-
TECHNISCHES
GEBIET
-
Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung
einer humanen Immunschwächevirus(HIV)-Infektion,
wobei eine zur Vorbeugung oder Behandlung einer HIV-Infektion wirksame
Menge einer γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung
oder eines oxidierte Dimers, das durch Dehydrierung von zwei identischen
Molekülen
dieser Art erhalten wird, eingesetzt werden.
-
HINTERGRUNDWISSEN
-
Die möglichen hemmende Wirkungen
von Antioxidantien einschließlich
Glutathion (GSH) und dessen Vorläufer
auf den menschlichen Immunschwächevirus
Typ 1 (HIV-1), wurde in den letzten Jahre gründlich untersucht. Anfängliche
Studien ergaben, dass reduzierende Verbindungen, wie D-Penicillamin,
2,3-Dimercapto-1-Propanol
und N-Acetylcystein (NAC) bei HIV-1 die LTR (long terminal repeat)
gesteuerte Transkription der viralen Gene hemmt (FEBS Letters 1988;
236 : 282–286,
AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919–927, Proc Natl Acad Sci USA
1990; 87: 4884–4888,
Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986–990). Parallel zu diesen ersten
grundlegenden Studien wurde über
das Absinken des GSH-Spiegels im Plasma, in den peripheren Blutzellen
und in der Lungenepithelflüssigkeit
bei mit HIV-1 infizierten Personen berichtet (Biol Chem Hoppe-Seyler
1989; 370: 101–108,
AIDS Res Human Retroviruses 1992; 2: 305–311, Lancet 1989; II: 1294–1298).
GSH ist nicht nur bekannt als wichtigstes intrazelluläres Antioxidans,
sondern auch als Modulator des Immunsystems (J Immunol 1985; 135:
2740–2747).
Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Änderung
des GSH-Mangels bei HIV-1 infizierten Personen mit Vorläufern von
Glutathion eine der vernünftigsten
therapeutischen Strategien sei, um das Fortschreiten von HIV-1 in
vivo zu verhindern (AIDS Res Human Retroviruses 1992; 8: 209–215, Blood
1995; 86: 258–267,
Blood 1996; 87: 4746–4753).
Auf diese Weise wurde die hemmende Wirkung von GSH Pro-Pharmaka,
wie z. B. NAC, gegen HIV-1 weiter charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass
diese Verbindungen in der Lage sind, die Transkription der HIV-1
Gene, die durch den Tumornekrosefaktor α (TNF-α) oder Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
(PMA) induziert wird, in latenten Proviren zu hemmen. Das ist ein
Modell für
das zellulare latente Stadium der HIV-1-Infektion (Proc Natl Acad
Sci USA 1991; 88: 986–990, Cell
1990; 61: 1271–1276).
Zudem wurde in einem neueren Bericht die Steigerung des HIV-1 Wachstums durch
NAC in peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) beschrieben (AIDS
1997; 11: 33–41).
Neue Studien haben gezeigt, dass die Replikation von HIV-1 in lymphoretikulären Geweben
kontinuierlich aktiv ist (Nature 1993; 362: 355–358, Nature 1993; 312: 359– 362).
Deshalb könnte
es schwierig sein, eine HIV-1 Infektion signifikant zu verändern nur
indem man latente HIV-1 Proviren in einem nicht-replikativen Zustand
hält, ohne die
massive Produktion von Viren aus den sogenannten spätphase-infizierten
Zellen abzustellen und folglich weitere Infektionszyklen auszuschließen. Es
wurde angedeutet, dass es kritisch sei könnte, die Beseitigung der spätphase-infizierten
Zellen um das Fortschreiten des erworbenen Immunschwächesyndroms
(AIDS) zu verzögern
(Science 1996; 272: 1962). Aber es gab keine Verbindungen, die eine
selektive Beseitigung von HIV-1 selbst und HIV-1 infizierten Zellen
bewirken, obwohl eine Vielzahl von Kandidaten für Anti-HIV-1-Chemotherapeutika
beschrieben wurde. Ähnlich
wurde, obwohl es verschiedene Berichte gab, die die Anti-HIV-1 Effekte
von einer Vielfalt von Antioxidantien beschrieben (FEBS Letters
1988; 236: 282–286,
AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919–927, Proc Natl Acad Sci USA
1990; 87: 4884– 4888,
Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986–990), von keiner dieser Verbindungen
berichtet, dass sie eine akute HIV-1-Infektion stoppen.
-
Die γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung
der Formel (I):
wobei R eine geradkettige,
verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1
bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe
ist, oder das oxidierte Dimer, das durch Dehydrierung zwischen zwei γ-L-Glutamyl-L-Cysteinestern
der Formel (I) erhalten wird, ist bekannt als Antioxidans, das entweder
direkt oder als einzigartiges GSH Pro-Pharmakon wirkt, wodurch es
vorbeugende oder therapeutische Wirkungen gegenüber Lebererkrankungen, grauem
Star, Nierenerkrankungen, Herz- und Leberreperfusionsverletzungen,
Arrhytmie und Lungenerkrankungen, wie Asthma zeigt, die durch Schädigungen
durch aktiven Sauerstoff und freien Radikalen hervorgerufen werden
(WO 88/00182 (→ U.S.
Patent No. 4,927,808) and WO 92/18420 (→ U.S. Patent No. 5,631,234)).
Insbesondere von γ-L-Glutamyl-L-Cysteinethylester
(γ-GCE)
wurde berichtet, dass es wirksam ist gegenüber grauem Star (Ophthalmic
Res 1991; 23: 51–58),
Leberschädigung
(Res Com Chem Pathol Pharmacol 1993; 82: 49–64), Herz- und Leberreperfusionsverletzungen
(Brit J Pharmacol 1991; 104: 805–810, J Am Coll Cardiol 1994;
24: 1391– 1397,
Circulation Res 1994; 74: 806–816
und Transplantation 1992; 54: 414–418) und Asthma (Am Rev Respir
Dis 1992; 145: 561–565).
Aber es gibt keinen Bericht über
die Wirkung von γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindungen
auf eine HIV-Infektion.
-
OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
-
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben die Wirkung von γ-GCE
gegen HIV-1, das für
die oben erwähnte γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung
steht, in vitro untersucht, indem sie (1) eine stark HIV-1-produzierende
menschliche T-Lymphozytenzelllinie,
ein Modell für
eine HIV-1-Produktion von spätphase-infizierten
Zellen in einer chronischen HIV-Infektion und (2) HIV-1 beimpfte
T-Lymphozyten, ein Modell für
eine akute HIV-1-Infektion benutzten, und haben festgestellt, (1)
dass γ-GCE, im Gegensatz
zu anderen Glutathion Pro-Pharmaka oder anderen Antioxidantien,
von denen berichtet wurde, einen neuen zweiphasischen hemmenden
Effekt auf chronische HIV-1-Infektion zeigt; der besteht in Folgendem:
i) in hohen Dosen, bis zu einer Konzentration von 2,5 mM, bei der
weder GSH noch andere GSH-Vorläufer
hemmende Wirkung zeigen, hemmt γ-GCE
die Produktion von HIV-1 stark durch selektive zytopathisch Wirkung
gegenüber
infizierten Zellen, während
die Lebensfähigkeit
und das Wachstum von nicht-infizierten Zellen bei der gleichen Konzentration unbeeinträchtigt sind,
ii) in niedrigeren Konzentrationen (200 bis 400 μM) unterdrückt γ-GCE die virale Produktion von
chronisch HIV-1 exprimierenden Zellen signifikant ohne deren Lebensfähigkeit
in Mitleidenschaft zu ziehen und iii) der Unterschied der Schwellenwerte
für die
toxischen Dosen zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen
beträgt
mehr als Faktor Zehn. Sie haben weiterhin festgestellt (2), dass
relativ hohe Dosen von γ-GCE,
eingesetzt bei eine akuten HIV-1-Infektion von T-Lymphozyten, die Ausbreitung von HIV-1
gänzlich stoppten
und die Zellen vor HIV-1-induziertem
Zelltod bewahrten und sie fanden heraus dass γ-GCE in solchen Konzentrationen
die Infektionsfähigkeit
von HIV-1 innerhalb von vier Stunden direkt hemmt. Solche Ergebnisse weisen
darauf hin, dass γ-GCE
hervorragende Eigenschaften als Mittel gegen HIV besitzt, es ist
nämlich
im Stande alle drei kritischen Faktoren einer HIV-Ausbreitung abzuschalten:
Es inaktiviert HIV-1 selbst, blockiert eine akute Infektion, unterdrückt die
Produktion von Viren durch infizierte Zellen und tötet HIV-1
produzierende Zellen selektiv ab, was noch von keinem anderen Anti-HIV-1 Chemotherapeutikum
jemals erreicht wurde.
-
Aus diesem Grund bezieht sich die
vorliegende Erfindung, basierend auf den oben erwähnten Ergebnissen,
auf die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung
oder Behandlung einer menschlichen Immunschwächevirus(HIV)-Infektion aus einer γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung
der Formel (I):
wobei R eine geradkettige,
verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1
bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe
ist, oder das oxidierte Dimer, das durch Dehydrierung zwischen zwei γ-L-Glutamyl-L-Cysteinestern
der Formel (I) erhalten wird.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Diese Ergebnisse sind die Mittelwerte
von zwei unabhängigen
Experimenten.
-
1 Feld
A zeigt, dass 2,5 mM γ-GCE
(ausgefüllte
Kreise), GSH (Dreiecke) und NAC (Rechtecke) keine negative Wirkung
auf das Wachstum der nicht-infizierten menschlichen T-Lymphozyten-Zelllinie
H-9, im Vergleich zur Kontrolle (nichtausgefüllte Kreise), haben.
-
Feld B zeigt, dass 800 μM γ-GCE (ausgefüllte Kreise)
das Wachstum einer chronisch infizierten stark HIV-1-exprimierenden
Linie H-9/IIIB (H-9-Zellen, die mit einem HIV-1-Stamm, HIV-1IIIB,
infiziert sind) im Vergleich zur Kontrolle (nicht-ausgefüllte Kreise)
dramatisch beeinträchtigt.
Gleichzeitig wird beobachtet, dass es nach 12 Tagen mit Behandlung
kein signifikantes Zellwachstum gibt und, dass die Lebensfähigkeit
der Zellen auch auf unter 40% absank (Daten sind nicht abgebildet);
das auf eine starke zytopathische Wirkung von γ-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen
schließen
lässt.
-
2 zeigt
, dass die zytotoxische Wirkung von γ-GCE bei einer Konzentration
von 5 mM auf nicht-infizierte H-9-Zellen (A) bezüglich der Größen Lebensfähigkeit
und Wachstum nahezu äquivalent
ist zu der Wirkung die für
400 μM auf
infizierte H-9/IIIB-Zellen
(B) bezüglich
der Größen Lebensfähigkeit
und Wachstum gezeigt wurde. Das weist darauf hin, dass infizierte
Zellen fast 12,5 Mal empfindlicher gegenüber γ-GCE sind als nicht-infizierte
Zellen, was eine selektive Toxizität von γ-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen
der H-9-Zelllinie bedeutet (Rechtecke: γ- GCE, gepunktet: Kontrolle).
-
3 zeigt,
dass 1,25 mM (A) oder 2,5 mM (B) γ-GCE
(ausgefüllte
Kreise), das die Lebensfähigkeit von
HIV-1-produzierenden H-9-Zellen selektiv vermindert, die logarithmische
Produktion von HIV-1 (dargestellt durch das p24-Antigen) von H-9/IIIB-Zellen fast vollständig ausschließt, während weder
GSH (Dreiecke) noch NAC (Rechtecke) die starke HIV-1-Produktion
von H-9/IIIB bei 1,25 mM (A) in den Griff bekommen können. Vielmehr
steigern sie die Virusproduktion bei 2,5 mM (B) im Vergleich zur
Kontrolle (nicht-ausgefüllte
Kreise), was eine neuartige Eigenschaft von γ-GCE als ein Anti-HIV-1-Mittel
beweist.
-
4 zeigt,
dass 200 μM
(ausgefüllte
Rechtecke) oder 400 μM
(ausgefüllte
Kreise) γ-GCE
die starke HIV-1-Produktion (dargestellt durch das Gesamt-HIV-1-p24-Antigen) von H-9/IIIB-Zellen
signifikant hemmt ohne die Lebensfähigkeit und das Wachstum von
H-9/IIIB-Zellen zu beeinflussen (wie in Beispiel 3 angegeben), was stark
im Gegensatz steht zu den Ergebnissen von GSH oder NAC in 3, in der sie die virale
Expression in höheren
Konzentrationen nicht verändern
und somit die Wirksamkeit von γ-GCE
als ein GSH-Pro-Pharmakon gegen aktive und kontinuierliche HIV-1-Produktion
beweisen, selbst in niedrigen Konzentrationen, die nicht toxisch
für infizierte
Zellen sind.
-
5 zeigt,
dass 1,6 mM γ-GCE
(ausgefüllte
Kreise) die Ausbreitung von HIV-1 (dargestellt durch Gesamt-HIV-1-p24-Antigen) über einen
Zeitraum von 21 Tagen nach der Infektion vollständig blockiert, während in
Gegenwart von 400 bis 800 μM γ-GCE (jeweils ausgefüllte Dreiecke
und ausgefüllte
Rechtecke) eine akute Infektion nicht signifikant inhibiert wurde
(Feld C) und dass die Zellen mit 1,6 mM γ-GCE fortfahren aktiv zu wachsen,
wobei sie während
des gesamten Experiments eine hohe Lebensfähigkeit beibehalten, wogegen das
Wachstum der Kontrollzellen (nichtausgefüllte Kreise) mit einer massiven
HIV-1-Produktion beeinträchtigtes
Zellwachstum (Feld A) und Zelltod (Feld B) zeigte.
-
6 zeigt,
dass eine Vorinkubation mit 2,5 mM (ausgefüllte Kreise) und 1,25 mM (Dreiecke) γ-GCE für einen
Zeitraum von vier Stunden HIV-1 direkt vollständig inaktiviert, es zeigt
sich in akuten Infektionsexperimenten kein Ausbruch einer akuten
Infektion mit diesen vorbehandelten Viren, wogegen eine Vorinkubation des
Virus mit 625 μM γ-GCE (Rechtecke)
nur eine Verzögerung
des Ausbruchs im Vergleich zur Kontrolle (nicht-ausgefüllte Kreise)
zeigte.
-
ARBEITSWEISEN
-
In der oben erwähnten Formel (I) steht R für eine geradkettige,
verzweigte oder cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen
oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit
1 bis 5 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer aromatischen Gruppe.
Außerdem
bezieht sich das oxidierte Dimer auf ein Dimer, in dem eine Disulfidbrücke (-S-S-)
nach Dehydrierung zwischen zwei identischen Molekülen der
oben erwähnten
Formel (I) gebildet wurde.
-
Die γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung,
angegeben in der oben erwähnten
Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer können entsprechend der Methode,
beschrieben z. B. in WO 88/00182 (→ U.S. Patent Nummer 4,927,808),
einer japanischen ungeprüften
Patentveröffentlichung
Nummer 64-19059 (→ Japanisches
Patent Nummer 2569060) und einer japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung
Nummer 64-26516
(→ Japanische
geprüfte
Patentveröffentlichung
Nummer 8-553090) hergestellt werden.
-
In der oben erwähnten Formel (I), schließen spezifische
Beispiele für
R eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine N-Hexylgruppe, eine
N-Octylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine 2-Methyl-2-Propenylgruppe, eine
Cyclohexylgruppe und ein Benzylgruppe ein. Obwohl die Verbindungen,
die in der oben erwähnten
Formel (I) angegeben sind, alle γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindungen
einschließen,
in denen eine bestimmte R-Gruppe gebunden ist, beziehen typische
Beispiele von dieser Verbindung γ-L-Glutamyl-L-Cysteinethylester mit
ein.
-
Im Falle der Anwendung der γ-L-Glutamyl-L-Cysteinesterverbindung
der oben erwähnten
Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers als Arzneimittel entsprechend
der vorliegenden Erfindung, können
diese Verbindungen in ihrer freien Form oder in der Form der pharmakologisch
akzeptablen sauren oder basischen Additionssalze eingesetzt werden.
Wenn die Verbindungen in Form eines Salzes eingesetzt werden, können die
hinzugefügten
sauren oder basischen Gruppen entweder anorganische oder organische
Verbindungen sein und sind in keiner Weise eingeschränkt, solange
sie ausreichend wirksam sind, wenn sie als Salz eingesetzt werden
und keine oder geringe Toxizität
aufweisen.
-
Die Verbindung der oben erwähnten Formel
(I) oder ihr oxidiertes Dimer können
oral, nicht-oral oder über
den Respirationstrakt in der gewünschten
Form verabreicht werden, indem sie mit pharmakologisch annehmbaren
Trägern,
Vehikeln, Lösungsmitteln,
Verdünnungsmitteln,
Farbstoffen, Konservierungsstoffen, Neutralisierungsmitteln und
Stabilisatoren zur sich Vorbeugung und Behandlung in Bezug auf die
vorliegende Erfindung gemischt werden.
-
Orale Präparate können entweder feste Präparate,
wie Tabletten, Granulate, Pulver und Kapseln oder flüssige Präparate wie
Sirup, Elixiere, Emulsionen und Suspensionen sein. Außerdem können nicht-orale
Präparate
in Form von Injektionen, Supposi torien oder äußerlichen Präparaten
zum Auftragen auf die Haut sein. Diese Präparate werden entsprechend
den Routinemethoden hergestellt, indem pharmakologisch akzeptable Adjuvantien
der Verbindung mit der oben erwähnten
Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers zugegeben werden. Darüber hinaus
können
die Präparate
auch entsprechend bekannter Verfahren in Form von zeitverzögert freisetzenden
Präparaten
hergestellt werden.
-
Feste Präparate zur oralen Verabreichung
werden in Form von Pulvern hergestellt, indem die Verbindung der
oben erwähnten
Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer mit einem Vehikel, wie Laktose,
Stärke,
Cellulosekristall, Methylcellulose, Glycerin, Natriumalginat, Gummiarabikum,
Calciumhydrogenphosphat, meta-Magnesium-Alluminiumsilikat, Calciumlaktat, Natriumchlorid,
Calciumcarbonat und Kaolin vermischt werden oder sie werden bei
Bedarf in Form von Granulaten hergestellt, indem ein sich auflösendes Agens,
wie Hydroxypropylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Natriumalginat
und Natriumbicarbonat zugefügt
wird mit anschließender
Granulation. Tabletten werden hergestellt, indem diese Pulver und
Granulate so wie sie sind zu Tabletten geformt werden oder indem
ein Glanzmittel wie Talk oder Magnesiumstearat zugegeben wird. Darüber hinaus
können
die oben erwähnten
Granulate oder Tabletten mit einer Grundlage, wie Methylmethacrylat-Copolymer
oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat beschichtet werden, um
ein enteral beschichtetes Präparat
zu schaffen, oder sie können
mit Ethylcellulose oder einem gehärteten Öl beschichtet werden, um ein
zeitverzögert
freisetzendes Präparat
herzustellen. Kapseln können
in Form von harten Kapseln gebildet werden, indem diese mit Pulver
oder Granulaten gefüllt
werden oder durch Umhüllung
mit einem Gelatinefilm in Form von weichen Kapseln gebildet werden,
nachdem die Verbindung der oben erwähnten allgemeinen Formel (I)
oder ihr oxidiertes Dimer in Glycerin, Polyethylen, Glycol oder
Olivenöl
usw. suspendiert oder gelöst worden
ist.
-
Flüssige Präparate zur oralen Verabreichung
können
in Form eines Sirups hergestellt werden, indem die Verbindung der
oben erwähnten
Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer zusammen mit einem Süßstoff wie
Glycerin oder Sorbit in Wasser aufgelöst werden, oder in Form eines
Elixiers, indem Ethanol oder Essenz zugegeben werden oder in Form
einer Emulsion oder Suspension hergestellt werden, indem Po lysorbat
80, Natriumcarboxymethylcellulose oder Gummiarabikum usw. zugegeben
werden.
-
Präparate zur Injektion werden
in Form einer Einzeldosis oder als Präparate zur lang- oder kurzfristigen
Injektion zur subcutanen, intramuskulären, intravenösen oder
intraarteriellen Injektion hergestellt, indem die Verbindung der
oben erwähnten
Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer in destilliertem Wasser zur
Injektion zusammen mit einem pH-Regulator wie Dinatriumhydrogenphosphat,
Natriumdihydrogenphosphat, Natriumhydroxid, Salzsäure, Milchsäure oder
Natriumlaktat, einem isotonischen Agens wie Glukose oder Natriumchlorid
und einem SH-Gruppenstabilisator wie Natriumbisulfit, Ascorbinsäure oder
Natriumethylendiamintetraacetat aufgelöst werden und nach einer Sterilfiltration
in Ampullen oder Polyethylen- oder Glasbehälter gefüllt werden. Außerdem können Injektionspräparate von
der Art, die direkt vor Gebrauch zubereitet werden, im Anschluss
an die Zugabe von Dextrin, Cyclodextrin, Mannitol, Gelatine usw.
mit Hilfe von Gefriertrocknung unter Vakuum hergestellt werden.
Außerdem
kann die Verbindung der oben erwähnten
Formel (I) oder ihr oxidiertes Dimer auch in Form eines Injektionspräparats,
das Liposome oder Mikrosphären
beinhaltet, in Übereinstimmung
mit bekannten Verfahren hergestellt werden.
-
Suppositorien können durch Erhitzen und Schmelzen
der Verbindung der oben erwähnten
Formel (I) oder ihres oxidierten Dimers mit Polyethylenglykol, Lanolin,
Mono-, Di- oder Triglyceriden von Fettsäuren oder Kakaobutter und durch
Beschichten mit Gelatine, etc. hergestellt werden, nachdem man es
entweder zum Plastifizieren abkühlen
lässt oder
es in Sojabohnenöl,
Polyethylenglykol usw. suspendiert oder aufgelöst hat.
-
Präparate zur äußerlichen Anwendung auf der
Haut können
hergestellt werden, indem die Verbindung der oben erwähnten Formel
(I) oder ihr oxidiertes Dimer zu Polyethylenglykol, weißer Vaseline
oder flüssigem Paraffin
etc. zugegeben werden und zu einer Salbe, Creme oder zu einem Gel
verarbeitet werden.
-
Präparate, die über den
Respirationstrakt verabreicht werden, werden in Form von feinen
Granulaten von der Verbindung der oben erwähnten Formel (I) oder ihres
oxidierten Dimers unter Einsatz von Routinemethoden zur Inhalation
verabreicht. Es ist wünschenswert,
dass die feinen Partikel, die das Arzneimittel als wirksame Komponente
enthalten, in Form von einem Aerosol oder Pulver vorliegen und eine
Partikelgröße von 0,5 bis
50 μm haben.
Beispiele für
Vorrichtungen, die eingesetzt werden können, um das Aerosol zu bilden,
umfassen Ultraschall- und Druckluftvernebler und Zerstäuber, die
niedere Alkane oder fluorierte Alkane als Treibmittel benutzen.
Außerdem
werden Pulver verabreicht, indem man einen einfachen Inhalator gekoppelt
mit einer spontanen oder erzwungenen Inhalation verwendet.
-
Obwohl es bei der vorliegenden Arzneimittelzubereitung
keine bestimmten Einschränkungen
für die Konzentration
der Verbindung, die in Formel (I) dargestellt ist oder ihr oxidiertes
Dimer gibt, sind im allgemeinen 0,1 bis 70 Gew.-% und vorzugsweise
1 bis 50 Gew.-% als Konzentration im Präparat geeignet. Außerdem sind,
obwohl es keine Einschränkung
für die
Dosierung gibt, 0,01 bis 5 g/Tag/Patient und vorzugsweise 0,1 bis 2,5
g/Tag/Patient geeignet. Mit Ausnahme von kontinuierlicher Injektion
beträgt
die Anzahl der Verabreichungen normalerweise 1 bis 4 Mal pro Tag.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1 Selektive Cytotoxizität von γ-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden
Zellen
-
Die nicht-infizierte menschliche
T-Lymphozyten Zelllinie H-9 oder H-9-Zellen, die mit einem HIV-1-Stamm
HIV-1IIIB (H-9/IIIB) infiziert sind (Science
1984; 224: 497–500)
wurden auf Gewebekulturplatten mit 24 oder 96 Vertiefungen mit einer
Dichte von 2 bis 2,5 × 105/ml geimpft und wurden in RPMI-1640 Gewebekulturmedium,
das mit 10 fötalem
Rinderserum (FBS = fetal bovine serum) ergänzt war, mit oder ohne Zusatz
einer Vielfalt an Konzentrationen von γ-GCE, GSH oder NAC kultiviert.
Alle zwei oder drei Tage wurden 50 bis 80% der Zellsuspension entfernt
und die gleiche Menge frisches Medium mit der gleichen Konzentration der
Verbindung, die analysiert werden sollte, zur weiteren Inkubation
zugegeben. Zu den gleichen Zeitpunkten wurden, um den relativen
Zellwachstumswert zu ermitteln, mit Hilfe des Trypan-Blau-Ausschlußverfahrens
die lebensfähigen
Zellen ausgezählt.
Gleichzeitig wurde auch die Lebensfähigkeit der Zellen als der
prozentuale Anteil der lebensfähigen
Zellen an der gesamten Zellpopulation überwacht.
-
Am Anfang wurden die Wirkungen von γ-GCE auf
die Lebensfähigkeit
und das Zellwachstum von nicht-infizierten H-9-Zellen im Vergleich
mit GSH und NAC bewertet. Bei einer Konzentration von 2,5 mM zeigte γ-GCE keine
negative Wirkung auf die Lebensfähigkeit
der Zellen und auf das Zellwachstum (1A).
Diese Ergebnisse ähneln
ziemlich den Ergebnissen mit GSH oder NAC. Während der 6-tägigen Inkubation
sank die Lebensfähigkeit
der Zellen in keinem Fall auf unter 90%, mit dem niedrigsten Wert
von 91,75 ± 0,45%
(mit NAC behandelte Zellen: an Tag 4), dies lässt ebenfalls auf eine geringe
Toxizität
von γ-GCE
gegenüber nicht-infizierten
T-Lymphozyten schließen.
-
Danach wurden Experimente, ähnlich zu
den oben Beschriebenen, mit einer chronisch infizierten Zelllinie
H-9/IIIB, die HIV-1 stark exprimiert, durchgeführt. Im Gegensatz zu den nicht-infizierten
H-9-Zellen zeigten die H-9/IIIB-Zellen überraschenderweise eine außergewöhnlich hohe
Empfindlichkeit gegenüber
der zytotoxischen Wirkung von γ-GCE.
Wie in 1 B dargestellt
ist, war das Zellwachstum, bei einer γ-GCE-Konzentration so gering wie 800 μM, dramatisch
eingeschränkt.
Am 6. Tag war das Zellwachstum auf einen Wert von weniger als 40%
im Vergleich zur Kontrolle gesunken. Nach 12tägiger Behandlung schließlich wurde
kein signifikantes Zellwachstum mehr beobachtet. Die Lebensfähigkeit
der Zellen sank nach dem 9. Tag auch auf unter 40% (Daten sind nicht
abgebildet), was eine relativ hohe Zytotoxizität von γ-GCE gegenüber HIV-1-produzierenden Zellen
andeutet.
-
Um die zytotoxische Wirkung von γ-GCE auf
H-9- und H-9/IIIB-Zellen zu vergleichen, wurden eine Auswahl von
Konzentrationen von γ-GCE
untersucht, um für
jede Zelllinie zwei Dosen zu bestimmen, die äquivalente zytotoxische Profile
ergaben. Es wurde beobachtet, dass die zytotoxische Wirkung von γ-GCE bei
5 mM auf H-9-Zellen annähernd äquivalent
war zu der, die für
400 μM bei
H-9/IIIB-Zellen nachgewiesen wurde (2).
Beide Zelllinien wiesen Verringerungen im relativen Zellwachstum
auf und minimale Verminderungen der Lebensfähigkeit nach 6 Tagen Behandlung
mit γ-GCE.
Folglich wurde gezeigt, dass H-9/IIIB-Zellen annähernd 12,5 Mal empfindlicher
gegenüber γ-GCE sind
als nicht-infizierte Zellen, was für eine selektive Toxizität von γ-GCE auf
HIV-1-produzierende Zellen steht.
-
Wenn man diese Ergebnisse zusammen
fügt, zeigt
sich, dass γ-GCE
bei einer Konzentration zwischen 800 μM und 2,5 mM in der Lage ist,
die Lebensfähigkeit
von H-9/IIIB-Zellen
zu verändern,
während
es nicht-infizierte H-9-Zellen nicht in Mitleidenschaft zieht.
-
Beispiel 2 Wirksame Hemmung
der HIV-1-Produktion durch γ-GCE
in Dosen, die selektiv das Wachstum und die Lebensfähigkeit
von HIV-1-produzierenden H-9-Zellen beeinträchtigen
-
Im Anschluss an die Entdeckung der
unterschiedlichen zytotoxischen Wirkung von γ-GCE in Beispiel 1 wurde die Wirksamkeit
einer solchen selektiven Toxizität
für die
Einschränkung
der HIV-1-Produktion ausgewertet.
-
H-9/IIIB-Zellen wurden gründlich mit
phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) gewaschen und mit einer Dichte von 1 × 105/ml
in RPMI-1640/10% FBS mit oder ohne 1,25 mM oder 2,5 mM γ-GCE, GSH
oder NAC resuspendiert. Da H-9/IIIB-Zellen beständig eine große Menge
an Viruspartikeln produzieren, war die Stimulation mit Faktoren
wie TNF-α oder
PMA zur Durchführung
dieser Experimente nicht nötig.
Nach zwei und vier Tagen wurde der Überstand der Kultur abgenommen,
zentrifugiert, um die Zellen und Ablagerungen zu entfernen, und
ausgewertet, indem die Menge an HIV-1-p24-Antigen bestimmt wurde.
Die Messung des HIV-1-p24-Antigens wurde mit Hilfe eines empfindlichen
ELISA's (DuPont)
durchgeführt.
-
Weder GSH noch NAC konnten die starke
HIV-1-Produktion von H-9/IIIB bewältigen. Im Gegenteil, sie steigerten
bei einer Konzentration von 2,5 mM die Virusproduktion, was im Widerspruch
zu einem früheren
Bericht steht (AIDS 1997; 11: 33–41). 1,25 mM oder 2,5 mM γ-GCE bringt
jedoch die logarithmische Produktion von HIV-1 aus H-9/IIIB-Zellen,
offensichtlich durch zytotoxische Wirkung fast völlig zum Stillstand (3). Diese Daten zeigen eine
neuartige Eigenschaft von γ-GCE
als ein Mittel gegen HIV-1.
-
Beispiel 3 Signifikante
Unterdrückung
der HIV-1-Produktion durch γ-GCE
in Dosen, die die Lebensfähigkeit von
HIV-1-produzierenden H-9-Zellen nicht in Mitleidenschaft ziehen
-
Da γ-GCE ein wirksames Antioxidans
ist, wurde die Hemmung von HIV-1 LTR-gerichteter Transkription innerhalb
eines nicht-toxischen Bereichs von γ-GCE ebenfalls vorhergesagt.
Dennoch wurde vermutet, dass es schwierig für diese Art von Verbindung
sein könnte,
eine derart beständige
und starke retrovirale Produktion zu hemmen.
-
H-9/IIIB-Zellen wurden mit PBS gewaschen
und mit einer Dichte von 2 × 105/ml in RPMI-1640/10% FBS mit oder ohne 0,2
mM oder 0,4 mM γ-GCE überimpft.
Drei und sechs Tage nach Beginn des Experiments, wurde von den Überständen der
Kulturen, wie oben beschrieben, Proben genommen. Am dritten Tag
wurden 72% von jeder Zellsuspension entfernt und frisches Medium
mit einem entsprechenden GSH Pro-Pharmakon zugegeben. Die Werte
für die
gesamte HIV-1-p24-Antigen-Produktion
am sechsten Tag wurden abgeleitet, indem die Rohdaten vom sechsten
Tag mit dem Verdünnungsfaktor
vom dritten Tag multipliziert wurden.
-
Die Behandlung von H-9/IIIB-Zellen
mit geringen Konzentrationen von γ-GCE
ist in 4 dargestellt. Wie
erwartet hemmte γ-GCE
die starke HIV-1-Produktion von H-9/IIIB-Zellen in niedrigen Konzentrationen (200 μM und 400 μM) signifikant,
wogegen höhere
Konzentrationen von GSH oder NAC die virale Expression nicht veränderten
(3). Bei einer solchen
Behandlung mit μ-GCE
wurde bei beiden Dosen die Lebensfähigkeit der Zellen nicht signifikant
in Mitleidenschaft gezogen (> 86%).
Langsameres Zellwachstum wurde nur bei einer Konzentration von 400 μM beobachtet
(wie in 2B dargestellt),
aber nicht bei 200 μM
(Daten sind nicht abgebildet). Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit
von γ-GCE
als ein GSH Pro-Pharmakon gegen aktive und kontinuierliche HIV-1-Produktion,
sogar in geringen Konzentrationen.
-
Beispiel 4 Hemmung von
akuter HIV-1-Infektion durch γ-GCE
-
Wenn γ-GCE in der Lage ist, HIV-1-produzierende
Zellen wirksam zu beseitigen, wird von ihm erwartet, dass es während einer
akuten Infektion die Ausbreitung von HIV-1 über die gesamte Zellpopulation
verhindert. Um die Richtigkeit dieser Hypothese zu bestätigen, wurde
eine akute Infektionsstudie durchgeführt.
-
Für
diese Experimente, wurde ein HIV-1-Stamm, NL4-3 (J. Virol. 1986;
59: 284–291)
vorbereitet, der eher einzusetzen ist als das HIV-1IIIB-Isolat
(Science 1984; 224: 497– 500),
dem bestimmte virale akzessorische Gene und ihre Translationsprodukte
fehlen, von denen für
einige bewiesen wurde, dass sie die frühe Phase der Infektion verändern.
-
Virusbestände des HIV-1NL4-3-Stamms
wurden präpariert
und wie früher
beschrieben (Hum Gene Ther 1995; 6: 1561–1571) titriert. H-9-Zellen
(3 × 105 Zellen) wurden in 1 ml Wachstumsmedium
mit oder ohne γ-GCE,
in einer Auswahl an Konzentrationen, suspendiert und in eine Kammer
von einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen geimpft. Eine Virussuspension,
die 30 pg HIV-1-p24-Antigen enthielt, wurde zu jeder Kammer zur
anfänglichen
Infektion dazu gegeben. Die Infektion wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt, dann wurden
die Zellen einmal mit PBS und noch einmal mit Wachstumsmedium gewaschen.
Der Überstand
des letzten Waschens wurde aufbewahrt als der Zeitpunkt Tag 0. Die
gewaschenen Zellen wurden in entsprechendem Medium resuspendiert
für eine
weitere Inkubation bei 37°C.
Einmal in drei Tagen wurden die Zellsuspensionen und die Überstände geerntet,
um die Zellen zu zählen
und um die Menge an HIV-1-p24-Antigen zu bestimmen. Die Messung
von Zellwachstum, Lebensfähigkeit
und Virusproduktion wurden wie in einem vorhergehenden Abschnitt
beschrieben durchgeführt.
An den Erntetagen verblieben 200 μl
Zellsuspension in jeder Vertiefung und 800 μl frisches Medium mit den entsprechenden
Konzentrationen an γ-GCE
wurden, um das Zellwachstum zu unterstützen, zugegeben außer am 18.
Tag, an dem 400 μl
Zellsuspension übrig
waren und 600 μl
Medium in jede Vertiefung zugegeben wurden. Die Anzahl der Zellen
wurden zu jedem Zeitpunkt dementsprechend bestimmt, basierend auf
der Ansammlung von Verdünnungsfaktoren
zusammen mit der Häufigkeit
der Durchgänge.
Die Infektion von H-9-Zellen
ohne γ-GCE
löste einen
Ausbruch der Virusproduktion am 12. bis 15 Tag nach der Infektion
aus. Während
in Gegenwart von 400 bis 800 μM γ-GCE eine
akute Infektion nicht signifikant unterdrückt wurde, wurde aber bei einer
Konzentration von 1,6 mM γ-GCE
die Ausbreitung von HIV-1 für
den Zeitraum von 21 Tagen nach der Infektion vollständig blockiert
(5, Feld C). Während des gesamten
Experiments, wuchsen die Zellen mit 1,6 mM γ-GCE aktiv weiter, behielten
eine hohe Lebensfähigkeit
bei, wogegen das Wachstum der Kontrollzellen mit einer massiven
HIV-1- Produktion
beeinträchtigtes
Zellwachstum (5, Feld
A) und Zelltod aufwies ( 5,
Feld B). In allen Kontrollzellkulturen mit einer aktiven Produktion
von HIV-1 war die Bildung von Synzytia, am 15. Tag und zu späteren Zeitpunkten
offensichtlich. Mit 1,6 mM γ-GCE,
wurde die Bildung von Synzytia in den Kulturen nicht signifikant
beobachtet (Daten sind nicht abgebildet).
-
Beispiel 5 Direkte Inaktivierung
von HIV-1 durch γ-GCE
-
Die Ergebnisse der akuten HIV-1 Infektionsstudie
warfen eine andere Möglichkeit
auf und zwar, dass γ-GCE
die Infektionsfähigkeit
von HIV-1 vor/während
des Infektionsprozesses inaktivieren könnte. Zur Untersuchung von
dieser desinfizierenden Wirkung von γ-GCE, entwarfen wir eine weitere
Serie von Experimenten und führten
sie durch.
-
Ein HIV-1 Virusstamm (NL4-3), der
6 ng von HIV-1-p24-Antigen enthielt, wurde in Gegenwart oder in Abwesenheit
von γ-GCE
in 20 ml RPMI-1640/10% FBS vier Stunden lang bei 37°C vorinkubiert.
Anschließend wurde
eine akute Infektion von H-9-Zellen
durchgeführt,
wobei 10 ml von jeder vorbehandelten Virussuspension auf 1 ml der
Zellsuspension ohne γ-GCE,
so wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist, eingesetzt
wurden. Probenentnahme und Versorgung der Zellkultur wurden auch
durchgeführt,
dabei wurde nach dem gleichen Verfahren, so wie es im vorhergehenden
Abschnitt beschrieben ist vorgegangen, ohne jedwedes γ-GCE während des
Durchgangs hinzuzufügen.
-
Überraschendeniveise
bewirkte die vierstündige
Behandlung mit γ-GCE
bei einer Konzentration von 1,25 mM oder 2,5 mM einen Rückgang der
Infektionsfähigkeit
von HIV-1, es gab selbst 15 Tage nach der Infektion keine virale
Produktion. Sogar in der niedrigsten Konzentration (625 μM) verursachte γ-GCE einige
Verzögerung
bei der Ausbreitung von HIV-1 in H-9-Zellen. Aber die einstündige Vorinkubation
mit der gleichen Konzentration an γ-GCE ergab keine signifikante
Beeinflussung der viralen Infektiosität (Daten sind nicht abgebildet).
Diese Daten deuten auf die direkte inaktivierende Wirkung von γ-GCE gegenüber HIV-1-Partikeln
hin und könnten
an der hemmenden Wirkung beteiligt sein, die in akuten Infektionsexperimenten
mit HIV-1 beobachtet wurde.
