KR100227095B1

KR100227095B1 - 항 hiv제

Info

Publication number: KR100227095B1
Application number: KR1019960703776A
Authority: KR
Inventors: 쇼조 쇼지; 쿠니오미 다치바나
Original assignee: 토미모토 요시히사; 니수이 세야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1994-01-26
Filing date: 1995-01-25
Publication date: 1999-10-15
Also published as: WO1995020388A1; CA2180732A1; KR970700032A; US5886000A; EP0830862A4; EP0830862A1

Abstract

(기술분야) 후천성 면역결핌증제 및 항HIV작용 증강제에 관한 것이다.

(해결하려고하는기술적과제) 본 발명은 안전성 및 효력이 우수한 AIDS 치료제의 제공.

(해결방법의 요지) Tat에 의한 항HIV제의 스크리닝 법에 의해 각종 화합물의 항HIV작용을 스크리닝하여 비타민 B₁유도체로서 널리 사용되고 있는 화합물(1)이 기존의 항HIV제에서 없는 작용기전으로 항HIV 증강 작용을 갖고 있어서 AIDS의 예방 및 치료에 유용함을 발견.

(구성) 티아민디술피드, 질산티아민디술피드, 인산티아민디술피드, 비스벤티아민, 비스부티티아민, 비시부티티아민, 알리티아민, 푸르술티아민 또는 옥토티아민과 같은 비타민 B₁류 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항HIV제, 항HIV 작용을 증강제 및 AIDS 예방 및 치료제.

(발명의 중요한 용도) 화합물(1) 또는 그의 염은 초기감염 세포에 대해서는 세포를 사멸시키지 않고 HIV의 증식을 억제하고, HIV를 지속적으로 산생하게된 지속산생 세포에 대해서는 세포살생 효과와 HIV 살생효과를 동시에 발휘하는 대단히 바람직한 성질을 갖기 때문에, 본 발명의 약제는 AIDS의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

항HIV제

AIDS는 HIV 감염을 원인으로 하는 질환이며, 그 환자수는 1983년에 미국에 발견된 이래 급속히 증가하고 있다. 이러한 AIDS의 치료에는 항HIV제인 아지도티미딘(AZT), 디다노신(DDI) 등이 알려져 있다.

그런, AZT는 저명한 연명효과가 인정되고 있는 것의 문제점으로서 두통이나 위장장해, 골수억제작용 등이 발생하는 문제점이 있다. 또한 이들 종래부터 연구되어온 항HIV제의 다수는 HIV 복제과정에서 DNA 합성을 저해하여 HIV의 증식을 억제하는 작용기전에 기초로 하고 있기 때문에, HIV의 억제와 동시에 정상세포의 DNA 합성도 억제해버려 정상세포가 감소하여 환자는 점점 중증상황으로 빠지게 되는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명은 안정성 및 효력이 우수한 AIDS 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 후천성 면역결핍증(AIDS : Acquired Immune Deficiency Syndrome Virus)제 및 항HIV작용 증강제에 관한 것이다.

제1도는 티아민디술피드의 CEM 세포에 대한 세포독성시험 결과를 나타낸 도이다.

제2도는 티아민디술피드의 CEM/LAV 세포에 대한 세포독성 시험결과를 나타낸 도이다.

제3도는 티아민디술피드의 초기감염 CEM 세포의 증식에 대한 효과를 나타낸다.

제4도는 티아민디술피드 첨가에 있어서 웨스턴 블롯에 의한 HIV 구성단백의 검출결과를 나타낸 도이다.

이러한 실정에 본 발명자는 최근 개발된 Tat에 의한 항HIV제의 스크리닝 법에 의해 각종 화합물의 항HIV작용을 스크리닝한 바, 비타민 B₁유도체로서 널리 사용되고 있는 하기 화합물(1)이 기존의 항HIV제에서 없는 작용기전으로 항HIV 증강 작용을 갖고 있어서 AIDS의 예방 및 치료에 유용함을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)

[식중, X¹는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타내고, R¹은 탄소수 2∼6의 알케닐기, 테트라히드로푸르푸릴기, 3-아세틸티오-7-메톡시카르보닐헵틸기 또는 식(2)

(여기서, X²는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타낸다)]

로 표시되는 비타민 B₁류 또는 그의염을 유효성분으로 하는 항HIV제 및 이 화합물을 배합하여 된 항HIV작용 증강제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 비타민 B₁류 또는 그의 염을 유효성분으로 하는 AIDS 예방 및 치료제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 항HIV제, 항HIV작용 증강제 및 AIDS의 예방 및 치료제로서 비타민 B₁류 및 그의 염의 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 HIV로 감염되어 지속산생되는 세포에 비타민 B₁류 또는 그의 염을 투여함을 특징으로 하는 HIV에 감염되어 지속산생되는 세포의 증식을 저해하는 방법에 관한 것이다.

일반식(1)중 X¹및 X²로 표시되는 탄소수 1∼18의 아실기로서는 탄소수 1∼18의 알카노일기 또는 탄소수 6∼10의 아로일기를 들 수 있다. 그리고, 탄소수 1∼18의 알카노일기로서는 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 헥사노일기, 옥타노일, 데카노일, 도데카노일, 테트라데카노일, 헥사데카노일, 옥타데카노일 등을 들 수 있고, 아로일기로서는 벤조일기, 나프토일기를 들 수 있다. 티아민디술피드의 형에서 X¹및 X²가 수소원자인 경우, 실시예에 나타난 바와 같이 우수한 항HIV작용을 나타낸다. 예시된 아실기가 X¹및 X²로 도입되는 경우, 이와 같은 화합물이 생체에 적용될 때 항HIV작용을 더욱 증진시킬 수 있다.

또한, R¹으로 표시되는 탄소수 2∼6의알케닐기로서는 비닐기, 알릴기, 2-부테닐기, 2-펜테닐기 등을 들 수 있으나, 특히 알릴기가 바람직하다.

화합물(1)의 염으로서는 약학적으로 허용되는 한, 특별한 제한은 없다. 그러나, 이들의 예로서는 질산염, 염산염, 아세트산엽, 황산염 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 화합물(1) 또는 그의 염의 바람직한 예로서는 티아민디술피드, 질산티아민디술피드, 인산티아민디술피드, 비스벤티아민, 비스부티티아민, 비시부티티아민, 알리티아민, 푸르술티아민 및 옥토티아민을 들 수 있다. 이들 중, 티아민디술피드가 가장 바람직하다.

본 발명에서 항HIV제 또는 AIDS 예방 및 치료제는 화합물(1) 또는 그의 염에 필요에 따라 부형제, 결합제, 활택제, 붕해제, 피복제, 유화제, 현탁제, 용제, 안정화제, 흡수조제, 연고기제 등의 의약용 담체를 적의첨가하든가, 또한 리포좀화 등을 행하여 통상의 방법에 따라 경구투여용, 주사용, 직장투여용 등의 제형으로 제제화하여 얻어진다.

또한, 항HIV작용증강제로서 사용하는 경우에는 화합물(1) 또는 그의 염에 다른 항HIV작용을 나타내는 화합물을 병용한다.

여기서, 다른 항HIV제로서는 이미 임상적으로 사용되는 있는 아지도티미딘이나 디다노신을 비롯하여, 현재 항HIV체로서 개발도상인 약물, 즉, 바이러스흡착, 막융합 및 침입을 방지하는 가용성 CD4, 황산폴리사카라이드, T22; 탈각작용 물질인 바이사이크램(bicyclam); 역전사효소에 작용하는 디데옥시 뉴클레오티드계 약제, 수라민(suramin) 등;발현계에 작용하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, rev 인히비터 등; 및 프로테아제 인히비터, 글리코레이션 인히비터, 인터페론 등을 들 수 있다.

경구투여제제로서는 과립제, 정제, 당의정, 캅셀제, 소프트캅셀제, 환제, 액제, 유제, 현탁제 등을 ; 주사투여용제제로서는 정맥내주사, 근육내주사, 피하주사, 점적주사용 등을 ; 직장내투여 제제로서는 좌제, 캅셀제 등을 들 수 있다.

이와 같은 제제의 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 증상 등에 따라 다르나, 통상 성인 1일 화합물(1) 또는 그의 염으로서 1∼1000㎎이 바람직하고, 이를 1회 또는 수회로 나누어 투여한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Tat 억제효과.

COS-7 세포에 Tat의 리포터 플라스미드 및 액티베이터 플라스미드를 DEAE 덱스트란법에 의해 코트랜스팩션하여 5% CO₂하, 37℃, 24시간 배양하고, 미리 약제를 넣은 96웰 마이크로플레이트에 1웰당 1×10⁴개의 트랜스팩턴트를 가하고, 다시 5% CO₂존재하, 37℃에서 3일간 배양했다. 다음에 기질로서 p-니트로페닐포스페이트와 완충액을 넣은 별도의 96웰 마이크로 플레이트에 전기 배양상청(50㎕)을 가하고, 37℃에서 3시간 인큐베이트한 후, 생성한 p-니트로페놀에 의한 405㎚의 흡광도 변화를 측정하여 Tat 억제효과의 유무를 조사했다. 그 결과를 표1에 나타낸다.

[표 1]

표 1로부터 명백한 바와 같이, 티아민디술피드는 125∼500㎛의 농도에서 용량 의존적으로 Tat 활성을 억제했다.

실시예 2: 세포독성시험

대수증식기의 CEM 및 HIV-1 지속산생주 CEM/LAV주를 각 농도의 약제를 함유하는 배지에서 2.5×10⁵cells/㎖, 10㎖로 조정하고, 5% CO₂하 37℃에서 배양했다. 24시간마다 세포배양액을 피펫팅한 후, 채취하여 트리판 블루 염색법에 의해 생세포수 및 사멸세포수를 계측했다. 그 결과, 제1도 및 제2도에 나타난 바와 같이 티아민디술피드에서는 500㎛이하의 농도에서 CEM 세포의 발육증식에 영향을 주지 않았다. 그리하여 HIV-1 지속생산주 CEM/LAV 세포의 발육증식을 500㎛ 농도에서 명확히 억제하였으나, 사멸세포수는 증대하지 않았다.

실시예 3: 초기 감염 CEM 세포에 의한 HIV 구성단백의 검출

대수증식기의 CEM 배양액(1.0×10⁶cell/㎖, 108㎖)으로부터 원심(260×g, 5분)에 의해 세포를 회수하고, HIV-1 바이러스 용액(12×10⁵TCID₅₀)을 가하여 180㎖의 배지중에서 37℃. 24시간 배양하고, 바이러스를 흡착시켰다. 다음에 원심(260×g, 5분)에 의해 바이러스를 함유하는 배양상청을 제거하고, 50㎖의 RPMI-1640 기초배지에서 3회 원심(260×g, 5분) 세정후, 각 농도의 약제를 함유하는 배지에서 각각 1×10⁵cell/㎖, 50㎖×2개의 세포부유액으로 했다. 이 세포배양액을 2시간마다 25㎖씩 96시간 후까지 회수하고, SDS-PAGE후 웨스턴 블롯을 행하고, 바이러스 구성단백을 검출했다. 또, 1차 항체로서 HIV-1 양성혈청을 사용했다.

제3도에 초기감염 CEM의 세포증식에 대한 효과를 제4도에 HIV 구성단백의 검출 결과를 나타냈다. 그 결과, 티아민디술피드는 50㎛ 이하의 농도에서 초기감염 CEM 세포증식에 영향을 주지 않았다. 또한 티아민디술피드 500㎛의 배양상청중에 p24 단백 및 p41 단백이 생성되지 않음을 나타냈다. 이것은, 즉 HIV가 형성되지 않은 것을 의미한다.

실시예 4: 항 HIV활성

대수 증식기의 HIV 지속세포(2×10⁵cell/㎖, 10㎖)에 각 농도의 약제를 가하고, 96시간 배양하고, 24시간마다 생세포수 및 사멸세포수를 트리판 블루 염색법으로 구하고, 약제의 세포에 대한 세포독성을 조사했다. 96시간 배양액중의 바이러스 감염가(TCID₅₀/㎖)를 MT-4세포의 거대세포(giant cell)형성을 지표로서 72시간 배양하여 구하였다. 대조군은 약제를 함유하지 않은 배지에서 배양했다. 항 HIV 활성(저해%)은 다음 식에 의해 구했다.

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 티아민디술피드는 500㎛농도에서 HIV 지속생산세포 CEM/LAV-1, Hg/MN 및 Molt-4/IIIB에 대해 현저한 항HIV 활성을 나타내고, 그의 저해효율은 90∼88%이었다. 또한, 티아민디술피드는 U₉₃₇/RF 세포에 대해서도 현저한 항HIV 활성을 나타냈다. 또한, 푸르술티아민은 50㎛ 농도에서 CEM/LAV-1, Hg/MN 및 U₉₃₇/RF 세포에 대해서 현저한 항HIV 활성을 나타내고, 알리티아민은 50㎛ 농도에서 CEM/LAV-1 세포에 대해 현저한 항HIV 활성을 나타냈다.

또한, 비스티아민은 50㎛ 농도에서 Hg/MN 세포에 대해 현저한 항HIV 활성은 나타냈다. 이들 모든 화합물은 상기 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다.

[표 2]

화합물(1) 또는 그의 염은 Tat 억제 및 HIV 지속산생 세포내에서 HIV의 증식억제 효과로서 HIV 억제작용을 발휘하고, 초기감염 세포에 대해서는 세포억제를 나타내지 않고 바이러스 단백의 산생을 억제한다. 즉, 초기감염 세포에 대해서는 세포를 사멸시키지 않고, HIV의 증식을 억제하고, HIV를 지속적으로 산생하게 된 지속산생 세포에 대해서는 세포살생 효과와 HIV 살생효과를 동시에 발휘하는 대단히 바람직한 성질을 갖는다.

또한, 화합물(1) 또는 그의 염은 다른 항HIV 물질과 같이 HIV 복제과정을 억제하는 성질을 가지나, 정상세포는 말할 것도 없이 초기감염 세포를 죽이지 않고 바이러스의 증식을 억제하는 독특한 점을 갖고 있다.

더욱이, 화합물(1) 또는 그의 염은 비타민 B₁유도체로서 임상적으로 널리 사용되고 있기 때문에 부작용이 없고 안정성이 높은 것으로 알려져 있다.

따라서, 화합물(1) 또는 그의 염을 유효성분으로 하는 본 발명의 항HIV제 및 이 화합물을 배합한 본 발명의 항HIV 작용증강제는 AIDS의 예방 및 치료에 유용하다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)

{(여기서, X¹는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타내고, R¹은 탄소수 2∼6의 알케닐기, 테트라히드로푸르푸릴기, 3-아세틸티오-7-메톡시카르보닐헵틸기) 또는 식(2)

(여기서, X²는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타낸다)}

로 표시되는 비타민 B₁류 또는 그의 염을 유효성분으로 하는 항HIV제
제1항에 있어서, 유효성분이 티아민디술피드, 질산티아민디술피드, 인산티아민디술피드, 비스벤티아민, 비스부티티아민, 비시부티티아민, 알리티아민, 푸르술티아민 및 옥토티아민에서 선택된 것이 특징인 항HIV제.
하기 일반식(Ⅰ)

{(여기서, X¹는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타내고, R¹은 탄소수 2∼6의 알케닐기, 테트라히드로푸르푸릴기, 3-아세틸티오-7-메톡시카르보닐헵틸기) 또는 식(2)

(여기서, X²는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타낸다)}

로 표시되는 비타민 B₁류 또는 그의 염을 유효성분으로 하는 항 HIV 작용 증강제.
제3항에 있어서, 유효성분이 티아민디술피드, 질산티아민디술피드, 인산티아민디술피드, 비스벤티아민, 비스부티티아민, 비시부티티아민, 알리티아민, 푸르술티아민 및 옥토티아민에서 선택된 것이 특징인 항HIV작용 증강제.
하기 일반식(Ⅰ)

{(여기서, X¹는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타내고, R¹은 탄소수 2∼6의 알케닐기, 테트라히드로푸르푸릴기, 3-아세틸티오-7-메톡시카르보닐헵틸기) 또는 식(2)

(여기서, X²는 수소원자, 탄소수 1∼18의 아실기 또는 포스포노기를 나타낸다)}

로 표시되는 비타민 B₁류 또는 그의 염을 유효성분으로 하는 AIDS 예방 및 치료제.
유효성분이 티아민디술피드, 질산티아민디술피드, 인산티아민디술피드, 비스벤티아민, 비스부티티아민, 비시부티티아민, 알리티아민, 푸르술티아민 및 옥토티아민에서 선택된 것이 특징인 AIDS 예방 및 치료제.