JPH04504850A - ヌクレオシド誘導体の相乗的組合せを用いたｈｉｖの阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシド誘導体の相乗的組合せを用いたＨＩＶの阻害１、序文 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）複製を阻害し、それによってＨＩ Ｖ感染の作用を制限するヌクレオシド誘導体の組合せを用いることに関する。本 発明の最重要点は、組合せて用いられるヌクレオシド誘導体が、これらの剤の結 合された作用用量は個々に用いたどの薬物の療法上の用量の総和よりも低くなる ような相乗作用を育する、という発見にある。すなわち漸増抗ウィルス活性が細 胞毒性の比例した増大と関連していない。事実ヌクレオシド誘導体の組合せは別 個に投与された同じ化合物と比較した場合、感染されていない細胞に毒性が少な い。

２、発明の背景 ２．１．ヒト免疫不全ウィルス ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡ ＩＤＳ関連症候群の原因となる病原体であると考えられるヒトレトロウィルスで ある。ＨＩＶピリオンまたはウィルス粒子は、およそ１，０００オングストロ一 ム単位幅の球体である。粒子は感染された宿主細胞の外膜より由来の脂肪二重層 膜により、おおわれている。ウィルスエンベロープに植込まれているのは、１６ ０ｋｄの先駆体として合成されひき続いて２個の糖タンパク質、すなわち脂肪二 重層にまたがるｇｐ４１および脂肪二重層より伸びているｇｐ１２０　、にプロ セスされた膜糖タンパク質である。エンベロープはｐ２４およびｐ１８と名付け られたタンパク質から成るコアをおおっている。ウィルスＲＮＡは数個の酵素コ ピー、ウィルスＤＮＡの組立てを触媒する逆転写酵素とともにコア中に担持され る。

ＨＩＶゲノムはレトロウィルス粒子の構成物をコードする３個の遺伝子を含有し ている。すなわちｅｎｖ　（エンベロープタンパク質をコード）、ｊＬＡｉ（コ アタンパク質をコード）、およびｐｏｌ　（逆転写酵素をコード）。これら３個 の遺伝子は末端反復配列（ＬＴＲｓ）と呼ばれるヌクレオチドの断片にはさまれ ている。ＬＴＲｓはウィルス遺伝子の発現を制御する役割を有する配列を包含す る。しかしながら、他のレトロウィルスとは異なり、ＨＩＶのゲノムは少なくと も５個の他の遺伝子を包含し、そのうち３個は調節機能が知られており、その発 現はウィルスにより行なわれる病原性メカニズムに影響を与えると考えられてい る。

ｔａｔ遺伝子はＨｒＶ遺伝子発現のトランスアクチベーター（ｔｒａｎｓ−ａｃ ｔｉｖａｔｏｒ）となりうるものとして機能するタンパク質をコードし、したが ってウィルス複写の増幅に重要な役割を果す。ｒｅｖまたはｔｒｓ／ａｒｔ遺伝 子はトランス活性（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ）の抗抑制メカニズムによりＨＩＶ 合成をアブブレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）することかできる。すなわ ちｒｅｖは組み込まれているＨＩＶウィルスが調節タンパク質またはピリオン構 成物のいずれかを選択的に産生ずるのを可能にする。それとは対照的に、ｎｅｆ または３−ｏ　ｒ　ｆ遺伝子は、おそらく第２のメツセンジャーを通してＨＩｖ ゲノムの転写を阻害する細胞質タンパク質を産生ずることによりウィルスの発現 をダウンレギュレートするように思える。

ｖｉｆまたはｓｏｒ遺伝子はピリオン（ｖｉｒｉｏｎ）形成には不可欠ではない が、感染性ピリオンの効率的生成に不可欠でありインビトロのウィルス伝染に影 響を与える。ｐｒまたはＲ遺伝子は機能が未知の免疫原性タンパク質をコードし ている。

ＨＩＶ感染の免疫病発生に関する重大な根拠はＣＤ４抗原を発現するＴリンパ球 のヘルパー／インデューサーサブセットを欠失し重大な免疫抑制を生ずることで あると考えられている。これらの免疫細胞のウィルスにより殺りくはＨＩＶが免 疫組織に有する能力を失わせる作用に寄与する主要なファクターであると考えら れる。エンベロープ槍タンパク質はＨＩＶがＣＤ４陽性の宿主細胞に入るのに重 要な役割を果たす。ｇｌ）１２０部分が細胞のＣＤ４レセプタ一分子に直接結合 することを示し、それによりＣＤ４レセプター、例えばＴヘルパー細胞（Ｔ４細 胞）、マクロファージ他、を発現する宿主細胞へのＨＩＶのし向性を生じている 。

ＨＩＶがＣＤ４分子に結合した後、ウィルスは内在化し外皮をぬぐ。いったん内 在化すると、ゲノムＲＮＡは逆転写酵素によりＤＮＡに転写される。次いでプロ ウィルスＤＮＡは宿主染色体ＤＮＡに組み込まれ、感染は“休止”または潜伏期 となる。しかしながら、いったん活性化か起こるとプロウィルスＤＮＡが転写さ れる。翻訳および翻訳後のプロセシングによりウィルスの組立ておよび細胞表面 からの成熟ピリオンの発芽を生じる。

ウィルスの活発な複製が起る場合、宿主ＣＤＪ＋細胞はだいたい殺される。しか しながら、ＨＩＶがその細胞変性作用を及ぼす正確なメカニズムは知られていな い。ＨＩＶ惑染の免疫病発生および細胞変性作用に関する数々のメカニズムが提 案されている。

すなわち感染細胞中に組み込まれないウィルスＤＮＡの大量の蓄積、大量のウィ ルスが細胞表面から発芽する際、細胞膜透過性の大きな増大、ＨＩＶか感染Ｔ４ 細胞に末期分化を誘導し知命に導くという説。ＣＤ４分子およびウィルスエンベ ロープの両方か、どういうわけか細胞融合を促進することによりＨＩＶ感染細胞 において細胞変性作用の役割を果すという証拠が増えている。ＨＩＶ感染の細胞 病理における顕著な特徴は、ｇｐ１２０／　ｇｐ４１エンベロープタンパク質に より誘導されたと思える５００細胞にも及ぶ融合により形成された多核シンジチ ア（ｓｙｎｃｙｔ　ｉａ）の形成である。それとは対照的に、ＨＩＶ感染マクロ ファージは長い間細胞変性作用なしにＨＩＶを産生じ続ける、すなわちマクロフ ァージはＩ−（Ｉ　Ｖの主要な保有宿主であり中枢神経系（Ｇａｒｔｎｅｒら、 　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ２３３　：　２１５−２１９）にウィルスを搬送す る役をすると考えられている。

現在、ＡＩＤＳの治療法は全くない。ワクチン試験を、人々の間にウィルスが広 がるのを制御する試みで現在行っている。しかしながら、感染患者の疾患の経過 を制御する努力は抗ウィルス剤の使用に主に向けられている。

２．２．抗ＨＩＶ薬物療法 種々の治療上の方法か、ＨＩＶ感染の罹患率および死亡率を減少するための努力 として現在探究されている（Ｙａｒｃｈｏａｎら、　１９８８゜６１−１５６９ ；　Ｙａｒｃｈｏａｎ、　Ｒ，およびＢｒｏｄｅｒ、　Ｓ。、　１９８７．　Ｎ 、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、　３１６　：　５５７−５６４）。ＨＩＶウィルスの生理学の知識は、 ウィルス複写または感染の散布を妨害するように設計された数々の理論的根拠を 生じたつ中断は標的細胞へのウィルスの結合、細胞膜の融合、ウィルス核酸を包 んでいるものからはがすこと、ＨＩＶＲＮＡゲノムかＤＮＡになる逆転写、ウィ ルスｍＲＮＡの転写または翻訳、ウィルスタンパク質のプロセシング、成熟ピリ オンへの組立て、または複写または感染性に関連するその他の事柄を防ぎうる。

ＨＩＶか細胞膜に結合するのを防ぐ、いくつかの方法か試めされている。すなわ ちこれらは、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０とヘルパーＴリンパ球 のような標的細胞上のＣＤ４抗原との間の相互作用を阻害することに向けられて いる。ＣＤ４抗原へのｇｐｌ、２０の結合は細胞膜へのウィルス侵入だけでなく シンジチア形成にも関連していることが示されている（Ｓｏｄｒｏｓｋｉら、　 Ｎａｔｕｒｅ３２２：　４７０−４７４；　Ｌｉｆｓｏｎら、１９８６．　Ｎａ ｔｕｒｅ　３２３　：　７２５−７２８；　５ｔｅｖｅｎ−ｓｏｎら、１９８８ ．　Ｃｅ１ｌ　５３　：　４８３−４９６）。Ｓｍ１ｔｈら　（１９８７，５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３狙：　１７０４−１７０７）は可溶化ＣＤ４抗原がウィルス粒 子に結合することによりそれらが細胞膜に植め込まれたＣＤ４分子に出会う前に ＨＩＶ感染性をしゃ断できることを示している。一方、抗ＣＤ４抗体に向う抗イ デイオタイプ抗体が、おそら＜ＣＤ４抗原決定基と類似のタンパク質外形を保有 することによりＨＩＶつ、イルスにインビトロで結合することが示されている（ Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、　１９８９゜ｔｌｃＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｍ ｏ１ｅｅｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｊ、　Ｃｅ ｌｌＢｉｏ−ｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ、　１３Ｂ、　ｐ、　２９８）。さらに、デ キストラン硫酸塩を包含する、いくつかの大きな硫酸化した負の電気を帯びた分 子は、インビトロにおいてＨＩＶ複写およびシンジチア形成の阻害を示している （Ｙａｒｃｈｏａｎら、同上）。

アンチセンス（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）オリゴヌクレオチドはウィルス誘導によ るシンジチア形成およびウィルスル２４タンパク質の発現を阻害することがわか っている（Ａｇｒａｗａｌら、　１９８８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　８５ニア０７９−７０８３）。ＨＩＶ 　ｍＲＮＡに相補的である、これらの合成核酸ポリマーはウィルスｍＲＮＡがタ ンノくり質に翻訳されるのを阻害するように設計された。すなわちアンチセンス オリゴヌクレオチドのホスホルアミド酸塩およびホスホロチオ酸塩誘導体を形成 することによりエンドヌクレアーゼ減成に対して実質的に耐性の化合物を産生し ている。

リボース部分およびトリアゾール環を含んでなるリノくビリン（Ｒｉｂａｖｉｒ ｉｎ）はヌクレオシド、グアノシンの類似体として作用すると考えられている。

それは、信じられていることであるが、主にウィルスｍＲＮＡのキャップイング に必要なグアノシレージョンステップを妨害することによりインビトロでのいく つかのＲＮＡウィルスに対して活性を有する。リバビリンはヒトＴリンフく球培 養物中のＨｒＶの複写を抑制すると報告されている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｔ ｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、Ｄｅｃ、１５．　１９８４：　１３６７−１３６９）。

一方、ウィルスタンパク質の翻訳後のプロセシングは中断されうる。すなわち植 物グリコシダーゼ活性、カスタノスノく一ミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎ ｅ）、はシンジチア形成およびＨＩＶ感染性を減少することが示された（Ｗａ　 １１ら、　１９８８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８５　：　５６４４−５６４８）。

ＨＩＶ複写の最期のステップは宿主細胞から出ることおよび新しい細胞標的への 感染である。アルファーインターフェロンはインビトロでのＨＩＶ複写を抑制す ることかわかり（Ｈｏら、　Ｌａｎｃｅｔ。

Ｍａｒｃｈ　１６．１９８５　：　６０２−６０４）、ウィルスの発芽を減少さ せ、およびＡＮ）Ｓと関連した悪性腫瘍であるカポジ筋腫に対して直接の抗腫瘍 性活性を有することか示されている。７：２：１の割合の中性グリセリド、ホス ファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンから成る脂質化合物 、ＡＬ７２１は細胞膜からコレステロールを抽出する証明された能力を育し、Ｈ ＩＶ感染性を減少させるように思える（Ｓａｒｉｎら、１９８５．　Ｎ、　Ｅｎ ｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１３：１２８９−１２９０）。

ＨＩＶ感染を制御するためにいくつかの方法はウィルス逆転写酵素の阻害に関し ており、試験されている。哺乳動物細胞は内生的逆転写酵素活性を欠いているた め、これらの方法は宿主細胞への最少限度の細胞毒性で、ありうる選択的阻害を 提供する。逆転写酵素を阻害すると考えられる薬剤はホスホツギ酸（Ｓａｌｄｓ ｔｒｏｍら。

Ｌａｎｃｅｔ　Ｊｕｎｅ　２９．１９８５　：　Ｌ１４８０）、スラミン（ｓｕ ｒａｍｉｎ）　（Ｍｉｔｓｕｙａら、　１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２６　： 　１７２−１７４）、リファブチン（ｒｉｆａｂｕｔｉｎ）（またはａｎｓａｍ ｙｃｉｎ、　Ａｍａｎｄら、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｊａｎ、比　１９８６．　ｐ、 ９７）および下記されるヌクレオチド誘導体を包含する。

２．２．１．　ヌクレオシド誘導体 ヌクレオシド誘導体はＲＮＡおよびＤＮＡの構築ブロックであるプリン（アデノ シンおよびグアノシン）およびとリミジン（チミジン、ウリジンおよびシチジン ）ヌクレオシドの改変された形態である。逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ は、もし誘導体の５゛炭素が前のヌクレオチドの３′ヒドロキシ基と結合すれば （例えばホスホジエステル結合を形成することにより）発生しているＤＮＡ鎖に 結合し、ヌクレオシド誘導体を組み込む。すなわち続くヌクレオチドは、もしヌ クレオシド誘導体がもうひとつのヌクレオチドの５゛リン酸塩にその３°炭素を 結合させる媒介物を含有すれば、添加される。抗ＨＩＶ薬物療法となりつる研究 中のヌクレオシド誘導体の多くは、全ウィルスゲノムが転写される前にウィルス ＤＮＡ複写が未熟の終結を生じる。これらの誘導体は続くヌクレオシドに結合す る３″置換基を欠き鎖終結を生じる。

ＡＺＴ（３’−アシド−２°、３゛−ジデオキシチミジン、アジドチミジン、ジ ドブデン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）はＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者の治療に効果が あることが示されたヌクレオシド誘導体である。

すなわちデータは、ＡＺＴがＡＩＤＳ患者の平均生存率を増太さ証拠によればＡ ＺＴはＡＩＤＳを有する子供、ＨＩＶ関連の乾せん（Ｂａｒｔｌｅｔｔら、上記 ）、ＡＩＤＳ関連の痴呆（Ｓｃｈｍｉｔｔら、　１９８８゜Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　 Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１９　：　１５７３−１５７８）、およびＨＩＶ関連の血小 板減少症（Ｐｏｔｔａｇｅら、　１９８８．　Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、　２６０　：　 ３０４５−３０４８）に効果があることを示す。ＡＺＴは哺乳細胞によりリン酸 化し少なくとも２つのメカニズムによりウィルスＤＮＡの産生物を阻害すると考 えられるＡＺＴ三リシリン酸ミジン三リン酸の類似物）を形成す。

すなわち競合的阻害およびチェーンターミネーション（Ｙａｒｃｈｏａｎら、上 記）。ウィルス逆転写酵素は天然ヌクレオチドに比べより密にＡＺＴ三リシリン 酸塩合することから、競合的抑制か起こる：ＡＺＴには３゛ヒドロキシル基が欠 如しており従って次に続くヌクレオチドに結合できないことから、ＡＺＴ取り込 みの結果、読み終りが生じる。

ジデオキシヌクレオシドは、２°および３°の両方の炭素残基でヒドロキシル基 が欠如し従ってＤＮＡの読み終りという結果になるようなヌクレオシド誘導体で ある。さらに、ＡＺＴと同じく、２゛。

３°−ジデオキシアデノシン、ジデオキシグアノシン、ジデオキシシチジン、及 びジデオキシチミジンの５゛三リン酸塩生成物は選択的にウィルス逆転写酵素及 び細胞β及びγＤＮＡポリメラーゼを抑制するものの、細胞分割の間に使用され る主なりＮＡ合成酵素であるＤＮＡポリメラーゼαの機能を妨害することはない （Ｅｄｅｎｂｅｒｇ他、１９７８年、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５３ 　：　３２７３−３２８０；　Ｗａｇａｒ他、　１９７８年、　Ｎｕｃｌ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　５；　１９３３−１９４６；　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｉｌｅ ｔ他。

イノシン、シチジン及びチミジン２′、３°ジデオキシヌクレオシドは、ＨＩＶ ウィルスの複製を抑制した（ただし、チミジン誘導体は比較的低い抑制活性を示 した）；基本的に、Ｔ細胞の免疫反応性又は増殖を抑制するのに必要とされるも のに比べ１０分の１から２０分の１の低い用量で、ＨＩＶウィルスの完全な抑圧 が観察された（Ｍｉ　ｔｓｕｙａ及びＢｒｏｄｅｒ共著、　１９８６年、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３　；　１９１１−１９１５）、　Ａｈｌｕｗａｌｉａ他は、 ２’、３’−ジデオキシイノシンの細胞薬理学についての最初の研究を行なった （１９８７年。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　３６　；　３７９７−３８０）　ｏ　Ｐ　Ｃ Ｔ刊行物ＷＯ３７１０１２８４、国際公示日１９８７年３月１２日は、２“、３ °ジデオキシイノシン、２°、３゛−ジデオキシグアノシン及び２’、３’−ジ デオキシアデノシンを含むプリン２゛、３′ジデオキシヌクレオシドによるＨＩ Ｖの生体外感染性及び細胞変性効果の抑制に関するものである。欧州特許出願明 細書第０２７３２７７号、公示日１９８８年７月６日は、２°及び３゛ヒドロキ シル基が欠如しかつ２′及び３′炭素原子の間に２重結合を有する３°−デオキ シチミジン−２゛−エン（３゛−デオキシ−２°、３′−ジデヒドロチミジンｄ ４Ｔ）の、レトロウィルス感染患者の治療における使用に関するものである。２ ’、３’−ジデヒドロ−２’、３’−ジは、ＨＩＶ逆転写酵素を抑制するもので あることがわかっており、又ＡＺＴに匹敵する抗−ＨＩＶ活性を有していた（Ｍ ａｎｓｕｒｉ他、。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、印刷中）、Ｄ４Ｔは又、ＡＺＴに比べ毒性効果も低 い可能性かある（Ｍａｎｓｕｒｉ他、同上：　Ｇｈａｚｚｏｕｌｉ他、　１９８ ８年。

ＩＣＡＡＣ，要約１３０１．　ｐ３４４）。

近年、抗ウイルス効果を示す酸安定性の２′、３″−ジデオキシ−２゛−フルオ ロヌクレオシドについての記述が行なわれた。２゛、３″−ジデオキシ−２゛− フルオロアデノシン及び２゛、３°−ジデオキシ−２°−フルオロイノシンにつ いて記述している欧州特許出願明細書、公示番号第０２８７３１３　Ａ２及び、 フルオロピリミジン誘導体、２゛。

３′−ジデオキシ−２′−フルオロ−アラビノフラノシルシトシン（Ｆ−ｄｄｅ ）について記述している欧州特許出願明細書公示番号第０２９２０２３　Ａ２を 参照されたい。

２　、２．２．抗−ＨＩＶ薬剤の毒性効果ＨＩＶは、そのライフサイクルを完了 するのに必要な組織に供給を与えるためヒトの細胞に依存していることから、ウ ィルス複製の抑制は往々にして、細胞傷害効果を随伴している。ＡＺＴ療法は、 骨髄毒性が随伴しており、（Ｒｉｃｈｍａｎ他、　１９８７．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ 。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１７；　１９２−１９７）、従って、赤血球（結果として貧 血をもたらす）、血小板（結果として血小板減少症をもたらす）及び白血球（結 果として白血球減少症をもたらす）の生産を減少させた。

Ｂａｒｔｌｅｔｔ他（１９８８年、　Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、　２６０　：　３０５１ −３０５２）に従うと、ＡＺＴでの治療を受けた患者の４０パーセントか、究極 的に貧血をもよおして用量の減少又は輸血が必要になったり、白血球減少症が発 症して顆粒細胞数が減少しかくして感染の危険性を増す。ＡＲＣ又はＡＩＤＳに かかった患者のうちわずか約６０％しか、１年の治療後ひき続きのＡＺＴ使用を 許容できないようである。（Ｐｅｔｔｉ−ｎｅｌｌｉ、　Ｃ，Ｂ、　Ｆｅｉｎｂ ｅｒｇ、　Ｊ、、及びエイズ臨床試験班：エイズ患者及び重症ＡＲＣ患者におけ るジドヴディン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）の安全性と許容度、要約；　Ｆｉｓｃ ｈｌ、　Ｍ、　Ａ、及びエイズ臨床試験班［エイズ患者の治療における２つのジ ドヴディン用量の安全性と効果、要約；再書共１９８８年６月１５日のストック ホルム第４回国際エイズ学会で事前に読まれ、Ｂａｒｔｌｅｔｔにより引用され ている）。

これらの毒性効果を避けるため、ＡＺＴはアサイクロビールナトリウム、フォス カルネットナトリウム、インターフェロン−α。

β又はγ、インターロイキン２又はアンブリゲンといったその他の抗ウィルス剤 と組合わせてテストされている。ＡＺＴを２’、３’ジデオキシチジン療法（ｄ 　ｄ　ｅ）でＡＺＴを交替させるその他の研究も又、進行中である（Ｙａｒｃｈ ｏａｎ他、　１９８８年、　Ｌａｎｃｅｔ　１　；　７６−８１）。８週間乃至 １２週間以上の連続高層量のｄｄｅ　（これは比較的骨髄節約力がある）は、痛 みの多い末哨神経疾患の発達と結びつけられる。ＡＺＴとｄｄｅを交替させるこ とにより、両方の毒性効果か最小限におさえられるものと期待されている。効果 が高くかつエイズ患者が臨床的に許容できるものでもあるような治療方法か、現 在健康管理研究書違から切望されている。

３、発明の概要 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）の複製を抑制しかくしてＨＩＶ惑 染を制限するためのヌクレオシド誘導体の相乗的組合せの使用に関する。本発明 に従うと、−緒に使用された場合式る種のヌクレオシド誘導体は、それぞれの薬 剤を別々に使用した場合に比べ、より低い濃度でより高い抗ウイルス効果とより 低い細胞毒性を示し、従ってＨＩＶ惑染の治療を最大限にし、毒性副作用を最小 限におさえる。

本発明の特定の一実施態様においては、プリンヌクレオシド類似体ジデオキシイ ノシン（ｄｄｌ）及びピリミジンヌクレオシド類似体２’、３’−ジデオキシ− ２’、３’−ジデヒドロチミジン（ｄ４Ｔ）を、ＨＩＶ複製抑制のために用いる ことができる。−例として、ｄｄＩ及びｄ４Ｔは強い相乗的抗ＨＩＶ活性を示す ことか立証されている；すなわち、ｄｄｌとｄ４Ｔの組合せは、いずれの化合物 を別々に使用した場合よりも大きな抗−ＨＩＶ効果を生み出したが、結びつけら れた細胞毒性は低いものであった。

本発明のもう１つの実施態様においては、ＨＩＶ複製を抑制するためｄ４Ｔと共 にフルオロヌクレオシド類似体の組合せを使用することができる。例えば、ｄ４ Ｔと共に、プリンヌクレオシド類似体、２’、３’−ジデオキシ−２′−ベータ ーフルオロイノシン（Ｆ−ｄｄＩ）を用いることかできる。

３．１．定義と略語 単数又は複数のいずれの形であれ本書中に使用されている以下の語は、指定され た意味を存するものとする。

組合せ指数（ｃｒ＞・作用物質の組合せの相乗的又は拮抗的効果の数値的表現で あり、ここで１より小さいＣＩは相乗作用を表わし工より大きいＣＩは拮抗作用 を表わし、１というＣＩは相加性を表わす。ＣＩ値は、Ｃｈｏｕ及びＴａ１ａｌ ａｙに従った等ボログラム等式及びコンピュータシミュレーションを用いて得ら れる（１９８４年、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚ、　Ｒｅｇ、　２２：　２７−５５及び １９８７年、「発達ガン化学療法における新たな方法」中、　Ｈａｒｒａｐ及び Ｃｏｎｎａｒｓ、編集、　Ｂｒｉｓ−ｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓシンポジウムシリーズ 、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、３７−６４　；Ｈａｒｔｓｈｏｒ ｎ他、　１９８７年、抗菌剤と化学療法３１　；　１６８−１７２）。

組合せ指数は、以下の等式で決定できるなお式中、（Ｄｘ）、はＸパーセントの 効果を単独で生み出すのに必要な作用物質ｌの用量であり、（Ｄ）１は同じＸパ ーセントの効果を（Ｄ）２との組合せで生み出すのに必要な作用物質ｌの用量で ある。同様に（Ｄｘ）ｚは、Ｘパーセントの効果を単独で生み出すのに必要な作 用物質２の用量であり、（Ｄ）２は、同じ効果を（Ｄ）１との組合せで生み出す のに必要な用量である。）ｌａｒｔｓｈｏｒｎ他（上述）に記述されているよう に、用量−効果曲線の勾配は、複数の作用物質が互いに排他的効果を有するか（ 例えば同様な作用様式）或いは又互いに非排他的効果（例えば独立した作用様式 ）を有するかを示す。

作用物質が互いに排他的である場合、αは０である（すなわち、ＣＩは２つの項 の和である）；作用物質か互いに非排他的である場合αは１である（すなわち、 ＣＩは３つの項の和である）。

相乗作用：２つ以上の物質が、それぞれ個別に用いられた場合の効果よりも大き い効果を達成する作用。抗ウィルス活性における相乗作用は、より大きな抗ウィ ルス活性を意味するものと解釈される；細胞毒性における相乗作用は、より大き な細胞毒性を意味するものと解釈される。

組織培養抑制用量（すなわちＴＣＩＤ、。）：ウイルス表現を一定の与えられた 百分率（すなわち５０パーセント）だけ減少させるのに必要なウィルス量 組織培養毒性用量（すなわちＴＣＴＤｓｏ）　：組繊培養細胞の数を一定の与え られた百分率（すなわち５０パーセント）だけ減少させるのに必要な薬剤の量。

４、図面の説明 図１．パーセント抑制として表わされた、ｐ２５ｇａｇの結合で測定されたｄ４ Ｔ　（破線）、ｄｄｌ（点線）又はｄ４Ｔ＋ｄｄＴ　（実線）の等しい合計濃度 の抗ウィルス活性。

５、発明の詳細な説明 本発明は、ＨＩＶの複製を抑制しかくしてＨＩＶ感染の効果を制限するための、 ヌクレオシド誘導体の相乗的組合せの使用に関する。本発明に従うと、成る種の ヌクレオシド誘導体の組合せは、匹敵する合計薬剤濃度において個々のヌクレオ シド誘導体よりも強い抗ＨＩＶ活性を表わすが、結びつけられた細胞毒性は比較 的低い。

出願人は、本発明を働かせているメカニズムを説明する義務も責任も全く無いか 、それは、ウィルス逆転写酵素活性において自然に起こるヌクレオシドの代替と なりうるちのを含む２つ以上のヌクレオシド誘導体を供給することにより、これ らの誘導体かウィルスＤＮＡ配列内に取り込まれる（そしてひいては発生期ＤＮ Ａの伸長を防ぐことにより逆転写を終結させる）可能性が大幅に増大するからで あると思われる。

決して制限的な意味をもたせるためてはなく、開示を明確にする目的で、本発明 の記述を次の三つの節に分割する：すなわち（１）ヌクレオシド誘導体の組合せ ；（２）ヌクレオシド誘導体の組合せのＨＩＶ抑制効果を実証するための生体外 検定法、及び（３）ＨＩＶ抑制ヌクレオシド誘導体の組合せの治療を目的とした 利用。

５．１．相乗作用あるヌクレオシド誘導体の組合せの識別本発明に従うと、組合 せた形で用いることのできるヌクレオシド誘導体としては、２′、３°−ジデオ キシアデノシン（ｄｄＡ）；２’、３’−ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）：　 ２″、３゛−ジデオキシイノシン（ｄ　ｄ　Ｉ）　；　２’、　３’−ジデオキ シシチジン（ｄｄＣ）；２’、３’−ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）；　２’、 ３°−ジデオキシ−２’、３’−ジデヒドロチミジン（ｄ　４　Ｔ）及び３′− アジド−２°、３゛−ジデオキシチミジン（ＡＺＴ）が含まれるが、これらに制 限されるわけではない。代替的には、ハロゲン化されたヌクレオシド誘導体、好 ましくは、２’、３’−ジデオキシ−２°−フルオロアデノシン；２’、３’− ジデオキシ−２°−フルオロイノシン；２’、３’−ジデオキシ−２″−フルオ ロシトシンを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）２’、３’−ジデ オキシ−２゛−フルオロヌクレオシド、ならびに、２°、３゛−ジデオキシ−２ ’、３’−ジデヒドロ−２゛−フルオロチミジン（Ｆ　ｄ　４　Ｔ）を含む（た だしこれに制限されるわけてはない）２°、３°−ジデオキシ−２゛、３°−ジ デヒドロ−２゜−フルオロヌクレオシドを用いることもてきる。好ましくは、本 発明の２°、３′−ジデオキシ−２′−フルオロヌクレオシドは、２°。

３“−ジデオキシ−２゛−ベーターフルオロアデノシン（Ｆ−ｄｄＡ）、２°、 ３′−ジデオキシ２°−ベーターフルオロイノシン（Ｆ−ｄｄＩ）及び２’、３ ’−ジデオキシ−２゛−ベーターフルオロシトシン（Ｆ−ｄｄｅ）を含む（ただ しこれらに制限されるわけではない）、フッ素連結がベータ構成であるようなも のである。

２’、３’−ジデオキシイノシン（ｄｄｌ）と２°、３゛ジデオキシ−２’、３ ’−ジデヒドロチミジン（ｄ　４　Ｔ）の組合せは、本発明の好ましい一実施態 様である。２′、３°−ジデオキシ−２゛−ベーターフルオロイノシン（Ｆ−ｄ ｄｌ）及び２°、３′−ジデオキシ−２′、３゜−ジデヒドロチミジン（ｄ　４ 　Ｔ）の組合せも同様に好ましい一実施態様である。２°、３゛−ジデオキシ− ２゛−フルオロヌクレオシド及び２’、３’−ジデオキシ−２′、３°−ジデヒ ドロ−２゛−フルオロヌクレオシドのさらに詳しい説明については、本書に全文 参考として内含される、５ｔｅｒｚｙｃｋｉ、　Ｍａｎｓｕｒｉ及びＭａｒｔｉ ｎか１１月１２日付で出願した同時係属出願第１２００５１号を参照されたい。

ヌクレオシド誘導体の組合せの潜在的な治療効率を評価するため、これらの組合 せを、当該技術分野において既知の方法に従って抗ウィルス活性についてテスト することができる。例えば、Ｈ■Ｖ細胞毒性、シンジチア形成、逆転写酵素活性 又はウィルス性ＲＮＡ又はタンパク質の生成を抑制するヌクレオシド組合せの能 力を、生体外でテストすることができる。

各々について広い濃度範囲にわたるヌクレオチド誘導体の組合せを、抗ウィルス 活性及び／又は細胞傷害活性についてテストすることかでき、以下の第６．１節 に概略が記されている方法に従つて、組合せ指数を導き出すことができる。ヌク レオシド誘導体組合せのＨＩＶ抑制効果を立証するための好ましい方法は、以下 の第５，２節及び例の節６に記されている。さらに、ヌクレオシド誘導体の組合 せを、シミアン免疫不全症ウィルス（ＳＩＶ）系といったエイズに対する動物モ デルシステムを用いて生体内で抗ウィルス活性についてテストすることができる （Ｋａｎｋｉ他、　１９８５年。

「科学Ｊ　２３０　；　９５１−９５４）　；　ｔ、かじながら、動物のさまざ まな種（或いは１つの種の中でも異なる細胞型）はこれらの薬剤をリンの１つの 細胞型）で得た実験結果を他の種（又は細胞型）で得られた結果に対し外挿する 場合には、極めて用心しなくてはならな８３３−７；　Ｏｎｏ他著、、　１９７ ９年、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ 。

８８　：　１２５５−１２６２）。これらの組合せのための細胞傷害用量を設定 することが可能であり、最大の相乗作用を示すすなわち最高の抗ウィルス活性及 び／又は最低の細胞毒性と結びつけられる組合せか、ヒトでの使用のために考慮 できるものである。

ヌクレオシド誘導体組合せの抑制活性は、本書の第６節以降にいてテストするこ とができる。例えば、選択されたいずれかのヌクレオシド誘導体の組合せの効力 は、ＨＩＶに感染しつる標的細胞系統を用いて生体外でＨＩＶ感染細胞内の（ａ ｌシンジチア形成及び（ｂ）ＨｒＶ粒子の生産を抑制するその相対的能力によっ て評価されつる。一般に、このような細胞系統は、Ｔ細胞又は骨髄法／単球性系 列又はＣＤ４に対する遺伝子が形質移入されたもう１つの細胞型のものである。

代替的には、ヌクレオシド誘導体が「標的とする」分子例えば単クローン性抗体 、ホルモン、成長因子などに結合されたとすると、標的細胞系統はそのヌクレオ チド誘導体に対し複合された分子のための適切な細胞表面抗原又は受容体を表現 するはずである。

選択されたヌクレオシド誘導体の組合せの効力を評価するためには、標的細胞は 、生体外で増殖され、ＨＩＶで感染させられ、感染前、感染中及び感染後に一連 の用量のヌクレオチド誘導体で処理されなくてはならない（例えば、制限された 希釈技術を用いることができる）。ピリオン生産に対する抑制効果は、例えば、 （ａｌ培養基内の２５ｇａｇウィルスコアタンパク質又は逆転写酵素といったＨ ＩＶタンパク質について検定することによりＨＩＶの生産を；（ｂ）免疫蛍光検 査法により細胞内のＨＩＶ抗原の誘発を：又はＦＣ）目で評価された融合細胞形 成の減少を測定することによって、説明通り評価することかできる。ＨＩＶを抑 制するヌクレオシド誘導体組合せの能力は、テスト対象であるヌクレオチド誘導 体組合せの抑制活性及び抑制用量を表わすものである。

５．３．ＨＩＶ−阻害性の相乗作用誘導体組合せの治療上の使用相乗作用性ヌク レオシド誘導体組合せは、本発明に従って生体内で使用することができ、シンチ チアの形成及びＨＩＶウィルス粒子の生産を防止し、こうして、曝露された患者 中のＨＩＶ感染の進行を阻害できる。好適な薬理学上の担体中に製剤化された有 効投薬量のヌクレオシド誘導体は、注射（例えば、静脈内注射、腹腔内注射、筋 肉内注射、皮下注射、等）を含むが、これらに限定されない適当な経路により、 上皮内層または皮膚粘膜内層（例えば、口粘膜、直腸上皮内層及び膣上皮内層、 鼻咽頭粘膜、腸粘膜、等）中の吸収、等により投与し得る。

加えて、ヌクレオシド誘導体は、インビボ投与に先立って好適な薬理学上の担体 中で混合されてもよく、担体または標的分子（例えば、抗体、ホルモン、成長因 子、等）に結合されてもよく、且つ／またはリポソーム、マイクロカプセル、お よび制御放出製剤に混入されてもよい。

別の実施態様では、相乗作用性ヌクレオシド誘導体組合せは、ＨＩＶ惑染のその 他の治療と組合せて使用し得る。例えば、限定のためではなく、相乗作用性ヌク レオシド誘導体は、逆転写酵素活性を阻害するその他の抗ウイルス性化合物（例 えば、ＡＺＴ）；細胞へのＨＩＶ吸収を阻害する可溶性ＣＤ４またはモノクロー ナル抗体二またはその他のサイトカイン及び成長因子（例えば、インターフェロ ンα、βまたはγ：腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、顆粒球／単球コロニ ー刺激因子；コロニー刺激因子−１、等）；およびエイズ患者を日和見感染する その他の微生物またはウィルスを治療するのに使用される薬剤と組合せて使用し 得る。

本発明の別の実施態様では、相乗作用性ヌクレオシド誘導体は種々の薬剤の効能 を試験するのに試験管内で使用し得る。これに関して、例えばまだ正常細胞に害 を及ぼさないウィルスを死滅させるもの、または骨髄の再生を刺激するものを同 定するために、エイズ患者から骨髄試料を得、その骨髄を試験される薬剤、化合 物または療法に試験管内で曝露することが有利である。しかしながら、エイズ患 者から得られた骨髄は試験管内で非常に不充分な骨髄コロニー形成を示す。これ は、おそら＜ＨＩＶによる前駆体ＣＤ３４細胞の感染のためである。その結果、 試験管内で試験される種々の薬剤の効能は評価し難く、または評価するのが不可 能である。このようなアッセイ系でＨＩＶを阻害するための相乗作用性ヌクレオ シド誘導体の使用は、試験管内で骨髄コロニー形成を増加し、それ故、試験管内 で骨髄活性に対する種々のその池のプロトコルおよび薬剤のスクリーニングを可 能にするだろう。

６、実施例；ジデオキシジデヒドロチミジンおよびジデオキシイソシンを使用す るＨＩＶ感染の阻害 下記の実験は、試験管内で培養中のＴ細胞源の標的細胞のＨＩＶ感染に関するジ デオキシジデヒドロチミジン（ｄ　４　Ｔ）およびジデオキシイノシン（ｄｄｌ ）の阻害効果を示す。

最初に、ＣＥＭ−Ｆ細胞を急性ヒトリンパ芽球性白血病から誘導し、これは確立 されたＴリンパ芽球様細胞株に相当した。それらはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎてＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣＮ ｏ、ＣＣＬ　１１９）として入手し得る。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のＬＡｖＩｌｌｌｌｕ株ヲ、フランス、パリの Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒのＤｒ、　Ｌｕｃ　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒか ら得た。そのウィルスはＣＥＭ−Ｆ細胞に適しており、これを液体窒素中で小ア リコートとして貯蔵した。そのウィルスの力価を２〜３週毎に測定し、これをＴ ＣＩＤ、。（組織培養阻害投与量、即ちウィルス発現を５０％減少するのに必要 なウィルスの量）として表わす。下記のサブセクションに記載された全ての実験 に於いて、５０ＴＣｒＤＳ。のウィルス投与量を使用した。

ＣＥＭ−Ｆ細胞およびＨＩｖウィルスの両方をＬＡＶ／ｃＥＭ培地中で増殖させ た。その培地は、１％のグルタミン、１００［Ｊ／ｍｌのペニシリン、　１００ μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２μｇ／ｍｌのポリブレン、および１０％の ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ　１６４０かジデオキシジデヒドロチミジン（ ｄ　４　Ｔ、　ＢＭＹ２７８５７−３／８、ロツ）　＃２６６３０−２３Ａ）　 オヨヒシデオＪＦシイ／　’、ｉン（ｄ　ｄ　Ｉ　、　ＢＭＹ４０９００゜ロフ ト＃２５８７９−４６−１）を、ブリストルーマイヤー社のＰｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｄｉｖｉｓｉ ｏｎから得た。両方の化合物を、２−３滴のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ， Ｄ−８７７９）、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ。

Ｃｏ、　）およびＬＡＶ１０ＥＭ培地に懸濁させた。次に、その懸濁液を音波処 理しくＭｉｃｒｏｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｄｉｓｒａｐｔｅｒ、　Ｋｏｎｔｅｓ ）、１ｍＭの最終濃度にした。全希釈液をその１ｍＭの原液からつくった。薬剤 の組合せた抗−ＨＩＶ効果を試験するために、二つの異なる組の実験を行なった 。第一の組では、一つの薬剤を一定の濃度に保ち、一方、他の薬剤濃度を変える ように、薬剤を混合した。例えば、ｄ４Ｔを０．０１．０．１、ｌまたは１０μ Ｍｌ：保ち、一方、ｄｄｌ（７）範囲は０．１．１１１０〜１００μＭであった 。この設定では、夫々の混合物中の薬剤の比は異なっていた。ｄ４Ｔとｄｄｌと の相乗作用の程度を更に正確に測定するために、第二組のアッセイでは、薬剤を １０４Ｍおよび５０μＭで開始してｌ：５の比で混合し、２倍に希釈した。この ようにして、薬剤の比を全希釈液中で一定に保った。”Ｄｏｓｅ−Ｅｆｆｅｃｔ 　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒｓ″ソフトウェア 　（Ｃｈｏｕ、Ｊ、ａｎｄ　Ｔ−Ｃ，Ｃｈｏｗ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−Ｂｉｏｓｏ ｆｔ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。

１９８６）を使用して、そのデータを評価した。等しい薬剤比の実験に於いて、 薬剤の比が１＝１であり、両方の薬剤の開始濃度が１００μＭであった以外は、 同じ二つのプロトコルを使用して未感染細胞に関するｄ４ＴおよびｄｄＩの毒性 を評価した。アジドチミジン（ＡＺＴ、　ＢＭＹ２７７５５／７、ロット＃２３ ００−３８）を、全てのアッセイで陽性対照として使用した。

６．１．３．　Ｄ４ＴおよびＤＩ］の増殖効果の測定夫々のアッセイに関して、 ２Ｘ１０’個のＣＥＭ−Ｆ細胞／ウェルを９６ウエルプレートに塗布した。細胞 を夫々の異なる組合せと混合し、夫々を四重にセットした。全容積／ウェルは２ ５０μｌであった。プレートを３７°Ｃで５％のＣＯ□で６日間インキュベート した。６日目に、細胞を４時間にわたってｌμＣｉ／μＣ用の３ＨＴｄＲ（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐ、、比活性６．７Ｃｉ／ミリモ ル）でラベルし、ガラス繊維フィルター上に回収し、シンチレーションカウンタ ーでカウントした（Ｈａｒｔｚｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、、　Ｓｅｇａｌｌ、　Ｍ、、 　Ｂａｃｈ、　Ｍ。

Ｌ、、およびＢａｃｈ、　Ｆ、Ｈ，、１９７１，Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉ ｌｉｔｙ　ａ＋ａｔｃｈｉｎｇ。

ＶＬ　Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍ１ｘｅｄ　１ｅｕｋ ｏｃｙｔｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｓｔ　：Ａ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｒｅ ｐｏｒｔ、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、　１１　：　２６８−２７３） 。その結果を、薬剤を使用しないでインキュベートされた細胞からなる対照に対 する３ＨＴｄＲ取り込み率（％）として表わした。その他に、結果を組織培養毒 性投与量５０（ＴＣＴＤｓ。）として表わすことかでき、これは対照と比較して 細胞数を５０％減少するのに必要な一種以上の薬剤の量（μｇ）に相当する。

６．１．４．　ＨＩＶ複製（７）阻害 ＣＥＭ−Ｆ細胞を２Ｘ１０’個の細胞／ウェルで９６ウエルプレートに塗布し、 ５０ＴＣＩＤＳ、のウィルスと４５分間混合した。４５分後に、ヌクレオシド誘 導体を夫々のウェルに添加し、増殖アッセイに関して記載したようにインキュベ ートした。６日目の終了時に、下記の抗原捕獲ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、 上澄をウィルス抗原の存在に関して試験した。そのアッセイはウィルスコアータ ンパクｐ２４ｇａｇに対する二つのモノクローナル抗体を使用する（）Ｉｕ、　 Ｓ、Ｈ。

ら、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ３２８　：　７２１−７２３　；およびＫｉｎｎ ｅｙ　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｅ、ら。

１９８８、　ＡＩＤＳ　２・２５−２９）。

６　、１．５．抗原捕獲アッセイ このアッセイに関して、マイクロタイタープレート（９６ウエルプレート）を二 つのモノクローナル抗体：　２５−２　（ＡＴＣＣ＃９４０７）および２５−３ 　（ＡＴＣＣ＃９４０８）で被覆した（夫々１　：　２５００で希釈した）。

これらの抗体（捕獲試薬）は、ｐ２４、ｐ４０、およびｐ５５　ＨｒＶｇａｇタ ンパクに対して特異的である。血清陽性の固体の血清から精製したホースラディ ツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合ヒトＩｇＧをシグナルとして使用した 。吸光度（４５０／６３０ｎｍ）を、基質−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） の添加後に測定した。ＯＤの読み取りは三つのカテゴリーに入る：実験値＝細胞 、ウィルス接種物および一種以上のヌクレオシド誘導体を含むウェルからの値： そして対照値＝細胞およびウィルス（１００％）を含むウェルからの値；そして バックグラウンド＝ウィルス接種物のみを含むつ工ルからの値。バックグラウン ド値を全てのＯＤ値から引いた。一種以上のヌクレオシド誘導体の抗ウイルス効 果を、対照に対するｐ２４ｇａｇ結合率（％）として表す。例えば、その値が２ ０％である場合、それは、ｐ２５ｇａｇ結合により間接的に測定されるウィルス 複製か８０％阻害されることを意味する。

６　、１．６．合胞体の形成 抗原捕獲検定用の上溝を集める前に、すべてのウェルは肉眼で調べた。これは感 染が起こったことを確かめるために、且つ細胞の状態をチェックするために行わ れた。合胞体は観察しやすかった。それらは計数しなかったが、ウェル間のそれ らの数の差異は非常に明白であった。

６．１．７．細胞毒性の分析 Ｄ４ＴおよびＤＤＩの毒性は宿主細胞ＣＥ　Ｍ　−Ｆ　（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９ ）に対して試験した。ＣＥＭ−ＦはＣＤ４レセプターを構成的に発現するＴ細胞 系列であり、従って、ＨＩＶ感染に適した宿主細胞ターゲットである。未感染細 胞の増殖に対するＤ４ＴおよびＤＤＩの作用は、Ｄ４ＴおよびＤＤＩで処理した 未感染ＣＥＭ−Ｆ細胞へのチミジン取込みを測定することにより評価した。

ｐ２５ｇａｇ蛋白のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定は、ｐ２５ｇａｇ発現を阻止すること に対するｄｄｌと組合わせたｄ４Ｔの強い相乗作用を明らかにし、個々に使用し たいずれの化合物よりも強い抗ウィルス活性を示した。

ｐ２５ｇａｇの結合検定の結果は表Ｉに示しである；同じ総濃度て使用したｄ４ ＴとｄｄＩの組合わせと各薬物との比較は図１に示しである。

表Ｉは、最大抗ウィルス活性を達成するためのｄ４ＴおよびＤＤｒの最適濃度お よび濃度比を見つけるために実施した一連の実験の結果を表す。いろいろな組合 わせ中の各誘導体の濃度の対数増加を、テストの“チェックボード”パターンを 使って評価することにより、広範囲の濃度が試験された。

ｄ４ＴおよびｄｄＩのウィルス複製の阻害パーセント９Ｄ４Ｔの　ｄｄＩの濃度 （μＭ） 濃度（μＭ）　Ｑ　、１　１　１０　１００．０１　２　２５　１３　３８　８ ３ ．１　１　２６　１１　１３　７６ 本ｐ２５ｇａｇ結合により測定 ｄ４ＴまたはｄｄＩをＡＺＴと共に１＋１０：５０の濃度で使用したとき、ｄ４ ＴとｄｄＩの組合せで観察された相乗作用より弱い相乗作用か達成された（表■ およびセクション６．３参照）。

６　、２．２．　ヌクレオシド誘導体の組合わせの低下した細胞毒性３Ｈ−チミ ジン取込みを測定する細胞毒検定は、併用されたｄ４ＴおよびｄｄＴが、増加し たウィルス毒性にもかかわらず、個々に使用した同一濃度の化合物よりもＣＥＭ −Ｆ細胞に対する毒性かかなり低いことを示す。広範囲の濃度のｄ４Ｔ、ｄｃｌ Ｉ、または１１の比でｄｄＩと組合わせたｄ４Ｔに関するこれらの検定の結果は 表■に示しである。

増加する濃度のｄ４Ｔおよび／またはｄｄＩにさらされたＣＥＭの細胞毒パーセ ント。

Ｄ４Ｔの　ｄｄＩの濃度（μＭ） 濃度（μＭ）０　．１　１　１０　１００本３Ｈ−チミジン取込みにより測定 上記データは、ヌクレオシド誘導体ｄ４ＴおよびｄｄＩが、組合わせて使用した とき、強い相乗的抗ウィルス作用を示すことを表している。例えば、表■を参照 すると、１μＭの濃度のｄ４Ｔはウィルス活性の２４％阻害をもたらし、そして １０ＭＭの濃度のｄｄＴはウィルス活性の２％阻害と関連していた；しかしなが ら、１０ＭＭのｄｄｌと組合わせた１４Ｍのｄ４Ｔは７５％のＨＩＶ阻害を達成 した。図１はヌクレオシドの同じ総濃度でのｄ４Ｔ、ｄｄＴ、および（ｄ４Ｔ＋ ｄｄＩ）の抗ウィルス活性を示すグラフであり、ｄｄＩと共に使用したｄ４Ｔの 相乗作用を示している。

組合わせ指数（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　１ｎｄｅｘ　：　ＣＩ）は薬物組合わ せの相乗または拮抗作用を表わす数である。ＣＩ値はアイソボログラム（ｉ　５ ｏｂｏ　ｌｏｇｒａｍ）方程式およびＣｈｏｕによるコンピューターシミュレー ションを使って得られる（セクション３．１参照）。ｌより小さいＣＩ（Ｉｆは 相乗（すなわち、全体かその部分の和より大きい）を表し、ｌより大きいＣＩは 拮抗（すなわち、全体がその部分の和より小さい）を表し、そしてｌに等しいＣ Ｉは相加（すなわち、全体がその部分の和に等しい）を表す。表■は、ＡＺＴ、 ｄ４ＴおよびｄｄＩ濃度が１：１０：５０の比である場合の抗ウィルス作用に対 する（ｄ４Ｔ＋ｄｄｌ）、（ｄ４Ｔ＋ＡＺＴ）　、および（ｄｄｌ＋ＡＺＴ）の ＣＩ値を示す。

ウィルスの５０．７０および９０％阻害における抗ＨＩＶ作用ＣＩ値 化合物　５０％　７０％　９０％ Ｄ４Ｔ　＋　ＤＤＴ　０．０２４　０．０４９　０．１６Ｄ４Ｔ　＋　ＡＺＴ　 Ｏ，５３０，４３０，３０ＡＺＴ　＋　ＤＤＩ　０．７７　０．７４　０．７５ ｄ４ＴとｄｄＩの相乗関係のために、比較的低濃度のヌクレオシドを使って効果 的なウィルス阻害を達成することができる。表■に示すように、ｄ４Ｔ、！：ｄ ｄＩの組合わせの増大した抗ウィルス活性は細胞毒性の増加と無関係であり、こ うして選択的抗ウィルス活性が達成された。さらに、ｄ４Ｔおよびｄｄｌ単独ま たはこれらの組合わせのＴＤ、。（毒性用量）を決定する研究は、単独で使用し たｄ４Ｔおよびｄｄｌの両方のＴＤ、。が１ｏｏμＭ以上であるのに対して、Ｄ ４ＴとＤＤＩの組合わせのＴ　Ｄ　ｓ。が７３０μＭであることを明らかにした （データは示してない）。１：１０：１０の濃度比のＡＺＴ、ｄ４Ｔおよびｄｄ ｌの組合わせの細胞毒作用のＣＩは、ＨＩＶ活性の９０％を阻害する濃度で、ｄ ４ＴとｄｄＩの組合わせが等しい抗ウイルス濃度の（ｄ４Ｔ＋ＡＺＴ）または（ ｄ　ｄ　Ｉ　＋ＡＺＴ）よりも著しく低いことを示す（表■参照）。

従って、ｄ４Ｔとｄｄｌの組合わせは個々考えたｄ４ＴまたはｄｄＩよりも一層 抗ウイルス性であるばかりでなく、　（ｄ４Ｔ＋ｄｄｌ）はより低い細胞毒性で ある。こうして、ＨＩＶ感染症を処置するための治療ウィンドーはこれらのヌク レオシド誘導体を併用することによって広くなる：治療抗ＨＩＶ作用が危険また は苦痛を伴う合併症の心配なしに患者において達成されるだろう。

（本頁以下余白） ５０および９０％ウィルス阻害に相当するヌクレオシド濃度での細胞毒性ＣＩ値 化合物　５０％　９ｏ％ Ｄ４Ｔ　＋　ＤＤＩ　２．１７　６．４０Ｄ４Ｔ　＋　ＡＺＴ　２．４５　１． ６６ＡＺＴ　＋　ＤＤＩ　２．２１　２．３７手続補正書彷功 平成　３年１０月１１日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ感染細胞をヌクレオシド誘導体の相乗的組合わせと接触させることか ら成る、ＨＩＶの阻害方法。
2. ２．インビトロで行う、請求項１の方法。
3. ３．インビボで行う、請求項１の方法。
4. ４．哺乳動物において行う、請求項３の方法。
5. ５．ヒトにおいて行う、請求項３の方法。
6. ６．ヌクレオシド誘導体の少なくとも１種は２′，３′−ジデオキシヌクレオシ ドである、請求項１、２、３、４または５の方法。
7. ７．ヌクレオシド誘導体の１種は２′，３′−ジデオキシイノシンである、請求 項１、２、３、４または５の方法。
8. ８．ヌクレオシド誘導体の１種は２，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒド ロチミジンである、請求項１、２、３、４または５の方法。
9. ９．ヌクレオシド誘導体の１積は２′，３′−ジデオキシ−２′−フルオロヌク レオシド誘導体である、請求項１、２、３、４または５の方法。
10. １０．フルオロヌクレオシド誘導体は２′．３′−ジデオキシ−２′−フルオロ イノシンである、請求項９の方法。
11. １１．フルオロヌクレオシド誘導体は２′，３′−ジデオキシ−２′−べーター フルオロイノシン（Ｆ−ｄｄＩ）である、請求項１０の方法。
12. １２．フルオロヌクレオシド誘導体は２′，３′−ジデオキシ−２′−フルオロ アデノシンである、請求項９の方法。
13. １３．フルオロヌクレオシド誘導体は２′，３′−ジデオキシ−２′−べーター フルオロアデノシン（Ｆ−ｄｄＡ）である、請求項１２の方法。
14. １４．フルオロヌクレオシド誘導体は２′，３′−ジデオキシ−２′−フルオロ シトシンである、請求項９の方法。
15. １５．フルオロヌクレオシド誘導体は２′，３′−ジデオキシ−２′−べーター フルオロシトシン（Ｆ−ｄｄＣ）である、請求項１４の方法。
16. １６．他の抗ＨＩＶ治療剤と共に使用する、請求項３の方法。
17. １７．日和見感染を含むＨＩＶ関連疾患の１種またはそれ以上の治療剤と共に使 用する、請求項３の方法。
18. １８．少なくとも１種のヌクレオシド誘導体は第二分子に化学的に結合される、 請求項１、２、３、４または５の方法。
19. １９．ＨＩＶ感染細胞を２′，３′−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）と２′，３ ′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒドロチミジン（ｄ４Ｔ）の組合わせと接触 させることから成る、ＨＩＶの阻害方法。
20. ２０．ｄＴ対ｄｄＩの比は約１：１−１：１０である、請求項１９の方法。
21. ２１．ｄＴ対ｄｄＩの比は約１：５である、請求項１９の方法。
22. ２２．ＨＩＶ感染細胞を２′，３′−ジデオキシ−２′−ベーターフルオロイノ シン（Ｆ−ｄｄＩ）と２′，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒドロチミジ ン（ｄ４Ｔ）の組合わせと接触させることから成る、ＨＩＶの阻害方法。
23. ２３．ＨＩＶ感染細胞を２′，３′−ジデオキシ−２′−ベーターフルオロアデ ノシン（Ｆ−ｄｄＡ）と２′，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒドロチミ ジン（ｄ４Ｔ）の組合わせと接触させることから成る、ＨＩＶの阻害方法。
24. ２４．ＨＩＶ感染細胞を２′，３′−ジデオキシ−２′−ベーターフルオロシト シン（Ｆ−ｄｄＣ）と２′，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒドロチミジ ン（ｄ４Ｔ）の組合わせと接触させることから成る、ＨＩＶの阻害方法。