DD301787A9 - Hemmung von hiv mit hilfe von synergistischen kombinationen von nucleosidderivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Anwendung von synergistischen Kombinationen von Nucelosidderivaten zur Hemmung der Replikation des Humanimmunmangelvirus (HIV) unter Begrenzung der HIV-Infektion. In einer besonderen Ausführungsform zeigt das Purinnucleosidanalogon Dideoxyinosin in Kombination mit dem Pyrimidinnucleosidanalogon 2',3' -Dideoxy-2',3' -didehydrothymidin (d 4 T) eine starke synergistische Wirksamkeit und eine verringerte zelltoxische Wirksamkeit gegenüber Säugerzellen.{In-vitro-Methode; Hemmung; HIV; synergistische Kombination; Nucleosidderivate; 2,3}

Description

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1. Einleitung

Die Erfindung betrifft eine In-vitro-Methode zur Hemmung von HIV unter Verwendung synergistischer Kombinationen von Nucleosidderivaten, sowie die Verwendung dieser Kombinationen von Nucleosidderivaten, zur Hemmung der Replikation des HIV (Immunmangelvirus beim Menschen), wodurch die Wirkungen der HIV-Infektion begrenzt werden. Eine Verwendung der

Nucleosidkombinationen ist sowohl in vitro als auch in vivo möglich. Der Kern der Erfindung liegt in der Feststellung, daß in Kombination verwendete Nucleosidderivate synergistische Wirkungen derart haben, daß die kombinierte effektive Dosis dieser Stoffe niedriger ist als die Summe der therapeutischen Dosierungen jedes einzeln angewendeten Wirkstoffs. Eine erhöhte antiviralo Wirksamkeit hängt nicht mit einer entsprechenden Erhöhung der Zelltoxizität zusammen. Kombinationen von Nucleosidderivaten sind im Vergleich zu identischen Verbindungen, die getrennt verabreicht werden, für nichtinfizierte Zellen sogar weniger toxisch. Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Mittel, die solche synergistische Kombinationen enthalten.

2. Ausgangssituation der Erfindung

2.1. Immunmangelvirus beim Menschen

Das menschliche Immunmangelvirua- (HIV) ist ein Humanretrovirus, von dem man annimmt, daß es der Verursacher des erworbenen Immunmangolsyndroms (AIDS) und des AIDS-bezogenen Komplexes (ARC) ist. Das HlV-Virion oder Viruspartikel ist eine Kugel, die ca. 1000 Angstrom-Einheiton im Durchmesser groß ist. Das Partikel ist von einer Lipiddoppelmembran bedeckt, die von der Außonmembran der infizierten Wirtszelle abgeleitet ist. Die Virusmembran ist von einem Müllglycoprotein besetzt, welches als eine Vorstufe von 1COKd synthetisiert und anschließend zu zwei Glycoproteinen verarbeitet wird: gp41, das die LipiddopDelschicht umspannt, und gp120, das sich über die Lipiddoppelschicht hinaus erstreckt. Die Hülle bedeckt einen Kern, der aus Proteinen besteht, die mit p24 und ρ 18 bezeichnet sind. Die virale RNA wird zusammen mit mehreren Kopien des Enzyms, Umkehrtranskriptase, die den Satz von viraler DNA katalysiert, im Kern getragen.

Das HIV-Genom enthält drei Gens, die die Komponenten der Betroviruspaitikel kodieren: env (Kodierung für die Hüllproteine), gag (Kodierung für die Kernproteine) und pol (Kodierung für Umkehrtranskriptase). Diese drei Gene sind von Abschnitten von Nucleotiden flankiert, die als lange terminale Wiederholungen (LTR) bezeichnet werden. Die LTRs beinhalten Sequenzen, die bei der Steuerung der Expression von Virusgenen eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu anderen Retroviren enthält das HIV-Genom jedoch mindestens fünf zusätzliche Gene, von denen drei bekannte Regulationsfunktionen haben und deren Expression eine Auswirkung auf die von dem Virus ausgeübten pathogenen Mechanismen haben soll. Das tat-Gen kodiert ein Protein, das als ein potenter Transaktivator der HIV-Genexpression fungiert und somit eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der Virusreplikation spielt. Das rev- oder trs/art-Gen kann die HIV-Synthese durch einen übertragenden Antirepressionsmochanismus nach oben regulieren; rev ermöglicht, daß das integrierte HIV-Virus selektiv entweder Regulationsproteine oder Virionkomponenten erzeugt. Im Gegensatz dazu scheint das nef- oder 3'-orf-Gen die Virusexpression durch Erzeugung e!nes zytoplasmatischen Proteins nach unten zu regulieren, welches wahrscheinlich über einen zweiten Boten die Transkription des HIV-Genoms hemmt. Das vif- oder sor-Gen ist für die Virionbildung nicht notwendig, es ist jedoch entscheidend für die wirksame Generation von infektiösen Virionen und beeinflußt die Virusübertragung In vitro. Da:: or- oder R-Gen kodiert ein immunogenes Protein unbekannter Funktion.

Die entscheidende Grundlage für die Immunopathogenese der HIV-Infektion ist vermutlich dio Verarmung an der Helfer/ Induktormenge von T-Lymphozyten, die das CD4-Antigen ausprägen, was zu einer tiefen Immunsuppression führt. Das Virustöten dieser Immunzellen wir J als ein Hauptfaktor angesehen, der zu der lähmenden Wirkung beiträgt, die HIV auf das Immunsystem hat. Das HüllglycopiO. ^;n spielt eine wichtige Rolle beim Eintritt von HIV in CD4 positive Wirtszellen. Für den gp 120-Abschnitt ist gezeigt worden, daß er direkt an das zelluläre CD4-Rezeptormoleki^;l bindet, wodurch Tropismus des HIV für Wirtszellen erzeugt wird, die den CD4-Rezeptor ausprägen, z. B. T-Helferzellen (T-4- Zellen), Makrophagen usw. Nach Bindung des HIV an das CD4-Molekül ist der Virus verinnerlicht und ohne Hülle. Einmal verinnerlicht, wird die genomische RNA durch die Enzymumkehrtranskriptase zu DNA transkribiert. Die Provirus-DNA wird dann in die Wirtschromosomen-DNA integriert, und die Infektion kann eine ruhende oder latente Phase annehmen. Wenn es jedoch zur Aktivierung kommt, wird die Provirus-DNA transkribiert. Translation und posttranslationale Verarbeitung führt zu Virusaufbau und zum Sprießen von reifen Virionen von der Zelloberfläche.

Wenn es zu einer aktiven Virusreplikation kommt, wird die Wirts-CD-4+-Zelle gewöhnlich getötet. Der genaue Mechanismus, mit dem das HIV seine zytopathische Wirkung ausübt, ist jedoch unbekannt. Es sind eine Reihe von Mechanismen für die Immunopathogenese und die zytopathische Wirkung der HIV-Infektion vorgeschlagen worden: die Akkumulation von großen Mengen nichtintegrierter Virus-DNA in den infizierten Zellen; massive Erhöhung der Durchlässigkeit der Zellmembran beim Sprießen großer Virusmengen von der Zolloberfläche; Spekulationen darüber, daß HIV eine terminale Differenzierung von indizierten T4-Zellen verursachen kann, was zu einer verkürzten Lebensspanne führt. Es gibt zunehmend Anhaltspunkte dafür, daß sowohl das CD4-Molekül als auch die Virushülle eine Rolle bei der zytopathischen Wirkung in HlV-infizierten Zellen durch eine gewisse Förderung der Zellfusion spielen. Ein hervorstechendes Merkmal in der ^ytopathologie der HIV-Infektion ist die Bildung von vielkernigen Synoytia durch die Fusion von 500 Zellen, die durch die gp120/gp41-Hüllproteine induziert zu sein scheinen. Im Gegensatz dazu können HlV-infizierte Makrophagen weiter HIV ohne zytopathische Wirkungen über lange Zeiträume produzieren. Es wird davon ausgegangen, daß der Makrophage ein Hauptreservoir für HIV ist und für den Transport des Virus in das Zentralnervensystem verantwortlich sein kann (Gartner et al., 1986, Science 233:215-219). Bis heute gibt es noch kein Heilmittel gegen AIDS. Es laufen gegenwärtig Impfversuche, um die Verbreitung des Virus unter der Bevölkerung zu bekämpfen. Bemühungen zur Beherrschung des Krankheitsverlaufs bei einem infizierten Patienten sind jedoch hauptsächlich auf den Einsatz von Antivirusmitteln gerichtet.

2.2. Anti-HIV-Medikamente

Es werden gegenwärtig verschiedene therapeutische Methoden erforscht, um die Morbidität und die Mortalität der HIV-Infektion zu reduzieren (Yarchoan et al., 1988, Scientific American 259:110-119; Bartlett, 1988, J. A. M. A. 260: 3051-3052; DeClercq, E., 1986, J. Med. Chem. 29:1561-1569; Yarchoan, R. und Broder, S., 1987, N. Engl. J. Med. 316: 557-564). Die Kenntnis der Physiologie des HIV-Virus hat zu einer Reihe von Gedankengängen geführt, die auf eine Störung der Virusreplikation oder Verbreitung der Infektion abzielen. Ein Eingreifen könnte möglicherweise die Bindung des Virus an Zielzellen, die Fusion mit Zellmembranen, ein Enthüllen der Virusnukleinsäure, die Umkehriranskription des HIVRNA-Genoms in DNA, die Transkription oder Translation von viraler mRNA, die Reifung von Virusproteinen, den Aufbau zu reifen Virionen oder andere auf die Replikation oder Infektiosität bezogene Vorgänge verhindern.

Verschiedene Methoden zur Verhinderung der Bindung von HIV an Zellmembranen worden geprüft; sie sind auf die Hemmung der Wechselwirkungen zwischen dem HIV-Hüllglycoprotein, gp 120, und dem CD4-Antigen auf Zielzellen wie Holfer-T-Lymphozyten gerichtet. Es ist gezeigt worden, daß die Bindung von gp120 an das CD4-Antigen nicht nur mit einer Viruspenetration der Zellmembranen, sondern auch mit einer Syncytiabildung zusammenhängt (Sodroski et al., Nature 322: 470-474; Lifson et al., 1986, Nature 323: 725-728; Stevenson et al., 1988, Cell 53: 483-496). Smith et al. (1987, Science 238: 1704-1707) haben gezeigt, daß lösliches CD4-Antigon dio HlV-lnfektiosität durch Bindung an Virusteilchen vor deren Auftreffen auf in Zellmembranen eingebettete CD4-Moleküle blockieren kann. Es ist aber auch gezeigt worden, daß Antiidiotypantikörper, die gegen Anti-CD4-Antikörper gerichtet sind, vermutlich durch don Besitz von Proteinkonfigurationen ähnlich den CD4-Determinanten sich an den HIV-Virus in vitro binden (Dalgleish et al., 1989, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology. J. Cell Biochem. Supp. 138, S. 298). Es ist darüber hinaus auch gezeigt worden, daß verschiedene große, sulfierte, negativ geladene Moleküle einschließlich Dextransulfat die HIV-Replikation und Syncytiabildung in vitro hemmen (Yarchoan et al., supra.).

Antisinnoligonucleotide hemmen nachweislich viral induzierte Syncytiumbildung und Expression des viralen p24-Proteins (Agrawäl et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7079-7083). Diese synthetischen Nucloinsäurepolymere, der HIV-mRNA komplementär, wurden so konstruiert, daß sie die Translation von viraler mRNA zu Protein hemmen; die Bildung von Phosphoramidat- und Phosphorthioatderivaten von Antisinncligonucleotiden hat Verbindungen erzeugt, die der Endonucleasedegradation gegenüber im wesentlichen resistent sind.

Von Ribavirin, das einen Riboseteil und einen Triazolring einschließt, wird angenommen, daß es als ein Anrlogon des Nucleosidguanosin wirkt. Es hat Wirksamkeit gegen mehrere RNA-Viren in vitro, hauptsächlich, so wird angenommen, durch Beeinträchtigung des zum Kappen von viraler mRNA erforderlichen Guanylierungsschrittcs. Über Ribavirin ist berichtet worden, daß es die Replikation des HIV in Kulturen von menschlichen T-Lymphozyten unterdrückt (McCormick et al., The Lancet, 15. Dez., 1984: 1367-1369).

Die posttranslationale Reifung von Virusproteinen kann aber auch unterbrochen werden; es ist gezeigt worden, daß Castenospermin, das Glycosidasewirksamkeit besitzt, die Synatiumbildung und HlV-lnfektiosität reduziert (Wall et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5644-5648).

Die Endschritte bei der HIV-Replikation beinhalten dessen Austritt aus der Wirtszelle und die Infektion von neuen Zellzielen. Man hat festgestellt, daß Alpha-Interferon die HIV-Replikation in vitro unterdrückt (Ho et al., Lancet, 16. März 1985: 602-604), es kann virales Sprießen reduzieren, und es ist gezeigt worden, daß es eine direkte Antitumorwirksamkeit gegen die Kaposi-Krankheit, eine im Zusammenhang mit Aids auftretende Malignität, besitzt. Eine Lipidverbindung, AL721, bestehend aus neutralen Glyceriden, Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin in einem Verhältnis von 7:2:1 hat die nachgewiesene Fähigkeit, Chloresterol aus Zellmembranen zu extrahieren, und scheint die HlV-lnfektiosität zu vermindern (Sarin et al., 1985, N. Engt. J. Med. 313: 1289-1290).

Es werden verschiedene Methoden zur Beherrschung der HIV-Infektion geprüft, die sich auf die Inhibition von viraler Umkehrtranskriptase beziehen. Da es Säugerzellen an endogener Umkbhrtranskriptasewirksamkeit mangelt, bieten diese Methoden eine potentiell selektive Inhibition der Virusrepükation bei minimaler Wirtszellcytotoxizität. Zu Mitteln, die Umkehrtranskriptase hemmen sollen, gehören Phosphonoformat (Sandstrom et al., Lancet, 29. Juni 1985: L1480), Suramin (Mitsuya et al., 1984, Science 226:172-174), Rifabutin (oder Ansamycin, Amad et al., Lancet, 11. Jan. 1986, S.97) und Nucleosidderivate, die unten beschrieben sind.

2.2.1. Nucleosidderivate

Nucleosidderivate sind modifizierte Formen der Purin-(Adenosin- und Guanosin-) und Pyrimidin- (Thymidin-, Uridin- und Cytidin-)Nucleoside, die die Bausteine der RNA und DNA sind. Umkehrtranskriptase und DNA-Polymerase binden und bauen die Nucleosidderivate in die naszierende DNA-Kette ein, vorausgesetzt, der 5' Kohlenstoff des Derivats kann an die 3' Hydroxylgruppe des vorherigen Nucleotids binden (d. h. durch Bildung einer Phosphodiestorbindung); nachfolgende Nucleotide können nur hinzugefügt werden, wenn das Nucleosidderivat ein Mittel zur Bindung seines 3' Kohlenstoffs an das 5' Phosphat eines anderen Nucleotids enthält. Viele der gegenwärtig als mögliche Anti-HIV-Medikamente untersuchten Nucleosidderivate führen zu einer vorzeitigen Termination der viralen DNA-Replikation, bevor das ganze Virusgenom transkribiert ist. Diesen Derivaten fehlen 3' Substituenten, die an nachfolgende Nucleoside binden könncr und zum Kettenabbruch führen.

AZT (3'-Azido-2'_f 3'-dideoxythymidin, Azidothymidin, Zidovucün) ist ein Nucleosidderivat, das, wie gezeigt worden ist, bei der Behandlung von Patienten mit AIDS und ARC wirksam ist. Daten geben an, daß AZT das mittlere Überleben von AIDS-Patienten erhöht (Fischletal., 1987, N. Engl. J. Med. 317:185-191: Greagh-Kirket al., 1988, J. A. N. A. 260:3009-3015). Vorläufige Aussagen deuten darauf hin, daß AZT bei Kindern mit AIDS, HlV-bezogener Psoriasis (Bartlett et al., supra), AIDS-bezogener Dementia (Schmitt et al., 1988, N. Engl. J. Med. 319:1573-1578) und HlV-bezogener Thrombocytopen in (Pottage et al., 1988, J. A. N. A. 260: 3045-3048) wirksam sein kann. AZT wird von Säugerzellen unter Bildung von AZT-Triphosphat (einem Analogon von Thymidintriphosphat) phosphoryliert, welches die Erzeugung von viraler DNA durch mindestens zwei Mechanismen hemmen soll, und zwar durch kompetitive Hemmung und Kettenabbruch (Yarchoan et al., supra). Kompetitive Hemmung tritt auf, weil virale Umkehrtranskriptase AZT-Triphosphat fester bindet als native Nucleotide. Kettenabbruch resultiert aus AZT-Einbau, weil AZT eine 3'-Hydroxylgruppe fehlt, und es daher nicht an nachfolgende Nucleotide anbinden kann.

Dideoxynucleoside sind Nucleosidderivate, denen an den 2'- und 3'-Kohlenstoffrückständen Hydroxylgruppen fehlen und die daher zum DNA-Kettenabbruch führen. Zudem hemmen, wie AZT, die 5'-Triphosphatprodukte von 2',3'-Didaoxyadenosin, Dideoxyguanosin, Dideoxycytidin und Dideoxythymidin selektiv die virale Umkehrtranskriptase und die zelluläre ß- und v-DNA-Polymerase, beeinträchtigen jedoch nicht die Funktion von DNA-Polymerase α, dem wichtigsten, während der Zellteilung verwendeten synthetischen DNA-Enzym (Edenberg et al., 1978, J. Eiol. Chem. 253:3273-3280; Waqar et al., 1978, Nucl. Acids Res.5:1933-1946; van der Vilet et al., 1981, Biochemistry 20:2628-2632; Waqar et al., 1984, J. Cell Physiol. 121:402-408). In vitro haben Adenosin-, Guanosin-, Inosin-, Cytidin- undThymidin-2',3'-dideoxynucleoside die HlV-Virusreplikation gehemmt (obwohl das Thymidinderivat eine weniger hemmende Wirksamkeit gezeigt hat); eine im wesentlichen vollständige Unterdrückung des HIV wurde bei Dosen beobachtet, die um einen Faktor von 10 bis ?0 niedriger waren als die Dosen, die zur Hemmung einer starken Vermehrung oder Immunreaktivität von T-Zellen erforderlich waren (Mitsuya und Broder, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 83:1911-1915). Ahluwalia et al. haben erste Untersuchungen zur Zellpharmakologie von 2',3'-Didooxyinosin durchgeführt (1987, Biochem. Pharm. 36: 3797-380). Die PCT-Veröffentlichung WO 87/01284, internationale Veröffentlichung vom 12. März

1987, bezieht sich auf die Hemmung der In-vitro-lnfektiosität und cytopathischer Wirkungen des HIV durch Purin-2',3'-didooxynucleoside einschließlich 2',3'-Dideoxyinosin, 2',3'-Didooxyguanosin und 2',3'-Dideoxyadenosin. Die Europäische Patentanmeldung 0273 277, die am 6. Juli 1988 veröffentlicht wurde, bezieht sich auf die Anwendung von 3'-Deoxythymidin-2'-ene (3'-Deoxy-2',3'-didshydrothymidin d4T), dem 2'- und 3'-Hydroxylgruppen fehlen und das eine Doppolbindung zwischen 2'- und 3'-Kohlenstoffatomoi ι hat, bei der Behandlung von Patienten, die mit dem Retrovirus infiziert sind. Man hat gefunden, daß D4T, auch als 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxythymidin oder 1-(2,3-Dideoxy-ß-D-glycero-pent-2-enofuranosyl)thymin bezeichnet, HlV-Umkehrtranskriptase hemmt und eine Anti-HIV-Wirksamkeit besitzt, die mit AZT vergleichbar ist (Mansuri et al., J. Med. Chem. im Druck). D4T hat möglicherweise auch geringere toxische Wirkungen als AZT (Mansuri et al., supra; Chazzoulietal.,

1988, ICAAC, Abstract 1301, S.344).

Kürzlich sind säurestabile 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside, die antivirale Wirkungen zeigen, beschrieben worden. Siehe Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 0287313 A2, die 2',3'-Dideoxy-2'-fluoradenosin und 2',3'-Dideoxy-2'-fluorinosin beschreibt, und Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 0292023 A2, die ein Fluorpyrimidinderivat, 2',3'-Dideoxy-2'-fluorarabinofuranosylcytosin(F-ddC) beschreibt.

2.2.2. Toxische Wirkungen von Anti-HIV-Medlkomenten

Da das HIV von menschlichen Zellen abhängig ist, die den Mechanismus liefern, der zur Vollendung von dessen Lebenszyklus erforderlich ist, ist die Inhibition der Virusreplikation häufig mit zelltoxischen Wirkungen verbunden. Die AZT-Therapie ist mit Knochenmarktoxizität verbunden (Richman et al., 1987, N. Engt. J. Med. 317:192-197) und führt folglich zu einer verminderten Produktion von roten Blutzellen (mit Anämiefolge), Plättchen (mit Thrombozytopenie) und weißen Blutzollen (mit Leukopeniefolge). Nach Bartlett et al. (1988, J. A. M.A. 260: 3051-3052) entwickeln 40% der mit AZT behandelten Patienten letztlich Anämie, was eine Reduzierung der Dosis oder eine Transfusion erforderlich macht, und Leukopenie mit einer verringerten Anzahl von Granulozyten, wodurch die Infektionsanfälligkeit erhöht wird. Nur ca. 60% der Patienten mit ARC oder AIDS scheinen eine fortgesetzte AZT-Anwendung nach einem Jahr Therapie vertragen zu können (Pettinelli, C. B., Feinberg, J., und die AIDS Clinical Trials Group: Safety and tolerance of zidovudine in patients with AIDS and advanced ARC (Sicherheit und Verträglichkeit von Zidovudin in Patienten mit AIDS und fortgeschrittenem ARC), zusammengefaßt; Fischl, M. A., und die AIDS Clinical Trials Group: The safety and efficacy of two doses of zidovudine in the treatment of patients with AIDS (Sicherheit und Wirksamkeit von zwei Dosen von Zidovudin bei der Behandlung von AIDS-Patienten), zusammengefaßt: beide auf der 4. Internationalen AIDS-Konferenz in Stockholm am 15. Juni 1988 vorgetragen und von Bartlett zitiert). Zur Vermeidung dieser toxischen Wirkungen wird AZT in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln wie Acyclovirnatrium, Foscarnetnatrium, Interferon-α, β oder γ, Interleukin 2 oder Ampligen getestet. Andere Untersuchungen, bei denen zwischen AZT und 2',3'-Dideoxycytidin (ddC) in der Therapie gewechselt wird, laufen ebenfalls (Yarchoan et al., 1988, Lancet 1: 76-81). Kontinuierliche hohe Dosen ddC (das relativ knochenmarkschonend ist) über mehr als 8 bis 12 Wochen bringen die Ausbildung von schmerzhafter peripherer Neuropathie mit sich. Man hofft, daß durch Wechseln zwischen AZT und ddC die toxischen Wirkungen beider minimiert werden können. Eine Therapie, die sowohl wirksam als a'jch für AIDS-Patienten klinisch verträglich ist, wird gegenwärtig von Forschern im Gesundheitswesen aktiv gesucht.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Anwendung von synerqistischen Kombinationen von Nucleosidderivaten zur Hemmung der HIV-Replikation und somit zur Begrenzung der HIV-Infektion. Erfindungsgemäß weisen bestimmte Nucleosidderivate, wenn sie zusammen verwendet werden, größere antivirale Wirkungen und eine geringere Zelltoxizität bei niedrigeren Konzentrationen auf als jede Droge einzeln angewendet, wodurch die Behandlung der HIV-Infektion maximiert und toxische Nebenwirkungen minimiert werden.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können das Purinnucleosidanalogon Dideoxyinosin (ddl) und das Pyrimidinnucleosidanalogon 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) zur Hemmung der HIV-Replikation verwendet werden. Mittels Beispiel wird gezeigt, daß ddl und d4Teine starke synergistische Anti-HIV-Wirksamkeit aufweisen; die Kombination aus ddl und d4T ergab eine größere Anti-HIV-Wirkung, bewirkte jedoch eine geringere Zelltoxizität als jede Verbindung einzeln angewendet.

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Kombinationen aus Fluornucleosidanaloga mit d4Tzur Hemmung der HIV-Replikation angewendet werden. So kann zum Beispiel das Purinnucleosidanalogon 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) mit d4T angewendet werden.

3.1. Definitionen und Abkürzungen

Die folgenden, hier verwendeten Begriffe, ob im Singular oder Plural, sollen die festgelegten Bedeutungen haben.

Kombinationsindex (Cl): numerische Darstellung der synergistischen oder antagonistischen Wirkungen von Wirkstoffkombinationen, wonach ein Cl von weniger als 1 Synergie, größer als 1 Antagonismus und gleich 1' Additi¹ 'smus darstellt. Der Cl-Wert wird durch Anwendung einer Isobologrammgleichung und Computersimulierung nach Chou und Talalay gewonnen (1984, Adv. Enz. Reg. 22: 27-55 und 1987, in „New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy", Harrapund Connors, Hg., Bristol-Myers Symposium Series, Academic Press, S, 37-64; Hartshorn et al., 1987, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31:168-172).

Ein Kombinationsindex kann nach der Gleichung

C, „ JPiL. ₊ JPJi- ₊ JMi. bestimmtwerden, (DJ₁ (D_xJ₂ (D_x), (D_x),

wobei (D_x)ι die Dosis von Stoff 1 ist, die zur Erzeugung einer Wirkung von x-% allein erforderlich ist, und (D)i die Dosis von Stoff 1 ist, die zur Erzeugung der gleichen Wirkung von x-% in Kombination (D)₂ erforderlich ist. Analog dazu ist (DJj die Dosis von Stoff 2, die zur Erzeugung einer Wirkung von x-% allein erforderlich ist, und (D)₂ ist die Dosis, die zur Erzeugung der gleichen Wirkung in Kombination mit (D)₁ erforderlich ist. Wie in Hartshorn et al. (supra) boschrieben ist, gibt das Gefälle der Dosis-Wirkung-Kurven an, ob die Stoffe gegenseitig ausschließliche Wirkungen (z. B. ähnliche Wirkungsweise) oder gegenseitig nichtausschließliche Wirkungen (z. B. unabhängige Wirkungsweise) haben.

Wenn die Stoffe gegenseitig ausschließlich sind, dann ist α 0 (d. h. Cl ist die Summe von zwei Gliedern); wenn die Stoffe gegenseitig nichtausschließlich sind, ist α 1 (d.h. Cl ist die Summe von drei Gliedern).

Synergie: Wirkung von zwei oder mehr Substanzen zur Erreichung eines Effektes, der größer ist als der jeder einzeln angewendeten Substanz. Synergismus bei der antiviralen Wirksamkeit ist so zu vorstehen, daß eine größere antivirale Wirksamkeit damit verbunden ist. Synergismus bei der Zelltoxizität bedeutet eine größere Zelltoxizität. Gewebekulturhemmdosis (z. B. TCID_M) ist die Virusmenge, die zur Reduzierung der Virusexpression um einen gegebenen Prozentsatz, d. h. 50%, erforderlich ist.

Toxische Dosis für die Gewebekultur (d. h. TCTD₆₀) ist die Menge an beispielsweise Wirkstoff, die zur Reduzierung der Anzahl an Gewebekulturzellen um einen gegebenen Prozentsatz (d. h, 50%) erforderlich ist.

4. Beschreibung der Figuren

Figur 1. Antivirale Wirksamkeit von gleichen Gesamtkonzentrationen an d4T (gestrichelte Linie), ddl (punktierte Linie) oder d4T + ddl (Vollinie), die durch p-25-gag-Bindung gemessen und als Hemmung in % ausgedrückt wird.

5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Anwendung von synergistischen Kombinationen von Nucleosidderivaten zur Hemmung der HIV-Replikation, wodurch die Wirkungen der HIV-Infektion begrenzt werden. Erfindungsgemäß üben Kombinationen von bestimmten Nucleosidderivaten stärkere Anti-HIV-Wirkungen aus, sind jedoch mit einer geringeren Zelltoxizität verbunden als einzelne Nucleosidderivate bei vergleichbaten Gesamtwirkstoffkonzentrationen. Obwohl die Anwender nicht verpflichtet sind, den Mechanismus 2u erklären, nach dem die Erfindung funktioniert, kann es sein, daß durch die Bereitstellung von zwei oder mehr Nucleosidderivaten, von denen jedes einzelne natürlich vorkommende Nucleoside in der viralen Umkehrtranskriptasewirksamkeit ersetzen kann, die Wahrscheinlichkeit, daß diese Derivate in die virale DNA-Sequenz eingebaut werden (und folglich die Umkehrtranskription durch Verhinderung der Verlängerung von naszierender DNA beenden), wesentlich erhöht ist.

Zum Zwecke der Klarheit der Offenbarung und nicht als Einschränkung wird die Beschreibung der Erfindung in drei Abschnitte eingeteilt: 1. Kombinationen von Nucleosidderivaten; 2. In-vitro-Versuch zum Nachweis der HIV-Hemmwirkung von Nucleosidderivatkombinationen und 3. therapeutische Anwendungen von HlV-hemmenden Nucleosidderivatkombinationen.

5.1. Identifikation von synergistischen Kombinationen von Nucleosidderivaten Erfindungsgemäß umfassen Nucleosidderivate, die in Kombination angewendet werden können, 2',3'-Dideoxyadenosin (ddA); 2',3'-Dideoxyguanosin (ddG); 2',3'-Dideoxyinosin (ddl); 2',3'-Dideoxycytidin (ddC); 2',3'-Dideoxythymidin (ddT); 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) und 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidin (AZT), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es können aber auch halogenierte Nucleosidderivate verwendet werden, vorzugsweise 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside wie 2',3'-Dideoxy-2'-fluoradenosin; 2',3'-Dideoxy-2'-fluorinosin; 2',3'-Dideoxy-2'-fluorcytosin und2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydro-2'-fluornucleoside wie 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydro-2'-fluorthymidin (Fd4T), die jedoch nicht darauf beschränkt sind. Die erfindungsgemäßen 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside sind vorzugsweise solche, bsi denen die Fluorbindung in der Beta-Konfiguration ist und die 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluoradenosin (F-ddA), 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) und 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorcytosin (F-ddC) einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.

Die Kombination aus 2',3'-Dideoxyinosin (ddl) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Die Kombination aus 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) und 2',3'^:Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) stellt ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform dar. Eine ausführlichere Beschreibung der 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside und der 2',S'-Dideoxy-2',3'-didehydro-2'-fluornucleoside ist in der gleichzeitig schwebenden Anmeldung der laufenden Nummer 120051 vom 12. November 1987 von Sterzycki, Mensuri und Martin enthalten, auf die hierin in ihrer Ganzheit Bezug genommen wird.

Zur Beurteilung der potentiellen therapeutischen Wirksamkeit von Kombinationen von Nucleosidderivaten können diese Kombinationen nach den auf dem Fachgebiet bekannten Methoden auf ihre antivirale Wirksamkeit geprüft werden. So kann zum Beispiel die Fähigkeit einer Nücleosidkombination zur Hemmung der HlV-Zelltoxizität, Syncytiabildung, Umkehrtranskriptasewirksamkeit oder Erzeugung von viraler RNA oder von Virusproteinen in vitro getestet werden. Kombinationen aus Nucleosidderivaten über einen großen Konzentrationsbereich für jedes Nucleosidderivat können auf antivirale und/oder zelltoxische Wirksamkeit getestet werden, und Kombinationsindices können nach den in Abschnitt 6.1. umrissenen Methoden abgeleitet werden. Eine bevorzugte Methode zum Nachweis der HIV-Hemmwirkung von Kombinationen von Nucleosidderivaten ist in Abschnitt 5.2. und dem Abschnitt 6 über Beispiele dargelegt. Darüber hinaus können Kombinationen von Nucleosidderivaten in vivo unter Anwendung eines Tiermodellsystems für AIDS wie dem Affenimmunmangelvirussystem (SlV-System) auf ihre antivirale Wirksamkeit hin überprüft werden (Kanki et al., 1985, Science 230: 951-954). Da jedoch unterschiedliche Tiergattungen (oder sogar verschiedene Zelltypen innerhalb einer Gattung) in dem Wirkungsgrad, mit dem sie diese Wirkstoffe phosphorylieren, unterschiedlich sind, sollte äußerste Vorsicht beim Extrapolieren der mit einer Gattung gewonnenen Ergebnisse angewendet werden (bzw. auch der für einen Zelltyp innerhalb einer Gattung gewonnenen Versuchsergebnisse) (Yarchoan und Broden, 1987, N. Engl. J. Med.316:557:564; Waqar, 1984, J. Cell. Physiol. 121: 402-408; Furmanetal., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 833-7; Onoetal., 1979, Biochem. and Biophys. Res. Commun. 88: 1255-1262). Für diese Kombinationen können therapeutische sowie zelltoxische Dosen festgelegt werden, und die Kombinationen, die die größte Synergie zeigen, d. h. die höchste antivirale Wirksamkeit und/oder niedrigste Zelltoxizität aufweisen, können für die Anwendung beim Menschen in Betracht gezogen werden.

5.2. In-vitro-Versuch zum Nachwels der HIV-Hemmwirkung von Kombinationen von Nucloosldderlvaten

Die Hemmwirksamkeit von Kombinationen von Nucleosidderivaten kann mit Hilfe eines In-vitro-Versuchssystems wie den in Abschnitt 6 hierin beschriebenen getestet werden. So kann zum Beispiel die Wirksamkeit einer jeden ausgewählten Nucleosidderivatkombination anhand ihrer relativen Fähigkeit zur Hemmung von (a) der Bildung von Syncytia und (b) der Erzeugung von HIV-Partikel in HlV-infizierten Zellen in vitro unter Anwendung einer Zielzellinie, die mit HIV infiziert werden kann, eingeschätzt werden. Im allgemeinen wurden solche Zellinien von einer T-ZeIIe sein oder myelozytischer/monozytischer Abstammung sein oder von einem anderen Zelltyp stammen, der mit dem Gen für CD4 transfiziort ist. Wenn die Nucleosidderivate aber mit einem „Zielmolekül' verbunden sind, z.B. einem monoklonalen Antikörper, Hormon, Wachs.umsfaktor usw., sollte die Zielzellinie das entsprechende Zelloberflächenantigen oder Rezeptor für das Molekül, das mit dem Nucleosidderivat konjugiert, ausprägen.

Zur Beurteilung der Wirksamkeit der ausgewählten Nucleosidderivatkombination sollte die Zielzelle in vitro gezüchtet werden, mit dem HIV infiziert werden und mit einer Reihe von Dosen von Nucleosidderivaten vor, während oder nach der Infektion behandelt werden (es können beispielsweise Verfahren dor begrenzten Verdünnung angewendet werden). Die hemmende Wirkung auf die Virionerzeugung kann, wie beschrieben, beurteilt werden, z. B. durch Messen von (a) der Erzeugung des HIV durch Untersuchen auf HIV-Proteine wie dem 25 gag Viruskernprotein oder der Umkehrtranskriptase in dem Kulturmedium; (b) der Induktion von HIV-Antigenen in Zellen durch Immunfluoressenz oder (c) der Reduktion der Syncytiabildung, die visuell eingeschätzt wird. Die Fähigkeit einer Nucleosidderivatkombination, das HIV zu hemmen, ist bezeichnend für die Hemmwirksamkeit und die Hemmdosis der untersuchten Nucleosidderivatkombination.

5.3. Therapeutische Anwendungen von HlV-hemmenden synergistischen Derivatkombinationen

Die synergistische Kombination von Nucleosidderivaten kann erfindiingsgemäß in vivo zur Verhinderung der Bildung von Syncytia und der Erzeugung von HlV-Virionen und somit zur Hemmung der Progression der HIV-Infektion in einem Patienten angewendet werden. Effektive Dosen von Nucleosidderivaten, dia in geeigneten pharmakologischen Trägern rezeptmäßig zubereitet sind, können auf jedem geeigneten Weg einschließlich, aber nicht ausschließlich durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan usw.), durch Absorption durch epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (z. B. Mundschleimhaut, rektale und vaginale Epithelauskleidungen, Nasopharyngealschleimhaut, Intestinalschleimhaut usw.) u.a. verabreicht werden.

Darüber hinaus können Nucleosidderivate in jedem geeigneten pharmakologischen Träger gemischt, an ein Träger- oder Zielmolekül (z. B. Antikörper, Hormon, Wachstumsfaktor usw.) gebunden und/oder in Liposome, Mikrokapseln und Präparate kontrollierter Freisetzung vor der Vsrabreichung in vivo eingebaut werden.

Nach einer anderen Ausführungsform können synergistische Kombinationen von Nucleosidderivaten in Verbindung mit anderen Behandlungen für die HIV-Infektion angewendet werden. So können synergistische Nucleosidderivate beispielsweise in Verbindung mit anderen antiviralen Verbindungen, die die Umkehrtranskriptasewirksamkeit hemmen (z. B. AZT), mit löslichen CD4 oder monoklonalen Antikörpern, die die HIV-Absorption in Zeilen hemmen, oder mit anderen Zytokinen und Wachstumsfaktoren (z. B. Interferon α, β oder γ, Tumornekrosefaktor, Interleukine, das granulozytische/monozytische Koloniewachstum stimulierender Faktor, das Koloniewachstum stimulierender Faktor 1 usw.) und mit Stoffen angewendet werden, die zur Behandlung anderer Mikroorganismen oder Viren, mit denen AIDS-Patienten opportunistisch infiziert werden, eingesetzt werden. Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung können synergistische Nucleosidderivate in vitro zum Testen der Wirksamkeit verschiedener Wirkstoffe verwendet werden. In diesem Zusammenhang wäre es vorteilhaft, von einem AIDS-Patienten Knochenmarkproben zu bekommen und das Knochenmark in vitro dem zu testenden Wirkstoff, Verbindung oder Kur auszusetzen, um die zu identifizieren, die beispielsweise das Virus töten, aber normale Zellen schonen, oder die nachzuweisen, die eine Markrepopulation stimulieren. Allerdings weist von AIDS-Patienten stammendes Knochenmark eine sehr schlechte Markkoloniebildung in vitro auf. Dies ist wahrscheinlich auf die Infektion der Vorläufer-CD-34-Zellen mit dem HIV zurückzuführen. Infolgedessen ist die Wirksamkeit der verschiedenen in vitro untersuchten Wirkstoffe schwer oder unmöglich einzuschätzen. Die Anwendung von synergistischen Nucleosidderivaten zur Hemmung des HIV in einom solchen Versuchssystem sollte die Markkoloniebildung in vitro erhöhen und somit das Prüfen von verschiedenen anderen Protokollen und Wirkstoffen hinsichtlich der Markwirksamkeit in vitro gestatten.

6. Beispiel: Hemmung der HIV-Infektion durch Anwendung von Dideoxydidehydrothymidin und Dideoxyinosln Die nachfolgend beschriebenen Versuche demonstrieren die hemmende Wirkung von Dideoxydidehydrothymidin (d4T) und Dideoxyinosin (ddl) auf die HIV-Infektion von Zielzellen mit T-Zellursprung in Kultur in vitro.

6.1. Stoffe und Methoden

6.1.1. Zellen und Virus

CEM-F-Zellen wurden ursprünglich aus der akuten lymphoblastischen Leukämie beim Menschen abgeleitet und stellen eine anerkannte T-Lymphoblastoidlinie dar. Sie sind als CCRF-CEM-Zellen bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr.

CCL119) verfügbar.

Der LAV_Bnu-Stamm des Humanimmunmangelvirus (HIV) wurde von Dr. Luc Montagnier vom Pasteur-Institut in Paris, Frankreich, bezogen. Das Virus wurde an CEM-F-Zellen angepaßt und in kleinen aliquoten Mengen in Flüssigstickstoff gelagert. Der Titer des Virus wurde alle zwei bis drei Wochen bestimmt und wird als TCIDm ausgedrückt (Gewebekulturhemmdosen; d. h. die Virusmenge, die zur Reduzierung der Virusexpression um 50% erforderlich ist). In allen in den nachfolgenden Unterabschnitten beschriebenen Versuchen wurde eine Virusdosis von 50TCID₆₀ angewendet.

Sowohl die CEM-F-Zellen als auch das HIV-Virus wurden im LAV/OEM-Medium gezüchtet. Das Medium besteht aus RPM11640, das durch 1 % Glutamin, 100U/ml Penizillin, 100Mg/ml Streptomycin, 2μ9/ΓηΙ Polybren und 10% fötalem Rinderserum ergänzt

6.1.2. Nucleosld.1erlvated4Tundddl

Dideoxydidohydrothymidin (d4T, BMY27857-3/8, Charge #26630-23A) und Didooxyinosin (ddl, BMY40900, Charge #25879-46-1) wurden von der Pharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsabteilung der Bristol-Myers Company bezogen. Beide Verbindungen wurden in 2-3 Tropfen Dimethylsulfoxid (DMSO, D-8779, Sigma Chem. Co.) und LAV/CEM-Modium wiederaufgeschwemmt. Die Suspension wurde dann beschallt (Mikroultraschallbrecher, Kontos) und auf eine Endkonzentration von 1 mM gebracht. Alle Verdünnungen wurden aus diesem 1mM Vorrat vorgenommen. Zur Prüfung der kombinierten AnJ-HIV-Wirkung der Wirkstoffe wurden zwei unterschiedliche Versuchsreihen durchgeführt. In der ersten Reihe wurden die Wirkstoffe so gemischt, daß die Konzentration des einen Wirkstoffs konstant gehalten wurde, während die dos anderen variiert wurde. So wurde beispielsweise d4T bei 0,01,0,1,1 oder 10μΜ gehalten, während der ddl-Bereich bei 0,1,1,10 bis 100μΜ lag. Bei dieser Anordnung war das Verhältnis der Wirkstoffe in jedem Gemisch unterschiedlich. Um den Grad der möglichen Synergie zwischen d4Tund ddl genauer zu bestimmen, wurden in der zweiten Versuchsreihe die Wirkstoffe im Verhältnis von 1:5, beginnend mit 10 und 50 μΜ, gemischt und zweifach verdünnt. Auf diese Weise wurde das Verhältnis der Wirkstoffe durch alle Verdünnungen hindurch konstant gehalten. Die Werte wurden mit Hilfe der Software von „Dose-Effect-Analysis with Microcomputers" (Chou, J., und T.-C. Chow, „Dosis-Wirkung-Analyse mit Mikrorechnern", Else-vier-Biosoft Publishers, 1986) ausgewertet. Die gleichen zwei Protokolle wurden zur Beurteilung der Toxizität von c!4T und ddl auf nichtinfizierte Zellen angewendet, nur daß bei dem Versuch mit gleichem Wirkstoffverhältnis das Verhältnis der Wirkstoffe 1:1 betrug, wobei die Ausgangskonzentration bei beiden Wirkstoffen 100μΜ ausmachte. Azidothymidin (AZT, BMY27755/7, Charge #2300-38) wurde als positive Kontrolle in allen Analysen verwendet.

6.1.3. Bestimmung der Prollferatlonswlrkung von d4T und ddl

Für jede Analyse wurden 2 χ 10⁴ CEM-F-Zellen/Quelle in 96 Platten ausgestrichen. Die Zellen wurden mit jeder der verschiedenen Kombinationen gemischt, von denen jede in vierfacher Ausfertigung vorlag. Das Gesamtvolumen/Quelle bzw. Behälter betrug 250μΙ. Die Platten wurden sechs Tage lang bei 37⁰C und 5% CO₂ inkubiert. Am sechsten Tag wurden die Zellen vier Stunden lang mit 1 pCi/Behälter ³HTdR markiert, (New England Nuclear Corp. spezifische Aktivität 6,7 Ci/mmol), auf Glasfaserfilter geerntet und im Szintillationszähler gezählt (Hertzman, R.J., Segall, M., Bach, M.L., und Bach, F.H., 1971, Histocompatibility matching. Vl. Miniaturization of the mixed leukocyte culture test: A preliminary report. Transplantation, 11: 268-273). Die Ergebnisse wurden als % ³HTdR-Aufnahme der Kontrollprobe ausgedrückt die aus Zellen bestand, die ohne Wirkstoffe inkubiert worden waren. Darüber hinaus können die Ergebnisse als eine toxische Dosis für die Gewebekultur 50 (TCTD₅₀) ausgedrückt werden, die die Menge an Wirkstoff oder Wirkstoffen in pg ausdrückt, die zur Reduzierung der Anzahl von Zellen um 50% im Vergleich zu der Kontrollprobe erforderlich ist.

6.1.4. Hemmung der HIV-Repllkatlon

Die CEM-F-Zellen wurden in 96 Platten bei 2 x 10⁴ Zellen/Quelle ausgestrichen und mit 50TCID₆O des Virus 45 Minuten lang gemischt. Nach 45 Minuten wurden Nucleosidderivate zu jeder Quelle hinzugegeben und gemäß der Beschreibung für die Proliferationsanalyse inkubiert. Am Ende des sechsten Tages wurden die überstehenden Flüssigkeiten unter Anwendung einer Antigeneinfang-ELISA (enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung), die nachfolgend beschrieben ist, auf das Vorhandensein von viralem Aniigen geprüft. Die Bestimmung verwendet zwei monoklonal Antikörper gegen das virale Kernprotein p24gag (Hu, S. H. et al., 1987, Nature 328: 721-723; und Kinney Thomas, e. et al., 1988,AIDS 2: 25-29).

6.1.5. Antigen-Einfang-Bestimmung

Für diese Bestimmung wurden Mikrotiterplatten (96 Platten) mit zwei monoklonalen Antikörpern, 25-2 (ATCC #9407) und 25-3 (ATCC #9408), beide bei 1:2 500 verdünnt, bestrichen. Diese Antikörper (Einfangreagenzien) sind spezifisch für ρ 24, ρ40 und ρ 55 HIV gag-Proteine. Meerrettichperoxidase (engl. MRP) - konjugiertes Human-lgG, das aus einem Serum eines seropositiven Menschen rein dargestellt wurde, wurde als ein Signal verwendet. Der Absorptionsgrad (450/630nm) wird nach der Zugabe von Substrat - Tetramethylbenzidin (TMB) - bestimmt. Die OD-Anzeigewerte fallen in drei Kategorien: Versuchswerte = Werte von Quellen, die Zellen, virales Impfmaterial und Nucleosidderivat(e) enthalten; Kontrollwerte = Werte von Quellen, die Zellen und Virus (100%) enthalten; und Hintergrundswerte = Werte von Quellen, die nur virales Impfmaterial enthalten. Der Hintergrundswert wurde von allen OD-Werten abgezogen. Die antivirale Wirkung des bzw. der Nucleosidderivate wird als die ρ 24 gag-Bindung der Kontrolle in % ausgedrückt. Wenn beispielsweise jener Wert 20% beträgt, bedeutet das, daß die Virusreplikation, indirekt durch p25gag-Bindung gemessen, um 80% gehemmt wird.

6.1.6. Syncytiabildung

Vor dem Auffangen der überstehenden Flüssigkeiten für die Antigen-Einfang-Bestimmung wurden alle Quellen visuell untersucht. Dies erfolgte zur Feststellung der Infektion und zur Überprüfung des Zustandes der Zellen. Die Syncytia waren leicht zu beobachten, und obwohl sie nicht gezählt wurden, waren die Unterschiede in der Anzahl zwischen den Quellen offensichtlich.

6.1.7. Analyse der Zelltoxizitat

Es wurde die Toxizität von d4T und ddl gegenüber der Wirtszelle CEM-F (ATCC CCL119) getestet. CEM-F ist eine T-Zellinie, die konstitutiv den CD4-Rezeptor ausprägt und somit ein geeignetes Wirtszellziel für die HIV-Infektion ist. Die Wirkung von d4T und ddl auf die Proliferation von nichtinfizierten Zellen wurde durch Messen des Thymidineinbaus in nichtinfizierten CEM-F-Zellen, die mit d4T und ddl behandelt wurden, eingeschätzt.

6.2. Ergebnisse

6.2.1. HIV-Hemmung durch eine Nucleosldderivatkomblnatlon

In-vitro-Bestimmungen für p25gag-Protein zeigten eine starke synergistische Wirkung von d4T in Kombination mit ddl für die Hemmung der p25gag-Ausprägung, die eine größore antivirale Wirkung als bei einer einzelnen Anwendung beider Verbindungen darstellt. Die Ergebnisse der Bindungsbestimmungen für p25gag sind in Tabelle I dargestellt. Ein Vergleich zwischen einer Kombination aus d4T und ddl und beiden, bei der gleichen Gesamtkonzentration eingesetzten Wirkstoffen ist in Figur 1 dargestellt.

Tabelle I stellt die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen dar, die zur Beurteilung der optimalen Konzentrationen und Verhältnisse der Konzentrationen von d4T und ddt zur Erreichung einer maximalen antiviralon Wirksamkeit angewendet wurden. Es wurde ein großer Bereich von Konzentrationen geprüft, indem logarithmische Inkremente in der Konzentration eines jeden Derivats in Mehrfachkombinationen unter Anwendung eines Prüfens nach Schachbrettmuster ausgewertet wurdon.

Tabelle I Hemmung der Virusreplikation von d4T und ddl in %*

d4T-Konzentration (μΜ)	ddl-Konzentration (μΜ)	0,1	1	10	100
	0	1	3	2	86
0	_	25	13	38	83
0,01	2	26	11	13	76
0,1	1	52	52	75	78
1	24	92	88	92	94
10	87

' durch p25gag-Bindung gemessen

Bei Anwendung von d4T oder ddl in Verbindung mit AZT bei einer Konzentration von 1:10:50 wurde eine synergistische Wirkung erreicht, die geringer war als der bei der Kombination von d4 T und ddl beobachtete Synergismus (siehe Tabelle III und Abschnitt 6.3.).

6.2.2. Verringerte Zelltoxizität einer Kombination von Nucleosidderivaten

Zelltoxizitätsbestimmungen, bei denen der Einbau von ³H-Thymidin gemessen wird, zeigen, daß in Kombination eingesetztes d4T und ddl trotz erhöhter Toxizität für den Virus für CEM-F-Zellen nicht zelltoxischer sind, als dies bei der gleichen Gesamtkonzentration jeder einzeln angewendeten Verbindung der Fail ist. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen über einen großen Konzentrationsbereich von d4T, ddl oder d4T in Kombination mit ddl im Verhältnis 1:1 sind in Tabelle Il dargestellt.

Tabelle Il Zelltoxizität von CEM bei Einwirkung von steigenden Konzentrationen von d4T und/oder ddl*

d4T-Konzentration (μΜ)	ddl-Konzentration (μΜ)	0,1	1	10	100
	0	_	1	1	1
0	_	1	2	3	1
1	1	3	3	9	14
10	1	26	31	28	30
100	19

• durch 'H-Thymidin gemessen

6.3. Diskussion

Die oben angeführten Werte zeigen, daß die Nucloosidderivate d4T und ddl bei Anwendung in Kombination eine starke synergistische antivirale Wirkung aufweisen. Gemäß Tabelle I führte eine Konzentration von 1 μΜ d4T zu einer 24%igen Hemmung der viralen Wirksamkeit, und eine Konzentration von 10μΜ ddl war mit einer 2%igen Hemmung der viralen Wirksamkeit verbunden. Allerdings wurde mit 1μΜ d4Tin Kombination mit 10μΜ ddl eine HIV-Hemmung von 75% erreicht. Figur 1 enthält eine graphische Darstellung, die die antiviralen Wirksamkeiten von d4T, ddl und d4T + ddl bei der gleichen Nucleosldgesamtkonzentration zeigt und eindeutig die synergistischen Wirkungen von d4T in Verbindung mit ddl angibt. Der Kombinationsindex (Cl) ist eine numerische Darstellung der synergistischen oder antagonistischen Wirkungen von Wirkstoffkombinationen. Der Cl-Wert wird mit Hilfe einer Isobologrammgleichung und Computersimulation nach Chou (siehe Abschnitt 3.1.) gewonnen. Ein Cl-Wert von weniger als 1 repräsentiert Synergie (d. h. das Ganze ist größer als die Summe seiner Teile), ein Cl-Wert von größer als 1 repräsentiert Antagonismus (d. h. das Ganze ist geringer als die Summe seiner Teile, und ein Cl-Wert von 1 repräsentiert Additivismus (d. h. das Ganze ist gleich der Summe seiner Teile). Tabelle III zeigt die Cl-Werte von (d4T + ddl),(d4T + AZT)und(ddl + AZT) fürdie antivirale Wirkung, wenn die Konzentrationen von AZT, d4T und ddl in einem Verhältnis von 1:10:50 stehen.

Tabelle III Cl-Werte für Anti-HIV-Wirkung bei 50-, 70- und 90%iger Hemmung des Virus

Verbindung 50% 70% 90%

d4T + ddl 0,024 0,049 0,16

d4T + AZT 0,53 0,43 0,30

AZT+ ddl 0,77 0,74 0,75

Aufgrund des synergistischen Verhältnisses zwischen d4T und ddl können zur Erreichung einer effektiven Virushemmung niedrigere Nucleosidkonzentrationen angewendet werden. Wie in Tabelle Il dargestellt ist, ist eine erhöhte antivirale Wirksamkeit von Kombinationen aus d4T und ddl nicht mit einer erhöhten Zelltoxizität verbunden, so daß eine selektive antivirale

Wirksamkeit erreicht woraen ist. Darüber hinaus haben Untersuchungen zur Bestimmung von TDw (toxische Dosis) für d 4 T und ddl einzeln i>der in Kombination aufgezeigt, daß, obwohl derTD₆₀-Wert sowohl für d4T als auch für ddl einzeln über 100μΜ lag, der TDso-Weitfür die Kombination aus d4T und ddl 730 μΜ betrug (Daten nicht dargestellt). Der Cl für zelltoxische Wirkungen von Kombinatione'i aus AZT, d4T und ddl bei Konzentrationsverhältnissen von 1:10:10 zeigt, daß bei Konzentrationen, die 90% der HIV-Wirksamkeit hemmen, die Kombination aus d4T und ddl deutlich weniger zelltoxisch ist als gleichermaßen viruzide Konzentrationen von (d4T + AZT) oder (ddl + AZT) (siehe Tabelle IV). Die Kombination aus d4T und ddl ist somit nicht nur vlruzlder als d4T oder ddl einzeln betrachtet, (d4T + ddl) ist sogar weniger zelltoxisch. Das therapeutische Fenster für die Behandlung der HIV-Infektion wird somit durch die Anwendung dieser Nucleosidderivate in Kombination erweitert. Es können bei den Patienten therapeutische Anti-HIV-Wirkungen erreicht werden, ohne daß gefährliche oder schmerzhafte Komplikationen riskiert werden.

Tabelle IV Zelltoxizitäts-Cl-Werte bei Nucleosidkonzentrationen, die einer 50- und 90%igen viralen Hemmung entsprechen

Verbindung 50% 90%

d4T + ddl 2,17 6,40

d4T + AZT 2,45 1,66

AZT+ ddl 2,21 2,37

Claims (22)

1. In-vitro-Methode zur Hemmung des HIV, dadurch gekonnzeichnet, daß HlV-infizierte Zellen mit einer synergistischen Kombination von Nucleosidderivaten in Kontakt gebracht werden.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Nucleosidderivate ein 2',3'-Dideoxynucleosid ist.

3. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Nucleosidderivate 2',3'-Dideoxyinosin ist.

4. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Nucleosidderivate 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin ist.

5. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Nucleosidderivate ein 2',3'-Dideoxy^'-fluomucleosidderivatist.

6. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluornucleosidderivat 2',3'-Dideoxy-2'-fluorinosin ist.

7. Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluornucleosidderivat 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) ist.

8. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluornucleosidderivat 2',3'-Dideoxy-2'-fluoradenosin ist.

9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Jas Fluornuoleosidderivat 2',3'-Dideoxy-2'-beta-f!uoradenosin (F-ddA) ist.

10. Methode nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluornucleosidderivat 2',3'-Dideoxy-2'-fluorcytosin ist.

11. Methode nach Anspruch 10, dnduich gekennzeichnet, daß das Fluornucleosidderivat 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorcytosin iF-ddC) ist.

12. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Nucleosidderivat chemisch an ein zweites Molekül gebunden ist.

13. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HlV-infizierte Zellen mit einer Kombination aus 2',3'-Dideoxyinosin (ddl) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) in Kontakt gebracht werden.

14. Methode nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von d4Tzu ddl zwischen ca. 1:1 bis 1:10 liegt.

15. Methode nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von d4Tzu ddl ca. 1:5 beträgt.

16. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HlV-infizierte Zellen mit einer Kombination aus 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) in Kontakt gebracht werden.

17. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HlV-infizierte Zellen mit einer Kombination aus 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluoradenosin (F-ddA) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) in Kontakt gebracht werden.

18. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HlV-infizierte Zellen mit einer Kombination aus 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorcytosin (F-ddC) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) in Kontakt gebracht werden.

19. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine HlV-inhibierende Menge einer synergistischen Kombination von Nucleosidderivaten gemäß einem der Ansprüche 2 bis 18, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

20. Verwendung einer synergistischen Kombination von Nucleosidderivaten gemäß einem der Ansprüche 2 bis 18 zur Inhibierung von HIV in vitro oder in einem infizierten Säuger in vivo.

21. Verwendung nach Anspruch 20 in Kombination mit einer anderen Anti-HIV-Behandlung.

22. Verwendung nach Anspruch 20 in Kombination mit einer oder mehreren Therapien für HIV-assoziierte Erkrankungen, einschließlich opportunistischer Infektionen.