DE69433953T2

DE69433953T2 - Neues Verfahen zur Hemmung der Replikation der virusabhängigen reversen Transkriptase durch Verwendung von Didesoxynukleotid-Synthese Inhibitoren

Info

Publication number: DE69433953T2
Application number: DE69433953T
Authority: DE
Inventors: Franco Lori; Andrea Cara; Wen-Yi Gao; C. Robert GALLO
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1994-05-17
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2014-05-18
Also published as: CA2163456A1; WO1994027590A1; JP4117901B2; US6046175A; DE69433953D1; US6194390B1; EP0706387A1; JPH08509957A; US20060052317A1; US20060154892A1; AU6951994A; US20010008905A1; JP2006143743A; CA2163456C; ATE273700T1; EP0706387B1; AU685128B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der von reverser Transkriptase abhängigen Viren. Spezieller betrifft die Erfindung die Verwendung von Mitteln, welche intrazelluläre Konzentrationen an Desoxyribonukleosiden reduzieren, als ein Mittel zum Hemmen der Replikation von von reverser Transkriptase abhängigen Viren.
Hintergrund der Erfindung
Viren sind Mikroorganismen, die für ihr Wachstum und ihre Replikation zu einem gewissen Grad von Wirtszellkomponenten abhängen. Virale Infektion und Replikation in Wirtszellen führt im allgemeinen zu einer Erkrankung unabhängig davon, ob der Wirt ein Tier oder eine Pflanze ist. Menschliche Erkrankungen, die von viralen Infektionen verursacht werden, umfassen das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) und Hepatitis. Eine allgemeine Diskussion dieses Gebiets wird in Fundamental Virology, Zweite Auflage, (Hrsg. B. N. Fields, D. M. Knipe, R. M. Chanock, M. S. Hirsh, J. L. Melnick, T. P. Monath und B. Roizman, Raven Press, Ltd., New York, N. Y. 1991) gegeben.
Retrovirus-Replikation
Retroviren umfassen eine große Familie von Viren, die in erster Linie Wirbeltiere infizieren. Viele Erkrankungen, einschließlich der Induktion einiger Tumore, gehen mit retroviraler Infektion einher (seihe Fundamental Virology, supra, S. 645–708). Alle Retroviren, unabhängig von ihrer klinischen Erscheinungsform, besitzen verwandte Strukturen und Replikationsmodi.
Retroviren enthalten ein RNA-Genom, das über ein DNA-Zwischenprodukt repliziert wird. Innerhalb der Zelle dient das virale Genom als Vorlage für die Synthese eines doppelstrangigen Desoxyribonukleinsäure- (DNA-) Moleküls, welches sich anschließend in das Genom der Wirtszelle integriert. Diese Integration führt gelegentlich zu der Induktion eines Tumors in dem infizierten Wirtsorganismus. Nach einer Integration führt eine komplexe Abfolge von Ereignissen zu der Produktion von Nachkommen-Virionen, welche von der infizierten Zelle freigesetzt werden.
Früh im retroviralen Lebenszyklus wird das RNA-Genom von der viral codierten reversen Transkriptase (RT) zu DNA kopiert. Dieses Enzym kann sowohl RNA- als auch DNA-Vorlagen verwenden, wobei es den ersten Strang von DNA (den Negativstrang) von dem infizierenden RNA-Genom herstellt und einen komplementären zweiten Strang (den Positivstrang) von DNA unter Verwendung des ersten DNA-Strangs als eine Vorlage. Zum Synthetisieren dieser DNA-Stränge verwendet die RT zelluläre Substrate, die als Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP) bezeichnet werden.
Menschliche Retroviren können in die Leukämieviren (Viren vom HTLV-Typ) und die Immunschwächeviren (Viren vom HIV-Typ) gruppiert werden. Eine HTLV-Infektion kann zu einer Form von Leukämie führen. Erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) wird von einer Form von HIV verur sacht, wobei HIV-1 stärker virulent ist als HIV-2. Sowohl HTLV als auch HIV infizieren periphere Blutlymphozyten (PBL).
Andere Tierretroviren umfassen Katzenleukämievirus (FeLV) und Lentiviren. Virulente FeLV-Infektion führt im allgemeinen zu tödlicher aplastischer Anämie in Katzen. Lentiviren verursachen eine Vielzahl neurologischer und immunologischer Erkrankungen, wie Visna in Schafen und infektiöse Anämie in Pferden.
HIV-Infektion
HIV-1 wurde 1983 zuerst als der ursächliche Stoff von AIDS identifiziert. Die AIDS-Pandemie ist nun eines der schwerwiegendsten Gesundheitsprobleme weltweit. Es ist wahrscheinlich, daß sich katastrophale medizinische und soziale Folgen bis in das nächste Jahrhundert erstrecken. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat geschätzt, daß derzeit zwischen acht und zehn Millionen Menschen mit HIV infiziert sind und daß etwa zehnmal so viele Individuen in der nächsten Dekade betroffen sein werden. Der große Pool an HIV-Trägern macht die Entwicklung von wirkungsvollen antiviralen Behandlungen zu einer medizinischen Priorität.
Hepatitis B-Infektion
Das Hepatitis B-Virus (HBV) ist eines von wenigstens drei (A, B und C) Viren, die selektiv Leberzellen infizieren (für eine allgemeine Diskussion von HBV siehe Fundamental Virology, supra, S. 989–1021). HBV-Infektionen sind häufig persistent mit minimalem Leberschaden oder chronischer Hepatitis, was zu Zirrhose oder Leberkrebs führen kann (hepatozelluläres Karzinom oder HCC). Weltweit sind mehr als 200 Millionen Menschen mit HBV infiziert.
Andere Viren
Mehrere andere Viren, die Menschen, Tiere und Pflanzen infizieren, sind für die Replikation ebenfalls von reverser Transkriptase abhängig. Diese umfassen Retroviren, wie die Leukämieviren, von denen bekannt ist, daß sie in mehreren Spezies vorkommen, einschließlich HTLV-1 im Menschen, sowie von reverser Transkriptase abhängige DNA-Viren, wie den Blumenkohl-Mosaikvirus (einem Pflanzenvirus).
Antivirale Therapien
Es gibt einen hohen Bedarf nach Entwicklung effektiver Arzneimittelbehandlungen zur Bekämpfung von RT-abhängigen Viren, wie HIV. Diese Bemühungen wurden kürzlich im Fazit des britisch-irisch-französischen Gemeinschaftsprojekts vorangetrieben, welches darüber berichtete, daß das Nukleosidanaloge Zidovudin (AZT), eine Hauptstütze bei der Behandlung von mit HIV-1 infizierten Patienten, darin versagte, das Überleben oder den Krankheitsfortschritt in asymptomatischen Patienten zu verbessern. Andere Nukleosidanaloge, wie Didanosin (ddl), sind derzeit in der Erprobung. Die Wirkungen von ddl auf den Krankheitsverlauf und den Endpunkt des Patientenüberlebens wurden noch nicht angemessen untersucht. Kürzlich wurden auch nicht-kompetitive HIV-1- RT-Inhibitoren und HIV-1-Proteaseinhibitoren entwickelt. Trotz der hohen Wirksamkeit dieser Verbindungen waren die anfänglichen in vitro/in vivo-Tests durch das schnelle Auftreten von Varianten von HIV-1, die gegen diese Arzneimittel resistent waren (Escape-Mutanten), gekennzeichnet. Obwohl sie verschiedene antivirale Aktivitäten und pharmakokinetische Eigenschaften besitzen, zielen die hier erwähnten Arzneimittel alle direkt auf HIV-1-Proteine.
Obwohl dieser letztgenannte Ansatz fortgeführt werden muß, haben wir eine andere antivirale Strategie entwickelt, die auf einen oder mehrere zelluläre Bestandteile zielt, die für die Replikation von reverser Transkriptase abhängigen Viren erforderlich sind.
Die US 4,927,843 beschreibt Thiosemicarbazone, wie M-IBT-Derivate, als wirkungsvoll bei der Behandlung von Retroviren.
Hydroxyharnstoff ist ein Antikrebsmittel, welches Ribonukleotidreduktase hemmt (J. Med. Chem., Band 28, 1985, Seiten 1103–06, T'ang et al., "Optimization of the Schiff Bases of N-hydroxy-N'aminoguanidines as Anticancer and Antiviral Agents"). Die WO 84/00888 offenbart, daß Ribonukleotidreduktase-Inhibitoren bei der Behandlung verschiedener viraler Infektionen, wie Rous-Sarkom-Virus, nützlich sein könnten, und Lien et al. diskutieren, daß Inhibitoren von Ribonukleotidreduktase synergistisch mit Ara-C wirken können (Progress In Drug Research, Band 31, 1987, Seiten 101–26, Lien J. Eric "Ribonucleotide Reductase inhibitors as anticancer and antiviral agents").
Die Wirkung von Hydroxyharnstoff auf Lymphozyten, die durch Adenosindesaminase- (ADA) Immunschwäche gekennzeichnet sind, wurde diskutiert (Experimental Cell Research, Band 179, 1988, Seiten 417–28, Albert et al., "Deoxyadenosine Toxicity and Cell Cycle Arrest in Hydroxyurea Resistant S49 T-Lymphoma Cells").
Die Möglichkeit, die Thymidinanalogen mit Hydroxyharnstoff bei der Behandlung von Retrovirus-Infektion zu kombinieren, ist bekannt (Eur. J. Biochem., Band 186, 1989, Seiten 689–94, Karlsson, "Hydroxyurea Increases the Phosphorylation of 3'-Fluorothymidine and 3'-Azidothymidine in CEM cells"), und die Wirkungen von Kombinationsbehandlungen, welche Desoxyguanosin und entweder Hydroxyharnstoff oder einen Inhibitor von Adenosindesaminase umfassen, die man als ENHA bezeichnet, auf Lymphoblasten wurden diskutiert (J. Clin. Invest., Band 64, 1979, Seiten 1475–84, Wilson et al., "Purinogenic Immunodeficiency Diseases – Differential Effects on Deoxyadenosine and deoxyguanosine on DNA synthesis in Human T Lymphoblasts"). Desoxyadenosin ist jedoch dafür bekannt, die Wirkungen von Hydroxyharnstoff umzukehren (VIII International Conference on AIDS/STD World Congress Amsterdam, Niederlande, Band 2, 1992, Seite A22–2118, Meyerhans et al., "The Intracellular Nucleotide Pool Effects HIV Replication").
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß Arzneimittel, welche die intrazelluläre Konzentration an Desoxynukleosidphosphaten reduzieren, die Replikation der von reverser Transkriptase abhängigen Viren hemmt. Solche Arzneimittel wirken entweder durch Hemmung der intrazellulären Synthese von Desoxynukleosidphosphaten oder durch Abreicherung des intrazellulären Pools an Desoxynukleosidphosphaten. Viren, die für eine Wachstumshemmung durch Begren zen der Desoxynukleosidphosphate empfindlich sind, sind Retroviren, einschließlich HIV, welches AIDS verursacht, Hepatitis B-Virus, Blumenkohl-Mosaikvirus und andere von reverser Transkriptase abhängige Viren. Als ein Beispiel begrenzt Hydroxyharnstoff die Synthese der intrazellulären Desoxynukleosidphosphate durch Hemmung der enzymatischen Aktivität von Ribonukleosidreduktase. Es sind andere Verbindungen bekannt, die in ähnlicher Weise die Ansammlung von intrazellulären Desoxynukleosidphosphaten durch diesen Mechanismus oder durch Beeinflussung anderer biosynthetischer Stufen, die zur Produktion von intrazellulären Desoxynukleosidphosphaten führen, hemmen. Verbindungen, welche intrazelluläre Desoxynukleosidphosphate begrenzen, können in Verbindung mit antiviralen Nukleosidphosphatanalogen, welche selbst als kompetitive Inhibitoren von nativen Nukleosiden therapeutisch wirksam sind, zur Erhöhung der Wirksamkeit von antiviraler Behandlung verwendet werden. Dementsprechend liefert ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer synergistischen Kombination eines Inhibitors von Ribonukleotidreduktase und eines antiviralen Nukleosidphosphatanalogen, welches ein anderes ist als ein Thymidin- oder Cytidin-Analoges, bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Replikation eines von reverser Transkriptase abhängigen Virus.
Ein bevorzugter Inhibitor von Ribonukleotidreduktase ist Hydroxyharnstoff.
Die Erfindung kann auf Zellen in vitro oder in vivo angewendet werden. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Tier ein Säuger oder ein Vogel. Vorzugsweise ist das Tier ein Mensch.
In einer speziellen Ausführungsform ist das Virus das menschliche Immunschwächevirus (HIV), wie HIV-1 oder HIV-2, und die Zellen sind menschliche Zellen. In einer weiteren speziellen Ausführungsform ist das Virus Hepatitis B, und die Zellen sind menschliche Zellen.
Vorzugsweise ist das antivirale Nukleosidphosphatanaloge ein Mittel, das dazu dient, die Replikation des Virus durch Beendigung der DNA-Kettenverlängerung zu hemmen. Zum Beispiel begrenzen AZT und Didesoxynukleoside, wie ddl, ddC und 2'-Fluordidesoxynukleoside, auf diese Weise virale Replikation. Wirksame 2'-Fluordidesoxynukleoside umfassen 2'-Fluoropurindidesoxynukleoside, wie 2'-F-dd-ara-A, 2'-F-dd-ara-I und 2'-F-dd-ara-G. Eine Verwendung dieser Verbindungen kann zu einer frühzeitigen Beendigung von viraler DNA-Synthese unter Herstellung unvollständiger viraler DNA führen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1a stellt graphisch die p24-Expression in mit HIV-1 infizierten PBL als eine Funktion der Hydroxyharnstoff- und ddl-Konzentrationen dar.
1b stellt graphisch die Anzahl überlebensfähiger PBL in einer mit HIV-1 infizierten Kultur als eine Funktion der Hydroxyharnstoff- und ddl-Konzentrationen dar.
1c zeigt HIV-1-p24-Expression, normiert auf die Anzahl überlebensfähiger Zellen, als eine Funktion der Hu- und ddl-Konzentrationen.
2 stellt graphisch die p24-Expression in mit HIV-1 infizierten menschlichen primären Makrophagen als eine Funktion der Hydroxyharnstoff- und AZT-Konzentrationen dar.
3a stellt graphisch einen zeitlichen Verlauf der p24-Hemmung durch Hydroxyharnstoff und/oder durch ddl in aktivierten PBL, die aus einem mit HIV-1 infizierten Patienten isoliert wurden, dar.
3b stellt graphisch die Anzahl überlebensfähiger Zellen, die von einem mit HIV-1 infizierten Patienten isoliert wurden und welche unter Behandlung mit Hydroxyharnstoff und/oder ddl in Kultur überlebten, dar.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß eine Reduzierung der intrazellulären Desoxynukleosidtriphosphat- (dNTP-) Konzentration selektiv die Replikation der von reverser Transkriptase abhängigen Viren hemmt. Ein Ansatz zur Virenhemmung, der auf dieser Strategie beruht, vermeidet mit Vorteil das Auslösen der Bildung von viralen Escape-Mutanten. Umgekehrt würde man erwarten, daß direkter selektiver Druck gegen virale Proteine die Bildung solcher Mutanten fördert.
In der Ausführung der vorliegenden Erfindung ist Hydroxyharnstoff eine bevorzugte Verbindung, die Ribonukleotidreduktase hemmt, ein Enzym, welches die Reduktion von Ribonukleosiddiphosphaten zu ihren Desoxyribonukleosid-Gegenstücken für die DNA-Synthese katalysiert. Andere Ribonukleotidreduktase-Inhibitoren umfassen Guanazol, 3,4-Dihydroxybenzohydroxamsäure, N,3,4,5-Tetrahydroxybenzimidamid HCl, 3,4-Dihydroxybenzamidoxim HCl, 5-Hydroxy-2-formylpyridinthiosemicarbazone und a-(N)-heterozyklische Carboxyaldehydthiosemicarbazone, 4-Methyl-5-amino-1-formylisochinolinthiosemicarbazon, N-Hydroxy-N'-aminoguanidin- (HAG-) Derivate, 5-Methyl-4-aminoisochinolinthiosemicarbazon, Diaziquon, Doxorubicin, 2,3-Dihydroxylbenzoyldipeptide und 3,4-Dihydroxylbenzoyldipeptide, mit Eisen komplexiertes 2-Acetylpyridin-5-[(2-chloroanilino)-thiocarbonyl]-thiocarbonohydrazon (348087), mit Eisen komplexiertes 2-Acetylpyridin-5-[(dimethylamino)-thiocarbonyl]-thiocarbonohydrazon (A1110U), 2'-Desoxy-2'-methylencytidin-5'-diphosphat (MdCDP) und 2'-Desoxy-2',2'-difluorocytidin-5'-diphosphat (dFdCDP), 2-Chloro-9-(2-desoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl)-adenosin (Cl-F-arg-A), Diethyldithiocarbamat (DDC), 2,2'-Bipyridyl-6-carbothioamid, Phosphonylmethylether von azyklischen Nukleosidanalogen [z. B. Diphosphate von N-(S)-3-Hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl- und N-2-Phosphonylmethoxyethyl-Derivaten von Purin- und Pyrimidin-Basen], Nitrosoharnstoffverbindungen, Acyclonukleosid-Hydroxamsäuren (z. B. N-Hydroxy-a-(2-hydroxyethoxy)-1(2H)-pyrimidinacetamide 1–3 und 2-Acetylpyridin-4-(2-morpholinoethyl)-thiosemicarbazon (A723U)).
Verbindungen, welche Ribonukleotidreduktase hemmen, können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden. Wenn sich die behandelten Zellen in vitro befinden, kann die Verbindung einfach in das Medium, in welchem die Zellen wachsen, eingebracht werden. Auf der anderen Seite, wenn die zu behandelnden Zellen Teil eines größeren Organismus sind, d. h., wenn die Behandlung in vivo stattfindet, kann eine Verabreichung an ein Tier über den oralen Weg erfolgen, oder sie kann intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, transdermal, transmukosal (z. B. durch Inhalation oder mittels eines Suppositoriums) oder auf jedem anderen geeigneten Weg erfolgen. Verabrei chung an Pflanzen kann durch Sprühen, Bestäuben, Anwendung im Bewässerungswasser oder durch jede andere bequeme Art und Weise erreicht werden.
Die besondere Dosierung, Toxizität und der Mechanismus zur Auslieferung der Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung sind entweder bereits bekannt oder können durch herkömmliche empirische Techniken einfach ermittelt werden. Obwohl einige der dNTP-abreichernden Verbindungen begrenzte Toxizität oder Schwierigkeiten bei der intrazellulären Auslieferung aufweisen können, wurden andere (wie Hydroxyharnstoff) ausgiebig untersucht, und es wurde gefunden, daß sie günstige pharmakologische Eigenschaften besitzen.
Geeignete Dosierungen dieser Verbindungen für den Menschen können in breitem Maße variieren. Jedoch können diese Dosierungen von den Fachleuten auf dem Gebiet einfach bestimmt werden. Zum Beispiel werden Dosierungen an erwachsene Menschen von etwa 0,1 mg bis etwa 1 g oder sogar 10 g in Betracht gezogen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Dosierung so, daß der intrazelluläre dNTP-Pool auf eine Konzentration abgereichert wird, die unterhalb des K_m der viralen reversen Transkriptase liegt, aber oberhalb des K_m von endogenen zellulären Polymerasen, wie DNA-Polymerase α, β und γ. Dies erlaubt eine selektive Hemmung viraler Replikation ohne signifikante zelluläre Toxizität.
Hydroxyharnstoff wurde in breitem Maße in der Krebstherapie als ein antineoplastischer Breitbandwirkstoff eingesetzt (R. C. Donehower, Seminars in Oncology 19 (Suppl. 9), 11 (1992)). Hydroxyharnstoff wird nach oraler Aufnahme leicht absorbiert, schnell in den Körperflüssigkeiten, einschließlich der zerebrospinalen Flüssigkeit, verteilt und dringt wirkungsvoll durch passive Diffusion in Zellen ein (id.). Seine toxischen Wirkungen sind weniger schwer und einfacher zu kontrollieren als die anderer chemotherapeutischer Wirkstoffe (id.).
In der Chemotherapie beim Menschen wird Hydroxyharnstoff derzeit unter Anwendung von zwei grundlegenden Plänen verabreicht: (a) eine kontinuierliche tägliche orale Dosis von 20–40 mg pro kg pro Tag oder (b) eine unterbrochene Dosis von 80 mg pro kg pro jedem dritten Tag. Jeder Plan könnte bei der Behandlung von viralen Infektionen angewendet werden. Da jedoch die Reaktion auf eine Behandlung variabel ist, müssen die Anzahlen peripherer weißer Blutzellen aufgezeichnet werden, so daß die Behandlung gestoppt werden kann, wenn Leukopenie auftritt. Ähnliche Dosierungsbereiche können in der Praxis der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
In Anbetracht dessen, daß virale reverse Transkriptase im allgemeinen ziemlich empfindlich auf erniedrigte Mengen an dNTP sind, können niedrigere Dosierungen von Hydroxyharnstoff bei einer Behandlung von viralen Infektionen ebenfalls wirksam sein. Solche niedrigen Dosierungen von Hydroxyharnstoff würden die Toxizität auf weiße Blutzellen reduzieren. Jede Dosierung, welche wirkungsvoll die Replikation von RT-abhängigen Viren vermindert, wäre bei der chronischen Behandlung von AIDS-Patienten nützlich.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden die Hemmung der Aktivität von reverser Transkriptase und die Verminderung von HIV-1-DNA-Synthese durch Behandlung von Zellen mit Hydroxyharnstoff in Kombination mit einer synergistischen Menge eines antiviralen Nukleosidphosphatanalogen, welches ein anderes ist als ein Thymidin- oder Cytidin-Analoges, durchge führt. Unter den spezifizierten Bedingungen wurde unvollständige HIV-1-DNA ohne offensichtliche toxische Wirkungen auf die Zellen gebildet. Von unvollständiger viraler DNA wurde gezeigt, daß sie in PBL schnell abgebaut wird (Zack et al., supra, 1990 und 1992). Daher liefert die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zum Hemmen von HIV-Replikation durch Modulieren intrazellulärer dNTP-Pools.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch antivirale Therapien, die auf der Verwendung von dNTP abreichernden Wirkstoffen in Verbindung mit herkömmlichen oder neuen Nukleosidphosphatanalogen basieren. Es wird erwartet, daß Wirkstoffe, wie Hydroxyharnstoff, durch Abreicherung des intrazellulären dNTP-Pools die therapeutische Wirkung der Behandlung von HIV-Infektion durch Nukleosidphosphatanaloge, wie AZT, ddl, ddC, 2'-F-dd-ara-A, 2'-F-dd-ara-I und 2'-F-dd-ara-G, erhöhen. Diese Analogen wirken als Kompetitoren von zellulären dNTP nach einem antiviralen Mechanismus, der sich von demjenigen von Hydroxyharnstoff unterscheidet. Eine Beschreibung der 2'-Fluoronukleoside wurde von Marquez et al. in J. Med. Chem. 33: 978–985 (1990) gegeben. Derzeit erfordert eine antivirale Therapie Dosen von AZT oder ddl von 500 mg pro Tag oder von ddC von 2 mg pro Tag für einen erwachsenen Menschen. Ähnliche Dosierungen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Jedoch kann die Verwendung von Ribonukleotidreduktase hemmenden Wirkstoffen die Wirksamkeit dieser Nukleosidphosphatanalogen erhöhen, so daß diese in geringeren Dosierungen oder weniger häufig eingesetzt werden können.
Eines der Probleme bei der Verwendung antiviraler Nukleosidphosphatanaloge ist das Auftreten von Escape-Mutanten. Diese Varianten leiten sich üblicherweise von Mutationen in dem Gen, welches RT codiert, ab. Wir glauben, daß das Auftreten von RT-Mutanten, welche wirken können, bei Verwendung niedriger Mengen an Nukleotiden ein unwahrscheinliches Ereignis sein wird. Daher nehmen wir an, daß antivirale Wirkstoffe, wie Hydroxyharnstoff, welche intrazelluläre dNTP-Pools abreichern, wahrscheinlich nicht die Entwicklung von RT-Escape-Mutanten fördern. Darüber hinaus könnten Wirkstoffe, welche den intrazellulären dNTP-Pool abreichern, bei der Behandlung von viraler Erkrankung in Fällen, bei denen RT-Escape-Mutanten aufgetreten sind, wertvoll sein.
Weil Ribonukleotidreduktase hemmende Wirkstoffe und Nukleosidphosphatanaloge verschiedene Hemmechanismen haben, sagen wir vorher, daß Kombinationen dieser Mittel zu synergistischen hemmenden Wirkungen führen werden. Es wird angenommen, daß die therapeutischen Wirkungen von Nukleosidphosphatanalogen, welche als Kompetitoren von dNTP wirken, durch Abreicherung des intrazellulären Nukleotidpools mit Hydroxyharnstoff oder einem ähnlich wirkenden Wirkstoff erhöht werden. Solch eine Kombinationswirkstoffbehandlung kann auch zu verminderter Toxizität führen, da niedrigere Dosierungen von Nukleosidphosphatanalogen wirkungsvoller gemacht werden würden.
Da HIV-1-RT ein sich verteilendes Enzym ist, haben wir erwartet, daß durch Wirkstoffe, wie Hydroxyharnstoff, induzierte niedrige Mengen an dNTP RT stärker beeinflussen würde als die zellulären DNA-Polymerasen α, β und γ, welche dafür bekannt sind, daß sie prozessierende Enzyme sind (Huber, et al., supra; Kati, et al., supra; U. Hübscher, supra). Diese selektive Wirkung auf RT kann zu niedrigeren zellulären toxischen Wirkungen führen als sie mit anderen antiviralen Wirkstoffen auftreten.
Anders als Retroviren ist HBV ein DNA-Virus mit einem teilweise doppelstrangigen und teilweise einzelstrangigen Genom. Jedoch ist, wie bei Retroviren, reverse Transkription früh in dem Prozeß der HBV-Genomreplikation erforderlich. Die RT ist durch das HBV-Genom spezifiziert und wird in der infizierten Wirtsleberzelle, wo virale Replikation stattfindet, synthetisiert.
Weil Replikation des viralen HBV-Genoms von RT abhängig ist, wird erwartet, daß die synergistische Kombination der vorliegenden Erfindung auch bei der Begrenzung der viralen HBV-Replikation wirksam ist. Wirkstoffe, wie Hydroxyharnstoff, welche in nahezu alle Zelltypen diffundieren, wären besonders vorteilhaft bei der Kontrolle der hepatischen Replikation von HBV.
Begrenzte HBV-Replikation hat zwei wichtige Effekte. Erstens begrenzt sie die Ausbreitung infektiöser Virionen von Trägern auf nicht-infizierte Individuen. Zweitens vermindert sie die Symptome, wie chronische Hepatitis, in infizierten Individuen. Allgemein verbessert sich die Leberfunktion, nachdem eine HBV-Replikation beendet wurde. Auch weil die Häufigkeit von HCC in mit HBV infizierten Menschen viel höher ist, würde eine abnehmende Infektion in der Population voraussichtlich zu einer abnehmenden Häufigkeit von Leberkrebs führen.
Wie es oben beschrieben ist, könnte die Verwendung von Hydroxyharnstoff (oder ähnlichen Ribonukleotidreduktase hemmenden Wirkstoffen) in Verbindung mit antiviralen Wirkstoffen, wie Adenin-Arabinosid, ara-Monophosphat, Acyclovir, 6-Desoxyacyclovir und α-, β- und γ-Interferonen, die über andere Mechanismen wirken, die Wirksamkeit dieser Anti-HBV-Wirkstoffe ebenfalls erhöhen. Dies wird insbesondere für Adenin-Arabinosid vorausgesagt, welches als ein kompetitiver Inhibitor in einem Mechanismus wirkt, der zu demjenigen von antiviralen Nukleosidphosphatanalogen, die zur Behandlung von HIV-Infektionen verwendet werden, analog ist. Darüber hinaus könnte eine Behandlung mit Hydroxyharnstoff (oder ähnlichen Ribonukleotidreduktase hemmenden Wirkstoffen) antivirale Wirkstoffe in niedrigeren Dosen als sie für eine Behandlung erforderlich sind, bei der antivirale Wirkstoffe allein verwendet werden, wirkungsvoller machen.
Wie es oben beschrieben ist, wird die Anwendung der synergistischen Kombination der vorliegenden Erfindung auf Menschen, deren HBV-Infektionen gegen antivirale Wirkstoff unempfänglich geworden sind, in der vorliegenden Erfindung ebenfalls antizipiert.
Andere Viren, welche Tiere oder Pflanzen infizieren, sind für ihre Replikation ebenfalls von RT-Aktivität abhängig. Blumenkohl-Mosaikvirus ist ein Beispiel eines Virus, das eine RT bei der Replikation seines DNA-Genoms verwendet.
Die botanische Verwendung der vorliegenden Erfindung liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung, wie auch die Anwendung dieser Verbindungen auf Tiere, einschließlich Menschen, die mit einer breiten Auswahl an RT-abhängigen Viren infiziert sind.
Das Grundprinzip der vorliegenden Erfindung und die Anwendung der vorliegenden Erfindung können durch Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele besser verstanden werden.
Eine Schlüsselstufe der HIV-1-Infektion von PBL ist die Überführung des viralen RNA-Genoms in doppelstrangige DNA durch die Wirkung von HIV-1-RT. Virale DNA-Synthese ist in verschiedenen Zuständen von infizierten PBL unterschiedlich. In ruhenden PBL kann virale DNA-Synthese so wirksam initiiert werden wie in mitogenstimulierten PBL. Im Gegensatz zu den stimulierten Zellen kann DNA-Synthese in ruhenden PBL jedoch vorzeitig abbrechen (J. A. Zack, et al., Cell 61: 213 (1990); J. A. Zack, et al., Virology 66: 1717 (1992)), wobei keine HIV-1-Nachkommen erzeugt werden (Zack, et al., supra; M. Stevenson, et al., EMBO J. 9: 1551 (1990); M. I. Bukrinsky, et al., Science 254: 423 (1991)). Dieser Vorgang führt zu einem Pool von nicht-integrierter viraler DNA (Stevenson, et al., supra; Bukrinsky, et al., supra), welcher sowohl in in vitro-infizierten ruhenden PBL als auch in vivo-infizierten ruhenden PBL latent verbleiben kann (Zack, et al., supra, 1990 & 1991; Stevenson, et al., supra; Bukrinsky, et al., supra). Stimulation dieser Zellen kann HIV-1-DNA freisetzen, was zu Integration und Produktion von viralen Nachkommen führt (id.). Unvollständige virale DNA wurde auch einhergehend mit reifen infektiösen HIV-1-Partikeln gefunden, aber die biologische Rolle dieser DNA ist unklar (F. Lori, et al., J. Virol. 66: 5067 (1992); D. Trono ibid. 66: 4893 (1992)).
Beispiel 1 erläutert ein Verfahren, das zur Quantifizierung der Replikation des HIV-1-Genoms in infizierten Zellen verwendet werden kann. In diesem Beispiel wurden die Raten von HIV-1-DNA-Synthese in infizierten ruhenden und stimulierten PBL unter Verwendung eines Polymerasekettenreaktion- (PCR-) Tests quantitativ analysiert.
Beispiel 1
HIV-Replikation
Der PCR-Test, welcher zuvor zur Quantifizierung von HIV-1-DNA in reifen HIV-1-Virionen angewendet wurde (F. Lori, et al., supra; D. Trono, supra), wurde dazu verwendet, mehrere Bereiche des HIV-1-Genoms zu vervielfältigen. Die zur Vervielfältigung der viralen DNA verwendeten Primerpaare waren M667/AA55, M667/BB301 und M667/M661 (M. Stevenson, et al., supra; M. I. Bukrinsky, et al., supra). M667 ist ein Sense-Primer in der R-Region der langen terminalen Wiederholung (LTR). AA55 ist ein Antisense-Primer unmittelbar 5' zu der PB- (tRNA-Primerbindungs-) Region. Das M667/AA55-Primerpaar vervielfältigt den Negativstrangbereich, der ursprünglich von RT synthetisiert wurde, unter Erhalt eines Produkts, das als R-U5 bezeichnet wird. BB301 ist komplementär zu der PB-Region. Vervielfältigung durch M667/BB301 kann erreicht werden in der Gegenwart von Positivstrang-DNA, welche beginnend bei dem Polypurinbereich aufstromig von dem rechten LTR synthetisiert und, nach Springen zu dem anderen Ende der Vorlage, bis zu der PB-Region unter Erhalt eines als R-PB bezeichneten Produkts verlängert wurde (H. E. Varmus und R. Swanstrom, in Replications of Retroviruses, RNA Tumor Viruses. R. Weiss, N. Teich, H. Varmus, J. Coffin, Hrsg. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1984), S. 369–512). Es wir nicht erwartet, daß der Negativstrang, welcher nicht vollständig abgeschlossen wurde, vervielfältigt wird, weil die RNA-Sequenzen, welche zu der PB-Region komplementär sind, in diesen Experimenten verdaut wurden. M661 ist ein Antisense-Primer in der gag-Region. Vervielfältigung durch M667/M661 spiegelt das Vorhandensein einer vollständigen Negativstrang-DNA zum Erhalt eines als R-gag bezeichneten Produkts wider. Die Primer wurden zur Bestimmung des Ausmaßes reverser Transkription an drei verschiedenen Replikationsstufen entworfen: R-U5, anfängliche Negativstrangsynthese; R-PB, anfängliche Positivstrangsynthese bis zu der tRNA-Primerbindungsregion; und R-gag, vollständige Negativstrangsynthese. Diese Stufen finden in aufeinanderfolgender Reihenfolge während reverser Transkription statt (Varmus und Swanstrom, supra). Wenn die von dem Virus getragene DNA eine Negativstrang-DNA der vollen Länge war, sollten die drei durch quantitative PCR analysierten Regionen in gleichen Mengen vervielfältigt werden. β-Globin-Sequenzen wurden von den gleichen DNA-Extrakten vervielfältigt, um die Menge an verwendeter DNA zu normalisieren, wie es in J. A. Zack et al., supra (1990); und J. A. Zack et al., supra (1992), beschrieben ist.
Virale DNA wurde unmittelbar nach der Infektion von ruhenden PBL festgestellt, und die Menge an DNA, die zu dieser Zeit beobachtet wurde, war proportional zu der Vielfachheit der Infektion (MOI) des HIV-1-IIIB-Stammes (M. Popovic, et al., Science, 224: 497 (1984)). Es wurde eine MOI von 1 und 10 verwendet, und virale DNA wurde festgestellt, vergleichbar mit HIV-1-DNA-Standards, die etwa 100 bzw. 1000 Kopien von HXB2(RIP7)-Plasmid-DNA (J. M. McCune, et al., Cell, 53: 55 (1988)) für die R-U5-, R-PB- und R-gag-Regionen entsprachen.
Diese DNA war unvollständig repliziert, die typische Form, die mit den reifen HIV-1-Partikeln einhergeht (F. Lori, et al., supra; D. Trono, supra). Diese Ergebnisse legen nahe, daß ein Teil der unvollständigen DNA, die in PBL in frühen Phasen der Infektion beobachtet wird, von der DNA, die von den infektiösen Viren getragen wird, beigesteuert wurde. Als nächstes wurde virale DNA-Synthese für 72 Stunden nach einer Infektion analysiert. HIV-1-DNA-Synthese in ruhenden PBL war signifikant langsamer und weniger effizient als in stimulierten PBL. Insbesondere wurde in ruhenden PBL die anfängliche Synthese von viraler DNA an dem Ursprung der retroviralen DNA-Replikation (unmittelbar aufstromig zu der tRNA-Primer bindenden Region, die von dem R-U5-Produkt der PCR-Reaktion repräsentiert wird) relativ früh nach einer Infektion erreicht (nach 10 Stunden), wogegen die Vervollständigung der Synthese von Negativstrang-DNA der vollen Länge signifikant verzögert war (zwischen 48 und 72 Stunden nach der Infektion, was durch das R-gag-Produkt des PCR-Tests repräsentiert wird). Im Gegensatz dazu war die Synthese von Negativstrang-DNA der vollen Länge in stimulierten PBL innerhalb von 10 Stunden nach der Infektion vollständig. Darüber hinaus nahm die DNA-Synthese in stimulierten PBL während des zeitlichen Verlaufs in viel höheren Mengen progressiv zu als in ruhenden PBL.
Zusammenfassend fanden wir heraus, daß die Gesamtmenge an viraler DNA, die in ruhenden PBL produziert wird, signifikant geringer war als diejenige, die in stimulierten PBL produziert wird. Sogar nach 72 Stunden war die Menge an viraler DNA in ruhenden PBL etwa 10-fach geringer als die Menge, die in stimulierten PBL nach 10 Stunden Wachstum produziert wurde. Nach 72 Stunden Wachstum war die Gesamtmenge an viraler DNA, die in stimulierten PBL produziert wurde, wenigstens 100-fach höher als die Menge, die in ruhenden PBL produziert wurde.
Zuvor wurden in Bezug auf die Form von HIV-1-DNA in infizierten ruhenden Lymphozyten sich widersprechende Beobachtungen berichtet. Eine unvollständige DNA in infizierten ruhenden Zellen wurde von Zack et al. (supra, 1990 und 1992) beschrieben. Andererseits zeigten Stevenson et al. (supra), daß latent vollständige DNA in ruhenden PBL vorhanden war, aber diese DNA war nicht integriert. Diese Diskrepanzen könnten durch unsere Beobachtungen, daß DNA-Synthese in ruhenden PBL in einer langsamen und ineffizienten Art und Weise abläuft, erklärt werden.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß zelluläre Enzyme, welche für dNTP-Synthese verantwortlich sind, wie Thymidin-Kinase und Desoxycytidin-Kinase, äußerst niedrige Aktivitäten in ruhenden PBL haben, welche in aktivierten PBL dramatisch zunehmen (L. Pegoraro und M. G. Bernengo, Exp. Cell Res. 68: 283 (1971)). Niedrige Niveaus der dNTP-Synthese und die hohe Umsatzrate an dNTP während der DNA-Replikation (J. Ji und C. K. Mathews, Mol. Gen. Genet., 226: 257 (1991)) würden den intrazellulären dNTP-Pool abreichern. In stationären Kinetiken, wenn die dNTP-Pools signifikant geringer wären als die Michaelis-Konstante K_m, würde das meiste des katalytischen Potentials von HIV-1-RT verlorengehen, und man würde erwarten, daß die Rate der viralen DNA-Synthese sehr empfindlich auf Veränderungen der dNTP-Konzentrationen wäre (I. H. Segel, in Biochemical Calculations (John Wiley & Sons, New York, 1975)).
Beispiel 2 erläutert die Korrelation zwischen den niedrigen Mengen an dNTP in ruhenden PBL und die niedrige Rate der viralen DNA-Synthese, die oben beschrieben wurde.
Beispiel 2
Korrelation zwischen dNTP-Pool und HIV-Replikation
PBL wurden in der Gegenwart oder Abwesenheit von Phytohämagglutinin A (PHA) mit 10 μg/ml für 48 Stunden kultiviert. Intrazelluläre dNTP wurden mit 60% Methanol extrahiert und mittels eines Enzym-Tests unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden untersucht (P. A. Sherman und A. J. Fyfe, Anal. Biochem., 180: 222 (1989)). Daten repräsentieren den Mittelwert aus drei Experimenten. K_m-Werte wurden unter Verwendung einer 600 Basen umfassenden Globin-mRNA als Vorlage bestimmt und betrugen 3,8, 4,0, 3,9 und 2,6 μM für dCTP, dTTP, dGTP bzw. dATP. Das zelluläre Volumen der PBL wurde unter Verwendung eines Coulter-Zähler-Kanalisierers gemessen, und es wurde gefunden, daß es ungefähr 0,25 μl/10⁶ Zellen für ruhende PBL bzw. 0,38 μl/10⁶ Zellen für stimulierte PBL betrug.
Wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, waren die Mengen an dNTP in ruhenden PBL signifikant geringer als in den stimulierten PBL. Die letztgenannten waren signifikant höher als der K_m von HIV-1-RT. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Infektion mit HIV-1 erhalten.
Tabelle 1 Vergleich von Desoxyribonukleosidtriphosphat-Pools (μM) in ruhenden und in mit PHA stimulierten PBL-Zellen
Wir untersuchten auch die in vitro-Aktivität von rekombinanter HIV-1-RT bei dNTP-Konzentrationen, die zu denjenigen äquivalent waren, die man in ruhenden und stimulierten PBL fand. DNA wurde unter Verwendung einer Globin-mRNA-Vorlage und eines Oligo-dT₁₆-Primers synthetisiert (ein Primerverlängerungstest). Das HIV-1-RT-Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 6 mM MgCl₂, 76 mM KCl, 0,5 mM DTT, 50 nM Globin-mRNA, die mit Oligo-dT₁₆ in einem Verhältnis von 1 : 5 initiiert wurde, und dNTP mit (a) den Konzentrationen, die zu ruhenden Zellen äquivalent waren, und (b) den Konzentrationen, die zu stimulierten Zellen äquivalent waren, wie es in Tabelle 1 beschrieben ist. Rekombinante HIV-1-RT (erhalten von American Biotechnologies) wurde mit 5 U/ml eingesetzt.
Bei den Nukleotidkonzentrationen, welche ruhende Zustände kennzeichneten, waren die Rate und die Ausbeute der Synthese von Gesamt-DNA deutlich geringer als bei denjenigen, die dem stimulierten Zustand entsprachen. Die Raten des dTMP-Einbaus durch HIV-1-RT für ruhende Zustände und stimulierte Zustände sind in Tabelle 2 angegeben. Dies könnte erklären, warum DNA-Synthese langsamer und weniger effizient in ruhenden als in stimulierten PBL war.
Tabelle 2 Raten des dTMP-Einbaus in vitro (pmol pro HIV-1-RT-Einheit) in ruhenden (–PHA) und stimulierten (+PHA) PBL
Die Wirkungsweise von HIV-1-RT und die Größe der DNA-Produkte wurden weiter unter Verwendung des oben beschriebenen Primerverlängerungstests untersucht, mit der Ausnahme, daß der Vorlagenprimer eine 600 Basen umfassende Globin-mRNA war, die mit Oligo-(dT)₁₆, welches an dem 5'-Ende mit ³²[P] markiert war, initiiert worden war. Aliquote Teile wurden nach 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten genommen. Reaktionsprodukte wurden durch (a) 15%-ige und (b) 6%-ige Polyacrylamid-Gelelektroforese getrennt.
Zwei Arten von HIV-RT-Aktivitäten waren deutlich: eine anfängliche verteilende Aktivität und eine spätere prozessive Aktivität. In der anfänglichen verteilenden Phase wurde die RT nach Einbau eines dNTP in die naszierende Kette häufig dissoziiert, was DNA-Produkte mit diskretem molekularem Gewicht lieferte. Dies war besonders deutlich bei dNTP-Konzentrationen, die für ruhende PBL charakteristisch waren. In den Gelspuren führte dies zu dem Auftreten einer Leiter von Produkten, die in der Größe von dem 16-meren Primer (zum Zeitpunkt 0) bis zu etwa einem 70-meren (nach 60 Minuten unter ruhenden Bedingungen) reichten. Nach 120 Minuten bei ruhenden PBL-Bedingungen maßen die längsten DNA-Produkte etwa 70 bis 100 nt. Nachdem etwa 70 neue Nukleoside (nt) hin zugefügt waren, nahm die Prozessivität von HIV-1-RT zu und es wurde DNA mit höherem Molekulargewicht synthetisiert. Prozessivität wurde in erster Linie bei dNTP-Konzentrationen beobachtet, die zu denjenigen in stimulierten PBL ähnlich waren. Prozessivität wurde nach 15 Minuten Inkubation unter stimulierten PBL-Bedingungen gesehen, was zu DNA-Produkten über 70 bis 100 nt führte; und sie wurde während des Experiments fortgesetzt, was nach 100 Minuten Inkubation zu Transkripten der vollen Länge führte. Im Gegensatz dazu wurde unter ruhenden PBL-Bedingungen sogar nach 120 Minuten Inkubation wenig oder keine Prozessivität gesehen. Diese Ergebnisse legen nahe, daß niedrige Konzentrationen an endogenem dNTP alleine ausreichend sind, um die in ruhenden PBL beobachtete, beeinträchtigte DNA-Verlängerung zu erklären.
Das zweiphasige Muster der HIV-1-RT-Aktivität steht in Übereinstimmung mit den Enzymkinetikstudien von anderen (H. E. Huber et al., J. Biol. Chem., 264: 4669 (1989); W. M. Kati, K. A. Johnson, L. F. Jirva, K. S. Anderson, ibid., 267: 25988 (1992)) und unterscheidet sich von der Wirkung der meisten der replikativen DNA-Polymerasen, welche prozessive Polymerasen sind, wie E. coli pol I und III, HSV-DNA-Polymerase und Säuger-DNA-Polymerase α und γ (Huber, et al., supra; Kati, et al., supra; U. Hübscher, Experientia 39: 1 (1983)).
Beispiel 3 erläutert sowohl, daß Hydroxyharnstoff dazu verwendet werden kann, die intrazelluläre dNTP-Konzentration abzureichern, und daß solche suboptimalen Konzentrationen an dNTP unvollständige HIV-1-DNA-Synthese in PBL verursachen. Die in diesen Verfahren verwendete Konzentration von 1 mM Hydroxyharnstoff ist annähernd gleich der Blutkonzentration dieses Wirkstoffs während eines klinischen Standardprotokolls im Menschen (R. C. Donehower, Seminars in Oncology 19 (Suppl. 9), 11 (1992)). Beachtenswert ist, daß Hydroxyharnstoff die enzymatische Aktivität von RT auch bei einer 200-fach höheren Konzentration (200 mM) nicht direkt hemmte.
Beispiel 3
Verwendung von Hydroxyharnstoff zum Hemmen von HIV-Replikation
HIV-1-DNA-Synthese wurde nach Infektion von mitogen (PHA) stimulierten PBL in der Gegenwart oder Abwesenheit von Hydroxyharnstoff gemessen. Nach 48 Stunden der PHA-Stimulation und 24 Stunden Vorbehandlung mit 1 mM Hydroxyharnstoff wurden die Zellen mit HIV-1 IIIB (Popovic et al., supra) in der Gegenwart von Hydroxyharnstoff infiziert. Kontrollzellen wurden in gleicher Weise behandelt, jedoch wurde die Hydroxyharnstoffbehandlung ausgelassen. Aliquote Teile von Zellen wurden 24, 48 und 72 Stunden nach der Infektion geerntet und hinsichtlich der Rate der Inhibition von dNTP-Synthese analysiert (Sherman und Fyfe, supra), gemessen als der Prozentsatz der dNTP-Mengen im Vergleich zu den Kontrollzellen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in Tabelle 3 erläutert sind, zeigen, daß dNTP-Pools in stimulierten PBL, die in der Gegenwart von 1 mM Hydroxyharnstoff inkubiert wurden, im wesentlichen abgereichert waren.
Tabelle 3 Wirkung von Hydroxyharnstoff auf dNTP-Pools in behandelten PBL im Verhältnis zu unbehandelten Kontroll-PBL (% der Menge der unbehandelten Kontrolle)
Darüber hinaus wurde HIV-1-DNA-Synthese nach Infektion von mit PHA stimulierten PBL in der Gegenwart oder Abwesenheit von Hydroxyharnstoff unter Verwendung der PCR-Analyse gemessen, wie es oben beschrieben ist. Standards, die zum Vergleich verwendet wurden, waren Reihenverdünnungen von HXB2(RIP7)-Plasmid-DNA (Anzahl der Kopien; McCune et al., supra) und β-Globin-DNA (Nanogramm).
Abreicherung von dNTP beeinflußte signifikant die HIV-1-DNA-Syntheserate und hemmte die Vervollständigung von viraler DNA-Synthese in stimulierten PBL. Darüber hinaus verzögerte dNTP-Abreicherung die Herstellung von viraler Negativstrang-DNA der vollen Länge, welche nur in begrenzten Mengen gesehen wurde (etwa 10-fach bis 100-fach weniger über einen Zeitraum von 72 Stunden), im Verhältnis zu Zellen, die nicht mit Hydroxyharnstoff behandelt worden waren. Das Inhibitionsmuster war ziemlich ähnlich zu demjenigen, das in ruhenden PBL beobachtet wurde. Nach 72 Stunden war die Zellüberlebensfähigkeit zwischen mit Hydroxyharnstoff behandelten und unbehandelten Zellen vergleichbar.
Weil die meisten zirkulierenden Lymphozyten in vivo ruhend sind, wurde die Relevanz der Population ruhender infizierter PBL, die als ein Reservoir für induzierbaren HIV-1 dienen, erkannt (Zack, et al., supra, 1990 und 1992; Stevenson, et al., supra; Bukrinsky, et al., supra). Der latente Pool von viraler DNA in diesen Zellen spielt klar eine Rolle in der viralen Freisetzung nach mitogener Stimulation (id.). Unsere Ergebnisse legen einen Mechanismus von ineffizienter reverser Transkription und anschließender Bildung von latenter HIV-1-DNA in ruhenden PBL nahe. Obwohl auch andere Mechanismen die HIV-1-Replikation in ruhenden PBL blockieren könnten, sind natürlich vorkommende niedrige Mengen an dNTP ausreichend, um reverse Transkription zu hemmen.
Beispiel 4 erläutert, daß die Behandlung von Zielzellen mit Hydroxyharnstoff alleine oder in Kombination mit dem Nukleosidphosphatanalogen ddl virale Expression von HIV-1 hemmt. Insbesondere wurde virale Expression von RT in mit HIV-1 infizierten, PHA-stimulierten PBL durch Behandlung vor der Infektion mit 1 mM Hydroxyharnstoff signifikant reduziert.
Beispiel 4
Verwendung von Hydroxyharnstoff und/oder ddl zum Hemmen von HIV-Expression
PBL wurden mit PHA für 48 Stunden stimuliert und mit 1 mM Hydroxyharnstoff für 24 Stunden vor der Infektion mit HIV-1 IIIB (Popovic et al., supra) in der Gegenwart des Wirkstoffs behandelt. Kontrollzellen wurden auf ähnliche Art und Weise behandelt mit der Ausnahme, daß die Hydroxyharnstoffbehandlung ausgelassen wurde. Aliquote Teile des Zellüberstandes wurden zwei, fünf und neun Tage nach der Infektion geerntet und hinsichtlich RT-Aktivität untersucht. Die RT-Aktivität wurde wie in Beispiel 2 aufgezeichnet. Die Ergebnisse dieses Verfahrens sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4 Hemmung der HIV-1-RT-Expression in mit 1 mM Hydroxyharnstoff (HU) behandelten infizierten PBL
Wenn PBL-Zellen mit einer Kombination von Hydroxyharnstoff und ddl behandelt wurden, nahm die in Zellüberständen festgestellte Expression von HIV-Protein p24 signifikant ab (Tabelle 5).
Tabelle 5 Virale Expression von p24-Protein nach HIV-1-Infektion von PHA-stimulierten PBL in der Gegenwart von μM Hydroxyharnstoff (HU) und/oder ddl (ddl)
Darüber hinaus hemmten Hydroxyharnstoff und ddl synergistisch die Expression von HIV-1 p24. Das heißt, p24-Expression nahm stärker ab, wenn Zellen mit beiden Wirkstoffen behandelt wurden als mit einem oder dem anderen Wirkstoff alleine. Zum Beispiel zeigt Tabelle 5, daß eine Behandlung von Zellen mit 5 μM ddl 125 ng p24 pro ml Zellüberstand nach 12 Tagen Infektion lieferte, wogegen eine Behandlung mit 50 μM Hydroxyharnstoff 148 ng/ml nach 12 Tagen Infektion lieferte. Wenn Zellen jedoch sowohl mit 5 μM ddl als auch 50 μM Hydroxyharnstoff behandelt wurden, wurden 24 ng/ml p24 am Tag 12 nach der Infektion festgestellt. Aufgrund dieses synergistischen Effekts konnten niedrigere Konzentrationen an Hydroxyharnstoff und ddl in Kombination wirkungsvoll p24-Expression ausschalten im Vergleich zu einer Behandlung mit nur Hydroxyharnstoff oder ddl in den gleichen Konzentrationen.
Während das Verfahren in Beispiel 4 die Vorbehandlung von Zielzellen mit Hydroxyharnstoff und/oder ddl vor der Infektion umfaßte, untersuchten wir auch den Effekt einer Wirkstoffbehandlung in Zellen, die bereits mit dem HIV-1 IIIB-Virus infiziert waren. Bei dem letztgenannten Verfahren maßen wir p24-Produktion während des Verlaufs einer in vitro-Infektion, um die Inhibition von HIV-1-Replikation in aktivierten PBL zu untersuchen.
Beispiel 5 erläutert, wie Hydroxyharnstoff entweder alleine oder in Kombination mit ddl die Produktion von p24 in mit HIV-1 IIIB infizierten Zellen beeinflußt.
Beispiel 5
Wirkung von Hydroxyharnstoff auf p24-Produktion
PBL von gesunden Spendern wurden für 2 Stunden bei 37°C mit HIV-1[HTLV-IIIB] (m. o. i. = 1) nach 2 Tagen Stimulation mit PHA und Interleukin-2 (IL-2) infiziert. Nach Auswaschen des restli chen Virus wurden die Zellen mit Hydroxyharnstoff und/oder ddl in den angegebenen Konzentrationen behandelt (als Kontrolle wurde Überstand ohne Wirkstoff verwendet). Alle 3–4 Tage wurde Überstand für eine p24-Analyse abgenommen, Zellen wurden gezählt und frischer Überstand und Wirkstoffe wurden hinzugefügt. Die Proben wurden hinsichtlich (a) p24-Produktion in dem Überstand, (b) Anzahl überlebensfähiger Zellen und (c) Verhältnissen zwischen den in (a) und (b) ausgedrückten Werten analysiert. Die Ergebnisse dieses Verfahrens sind in den 1a–1c dargestellt.
Wie es in 1a gezeigt ist, wurde, wenn er alleine in niedrigen Konzentrationen oder in Kombination mit ddl verwendet wurde, die HIV-1-Replikation in einer dosisabhängigen Art und Weise gehemmt. Bemerkenswerterweise blockierte die Kombination von Hydroxyharnstoff und ddl die HIV-1-Replikation vollständig (> 99,9%), was den starken synergistischen Effekt dieser Wirkstoffkombination erläutert. Zelltoxizitätsanalyse spiegelte die bekannten Eigenschaften der zwei Wirkstoffe wider. Von Hydroxyharnstoff ist bekannt, daß er in erster Linie als ein zytostatisches Arzneimittel wirkt. Jedoch führt ein andauerndes Aussetzen an den Wirkstoff schließlich zu gewissen zytotoxischen Wirkungen (Yarbro, J. W., Semin. Oncol. 19: 1 (1992)). Dies wurde auch in unseren Experimenten bei Konzentrationen von 0,1 mM Hydroxyharnstoff beobachtet (1b). Jedoch verschwanden sowohl zytostatische als auch zytotoxische Wirkungen nahezu, wenn die Wirkstoffkonzentration herabgesetzt wurde (1b). Es ist bekannt, daß die Zytotoxizität von ddl bei den in unseren Experimenten verwendeten Dosen, welche den Plasmakonzentrationen entsprechen, die man in hinsichtlich AIDS behandelten Patienten beobachtet, niedrig ist (Faulds, D. und Brogden, R. N. Drugs 44: 94 (1992)). Die Kombination der zwei Wirkstoffe veränderte die Zytotoxizität im Vergleich zur Verwendung von Hydroxyharnstoff alleine nicht signifikant. Dies stellt einen weiteren Vorteil der Hydroxyharnstoff/ddl-Kombination dar, da die antiviralen Wirkungen ohne eine signifikante Zunahme der Zytotoxizität synergistisch erhöht wurden.
Um zu verstehen, ob die bei verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen oder während des Verlaufs einer Infektion beobachtete unterschiedliche Anzahl überlebensfähiger Zellen unsere Daten beeinflußt haben könnten (weniger lebende Zellen führen zu geringerer Virusproduktion), normierten wir die p24-Expression auf die Anzahl überlebensfähiger Zellen (1c). Unsere Ergebnisse zeigten, daß die antivirale Wirkung von Hydroxyharnstoff bei niedrigen Konzentrationen nicht durch Zytotoxizität vermittelt wird.
Wir untersuchten auch die hemmenden Wirkungen von Hydroxyharnstoff entweder alleine oder in Kombination mit AZT auf HIV-1-Infektion von primären menschlichen Makrophagen. Obwohl wir eine größere Variabilität zwischen verschiedenen Experimenten, bei denen Makrophagen verwendet wurden, im Vergleich zu unseren Ergebnissen mit primären PBL fanden (man beachte, daß in jedem Experiment der gleiche Spender als eine Quelle sowohl für PBL als auch Makrophagen verwendet wurde), war die dosisabhängige Inhibition von HIV-1-Produktion durch Hydroxyharnstoff trotzdem durchweg stärker als mit primären PBL.
Beispiel 6 erläutert die Wirksamkeit von Hydroxyharnstoff als ein Inhibitor von HIV-Infektion in Makrophagen. Darüber hinaus erläutert dieses Beispiel den starken synergistischen Effekt von Hydroxyharnstoff und AZT als Inhibitoren von HIV-Infektion von Makrophagen.
Beispiel 6
Zeitlicher Verlauf der HIV-1-Inhibition durch Hydroxyharnstoff und/oder AZT in Makrophagen
Makrophagen wurden durch Zelladhäsion nach Reinigung von PBL von gesunden Spendern erhalten. Nach 14 Tagen der Behandlung mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor wurden die Zellen über Nacht mit dem HIV-1-Stamm Ba-L (Gartner et al., Science 233: 215 (1986)) infiziert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und mit Hydroxyharnstoff und/oder mit AZT in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Überstände wurden alle 4–5 Tage für eine p24-Analyse abgenommen, und frischer Überstand und Wirkstoffe wurden hinzugefügt. Wir stellten fest, daß in diesem Experiment keine zytotoxischen Wirkungen beobachtet wurden (siehe auch Tabelle 6). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 2 wiedergegeben.
Unsere Ergebnisse zeigen, daß Konzentrationen von Hydroxyharnstoff von nur 0,05 mM HIV-1-Replikation blockierten (> 99,9%). Die Verwendung von niedrigeren Dosen von Hydroxyharnstoff und AZT in Konzentrationen, bei denen jeder der zwei Wirkstoffe nur teilweise wirksam war, führte zu vollständiger Hemmung (> 99,9%). Die synergistischen Effekte von Hydroxyharnstoff und AZT, welche in Makrophagen beobachtet wurden, waren daher übereinstimmend mit den Ergebnissen, die unter Verwendung primärer PBL, die mit Hydroxyharnstoff und ddl behandelt wurden, erhalten wurden.
Unsere Demonstration, daß Hydroxyharnstoff zwei verschiedene HIV-1-Stämme in primären menschlichen Zellen hemmte, legte nahe, daß dieser Wirkstoff entweder alleine oder in Kombination auch in vivo wirksam sein könnte. Um diese Möglichkeit weiter zu testen, bestätigten wir die vorausgegangenen Beobachtungen, indem ein weiteres in vitro-System für den Wirkstofftest verwendet wurde. Dieses in vitro-System verwendete primäre Zellen, die aus mit HIV-1 infizierten Individuen isoliert waren. Wir nehmen an, daß dieses Modell der HIV-1-Hemmung unter in vivo-Bedingungen sehr nahe kommt, da es die Verwendung von primären Zellen und Virusisolaten beim Einsetzen einer Infektion, die in vivo etabliert wurde, kombiniert.
Beispiel 7 erläutert, daß Hydroxyharnstoff entweder alleine oder in Kombination mit Nukleosidanalogen HIV-1-Replikation in Zellen, die direkt von einem mit HIV-1 infizierten Patienten isoliert wurden, hemmt.
Beispiel 7
Hemmung von HIV-1 in aktivierten PBL von einem mit HIV-1 infizierten Patienten
PBL wurden isoliert und für 2 Tage mit PHA und IL-2 stimuliert. Anschließend wurden Hydroxyharnstoff und ddl in den spezifizierten Konzentrationen hinzugefügt. Das Ausmaß der HIV-1-Infektion wurde analysiert, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. Die Proben wurden hinsichtlich (a) p24-Produktion in dem Überstand und (b) der Zahl überlebensfähiger Zellen getestet.
Erneut hemmte Hydroxyharnstoff die HIV-1-Replikation in einer dosisabhängigen Art und Weise und zeigte in Kombination mit ddl starke synergistische Effekte (3a). Jedoch waren in einigen Fällen sowohl die pharmakologischen als auch die zytotoxischen Effekte von Hydroxyharnstoff deutlicher ausgeprägt (3a, 3b) und es wurden niedrigere Dosen von Hydroxyharnstoff im Vergleich zu den Experimenten an PBL, die von gesunden Spendern erhalten wurden und in 1 dargestellt sind, verwendet, insbesondere mit Zellen von mit HIV-1 infizierten Patienten in den fortgeschittenen Stadien von AIDS. Es ist auch anzumerken, daß die niedrigsten Mengen sowohl von Hydroxyharnstoff als auch ddl in einigen Fällen (wie sie in 3 erläutert sind) HIV-1-Replikation stimulierten, aber nur, wenn sie einzeln verwendet wurden.
Dieses Phänomen war nicht auf die Verwendung von Zellen von infizierten Patienten beschränkt, daß es auch gelegentlich beobachtet wurde, wenn Zellen von einem gesunden Spender verwendet wurden. Unabhängig von der viralen oder zellulären Quelle wurden jedoch keine stimulierenden Effekte beobachtet, wenn Hydroxyharnstoff und eines der Nukleosidanalogen in Kombination verwendet wurden (nicht gezeigt).
Beispiel 8 erläutert die Wirkung hoher Dosen von Hydroxyharnstoff auf HIV-1-Infektion von aktivierten PBL und Makrophagen, die von gesunden Spendern isoliert wurden.
Beispiel 8
Die Wirkung hoher Konzentrationen von Hydroxyharnstoff auf HIV-1-Infektion
Es wurden Experimente durchgeführt, wie es in den 1 (für PBL) und 2 (Makrophagen) beschrieben ist, mit 1 mM Hydroxyharnstoff. Die prozentuale HIV-1-Hemmung wurde auf der Grundlage der p24-Produktion im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle berechnet. Die Wirkstoffbehandlung von Makrophagen wurde nach 14 Tagen unterbrochen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6
Ununterbrochene Behandlung mit 1 mM Hydroxyharnstoff blockierte vollständig die HIV-1-Replikation sowohl in aktivierten PBL als auch in Makrophagen. In aktivierten PBL wurden jedoch toxische Effekte bei diesen Konzentrationen früh beobachtet im Gegensatz zum Fehlen signifikanter Toxizität in Makrophagen. Darüber hinaus wurde in einigen Experimenten das Fehlen von HIV-1- Replikation in infizierten Makrophagen sogar mehrere Wochen nach der Unterbrechung der Wirkstoffbehandlung dokumentiert.
Unser Ergebnis, daß Hydroxyharnstoff alleine oder in Kombination mit Nukleosidanalogen wirkungsvoll HIV-1-Replikation in primären menschlichen Zellen in vitro hemmte, legt nahe, daß dieser Wirkstoff auch in einer Therapie am Menschen nützlich sein wird.
Beispiel 9 beschreibt die Verwendung von Hydroxyharnstoff in einem Protokoll, das für die Kontrolle von HIV-1-Replikation in vivo ausgelegt ist, wobei das behandelte Individuum profitiert.
Beispiel 9
Verabreichung von Hydroxyharnstoff an mit HIV infizierte Menschen
Ein oder mehrere bezüglich HIV-1 seropositive Freiwillige werden zuerst identifiziert. Blutproben, die von den Freiwilligen genommen wurden, werden unter Verwendung eines geeigneten Quantifizierungsmittels hinsichtlich CD4⁺-T-Zellen getestet. Das Quantifizierungsmittel umfaßt das Durchflußzytometer, ist darauf aber nicht beschränkt. Über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten wird beobachtet, daß die Anzahl an CD4⁺-T-Zellen stetig abnimmt als ein Indikator für den Krankheitsfortschritt.
Die mit HIV-1 infizierten Freiwilligen werden dann auf einen Wirkstoff-Therapieplan gesetzt, der Hydroxyharnstoff entweder alleine oder in Kombination mit Nukleosidanalogen umfaßt. Die Nukleosidanalogen können irgendeines von ddl, ddC oder AZT oder Kombinationen davon sein. Hydroxyharnstoff wird mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel kombiniert und in Dosierungen von 20–40 mg pro kg pro Tag verabreicht. Die Wirkstoffdosierung wird so eingestellt, daß sie zu einer stabilen Hydroxyharnstoffkonzentration im Blut von etwa 1 mM führt. Diese Konzentration wird gewählt, weil sie etwa der Blutkonzentration von Hydroxyharnstoff bei klinischen Standardprotokollen im Menschen entspricht. Wenn Hydroxyharnstoff in Verbindung mit einem Nukleosidanalogen verwendet wird, wird die Dosierung des Analogen nach einer Übereinkunft auf dem medizinischen und pharmazeutischen Gebiet bestimmt.
Nach einem Monat der Wirkstoffbehandlung werden erneut Blutproben abgenommen und hinsichtlich CD4⁺-T-Zellen getestet. Die T-Zellpopulation hat sich als ein Anzeichen der therapeutischen Wirksamkeit der antiviralen Aktivität von Hydroxyharnstoff stabilisiert oder erhöht. Die deutlichsten Verbesserungen werden in Freiwilligen beobachtet, welche die Kombination von Hydroxyharnstoff zusammen mit einem Nukleosidanalogen erhielten.
Die vorangegangenen Beispiele haben Ergebnisse wiedergegeben, die unter Verwendung von Kombinationen von Hydroxyharnstoff und bestimmten kettenterminierenden Nukleosidanalogen zur Hemmung der von reverser Transkriptase abhängigen viralen Replikation erhalten wurden. Wir erwarten auch, daß die kettenterminierende Wirksamkeit von anderen Didesoxynukleosidphosphatanalogen und Derivaten davon durch Kombinationswirkstofftherapie unter Einbeziehung von Hydroxyharnstoff verstärkt wird. Daher wird erwartet, daß fluorierte Derivate von Purindidesoxynukleosiden, wie solchen, die von Marquez et al. in J. Med. Chem. 33: 978–985 (1990) beschrieben werden, besonders starke antivirale Aktivitäten aufweisen, wenn sie in Kombination mit Hydroxyharnstoff verabreicht werden. Von solchen fluorierten Derivaten wird erwartet, daß sie vorteilhafterweise als orale Medikationen aufgrund ihrer chemischen Stabilität unter sauren Bedingungen einsetzbar sind.
Beispiel 9 beschreibt ein Experiment, das dazu verwendet werden kann, die antiviralen Wirkungen von Hydroxyharnstoff und verschiedenen fluorierten Derivaten von kettenterminierenden Nukleosidanalogen in vitro zu testen.
Beispiel 9
Verwendung von Hydroxyharnstoff und fluorierten Derivaten von kettenterminierenden Nukleosidanalogen zur Hemmung von HIV-Expression
PBL, die von gesunden Spendern isoliert wurden, werden mit PHA und IL-2 für 48 Stunden unter Anwendung von Standardprotokollen stimuliert. Gleichzeitig werden die Zellen mit Hydroxyharnstoff alleine oder in Kombination mit entweder ddl oder fluorierten Derivaten von kettenterminierenden Nukleosiden vorbehandelt. Die Verwendung von ddl in diesem Verfahren dient als eine Positivkontrolle für die durch Hydroxyharnstoff verstärkte Inhibition der p24-Produktion. Am Ende des Zeitraums von 48 Stunden werden Proben der behandelten Zellen mit HIV-1 IIIB (Popovic et al., supra) infiziert. Aliquote Teile der Zellüberstände werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion abgenommen und hinsichtlich des Vorhandenseins von p24-Antigen als ein Indikator für HIV-1-Infektion analysiert. Beispielergebnisse, die bei diesem Verfahren erwartet werden, sind in Tabelle 7 qualitativ wiedergegeben.
Tabelle 7 Virale Expression von p24-Protein nach HIV-1-Infektion von mit PHA stimulierten PBL in der Gegenwart von μM Hydroxyharnstoff (HU) und/oder Nukleosidanalogen
Ergebnisse, wie solche, die in Tabelle 7 wiedergegeben sind, bestätigen, daß die antiviralen Aktivitäten von fluorierten kettenterminierenden Nukleosidanalogen verstärkt werden, wenn sie in Kombination mit Hydroxyharnstoff verwendet werden.
Wir haben gezeigt, daß Hydroxyharnstoff ein wirksamer HIV-1-Inhibitor ist. Signifikanterweise wurden diese antiviralen Eigenschaften nicht alleine durch die zytostatischen oder zytotoxischen Effekte des Wirkstoffs in nicht-stimulierten PBL und Makrophagen vermittelt. Wir nehmen an, daß dies so war, weil diese Zellen entweder ruhend (PBL) oder abschließend differenziert (Makrophagen) waren und daher keine hohen Niveaus der dNTP-Synthese benötigten. Auch nach PBL-Aktivierung, wenn dNTP-Synthese für den Zellzyklus erforderlich war, konnten die antiviralen und zytotoxischen Effekte bei niedrigen Wirkstoffkonzentrationen unterschieden werden. Die selektive Anti-HIV-1-Aktivität von Hydroxyharnstoff in aktivierten PBL kann zum Teil durch die verteilenden Eigenschaften von HIV-1-RT erklärt werden. Verglichen mit zellulären Polymerasen kann die verteilende Eigenschaft von RT sie empfindlicher für niedrige intrazelluläre Konzentrationen an dNTP machen. In aktivierten PBL steuerten die zytostatischen Eigenschaften von Hydroxyharnstoff wahrscheinlich zu dessen antiviraler Aktivität bei, da virale Replikation in Lymphozyten Zellteilung erfordert.
Durch Herabsetzung der intrazellulären Konzentration von dNTP bei gleichzeitiger Erhöhung der Aufnahme und des Metabolismus von Nukleosidanalogen, wie ddl oder AZT, erniedrigte Hydroxyharnstoff das Verhältnis zwischen intrazellulären dNTP und Nukleosidanalogen, wodurch ihre antiviralen Wirkungen verstärkt wurden.
Kombinationen von Hydroxyharnstoff und entweder ddl oder AZT erwiesen sich als äußerst wirkungsvolle antivirale Behandlungen. Insbesondere setzte diese Kombination die Wirkstoffkonzentrationen herab, die notwendig waren, um > 99,9% Hemmung der HIV-1-Replikation zu erreichen, und lieferte klare synergistische Effekte gegenüber der Verwendung der einzelnen Wirkstoffe, ohne deren Zytotoxizitäten zu erhöhen. Das Phänomen der viralen Stimulation, das manchmal beobachtet wird, wenn niedrige Dosierungen von Wirkstoffen einzeln verwendet werden, wurde ebenfalls ausgeschaltet. Die kombinierte Verwendung dieser Wirkstoffe kann daher für asymptomatische, seropositive Individuen vorteilhaft und sicher sein.
Die Verwendung von Hydroxyharnstoff bei der Behandlung von AIDS bietet mehrere Vorteile. Nach mehr als 30 Jahren der Anwendung am Menschen sind die Eigenschaften dieses Wirkstoffs gut ermittelt. Infolge seiner extremen Diffundierbarkeit kann dieser Wirkstoff in alle Gewebe eindringen, einschließlich Zellen des zentralen Nervensystems, mit einer V_max, die unbegrenzt zu sein scheint (Morgan, J. S., Creasey, D. C. und Wright, J. A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 134: 1254 (1986)). In Anbetracht der Tatsache, daß Hydroxyharnstoff beim Hemmen der HIV-1-Replikation in Makrophagen hochgradig wirksam ist, erwarten wir, daß dieser Wirkstoff gegen die neurologischen Manifestierungen von AIDS, von denen man annimmt, daß sie von den Wirkungen von viraler Replikation in Makrophagen herrühren, wirksam ist (Koenig, S., et al., Science 233: 1089 (1986)). Die Aktivität von Hydroxyharnstoff hängt nicht von dem Metabolismus des Wirkstoffs in Zellen ab. Somit wird erwartet, daß Hydroxyharnstoff im Gegensatz zu Nukleosidanalogen in allen Zellen, unabhängig von ihrem Aktivierungszustand, wirksam ist. Hydroxyharnstoff wird als ein schwach toxischer Wirkstoff klassifiziert und verursacht keine Immundepression. Myelotoxizität ist die dosislimitierende Toxizität des Hydroxyharnstoffs. Jedoch kann diese Toxizität einfach aufgezeichnet werden, und sie ist konstant und schnell reversibel nach einem Herabsetzen der Dosis oder einer Unterbrechung der Behandlung (Donehower, R. C., Semin. Oncol., 19: 11 (1992)). Durch Aufzeichnen einfacher Parameter, wie der Zahl peripherer Zellen, kann Hydroxyharnstoff über Jahre und manchmal Jahrzehnte verabreicht werden. Darüber hinaus ist die Knochenmarkstoxizität nur schwerwiegend, wenn Hydroxyharnstoff in sehr hohen Dosen, wie solchen, die in der Leukämiebehandlung eingesetzt werden, verwendet wird (etwa 0,5–2,5 mM) (Belt, R. J. et al., Cancer 46: 455 (1980)). In den meisten unserer Experimente waren die Hydroxyharnstoffkonzentrationen 2–3 Logarithmen niedriger, und dann waren diese Mengen noch ausreichend für eine vollständig gehemmte HIV-1-Replikation. Hydroxyharnstoff kann oral verabreicht werden und ist viel preiswerter als andere Wirkstoffe, die derzeit für eine AIDS-Therapie verwendet werden. Hydroxyharnstoff hemmt HIV-1 nicht direkt, sondern über die Hemmung des zellulären Enzyms Ribonukleotid-Reduktase. Zelluläre Enzyme mutieren nicht unter physiologischen Bedingungen, und man könnte erwarten, daß HIV-1-Resistenz gegen Hydroxyharnstoff erheblich weniger wahrscheinlich auftritt als mit herkömmlichen Wirkstoffen. Dies könnte das Auftreten von HIV-1-Escape-Mutanten umgehen. Bis jetzt hat keiner der Anti-HIV-1-Wirkstoffe, die getestet wurden, die Entwicklung von Escape-Mutanten verhindert. Dieses Versagen stellt eine Hauptenttäuschung im Kampf gegen AIDS dar. Darüber hinaus sollte das Auftreten von Escape-Mutanten, die während einer Behandlung von AIDS-Opfern mit Nukleosidanalogen auftreten, ebenfalls reduziert werden, wenn diese Wirkstoffe in Kombination mit Hydroxyharnstoff verwendet werden. Da der synergistische Effekt der Kombination eines Nukleosidanalogen und Hydroxyharnstoff die Virusreplikation hemmt, welches ein erforderlicher Schritt in dem Prozeß der Virusmutation, die zu der Entwicklung von Escape-Mutanten führt, sein kann.
Nach unserer Ansicht können zwei Hauptstrategien, welche Hydroxyharnstoff verwenden, als AIDS-Therapien verfolgt werden. Die erste ist die Verwendung niedriger Dosierungen von Hydroxyharnstoff. Wirkstoffkombinationen werden in diesem Fall aufgrund der oben erläuterten Gründe empfohlen, und Versuche könnten asymptomatische, seropositive Individuen einbeziehen. Die zweite Strategie würde hohe Mengen an Hydroxyharnstoff in Anweisungen, die ähnlich zu den bei Leukämie verwendeten sind, verwenden. Diese Strategie wäre gegen HIV-1 stärker und würde auch die replizierenden PBL, welche Virus produzieren, töten. Man könnte jedoch auch eine Kombination aus beiden Strategien durch Abwechseln von hohen Dosierungen von Hydroxyharnstoff zum Zwecke der Spülung, gefolgt von niedrigeren Aufrechterhaltungsdosierungen entwerten.

Claims

Verwendung einer synergistischen Kombination aus einem Inhibitor von Ribonukleotid-Reduktase und einem antiviralen Nukleosidphosphatanalogen, welches ein anderes ist als ein Thymidin- oder Cytidinanaloges, bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Replikation eines von reverser Transkriptase abhängigen Virus.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Retrovirus ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Virus das humane Immunschwächevirus (HIV) ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Inhibitor von Ribonukleotid-Reduktase Hydroxyharnstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das antivirale Nukleosidphosphatanaloge ein Mittel ist, das dazu dient, die Replikation des Virus zu hemmen, indem die DNA-Kettenverlängerung beendet wird.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Mittel, das zur Hemmung der Replikation des Virus durch Beendigung der DNA-Kettenverlängerung dient, die Replikation durch Beendigung von viraler DNA-Synthese vor der Reife unter Herstellung unvollständiger viraler DNA hemmt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Mittel ein Didesoxynukleosid ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Didesoxynukleosid ddl ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Didesoxynukleosid ein 2'-Fluoropurindidesoxynukleosid ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das 2'-Fluoropurindidesoxynukleosid eine der folgenden Verbindungen ist: 2'-F-dd-ara-A, 2'-F-dd-ara-I oder 2'-F-dd-ara-G.