頻繁に翻訳後脱アミド化されて対応するグルタミル残基とアスパルチル残基となる。他に、これらの残基は穏やかな酸性条件下に脱アミド化される。これらの残基の両型も本発明の範囲内にある。他の翻訳後修飾はプロリンとリジンの水酸化、セリルとスレオニル残基ヒドロキシル基の燐酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖α−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「蛋白質：構造と分子の性質」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ・Ｃｏ．、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、７９〜８６頁（１９８３年）］、Ｎ−末端アミンのアセチル化および、場合によってはＩＦＮ−γのＣ−末端カルボキシルのアミド化を含む。他の共有結合誘導体は米国特許４６４０８３５、４４９６６８９、４３０１１４４、４６７０４１７、４７９１１９２、４１７９３３７、５１１６９６４に記載されている様式でポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような非蛋白質高分子に共有結合するIFN−γを含む。特異的な変異型ＴＮＦは、細胞毒性作用が自然型ＴＮＦに類似している連続的ＴＮＦアミノ酸配列と免疫グロブリンのような安定な血漿蛋白質との融合物を包含する。得られる分子はＴＮＦ−免疫グロブリンキメラまたは、より最近では免疫アデシンと呼ばれる。通常、ＴＮＦの受容体結合ドメインの連続的アミノ酸配列Ｃ末端は免疫グロブリンの可変領域の代わりに定常領域の連続的アミノ酸配列Ｎ末端に融合しているが、しかしながら、Ｎ末端融合も可能である。典型的にはこの融合では免疫グロブリン重鎖の定常領域にある少なくとも機能的に活性なヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。融合は定常ドメインにあるＦｃ部分のＣ末端または重鎖のＣＨ１のＮ末端に直接または軽鎖の対応領域でも行われる。これは通常、適当なＤＮＡ配列を構築し、組み換え細胞培養物中で発現することにより達成される。あるいは、この構造は種々の公知方法に従って合成しうる。融合が起きた正確な部位は重要な問題ではない；特定部位はよく公知であり、生物学的作用、分泌または結合特性を最適化するために選択しうる。好適な態様ではＴＮＦ−Ｒ１が結合する部位を含む連続的アミノ酸配列のＣ末端が免疫グロブリン、たとえば免疫グロブリンＧ₁（ＩｇＧ−１）のエフェクター機能を含む抗体（殊にＦｃドメイン）Ｃ末端部分のＮ末端に融合する。前記の通り、全重鎖の定常領域を結合部位を含む配列に融合することはできる。しかしながら、より好ましくはパパイン切断部位（化学的にＩｇＧＦｃを決定する；残基２１６、重鎖定常領域の第一残基は１１４とする［Ｋｏｂｅｔなど、前出］、または他の免疫グロブリンの類似部位）の少し上流にあるヒンジ領域に始まる配列をこの融合に使用する。ＴＮＦ−免疫グロブリン融合（免疫アデシン）の構築に使用した免疫グロブリンの重鎖定常ドメイン配列は軽鎖結合部位がなくてもよい。これは通常は軽鎖が結合している免疫グロブリンの重鎖配列エレメントを除くことまたはその結合が不可能になるまで十分に変えることにより達成することができる。それである態様ではＣＨ１ドメインは完全に欠落することができる。殊に好適な態様ではＴＮＦ分子のＴＮＦ−Ｒ１ドメイン１個またはそれ以上を含むアミノ酸配列をＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４重鎖のヒンジ領域とＣＨ２、ＣＨ３；またはＣＨ１、ヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合する。ある態様では、ＴＮＦ−免疫グロブリン融合分子（免疫アデシン）は会合してモノマー、二量体または多量体、特に二量体または四量体となる。一般にこれら会合免疫アデシンは対応する免疫グロブリンのそれらと類似の公知ユニット構造を持つであろう。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥは、この基本的４鎖構造ユニット（免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア２個の二量体）の型で存在する。高分子量免疫グロブリンでは４鎖ユニットが反復している。ＩｇＭは一般に互いにジスルフィド結合で保たれる基本４鎖ユニットの五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンおよび、時にはＩｇＧグロブリンも血清内では多量体型でも存在しうる。多量体の場合には、各４鎖ユニットは同一でも相違していてもよい。ＴＮＦ−免疫グロブリンキメラでは免疫グロブリン部分が全て同一の免疫グロブリンに由来する必要はない。異なる免疫グロブリンの種々の部分を結合して、ＴＮＦに関して前記したようにして、免疫アデシン分子の性質を最適化するために、自然型免疫グロブリンの変異型および誘導体を作ることができる。例えば、ＩｇＧ−１のヒンジ部をＩｇＧ−３のものに変換した免疫アデシン構築物は機能を持ち、ＩｇＧ−１重鎖全体を含む免疫アデシンのものと同様な薬動力学を示すことが見出された。他の安定な血漿蛋白質を含む融合蛋白質は当業者に公知の方法により製造できる。例えば、安定な血漿蛋白質としてのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）Ｎ末端側断片を含む融合蛋白質は１９９０年１１月２８日公開のＥＰ３９９６６６に開示されている。３．双特異性抗体と免疫アデシンモノおよび双特異性免疫アデシンの可能な構造を図示する模式図は、例えば、１９９２年５月２６日発行の米国特許５１１６９６４に鎖またはその構築において単量体と免疫グロブリンのヘテロおよびホモ多量体とを会合するために利用しうる種々の構造の基本ユニットとともに開示されている。双特異的免疫アデシンおよび抗体も１９９０年２月２１日公開のＥＰ３５５０６８と１９９１年５月２日公表のＰＣＴ出願ＷＯ９１／０５８７１とに開示されている。特定的な態様において、特異性２種を持つ融合蛋白質はＴＮＦアミノ酸配列を抗Ｆａｓ抗体である抗体の重鎖３’末端に融合することで作られる。ＴＮＦアミノ酸配列は、例えば免疫グロブリン重鎖のヒンジ部とＣＨ２ドメインとの間か、またはＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間のどちらかに挿入しうる。キメラ免疫グロブリン重鎖ＴＮＦ遺伝子を次に免疫グロブリン軽鎖分泌トランスフェクトーマ細胞系に導入し、所期抗体の軽鎖を生産した。同様な構造の構築物はＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８巻：１０２７〜１０３７頁（１９９１年）により報告された。免疫グロブリン配列を含む二重特異性を持つ直線状融合蛋白質（ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストおよびＦａｓアゴニストのアミノ酸配列を含む）は本質的にＴｒａｕｎｅｃｋｅｒなど、ＥＭＢＯ、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）により記載されているようにして調製しうる。ＴｒａｕｎｅｃｋｅｒなどはＦｖＣＤ３、ＣＤ４とＣ−カッパとのＮ末端ドメイン２個を含み、Ｊａｎｕｓｉｎ（ＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃカッパ）と呼ばれる単鎖ポリペプチドを設計した。この双特異性直線状分子は抗カッパ・アフィニティーカラムを用いて精製した。本発明範囲内の直線状双特異性分子も類似の工法で製造できる。本発明の双特異性免疫アデシン（またはＴＮＦ免疫グロブリン分子）に（重鎖）定常ドメイン配列を提供する免疫グロブリンの選択は、主にそれを構築しようとする動機に依存する選択の問題である。もしアゴニストの血漿中半減期の延長を考慮するなら、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２およびＩｇＧ−４アイソタイプの免疫グロブリンはいずれも生体内半減期２１日を持つので良い候補であるが、ＩｇＧ− ３は生体内半減期７日である。ある場面で得失点となる相違は、例えば、補体の活性化である。ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２およびＩｇＧ−３はいずれも補体を活性化するが、しかしながらＩｇＧ−２は補体活性化ではＩｇＧ−１より明らかに弱く、単核細胞または好中球のＦｃ受容体には結合しない。一方、ＩｇＧ−３はＩｇＧ−１よりも良い補体活性化を示す。ＩｇＧ−１は血清学的に定義されたアロタイプ部位４個のみを持ち、その２個（Ｇｌｍ１および２）はＦｖ部分にあって部位２個（Ｇｌｍ１および１７）中、アロタイプの１個は非免疫原性である。対照的にＩｇＧ−３には血清学的に定義されたアロタイプが１２種あり、これらは全てＦｃ部分にあって、そのうち３種（Ｇ３ｍ５、１１および２１）のみが非免疫原性アロタイプである。長期間にわたり反復する治療的適用のためにはＩｇＧ −１に由来する定常ドメイン配列を持つ免疫アデシンが好適である。双特異性免疫アデシン分子のアーム２本内に異なるクラスまたはアイソタイプからの免疫グロブリンを使用することも可能である。また種々のクラスまたはアイソタイプからの免疫グロブリンの配列を、双特異性分子の同じアーム内に結合するか、単または双特異性免疫アデシンの両アーム内に結合することも可能である。双特異性免疫アデシンまたは抗体は前記詳述したように組み換えＤＮＡ技術の標準的手段により調製しうる。他の別法はＥｎｇｅｌｓなど、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６頁（１９８９年）が記載した方法の一つを用いてキメラをコードする遺伝子を化学的に合成することである。これらの方法にはトリエステル、ホスファイト、ホスホロアミダイトおよびＨ− ホスホネート法、ＰＣＲおよび他のオートプライマー法、および固体担体上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。４．医薬組成物本発明のＴＮＦ−Ｒ１アゴニスト、Ｆａｓアゴニストおよび双特異性分子は通常医薬組成物として通常当業者公知の方法、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎの「医薬品科学」、Ｍａｃｋ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ・Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１５版、１９７５年参照、で用量型に製剤化して投与される。本発明のアゴニストと双特異性分子は哺乳類、好ましくはヒトに、医薬的に許容でき、ヒトに一括注射または所定時間連続点滴で静脈内、筋肉内、皮下、関節内、滑液内、硬膜下内腔、経口的、局所的または吸入的な経路で投与しうるものを含む用量型として投与する。それらの用量型は医薬的に許容しうる本質的に非毒性で非治療的な担体をも含む。そのような担体の例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清蛋白質、燐酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物酸の部分グリセリド混合物、水、塩または硫酸プロタミン、燐酸水素ニナトリウム、燐酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような電解質、コロイド性シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース由来物質およびポリエチレングリコールを含む。局所またはゲル型剤の担体にはカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロースのようなポリサッカライド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックスアルコールを含む。全ての投与法にわたって通常のデポ剤の使用は適当である。この剤型は、例えばマイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、貼付剤、吸入剤、鼻用スプレーおよび舌下錠を含む。抗体はこの基剤中に典型的には約０．１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬ濃度で製剤化され、例えばアポトーシスを誘発するために１９９１年７月２５日公表のＰＣＴ特許出願公表ＷＯ９１／１０４４８に記載のようにして投与する。ＴＮＦは前記のような生理学的に許容しうる担体と混合することにより投与用に製剤化する。ＴＮＦを必要な補助成分とともに無菌等張製剤に入れる。ＴＮＦ用製剤は好ましくは液体であり、通常、常用の安定化剤および／または添加剤を含む生理食塩水またはデキストロース溶液である。組成物は最終的に溶液にするための凍結乾燥粉末であってもよい。食塩水は適当な担体であるが、他の常用の非経口投与用溶液または緩衝液も使用できる。ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストとによる処置は所望の順序で同時または順次に行いうる。要すれば、ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストを同一の医薬的製剤中に混入しうるが、しかしながら、そのような組合せで発揮される効果と相乗作用は混合法および少なくとも比較的短時間内の一時的処理法とは無関係なことは明らかである。ＴＮＦ単独投与時の治療的有効用量はヒト患者では単回あたり約１から２５０ μｇ／ｍ²であり、好ましくは約１から１０μｇ／ｍ²であり、最も好ましくは約１０μｇ／ｍ²であるが、ＴＮＦ用量は患者、採用したＴＮＦのたとえばその活性と生理学的半減期のような性質、製剤中のＴＮＦ濃度、投与速度、被療患者の臨床的寛容度、患者の病理学的状態などに依存することは医師にとっては明らかである。実施者は所与ＴＮＦについての臨床経験に沿って治療用量を調節すればよい。ここでは、抗ＴＮＦ−Ｒ１と抗Ｆａｓアゴニスト抗体とは単独投与時には同じような用量範囲で有効であると信じられる。本発明によれば、ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストおよびＦａｓアゴニストは組合せて（同時投与および任意順序の順次投与を含む）の形で投与する。もしＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストとが特定標的細胞の致死に相乗効果を発揮するなら、組合せ内各成分の有効用量は単独時よりも低下する。ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストおよびＦａｓアゴニストは典型的には相乗作用を達成するために約０．１：１００〜１００：０．１、好ましくは約０．１：１０〜１０：０．１、最も好ましくは約１：１の百分比率で投与する。勿論、これらの比率は治療経験から割出した修正をすべきものである。ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストおよびＦａｓアゴニストによる細胞致死作用に対して殊に感受性のある細胞型は当業者に公知であり、ＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓ抗原とを発現するリンパ球様細胞悪性疾患、たとえば、成人Ｔ細胞白血病を含むＢ細胞やＴ細胞リンパ球の様々な悪性腫瘍ならびに肺繊維芽細胞、頸部癌細胞、乳癌細胞その他の悪性腫瘍を含む。ただし、これらはＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓとの双方を発現するものとする。本発明の詳細をさらに以下の非限定的実施例から明らかにする。実施例材料と方法細胞および試薬細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し、マイコプラズマ不含である。ヒトおよびネズミのＴＮＦ−Ｒ１に対するウサギ抗ＴＮＦ−Ｒ１抗血清は以前に報告されている［ＴａｒｔａｇｌｉａとＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻：４３０４頁（１９９２年）；Ｔａｒｔａｇｌｉａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：９２９２頁（１９９１年）参照］。アゴニスト抗体は各受容体の可溶性細胞外ドメインに対して作成した。抗血清の力価は直接酵素免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）により定量した。精製可溶性受容体に対して５０％結合を与えるアゴニスト抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体の希釈率は１：１０９０００であった。Ｆａｓ抗原の細胞外ドメインを含む組み換えＦａｓ−ＩｇＧ融合蛋白質を使用してウサギ抗Ｆａｓ抗血清を作った。抗Ｆａｓ抗血清の力価は直接ＥＬＩＳＡ定量では１：８００００であった。表面受容体発現の検出細胞表面ＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓ抗原の存在は抗Ｆａｓおよび抗ＴＮＦ−Ｒ１抗血清およびＰＥ−複合ヒツジ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｃａｌｔａｇ）を用い、Ｅｐｉｃｓ・Ｅｌｉｔｅフローサイトメーターにより分析する免疫螢光法により測定した。細胞毒性検定５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加Ｆ１２またはＲＰＭＩ−１６４０培地中２× １０⁴細胞懸濁液各１００μＬを検定２４時間前に９６穴板の各穴に添加した。検体に種々の用量の抗Ｆａｓおよび抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体およびサイクロヘキシミド（ＣＨＩ）１０μｇ／ｍＬを加えて標的細胞に添加した。３８．４℃で１７〜２４時間後、細胞を０．５％クリスタルバイオレットの２０％メタノール溶液で染色した。細胞生存率を染色した細胞から０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム／０．１Ｍ−クエン酸と５０％エタノールで染料を溶出し、５４０μｍで吸光度を測定して細胞生存率を定量した。ＨｕＴ−７８、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕ−４のような非接着性細胞系の場合には、Ｃｅｌｌ・Ｔｉｔｒｅ・９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率を定量した。核ＤＮＡの分離１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５００μＬ、０．１Ｍ−ＮａＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂および０．５％ＮＰ−４０中、４℃で１分間、細胞１０⁸個を溶菌した。溶菌物を１４Ｋで１分間マイクロ遠心分離して核をペレット化した。核を２００ｍＭ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ−ＥＤＴＡ、プロティナーゼＫ２００μｇ／ｍＬ、１％ＳＤＳによって２時間６５℃で処理した。ＤＮＡ標本をフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出した。ＲＮａｓｅ・Ａ（１００μｇ／ｍＬ）により３７℃で１時間処理後、ＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈降させた。ＤＮＡ標本約１０μｇを１％アガロースゲル電気泳動し、臭化エチジウムによって染色し、紫外線照射下に撮影して分析した。結果と考察ＴＮＦ−Ｒ１がシグナル伝達するものと非常に類似したプログラムされた細胞死をＦａｓ抗原がシグナル伝達することができることは以前に証明されている。Ｆａｓ抗原とＴＮＦ−Ｒ１とが細胞致死作用をシグナル伝達する経路が同一か相違するかを決定するために、われわれはアゴニスト抗Ｆａｓポリクローナル抗体（以下、Ｆａｓアゴニストと称する）による細胞致死作用について、ＴＮＦ耐性およびＴＮＦ感受性細胞系多数を検索した。この検索で、ＳＷ４８０とＨｕｔ−７８細胞はＦａｓアゴニストに高度に感受性であることを確認した。抗Ｆａｓアゴニスト抗体は有意にＨＵＴ−７８細胞を殺したが、免疫前血清は無効であった（図２ａ）。この血清中の作用は可溶性のＩｇＧ−ＨｕＦａｓ免疫アデシンにより中和される。興味深いことに、ＨＵＴ− ７８細胞はＴＮＦ−αまたは抗ＴＮＦ−Ｒ１アゴニスト抗体によっては殺されない。ＴＮＦ−αは効率的にＨＵＴ−７８細胞にＭｎＳＯＤを誘導するのだから、ＴＮＦ−αがＨＵＴ−７８細胞致死能を持たないのは機能のあるＴＮＦ−Ｒ１が不在のためではない。それ故、機能性ＦａｓおよびＴＮＦ−α受容体双方を共発現する細胞内ではＦａｓ受容体のみが細胞毒性をシグナル伝達することができることになる。同様な結果はＳＷ−４８０細胞についても観察された（図３ａおよび３ｂ）。われわれは、ＴＮＦ−αと抗ＴＮＦ−Ｒ１アゴニスト抗体とには高度に感受性であるが、Ｆａｓを特異的に結合するアゴニスト抗体には感受性を示さない細胞系数種を確認した（図２ｂおよび表１）。ＭＥ１８０（頸部癌）、Ａ５４９（肺繊維芽）、ＭＣＦ（乳癌）、ＨｅＬａ（頸部癌）およびＷＩ−３８（肺繊維芽）のようなヒトの腫瘍細胞系はＴＮＦ−Ｒ１アゴニストにより効果的に殺すことができたが、Ｆａｓアゴニストには感受性がなかった（表１）。Ｆａｓアゴニスト耐性細胞系数種ではＦａｓ受容体の発現が比較的低水準であったが、これが耐性を説明するかも知れない。これはＨｅＬａ細胞の場合に、ヒトＦａｓ・ｃＤＮＡの移入によってこれら細胞が表面に高水準のＦａｓ抗原を発現すればＦａｓアゴニストに感受性になることで証明された。しかしながら、これではフローサイトメーターにより高水準にＦａｓ抗原を発現すると判断されているＭＥ−１８０およびＷＩ−３８細胞系の耐性は説明できない。それ故、ＭＥ−１８０およびＷＩ−３８細胞は両者共ＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓ抗原とを共発現するが、これらはＴＮＦ−Ｒ１からのシグナル伝達に対してのみ選択的に感受性である。前記研究は、ＦａｓおよびＴＮＦ−Ｒ１が異なるシグナル伝達経路を利用してプログラムされた細胞死を仲介するモデルを支持する。共通の下流効果に導いていく経路が違っている証拠にはこの他にシグナル伝達２種の相乗性がある。ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞はＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓとのアゴニスト両方に非感受性であることが見出された（図４ａ）。単独投与の場合には、最高濃度を用いてもＴＮＦ −Ｒ１およびＦａｓアゴニストによるＴ２４細胞の細胞致死は１０％以下であった。しかしながらＦａｓとＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとの双方を組合せると殆ど大部分の細胞を比較的低濃度で殺した（図４）。ＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓアゴニストとの間のこの驚異的な相乗作用はＦａｓとＴＮＦ−Ｒ１とが異なるシグナル伝達経路を利用するとの見解を強く支持する。同様な相乗的結果はヒトＦａｓ抗原ｃＤＮＡ（図４ｂ）とヒト膠芽腫Ａ１７２細胞系（図４ｃ）とを移入されて発現しているネズミＬ９２９細胞のように抗ＴＮＦ−Ｒ１と抗Ｆａｓ抗体との両方にいくらか感受性のある細胞系についても見出された。相乗作用はＳＷ−４８０、ＭＥ−１８０およびＷＩ−３８細胞（資料未記載）でも見出され、この相乗現象が一般的で、Ｆａｓ抗原はＭＥ−１９０およびＷＩ−３８細胞でもシグナル伝達をすることができることを示唆する。おそらく保護蛋白質の合成阻害によってＣＨＩは細胞多種のＴＮＦの細胞致死作用に対する感受性を劇的に強化する。驚いたことに、３時間ＣＨＩでＭＡ−１細胞を前処理すると、後続するＴＮＦ−α処理による致死作用から細胞を保護した（図５ａ）。対照的に、ＣＨＩ前処理はＭＡ−１細胞を後続するＦａｓアゴニストによる細胞致死作用からは保護しなかった。活性な細胞致死蛋白質に加えて、ＴＮＦまたはＩＬ−１が誘導するＭｎＳＯＤのような保護蛋白質も後続するＴＮＦ−αによる致死作用に対して細胞を保護することが示されている。そこで、われわれはＴＮＦ−α前処理が後続するＦａｓ拮抗剤＋ＣＨＩ処理による細胞致死作用に対して保護するかどうかに興味を持った。図５ｂはＭＡ−１細胞のＴＮＦ＋ＣＨＩ細胞致死作用がＴＮＦ−α前処理によって完全に阻害できることを示す。この誘導耐性はＴＮＦ受容体のダウンレギュレーションに起因するものでなく、またＩＬ−１のそれに似ている。しかしながら、ＴＮＦ−α前処理はＭＡ−１細胞を後続するＦａｓアゴニスト＋ＣＨＩによる致死作用に対して保護しなかった（図５ｃ）。対照的に、ＦａｓアゴニストによるＭＡ−１細胞の前処理ではＴＮＦが誘導する同様な保護効果をシグナル伝達することができなかった（図５ｂ）。これらのデータはＴＮＦ−Ｒ１とＦａｓとが仲介する細胞致死作用の伝達経路が異なることの追加的証拠を提供する。Ｆａｓ抗原は以前にはＴＮＦ−Ｒ１が仲介するものと区別できないプログラムされた細胞死をシグナル伝達することが判り、細胞内ドメイン内の相同的構造がこのシグナル伝達を仲介するのであろうと示唆されていた。Ｆａｓもこれら多様な作用をシグナル伝達できるかどうか確認するため、われわれはＦａｓとＴＮＦ −Ｒ１との各種細胞応答の誘導能を両受容体を共発現する細胞系内で調査した。われわれはＴＮＦ−Ｒ１が持つ生物学的活性を誘導する周知の能力、たとえば細胞増殖、抗ウイルス活性、ＭｎＳＯＤの誘導、およびＩＣＡＭ、をＦａｓは共有していないことを見出した。ＴＮＦが多様な細胞応答を誘導する一方で、Ｆａｓ抗原を経るシグナル伝達はある種のＴ細胞および腫瘍型に特異的にアポトーシスによる死を招くものと思われる。標的腫瘍に保護を誘発しないので、この高度に特異的な抗Ｆａｓ抗体の作用はＦａｓ抗原のアゴニスト（抗体またはＦａｓリガンドのような）は効果的抗腫瘍治療を導きうることを示唆する。さらにＴＮＦ− Ｒ１とＦａｓ抗原とが仲介するアポトーシスの異なる経路を理解すれば、最終的にはこれら受容体２種が端緒を開く相乗的作用により癌または他の疾患の有効な治療法に到るであろう。前記は、殊に好適な態様を示したが、本発明はこれに限定されないものと理解されると思われる。当業者には本発明の全範囲から離脱せずに、開示された態様に種々修飾を施しうることは自から明らかである。そのような修飾は全て本発明の範囲に含めるとの意向を持つものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/24 16/30 19/00 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ 9452−4ＢＣ 9452−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｆａｓ抗原と１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）の双方を発現する細胞を有効量のＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストとで処理することを含む細胞溶解法または細胞成長阻止法。２．細胞が腫瘍細胞、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染細胞およびエプスタイン−バール（ＥＢ）ウイルス感染細胞から構成される群から選択される請求項１の方法。３．ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストがＴＮＦ−αである請求項２の方法。４．ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストが抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体である請求項２の方法。５．Ｆａｓアゴニストが抗Ｆａｓ抗体である請求項２の方法。６．ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストを相乗的有効量使用する請求項２の方法。７．細胞が腫瘍患者の細胞である請求項６の方法。８．患者が哺乳類である請求項７の方法。９．患者がヒトである請求項８の方法。１０．処理が生体内で行われる請求項９の方法。１１．処理がサイクロヘキシミド（ＣＨ）またはガンマ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の存在下に行われる請求項７の方法。１２．ＴＮＦ−Ｒ１を特異的に結合する第一の連続アミノ酸配列とＦａｓ抗原を特異的に結合する第二の連続アミノ酸配列とを含む双特異性分子。１３．第一のアミノ酸配列がＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびアゴニスト抗ＴＮＦ−Ｒ１抗体から構成される群から選択される請求項１２の双特異性分子。１４．第二のアミノ酸配列がアゴニスト抗Ｆａｓ抗体である請求項１２の双特異性分子。１５．さらに免疫グロブリン配列を含む請求項１２の双特異性分子。１６．第一のアミノ酸配列が第一免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合し、第二のアミノ酸配列が第二免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合していることを含む請求項１５の双特異性分子。１７．第一および第二のアミノ酸配列の各々がそのＣ末端で少なくともヒンジ領域およびＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２またはＩｇＧ−３免疫グロブリンのＣ_H２およびＣ_H３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列のＮ末端に融合している請求項１６の双特異性分子。１８．融合がジスルフィド結合である請求項１７の双特異性分子。１９．融合のうち少なくとも一つが免疫グロブリン軽鎖に関連している請求項１８の双特異性分子。２０．請求項１２の双特異性分子をコードするヌクレオチド配列。２１．請求項２０のヌクレオチド配列を含み、適当な宿主細胞内で発現することができる複製可能な発現ベクター。２２．請求項２１のベクターで形質転換した宿主細胞。２３．コードされた双特異性分子を発現するように請求項２２の宿主細胞を培養することを含む工程。２４．さらに双特異性分子を宿主細胞培養物から回収することを含む請求項２３の方法。２５．細胞溶解または細胞成長阻止を誘導することができる量の請求項１２の双特異性分子と医薬的に許容できる担体とを混合して含む医薬組成物。２６．Ｆａｓ抗原と１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ１）とを持つ標的細胞を有効量の請求項１２の双特異性分子で処理することを含む細胞溶解法または細胞成長阻止法。２７．ＴＮＦ−Ｒ１アゴニストとＦａｓアゴニストとの相乗的組成物。