KR0131323B1 - Bu-3608을 함유한 인체면역결핍 바이러스에 대한 항바이러스 조성물 - Google Patents

Abstract

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Description

BU-3608을 함유한 인체면역결핍 바이러스에 대한 항바이러스 조성물

본 발명은 AIDS나 또는 pre-AIDS(임파선증)와 같은 HIV 감염 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 AIDS를 일으키는 바이러스인 HIV(HTLV-Ⅲ 및 LAV라고도 알려져 있음)에 감염된 동물숙주에서 BU-3608 화합물을 함유하는 조성물을 약리적으로 유효한 항바이러스 양만큼 투여하는 것에 관한 것이다.

인체면역결핍 바이러스(HIV)는 인체 T4 임파구에 대해 세포변성적인 새로이 인식된 레트로바이러스이다. 이 바이러스는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 및 AIDS-관련 콤플렉스(ARC)의 병원체인 것으로 믿어지고 있다. 비록 여러가지의 항바이러스제제; 리바비린, HPA-23, 슈라민 및 포스포노 포르메이트와 같은 제제들이 AIDS 치료에 시험되고 있으나, 이들의 임상효과는 적절한 것으로 사료되지는 않고 있다. 최근, 뉴클레오사이드 동족체, 3-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT)이 AIDS 환자의 수명을 연장시키고, 면역결핍에 수반되는 갖가지 증상들을 개선시킨다는 것이 입증되어, 어떤 AIDS 환자를 치료하는데 AZT를 사용하는 것이 정부당국에 의해 인가되었다. AZT는 감염된 세포에 있어서 바이러스 RNA를 DNA로 전환시키는 바이러스 효소인 역전사효소를 저해함으로써 그 기능을 발휘하는 것으로 사료된다. AZT의 선택성은 생체외에서 비교적 높고, AZT는 HIV 감염에 의한 바이러스 항원의 발현 및 세포손상을 억제한다. 그러나, 일단 HIV에 의해 감염되고 프로바이러스 DNA가 세포의 DNA로 삽입되면, AZT는 바이러스 생성을 억제하지 못한다. AZT는 세포 대 세포감염을 일으키는 바이러스 생산세포와 T4-양성세포와의 세포융합을 억제하지 못한다.

생육중인 세포계에서 HIV 증식을 방지할 수 있는 것으로 밝혀짐에 따라 AIDS 및 이 바이러스에 의한 감염으로 인한 기타 질병을 치료하는데 효과적일 것으로 여겨지는 BU-3608 화합물은 각각 1987년 11월 2일 및 1988년 6월 7일자 미합중국 특허출원 제115,273호와 203,776호에 기재된 방법에 따라 제조하며 이 출원들은 본 명세서에 그 전부를 참고 삽입하였다. 몇가지 대표적인 BU-3608 화합물의 구조를 표 1에 도시하였다. 화합물 제28567호, 28747호 및 28634호는 American Type Culture Collection에 기탁번호 제ATCC 53557호와 53646호로 각각 기탁된 미생물 Actinomadura hibisca 균주 No. P157-2호와 균주 No. Q278-4호를 이용하여 발효시켜 생산한다. 이 종들중 세번째 균주인 균주 No. P157-2-A-2660은 화합물 제28786호와 28787호를 생산하는데 바람직하며 이 화합물은 American Type Culture Collection에 기탁번호 제ATCC 53762호로 기탁된 이 미생물을 미합중국 특허출원 번호 제115,273호에 기재된 방법에 따라 발효시켜 얻을수 있다. 화합물 제28567호의 퀴논이민 유도체의 제조는 화합물 제28759호의 경우와 같이 본 명세서에 기재되어 있다. 전술한 물질들이 단순포진 바이러스 타잎 Ⅰ (HSVI)과 인플루엔자 바이러스 A에 대해서 항바이러스 활성을 갖는다는 것은 전부터 알려져 있었지만 본 출원발명에 기재된 바와 같은 항 HIV 활성에 대한 발견은 예기치 못한 바였다. 본 발명의 특히나 놀랍고도 중요한 측면은 강력한 항 HIV 특성을 갖는 이 BU-3608 화합물이 종래의 많은 항 HIV 제제의 흔한 특성인 역전사효소에 대한 심각한 저해 작용을 나타내지 않는다는 것이다.

본 발명에 관련된 BU-3608 화합물은 프로바이러스 DNA나 또는 바이러스 자체의 세포대 세포감염을 방지함으로써 작용하는 것으로 믿어지기 때문에, 바이러스 제거후 면역계가 자체를 재수립할 회복력만 충분히 보유한다면 어떠한 단계에 처해 있는 AIDS 환자에게도 BU-3608 화합물을 투여할 수 있을 것이다. 바이러스, 또는 프로바이러스 DNA를 지니는 세포들이 BU-3608 화합물의 존재하에서는 신선한 세포를 감염시키지 못하기 때문에, 치료가 행해지기 시작하는 때의 질병의 단계는 중요한 것으로 생각되지 않는다. BU-3608 화합물의 투여는 바이러스 또는 프로바이러스 DNA가 존재하는한 치료적 또는 예방적 처리이다. 이 독특한 특성은 BU-3608 화합물이 역전사 효소를 억제함으로써 작용하거나 또는 본 발명에 따른 BU-3608 화합물과는 다른 기작으로 작용하는 뉴클레오사이드 동족체 또는 AZT와 같은 AIDS 치료에 이용되는 기타 항바이러스 제제들과 배합되어 본 발명에 따라 이용되기에 적합하게 만든다.

투여량 및 투여

마우스에게 정맥 및 근육투여를 1회 실시한 후 화합물 제28567호의 급성독성 시험을 하였다. 정맥투여 후 LD₅₀은 140㎎/㎏이었고; 근육투여 400㎎/㎏ 후에는 독성의 징후가 나타나지 않았다.

동물과 사람에서의 HIV 감염 치료를 위해, 정맥, 근육, 경구, 비강, 및 국소 투여와 같은 허용된 투여경로로 BU-3608 화합물을 항바이러스 유효량만큼 투여할 수 있으나 투여경로를 상기예로 한정하는 것은 아니다. 비경구투여용 조제에는 멸균수용액 또는 비수용액, 현탁제 또는 유제가 포함된다. 이들은 또한 사용직전 멸균수, 생리식염수 또는 기타 멸균된 주사용 매질에 용해시킬 수 있는 멸균고상 조성물 형태로 제조할 수도 있다. 경구용 조제는 정제, 절라틴 캡슐제, 과립제, 함당정제, 시럽제등의 형태일 수 있다. 국소투여를 위해, 이 화합물을 로션, 연고, 겔, 크림, 고약, 정기제 등에 혼합시킬 수 있다. 약물조제분야의 기술에 숙련된 자들에게 일반적으로 알려진 방법을 이용하여 단위 복용형태를 제조할 수 있다.

HIV에 감염된 숙주를 BU-3608 화합물로 치료하고자 할 때, 실제 사용되는 바람직한 투여경로 및 투여량은 이러한 감염치료에 숙련된 주치의의 자유재량에 따른다는 것과, 병원체, 항생제에 대한 그의 감수성, 위증도 및 감염부위, 연령, 체중, 배설률과 같은 환자의 고유특성, 동시에 처리된 약물, 및 일반적인 물리조건에 따라 변화할것임을 이해하여야 할 것이다. 숙련된 의사는 특정 투여량을 결정하는 지침으로서 전술한 독성정보 및 다음의 세포배양 실험에서 나타난 바와 같이 세포독성은 없으면서 항바이러스 효과는 있는 농도를 이용할 것이다.

항-HIV 활성의 입증

세포변성 효과의 저해

본 발명의 화합물의 효용을 입증하기 위해 HTLV-Ⅲ 바이러스에 감염된 세포들을 시험 화합물로 처리하는 세포배양계를 사용할 수 있다. Harada, S.등의 Virology(146권, pp 272-281(1985))에 기재된 세포주 MT-4가 적합하다. 이 세포주는 HTLV-Ⅲ를 빠르고 효율적으로 복제하여 세포용해를 일으킨다. 이러한 특성들은 HTLV-ⅢB의 검색을 쉽게해주어, 실험실에서 항-AIDS 유용성을 입증하는 실행가능한 시스템을 제공해준다.

세포주

MT-4 세포를 37℃에서 완전배지중에서 유지시킨다. 실험을 개시하기 이틀전에, 트리판 블루 염료 배제법을 이용하여 생세포 수를 세고 농도를 30×10⁴세포/mL로 조정한다.

바이러스 감염 절차

MT-4 세포의 바이러스 감염은 감염의 다중도(MOI : multiplicity of infection)를 0.002로하여 행한다. MT-4 세포(60×10⁴세포/mL)를 바이러스 조제와 1 : 100 희석비율로 혼합한 다음 바이러스가 흡착되도록 37℃에서 1시간동안 정치시킨다. 흡착 후, HTLV-ⅢB에 감염된 MT-4 세포를 1회 세척하고 완전배지로 재현탁시킨다.

바이러스 조제

보체를 제거한 10% 송아지 태아혈청(FCS), 페니실린 100IU/mL, 및 스트렙토마이신 100mcg/mL가 보강된 RPMI 1640 배지(완전배지)에서 30×10⁴세포/mL의 농도로 MOLT-4/HTLV-ⅢB 세포를 조제하여 37℃에서 4일간 배양한다. 1500×g로 세포를 10분간 원심분리시킨 후, MOLT-4/HTLV-ⅢB 세포배양체의 상등액을 0.22㎛ 밀리포어 막을 통해 여과시켜 바이러스 조제를 얻은다음 세분하여 사용하기 전까지 -80℃에서 1.0mL 단위로 보관한다. 이 바이러스 조제의 역가는 6×10⁵PFU/ml(PFU, plaque forming units : 플라크 형성단위)이다.

시험물질 처리

디메틸술폭시드(DMSO)에 시험물질을 용해시킨다음 이 용액을 완전배지로 10, 5.0, 2.5, 및 1.25mcg/ml로 희석하여 시험용액을 만든다. HTLV-ⅢB에 감염된 MOLT-4 세포와 감염되지 않은 MOLT-4 세포의 매치(matched)부분을 60×10⁴세포/mL로 조정하고 동부피의 희석 시험용액과 혼합하여 최종농도 30×10⁴세포/mL로 하고, 시험물질은 5.0, 2.5, 1.25 및 0.63mcg/mL로 한다. 항-HIV 활성을 측정하기 위하여 시험배지중에 생존해 있는 생세포의 수를 세포가 감염된 후 제3일과 제6일에 트리판 블루 염료-배제법으로 측정한다.

HIV 항원 발현의 저해

여러농도의 화합물이 함유된 배지로 배양시킨 후, 감염된 MT-4 세포중의 바이러스-특이 항원의 발현율을 감염후 제3일과 6일에 간접 면역형광법(IF)으로 측정할 수 있다. -20℃에서 슬라이드 글래스상에 세포를 메탄올로 고정시키고 1 : 1,000-희석 항-HIV 양성 인체혈청(IF 역가, 1 : 4,096)과 함께 37℃에서 30분간 정치시킨다. 이 조제물을 인산완충염수로 15분간 세척한 다음, 세포를 37℃에서 30분간플루오레신 이소티오시아네이트-결합토끼의 항-인체 면역글로불린 G(Dakapatts A/S, 코펜하겐, 덴마크)와 함께 정치 시킨 후, 인산완충염수로 다시 세척한다. 최소한 500개의 세포시료가 형광 현미경하에서 계수되며, IF-양성 세포의 백분율을 계산한다.

HTLV-Ⅲ 특이 항원을 Popovic, M. 등의 Science 224권, pp. 497-500(1984)에 기재된 바와같이 염색한다. 감염 후 제3일과 6일에, HTLV-ⅢB 감염 MT-4 세포를 도말하고, 건조시킨 다음 냉메탄올로 3분간 고정시킨다. 다음 이 고정세포를 37℃에서 1 : 1000 희석된 항-HTLV-Ⅲ 양성 인체혈청 (IF 역가, 1 : 4096)과 함께 30분간 정치시킨다. 다음 이 조제를 인산완충염수(PBS)로 15분간 세척한다. 플루오레신-이소티오시아네이트 결합 항-인체 IgG(Dakopatts A/S, 코펜하겐, 덴마크)를 도포하고, 37℃에서 30분간 정치시켜 PBS로 다시 세척한다. 세포들을 형광 현미경하에서 시험하여 최소한 500개의 세포 시료로 부터 IF-양성세포의 백분율을 산출한다.

세포융합에 미치는 저해효과

세포대 세포감염을 야기시키는 세포융합에 미치는 영향 및 거대세포 생성을 다음과 같이 시험할 수 있다.

MOLT-4와 그의 바이러스- 생산 세포인 MOLT-4/HTLV-ⅢB를 세포수 1 : 1의 비율로 혼합하고, 여러농도의 화합물이 함유된 배지로 최종농도 5×10⁵세포/ml로 조정한다음 CO₂인큐베이터 내에서 10시간 동안 정치시킨다. 정치 후, 세포크기 분포를 세포 멀티사이저(Coulter Electronics Ltd., 루턴, 영국)로 측정하였다. 트리판 블루염료 배제법으로 생세포를 계수한다. 거대세포 형성을 상 대비 현미경하에서 관찰한다. 직경이 3 내지 100μm인 입자가 공-배양체에서 관찰되었다. 직경이 9μm가 넘는 입자들만을 세포로 간주한다.

MOLT-4 또는 MOLT-4/HTLV-ⅢB의 각 배양체에 있어서의 세포크기는 비슷하고, 직경이 12-14μm인 세포입자의 비율은 각 배양체의 경우 실제로 동일하다. 직경이 20μm가 넘는 세포입자의 백분율은 MOLT-4 세포배양체에서는 2.7%, MOLT-4/HTLV-ⅢB 세포배양체에서는 2.4%였다. 직경이 50μm가 넘는 세포입자들이 공-배양체에서 관찰되었으며, 직경이 20μm가 넘는 세포입자의 비율은 11.8%였다. 이것은 비감염 MOLT-4 세포에 대한 MOLT-4/HTLV-ⅢB 세포의 세포대 세포융합에 의한 감염성을 반영하는 것이다. 이 시험방법은 시험물질이 이효과를 방지하거나 감소시키는 능력을 측정한다.

시험화합물

본 발명에 따라 표 1의 구조로 나타낸 다음의 BU-3608 화합물들의 용도는 전술한 방법에 의해 입증할 수 있다.

1. 공동계류중인 T. Oki등의 1987년 11월 2일자 미국 특허출원 제115,273호

2. Actinomadura hibisca P157-2-A-2660(ATCC No. 53762)의 발효 브로쓰로부터 상기 출원 제115,273호에 기재된 방법에 따라 회수

3. 다음에 나타낸 제조공정

화합물 제28759호의 제조공정

화합물 제28567호의 염산염(500mg)을 빙욕중의 8N 메탄올 암모니아(200mL)에 용해시키고 이 용액을 4℃에서 65시간 동안 교반시켰다. 용액을 농축시킨 후, 잔사를 H₂O(200ml)에 용해시키고, pH 3.0으로 조정한 다음 Diaion HP-20(300ml) 컬럼에 부하시켰다. 컬럼을 물로 세척하고 80% 아세톤 수용액(pH 3.0)으로 용출시켰다. 자주색 용출물을 증발시켜 소망하는 화합물을 염산염으로서 얻었다. 이 염산염(200mg)의 수용액을 pH 7.0으로 조정하여 소망하는 퀴논이민(6mg)의 즈비터이온 형태를 얻었다. 융점 150-155℃(분해);

결과

제1도는 MT-4 세포에 미치는 HIV 바이러스의 세포변성 효과의 화합물 제28567호에 의한 저해를 나타낸다. 먼저, 흰색막대는 비감염 MT-4 세포에 미치는 화합물의 세포독성의 결여를 나타낸다. 제28567의 농도가 30μg/ml을 넘은 경우에만 3일 또는 6일후 관찰되는 세포수가 현저하거나 지속적으로 감소되며, 120μg/ml에서조차 60-70%의 세포가 생존해있다.

제1도의 빗금친 막대는 시험배지중 여러 농도의 화합물 제28567호의 존재하에서 3일 또는 6일후 생존한 HIV-감염 세포의 수를 나타낸다. 0농도값은 이 시험계에서 세포에 대한 바이러스의 치사율을 나타내는 것이다. 실제로 MT-4 세포는 화합물 제28567호의 농도가 3.5μg/ml 이상일 때 완전히 보호된다.

제2도는 MT-4 세포를 이용한 동일한 시험계에서의 화합물 제28759호의 평가를 나타낸다. 28567호에서와 비슷한 결과가 제28759호에서 얻어졌다.

제3도 및 제4도는 3일 또는 6일간 배지중에서 배양시켰을 때 HIV 항원을 발현시키는 MT-4 세포의 백분율을 나타낸다. 배지중의 시험물질의 농도를 횡축에 나타내었다. 보호적인 시험약물의 부재시에는 모든 세포(100%)가 6일이내 양성이 되었다. 화합물 제28567호와 28759호는 3.5μg/ml 이상의 농도에서 바이러스 항원양성 세포의 수를 1% 미만으로 감소시켰다.

제5도는 세가지 입자크기 분포곡선 군을 나타내며 여기서 입자수는 종축에, 입경은 횡축에 μm으로 나타낸다. 각 곡선아래의 면적중 일부분을 색칠하여 직경이 20μm가 넘는 입자비율을 나타내었다.색칠된 부분은 거대세포, 융합세포(fused cell) 또는 융합세포(syncythia)를 나타낸다. 곡선 A는 MOLT-4 세포배양체의 크기분포 프로필로서, 세포의 2.4%가 직경이 20μm가 넘었다. 곡선 B는 MOLT-4/HTLV-ⅢB 배양체의 크기분포 프로필로서, 직경이 20μm가 넘는 세포는 2.4%였다. 곡선 C는 동량의 MOLT-4 세포와 MOLT-4/HTLV-ⅢB 세포와의 혼합 배양체의 입자크기 분포를 나타내는 것으로 직경이 20μm가 넘는 11.8%의 세포가 세포융합을 통해 세포 대 세포 감염되었음을 나타낸다.

제6도는 MOLT-4 및 MOLT-4/HTLV-ⅢB 의 혼합 배양체의 세가지 입자크기 분포곡선군으로서 곡선 D의 경우, 배지에 덱스트란 50μg/ml 가 첨가되고; 곡선 E의 경우, 배지에 화합물 제28567호가 25μg/ml 가 첨가되었으며; 곡선 F의 경우, 배지에 화합물 제28759호가 25μg/ml 가 첨가된 것을 제외하고는 제5도의 곡선 C와 유사하다. 각각의 경우 입자 크기가 20μm가 넘는 비율이 11.8%인 값(제5도의 곡선 C)이 덱스트란황산염의 경우 1.9%(곡선 D), 화합물 제28567호의 경우 2.7%(곡선 E), 그리고 화합물 제28759호의 경우 4.4%(곡선 F)로 저하하였다. 이 결과들은 시험화합물이 HTLV-ⅢB 바이러스에 의한 MOLT-4 세포의 세포-융합을 방지하는 능력을 가졌음을 입증해준다.

제1도는 생세포수는 종축에, 배지중에 시험화합물의 농도는 횡축에 나타낸 막대 그래프임. 제1도는 배지중에서 생육된 MT-4 세포에 미치는 화합물 No. 28567의 효과를 나타낸다.

제2도는 생세포의 수를 종축에, 시험화합물의 농도는 횡축에 나타낸 막대그래프임. 제2도는 제1도와 유사하나 시험 결과는 화합물 No. 28759에 관한 것이다.

제3도는 역시 일련의 막대그래프를 포함하는데 종축에는 시험화합물의 농도를 달리하여 감염된 세포를 배양시켰을 때 배양체중 그 표면에 HIV 특이 항원을 갖는 배양세포의 백분율을 나타내었다. 시험화합물의 농도는 횡축에 나타내었다. 제3도는 화합물 No. 28567에 관한 시험결과를 나타낸다.

제4도는 면역형광시험(IF)으로 나타낸 HIV 특이 항원을 갖는 세포백분율 대 배지중 시험화합물의 농도를 표시한 막대그래프라는 점에서 제3도와 유사하다. 농도는 횡축에 나타내었다. 제4도는 화합물 No. 28759에 관한 시험결과를 나타낸 것이다.

제5도는 입자크기 분포를 나타내는 세가지 그래프로 이루어져 있는데 입자수는 종축에, 입자직경은 횡축에 나타내었다. 이 입자들은 배지중에 생육된 MOLT-4 생세포들로서 각각의 경우 직경이 20마이크로미터가 넘는 입자의 비율은 곡선 아래의 어두운 부분으로 나타내었으며 그 백분율은 여러 그래프에 나타나 있다. 제5도의 곡선 A와 B는 MOLT-4 세포주의 순수한 세포 배양체와 HTLV-ⅢB 감염 MOLT-4 세포주이다. 곡선 C는 동수의 MOLT-4 세포와 MOLT-4/HTLV-ⅢB 세포를 함유하는 혼합 배양체를 나타내는 것이다.

Claims (11)

1. BU-3608 화합물을 비독성 항바이러스 유효량만큼 함유함을 특징으로 하는 살아있는 민감한 생물학적 기질의 HIV 바이러스 감염 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 기질이 생체외에서 생육중인 세포 배양체인 것이 특징인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 기질이 생체외에서 생육중인 MT-4 세포의 세포 배양체인 것이 특징인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 민감한 기질이 HIV에 감염된 숙주 동물내에 있는 것이 특징인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 민감한 기질이 HIV에 감염된 인간내에 있는 것이 특징인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 BU-3608 화합물이 다음 일반식을 갖는 화합물 제28567호인 것이 특징인 조성물.

   

   (식중에서, R₁은 -CH₃(D)이며, R₃는 -NHCH₃이고, R₄는 크실로실기이며, R₆는 =O임)
7. 제1항에 있어서, 상기 BU-3608 화합물이 다음 일반식을 갖는 화합물 제28747호인 것이 특징인 조성물.

   

   (식중에서, R₁은 -CH₃(D)이며, R₃는 -NH₂이고, R₄는 크실로실기이며, R₆는 =O임)
8. 제1항에 있어서, 상기 BU-3608 화합물이 다음 일반식을 갖는 화합물 제28786호인 것이 특징인 조성물.

   

   (식중에서, R₁은 H이며, R₃는 -NHCH₃이고, R₄는 크실로실기이며, R₆는 =O임)
9. 제1항에 있어서, 상기 BU-3608 화합물이 다음 일반식을 갖는 화합물 제28787호인 것이 특징인 조성물.

   

   (식중에서, R₁은 H이며, R₃는 -NH₂이고, R₄는 크실로실기이며, R₆는 =O임)
10. 제1항에 있어서, 상기 BU-3608 화합물이 다음 일반식을 갖는 화합물 제28634호인 것이 특징인 조성물.

    

    (식중에서, R₁은 -CH₃이며, R₃는 -NHCH₃이고, R₄는 -H이며, R₆는 =O임)
11. 제1항에 있어서, 상기 BU-3608 화합물이 다음 일반식을 갖는 화합물 제28759호인 것이 특징인 조성물.

    

    (식중에서, R₁은 -CH₃이며, R₃는 -NHCH₃이고, R₄는 크실로실기이며, R₆는 =NH임)

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