JP2000505076A

JP2000505076A - エイズ治療用免疫複合体

Info

Publication number: JP2000505076A
Application number: JP9525440A
Authority: JP
Inventors: エム．ウクン，ファティ
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1996-01-11
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 2000-04-25
Also published as: WO1997025071A3; CA2242514A1; EP0873140A2; US5919457A; AU1697197A; WO1997025071A2

Abstract

(57)【要約】哺乳動物ＨＩＶ感染の治療に有効であるアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはその生物活性サブユニットに結合したモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を含んでなる免疫複合体が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】エイズ治療用免疫複合体発明の背景後天性免疫不全症候群（エイズ）およびヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ− １）による感染は、全世界に広まった公衆の健康の問題を構成する。Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４１、１４８１−１４８５（１９８８）。ＨＩＶは、本来、ヒトＴリンパ球趨向性ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）、リンパ節疾患関連ウイルス（ＬＡＶ）、またはエイズ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と表示されたＲＮＡレトロウイルスである。Ｆａｕｃｉ「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３９、６１７（１９８８）。ＨＩＶはそれをＨＩＶ−２と区別するためにＨＩＶ−１と普通に呼ばれる。ＨＩＶ−２は、西アフリカの患者から単離されたＨＩＶ誘導エイズと区別不可能な臨床症候群である。ＨＩＶはレトロウイルスの非形質転換性および細胞変性レンチウイルスのファミリーの他のメンバーと多数の特徴を共有する。ＨＩＶ感染の免疫病原論の重大な基礎は、深遠な免疫抑制を生ずる、Ｔ細胞のＣＤ４＋ヘルパー／インデューサーのサブセットの消耗である。Ｄａｈｇｌｅｉｓｈ他「Ｎａｔｕｒｅ」３１２、７６３（１９８４）；Ｆａｕｃｉ「Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．」３２、４９１（１９８５）；Ｈｏ他「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」３１７、２７８（１９８７）を参照のこと。ＨＩＶはＣＤ４^-Ｔ細胞およびマクロファージに対して選択的向性を有する。この向性はそのエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質ｇ１２０とＨＩＶ−１の細胞表面レセプターの必須成分、すなわち、ＣＤ４抗原との相互作用により伝達される。Ｌａｓｋｙ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３３、２０９（１９８６）。ＨＩＶは外部のエンベロープタンパク質ｇ１２０を介してＣＤ４分子の第１ドメインに結合した後、このウイルスは内在化されかつ脱外被される。Ｆａｕｃｉ「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３９、６１７（１９８８）。いったん脱外被されると、ウイルスのゲノムＲＮＡは酵素の逆転写酵素によりＤＮＡに転写される。次いでプロウイルスのＤＮＡは宿主染色体ＤＮＡの中に組込まれる。プロウイルスの組込み後、感染は潜伏期を取ることができるか、またはプロウイルスＤＮＡはウイルスのゲノムＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡを転写することができる。タンパク質の合成、プロセシング、およびウイルスのアセンブリーは細胞表面からの成熟ヴィリオンの出芽とともに起こる。現在、エイズは不治であり、そして逆転写酵素インヒビター、たとえば、ジドブジン／ＺＤＶ（以前においてアジドチミジン／ＡＺＴと呼ばれた）およびジデオキシイノシン（ｄｄＩ）を使用してＨＩＶ−１の複製をｉｎｖｉｖｏにおいて減少させる治療の理学療法は実質的な副作用を引き起こす。Ｙａｒｃｈｏａｎ他「Ｂｌｏｏｄ」７８：８５９（１９９１）。ＺＤＶはＨＩＶ−１血清反応陽性の無症候性個体において疾患の進行を遅延し、そしてエイズおよびＡＩＤＳ関連コンプレックス（ＡＲＣ）の患者の生存率を改善したが、治療的応答はしばしば一過性である。Ｖｏｌｂｅｒｄｉｎｇ他「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」３２２、９４１（１９９０）；Ｆｉｓｃｈｌ他「Ａｎｎ．ＩｎｔｅｒｎＭｅｄ．」１１２、７２７（１９９０）；Ｆｉｓｃｈ他「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」３１７、１８５（１９８７）。ＺＤＶに対して耐性であるＨＩＶ−１の変異型が出現して、続けられた治療の成功を妨害する。Ｅｒｉｃｅ他「ＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ」１８、１４９（１９９４）。最近のデータは、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）の治療の間にＨＩＶ−１分離物の中に耐性が出現することを示す。ＳｔＣｌａｉｒ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５３、１５５７（１９９１）。これらの特性は、ＨＩＶ−１の弾力性およびこのウイルスに対するいっそう強力な戦略の必要性を強調する。正常ＣＤ４⁺Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の複製をｉｎｖｉｔｒｏにおいてアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）により阻害できることが報告された。Ｚａｒｌｉｎｇ他「Ｎａｔｕｒｅ」３４７：９０−９５（１９９０）。顕著には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞と反応性のモノクローナル抗体にＰＡＰを複合化することによってｉｎｖｉｔｒｏにおいてＰＡＰをＣＤ４⁺Ｔ細胞にターゲッティングすることは、ＨＩＶ−１複製の阻害においてその効能を＞１，０００倍に増加した（Ｚａｒｌｉｎｇ他「Ｎａｔｕｒｅ」３４７：９０−９５（１９９０）；米国特許出願第０７／９７９，４７０号）。ＡＺＴ感受性およびＡＺＴ耐性ＨＩＶ−１の臨床分離物を使用する引き続く研究において、Ｇ１７．２（抗ＣＤ４） −ＰＡＰ免疫複合体がナノモル濃度においてすべての分離物に対して有効な抗ＨＩＶ活性を示すことが証明された（Ｅｒｉｃｅ他「ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」３７：８３５−８３８、１９９３）。これらの非常に有望なｉｎｖｉｔｒｏのデータにかかわらず、ＨＩＶ−１で感染した個体を治療するためのＰＡＰ免疫複合体の臨床的開発は、抗Ｔ細胞特異的免疫複合体のｉｎｖｉｖｏ安定性が低いために妨害された。結局、抗Ｔ細胞特異的ＰＡＰ免疫複合体の治療的濃度をｉｎｖｉｖｏにおいて獲得することは不可能であった。たとえば、Ｇ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ免疫複合体（米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されている）は、ヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて検出可能な抗ＨＩＶ−１活性を示さなかった。したがって、ｉｎｖｉｖｏにおいて有効な、改良された安定性を有する抗Ｔ細胞ＰＡＰ免疫複合体が要求されている。発明の要約本発明は、有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）に結合したＴ細胞に対して特異的なモノクローナル抗体を含んでなる抗ウイルス生物治療剤に関する。これらの抗ウイルス免疫複合体は、エイズ、ＡＲＣまたはＨＩＶの感染の治療に有効である。さらに、本発明の免疫複合体はｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの双方において活性であり、そしてこれらは本発明の化合物のために特別に主張する実用性を有する。好ましくは、本発明の免疫複合体は、ウイルスが感染した哺乳動物細胞の表面に存在するＣＤ４抗原に結合するモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を使用する。より好ましくは、本発明の実施において利用する抗体は、ハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣにより生産されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する。本明細書において記載するように、用語「免疫複合体」は一般にモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）および抗ウイルスタンパク質複合体を意味し、ここで抗体は抗ウイルスタンパク質に共有結合または架橋している。さらに詳しくは、本発明の免疫複合体はモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を包含し、この抗体はヒト細胞上の表面ＣＤ４レセプターのＨＩＶ−１結合部位と反応する。ＴＸＵ−５／Ｂ５３はアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）または任意の誘導源からの生物学的同等物（そのサブユニットおよび誘導体を包含する）に共有結合する。本明細書において使用するとき、用語「ＰＡＰ」は任意の抗ウイルス性のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、またはそのサブユニット、変異型または突然変異体（サブタイプＰＡＰ−ＩＩ、ＰＡＰ−Ｓ、および組換えＰＡＰを包含する）を意味する。用語「抗ウイルス量」は、いったん免疫複合体がＣＤ４⁺ヒト細胞と会合したとき、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１の複製を阻害する量を意味すると定義される。本発明は、また、ＨＩＶ感染、ＡＲＣまたはエイズに悩む患者を本発明の免疫複合体で治療することからなる、哺乳動物の細胞におけるＨＩＶの複製を不活性化または阻害する方法を提供する。本発明の方法は、ＺＤＶ耐性となったＨＩＶ株で感染した患者の治療に特に適する。ＨＩＶ−１はＣＤ４分子に結合し、そしてＣＤ４⁺細胞に感染するので、ＣＤ４⁺細胞の機能障害および選択的消耗が少なくとも部分的に生ずる。本発明の免疫複合体は、ウイルス感染ＣＤ４⁺細胞に対して有効な抗ウイルス剤をターゲッティングすることによって、その作用を発揮する。しかしながら、ある場合において、存在するか、または出現するＰＡＰ耐性突然変異体の排除を促進するために、治療の組合わせまたは付加的治療を必要とすることがある。これに関して、本発明の免疫複合体の抗ウイルス活性を喪失しないで、または望ましくない副作用を引き起こさないで、本発明の免疫複合体をヌクレオシド類似体、たとえば、逆転写酵素インヒビターのジドブジン（以前においてＡＺＴ）と組み合わせて利用できることを出願人は発見した。したがって、本発明の１つの態様は、有効量の１または２以上の慣用の抗エイズ剤と組み合わせてＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰを投与することからなる。好ましくは、使用する抗エイズ剤は逆転写酵素インヒビターである。より好ましくは、使用する抗エイズ剤はＺＤＶである。感染した細胞上でＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現させて、感染した細胞に結合標的を提供することに頼る免疫複合体と異なり、本発明の免疫複合体は、ＣＤ４⁺細胞上の正常の抗原に対するモノクローナル抗体を使用して、非感染の、または潜伏的に感染したＣＤ４⁺細胞に、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）をターゲットする。このアプローチは、異なるＨＩＶ−１分離物の間のエンベロープ抗原の異質性によるか、または宿主抗エンベロープ抗体の存在により引き起こされる潜在的問題を回避することを出願人は発見した。ＭｏＡｂレセプター仲介エンドサイトーシスによるＰＡＰ−モノクローナル抗体複合体の内在化は、高いＰＡＰ濃度において起こる非特異的吸収に比較して、形質膜を通るＰＡＰの放出を増加させることを出願人は以前に発見し、これは米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に記載された。しかしながら、米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されているＰＡＰ免疫複合体は非常に低い安定性を表し、そしてヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて抗ＨＩＶ活性を示さなかった。今回、より長い血清半減期およびより大きい全身的暴露により測定して、驚くべきｉｎｖｉｖｏ安定性を示す、本発明の免疫複合体を出願人は発見した。たとえば、１ｍｇの投与量のＧ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ（米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されている）は、４ｋｇのウサギにおいて３．８μｇ×時／Ｌの全身の無傷の免疫複合体の暴露レベルを発生した。対照的に、１ｍｇ／ウサギの同一投与量で投与された、本発明の免疫複合体（ＴＸＵ−５／Ｂ５３（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ）は、６７．５μｇ×時／Ｌ（米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されている免疫複合体の１７．８倍の増加）の全身の無傷の免疫複合体の暴露レベルを発生した。その結果、本発明の免疫複合体、ＴＸＵ−５／Ｂ５３− ＰＡＰ、の治療的濃度をｉｎｖｉｖｏにおいて達成することができる。最も重要なことには、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰは、全身の毒性を引き起こさないで、ヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて有効な抗ＨＩＶ活性を示した。さらに、驚くべきことには、望ましくない副作用を引き起こさないで、本発明の免疫複合体をＡＺＴ（ＺＤＶ）と同時に投与できることを出願人は発見した。本発明の免疫複合体は、哺乳動物の単球およびＴ細胞におけるＨＩＶ複製を阻害するための、高度に有効な手法の基礎を提供し、これによりエイズ、ＡＲＣの患者、またはエイズをまだ発生しないＨＩＶ−１で感染した無症候性の患者を治療する方法を提供することが期待される。さらに、本発明の免疫複合体は他のレトロウイルス（ＨＴＬＶ−１、およびその他）およびレトロウイルス以外のウイルス［たとえば、疱疹ウイルス群のメンバー（ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、パポバウイルス（ヒト乳頭腫）、アデノウイルス、肝炎ウイルス、およびその他であるが、これらに限定されない］を阻害するための、有効な手法の基礎を提供するであろうことが期待される。最後に、本発明の免疫複合体は、望ましくないＴ細胞の増殖に関連する疾患または病理学の治療において、単独で、またはこのような病気に慣用の療法と組み合わせて、有効であることが期待される。このような病理学は、癌、たとえば、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫、器官の拒絶反応、骨髄移植の拒絶反応または自己免疫疾患、たとえば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、非糸球体腎炎、乾癬、慢性活性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎（膜性）、慢性血小板減少性紫斑病、および自己免疫溶血性貧血を包含する。図面の簡単な説明第１図は、２つのＡＺＴ耐性ＨＩＶ−１分離物に対するＴＸＵ−５／Ｂ５３− ＰＡＰのｉｎｖｉｖｏ活性を描写する。第２図は、Ｇ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ／ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰのｉｎｖｉｖｏ安定性の比較のｉｎｖｉｖｏ安定性を描写する。第３図は、非感染およびＨＩＶ感染の双方のＳＣＩＤマウスからの脾臓および腹腔洗浄の検体における異種移植したヒトリンパ球の存在を示す。第４図は、ＺＤＶ治療マウスまたはＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ治療マウスから得られたリンパ球表面上のＣＤ４およびｇｐ１２０抗原の同時発現の多パラメーターのフローサイトメトリー分析の結果を描写する。第５図は、ＨＩＶ−１でチャレンジし、そしてＰＢＳ、ＺＤＶ、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰまたはＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ＋ＺＤＶの組合わせで治療したＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの脾細胞からのＨＩＶ−１ＰＣＲおよび培養の結果を描写する。第６図は、ＨＩＶ−１でチャレンジし、そしてＰＢＳ、ＺＤＶ、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰまたはＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ＋ＺＤＶの組合わせで治療したＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの腹腔細胞からのＨＩＶ−１ＰＣＲおよび培養の結果を描写する。発明の詳細な説明本発明は、レトロウイルス、たとえば、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−１１、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２またはその他を包含する、哺乳動物ウイルスの治療において有用な免疫複合体に関する。詳しくは、本発明は、ＡＲＣ、エイズ、または無症候性感染の治療において有用な免疫複合体に関する。Ａ．モノクローナル抗体モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）は、脾リンパ球を骨髄の一次腫瘍の悪性細胞（骨髄腫）と融合させることによって生産される。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ「Ｓｃｉ．Ａｍ．」２４３、６６（１９８０）。この手順は、単一の融合した細胞のハイブリッド、またはクローンから生ずる、ハイブリッド細胞系統、またはハイブリドーマを与え、これはリンパ球および骨髄腫細胞系統の双方の特性を有する。リンパ球（抗原としてヒツジ赤血球で開始した動物から採った）と同様に、融合したハイブリッドまたはハイブリドーマは抗原と反応性の抗体（免疫グロブリン）を分泌する。そのうえ、骨髄腫細胞系統と同様に、ハイブリッド細胞系統は永久分裂能を有する。詳しくは、ワクチン接種した動物から誘導された抗血清は同一に再現することができない抗体の可変混合物であるが、ハイブリドーマが分泌する免疫グロブリンの単一の型は抗原上の１つのかつただ１つの決定因子（すなわち、多数の抗原分子の下部構造を有する複雑な分子）、または複数の決定因子（エピトープ）に対して特異的である。それゆえ、単一の抗原に対して発生したモノクローナル抗体は、それらの形成を誘発した決定因子に依存して、互いに区別される。しかしながら、所定のクローンにより生産された抗体のすべては同一である。さらに、ハイブリドーマ細胞系統は、同一に再現することができ、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて容易に増殖され、そして極めて高い濃度においてモノクローナル抗体を生ずることができる。モノクローナル抗体は主として臨床的に癌の診断および治療、自己免疫および宿主の疾患に対する移植片（ＧＶＨＤ）の治療および異系移植片の拒絶反応の予防のための免疫抑制を生成する免疫応答の変調に適用されてきている。ヒトモノクローナル抗体は、また、サイトメガロウイルス、水痘−帯状疱疹（Ｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒ）ウイルス、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の種々の特異的血清型に対して臨床的に適用されてきている。本発明において有用なモノクローナル抗体は、よく知られているハイブリドーマ融合技術を使用して生産される［Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」６：５１１（１９７６）；Ｍ．Ｓｈｕｌｍａｎ他「Ｎａｔｕｒｅ」２７６：２６９（１９７８）］。上に示したように、本発明はＴ細胞に対して向けられたモノクローナル抗体を使用する。好ましくは、使用する特定の抗体はＴＸＵ−５／Ｂ５３である。１．ＴＸＵ−５／Ｂ５３モノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３は、ＣＤ４抗原に対して向けられたネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＣＤ４抗原は、ヒトＴ細胞ならびに単球上で発現され、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質ｇｐ１２０のレセプターである。ＣＤ４のｇｐ１２０結合部位は十分に特性決定され、そしてＣＤ４の第１ドメイン（Ｄ１）内の残基３９−５９を包含する領域にマッピングされた。ＣＤ４レセプター上のＴＸＵ−５／Ｂ５３の結合部位は、「ｔｈｅＦｉｆｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＷｏｒｋｓｈｏｐｏｎＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎｓ」（Ｐｉａｔｉｅｒ−Ｔｏｎｎｅａｕ他「［Ｉｎ］ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＴｙｐｉｎｇＶ」ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、１９９５；ｐｐ．４７６−４７９）の間にＣＤ４の第１ドメイン（エピトープ：ＣＤＲ２、Ｃ’Ｃ”Ｄ鎖）であると決定された。詳しくは、第１ドメイン内のアミノ酸残基４３−４９を欠如するＣＤ４の欠失突然変異体でＣＯＳ細胞をトランスフェクトするとき、ＣＤ４陽性ＣＯＳ細胞に対するＴＸＵ−５／Ｂ５３抗体の結合は喪失された。さらに、ＴＸＵ−５／Ｂ５３抗体はＣＤ４陽性細胞に対する放射性ヨウ素化ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０の結合を１００％だけ阻害した（Ｐｉａｔｉｅｒ−Ｔｏｎｎｅａｕ他「［Ｉｎ］ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＴｙｐｉｎｇＶ」ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、１９９５；ｐｐ．４７６−４７９）。Ｂ．アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）は、フィトラッカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）の葉または種子から単離された抗ウイルス剤である（ＩｒｖｉｎおよびＵｃｋｕｎ「ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」５５：２７９、１９９２）。ＰＡＰは植物ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ポリオウイルス、およびインフルエンザウイルスに対して広いスペクトルの抗ウイルス活性を示す。Ａｒｏｎ他「ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」１７、１０３２（１９８０）。事実、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質は植物中のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の伝達を阻害する能力を有するために発見され、引き続いて、精製されたタンパク質は多数の他の植物ウイルスに対して等しく有効であることが証明された。Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ他「Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．」２２、２２５（１９７４）。ＰＡＰの抗ウイルス活性は、細胞表面のレセプターに対して特異的な抗体への複合化により、大きく増強されかつ高度に細胞選択的とすることができる。このようなＰＡＰを含有する免疫複合体の１つは出願人により開発され、そしてヘルペス族の他のメンバー、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対して試験された。この研究において、ＰＡＰの抗ウイルス作用はそれを抗体に化学的にカップリングすることによって増強されることが見出された。Ｇｅｈｒｚ他著『Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＨＣＭＶ）ｗｉｔｈｎｏｖｅｌａｎｔｉｖｉｒａｌｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ』、「ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ」ＬａｎｄｉｎＭ．Ｐ．編、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢＶ、アマーシャム、ｐ．３５３（１９９１）。低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬｒ）およびＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ５５（これはＨＣＭＶ感染細胞上で発現される）に対して特異的なモノクローナル抗体を使用してＰＡＰ−抗体複合体を製造し、抗ウイルス作用について試験した。ＰＡＰおよび抗ＬＤＬｒを使用して製造された複合体はＰＡＰの抗ウイルス作用を１０００倍増加し、１ｎｇ／ｍｌにおいてプラークの形成を５０％減少させた。抗ｇｐ５５へのＰＡＰの複合化はＰＡＰ単独について観測された抗ウイルス活性を増加させなかった。Ｇｅｈｒｚ他、上掲。これらの研究において、ＰＡＰの抗ウイルス活性は細胞表面特異的抗体への複合化により有意に増加することができるが、内在化することができる細胞表面のタンパク質に抗体をターゲットしなくてはならないことが示された。非複合化ＰＡＰは、トリコサンシンについて報告された特性に匹敵する抗ＨＩＶおよび堕胎特性を有することが示された。Ｔｅｌｔｏｗ他「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．」２３、３９０（１９８３）。感染前４時間に細胞を処理した後、ｉｎｖｉｔｒｏで感染したＴ細胞およびマクロファージの双方において、ほぼ５× １０³ｐＭのＩＤ₅₀で、ＰＡＰはｐ２４のＨＩＶ−１産生を阻害することが報告された。Ｚａｒｌｉｎｇ他「Ｎａｔｕｒｅ」３４７、９２（１９９０）。これらの研究において、また、非感染細胞は３０ｎＭまでの濃度におけるＰＡＰ処理により悪影響を受けないことが証明された。顕著には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞と反応性のモノクローナル抗体にＰＡＰを複合化することによって、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＣＤ４⁺Ｔ細胞に対してＰＡＰをターゲットすると、ＨＩＶ−１複製を阻害するＰＡＰの能力は＞１０００倍増加した（Ｚａｒｌｉｎｇ他「Ｎａｔｕｒｅ」３４７：９２−９５、１９９０；米国特許出願第０７／９７９，４７０号）。ＡＺＴ感受性およびＡＺＴ耐性ＨＩＶ−１の臨床分離物を使用する引き続く研究において、Ｇ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ免疫複合体はナノモル濃度においてすべての分離物に対して有効な抗ＨＩＶ活性を示すことが証明された（Ｅｒｉｃｅ他「ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」３７：８３５−８３８、１９９３）。しかしながら、この非常に有望なｉｎｖｉｔｒｏのデータにかかわらず、ＨＩＶ−１感染した個体の治療のためのＰＡＰ免疫複合体の臨床的開発は、抗Ｔ細胞特異的免疫複合体の低いｉｎｖｉｖｏ安定性により妨害されてきた。結局、ｉｎｖｉｖｏにおけるＴ細胞特異的ＰＡＰ免疫複合体の治療的濃度を達成することができなかった。たとえば、米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されているＧ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ免疫複合体は、ヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて検出可能な抗ＨＩＶ−１活性を示さなかった。Ｃ．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体の製造および精製本発明の好ましいＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体は、有効抗ウイルス量のＰＡＰ分子をＴＸＵ−５／Ｂ５３の各分子に結合させることによって形成される。たとえば、本発明の実施において有用な試薬は、それぞれ、ＴＸＵ−５／Ｂ５３分子当たり１つおよび２つのＰＡＰ分子を有するＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ種の約１：１混合物である。下記の実施例２〜４において使用される特定のＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体は、米国特許第４，８３１，１１７号明細書（Ｕｃｋｕｎ）に記載されているように、ＴＸＵ−５／Ｂ５３ＭｏＡｂをＰＡＰに結合させることによって製造される。ＴＸＵ−５／Ｂ５３を分泌するハイブリドーマは、ＡＴＣＣから表示で入手可能である［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州２０８５２ロックビレ、パークラウンドライブ１２３０１）に１９９７年１月１０日に寄託された］。ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの製造および精製に関するそれ以上の情報は、実施例１において見出すことができる。しかしながら、この分野において開示される他の手段、たとえば、米国特許第４，３６３，７５８号（Ｍａｓｕｈｏ他）、米国特許第５，１６７，９５６号（Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｊｒ．他）および米国特許第４，３４０，５３５号（Ｖｏｉｓｉｎ他）明細書に記載されている手段により、ＴＸＵ−５／Ｂ５３を有効量のＰＡＰに結合させることができる。たとえば、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）に加えて、４−スクシニミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、およびＮ−スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ −ＳＰＤＰ）を結合剤として使用することができる。Ｄ．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの投与のモード本発明の免疫複合体は医薬組成物として処方し、単独で、あるいは薬学上許容される担体またはべヒクルと組み合わせて有効量の１または２以上のこれらの薬剤を含んでなる単位投与形態の組合わせで、エイズに悩むヒトまたは他の哺乳動物に投与することができる。１．投与形態本発明のＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体は非経口的に、すなわち、静脈内、筋肉内、または皮下に注入または注射により投与することが好ましい。免疫複合体の溶液または懸濁液は、水、または等張生理食塩水、たとえば、ＰＢＳ中で、必要に応じて無毒の界面活性剤と混合して、調製することができる。また、分散液はグリセロール、液状ポリエチレングリコール、ＤＭＡ、植物油、トリアセチン、リポソーム、およびそれらの混合物中で調製することができる。通常の貯蔵および使用の条件下に、これらの調製物は微生物の増殖を防止するために保存剤を含有することができる。注射または注入の用途に適当な薬学上の投与形態は、無菌の水性の溶液または分散液、あるいは無菌の注射または注入可能な溶液または分散液の即時調製に適合する免疫複合体を含んでなる無菌の粉末を包含することができる。すべての場合において、究極的投与形態は、製造および貯蔵の条件下に、無菌、流動性でありかつ安定性でなくてはならない。液状の担体またはベヒクルは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール、およびその他）、植物油、無毒のグリセロールエステル、脂質（たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン）および適当なそれらの混合物を含んでなる溶媒または液状分散媒質であることができる。適切な流動性は、たとえば、リポソームの形成、分散液の場合において要求される粒度の維持、あるいは無毒の界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびその他により達成することができる。多くの場合において、等張剤、たとえば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを添加することが望ましいであろう。注射可能な組成物の延長した吸収は、組成物の中に吸収を遅延させる物質、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムのヒドロゲルおよびゼラチンを添加することによって、生じさせることができる。無菌の注射または注入可能な溶液は、免疫複合体を要求される量で適当な溶媒の中に種々の他の前述の成分とともに混入し、次いで必要に応じて、濾過滅菌することによって調製される。無菌の注射または注入可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合において、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらの技術は活性成分と、前に濾過滅菌した溶液の中に存在する任意の追加の所望の成分との粉剤を生ずる。さらに、本発明の免疫複合体に適当な処方物は、経口的または経直腸的投与に適当なものを包含する。製剤は薬学分野においてよく知られている任意の方法により調製することができる。このような方法は、免疫複合体を液状担体または微細な固体状担体または双方と一緒にし、次いで、必要に応じて、生成物を所望の処方物に造形する工程を含む。経口投与に適当な医薬製剤は、好都合には、下記のような個々の単位として提供することができる：各々、前もって決定した量の活性成分を含有する、カプセル剤、プラスチック製小容器、または錠剤；粉剤または顆粒；溶液、懸濁液または乳濁液。活性成分は、また、ボーラス、舐剤またはペーストとして提供することができる。経口投与のための錠剤またはカプセル剤は、慣用の賦形剤、たとえば、結合剤、充填剤、滑剤、崩壊剤、または湿潤剤を含有することができる。錠剤はこの分野においてよく知られている方法に従い被覆することができる。経口液状調製物は、たとえば、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であることができるか、あるいは使用前に水または他の適当なベヒクルで構成するための乾燥生成物として提供することができる。このような液状調製物は、慣用の添加剤、たとえば、懸濁剤、乳化剤、非水性ベヒクル（これは食用油を包含する）、または保存剤を含有することができる。さらに、本発明の免疫複合体は徐放性投与形態の製剤によく適する。製剤は、それらが活性乾燥成分のみを、または好ましくは特定の生理学的位置に、必要に応じてある期間にわたって、放出するように構成することができる。コーティング、エンベロープ、および保護のマトリックスを、たとえば、ポリマーの物質またはワックスから作ることができる。化合物は、また、経皮的送出のためのパッチ、皮下の移植片、注入ポンプにより、あるいは移植されたデポー製剤の持続放出性投与形態からの放出により送達することができる。２．投与量前記組成物中の免疫複合体の投与量は、患者の大きさ、年令および症状、および標的癌に従い、広く変化させることができる。しかしながら、投与量は患者の感染した細胞におけるウイルスの複製の実質的な部分、通常約９０％より多く、を阻害するのに十分であるべきである。詳しくは、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰは、２．０〜２０ｎｇ／ｍｌに等しい、１０〜１００ｐＭの範囲において使用する場合、ＨＩＶの複製を＞９０％だけ阻害するであろう。この濃度を達成するために要求される量は、下記式を使用して計算することができる：投与量（マイクログラム）＝７０×２（２０）×体重（ｋｇ）／１，０００。７０ｋｇの患者について、これは１０〜１００マイクログラムをもたらすだろう。したがって、本発明により想像されかつ治療的に有効であると考えられるＨＩＶ感染の成人のヒトのための投与量は約１０〜１００マイクログラムであり、そして、固相ＥＬＩＳＡにより測定して、所定の患者におけるＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの血漿半減期に基づく頻度で投与されるであろう。ある場合において、より多い投与量を使用することができ、そして上記式を使用して子供に適当量の免疫複合体を提供するように、投与量を容易に調節することができる。下記の詳細な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。実施例１．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体の製造および精製従来記載された手順に従い、ヘテロ二官能架橋剤Ｎ−スクシニミジル３−（２ −ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用して、アフィニティー精製されたＴＸＵ−５／Ｂ５３（ＩｇＧ１、αＣＤ４）ＭｏＡｂをフィトラッカ・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）の春の葉からの２− イミノチオラン修飾ＰＡＰまたはＰＡＰ突然変異体に複合化させた（Ｕｃｋｕｎ他「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」１６３、３４７（１９８６））。次いで、従来Ｕｃｋｕｎ他「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」１６３、３４７（１９８６）に詳述に記載されているように、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体を非複合化ＴＸＵ−５／Ｂ５３ＭｏＡｂおよび遊離ＰＡＰからサイズ排除ＨＰＬＣおよびカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Ｕｃｋｕｎ他、上掲、に報告されているように、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体の純度、免疫反応性、リボソーム阻害活性および組成を測定した。対照は非複合化ＰＡＰ、Ｂ細胞に対して向けられたＢ４３（αＣＤ１９）−ＰＡＰ、および非複合化ＴＸＵ−５／Ｂ５３抗体を包含した。以前にＵｃｋｕｎ他、上掲、に発表されている手順を使用して、対照試薬を製造した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５％の分離ゲル）を使用して、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの純度および組成を監視した。Ｕｃｋｕｎ他、上掲。ゲルをクーマシーブルーＧ−２５０で染色し、１０％酢酸／３０％メタノールで脱染し、乾燥し、引き続いてベックマンＤＵ６２分光光度計およびゲル・スキャン・ソフト−パック・モジュール（ＧｅｌＳｃａｎＳｏｆｔ−ＰａｃＭｏｄｕｌｅ）（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）使用して走査した。さらに、バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した銀染色キットを利用して、検出のより大きい感度を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質バンドを可視化した。Ｕｃｋｕｎ他、上掲。ウェスタンブロット分析およびバイオ・ラド・ラボラトリーズから入手した検出キットを使用して、ＴＸＵ− ５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体中のＴＸＵ−５／Ｂ５３およびＰＡＰ成分の存在を確証した。Ｕｃｋｕｎ他、上掲。高度に精製されたＰＡＰで超免疫化されたウサギにおいて、抗ＰＡＰ一次抗体を発生させた。また、アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミゾリー州セントルイス）を使用して、イムノブロッティングを実施して、精製された免疫複合体調製物の中に残留する非複合化ＴＸＵ−５／Ｂ５３を検出した。Ｕｃｋｕｎ他、上掲。シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）（ミズリー州セントルイス）から入手したビシンコニニック・アッセイ・システム（ＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。プロメガ・バイオテク・インコーポレーテッド（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈｉｎｃ．）（ウイスコンシン州マディソン）からのキットにおいて得られたｍＲＮＡ依存性細胞不含翻訳システムにより、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体中のＰＡＰ成分のリボソーム阻害活性を分析した。Ｕｃｋｕｎ他、上掲。実施例２．ＡＺＴ耐性エイズウイルスに対するＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体のｉｎｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性従来、Ｅｒｉｃｅ他「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａ１ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」３７、８３５（１９９３）に記載されているように、ｉｎｖｉｔｒｏ逆転写酵素阻害アッセイを使用して、２つのジドブジン（ＺＤＶ＝ＡＺＴ）耐性ＨＩＶ−１分離物、すなわち、Ｇ−９１０６（ＺＤＶＩＣ５０［逆転写酵素活性の５０％が阻害される濃度］＝８．７μＭ）、およびＧ− ６９１２（ＺＤＶＩＣ５０＝１．５μＭ）（Ｌａｒｄｅｒ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４３、１７３１（１９８９））に対して、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの抗ウイルス活性を試験した。第１図に図解されているように、ＴＸＵ−５／Ｂ５３ −ＰＡＰはナノモル濃度において双方の分離物の複製を阻害した。したがって、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰは、これらのＡＺＴ耐性ＨＩＶ−１分離物に対して、ＡＺＴよりも＞１，０００倍有効な抗ウイルス剤である。ＴＸＵ−５／Ｂ５３ −ＰＡＰと異なり、Ｔ細胞と反応しない陰性の対照のＰＡＰ免疫複合体Ｂ４３（抗ＣＤ１９）−ＰＡＰはＨＩＶ−１の複製を阻害しなかった。実施例３．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体のｉｎｖｉｖｏ安定性米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されているＰＡＰ免疫複合体は、非常に低いｉｎｖｉｖｏ安定性を表し、そしてヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて抗ＨＩＶ活性を示さなかった。本発明のＴＸＵ−５／Ｂ５３（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ免疫複合体のｉｎｖｉｖｏ安定性を、米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されているＧ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ免疫複合体のｉｎｖｉｖｏ安定性と比較するために、体重３ｋｇの雌のニュージーランド白色ウサギに１ｍｇの投与量のこれらの物質を静脈内注射した。免疫複合体の投与後に多数の時点において、眼窩後の静脈穿剌により末梢血を採取し、そして従来記載されているように（Ｕｃｋｕｎ他「ＬｅｕｋｅｍｉａａｎｄＬｙｍｐｈｏｍａ」９：４５９−４７６、１９９３；Ｍｙｅｒｓ他「ＬｅｕｋｅｍｉａａｎｄＬｙｍｐｈｏｍａ」１８：９３−１０２、１９９５）固相ＥＬＩＳＡにより、無傷の免疫複合体ならびに非複合化抗体の血清濃度を測定した。２つの別々であるが、結合した２つの隔室の一次薬物速度論のモデル（無傷の免疫複合体についての１つおよび遊離抗体について１つ）のデータは、同一動物内の無傷の免疫複合体および遊離抗体のデータに同時に適合した。ＡＤＡＰＴ−ＩＩソフトウェアにおいて実行された、最大確度の推定を使用して、薬物速度論のパラメーターを決定した。これらの解析において、より長い血清半減期およびより大きい全身の暴露（すなわち、濃度−時間の曲線の下の面積）により測定して、本発明の免疫複合体は驚くべきｉｎｖｉｖｏ安定性を示すことが証明された。１ｍｇの投与量のＧ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰは４ｋｇのウサギにおいて３．８μｇ×時／Ｌの全身の無傷の免疫複合体の暴露レベルを発生したが、１ｍｇ／ウサギの同一投与量で投与された本発明のＴＸＵ−５／Ｂ５３（抗ＣＤ４）−ＰＡＰは６７．５μｇ×時／Ｌの１７．８倍より高い全身の無傷の免疫複合体の暴露レベルを発生した。実施例４．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体のｉｎｖｉｖｏ抗ＨＩＶ活性突然変異体Ｃ．Ｂ．１７マウスをモデル系として使用して、正常および悪性のヒト造血細胞のｉｎｖｉｖｏのホーミング、移植、および増殖のパターンを検査した。Ｌａｐｉｄｏ他「Ｂｌｏｏｄ」８０、３２ａ（１９９２）。重度の複合型免疫欠損症（ＳＣＩＤ）マウス［ヒト末梢血白血球で再構成した（ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス）］は誘導可能な免疫機能を有し、そしてエイズのための代理モデルとして有用であることが示された。Ｍｏｓｉｅｒ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５１、７９１（１９９１）。Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスはＨＩＶ−１の多数の株で感染させることができ、そして感染後１６週までの間、感染したマウスは腹膜腔、脾臓、末梢血、およびリンパ節からの培養により回復可能であるウイルスを含有した。Ｍｏｓｉｅｒ他、上掲。Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを以前に記載されたように発生させた。Ｍｏｓｉｅｒ他、上掲。無毒の投与量のＴＸＵ −５／Ｂ５３−ＰＡＰ（ＬＤ₁₀の２０％〜５０％）を、合計の投与量の半分を腹腔内にボーラスとして注射し、そして残部をアルゼット（Ａｌｚｅｔ）マイクロ −浸透圧ポンプにより２週にわたって腹腔内に送出した。ＺＤＶを水に１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した（これは平均２００ｍｇ／ｋｇ／日のＺＤＶの消費を生じた）。ＨＩＶ−１感染後２週に、マウスを選択的に殺し、新鮮な腹腔洗浄細胞ならびに脾細胞を単離し、ＨＩＶ−１抗体陰性ドナーからのフィトヘマグリチニン（ＰＨＡ）剌激ヒト末梢血単核細胞と同時培養し、そして、以前に記載されたように、商業的に入手可能な酵素イムノアッセイ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州ノースシカゴ）（ＨＩＶ−１のコアｐ２４抗原を主として検出する）を使用して、培養上清をＨＩＶ−１抗原の存在について３〜４日毎に最長２８日間試験した。Ｇｏｕｄｓｍｉｔ他「Ｊ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ」１５５、５５８（１９８７）。この培養法に加えて、また、腹腔洗浄細胞ならび脾細胞からＤＮＡを単離し、増幅すべき領域をフランクする、２つの２９塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、ＳＫ３８およびＳＫ３９、を使用して、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇ領域における１１５塩基対の配列をＰＣＲ増幅することによって、ＨＩＶ−１のＤＮＡを検出した。ＯｕＣ−Ｙ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２３９。２９５（１９８８）。また、Ｕｃｋｕｎ他「Ｂｌｏｏｄ」７９、２２０１（１９９２）に以前に記載されているように、増幅すべき領域をフランクする、２つの２０塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、ＰＣＯ３およびＰＣＯ４、を使用して、ヒトβ−グロビン遺伝子の第１エクソンからの１１０塩基対のフラグメントをＰＣＲ増幅することによって、ＤＮＡ試料をヒトＤＮＡの存在について検査した。ＨＩＶ−１で感染させ、そしてＰＢＳで治療した２３匹のＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスについての下記表１に示すように、（ａ）１１匹をＨＩＶ−培養およびＨＩＶ−ＰＣＲの双方により分析し、そして１０匹は双方のアッセイにおいて陽性であったが、１匹はＰＣＲによってのみ陽性であり、（ｂ）６匹をＨＩＶ− 培養のみで分析し、すべての６匹は陽性であり、（ｃ）６匹をＨＩＶ−ＰＣＲのみで分析し、すべての６匹は陽性であった。対照的に、ＨＩＶ−１を注射しなかった１７匹の対照Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのいずれにおいても、ＨＩＶ−培養およびＨＩＶ−ＰＣＲにより誤った陽性の結果は存在しなかった。２０μｇの合計の投与量のＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療した、すべての４匹のＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいてＰＣＲによりウイルスのゲノムが検出されたが、これらのマウスのいずれからも培養によってウイルスは回収されなかった。顕著には、４０ｐｇの合計の投与量のＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療した１８匹のＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのうちの３匹のみにおいてＨＩＶ−１ＤＮＡが検出され、そしてこれらのマウスからの１１の混合腹膜洗浄＋脾細胞培養物のいずれも陽性ではなかった（表１）。同様に、ＨＩＶ−１感染の培養またはＰＣＲの証拠は６０μｇのＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療した５匹のＨｕ− ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのいずれにおいても見出されなかった。ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療したマウスと対照的に、１０匹のＺＤＶ治療したＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのうちで３匹のみがＨＩＶ−１陰性であった。残りの７匹のマウスのうちで、４匹は培養−陽性およびＰＣＲ陽性であり、そして３匹の場合は培養−陰性であったが、ＰＣＲ陽性であった。顕著には、ＴＸＵ−５／Ｂ５３ −ＰＡＰとＺＤＶとの組合わせで治療した８匹のＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスのうちで、腹膜腔誘導細胞において、いずれも培養−陽性ではなく、いずれも（分析した５匹の）ＰＣＲ陽性ではなく、そして３匹（分析した８匹のうちの）は脾臓においてＰＣＲ陽性であった。非感染ＳＣＩＤマウス、ならびにＨＩＶ−１で感染させたが、ＺＤＶまたはＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体で治療したＳＣＩＤマウスからの脾臓ならびに腹腔洗浄検体において、ヒトＤＮＡは検出され、異種移植したヒトリンパ球の存在と一致した。適当な治療の非存在におけるＨＩＶ−１の細胞変性作用のために、抗ウイルス治療を受けないＨＩＶ−１感染Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて、このような移植は常に明らかということはなかった（第３図）。非治療またはＺＤＶ治療のマウスの腹膜腔から得られたリンパ球上の表面抗原のマルチフロー・サイトメトリー分析は、持続するＨＩＶ−１感染と一致するＣＤ４＋細胞上のｇｐ１２０の存在を示したが、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療したマウスからのＣＤ４＋細胞はｇｐ１２０陰性であった（第４図）。ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療したＳＣＩＤマウスにおけるヒトＤＮＡおよびＣＤ４＋リンパ球の検出において、低い移植またはＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの細胞障害性のために、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の非存在により引き起こされないような、ＴＸＵ −５／Ｂ５３−ＰＡＰで治療したＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおけるＨＩＶ −１の非存在の証拠が提供された。これらの結果はＺＤＶ単独で得られた結果よりも明らかにすぐれ、そしてＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰおよびＺＤＶを安全に組合わせることができることを示す。第５図および第６図は、ＨＩＶ−１でチャレンジし、そしてＰＢＳ、ＺＤＶ、ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ、またはＴＸＵ −５／Ｂ５３−ＰＡＰ＋ＺＤＶの組合わせで治療した、代表的なＨｕ−ＰＢＬ− ＳＣＩＤマウスからのＨＩＶ−１ＰＣＲおよび培養の結果を描写する。本発明のある種の好ましい態様のみを例示のために示しかつ記載したが、当業者にとって多数の変更は明らかであり、したがって、これは本発明の精神および範囲内に入るすべてのこのような変更をここにおいて包含することを意図すると理解すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１２月１８日（１９９７．１２．１８）【補正内容】明細書第３頁第２６行〜第５頁第８行の「０７／９７９，４７０号…阻害する方法を」を『０７／９７９，４７０号明細書に開示されている）は、ヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて検出可能な抗ＨＩＶ−１活性を示さなかった。したがって、ｉｎｖｉｖｏにおいて有効な、改良された安定性を有する抗Ｔ細胞ＰＡＰ免疫複合体が要求されている。発明の要約本発明は、有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）に結合したＴ細胞に対して特異的なモノクローナル抗体を含んでなる抗ウイルス生物治療剤に関する。これらの抗ウイルス免疫複合体は、ＨＩＶ感染、たとえば、エイズ、ＡＲＣまたは無症候性のＨＩＶの感染の治療に有効である。さらに、本発明の免疫複合体はｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの双方において活性であり、そしてこれらは本発明の化合物のために特別に主張する実用性を有する。好ましくは、本発明の免疫複合体は、ウイルスが感染した哺乳動物細胞の表面に存在するＣＤ４抗原に結合するモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を使用する。より好ましくは、本発明の実施において利用する抗体は、ハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣＨＢ−１２２６１により生産されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する。本明細書において記載するように、用語「免疫複合体」は一般にモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）および抗ウイルスタンパク質複合体を意味し、ここで抗体は抗ウイルスタンパク質に共有結合または架橋している。さらに詳しくは、本発明の免疫複合体はモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を包含し、この抗体はヒト細胞上の表面ＣＤ４レセプターのＨＩＶ−１結合部位と反応する。ＴＸＵ−５／Ｂ５３はアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）または任意の誘導源からの生物学的同等物（そのサブユニットおよび誘導体を包含する）に共有結合する。本明細書において使用するとき、用語「ＰＡＰ」は任意の抗ウイルス性のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、またはそのサブユニット、変異型または突然変異体（サブタイプＰＡＰ− ＩＩ、ＰＡＰ−Ｓ、および組換えＰＡＰを包含する）を意味する。用語「抗ウイルス量」は、いったん免疫複合体がＣＤ４⁺ヒト細胞と会合したとき、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１の複製を阻害する量を意味すると定義される。本発明は、また、ＨＩＶ感染、ＡＲＣまたはエイズに悩む患者を本発明の免疫複合体で治療することからなる、哺乳動物の細胞におけるＨＩＶの複製を不活性化または阻害する方法』と差し替えします。明細書第１３頁第２０行〜第１５頁第６行の「抗Ｔ細胞特異的…エイズに」を『抗Ｔ細胞特異的免疫複合体の低いｉｎｖｉｖｏ安定性により妨害されてきた。結局、ｉｎｖｉｖｏにおけるＴ細胞特異的ＰＡＰ免疫複合体の治療的濃度を達成することができなかった。たとえば、米国特許出願第０７／９７９，４７０号明細書に開示されているＧ１７．２（抗ＣＤ４）−ＰＡＰ免疫複合体は、ヒトエイズのＳＣＩＤマウスのモデルにおいて検出可能な抗ＨＩＶ−１活性を示さなかった。Ｃ．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体の製造および精製本発明の好ましいＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体は、有効抗ウイルス量のＰＡＰ分子をＴＸＵ−５／Ｂ５３の各分子に結合させることによって形成される。たとえば、本発明の実施において有用な試薬は、それぞれ、ＴＸＵ−５／Ｂ５３分子当たり１つおよび２つのＰＡＰ分子を有するＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ種の約１：１混合物である。下記の実施例２〜４において使用される特定のＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰ免疫複合体は、米国特許第４，８３１，１１７号明細書（Ｕｃｋｕｎ）に記載されているように、ＴＸＵ−５／Ｂ５３ＭｏＡｂをＰＡＰに結合させることによって製造される。ＴＸＵ−５／Ｂ５３を分泌するハイブリドーマは、ＡＴＣＣから表示ＨＢ−１２２６１で入手可能である［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州２０８５２ロックビレ、パークラウンドライブ１２３０１）に１９９７年１月１０日に寄託された］。ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの製造および精製に関するそれ以上の情報は、実施例１において見出すことができる。しかしながら、この分野において開示される他の手段、たとえば、米国特許第４，３６３，７５８号（Ｍａｓｕｈｏ他）、米国特許第５，１６７，９５６号（Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｊｒ．他）および米国特許第４，３４０，５３５号（Ｖｏｉｓｉｎ他）明細書に記載されている手段により、ＴＸＵ−５／Ｂ５３を有効量のＰＡＰに結合させることができる。たとえば、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）に加えて、４−スクシニミジルオキシカルボニル−メチル−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、およびＮ−スクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）を結合剤として使用することができる。Ｄ．ＴＸＵ−５／Ｂ５３−ＰＡＰの投与のモード本発明の免疫複合体は医薬組成物として処方し、単独で、あるいは薬学上許容される担体またはベヒクルと組み合わせて有効量の１または２以上のこれらの薬剤を含んでなる単位投与形態の組合わせで、エイズに』と差し替えします。請求の範囲を次のとおり差し替えします。『請求の範囲１．有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、またはその生物学的同等物、サブユニット、変異型または突然変異体に結合したモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を含んでなるＨＩＶ感染治療用免疫複合体。２．前記ＴＸＵ−５／Ｂ５３抗体がハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣＨＢ−１２２６１により産生される、請求項１に記載の免疫複合体。３．ＨＩＶ感染の治療に有効な薬剤を製造するために、モノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３またはそのＣＤ４抗原反応性誘導体に結合した、有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはその生物学的同等物、サブユニット、突然変異体、変異型または遺伝子操作された組換えバージョンを含んでなる免疫複合体の治療的に有効量を使用する方法。４．前記モノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３がハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣＨＢ−１２２６１により産生される、請求項３に記載の免疫複合体。５．前記薬剤が非経口投与に適合する、請求項３に記載の方法。６．前記免疫複合体を薬学上許容される液状担体と組み合わせる、請求項５記載の方法。７．前記液状担体が等張生理食塩水を含んでなる、請求項６に記載の方法。８．前記薬剤が静脈内投与に適合する、請求項５に記載の方法。９．前記免疫複合体を有効量の抗ＨＩＶヌクレオシド類似体と組み合わせて使用する、請求項３に記載の方法。１０．前記抗ＨＩＶヌクレオシド類似体が逆転写酵素インヒビターである、請求項９に記載の方法。１１．前記抗ＨＩＶヌクレオシド類似体がジドブジンである、請求項１０に記載の方法。』【手続補正書】【提出日】１９９８年７月２７日（１９９８．７．２７）【補正内容】請求の範囲１．有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、またはその生物学的同等物、サブユニット、変異型または突然変異体に結合したモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を含んでなるＨＩＶ感染治療用免疫複合体。２．前記ＴＸＵ−５／Ｂ５３抗体がハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣＨＢ−１２２６１により産生される、請求項１に記載の免疫複合体。３．ＨＩＶ感染の治療に有効な薬剤を製造するために、モノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３またはそのＣＤ４抗原反応性誘導体に結合した、有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはその生物学的同等物、サブユニット、突然変異体、変異型または遺伝子操作された組換えバージョンを含んでなる免疫複合体の治療的に有効量を使用する方法。４．前記モノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３がハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣＨＢ−１２２６１により産生される、請求項３に記載の方法。５．前記薬剤が非経口投与に適合する、請求項３に記載の方法。６．前記免疫複合体を薬学上許容される液状担体と組み合わせる、請求項５記載の方法。７．前記液状担体が等張生理食塩水を含んでなる、請求項６に記載の方法。８．前記薬剤が静脈内投与に適合する、請求項５に記載の方法。９．前記免疫複合体を有効量の抗ＨＩＶヌクレオシド類似体と組み合わせて使用する、請求項３に記載の方法。１０．前記抗ＨＩＶヌクレオシド類似体が逆転写酵素インヒビターである、請求項９に記載の方法。１１．前記抗ＨＩＶヌクレオシド類似体がジドブジンである、請求項１０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ０７Ｋ 16/10 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、またはその生物学的同等物、サブユニット、変異型または突然変異体に結合したモノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３を含んでなるエイズ治療用免疫複合体。２．前記ＴＸＵ−５／Ｂ５３抗体がハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣにより産生される、請求項１に記載の免疫複合体。３．エイズの治療に有効な薬剤を製造するために、モノクローナル抗体ＴＸＵ −５／Ｂ５３またはそのＣＤ４抗原反応性誘導体に結合した、有効抗ウイルス量のアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはその生物学的同等物、サブユニット、突然変異体、変異型または遺伝子操作された組換えバージョンを含んでなる免疫複合体の治療的に有効量を使用する方法。４．前記モノクローナル抗体ＴＸＵ−５／Ｂ５３がハイブリッド細胞系統ＡＴＣＣにより産生される、請求項３に記載の免疫複合体。５．前記薬剤が非経口投与に適合する、請求項３に記載の方法。６．前記免疫複合体を薬学上許容される液状担体と組み合わせて投与する、請求項５記載の方法。７．前記液状担体が等張生理食塩水を含んでなる、請求項６に記載の方法。８．前記薬剤が静脈内投与に適合する、請求項５に記載の方法。９．前記免疫複合体を有効量の抗ＨＩＶヌクレオシド類似体と組み合わせて使用する、請求項３に記載の方法。１０．前記抗ＨＩＶヌクレオシド類似体が逆転写酵素インヒビターである、請求項９に記載の方法。１１．前記抗ＨＩＶヌクレオシド類似体がジドブジンである、請求項１０に記載の方法。