DE3724951A1 - Arzneimittel, enthaltend modifizierte desoxyribonukleinsaeure und dessen verwendung - Google Patents

Description

Das Naturprodukt Desoxyribonukleinsäure (DNA) kann sowohl durch physikalische als auch chemische Methoden modifiziert werden. Diese seit langem bekannten Modifikationen umfassen folgende Veränderungen an der DNA:

(1) physikalische Modifikationen, wie Hitzedenaturierung, Behandlung mit Komplexen wie EDTA (Äthylendiamin­ tetraacetat, Dinatriumsalz) als auch durch Zentrifugation im hohen Schwerefeld (siehe R. K. Zahn et al., Biochem. Z. 342: 502, 1965).

Aus dieser Gruppe wurde EDTA-behandelte DNA (ab jetzt abgekürzt: EDTA-DNA) ausgewählt zur Untersuchung über deren pharmakologische Wirkung. Die Herstellung von EDTA-DNA wurde in der Publikation von R. K. Zahn et al. (s. o.) beschrieben.

(2) chemische Modifikationen, wie Behandlung mit alkylierenden Agenzien, mit Schwermetallen (die beiden letzteren Prozesse führen u. a. zu DNA-Strangvernetzung) als auch durch selektive Hydrolyse (wie: milde Säurehydrolyse, die zur Abspaltung von Purinbasen führt, oder Hydrazinolyse, die zur Abspaltung von Pyrimidinbasen führt). Die Methoden, die zur chemischen Modifikation von DNA angewendet werden sind u. a. zusammengefaßt bei: R. K. Zahn et al., Biochem. Z. 341: 502, 1965; R. K. Zahn et al., Biochem. Z. 344: 26-48, 1966; C. Tamm et al., J. Biol. Chem. 195: 49, 1952 und E. Chargaff et al., Biochim. Biophys. Acta 76: 149, 1963. Aus dieser Gruppe von modifizierten DNAs wurde die Apurinsäure (ab jetzt abgekürzt APA) zur weiteren Prüfung ausgewählt. Die Herstellung von APA wurde bei C. Tamm et al. (s. o.) und bei C. Tamm und E. Chargaff, J. Biol. Chem. 203: 689, 1953 beschrieben.

Native DNA besitzt keine pharmakologischen Eigenschaften speziell bei der Hemmung von Retroviren wie HIV (human immunodeficiency virus) oder bei der Induktion von Lymphokinen (wie Interferon): Es wird nun beschrieben, daß modifizierte DNAs diese eben genannten Eigenschaften besitzen. Diese Eigenschaften waren bisher unbekannt. Die nun beschriebene Erfindung läßt den Einsatz modifizierter DNAs bei der Behandlung der Immunschwäche AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) der ARC (AIDS-related Complex) als sinnvoll erscheinen. Bisher war lediglich bekannt, daß modifizierte DNAs, speziell APA einen schwachen antitumoralen Effekt in vitro (W.E.G. Müller et al., Cancer Res. 33: 2330, 1973) als auch in vivo (D. M. Goldenberg und B. Heicke, Verh. Deutschen Ges. f. innere Medizin 77: 1333, 1971) zeigt. Es war nicht naheliegend modifizierte DNAs zur Bekämpfung des o. g. Virusbedingten Krankheitsbildes einzusetzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen erfolgversprechenden Weg zur Bekämpfung von AIDS bzw. ARC mit Hilfe von modifizierten DNAs aufzuzeigen.

AIDS wird durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV), oder auch genannt Human-T-Cell Leukemia/Lymphotropic Virus vom Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV) verursacht. HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen AIDS in Form des Kaposi-Sarcoms (KS) oder des ARC sich klinisch am schwersten manifestiert. Eine wirksame therapeutische Behandlung von AIDS oder ARC war bis jetzt noch nicht möglich.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß modifizierte DNAs zur Bekämpfung von AIDS oder des ARC sehr geeignet sind. Basis dieser Erfindung ist der Nachweis, daß modifizierte DNAs (1) einen anti-HIV Effekt und (2) einen immunmodulierenden Einfluß bewirken.

Die erfindungsmäßig zur Anwendung kommenden Verbindungen werden im allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als Dosiseinheiten vorliegen und systemisch also oral, rektal oder parenteral (intramuskulär, intravenös und subkutan), verabreicht werden können.

Die Mittel enthalten eine zur Behandlung, Eliminierung, Linderung oder Verbesserung von AIDS oder ARC wirksame oder immundefekt-beseitigende Menge wenigstens einer Verbindung aus der Klasse der modifizierten DNAs, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.

Wenn das Mittel in einer Form einer Dosiseinheit vorliegt, enthält diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung.

Die pharmazeutischen Mittel können zur oralen Verabreichung in fester Form, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulver, oder in flüssiger Form, beispielsweise als wäßrige oder ölige Suspension, Sirup, Elixier, Lösung oder mit Flüssigkeit gefüllte Kapseln vorliegen.

Bevorzugte orale Mittel liegen in der Form von Tabletten oder Kapseln vor und können übliche Träger, wie Bindemittel (z. B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kartoffelstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglykol oder Siliciumoxid), Disintegrationsmittel (z. B. Stärke) und Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat), enthalten.

Mittel zur parenteralen Verabreichung liegen im allgemeinen in Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin, Propylenglykol oder Polyäthylenglykolen oder einer Mischung davon besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.

Pharmazeutische Mittel zur rektalen Verabreichung liegen in Form von Suppositorien vor, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen einer geeigneten Suppositoriengrundlage, wie Kakaobutter, gehärtete Fette, Polywachse oder Polyethylenglykole, in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-% einverleibt sind.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt anhand üblicher Verfahren, beispielsweise durch Tablettieren, Einverleiben der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in eine Suppositoriengrundlage, Sterilfiltration und Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Bezylalkohol oder Natriumhydroxid zur Einstellung des pH.

Das Verfahren zur Behandlung von AIDS oder ARC umfaßt die Verabreichung einer therapeutischen (antiviral oder immunomodulierenden oder prophylaktisch) wirksamen Menge modifizierter DNA davon an einen Patienten, der dieser Behandlung bedarf.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungssschema können am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter, das Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und die Schwere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im allgemeinen beträgt die Tagesdosis 2-20, vorzugsweise 3-10, insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht.

Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen, beispielsweise 4 bis 8 Wochen.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wirken auf vielfältige Weise gegen das Human Immunodeficiency Virus (HIV) und sie wirken stimulierend auf das Immunsystem, so daß die körpereigenen Abwehrkräfte gegen AIDS, ARC und verwandte Erkrankungen gestärkt werden. Diese Verhandlungen sind deshalb zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung der durch das AIDS-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.

Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen wird nachfolgend am Beispiel von APA und EDTA-DNA anhand pharmakologischer in vitro-Testsysteme untersucht.

Beispiele: Pharmakologische Wirkungen von APA und EDTA-DNA Beispiele 1) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von APA und EDTA-DNA 2) Molekularer Wirkmechanismus von modifizierten DNAs auf die Vermehrung des AIDS-Virus HIV 3) Nachweis der immunmodulierenden Aktivität von APA und EDTA- DNA 1) Nachweis der anti-HIV-Aktivität von APA und EDTA-DNA

Dabei kam die Zellinie H9 zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte OKT4+ T-Zellinie handelt, in der sich das AIDS- Virus der Isolatbezeichnung HTLV-IIIB (zugehörig zu HIV-1) vermehrt (M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed und R. C. Gallo; Science 224, 497-500 (1984)).

Versuchsdurchführung

Reinigung von HIV-1 Reverser Transkriptase und Assaybedingungen:
Die für die vorliegenden Versuche verwendete HIV-1 Reverse Transkriptase (Herstellung nach dem Verfahren von: P. S. Sarin, Y. Taguchi, D. Yun, A. Thornton, R. C. Gallo, B. Oeberg; Bichem. Pharmacol. 34, 4075-4079; 1985) wurde mittels sequentieller Chromatographie an DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Hydroxylapaptit gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde in 50 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl-aminomethan) (pH 7.5), 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,01% Triton X-100 und 20% Glycerin aufbewahrt. Die Versuchsansätze auf Reverse Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 10 mM MgC12, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01 Triton X-100 (C8H17-C6H4- (OCH2CH2)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d. i. Octylphenolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)15. (A)n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und 3H-Desoxythymidintriphosphat (3H-dTTP) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 5%iger TCA- Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Scintillationszähler bestimmt.

HIV-Infizierung von H9-Zellen

H9-Zellen (M. Popovic, M. G. Sarngadharan, E. Reed, R. C. Gallo, Science: 224, 497-500, 1984) wurden mit Polybren (im Handel erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 200 000 000 HTLV- III-Virusteilchen (isoliert aus H9-Zellenkulturen nach M. Popovic, vgl. oben) pro 4×100 000 H9-Zellen infiziert. Ein nicht mit Arzneimittel behandelter Teil dieser Proben wurde als positive Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den Testproben unterschiedliche Konzentrationen an zu testender Verbindung (APA oder dessen Derivate) gegeben wurden. Die HTLV- III Reverse Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie oben beschrieben analysiert.

Immunofluoreszenz-Assay

Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol : Aceton (1 : 1)- fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der Maus) gegen HTLV-III p17 (Gag-Protein mit MG=17 000) und p24 (Gag-Protein mit MG=24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln in den Zellen anzeigen. Die HTLV-III infizierten Zellen wurden mit oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert. Nach der Fixierung mit Methanol-Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der 0,25% Tripton X-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege- Antimaus IgG (Capell Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%iges Glycerin gegeben und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop bestimmt.

Untersuchungsparameter 1. Zellwachstum

H9-Zellen sowie mit HTLV-IIIB infizierte H9-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2×1 000 000 Zellen/ml Kulturmedium zum Beimpfen eines Kulturmediums verwendet. Nach 4 tägiger Inkubation betrug die Dichte der H9-Zellen 1,3× 1 000 000 Zellen/ml, während die Dichte der mit HTLV-IIIB infizierten H9-Zellen lediglich 0,5×1 000 000 Zellen/ml war, diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte.

Dann wurden Proben von H9-HTLV-IIIB-Zellen 0,2×1 000 000 Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von APA und EDTA-DNA behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß APA und EDTA-DNA in den Konzentrationen von zwischen 10 und 50 µg/ml die Wachstumsrate von H9-HTLV-IIIB-Zellen auf Werte steigert, die im Bereich der Kontrolle, nämlich der H9-Zellen ohne HTLV-IIIB liegen.

2. Inhibierung der Produktion von Reverser Transkriptase durch H9-HTLV-IIIB-Zellen, die mit APA und EDTA-DNA behandelt wurden

Es wurde untersucht, ob die 4tägige Zugabe von APA oder EDTA- DNA zu H9-HTLV-IIIB-Zellen die Produktion von HTLB-III-Viren einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der H9-HTLV-IIIB-Zellen, die nicht mit APA oder EDTA-DNA behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe von APA oder EDTA-DNA führte zu einer dosisabhängigen Verringerung der reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand. Bereits bei der Dosis von 10 µg/ml wurde eine beträchtliche Inhibierung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen sind deshalb in der Lage, die Virusreplikation beinahe vollständig bei Dosen zu inhibieren, bei denen verschiedene in vitro-Parameter, beispielsweise das Zellwachstum, praktisch nicht nachteilig beeinflußt werden.

3. Inhibierung der HTLV-IIIB p15 und p24 Expression in H9-HTLV- IIIB durch APA oder EDTA-DNA

Es hat sich gezeigt, daß APA eine stark inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p24 und p15 in infizierten H9- Zellen besitzt. Wenn die Target H9-Zellen mit dem HTLV-IIIB- Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung kultiviert worden, wurden die H9-Zellen infiziert und es kam, wie mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur Expression des p24 und p15-Proteins. Nach Inkubierung der H9-HTLV-IIIB-Zellen mit den zu testenden Verbindungen wurde ein beinahe vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß APA oder EDTA-DNA eine signifikante Reduktion der Expression der HTLV-III-Proteine p15 und p24 verursacht.

2) Molekularer Wirkmechanismus von modifizierten DNAs auf die Vermehrung des AIDS-Virus HIV

Der Wirkmechanismus der modifizierten DNAs als Inhibitor der HIV-Vermehrung wurde als Hemmung der Reversen Transkriptase erkannt. Dieses Enzym ist ein Schlüsselenzym bei AIDS-Viren. Eine Hemmung dieses Enzyms führt zu einem Stop der Virus- Vermehrung. Es wurde eine Selektivität der Hemmung im Vergleich zu den Säugetier-DNA Polymerasen ermittelt.

Isolierung der Säugetier-DNA Polymerasen.

Die DNA Polymerase-alpha wurde isoliert und partiell gereinigt aus Kälber-Thymus nach einem Verfahren von F. J. Bollum et al. (Methods in Enzymology 29: 70, 1974). Die spezifische Aktivität des Enzymes lag bei 2300 units/mg Protein. Die DNA Polymerase-beta wurde ebenfalls aus Kälber-Thymus gereinigt (L. M. S. Chang, J. Biol. Chem. 248: 3789, 1973). Die erhaltene spezifische Aktivität lag bei 54 000 units/mg. Die DNA Polymerase-gamma wurde aus Ratten-Leber-Mitochondrien gewonnen (A. Bolden et al., J. Biol. Chem. 252: 3351, 1977); als spezifische Aktivität wurde 12.1 units/mg ermittelt.

Isolierung der HIV-Reversen Transkriptase

Die HIV-1 Reverse Transkriptase wurde aus HTLV-IIIB- infizierten H9-Zellen durch aufeinanderfolgende Chromatographie an DEAE-Zellulose und Posphozellulose isoliert und angereichert (A. Vogel und P. Chandra, Biochem. J. 197, 553, 1981). Die spezifische Aktivität war 13.2 units/ml <(bei Benutzung des Template-Primers Poly(A).(dT)10< bzw. 54,9 units/mg <bei Benutzung des Template-Primers Poly(C).(dG)18< im Reaktionsansatz.

Eine Unit ist definiert als der Einbau von 1 nmol DNA-Vorstufe in die DNA pro 1 Std.

Nachweis der Enzymaktivitäten

Der Nachweis der DNA Polymerase alpha, beta und gamma, sowie der Reversen Transkriptase wurde genau so durchgeführt wie von E. M. Wondrak, J. Löwer und R. Kurth (J. Antimicrobial Chemotherap., im Druck, 1987) beschrieben. Als Template- Matrize wurde im Falle deer Reversen Transkriptase eingesetzt: Poly(A).(dT)10 oder Poly(C).(dG)18.

Ergebnis: Hemmung der verschiedenen DNA-Polymerasen durch modifizierte DNAs.

Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengefaßt. Die durch die modifizierten DNAs bewirkte Hemmung der Enzymaktivitäten erfolgte nach dem nicht-kompetitiven Hemmtyp. Die Bestimmungen wurden nach H. Lineweaver und D. Burk (J. Amer. Chem. Soc. 56: 408, 1934) durchgeführt. Als Hemmparameter ist in der Tabelle die Inhibitor-Konstante (Ki) angegeben; dieser Wert ist im Falle der erhaltenen nicht- kompetitiven Hemmung identisch mit dem 50% Hemmwert, der für das betreffende Enzym gefunden wird (M. Dixon und E. C. Webb. Enzymes. Longman, London; Seite 348; 1979).

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Ki-Werte für die Säugetierpolymerasen zwischen 140- bis 300mal unempfindlicher gegen APA und EDTA-DNA reagieren als die HIV-Reverse Transkriptase. Die Hemmung der Reversen Transkriptase ist 8 mal stärker wenn das Template-Primer-System Poly(A).(dT)10 im Gegensatz zu Poly(C).(dG)10 in das Testsystem eingesetzt wurde.

Dieses unerwartete Ergebnis zeigt, daß modifizierte DNAs mit hoher Selektivität die HIV-Reserve Transkriptase hemmen und läßt den Schluß zu, daß sie die HIV-Virusvermehrung dadurch hemmen.

3) Nachweis der immunmodulierenden Aktivität von APA und EDTA- DNA Kultivierung von menschlichen Peripheren Blut Lymphozyten

Periphere Blutlymphozyten wurden von gesunden Probanden nach der bekannten Ficoll-Hypaque Methode gewonnen. Nachdem sie gewaschen waren, wurden sie in einer Konzentration von 5 000 000 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum in 1 ml Ansätzen inkubiert (G. Leyhausen et al., Antimicrob. Agents Chemother. 26: 752, 1984).

Behandlung der Lymphozyten

Zur Bestimmung des Einflusses von modifizierten DNAs auf das Wachstumsverhalten von Lymphozyten wurde der Einfluß dieser Substanzen auf die Inkorporation von radioaktivmarkiertem Thymidin (3H-dThd) in die DNA bestimmt. Die Versuchsbedingungen wurden wie früher beschrieben, durchgeführt (G. Leyhausen et al., s. o.). Die 50% Hemmkonzentration, durch die die Inkorporationsrate von 3H- dThd auf 50% reduziert wird, wurde durch das Logit- Regressions-Verfahren bestimmt (L. Sachs. Angewandte Statistik; Springer Verlag, Berlin; 1984).

Der Einfluß von APA und EDTA-DNA auf die Produktion von Interferon-gamma (IFN-gamma) wurde wie folgt bestimmt. 1 ml- Kulturen wurden für 0-72 Std. in Anwesenheit verschiedener APA oder EDTA-DNA Konzentrationen alleine oder zusammen mit dem Mitogen Phytohaemagglutinin A (PHA) inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen abzentrifugiert, der Überstand gesammelt und der IFN-gamma-Titer bestimmt.

Interferon Nachweis

Die Menge an IFN-gamma wurde nach dem Verfahren von H. Gallati (J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 20: 907, 1982) auf der Basis eines Enzyme-Immuno-Assays bestimmt. In Kürze, 96er Kulturplatten wurden mit monoklonalen Antikörpern, gerichtet gegen IFN-gamma, beschichtet. Dann wurden 50 µl Kulturüberstand in die einzelnen Vertiefungen der Kulturplatten gegeben. Anschließend wurde Peroxidasemarkiertes anti-Mensch IFN-gamma hinzugegeben: Nach erfolgter Waschung wurde die Menge an gebundener Peroxidase bestimmt. Die Höhe der Peroxidase-Aktivität wurde über eine Eichkurve mit der IFN-gamma-Menge korreliert. Die IFN-gamma-Menge wird angegeben in NIH-units/ml Kulturüberstand.

Untersuchungsparameter 1) Einfluß von APA und EDTA-DNA auf die Inkorporationsrate von 3H-dThd in Lymphozyten

In Abwesenheit von APA und EDTA-DNA wurde in Lymphozyten eine Inkorporationsrate von 1300 Zerfälle pro Minute×1 000 000 Zellen gemessen.

Die ED50-Werte in den Ansätzen mit APA bzw. EDTA-DNA wurden wie folgt ermittelt:

modifizierte DNA
ED50 Wert
(µg/ml)
APA
167,4
EDTA-DNA	189,0

Bei Konzentrationen an APA bzw. EDTA-DNA unterhalb von 50 µg/ml wurden keine Effekte auf die Inkorporationsraten gemessen.

Diese Untersuchungsreihe zeigt, daß APA und EDTA-DNA erst in den o g. sehr hohen Dosen zytostatisch wirken.

2) Induktion von IFN-gamma in Lymphozyten-Kulturen nach Inkubation mit APA bzw. EDTA-DNA

Die Kulturen wurden wie folgt mit den modifizierten DNAs für 72 Std. behandelt:

Aus diesen Befunden wird deutlich, daß APA bzw. EDTA-DNA in dem sehr niedrigen Konzentrationsbereich von 0,05 bis 3 µg/ml signifikante Mengen an IFN-gamma induziert.

3) Induktion von IFN-gamma durch APA bzw. EDTA-DNA in Kombination mit dem Mitogen PHA

Auch diese Untersuchungen wurden in dem oben beschriebenen Lymphozyten-Ansatz während einer Inkubationsperiode von 72 Std. durchgeführt.

Aus diesen Experimenten muß der Schluß gezogen werden, daß modifizierte DNAs den IFN-gamma induzierenden Effekt von PHA potenzieren.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung Beispiele für pharmazeutische Mittel

In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann als Wirkstoff jeweils eine der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen einzeln oder im Gemisch mit einer anderen erfindungsgemäßen Verbindung eingesetzt werden.

Beispiel a
Tablettenformulierung
Wirkstoff|10 mg
Lactose	18 mg
Kartoffelstärke	38 mg
Gelatine	2 mg
Talkum	2 mg
Magnesiumstearat	0,1 mg

Beispiel b
Tablettenformulierung
Wirkstoff|10 mg
Kartoffelstärke	40 mg
Polyvinylpyrrolidon	5 mg

Die Tabletten werden mit einer gefärbten Zuckerschicht überzogen.

Beispiel c
Kapselformulierung
Wirkstoff|10 mg
Maisstärke	90 mg
Lactose	50 mg
Talkum	2 mg

Diese Mischung wird in Gelatinekapseln gefüllt.

Beispiel d
Flüssige orale Formulierung
Wirkstoff|2 g
Saccharose	250 g
Glucose	300 g
d.-Sorbit	150 g
Agar-agar	0,15 g
Methylparaben	0,5 g
Propylparaben	0,05 g
Geschmackstoff (Orangengeschmack)	10 g
Tartazin gelb @	Gereinigtes Wasser auf	1000 ml

Beispiel f
Flüssige orale Formulierung
Wirkstoff|2 g
Tragacanth	7 g
Glycerin	50 g
Saccharose	400 g
Methylparaben	0,5 g
Propylparaben	0,05 g
Geschmackstoff @	(Geschmack von schwarzer Johannisbeere) @	Roter Farbstoff Nr. 2C.E.184	0,02 g
Gereinigtes Wasser auf	1000 ml

Beispiel g
Flüssige orale Formulierung
Wirkstoff|2,4 g
Saccharose	400 g
Tinktur von Bitterorangenschalen	20 g
Tinktur von Süßorangenschalen	15 g
Gereinigtes Wasser auf	1000 ml

Claims (3)

1. Verwendung von chemisch und/oder physikalisch modifizierten Desoxyribonukleinsäuren (DNA) als Arzneimittel.

2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer chemisch und/oder physikalisch modifizierten DNA.

3. Verwendung einer physikalisch und/oder chemisch modifizierten DNA zur antiviralen und/oder immuntherapeutischen Behandlung von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) bzw. ARC (AIDS-related Complex).