JPH02237935A

JPH02237935A - エイズ処置剤

Info

Publication number: JPH02237935A
Application number: JP5921689A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Kobayashi; 信之小林; Hajime Sasaki; 一佐々木; Hiroyoshi Hoshi; 宏良星
Original assignee: BIO KAGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: BIO KAGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1989-03-10
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1990-09-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】く産業上の利用分野〉本発明はエイズ処置剤に関し、さらに詳細にはモノクロ
ーナル抗体を有効成分とし、エイズの予防、治療等に有
用なエイズ処置剤に関する。

く従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉エイズ
（後天性免疫不全症候群）はエイズ・ウイルスに起因す
る予後不良の免疫不全症である。

エイズ・ウイルスはＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　ｍ　（Ｈｕｍ
ａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌＬｅｕｋｅｍ１ａ　Ｖｉｒｕｓ　−
　ｍ　）とも称されるが、現在ではＨ　Ｉ　Ｖ　（Ｈｕ
ｍａｎ　ＩＩＩｌａ＋ｕｎｏｄｅｆ’ｌｃｉｅｎｃｙ　
Ｖｉｒｕｓ）と表現されている。このウイルスはヒトレ
トロウイルスに属し、このウイルスに感染するとリンパ
球のヘルパーＴ細胞が特異的に障害を受け、免疫応答能
が破壊される結果、真菌、ウイルス、細菌などによる日
和見感染、肉腫等が発生し、７０％以上の高死亡率を招
くことが知られている。

この疾患に対する治療剤としては、従来、幾つかの薬剤
が報告されている。それらの多くは、ＨＩＶ中に含まれ
、レトロウイルスの複製に重要な役割を果たす逆転写酵
素を阻害する作用を有するもので、例えば、３′−アジ
ドーデオキシチミジン、スミラン、２”，３−−ジデオ
キシシチジン等が知られている。しかしながら、これら
の薬剤は副作用が強く、またＨＩＶの感染予防には有効
でもＨＩＶに感染した細胞を除去することはできないの
で、治療効果が十分なものとはいえない。

また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を用いた治療法も検討さ
れているが、ＴＮＦはＨＩＶの増殖も増強するという欠
点を有する。さらに、免疫抑制剤であるシクロスボリン
、Ｔ細胞増殖刺激剤であるインターロイキン−２等を用
いた治療法も検討されているが十分な効果は得られてい
ない。

本発明は上記従来技術の欠点を解消するために創案され
たもので、本発明者らが種々の検討を重ねた結果、ある
種のモノクローナル抗体がＨＩＶの増殖をもたらすこと
な（ＨＩＶ感染細胞の増殖を抑制し得ることを見出し、
本発明を完成したもので、新規なエイズ処置剤を提供す
ることを目的とする。

く課題を解決するための手段〉上記の課題を解決すべくなされた、本発明のエイズ処置
剤は、下記の性状を有するモノクローナル抗体を有効成
分として含有することを特徴とするものである。

（１）ヒト二倍体線維芽細胞ＦＳ−７を認識する。

■クラスがＩｇＭである。

（３）分子量が２００Ｋである。

本発明で使用される上記のモノクローナル抗体（以下、
抗Ｆａｓ抗体という）は、例えば、ヒト二倍体線維芽細
胞ＦＳ−７で免疫して得られた実験小動物のリンパ球と
ミエローマ細胞との細胞融合によって得られたハイブリ
ドーマをクローニングして樹立したハイブリドーマ株か
ら産生され、米原らにより報告されている（例えば、Ｐ
ｒｏｃｅｅｄ−１ｎｇｓ　ｏｆ’　ｔｈｅ　Ｊａｐａｎ
ｅｓｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．４７
ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　（１９８８）　
ｐ４５２など参照）。

より詳細には、６週齢のＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃ雌性マ
ウスに、ヒト包皮由来ヒト二倍体線維芽細胞ＦＳ−７（
約３Ｘ１０６個）を腹腔内投与して免疫する。

２週間後、上記ヒト二倍体線維芽細胞ＦＳ−７（約２Ｘ
１０６個）を腹腔内投与して追加免疫する。３日後、マ
ウスの免疫牌臓細胞を取り出し、ポリエチレングリコー
ル等の細胞融合促進剤を用いてマウスミエローマ細胞Ｍ
Ｓ−１と融合させる。

次いで、融合細胞の培養を、ＨＡＴ培地（正常培地にヒ
ボキサンチン、アミノブテリン及びチミジンを添加した
培地）等のハイブリドーマ選択培地を用いて経時的に徐
々に高濃度とした培地中で行ない、ハイブリドーマ以外
の細胞を死滅させてノ１イブリドーマを選択する。各ウ
エル中のハイブリドーマが抗体を産生じているか否かの
検定を細胞（ヒト細胞）障害活性の測定により行ない、
抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する。抗体産生の
認められたウエルのハイブリドーマは、限外希釈法又は
シングル●セルＱマニブレーション（倒立顕微鏡下、１
ウエルに１個のハイブリドーマを入れる方法）等の慣用
の方法にてクローニングを２回行ない、抗Ｆａｓ抗体産
生ハイブリドーマ株を選択する。斯くして得られた抗Ｆ
ａｓ抗体産生ハイブリドーマ株を無血清培地ＡＳＦ１０
４で培養し、上清をハイドロキシルアパタイト・カラム
クロマトグラフィで精製して、精製抗Ｆａｓ抗体が得ら
れる。

上記方法で得られた抗Ｆａｓ抗体は、クラスがＩｇＭで
あり、分子量が２００Ｋ　（ウエスタン・プロッティン
グ法による）である。

本発明の処置剤は上記抗Ｆａｓ抗体を有効成分とするも
ので、有効成分の投与量は、患者の年齢、体重、症状、
疾患の程度等により適宜決定されるが、一般に０．０１
〜１００μｇ　／　ｋｇ体重・日、好ましくは０．１〜
１０μｇ　／　ｋｇ体重・日である。

本発明の処置剤は、経口又は非経口投与のいずれも採用
することができる。投与に際しては、有効成分である抗
Ｆａｓ抗体を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法
に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、
慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このよ
うな製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプ
セル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍
結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套
手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性
担体としては、例えば、グルコース、乳糖、シヨ糖、澱
粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、
ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンブン、
エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂
肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、
生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定
化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の慣用の添
加剤を適宜添加することができる。

く発明の作用・効果〉本発明の処置剤の有効成分である抗Ｆａｓ抗体は、ＨＩ
Ｖに感染した細胞の増殖を特異的に抑制することができ
、またその際にＨＩＶの増殖を促進しないという特性を
有する。従って、抗Ｆａｓ抗体を有効成分として含有す
る本発明の処置剤は、エイズの予防、治療等に極めて有
用である。

く実施例〉以下、試験例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

試験例ＩＨＩＶ感染細胞に対する抗Ｆａｓ抗体の増殖抑制効果を
調べるため、ＨＩＶに感染し、ウイルスを産生じながら
増殖するＭＯＬＴ−４細胞を用いて試験した。試験法は
下記のとおりである。

ヒト成人Ｔ細胞白血病患者リンパ球由来の株化細胞ＭＯ
ＬＴ−４（Ｊ．　Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．
，　Ｖｏｌ．４９，　ｐｐ８９１．　１９７２参照）を
、感染多重度（Ｌｏ．ｌ．）０．００２　＋．１：テＨ
ＴＬＶ−ＩＩＩＢテ感染させ、ＨＩＶ感令ＭＯＬＴ−４
　（以下、ＭＯＬＴ−４／Ｈ　Ｉ　Ｖという）細胞を樹
立した。

ＨＩＶ非感染ＭＯＬＴ−４細胞及びＭＯＬＴ−４／Ｈ　
Ｉ　Ｖ細胞を、種々の濃度の抗Ｆａｓ抗体を含むＲＰＭ
Ｉ−１１１ｉ４０培地（１０％胎児牛血清、ＩＯＯＩＵ
／ｍｌペニシリン及び１００μｇ　／　ｍｌストレプト
マイシン含有）で培養した。また、コントロールとして
、抗Ｆａｓ抗体を含有しない上記培地を用いて同様に培
養した。培養１日目、２日目及び３日目に、それぞれト
リパンブルー色素排除法により生存細胞数を計測し、下
記式から細胞の生存率（％）を求めた。

生存率（％）一その結果を第１図に示す。なお、同図中の符号の意味は
下記のとおりである。

■・・・・・・ＨＩＶ非感染ＭＯＬＴ−４細胞１日目』
・・・・・・同上２日目口・・・・・・同上３日目 ●・・・・・・ＭＯＬＴ−４／Ｈ　Ｉ　Ｖ細胞１日目Ｃ
・・・・・・同上２日目Ｏ・・・・・・同上３日目第１図に示されるように、ＨＩＶ非感染ＭＯＬＴ−４細
胞は、抗Ｆａｓ抗体濃度に対する生存率の低下がさほど
認められない。一方、ＭＯＬＴ−４／ＨＩＶ細胞は抗Ｆ
ａｓ抗体濃度に依存して生存率の低下が認められ、５０
ｎｇ／ｍｌの添加量における３日目の生存率は数％であ
った。このことより、抗Ｆａｓ抗体は特異的にＭＯＬＴ
−４／ＨＩＶ細胞の増殖を抑制することが判った。

試験例２抗Ｆａｓ抗体のＨＩＶの増殖促進性を試験するため、Ｍ
ＯＬＴ−４／Ｈ　Ｉ　Ｖ細胞を抗Ｆａｓ抗体で処理し、
ドット・プロット・ハイブリダイゼーション法により、
ＨＩＶ及びβ−アクチンのｍＲＮＡ量を調べた。試験法
は以下のとおりである。

ＭＯＬＴ−４／Ｈ　Ｉ　Ｖ細胞をＬｏｎｇ／ｍｌの抗Ｆ
ａＳ抗体を含有する培地で１日処理した。低速遠心分離
により細胞を分離し、冷生理食塩水で２回洗浄した。Ｉ
　Ｘ　１　０６個の細胞を１００μｇの氷冷ＴＥ（１０
ｍＭｈリスー塩酸、１ａ＋ＭＥＤＴＡ含有）及び０．５
％Ｎｏｎｌｄｅｔ　Ｐ−４０中に再懸濁し、水浴中で１
５分間激しく攪拌した。細胞溶解産物はエッペンドルフ
・マイクロチューブを用いて１５　，　ＯＱＯｒｐｍで
１５分間遠心分離した。上清は１５０μｇのホルムアル
デヒド及び１５０μｇの２０ＸＳＳＣと混合し、６０℃
で１５分間インキユベートした。この溶液は使用するま
で−２０℃に保存した。

このようにして得られたＲＮＡ溶液のうち、１×１０５
個の細胞に相当する溶液をニトロセルロース膜に固定化
し、３２Ｐ標識ブローブとハイブリダイズした。ハイブ
リダイゼーションは、５ＸＳＳ　Ｐ　Ｅ，　５　ＸＤｅ
ｎｈａｒｔ’ｓ　，　５　０％ホルムアミド、０．２％
ＳＤＳ及び２００　ｕ　ｇ　／　ｍｌの熱変性サケ精子
ＤＮＡ中、４２℃で１６時間行なった。該膜の洗浄は、
最初ハ２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅと０．２％ＳＤＳで行な
い、次いで０．ＩＸＳＳＰＥと０．２％ＳＤＳを用い５
０℃にて行なった。この試験で用いたＨＩＶ特異プロー
ブは、ＨＩＶ−１ゲノムの約９０％をカバーするｐＮＫ
５．２のＳａＣＩフラグメントであり、ヒトβ−アクチ
ン特異ブローブは、λＨ　ａ　ｌｆｌ（ｌの０．４４ｋ
ｂＨｉｎｆ　１フラグメントである。また、用いた３２
Ｐ標識ブローブの比活性は約４ｘｌ０８　ｄｐｍ／μｇ
−ＤＮＡである。

その結果、ＨＩＶ及びβ−アクチンのｍＲＮＡ量は、両
者とも抗Ｆａｓ抗体処理により本質的な変化はなく、抗
Ｆａｓ抗体にはＨＩＶの増殖促進作用がないことを示し
た。

実施例抗Ｆａｓ抗体を適当量の生理食塩水（２０％マンニトー
ル含有）に溶解し、ｐＨ調整を行った後、滅菌したミリ
ボアフィルターで除菌濾過し、バイアル瓶に充填して凍
結乾燥することにより注射用粉末製剤を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＩＶ非感染ＭＯＬＴ−４細胞及びＭＯＬＴ
−４／Ｈ　Ｉ　Ｖ細胞を、抗Ｆａｓ抗体含有培地で培養
したときのコントロールに対する生存率を示すグラフで
ある。同図中の符号の意味は下記のとおりである。 ■・・・・・・ＨＩＶ非感染ＭＯＬＴ−４細胞１日目ｌ
・・・・・・同上２日目口・・・・・・同上３日目 ●・・・・・・ＭＯＬＴ−４／Ｈ　ＩＶ細胞１日目Ｃ・
・・・・・同上２日目０・・・・・・同上３日目

Claims

【特許請求の範囲】１、下記の性状を有するモノクローナル抗体を有効成分
として含有するエイズ処置剤。（１）ヒト二倍体線維芽細胞ＦＳ−７を認識する。（２）クラスがＩｇＭである。（３）分子量が２００Ｋである。