DE69430440T2

DE69430440T2 - Zusammensetzungen zur inhibition von retroviraler verbreitung, die 2',3'-dideoxy-inosin und hydroxyharnstoff enthalten

Info

Publication number: DE69430440T2
Application number: DE69430440T
Authority: DE
Inventors: D. Malley; Raul Jorge Vila
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-12-20
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2014-12-21
Also published as: OA10721A; US5736527A; CA2179627A1; WO1995017899A2; CA2179627C; AU1821295A; US5521161A; EP0735890B1; EP0735890A1; WO1995017899A3; DK0735890T3; TW283645B; DE69430440D1; PT735890E; ZA949219B; ATE216245T1; ES2173948T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination aus dem Reverse-Transkriptase-Hemmer 2',3'-Didesoxyinosin (ddI) und Hydroxycarbamid in einer synergistisch effektiven Menge, wobei die Kombination zur Hemmung der Ausbreitung von Retroviren verwendet werden kann.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Ausdruck "acquired immune deficiency syndrome" (AIDS) wurde zum ersten Mal 1981 verwendet, um bei Homosexuellen einen Zustand der zellulären Immun-Defizienz zu beschreiben, die durch das Auftreten von opportunistischen Infektionen und Kaposi-Sarkomen charakterisiert ist, die sich sehr aggressiv entwickelten (CDC (Center for Desease Control), MMWR, 30: 305-308.DC, (1981)). 1983 wurde das von da an mit HIV (Human Immunodeficiency Virus type 1) bezeichnete Retrovirus aus AIDS- Patienten isoliert (Barre-Sinoussi F. et al., Science, 220: 868-870(1983)).
In den vergangenen Jahren konnten Forscher und Kiniker bei der Beobachtung und Pflege von mit HIV infizierten Patienten während des sich oftmals hinziehenden Verlaufs einer HIV- und AIDS-Erkrankung bedeutende Erfahrungen gewinnen. Auf Grundlage dieser Erfahrungen stellte sich heraus, daß die pathogenen Mechanismen, die einer HIV-Infektion und -Erkrankung zugrunde liegen, nicht eindimensional sind, sondern vielmehr äußerst komplex (Fauci AS., Science, 239, 617, (1988)). Jeder Versuch zur Schaffung einer umfassenden therapeutischen Strategie für eine HIV-Erkrankung muß diese Tatsache berücksichtigen (Fauci, 1993, Science, 262: 1011-1018).
Nach dem Eindringen des HI-Virus in Zellen und nach Freisetzung des HIV-Partikels findet eine reverse Transkription des viralen RNA-Genoms in DNA-Kopien statt. Unter mehreren Formen von nicht eingebauter viraler DNA (die nun die langen Repeats [LTRs] sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende enthält) können nur die linearen Formen mit zwei LTR in das Wirtsgenom integrieren. Ein solcher Prozeß scheint strikt von der Zellaktivierung/replikation von T-Lymphocyten abzuhängen, obwohl "ruhende" T- Zellen eindeutig anfällig für eine HIV-Infektion sind (Zack J.A. et al., Cell, 61, 213-222 (1990)). Darüber hinaus kann ein Teil der reversen Transkription auch in nicht aktivierten T- Zellen stattfinden, wobei dieser Prozeß in einer Anhäufung von unvollständigen DNA-Molekülen resultiert, die für einige Stunden persistieren können und dazu fähig bleiben, in das Wirtsgenom zu integrieren, wenn die Zelle eine hinreichende Aktivierung erfährt (Zack J.A. et al., Cell, 61: 213-222 (1990)). Daher können infizierte "ruhende" CD4&spplus;T-Lymphocyten als transientes virales Reservoir in infizierten Patienten angesehen werden (Bokrinsky M.I. et al., Science, 254: 423-427, (1991)).
Diese Beobachtungen sind von besonderer Bedeutung in anatomischen Kompartimenten, wie bspw. in peripherem Blut und lymphoiden Organen, in denen die CD4&spplus;T-Zellpopulation die am meisten infizierte Zellart darstellt (Schmittman S.M. et al., Science, 245: 305-308 (1989)); (Fox CH. et al., J. InfectDis, 164: 1051-1057, (1991)).
Die obige Diskussion bietet eine fundierte wissenschaftliche Basis, um den anfänglichen Ausbruch der Virusreplikation und -verbreitung und außerdem die anhaltende Replikation im Verlauf der Krankheit zu blockieren, und zwar durch Behandlung von HIV infizierten Patienten mit antiretroviralen Mitteln vom frühesten Zeitpunkt an, bei dem eine HIV-Infektion erkannt wird, über den gesamten Verlauf der Infektion. Unglücklicherweise sind die momentan verfügbaren Mittel nur teilweise bei der Unterdrückung der Virusreplikation und -ausbreitung effektiv, wobei dieser Effekt darüber hinaus nicht dauerhaft ist (Hirch MS, et al., New Engl J. Med. 328, 1686, (1993)). Ein eindeutiger, jedoch limitierter Effekt wird beobachtet, wenn 3'-Azido-2',3'-didesoxythymidin oder Azidothymidin (AZT) einem Patienten mit fortgeschrittener HIV-Erkrankung verabreicht wird, wobei die Effekte einer frühen Behandlung gewöhnlich nur temporär sind und mit Bezug auf den Verlauf der Erkrankung und auf die Todesfolge keine bedeutenden langfristigen Vorteile erzielen (Fauci, 1993, Science, 262: 1011-1018).
Eine Reihe von 2'-3'-Didesoxynucleotiden erwiesen sich für die Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen mit Retroviren und insbesondere HIV und AIDS als nützlich. Zu den Beispielen solcher Stoffe zählen 2',3'-Didesoxycytosin (ddC), 2',3'- Didesoxyadenosin (ddA), 2',3'-Didesoxyguanosin (ddG), 2',3'- Didesoxyinosin (ddI) und 2',3'-Didesoxythymidin (ddT). Siehe bspw. die europäische Patentanmeldung 0 206 497 und die veröffentlichte PCT-Anmeldung mit der Nummer WO 87/01284.
Hydroxycarbamid (HC) wurde zum ersten Mal vor über 120 Jahren synthetisiert und erwies sich gegenüber einem breiten Spektrum an Tumoren als aktiv (Donehower, Seminars in Oncology, Vol. 19, Nr. 3, Suppl. 9 (Juni) 1992: Seiten 11-19). Darüber hinaus wurde Hydroxycarbamid auch als Virus-Hemmstoff eingesetzt. In der veröffentlichten PCT-Anmeldung mit der Nummer WO 93/09718 wird gezeigt, daß Hydroxycarbamid bei einer Hydrogel-Polymer-Beschichtung eines Blutbeutels eingesetzt werden kann, um damit eine Infektion mit Viren und HIV zu verhindern.
Gao et al., (PNAS, USA, Vol. 900, Seiten 8925-8928, Oktober 1993) offenbaren, daß die Behandlung von peripheren Blutlymphocyten (PBLS) mit Hydroxyharnstoff (Hydroxycarbamid) die dNTP-Pegel und die DNA-Syntheserate auf Pegel senkt, die mit ruhenden PBLS vergleichbar sind.
Dieser Artikel legt eine mögliche Verwendung von Hydroxyharnstoff in der AIDS-Therapie nahe.
Dennoch besteht weiterhin der Bedarf an effektiveren Behandlungen zur Unterdrückung von Retroviren und insbesondere zur Vorbeugung und/oder Inhibition der Ausbreitung von HIV und Viren. Bei der Vorbeugung und/oder Hemmung der Ausbreitung von HIV und Viren soll die Hemmung der viralen Replikation und darüber hinaus auch die Möglichkeit mit eingeschlossen werden, das Virus daran zu hindern, weitere Wirtszellen zu infizieren.
Zu den Aufgaben der vorliegenden Erfindung bei der Suche nach neuen antiretroviralen Mitteln zählt:
1) Die Identifizierung von Verbindungen mit niedrigerer Toxizität und mit einer größeren antiviralen Aktivität als AZT.
2) Die Entwicklung von Arzneimittelkombinationen, die für einen additiven oder synergistischen Effekt sorgen, und die die Wahrscheinlichkeit von Arzneimittel-resistenten Isolaten vermindern.

KURZE ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit Hydroxycarbamid und 2',3'-Didesoxyinosin (ddI), in der die Menge von ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 0,01 uM bis 100 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird. Diese Zusammensetzung kann einer Ausbreitung von Retroviren, einschließlich HIV, vorgebeugen und/oder diese hemmen. Die vorliegende Erfindung betrifft genauer die Verwendung der Zusammensetzung in einem Verfahren zur Vorbeugung und/oder Hemmung der Ausbreitung von Retroviren, einschließlich HIV (HIV-1 und HIV-2), HTLV-1, HTLV-2, SIV oder HSV, und zwar dadurch, daß eine Zellpopulation, einschließlich Zellen, die mit einem Retrovirus wie bspw. HIV infiziert wurden, einer synergistischen Kombination aus ddI und Hydroxycarbamid ausgesetzt wird. Darüber hinaus können HIV-Infizierte und AIDS-Patienten mit dieser Zusammensetzung aus ddI und Hydroxycarbamid behandelt werden, um der Ausbreitung von HIV in diesen Patienten vorzubeugen und/oder diese zu verhindern.
Es wurde gefunden, daß eine synergistische Kombination aus Hydroxycarbamid (HC) und 2',3'-Didesoxyinosin (ddI) hergestellt werden kann, die bei der Vorbeugung und/oder Hemmung der HIV- Ausbreitung besonders effektiv ist. Die Erfindung schließt eine wie oben definierte Zusammensetzung einschließlich einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit ein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ggf. einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Exzipienten und/oder Vehikel enthalten. Diese Zusammensetzung ist bei der Vorbeugung und/oder Hemmung einer Ausbreitung von Retroviren oder HIV nützlich, und zwar durch die Behandlung einer Zellpopulation, einschließlich Zellen, die mit HIV infiziert sind.
Daher betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die zur Hemmung der Ausbreitung eines Retrovirus in einer Zellpopulation geeignet ist. Das Retrovirus ist bspw. HIV oder HIV-1. Die Zusammensetzung weist eine Mischung aus ddI und Hydroxycarbamid auf, in der die Menge an ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 0,01 uM bis 100 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0, 25 mM bereitgestellt wird. Die Menge an ddI ist bspw. derart, daß eine Konzentration von etwa 2,5 uM bis 25 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird, oder die Menge an ddI ist derart, daß eine Konzentration von etwa 5 uM bis 10 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird.
Oder die Menge an ddI ist vorzugsweise derart, daß eine Konzentration von ungefähr 5 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von ungefähr 0,15 mM bereitgestellt wird.
Wenn das Retrovirus HIV-1 ist, ist die Menge an ddI bspw. derart, daß eine Konzentration von ungefähr 5 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von etwa 0,15 mM bereitgestellt wird.
Oder die Menge an ddI ist vorzugsweise derart, daß eine Konzentration von ungefähr 10 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von 0,15 mM bereitgestellt wird.
Wenn das Retrovirus HIV-1 ist, ist die Menge an ddI bspw. derart, daß eine Konzentration von ungefähr 10 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von etwa 0,15 mM bereitgestellt wird, oder die Menge an ddI ist derart, daß eine Konzentration von etwa 0,01 uM bis 100 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird. Die Menge an ddI ist bspw. derart, daß eine Konzentration von ungefähr 2,5 uM bis 25 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als ungefähr 0,25 mM bereitgestellt wird, oder die Menge an ddI ist derart, daß eine Konzentration von ungefähr 5 uM bis 10 uM bereitgestellt wird, und die Menge an Hydroxycarbamid ist derart, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als ungefähr 0,25 mM bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung irgendeiner Zusammensetzung, die zuvor definiert oder beispielhaft dargestellt wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Infektion, die mit einem menschlichen Retrovirus in Zusammenhang steht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Beispiele spezifischer Ausführungen der vorliegenden Erfindung sind nur zu illustrativen Zwecken aufgeführt und sind bezüglich des Umfanges der Offenbarung oder des Bereiches der Ansprüche nicht limitierend.
Das Testen der Mischung aus Didesoxyinosin (ddI) und Hydroxycarbamid (HC) bezüglich der Ausbreitung des HI-Virus wurde unter zwei Arten von Bedingungen durchgeführt:
a) Aus PBMC gereinigte CD4&spplus;-Lymphocyten, die mit dem HI- Virus ohne vorherige Aktivierung/Proliferation dieser Zellen durch Phythämagglutinin (PHA) und Interleukin-2 (IL-2) infiziert waren.
b) PBMC, aktiviert durch PHA und IL-2, anschließend mit dem HI-Virus infiziert.

Beispiel 1

Die Aktivität der Mischung aus ddI und HC auf nicht aktivierte CD4&spplus;-Lymphozyten, infiziert mit dem HI-Virus, wurde untersucht.

Nicht aktivierte CD4&spplus;-Zellen wurden infiziert und anschließend für 7 Tage mit HC, ddI oder der Kombination aus den beiden behandelt und anschließend durch PHA und IL-2 (PHA-IL-2) aktiviert.
Eine Lebensfähigkeit der Zellen zwischen 90% und 100% wurde während der ersten sieben Tage nach der Infektion beobachtet, jeweils bezüglich der infizierten Kontrolle und bezüglich der infizierten Zellen, die entweder mit den zwei Arzneistoffen getrennt oder in Kombination behandelt wurden. Eine vergleichbare proliferative zelluläre Antwort wurde in Anwesenheit von PHA-IL-2 innerhalb der ersten 3 Tage (Tage 7-9) sowohl bei den sechs Virus-infizierten Gruppen als auch bei den nicht infizierten und nicht behandelten Donor-CD4&spplus;-Zellen beobachtet. Diese proliferative Antwort steht mit dem cytopathischen Effekt in der infizierten Kontrollgruppe und in den Gruppen in Zusammenhang, die nur mit HC mit einer Konzentration von 0,05 und 0,15 mM behandelt wurden: diese Gruppen wiesen einen mehr als 50%igen Verlust der Lebensfähigkeit im Vergleich zu der nicht infizierten Kontrollgruppe auf; dieser Effekt beruht auf der viralen Replikation und geht mit der in großem Umfang erfolgten Produktion von p24-HIV in dem Kulturüberstand einher, die an Tag 15 beobachtet wurde (86215 pg an p24/ml bezüglich der infizierten Kontrolle, 75470 und 82005 bezüglich der mit 0,05 bzw. 0,15 mM HC behandelten Gruppen).
Der cytopathische Effekt wurde bei Zellen, die mit 5 uM ddI behandelt wurden, später beobachtet und erreichte 10 Tage später, an Tag 25, im wesentlichen den gleichen Pegel an p24- Produktion wie die infizierte Kontrolle (101080 pg p24/ml).
Die Mischung aus HC mit 0,05 mM und ddI mit 5 uM ändert das virale Replikations-Profil im Vergleich zu ddI alleine nicht wesentlich (84883 pg p24/ml an Tag 25).
Im Gegensatz dazu wird mit der Kombination aus 0,15 mM an HC und 5 uM an ddI ein überraschender synergistischer Effekt beobachtet, wobei an Tag 7 und Tag 25 keine verbleibende virale Produktion (< 1 pg p24/ml) detektierbar ist, und zwar trotz einer zellulären Proliferation, die identisch zu der nicht behandelten, nicht infizierten Kontrolle ist (> 90% Zell- Lebensfähigkeit, gemessen durch den MTT-Test).
Insbesondere wurde eine Aktivitätsstudie für eine Mischung aus ddI und HC auf nicht aktivierte CD4&spplus;-Lymphocyten erstellt, welche mit dem HI-Virus infiziert waren. Die CD4&spplus;-Lymphocyten wurden aus PBMC mit immunomagnetischen Beads (Dynabeads® M450) gereinigt. Diese Zellen wurden mit dem HIV-1-Stamm IIIB mit einer Multiplizität der Infektion von 5000 TCID (Gewebekultur- Infektionsdosis) pro 106 Zellen infiziert (241 pg/ml p24-Virus- Antigen-Äquivalent). Nach 2 Stunden des Virus-Zell-Kontaktes wurden die Zellen zweimal gewaschen und in das Kulturmedium RPMI 1640 gegeben (ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin), und zwar mit einer Dichte von 1,3 · 10&sup6; Zellen/ml. Umgehend wurde ddI mit einer Konzentration von 5 uM und HC mit Konzentrationen von 0,05 mM und 0,15 mM hinzugefügt. Die Arzneistoffe und das Kulturmedium wurden am Tag 4 teilweise erneuert (50%), wobei jeweils die gleiche Konzentration beibehalten wurde. Am Tag 7 wurden die Zellen zweimal gewaschen, um die Arzneistoffe zu entfernen, und in Anwesenheit von PHA mit einer Konzentration von 1 ug/ml und von rekombinantem IL-2 mit einer Konzentration von 20 U/ml zurück in Kultur gesetzt. Diese Kultur wurde bis Tag 25 aufrechterhalten, wobei das Medium zweimal in der Woche teilweise erneuert wurde (50%). Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde durch ein auf Tetrazolium basierendes kolorimetrisches Verfahren mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT) quantifiziert (Pauwels, R. et al., J. Virol. Methods, 20, 309-321, (1988)), und die Aktivität wurde als Prozentsatz des Signals in der Arzneistoff- und Virusfreien Kontrolle ausgedrückt. Die virale Replikation wurde durch Messung des HIV-1 p24-Antigens mittels ELISA unter Verwendung des DuPont de Nemours-Kit quantifiziert.

Beispiel 2

Um zu bestimmen, ob dieser synergistische Effekt von ddI in einer Mischung mit HC spezifisch ist für ddI oder nicht, oder ob ein ähnlicher Effekt auch mit AZT beobachtet werden konnte, wurde eine parallele Versuchsreihe durchgeführt, bei der HC mit Azidothymidin (AZT) kombiniert wurde, wobei überraschende Ergebnisse erzielt wurden.
AZT alleine bei einer Konzentration von 5 um weist eine nur geringe antivirale Aktivität auf, weniger als 1 log, 88,4% Inhibierung (10030 pg p24/ml im Vergleich zu 86215 pg p24/ml bezüglich der infizierten Kontrolle), weniger als ddI mit der gleichen Dosis unter den gleichen Bedingungen: 99,1% Inhibierung (766 pg p24/ml im Vergleich zu 86215 pg p24/ml bezüglich der infizierten Kontrolle). Die Konzentrationen der Arzneistoffe, die hierin verwendet wurden, können im Plasma leicht erreicht werden (Plasmakonzentration erreichbar unter Behandlungs-Bedingungen: 4 uM an AZT und 10 uM an ddI (Yarchoan et al., New Engl. J. Med., 321: 726-738, (1989)).
Eine vergleichbare proliferative zelluläre Antwort wurde nach einer Stimulierung durch PHA-IL-2 in allen Gruppen beobachtet. Diese proliferative Antwort steht mit dem cytopathischen Effekt in der infizierten Kontrollgruppe in Zusammenhang und mit den Gruppen, die nur mit HC bei Dosen von 0,05 und 0,15 mM und kombiniert mit AZT bei 5 uM behandelt wurden (diese Gruppen wiesen einen mehr als 50%igen Verlust an Lebensfähigkeit im Vergleich zur nicht infizierten Kontrollgruppe auf). Die Kombination aus HC bei 0,05 mM und bei 0,15 mM mit AZT bei 5 uM (10108 bzw. 9166 pg p24/ml) verändert das virale Replikationsprofil im Vergleich zu AZT alleine nicht.
Diese Ergebnisse zeigen, daß der synergistische Effekt, der die HIV-Replikation in den CD4&spplus;-Zellen, die nicht mit PHA- IL-2 (Beispiel 1) aktiviert wurden, auslöscht, nicht mit der Mischung aus HC mit AZT erzielt werden kann.
Eine weitere Versuchsreihe wurde bezüglich der Aktivität der Kombination aus AZT und HC auf nicht aktivierte CD4&spplus;- Lymphocyten, infiziert mit dem HI-Virus, durchgeführt. Die CD4&spplus;-Lymphocyten wurden aus PBMC mit immunomagnetischen Beads (Dynabeads® M450) gereinigt. Diese Zellen wurden mit dem HIV-1- Stamm IIIB mit einer Multiplizität der Infektion von 5000 TCID (Gewebekultur-Infektionsdosis) pro 106 Zellen (241 pg/ml p24- Virus-Antigen-Äquivalent) infiziert. Nach 2 Stunden des Virus- Zell-Kontaktes wurden die Zellen zweimal gewaschen und in das Kulturmedium RPMI 1640 gegeben (ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin), und zwar mit einer Dichte von 1,3 · 10&sup6; Zellen/ml. Umgehend wurde AZT mit einer Konzentration von 5 uM und HC mit einer Konzentration von 0,05 mM und 0,15 mM hinzugefügt. Die Arzneistoffe und das Kulturmedium wurden teilweise am Tag 4 erneuert (50%), wobei jeweils die gleiche Konzentration beibehalten wurde. Am Tag 7 wurden die Zellen, um die Arzneistoffe zu entfernen, zweimal gewaschen und unter Anwesenheit von PHA mit einer Konzentration von 1 ug/ml und von rekombinantem IL-2 mit einer Konzentration von 20 U/ml zurück in Kultur gegeben. Diese Kultur wurde bis Tag 25 aufrechterhalten, wobei das Medium zweimal in der Woche teilweise erneuert wurde (50%). Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde durch ein auf Tetrazolium basierendes kolorimetrisches Verfahren mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid (MTT) quantifiziert (Pauwels, R. et al., J. Virol. Methds, 20, 309-321, (1988)), und die Aktivität wird als Prozentsatz des Signals in der Arzneistoff- und Virusfreien Kontrolle ausgedrückt. Die virale Replikation wurde durch Messung des HIV-1 p24-Antigens mittels ELISA unter Verwendung des DuPont de Nemours-Kit quantifiziert.

Beispiel 3

Eine weitere Versuchsreihe zeigte die durch die Mischung von HC und ddI erreichte Hemmung der viralen Ausbreitung in einer zuvor aktivierten PBMC-Kultur, die mit dem HI-Virus infiziert wurde.
PBMC, welche zuvor mit PHA und IL-2 aktiviert wurden, wurden infiziert und mit HC bei einer Konzentration von 0,15 mM behandelt; diese Konzentration entspricht der IC&sub5;&sub0; (50% inhibitorische Konzentration) nach 3 Tagen, was durch den MTT-Test gemessen wurde, wobei die zelluläre Lebensfähigkeit > 90% war (diese Zell-Lebensfähigkeit wurde durch die Behandlung der Zellen mit 2% Trypanblau für 2 Minuten bestimmt, wobei der Farbstoffausschluß beobachtet wurde). Die Kombination aus 0,15 mM HC und 10 um ddI verändert den IC&sub5;&sub0; und die zelluläre Lebensfähigkeit nicht.
Das Virus replizierte sich in der unbehandelten Kultur schnell, wobei von Tag 6 an ein stabiler Pegel beibehalten wurde (Tag 6 = 71815; Tag 12 = 72750; Tag 20 = 62750 pg p24/ml). Die Behandlung mit ddI alleine bei 10 um und HC alleine bei 0,15 mM induzierte eine Hemmung von 97,1% (2071 pg p24/ml) bzw. 82,6% (12500 pg p24/ml) an Tag 6. Im Gegensatz dazu wird mit der Kombination aus 10 pH ddI und 0,15 mM HC ein bedeutender synergistischer Effekt beobachtet, mit einer Inhibierung von 99, 8% (100 pg p24/ml) an Tag 6 und keiner detektierbaren restlichen viralen Produktion (< 1 pg p24/ml) an Tag 12 und Tag 20.
Dieser bedeutende synergistische Effekt, der bei nicht aktivierten Lymphocyten gezeigt werden konnte, bei welchen die Kombination aus ddI mit HC die HIV-Infektion der Zellen auslöscht, wird auch hier beobachtet, wo die Lymphocyten zuvor aktiviert und mit der Kombination aus ddI und HC behandelt werden, während sich die PBMC replizierten.
Die virale Replikation wird in einer zuvor aktivierten PBMC-Kultur, die mit HIV infiziert wurde, durch die Kombination aus HC und ddI eliminiert. Die PBMC wurden durch eine diskontinuierliche Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation aus peripherem Blut gereinigt. Die Zellen wuchsen mit einer Dichte von 1,3 · 10&sup6; Zellen/ml in RPMI 1640- Medium, ergänzt mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin unter Anwesenheit von PHA mit einer Konzentration von 1 ug/ml und von rekombinantem IL-2 mit einer Konzentration von 20 U/ml für 72 Stunden; anschließend wurden sie mit dem HIV-1-Stamm IIIB mit einer Multiplizität von 5000 TCID pro 10&sup6; Zellen infiziert (241 pg/ml p24-Virus-Antigen-Äquivalent).
Nach 2 Stunden des Virus-Zell-Kontaktes wurden die Zellen zweimal gewaschen und in das Kulturmedium mit IL-2, jedoch ohne PHA, gegeben, und zwar in Anwesenheit von ddI bei einer Konzentration von 10 uM und von HC bei einer Konzentration von 0,15 mM. Diese Kulturen wurden für 20 Tage aufrechterhalten, wobei das Medium und die zwei Arzneistoffe zweimal in der Woche teilweise erneuert wurden, wobei die anfänglichen Konzentrationen beibehalten wurden. An Tag 6 und Tag 14 wurden frische, nicht infizierte Donor-PBMC hinzugefügt (5 · 10&sup5;/ml), um die gealterten Kulturen wieder aufzufüllen (Nature, 361: 1993, 650-654). Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde durch ein auf Tetrazolium basierendes kolorimetrisches Verfahren mit 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) quantifiziert (Pauwels, R. et al., J. Virol. Methods, 20: 309-321, (1988)), und die Aktivität wird als der Prozentsatz des Signals in der Arzneistoff- und Virusfreien Kontrolle ausgedrückt. Die virale Replikation wurde durch Messung des HIV-1 p24-Antigens mittels ELISA unter Verwendung des DuPont de Nemours-Kit gemessen.
Gao et al. (siehe PNAS USA, wie oben zitiert) zeigen "die Untersuchung der viralen DNA-Synthese des humanen Immundefizienz-Virus-Typ-1" (HIV-1) in ruhenden und aktivierten peripheren Blut-Lymphocyten (PBLS). Eine unvollständige virale DNA (von der zuvor gezeigt wurde, daß sie mit HIV-1-Virionen assoziiert ist) wird durch die HIV-1-Virionen in die ruhenden und aktivierten PBLS transportiert, wodurch zur Bildung eines frühen viralen DNA-Pools in diesen Zellen beigetragen wird. Die virale DNA wird anschließend vervollständigt, in den ruhenden PBLS jedoch im Vergleich zu der DNA in stimulierten PBLS äußerst langsam und ineffizient. Unseres Erachtens geht dieses Ergebnis mit den bedeutend niedrigeren Pegeln an dNTP-Substraten in den ruhenden PBLS im Vergleich zu aktivierten PBLS einher. Bei diesen geringen dNTP-Konzentrationen agiert die HIV-1-reverse Transkriptase teilweise distributiv. Ansteigende dNTP-Konzentrationen von den Pegeln der ruhenden PBLS auf die Pegel der aktivierten PBLS erhöhen die prozessive Wirkung der reversen Transkriptase, die daraufhin eine schnelle und effiziente Bildung von DNA mit kompletter Länge stimuliert. Darüber hinaus senkt eine Behandlung von stimulierten PBLS mit Hydroxyharnstoff die dNTP-Pegel und die DNA-Syntheserate auf Pegel, die mit denen von ruhenden PBLS vergleichbar sind. Unsere Daten zeigen daher, daß niedrige Pegel an dNTP dafür verantwortlich sind, daß HIV-1-DNA in ruhenden PBLS langsam und effizient synthetisiert wird, und lassen vermuten, daß die pharmakologische Induktion niedriger dNTP-Pegel einen therapeutischen Ansatz zur Inhibierung der HIV-1-Replikation darstellt."
Die Erklärung von Gao et al. zur langsamen und ineffizienten viralen HIV-1-DNA-Synthese in ruhenden PBLS kann unter der Tatsache stichhaltig sein, daß die virale DNA unter Bedingungen einer ausreichenden Replikation/Aktivierung vollständig in PBLS synthetisiert wird (Fauci, 1993, Science, 262: 1011-1018).
Nichtsdestotrotz können Gao et al. nicht erklären, wie HC (Hydroxycarbamid oder Hydroxyharnstoff) mittels seiner inhibitorischen Wirkung auf die Ribonucleotidreduktase und wie die Reduktion der dNTP-Pools in aktivierten Lymphocyten eine potentielle Verwendung von HC in der Behandlung von Patienten mit AIDS begründen würde. Bei einer Konzentration von 1 mM reduziert HC zum Teil die verschiedenen untersuchten dNTP-Pools, siehe dazu Fig. 4(a).
Ein Vergleich der Fig. 4(a) und der Tabelle 1 (dNTP-Pools in ruhenden und in PHAstimulierten PBLS) von Gao et al. zeigt, daß unter den gleichen Bedingungen (PBLS, infiziert mit HIV-1 in Anwesenheit und Abwesenheit von PHA) die Reduktion der Pool- Pegel in Tabelle 1 über einen äquivalenten 48-Stunden-Zeitraum bedeutend größer ist als die HC-induzierte Reduktion (siehe Tabelle 1).
Wenn man der Hypothese von Gao et al. zustimmt, daß die virale DNA-Synthese in "ruhenden" Zellen, in denen sie langsam und ineffizient ist, letztendlich vollständige DNA produziert, welche zur Integration fähig ist, ist es schwierig zu verstehen, wie - unter den zuvor beschriebenen Bedingungen - HC in AIDS-Patienten eine Aktivität aufweisen könnte. In der vorliegenden Offenbarung wird gezeigt, daß ruhende Zellen in der Anwesenheit von HC bei nicht toxischen Konzentrationen nicht dazu fähig sind, die Produktion von infektiösen Virionen zu verhindern, was durch die Messung des HIV-1-p24-Antigens im Überstand nach der Stimulierung durch PHA und IL-2 gemessen wurde.
Eine Erklärung der HC-induzierten Depletion des dNTP- Pools, die "die Rate an HIV-1-DNA-Synthese bedeutend reduziert und die Vervollständigung der viralen DNA-Synthese in mit PHAstimulierten PBLS inhibiert", siehe dazu Fig. 4(b) von Gao et al., würde sein, daß HC mit einer Konzentration von 1 mM für nicht aktivierte Lymphocyten cytotoxisch ist, welche für 24 Stunden vorbehandelt und durch PHA und IL-2 für die folgenden 48 Stunden in Anwesenheit von HC aktiviert wurden. Unter solchen Bedingungen sterben aufgrund der Toxizität des Arzneistoffs mehr als 70% der PBLS.
Unter der Überschrift "Mögliche Verwendung von Hydroxyharnstoff bei der AIDS-Therapie" legen Gao et al. dar, daß durch "die Depletion des zellulären dNTP-Pools Hydroxyharnstoff den therapeutischen Effekt der Nucleosidanaloga 3'-Azido- 3'-desoxythymidin, Didesoxyinosin oder Didesoxycytosin, die als Kompetitoren des zellulären dNTP fungieren, vermutlich steigern wird". Wenn dies wahr sein sollte, würde man erwarten, daß bei der Behandlung von infizierten "ruhenden" Zellen, in denen sich die dNTP-Pools auf ihren niedrigsten Pegeln befinden, Nucleosidanaloga einen bedeutenden Effekt hervorrufen würden. Wie in der vorliegenden Offenbarung gezeigt, hat dennoch die Behandlung von "ruhenden" Zellen, die 7 Tage lang mit HIV-1 infiziert und mit AZT alleine bei einer Konzentration von 5 mM behandelt wurden, nur einen leichten Effekt auf die virale Replikation, was durch die Messung des p24-Antigens gezeigt wird. Auf ähnliche Weise wird durch ddI alleine, mit der gleichen Konzentration und unter den gleichen Bedingungen, die virale Replikation nur vorübergehend und teilweise inhibiert; der Pegel der infizierten Kontrollgruppe wird schon an Tag 25 wieder erreicht. Daher kann die Erklärung von Gao et al., daß man einen Anstieg im therapeutischen Effekt bei der AIDS-Therapie durch Kombinieren eines Nucleosid-Analogons mit HC hätte vorhersagen können, nicht akzeptiert werden, zumal darüber hinaus die Ergebnisse der vorliegenden Offenbarung zeigen, daß ein überraschender synergistischer Effekt für die Kombination aus HC und ddI, jedoch keineswegs für HC und AZT, beobachtet wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine neue Zusammensetzung für die Behandlung einer Zellpopulation in Anwesenheit eines Retrovirus. Darüber hinaus schließt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung mit ein, die insbesondere für die Behandlung und Prävention von retroviralen Infektionen, insbesondere für diejenigen, die mit HIV und AIDS in Zusammenhang stehen, vorgesehen ist, wobei die Zusammensetzung eine synergistische Kombination aus Hydroxycarbamid (HC) und ddI als aktives Wirkprinzip in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist. Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann darüber hinaus auch inerte oder pharmakodynamisch aktive Additive, Träger und/oder Exzipienten aufweisen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann in Form eines gefriergetrockneten Pulvers der aktiven Substanz vorliegen, die direkt vor der Verwendung in einer physiologischen Lösung zum Zwecke der Injektion gelöst werden kann. Das Arzneimittel kann dann parenteral, bspw. intravenös, intraperitoneal, in die cerebrospinale Flüssigkeit und ähnlich verabreicht werden. Für eine Injektion wird der aktive Arzneistoff in einer physiologischen Lösung gelöst, bis die zur Verabreichung erwünschte Konzentration erreicht ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann darüber hinaus auch in einer Form vorliegen, die für eine orale Verabreichung geeignet ist. Geeignete Formen können bspw. Tabletten, harte Gelatinekapseln, Dragees, Pulver und Granulate sein. Die Bildung dieser oralen Formen ist dem Fachmann hinreichend bekannt. Jede der bekannten Formulierungen kann für die Herstellung der löslichen oralen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden.
Was die Dosierung des Arzneimittels gemäß der Erfindung betrifft, so wird dem Fachmann klar sein, daß die zu verabreichenden Dosierungen entsprechend dem Behandlungszeitraum, der Häufigkeit der Verabreichung, dem Patienten und der Beschaffenheit und Ernsthaftigkeit der Erkrankung variierbar sind, und daß die Dosierungen ohne unangemessenen Versuchsaufwand einfach bestimmt werden können.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung werden in im wesentlichen nicht toxischen Dosierungskonzentrationen verabreicht, die dazu ausreichen, um die Freisetzung einer ausreichenden Dosierungseinheit der vorliegenden synergistischen Kombination im Patienten zu gewährleisten, um für die erwünschte Inhibierung der Ausbreitung des Retrovirus zu sorgen. Die tatsächlich verabreichte Dosis wird durch physikalische und physiologische Faktoren, wie bspw. das Alter, Körpergewicht, Ernsthaftigkeit des Zustandes und/oder der klinischen Anamnese des Patienten zu bestimmen sein. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen kann die Dosis der vorliegenden synergistischen Kombination für ein bestimmtes Subjekt einfach durch den Arzt bestimmt werden. Es wird bemerkt, daß in außergewöhnlichen Fällen eine Dosis, die den toxischen Pegel erreicht, das geeignete Behandlungsprotokoll sein kann.
Bei der Behandlung von HIV-Infizierten und AIDS-Patienten kann die Zusammensetzung bspw. von ungefähr 1 bis 66 mg/kg/Tag an ddI und von größer als 5 mg/kg/Tag bis ungefähr 20 mg/kg/Tag an HC aufweisen.
Hydroxycarbamid (HC) und Didesoxyinosin können auch in Kombination mit anderen medizinischen Zusammensetzungen, die für die Behandlung von retroviralen Infektionen und Tumoren vorgesehen sind, verwendet werden. Immunostimulanzien und Immunomodulatoren, wie bspw. Cytokine, einschließlich IL-2, IL-12 und Interferon-Moleküle, können in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine bevorzugte Variationsbreite zur in vitro- Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließt Hydroxycarbamid in einer Konzentration mit ein, die größer als 0,05 mM und kleiner als oder gleich 0,25 mM ist, und zwar in Kombination mit ddI in Konzentrationen, die im allgemeinen bekannt sind und im Fachgebiet verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet HC in einer Konzentration von 0,15 mM und ddI in einem Bereich zwischen ungefähr 0,01 uM bis ungefähr 100 uM, vorzugsweise zwischen ungefähr 2,5 uM bis ungefähr 25 uM, am bevorzugtesten von ungefähr 5 uM bis ungefähr 10 uM.
Die Erfindung ist mit Bezug auf spezifische und bevorzugte Ausführungen beschrieben worden. Dem Fachmann wird klar sein, daß zahlreiche Veränderungen und Austausche vorgenommen werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen.

Claims

1. Zusammensetzung, die Hydroxycarbamid und 2',3'- Didesoxyinosin (ddI) aufweist, in der die Menge von ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 0,01 uM bis 100 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Menge von ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 2,5 uM bis 25 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in der die Menge von ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 5 uM bis 10 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von größer als 0,05 mM und gleich oder kleiner als etwa 0,25 mM bereitgestellt wird.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der die Menge von ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 5 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von etwa 0,15 mM bereitgestellt wird.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der die Menge von ddI derart ist, daß eine Konzentration von etwa 10 uM bereitgestellt wird, und die Menge von Hydroxycarbamid derart ist, daß eine Konzentration von etwa 0,15 mM bereitgestellt wird.

6. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 für die Zubereitung eines Arzneimittels zur Hemmung der Ausbreitung eines Retrovirus in einer Zellpopulation.

7. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 2 für die Zubereitung eines Arzneimittels zur Hemmung der Ausbreitung eines Retrovirus in einer Zellpopulation.

8. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 3 für die Zubereitung eines Arzneimittels zur Hemmung der Ausbreitung eines Retrovirus in einer Zellpopulation.

9. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 4 für die Zubereitung eines Arzneimittels zur Hemmung der Ausbreitung eines Retrovirus in einer Zellpopulation.

10. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 5 für die Zubereitung eines Arzneimittels zur Hemmung der Ausbreitung eines Retrovirus in einer Zellpopulation.