DE60009098T2

DE60009098T2 - Methode für die selektive protektion der proliferation der normalen zellen und der selektiven beseitigung der tumorzellen, die eine inaktivierte p53 pathway haben

Info

Publication number: DE60009098T2
Application number: DE60009098T
Authority: DE
Inventors: Franco Tato'; Antonio Zanetti; Milena Grossi
Original assignee: Universita degli Studi di Roma La Sapienza
Current assignee: Universita degli Studi di Roma La Sapienza
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2020-09-22
Also published as: WO2001021765A2; WO2001021765A3; DE60009098D1; CA2385424A1; AU7555000A; IT1306187B1; EP1214397A2; ITRM990580A0; EP1214397B1; ES2218224T3; ITRM990580A1; ATE262033T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel, die es ermöglichen, normale Zellen zu schützen, während Tumorzellen vernichtet werden, insbesondere diejenigen mit einer geringen Proliferationsgeschwindigkeit in einer Umgebung, in der sowohl Tumor- wie auch normale Zellen vorhanden sind und proliferieren.
Hintergrund der Erfindung
Der Hauptzweck einer jeden Krebsbehandlung ist die vollständige und zur gleichen Zeit selektive Vernichtung von Tumorzellen aus Patientengeweben.
Die Vollständigkeit der Tumorzellenvernichtung ist tatsächlich wesentlich zur Verhinderung wiederkehrender Formen, die Selektivität wiederum, um den Patienten vor Nebenwirkungen zu schützen.
Beide Merkmale sind daher wesentlich für eine erfolgreiche Krebsbehandlung, sogar, wenn das vollständige Erreichen beider zur gleichen Zeit im Hinblick auf die gegensätzlichen technischen Wirkungen extrem schwierig ist, die jedem dieser zugrunde liegen ("das Abtöten von Zellen" vs. "das Retten von Zellen").
In den in vitro-Systemanwendungen, die damit verbunden sind (d. h., die auf die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen oder neuen therapeutischen Verbindungen gerichtet sind) könnte statt dessen sogar eine teilweise selektive und/oder eine teilweise vollständige Vernichtung der Tumorzellen auch vorteilhaft sein, wenn diese steuerbar ist, da die Steuerbarkeit eine bessere Zuverlässigkeit der Daten sicherstellt.
In derzeitigen therapeutischen Ansätzen wird die vollständige Vernichtung der Tumorzellen in vivo durch die wiederholte Verabreichung chemotherapeutischer Mittel zusätzlich zu anderen operativen Eingriffen wie Radiotherapie und Chirurgie versucht.
Als solches haben chemotherapeutische Mittel im Allgemeinen die Fähigkeit, wirksam proliferierende Zellen in einer bevorzugten Weise zu töten; ein therapeutischer Ansatz, der solche Mittel einsetzt, ermöglicht eine selektive Vernichtung von Tumorzellen in Bezug auf normale Zellen, die sich gewöhnlich in einer nicht-proliferativen Phase befinden.
Es gibt jedoch einige normale Zellen, die physiologisch proliferieren und damit in Bezug auf die Wirkung des chemotherapeutischen Mittels zu Tumorzellen vollständig äquivalent sind.
Solch eine "Aspezifität", die die Wirkung eines chemotherapeutischen Mittels auf proliferierende Zellen kennzeichnet, resultiert klinisch in einer deutlichen und allgemeinen Toxizität in proliferierenden Geweben wie Knochenmark, der gastrointestinalen Schleimhaut und Haut.
Daher ist die Unterbrechung der Behandlung oft die einzige klinische Lösung für Nebenwirkungen, die aus einer solchen erhöhten Toxizität abgeleitet werden und entsprechend ist es unabhängig des bemerkenswerten therapeutischen Potentials der chemotherapeutischen Medikamente schwer, eine vollständige Vernichtung der Tumorzellen in den meisten Patienten zu erreichen.
Dies ist in der Tat zum Beispiel die Standardvorgehensweise im Falle einer Toxizität gegenüber gastrointestinaler Schleimhaut, wohingegen im Falle einer Toxizität gegenüber den hematopoetischen Vorstufen auch andere Ansätze praktiziert werden, von denen sich jedoch gezeigt hat, dass sie in einem Wesentlichen Prozentanteil der Fälle nicht entscheidend sind. (1)
Jedoch können im Hinblick auf ihre höchst wirkungsvolle vernichtende Aktivität die meisten chemotherapeutischen Verbindungen sogar bei Vorhandensein von Nebenwirkungen zur Behandlung von Formen mit hohem Proliferationspotential wirksam verwendet werden, sogar, wenn mit schweren Nachteilen in Bezug auf das Leiden des Patienten zu rechnen ist.
Keine Anwendung ist stattdessen bei Formen mit geringem proliferativen Potential wie Pankreaskrebs und einigen Lymphomen praktizierbar. Gekennzeichnet durch eine Proliferationsgeschwindigkeit, die nahezu identisch mit der von replizierenden normalen Geweben ist, würden derartige Tumorformen tatsächlich Behandlungszeiten und chemotherapeutische Dosierungen benötigen, die aspezifisch auch die Gesamtheit der proliferierenden normalen Zellen töten würden.
Daher gibt es einen dringenden Bedarf für alternative therapeutische Ansätze, die in der Lage sind, proliferierende normale Zellen vor der toxischen Wirkung der chemotherapeutischen Medikamente zu schützen.
Obwohl auf dem Gebiet einige alternative Ansätze in dieser Hinsicht entwickelt wurden, wurde ein wirksamer Schutz der normalen Zellen, der mit einer vollständigen und selektiven Zerstörung der Tumorzellen einhergeht, bis jetzt nicht erhalten.
Die hauptsächliche Schwierigkeit im Erzielen eines solchen Ergebnisses liegt in den zu ähnlichen Eigenschaften, die proliferierende normale und Tumorzellen teilen, so dass in Bezug auf die Wirkung des chemotherapeutischen Medikaments diese nahezu nicht unterscheidbar sind.
Dementsprechend ist es eine der möglichen Ansätze zur Lösung des Problems von Chemotherapie-assoziierten Nebenwirkungen, Medikamente zu definieren und aufzufinden, die helfen können, proliferierende normale Zellen vor den nachteiligen Wirkungen bereits bekannter chemotherapeutischer Medikamente zu schützen.
Einige Ansätze wurden daher in vitro untersucht, um Verbindungen aufzufinden, die in der Lage sind, einen Zustand zu etablieren, bei dem in Bezug auf eine chemotherapeutische Intervention normale Zellen eine deutlich verringerte oder eine nicht vorhandene Empfindlichkeit aufzeigen, wohingegen die Empfindlichkeit der Tumorzellen unverändert bleibt (dies wird hierin auch als "differenzierender Status" bezeichnet). Jedoch wurden bis jetzt keine signifikanten Daten in einer anwendbaren und therapeutischen Perspektive erhalten.
Dementsprechend gibt es weiterhin die Notwendigkeit für experimentelle Ansätze und Zellmodelle, die geeignet sind, eine neue Strategie zu definieren, die geeignet ist, die Möglichkeit der Definition von Bedingungen und Mechanismen zu ermöglichen, die in der Lage sind, proliferierende normale Zellen vor den toxischen Wirkungen chemotherapeutischer Mittel zu schützen.
Tatsächlich wäre das beste System für diesen Zweck offensichtlich dasjenige, das durch proliferierende normale menschliche Zellen aufgebaut ist, die in vivo chemotherapeutisch assoziierten Nebenwirkungen ausgesetzt sind, d. h. proliferierende Stammzellen von sich physiologisch selbst erneuernden Geweben. Jedoch verändern derartige Zellen ihren proliferativen Zustand, wenn sie in vitro transferiert werden und sind daher nicht geeignet, Daten zu ergeben, die relevant für in vivo-Situationen sind.
In der Abwesenheit einer solchen Art eines Zellsystems, das mindestens teilweise eine in vivo-Situation reproduziert, würden keinerlei Experimente von Bedeutung sein, die auf die Auswahl von Verbindungen und Ansätzen in einer anwendbaren Perspektive gerichtet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Schützen von proliferierenden normalen Zellen in einer in vitro- oder ex vivo-Kultur, die besagte proliferierende normale Zellen umfasst, sowie Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg, vor der eradikativen Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung (hierin auch als Klasse B-Verbindung oder Medikament bezeichnet) mit der Fähigkeit

– eine cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben und
– das Überleben und proliferative Potential von Interphasenzellen nicht zu beeinträchtigen, umfassend eine kombinierte Behandlung einschließlich der Verabreichung einer schützenden Verbindung zu besagter Kultur (hierin auch als Klasse A-Verbindung oder Medikament bezeichnet) mit der Fähigkeit
– die Zellteilung (Cytodierese) von normalen Zellen reversibel zu hemmen,
– die biologische Wirkung der besagten Klasse B-chemotherapeutischen Verbindung nicht zu hemmen,

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf den überraschenden Beobachtungen, dass der Binukleations-/Multinukleationszustand, der durch Klasse A-Verbindungen jeweils in normalen/Tumorzellen induziert wird, ein "differenzierender Status" ist, wie er hierin in Bezug auf die eradikative Wirkung von Klasse B-Verbindungen definiert wird, und dass solch ein "differenzierender Zustand" strikt von dem Funktionieren des p53-Stoffwechselweges in normalen Zellen und dem Mangel an einem funktionellen p53-Stoffwechselweg in den meisten Tumorzellen abhängt.
In dem besagten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird besagter "differenzierender Zustand" daher durch eine Klasse A-Verbindung in proliferierenden normalen Zellen mit einem aktiven p53-Stoffwechselweg, nicht aber in Tumorzellen mit einem inaktiven p-53-Stoffwechselweg induziert, wodurch besagte proliferierende normale Zellen von den toxischen Wirkungen der Klasse B-Verbindungen geschützt werden, welche eine spezifische Untergruppe chemotherapeutischer Medikamente ist, die auf replizierende Zellen gerichtet sind.
Solch ein Schutz ermöglicht die reversible Hemmung der Zellteilung, die zur Hemmung der weiteren DNA-Replikation in normalen Zellen führt, aber nicht in Tumorzellen, die einen inaktiven p53-Stoffwechselweg aufzeigen. Dementsprechend wird ein hoher Grad an Selektivität gegenüber Tumorzellen auf ansonsten nicht-selektive Medikamente vermittelt, so dass es möglich wird, eine vollständige Vernichtung von Tumorzellen zu erreichen, insbesondere solche mit einer geringen Proliferationsgeschwindigkeit, während normale Zellen verschont bleiben, in einem Umfeld, in dem sowohl normale wie auch Tumorzellen vorhanden sind und proliferieren.
Die Umkehrbarkeit der Wirkung der Klasse A-Verbindung nach der Entfernung des Medikaments ermöglicht die anschließende Erholung der physiologischen proliferativen Fähigkeit besagter normaler Zellen.
Dementsprechend ist als Ergebnis des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ein vollständiger Schutz vieler normaler Zellen, die in der intermitotischen Phase durch die Wirkung der Klasse A-Verbindung stehen bleiben, vor der zerstörenden Wirkung der Klasse B-Verbindung und eine vollständige Zerstörung der Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg erreichbar.
Des Weiteren sind gemäß der vorliegenden Erfindung wie unten gezeigt wird sowohl der Schutz normaler Zellen wie auch die Zerstörung von Tumorzellen steuerbare Funktionen von bestimmten Parametern (CT: Zeit der kombinierten Behandlung; CACT: Konzentration der Klasse A-Verbindung in der kombinierten Behandlung; und CBCT: Konzentration der Klasse B-Verbindung in der kombinierten Behandlung).
Dementsprechend kann der Schutz normaler Zellen und die Vernichtung von Tumorzellen bis zur vollständigen und selektiven Vernichtunung aller Tumorzellen in einer gemischten Kultur und einem signifikanten und selektiven Schutz normaler Zellen in der Kultur gesteuert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor der kombinierten Behandlung eine Vorbehandlung durchgeführt, die die Verabreichung der schützenden Verbindung, wie sie oben definiert wird, zu besagter Kultur umfasst, wobei die Verabreichung besagter schützender Verbindung in dem Verbleib von mindestens einem Teil besagter normaler Zellen in der Interphase resultiert.
In diesem Fall, bei dem der Stillstand der normalen zu schützenden Zelle vor der Verabreichung der Klasse B-Verbindung durchgeführt wird, ist der dadurch erreichbare Schutz steuerbarer, bis hin zur Vollständigkeit für viele normale Zellen, die in der Lage sind, in der Kultur zu proliferieren.
In dieser Behandlung ist analog zur kombinierten Behandlung wie unten gezeigt wird der Schutz normaler Zellen eine Funktion bestimmter Parameter (PT: Vorbehandlungszeit; und CAP: Konzentration der in der Vorbehandlung verwendeten Klasse A-Verbindung).
In jedem Fall muss zur Erreichung des möglichst vollständigen Schutzes von normalen Zellen berücksichtigt werden, dass bedingt durch die Umkehrbarkeit der Wirkung der Klasse A-Verbindungen auf normale Zellen, die gleichzeitige Unterbrechung der Behandlung mit beiden Verbindungen, den Tod eines kleinen aber messbaren Prozentanteils normaler Zellen bestimmen kann.
Tatsächlich ist diese Wirkung auf die Wirkung der verbleibenden Klasse B-Verbindung in den normalen Zellen zurückzuführen, die in der Abwesenheit der Klasse A-Verbindung sofort zu proliferieren beginnen.
In diesem Zusammenhang wird, obwohl die Verabreichung der Klasse A- und Klasse B-Verbindung gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten gemäß dem experimentellen Zweck unterbrochen werden kann, in einer bevorzugten Ausführungsform nach der kombinierten Behandlung eine Nachbehandlung durchgeführt, die einen Waschschritt umfasst, worin

– nach der Unterbrechung der Verabreichung der besagten Klasse B-Verbindung, besagte Klasse B-Verbindung aus der Kultur ausgewaschen wird, wobei die Verabreichung von besagter Klasse A-Verbindung beibehalten wird.

Nach diesem Waschschritt kann die Verabreichung der Klasse A-Verbindung gemäß dem experimentellen Zweck unterbrochen werden.
In dem Verfahren, in dem der Waschschritt durchgeführt wird, kann jegliche verbleibende cytotoxische Wirkung der Klasse B-Verbindung auf normale Zellen, die durch die gleichzeitige Unterbrechung der Verabreichung der Klasse A- und Klasse B-Verbindungen bedingt ist, vermieden werden.
Als Folge ist der weitere Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in der Ausführungsform, die eine Nachbehandlung umfasst, im Falle, dass die Vorbehandlung in dem Stillstand aller normalen Zellen mit der Fähigkeit zu proliferieren resultiert, die vollständig selektive und vollständige Vernichtung jeglicher Tumorzellart mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg und der korrespondierende Schutz jeglicher normaler Zellen in Kultur ist dadurch erreichbar.
Eine Klasse A-Verbindung (die in der Lage ist, solch einen "differenzierenden Zustand" zwischen normalen Zellen und Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg zu induzieren) ist gemäß der vorliegenden Erfindung jegliche Verbindung mit den folgenden Merkmalen:

– der Fähigkeit, die Zellteilung (Cytodierese) in normalen Zellen zu hemmen,
– die Umkehrbarkeit besagter Hemmung der Zellteilung (Cytodierese) in normalen Zellen und
– die Fähigkeit der Nicht-Hemmung der biologischen Wirkung einer Klasse B-Verbindung.

Die Fähigkeit der Hemmung der Cytodierese gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, die Tochter-Zellteilung und damit die anschließenden Phasen des Zellzyklus in proliferierenden normalen Zellen mit einem funktionellen p53-Stoffwechselweg durch direkte oder indirekte Wechselwirkung unter Veränderung des Actomyosin-Cytoskeletts zu hemmen.
Sie resultiert im Allgemeinen in einem Zellzyklusstillstand im Binukleusstadium in mindestens 40 % der Klasse A-Verbindung-behandelten proliferierenden normalen Zellen unter Verwendung der minimalen Medikamentenkonzentration (d. h., ausreichend, um reversibel seine Wirkungen auf Zielzellen ohne Bewirkung eines signifikanten Schadens auszuüben, experimentell durch Dosis/Reaktionskurven definiert), was das oben genannte Ergebnis ohne signifikante Toxizität ergibt und eine Inkubationszeit liegt im Allgemeinen abhängig vom Zelltyp im Bereich von 12 bis 48 Stunden.
Die Umkehrbarkeit nach Medikamentenentzug von besagter hemmender Fähigkeit ist mit der Wiedergewinnung eines proliferativen Potentials assoziiert, ähnlich dem, das normale Zellen vor der Behandlung mit dem Klasse A-Medikament aufzeigten.
Besagte Umkehrbarkeit der Wirkungen der Klasse A-Verbindung nach Medikamentenentfernung umfasst im Allgemeinen:

– einen Übergang von binuklearen zu mononuklearen Zellen von mindestens 60 % der Zellen;
– eine wiedergewonnene Kompetenz zur DNA-Synthese in mindestens 70 % der Zellen innerhalb von 48 Stunden nach Medikamentenentzug;
– am wichtigsten, eine Rückgewinnung von mindestens 30 % des klonogenen Potentials im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen.

Betreffend hingegen die Fähigkeit der Nicht-Hemmung der biologischen Wirkung einer Klasse B-Verbindung, resultiert sie im Allgemeinen in der Verringerung der Aufnahme einer Klasse B-Verbindung durch die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg in einem Prozentanteil, der geringer oder gleich 50 % ist.
Spezifische bevorzugte Klasse A-Verbindungen sind Verbindungen, die zu den Familien der Cytochalasine (2, 3, 4, 5) mit der Ausnahme von Cytochalasin B (6, 7, 8) gehören, die Jasplakinolide (9), Chondramide (10), Isoindolinone (11) und die Latrunculine (12). Insbesondere Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und Lactrunculin B.
Eine Klasse B-Verbindung (vernichtendes und/oder chemotherapeutisches Mittel) gemäß der vorliegenden Erfindung ist statt dessen jegliche Verbindung mit der Fähigkeit, eine Cytotoxizität gegenüber aktiv proliferierenden Zellen aufzuzeigen, ohne das Proliferationspotential und die Überlebensfähigkeit von Interphasenzellen zu betreffen.
Cytotoxizität gegenüber aktiv proliferierenden Zellen geringer Dichte (10² – 10³ Zellen/cm²) ist eine Toxizität, die im Allgemeinen in einer Verringerung von mindestens 90 % der Anzahl der überlebenden proliferierenden Zellen resultiert (im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollzellen), die mit der geeigneten (d. h. in der Lage, einen irreversiblen Verlust an Überlebensfähigkeit in mindestens 90 % der Zellen zu bewirken, wie durch Dosis/Reaktionsexperimente bestimmt wurde) Medikamentenkonzentration für einen Zeitraum im Bereich von 24 bis 96 Stunden behandelt wurden.
Bezüglich der Fähigkeit, das proliferative Potenzial von Interphasenzellen nicht zu beeinträchtigen, ist sie mit der Fähigkeit einer Klasse B-Verbindung assoziiert, nicht-cytotoxisch gegenüber normalen Zellen zu sein, die in der intermitotischen Phase als Folge der Klasse A-Wirkung stillstehen. Sie resultiert im Allgemeinen nach der Behandlungsunterbrechung in:

– dem Aufrechterhalten einer konstanten Interphasen-Zellzahl nach 24 – 48 Stunden Behandlung, was zu mindestens 80 % der Interphasen-Zellzahl zu Beginn des Experiments im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen resultiert;
– der Induktion der DNA-Synthese durch Serumstimulation, vorzugsweise in 40 % der Interphasenzellen nach 24 – 48 Stunden Medikamentenbehandlung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen.

Spezifische bevorzugte Klasse B-Verbindungen sind Verbindungen, die zu den Familien der Folat-Hemmer, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Hemmer, Vinca-Alkaloide, Taxane, Colchicin-Derivate, Podophyllotoxin-Derivate und Topoisomerase-Hemmer gehören und insbesondere Trifluorthymidin-(2'-deoxy-5-trifluormethyluridin), Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptopturin, Gemcytabin, Fludarabin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan, 9-Amino-20(S)-campothecin. Alle diese Verbindungen zielen auf verschiedene Phasen des Zellzyklus und haben einen hohen Grad an Toxizität für hoch-proliferierende Zellen (1) gemeinsam.
In Bezug auf die Behandlungen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden solche Klasse A- und Klasse B-Verbindungen in Kombination verwendet, wie sie oben genannt wurden, Sie sind von bestimmten Parametern abhängig.
In Bezug auf die Vorbehandlung sind die relevanten Parameter die Vorbehandlungszeit (PT) und die Konzentration der Klasse A-Verbindung, die in dem Vorbehandlungsschritt verwendet wird (CAP). Die PT ist die Zeit, die zur Induktion der Binukleation in normalen Zellen notwendig ist, um diese gemäß dem experimentellen Zweck zu schützen. Die PT-Dauer ist daher eine Funktion der Zellzykluszeit von normalen Zellen, die zu schützen sind. in vitro kann sich eine solche Zeit zwischen verschiedenen Zelltypen unterscheiden, da verschiedene Zelltypen unterschiedliche Zellzykluszeiten aufweisen (z. B. hat ein primärer Fibroblast unter Standardbedingungen einen Zellzyklus von ungefähr 24 – 48 h, die C3H10T1/2 20 Stunden). Jedoch könnte ein Fachmann auf dem Gebiet diese für jeden Zelltyp auf der Basis des Standes der Technik bestimmen.
In einer ex vivo-Behandlung kann diese leicht für alle Zelltypen bestimmt werden, da die Zellzykluszeit ex vivo (wie in vivo) stark standardisiert ist.
In der bevorzugten Ausführungsform, bei der die Gesamtheit der normalen Zellen in Kultur zu schützen ist, ist die PT länger oder gleich der Zellzyklusdauer von besagten proliferierenden normalen Zellen in vitro oder ex vivo (in beiden Fällen ist sie die Zeit, die von den meisten der physiologisch proliferierenden normalen Zellen in der Kultur zum Stillstand ihres Wachstums benötigt wird). Gemäß einigen experimentellen Daten liegt dieser Zeitraum unter Standardbedingungen abhängig von den Zelltypen zwischen 12 und 96 Stunden.
Jedoch kann gemäß dem, was oben gesagt wurde, die PT abhängig von dem unterschiedlichen Anteil proliferierender, zu schützender normaler Zellen in den verschiedenen Anwendungen verlängert oder gekürzt werden.
In Bezug auf den CAP-Parameter ist der korrespondierende Wert einer Klasse A-Verbindungskonzentration, derjenige, der den Stillstand von mindestens 40 % der normalen Zellen in dem intermitotischen Stadium bewirkt; eine solche Konzentration wird experi mentell durch Dosis/Reaktionsexperimente bestimmt, die den geeigneten Wertebereich für verschiedene Zelltypen und Verbindungen definieren.
Die relevanten Werte variieren als Funktion der Klasse A-Verbindung und des verwendeten Zelltyps, aber dementsprechend, was oben gesagt wurde, kann dieser für jede einzelne Klasse B-Verbindung durch Fachleute auf dem Gebiet auf Basis des Wissens des Standes der Technik und der Lehre der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
Für die oben genannten Klasse A-Verbindungen liegt dieser Wert unter Standardbedingungen im Bereich zwischen 1 nM- bis 40 μM-Konzentrationen. Zum Beispiel liegt unter Standardbedingungen der CAP-Wert für Cytochalasin D vorzugsweise im Bereich von 20 nM – 2 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform ist er 400 nM; für das Dihydrocytochalasin B liegt er im Bereich von 600 nM – 8 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform ist er 2 μM; für das Jasplakinolid liegt er im Bereich 50 nM – 3 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform ist er 700 nM; für Latrunculin B liegt er im Bereich von 500 nM – 2 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform ist er 650 nM; für Chondramid B liegt er im Bereich 10 – 800 nM und in einer bevorzugten Ausführungsform ist er 100 nM. Besagte bevorzugte Konzentrationen sind die CAP-Werte, die mit der minimalen Konzentration unter Standardbedingungen korrespondieren, die notwendig sind, um den Stillstand in der intermitotischen Phase der normalen zu schützenden Zellen zu erreichen (minimale funktionelle Konzentration), sie könnten aber auch höher sein.
Tatsächlich kann jedoch wie die PT auch die CAP als Funktion des gewünschten zu erreichenden Schutzes variiert werden. Im Allgemeinen kann die Kombination CAP-PT durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf Basis der oben genannten Informationen und des Standes der Technik als Funktion der gewünschten schützenden Wirkung variiert werden.
In Bezug auf die kombinierte Behandlung sind die relevanten Parameter CT (Zeit der kombinierten Behandlung), CACT (Konzentration der Klasse A-Verbindung in der kombinierten Behandlung) und CBCT (Konzentration der Klasse B-Verbindung in der kombinierten Behandlung).
In Bezug auf die TC ist diese Zeit funktionell in Bezug auf die gewünschten Tumorzellvernichtenden Wirkungen. Da Klasse B-Verbindungen replizierende Zellen töten, kann die optimale CT als äquivalent zur durchschnittlichen Zellzykluszeit der zu vernichtenden Tumorzellen vorausgesagt werden, wobei man der Regel folgt, je länger die Behandlung, desto besser die Ergebnisse.
Dementsprechend ist die CT eine Funktion des Zellzyklus der Tumorzellen, auf die die Klasse B-Verbindung gerichtet ist, dahingehend, dass sie gleich oder kürzer als oder länger als die Tumorzellzykluszeit gemäß der verschiedenen Verrichtungsprotokolle, die geplant werden können, ist.
In der bevorzugten Ausführungsform, in der alle Tumorzellen, die zu zerstören sind, einen inaktiven p53-Stoffwechselweg aufweisen, ist eine solche Zeit im Allgemeinen größer als oder gleich der Zellzyklusdauer der Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg, die zu vernichten sind. Vorzugsweise ist sie die minimale Zeit, die durch die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg benötigt wird, um mindestens einen Zellzyklus zu vervollständigen, welches die Zeit ist, innerhalb der in Abwesenheit der Verabreichung einer Klasse A-Verbindung alle Tumorzellen innerhalb der Kultur durch die Klasse B-Verbindung vernichtet werden.
Die CT kann jedoch auch bis zu zwei oder mehr Zellzyklusäquivalenten erhöht werden, um sogar solche Tumorzellen zu vernichten, die vielleicht nach dem ersten Zellcyclus überlebt haben. Jedoch stellt ein CT-Äquivalent von zwei Tumorzellzyklen keine Obergrenze dar und kann, falls notwendig, weiter erhöht werden.
Eine solche Zeit kann auch unter eine Zellzykluszeit in Fällen verringert werden, bei denen eine langsamere vernichtende Wirkung von Nöten ist.
In jedem Fall variiert die Zellzykluszeit von Tumorzellen in vitro von Zelltyp zu Zelltyp (wie oben für die normale Zellzykluszeit festgestellt wurde). Die CT variiert gemäß dem zu vernichtenden Zelltyp.
Da die Zellzykluszeit für jeglichen Zelltyp durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis des Standes der Technik bestimmt werden kann, kann die CT auch entsprechend durch einen Fachmann auf dem Gebiet als Funktion der gewünschten vernichtenden Wirkung bestimmt werden.
In Bezug auf die Konzentration der Klasse A-Verbindung, die in der kombinierten Behandlung zu verabreichen ist (CACT), ist diese die Konzentration, die notwendig ist, um den Stillstand in der intermitotischen Phase von mindestens 40 % der normalen Zellen zu erhalten, die zu schützen sind. Somit variiert die CACT in einer Weise, die in allem analog zur CAP ist, in der Funktion der Klasse A-Verbindung und des verwendeten Zelltyps.
Im Hinblick auf das, was oben in Bezug auf die Wirkung der Klasse A-Verbindung gesagt wurde, kann der korrespondierende Wert für jede einzelne Klasse A-Verbindung durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis des Wissens des Standes der Technik und der vorliegenden Anmeldung bestimmt werden.
Die CACT korrespondiert im Allgemeinen mit der CAP und kann daher unter Standardbedingungen für die oben erwähnten Verbindungen in dem Konzentrationsbereich liegen, der für die Vorbehandlung gezeigt wurde. Obwohl die CACT im Allgemeinen dem CAP gleicht, könnte sie sogar arbiträr innerhalb oder außerhalb des genannten Bereiches erhöht oder verringert werden. In der bevorzugten Ausführungsform werden Klasse A-Verbindungen ohne Unterbrechung während beider Phasen verabreicht.
In Bezug auf die Konzentration der Klasse B-Verbindung (CBCT) liegt diese in einem Bereich, der als Funktion der CT berechnet werden sollte, des Ziel-Tumorzelltyps und der Halbwertszeit der verabreichten Klasse B-Verbindung in Kultur. Insbesondere gleicht die CBCT der Medikamentenkonzentration, die in der Lage ist, mindestens 50 % des Zieltumores innerhalb der Dauer einer Zellzykluszeit zu töten, es sei denn, eine langsamere Vernichtungsgeschwindigkeit wird benötigt. Üblicherweise ist diese unter Standard-Kulturbedingungen für die oben genannten Klasse B-Verbindungen größer als oder gleich 100 nM.
Insbesondere für das Trifluorthymidin ist diese Konzentration größer als oder gleich 40 μM, liegt insbesondere im Bereich von 10 μM – 800 μM, vorzugsweise 50 μM; für das Cytarabin ist diese Konzentration im Allgemeinen größer als oder gleich 40 μM, insbe sondere im Bereich von 40 μM – 600 μM, vorzugsweise 40 μM; für das 6-Thioguanin ist diese Konzentration im Allgemeinen größer als oder gleich 50 μM, insbesondere eine Konzentration im Bereich von 50 μM – 600 μM, vorzugsweise 100 μM.
Besagte bevorzugte Konzentrationen sind die CBCT-Werte, die mit der minimalen Konzentration unter Standardbedingungen korrespondieren, die notwendig sind, um Tumorzellen in Kultur (minimale funktionelle Konzentration) zu vernichten, sie könnten aber auch höher sein. Tatsächlich kann diese Konzentration, bedingt durch die schützende Wirkung der Klasse A-Verbindung auf normale Zellen, auch bis auf das 10 – 20-fach der erwähnten minimalen Konzentration davon erhöht werden.
In diesem Zusammenhang kann die Kombination CBTC-TC tatsächlich durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis der oben genannten Information und des Standes der Technik als Funktion der gewünschten vernichtenden Wirkung variiert werden. Insbesondere kann sie in einer extrem erwähnenswerten Weise sowohl in der in vitro wie auch der ex vivo-Behandlung erhöht werden, aber über alles in der Vorangegangenen.
Wie oben berichtet wurde, umfasst in Bezug auf die Nachbehandlung diese im Allgemeinen das Auswaschen von mindestens der verabreichten Klasse B-Verbindung aus der Kultur gemäß dem oben erwähnten Waschschritt.
Die Waschschrittzeit (WST) in vitro hängt von der Erneuerungsgeschwindigkeit des Mediums und von der Fähigkeit der normalen Zellen ab, die Klasse B-Verbindung zu katabolisieren. Dementsprechend kann sie im Allgemeinen aus einem Bereich zwischen 1 und 48 Stunden ausgewählt werden. Vorzugsweise wird besagter Waschschritt für eine Zeit durchgeführt, die größer oder gleich 3 Stunden ist. Auch könnte sie in diesem Fall jedoch gemäß den Eigenschaften des Zelltyps und der Klasse B-Verbindung variiert werden. Sowohl in der Gegenwart wie auch der Abwesenheit des Waschschrittes nach der Unterbrechung der Behandlung mit den Klasse A- und B-Verbindungen wird im Allgemeinen die Erholung der Zellproliferation für einen variablen Zeitraum ermöglicht, der in vitro gemäß dem experimentellen Zweck berechnet werden kann und in vivo gemäß der gewünschten Gewebeerholung.
Die minimale Abschätzung des Schutzes, der durch das Verfahren der Erfindung in der Ausführungsform zur Verfügung gestellt wird, in der die normalen Zellen geschützt werden, liegt bei ungefähr 500/1000-fach.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist diejenige, in der die Reihenfolge der oben genannten Behandlungen (Vorbehandlung, kombinierte Behandlung und Nachbehandlung) in der Kultur zweimal oder mehrfach wiederholt wird, jedes Mal mit den gleichen Modalitäten oder mit unterschiedlichen Modalitäten als Funktion des experimentellen Zwecks.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer schützenden Verbindung mit der Fähigkeit

– die Zellteilung von normalen Zellen reversibel zu hemmen,
– die biologische Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung nicht zu hemmen, wobei diese chemotherapeutische Verbindung die Fähigkeit hat
– eine cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben, aber
– das Überleben und proliferative Potenzial von Interphasenzellen nicht zu beeinträchtigen, für die Herstellung eines Medikaments zum Schützen von normalen Zellen vor der eradikativen Wirkung der chemotherapeutischen Verbindung bei einer Behandlung einer Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg.

Eine solche Verwendung ist die in vivo Anwendung der oben genannten in vitro und ex vivo-Verfahren.
In bevorzugten Ausführungsformen, die auf den Schutz aller normalen Zellen und auf die Vernichtung aller Tumorzellen gerichtet sind, wird auch die Vorbehandlung und/oder die Nachbehandlung, wie sie oben definiert ist, durchgeführt.
Insbesondere umfasst die in vivo Vorbehandlung die Verabreichung der schützenden Verbindung, wie sie oben definiert ist, an besagtes Objekt, das derer bedarf, wobei die Verabreichung besagter schützender Verbindung in dem Stillstand in der Interphase von mindestens einem Teil der normalen Zellen resultiert. Die Nachbehandlung in vivo umfasst einen Waschschritt, worin

– nach der Unterbrechung der Verabreichung besagter chemotherapeutischer Verbindung, besagte chemotherapeutische Verbindung aus den Geweben des Subjekts herausgewaschen wird, wobei die Verabreichung besagter Klasse A-Verbindung aufrechterhalten wird.

Ein erster Vorteil der in vivo-Verwendung der vorliegenden Erfindung ist, dass ein vollständiger Schutz vieler normaler Zellen, die in der intermitotischen Phase stillstehen, vor der vernichtenden Wirkung der Klasse B-Verbindung dadurch erhalten wird. Solche Zellen resultierten tatsächlich in einem wirksamen Schutz und einer Umkehrbarkeit, um die Erholung ihrer physiologischen proliferativen Fähigkeit zu ermöglichen. Die vollständige Vernichtung der Tumorzellen in Patientengeweben ist daher erreichbar, da besagte Vernichtungsbehandlung normale Zellen nicht betreffen kann, die in der intermitotischen Phase stillstehen, wenn Klasse B-Verbindungen, wie sie hierin definiert sind, verwendet werden.
Ein zweiter Vorteil der in vivo-Verwendung der vorliegenden Erfindung ist, dass sowohl der Schutz normaler Zellen wie auch die Vernichtung von Tumorzellen in jedem Fall als Funktionen der Parameter von jeder Behandlung, wie hierin definiert ist, steuerbar ist.
Insbesondere die PT und CAP der Vorbehandlung des besagten in vivo-Verfahrens sind diejenigen, die den vollständigen Schutz aller proliferierenden normalen Zellen ermöglichen, die in Patientengeweben vorhanden sind, gemäß dem verfolgten therapeutischen Ansatz.
Mit spezifischem Bezug auf die PT ist die bevorzugte Zeit wie bei der ex vivo-Behandlung, die Zeit, die durch alle physiologisch proliferierenden normalen Zellen in dem menschlichen Körper benötigt wird, bis ihr Wachstum anhält. Eine solche Zeit kann für alle Zelltypen vorbestimmt werden, da die Zellzykluszeit in vivo stark standardisiert ist. Wie in den ex vivo- und in vitro-Verfahren oben liegt diese Zeit zwischen 12 und 96 Stunden.
Jedoch können diese Zeiten in den verschiedenen Anwendungen verlängert oder gekürzt werden, abhängig von den verschiedenen Merkmalen der proliferierenden normalen Zellen, die zu schützen sind.
In Bezug auf den CAP-Parameter ist diese diejenige, der für die Medikamenten-Plasmakonzentration benötigt wird, um eine Menge zu erreichen, die ausreichend ist, um proliferierende normale zu schützende Zellen in der intermitotischen Phase in verschiedenen normalen Zielgeweben anzuhalten. In diesem Falle kann ein solcher Wert auch durch Fachleute auf dem Gebiet für jede einzelne Klasse A-Verbindung abhängig von dem Verabreichungsmodus bestimmt werden, der gemäß dem Wissen des Standes der Technik und den durch die vorliegende Erfindung beschriebenen Regeln vorausgewählt wird.
Im Allgemeinen liegt eine solche Menge im oben genannten Bereich (1 nM – 40 μM). Jedoch sollte auch in vivo für jede Verbindung der CAP-Wert, der mit der minimalen Konzentration korrespondiert, die für das Erreichen des Stillstandes der normalen Zellen in der intermitotischen Phase in den zu schützenden Geweben (minimale funktionelle Konzentration) notwendig ist, wie die oben gezeigten, als bevorzugt angesehen werden.
Die Kombination CAP-TP kann in jedem Fall durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis der oben genannten Information und des Standes der Technik als Funktion der gewünschten schützenden Wirkung variiert werden.
In Bezug auf die kombinierte Behandlung sind analog zu der Vorbehandlung auch die CT, CACT und CBCT diejenigen, die eine vollständige Vernichtung der Tumorzellen in den Patientengeweben gemäß dem befolgten therapeutischen Ansatz ermöglichen.
Insbesondere kann die CT daher als die minimale Zeit definiert werden, die durch die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg benötigt wird, um mindestens einen Zellzyklus zu vervollständigen, aber sie ist vorzugsweise die Zeit, die durch die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg benötigt wird, um zwei oder mehr Zellzyklen zu vervollständigen, um sogar solche Tumorzellen zu vernichten, die nach dem ersten Zellzyklus in der Anwesenheit von Klasse A- und Klasse B-Verbindungen überlebt haben könnten. Auch stellen die zwei Tumorzellzykluszeiten in vivo keine Obergrenze für die CT-Zeit dar, die weiter erhöht werden kann (siehe oben).
Zusätzlich kann auch eine kürzere CT als eine Zellzykluszeit in einigen Vernichtungsprotokollen notwendig sein (z. B., um eine langsamere Vernichtung des Tumors zu erreichen und so potentielle schädliche entzündliche Reaktionen bedingt durch die zu hohe Geschwindigkeit des Tumorzelltodes zu vermeiden).
In Bezug auf die Konzentration der Klasse B-Verbindung (CBCT) ist diese eine Funktion der kombinierten Behandlungszeit, des Zielzelltyps und der Halbwertszeit des verabreichten Klasse B-Medikaments in vivo.
Auch kann diese in vivo 100 nM – 800 μM in den Patientengeweben sein. Jedoch kann, bedingt durch die schützende Wirkung der Klasse A-Verbindung, eine solche Konzentration bis zum 10 – 20-fachen der erwähnten minimalen Konzentration davon erhöht werden.
Diese Möglichkeit (gut für die in vitro- und ex vivo-Behandlung, bei der jedoch die Behandlungszeit und die Konzentrationen der verwendeten Medikamente recht leicht durch den Operateur gesteuert werden können) ist am wichtigsten in der in vivo-Behandlung, in der die Variationen, die durch den Bluttransport des Medikaments und die Halbwertszeit davon in dem Blut und in den Tumorgeweben bedingt sind, berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel sind tatsächlich alle Nukleosid-Analogachemotherapeutischen Medikamente im Allgemeinen dahingehend bekannt, dass sie in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit aufweisen (ungefähr 1 – 3 Stunden).
Zudem werden transiente plasmatische Konzentrationsspitzen im Allgemeinen nach der Verabreichung der Nukleosid-Analoga-Medikamente nachgewiesen. Daher sollte, um eine konstante Konzentration auf der Zellebene zu erhalten, eine längere Behandlung zur Verfügung gestellt werden, der derzeit schwere Nebenwirkungen folgen. Stattdessen kann nach einer Behandlung mit einer Klasse A-Verbindung eine in vivo-Perfusion des chemotherapeutischen Medikaments (Klasse B-Verbindung) durchgeführt werden.
In diesem Zusammenhang (wie in den in vitro- und es vivo-Behandlungen) kann die Verabreichungszeit des Klasse B-Medikaments (die mit der CT-Zeit in dem Verfahren korrespondiert) und die Konzentration selbst des Klasse B-Medikaments (die mit der CBCT-Konzentration in dem Verfahren korrespondiert) in vivo in einer extrem erwähnenswerten Weise erhöht werden
Diese Tatsache ermöglicht es, auch in vivo die geeigneten Konzentrationen der Klasse B-chemotherapeutischen Mittel, Medikamente und/oder die für die Vernichtung aller Tumorzellen in dem ursprünglichen Kontext notwendige Verabreichungszeit zu bestimmen.
In Bezug auf die Nachbehandlung ist die WST in vivo neben der Fähigkeit der Zelle, die Klasse B-Verbindung zu katabolisieren, auch eine Funktion der intrinsischen, hematischen und/oder Gewebe-Halbwertszeit der Klasse B-Verbindung selbst.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist diejenige, in welcher die Reihenfolge der Vorbehandlung, kombinierten Behandlung und/oder Nachbehandlung mit den gleichen Modalitäten oder mit verschiedenen Modalitäten als Funktion des therapeutischen Zwecks zu wiederholen sind.
Die in vivo-Verwendung der vorliegenden Erfindung kann entweder für eine systemische Behandlung oder für eine topische Behandlung verwendet werden. Zudem kann sie unter der Voraussetzung, dass die Tumorzielzellen einen inaktivierten p53-Stoffwechselweg aufweisen, auf einen malignen Tumor wie auch auf gutartige Tumore angewendet werden, wie die hyperproliferativen Lesionen, die durch eine Papillomavirus-Infektion bewirkt werden. Sie kann auch in der Behandlung von pathologischen Infektionen angewendet werden, die durch Mikroorganismen hervorgerufen werden, die keinen p53-Stoffwechselweg aufweisen und somit keine p53-Funktion, und in der Behandlung von Alopezia, die mit standardisierter systemischer Chemotherapie assoziiert ist.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung zusätzlich die Verwendung einer schützenden Verbindung, wie sie in Anspruch 14 definiert ist, für die Herstellung eines Medikaments zum Schützen von normalen Zellen vor der eradikativen Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung bei einer Behandlung einer pathologischen Infektion, die durch Mikroorganismen verursacht wird, die keine p53-Funktion aufweisen.
In bevorzugten Ausführungsformen sind eine Vorbehandlung und/oder eine Nachbehandlung, wie sie in dem Verfahren zum Schützen proliferierender normaler Zellen einer Behandlung von Tumorformen definiert sind, wie es oben beschrieben wird, mit umfasst.
Die Behandlungen der Verwendung kann mittels systemischer und/oder topischer Verabreichungen durchgeführt werden. Mikroorganismen ohne p53-Funktion sind jegliche prokaryontischen und eukaryontischen Mikroorganismen ohne F53-Stoffwechselweg, die mit einer pathologischen Infektion assoziiert sind. Ein Subjekt, das dieser Bedarf, kann ein Subjekt jeglicher Tierspezies sein, vorzugsweise Menschen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung gemäß dem, was oben gesagt wurde, ist auch eine Verwendung einer schützenden Verbindung, wie sie in Anspruch 14 definiert ist, für die Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und Behandeln von Alopezia, die mit einer systemischen Verabreichung einer chemotherapeutischen Verbindung bei einer Behandlung von Zellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg assoziiert ist.
In diesem Fall ist eine bevorzugte Form der Verabreichung der Klasse A-Verbindung eine topische Verabreichung.
Analog zu den oben genannten Verwendungen sind in bevorzugten Ausführungsformen eine Vorbehandlung und/oder eine Nachbehandlung, wie sie zum Schutz proliferierender normaler Zellen in einer Behandlung von Tumorformen oben genannt werden, mit umfasst.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auch ein pharmazeutisches Produkt, das eine therapeutisch wirksame Menge einer schützenden Verbindung (Klasse A-Verbindung), wie sie oben definiert wird, eine therapeutisch wirksame Menge einer chemotherapeutischen Verbindung (Klasse B-Verbindung), wie sie oben definiert wird, in einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel, Träger oder Hilfsmittel umfasst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als ein Adjuvans, insbesondere in einer Behandlung einer Tumorform mit einem inaktivierten p53-Stoffwechselweg geeignet ist, insbesondere der Formen mit einem gering proliferierenden Potential, einer hyperproliferierenden Lesion, die durch Papillomavirus hervorgerufen wird und Alopezia, die mit systemischer Therapie assoziiert ist, die eine therapeutisch wirksame Menge einer schützenden Verbindung (Klasse A-Verbindung), wie sie oben definiert ist, optional einer therapeutisch wirksamen Menge einer chemotherapeutischen Verbindung (Klasse B-Verbindung), wie sie oben definiert ist, und ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel, Träger oder Hilfsmittel umfasst.
Eine therapeutisch wirksame Menge der schützenden Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Menge, bei der die CAP- und/oder CATC-Konzentration, wie sie oben gezeigt wird, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Zielgeweben erhalten wird. Tatsächlich ermöglichen besagte CAP- und CATC-Konzentrationen der schützenden Verbindung der vorliegenden Erfindung ihre therapeutische Wirkung in einem Zielgewebe auszuüben, welche eine Adjuvanswirkung ist, die typischerweise in einem Zellschutz besteht.
Eine therapeutisch wirksame Menge der chemotherapeutischen Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Menge, bei der die CBTC-Konzentration, wie sie oben gezeigt wird, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Zielgeweben erhalten wird. Tatsächlich ermöglicht besagte CBTC-Konzentration es der chemotherapeutischen Verbindung der vorliegenden Erfindung, ihre chemotherapeutische Wirkung in einem Zielgewebe auszuüben, welche typischerweise Cytotoxizität ist.
In diesem Zusammenhang kann eine therapeutisch wirksame Menge der schützenden Verbindung und der chemotherapeutischen Verbindung, die als Adjuvantien und wirksame Mittel in den verschiedenen oben gezeigten Verbindungen wirksam sind, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verschieden sein.
Zusätzlich können sowohl die therapeutisch wirksame Menge der schützenden Verbindung und die therapeutisch wirksame Menge der chemotherapeutischen Verbindung der vorliegenden Erfindung zwischen systemischer und topischer Verabreichung, abhängig auch von der Art der Verabreichung und dem Träger und/oder Trägermittel, das verwendet wird, variieren.
Ein Fachmann auf dem Gebiet kann jedoch solche Mengen auf Basis des Standes der Technik und der hierin offenbarten Lehre ableiten.
In dem Fall, in dem eine chemotherapeutische Verbindung mit umfasst ist, wird die Zusammensetzung gemäß dem Stand der Technik derart hergestellt, dass die pharmakologische Freisetzung der chemotherapeutischen Verbindung vorzugsweise in Bezug auf die pharmakologische Freisetzung der schützenden Verbindung retardiert ist.
Vorzugsweise wird die schützende Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Cytochalasinen mit der Ausnahme von Cytochalasin B, Jasplakinoliden, Chondramiden, Isoindolinonen und den Latrunculinen, besteht, spezifisch kann sie Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und/oder Latrunculin B sein.
Vorzugsweise wird die chemotherapeutische Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Folat-Hemmern, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Hemmern, Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten und Topoisomerase-Hemmern besteht, insbesondere kann sie Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptoputrin, Gemcytabin, Fludarabin, Floxuridin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotectan und/oder 9-Amino-S(20)-camptothecin sein.
Ein pharmazeutisch verträgliches Trägermittel, Träger oder Hilfsstoff für die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist ein Trägermittel, Trägerstoff oder Hilfsmittel, von dem auf dem Gebiet bekannt ist, dass es mit den oben erwähnten beschriebenen Verbindungen kompatibel ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auch der folgende Kit:

• ein Teilekit zum selektiven Vernichten von Zellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg und selektiven Schützen von proliferierenden normalen Zellen, umfassend:
– eine schützende Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse A-Verbindung oder Medikament);
– eine chemotherapeutische Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse B-Verbindung oder Medikament) als Kombinationszubereitung zur simultanen, separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in der in vivo- und/oder ex vivo-Therapie von Tumorformen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg (einschließlich gutartiger Formen wie eine hyperproliferative Lesion, die durch Papillomavirus bewirkt wird), vorzugsweise derjenigen mit einem geringen Proliferationspotenzial.
• Einen Teilekit zur selektiven Vernichtung von Zellen ohne p53-Funktion und zum selektiven Schützen proliferierender normaler Zellen, umfassend:
– eine schützende Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse A-Verbindung oder Medikament);
– eine chemotherapeutische Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse B-Verbindung oder Medikament) als Kombinationszubereitung zur simultanen, separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in der Therapie einer pathologischen Infektion, die mit einem Mikroorganismus ohne p53-Funktion assoziiert ist;
• Einen Teilekit zur selektiven Vernichtung von Zellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg oder ohne p53-Stoffwechselweg und dem selektiven Schützen proliferierender normaler Zellen, umfassend:
– eine schützende Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse A-Verbindung oder Medikament);
– eine chemotherapeutische Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse B-Verbindung oder Medikament) als eine Kombinationszubereitung zur simultanen, separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in dem Verfahren zum Schützen proliferierender normaler Zellen in einer in vitro-Kultur der vorliegenden Erfindung.

In den Kits der vorliegenden Erfindung wird die schützende Verbindung vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Cytochalasinen mit der Ausnahme von Cytochalasin B, Jasplakinoliden, Chondramiden, Isoindolinonen und den Latrunculinen besteht, spezifisch kann sie Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und/oder Latrunculin B sein.
Vorzugsweise wird die chemotherapeutische Verbindung in den Kits der vorliegenden Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Folat-Hemmern, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Hemmern, Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten und Topoisomerase-Hemmern besteht, spezifisch kann sie Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptoputrin, Gemcytabin, Fludarabin, Floxuridin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan und/oder 9-Amino-S(20)-campothecin sein.
Die schützenden und chemotherapeutischen Verbindungen der Kits der vorliegenden Erfindung können in dem Kit zusammen mit einem kompatiblen Trägermaterial mit umfasst sein, welches in den Kits zur medizinischen Verwendung auch jeweils mit einer schützenden Zusammensetzung und einer therapeutischen Zusammensetzung pharmazeutisch verträglich ist.
Ein kompatibles Trägermittel gemäß der vorliegenden Erfindung ist jegliches Trägermittel, das auf dem Gebiet als kompatibel mit den oben definierten Verbindungen bekannt ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind zudem die Verwendung von C3H10T1/2-Zellen oder von Zellen, die gemäß den auf dem Gebiet zu diesem Zweck bekannten Techniken davon abgeleitet sind, um Verfahren aus Kulturen zur Vernichtung von Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg herzustellen, die besagte Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechsweg und normale Zellen umfassen und insbesondere für ein Verfahren für eine Behandlung einer Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist zudem die Verwendung des Verfahrens und der C3H10T1/2-Zellen oder von Zellen, die davon gemäß den für diesen Zweck bekannten Techniken auf dem Gebiet abgeleitet sind, zur Identifizierung schützender Verbindungen und/oder chemotherapeutischer Verbindungen, wie sie oben definiert sind.
Die Erfindung wird besser mit Unterstützung der beigefügten Figur beschrieben werden.
Beschreibung der Figur
1 zeigt den zeitlichen Verlauf des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform davon in tabellarischer Form, das mit einem System aus C3H10T1/2- und C3H10/T1/2v-src/v-myc-Zellen ausgeführt wird.
Die Begriffe T0h, T24h, T72h, T84h zeigen die Zeiten des Verfahrens ausgedrückt in Stunden an; insbesondere korrespondiert T0h mit 0 Stunden, T24h mit 24 Stunden, T72h mit 72 Stunden und T84h mit 84 Stunden.
In Zeile 1 wird die Zeit der Behandlung, die nur mit dem Klasse A-Medikament von Zeit T0 bis Zeit T84 bewirkt wird, gezeigt.
In Zeile 2 wird die Zeit der Behandlung, die nur mit dem Klasse B-Medikament von Zeit T24 bis Zeit T72 bewirkt wird, gezeigt.
In Zeile 3 werden die Zeiten des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie sie in ihrer bevorzugten Ausführungsform auf die oben gezeigten Zellen angewendet wer den, gezeigt: insbesondere ist hervorgehoben, wie die Behandlung mit dem Klasse A-Medikament in der Zeit T0 bis Zeit T84 bewirkt wird und die Behandlung mit dem Klasse B-Medikament überlappt mit der Klasse A-Medikamentenbehandlung von Zeit T24 bis Zeit T72. Die Zeit T0 – T24 ist die PT-Zeit, die Zeit T24-T72 ist die CT-Zeit, die Zeit T72 – T84 ist die WST-Zeit, die Zeit 10 – 15 Tage ist die Zeit zum Ermöglichen der Proliferation von normalen Zellen nach der Behandlung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein hauptsächliches Merkmal der in vitro-Verfahren und der medizinischen Verwendungen der vorliegenden Erfindung ist die relevante Anwendbarkeit auf jegliche Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg. Solch ein Merkmal wurde aus verschiedenen Assays abgeleitet, die zuerst darauf gerichtet waren, die molekularen Gründe für den Binukleations-/Multinukleations-Phenotyp in normalen/Tumorzellen zu verifizieren.
Im dem ersten Fall wurde daher eine Assay-Serie, die ausgiebig in Beispiel 1 beschrieben wird, durchgeführt, um zu verifizieren, ob die Bestimmung eines solchen Zustands dem Verlust der Funktionen zugeschrieben werden kann, die mit einem oder mehreren Tumor-Suppressor-Genen (hiernach als TSG bezeichnet) assoziiert sind (13).
Solche Assays wurden mit "Knock-out"-Zellen (genetisch Null) für einzelne TSG-Funktionen ausgeführt, da die relevanten Ergebnisse direkt signifikant für die Tumorformen sind, mit denen sie normalerweise assoziiert sind (14).
Die untersuchten TSG-Funktionen sind die relevantesten: Rb- (Retinoblastom), p21- und p53-Gene. In den relevanten "Knock-out"-Zellen existiert die Funktion nicht, daher können die gewonnenen Daten auf den Verlust dieser spezifischen Funktion zurückgeführt werden.
Der Nukleui-Anzahl-Zustand der Knock-out-Zellen nach besagten Assays (siehe Beispiel 1) zeigt, dass die p53-Funktion eine zentrale Rolle in der Bestimmung des Multinukleuszustandes in den Tumorzellen hat, während Rb- und p21- Knock-out dieses nicht tun (die relevanten Knock-out-Zellen behalten tatsächlich den binuklearen Zustand). Der Wachstumsstillstand im binuklearen Zustand in der Abwesenheit von p21- oder pRb schlägt deutlich vor, dass die Cytokinese-Blockade einen neuen wachstumshemmenden Stoffwechselweg auslöst, der einzigartig und unterschiedlich von dem ist, der mit Wachstumshemmung assoziiert ist, die durch Microtubulie- destabilisierende Mittel und Röntgenbestrahlung induziert wird, von dem bekannt ist, dass er beide, p21 und pRb, benötigt (15).
Weitere Assays mit p35-Knock-out-Zellen, die mit einem temperaturempfindlichen Allel von p53 rekonstituiert wurden, haben, während sie die vorangegangenen Daten (siehe Beispiel 1) bestätigen, auch die p53-Funktion als Kontrollpunkt "Schalter" für den binuklearen/multinuklearen Zustand in Zellen gezeigt. p53 wird tatsächlich als notwendig und ausreichend für die Etablierung eines solchen "differenzierenden Zustands" zwischen Tumorzellen und proliferierenden normalen Zellen nachgewiesen.
Nach diesen Assays, die mit murinen Zellsystemen durchgeführt wurden, wurde die Validität der relevanten Ergebnisse bestätigt und auf menschliche Zelllinien erweitert, d. h., auf solche von größerem Interesse. Die verwendeten Zelllinien waren menschliche Lungen-Fibroblasten (LHF), entweder normal oder durch Transfektion mit zwei Papillomavirus-Onkogenen (E6 und E7) transformiert, die in der Lage sind, jeweils das p53 und die pRB-Genprodukte zu binden und funktionell zu inaktivieren.
Die in Beispiel 2 beschriebene Assayserie übertrug die Validität der Daten der murinen Zelldaten auf menschliche Zelllinien, wodurch der Schluss unterstützt wird, dass p53 einen Cytodierese (Zellteilungs)-Kontrollpunkt reguliert, dessen Verlust einen Zustand darstellt, der zur Induktion eines multinuklearen Zustands in Zellen ausreicht, bei denen die Cytokinese blockiert ist.
Die Inaktivierung des p53-Stoffwechselweges ist ein Zustand, der in den meisten bekannten Tumorformen nachweisbar ist (14). Die meisten von diesen haben tatsächlich nicht nur eine inaktive p53-Funktion, sondern sind durch diese gekennzeichnet. Jedoch ist sogar in unbekannten Tumorformen oder in Tumorformen, für die keine Information bezüglich des p53-Stoffwechselweges vorhanden ist, im Hinblick auf die oben genannten Ergebnisse ein inaktiver p53-Stoffwechselweg a priori ein Anhaltspunkt für die Fähigkeit einer Multinukleation.
Um zu verifizieren, ob und in welchem Ausmaß ein solcher Zustand als "differenzierender Zustand" verwendet werden könnte, wurde ein in vitro-Modellsystem zur Verifizierung von Verbindungen und Bedingungen, die für die in vivo-Situation relevant sein könnten, abgeleitet.
Ableitung eines Modellsystems
Um ein solches System aufzubauen, welches wie oben im Überblick über den Stand der Technik hervorgehoben wurde, auf dem Gebiet nicht verfügbar war, wurde eine beträchtliche Anzahl von Assays durchgeführt.
Um Gegenstand quantitativer Tests zu sein, die das Modell bestätigen und validieren, war ein neues System notwendig, das aus:

a) normalen Zellen, die eine phenotypische Stabilität in Kultur aufzeigen und den Stillstand nach der Verabreichung von Cytokinese-Hemmern im Binukleusstadium aufrechterhalten;
b) einem isogenes tumoröses Gegenstück, das auch phenotypische Stabilität aufzeigt, aber in der Lage ist, Multinukleation in der Gegenwart von Cytokinese-Hemmern zu durchlaufen (d. h. mit einer p53-Funktion, die inaktiviert ist oder umgangen wird) aufgebaut ist.

Als Konsequenz der schlechten Wachstumseigenschaften natürlicher primärer Zellen (die nicht in vitro in den experimentellen Ansätzen, die auf die Messung klonogenen Potentials gerichtet sind, nützlich sind) wurden übliche verwendete Zelllinien untersucht.
Die Mehrheit davon erwies sich jedoch als natürlich befähigt, einen transformierten Zustand aufzunehmen (mit dem entsprechenden Verlust der Fähigkeit, in einem binuklearen Zustand zu verbleiben).
Die C3H10T1/2-Zellen (Maus-Fibroblasten) wurden letztendlich ausgewählt, da sie tatsächlich relativ stabil sind, klonogenes Potenzial in Kultur zeigen und die Fähigkeit auf zeigen, Binukleation nach der Verabreichung des Cytochalachalasins D (CD) zu durchlaufen, das in diesen Assay-Serien verwendet wurde (und in den vorausgegangenen, von denen in Beispiel 1 und 2 berichtet wird), um Cytokinese in normalen Zellen zu hemmen.
Dann musste das tumoröse Gegenstück von C3H10T1/2 hergestellt werden, was die Überwindung einiger Probleme implizierte.
Das Hauptsächliche war die Notwendigkeit der Gewinnung stabil transformierter Zellen, die gleichzeitig polyklonal sind, um die höchste Messzuverlässigkeit für den oben genannten Zweck zur Verfügung zu stellen (Verifizierung, dass die Binukleation / Multinukleation als "differenzierender Zustand" geeignet ist). Die einzige Behandlung, die eine stabile und polyklonale Tumorpopulation für C3H10T1/2-Zellen sicherstellt, die zu primären Zellen extrem ähnlich sind, ist tatsächlich die kooperative Transformation mit zwei retroviralen Onkogenen nacheinander wie den v-src und v-myc-Onkogenen.
In jedem Fall war es durch die Vorurteile auf dem Gebiet bezüglich retroviraler Onkogene (16) sowieso notwendig, die multinukleative Fähigkeit der Zellen, die mit v-src und v-myc transformiert worden waren, nach der Verabreichung von Cytochalasin D zu untersuchen. Der positive Ausgang des relevanten Assays stellte auch eine klare Indikation dahingehend zur Verfügung, dass die Transformation mit v-src und v-myc nacheinander die Inaktivierung oder die Umgehung des p53-abhängigen Cytokinese Kontrollpunkts bewirkt.
Im Lichte dieses Ergebnisses wurde ein Modellsystem aufgebaut, das Kulturen von entweder C3H10T1/2 normalen Zellen oder C3H10T1/2v-src/v-myc-Tumorzellen umfasst, die allein kultiviert werden, und eine gemischte, die aus C3H10T1/2- und C3H10T1/2v-src/v-myc-Zellen besteht. Die letztere wurde insbesondere so hergestellt, dass sie hauptsächlich aus normalen Zellen besteht und zu einem geringeren Anteil aus Tumorzellen (ähnlich einer in vivo-Situation).
Dann wurde dieses System einer Assay-Serie ausgesetzt, die darauf gerichtet ist, die Zell-Nuklei-Anzahl und die Fähigkeit derer, DNA-Synthese in der Gegenwart oder Abwesenheit von Cytochalasin D durchzuführen, zu analysieren.
Im Hinblick auf den positiven Ausgang dieser Assay-Serien ergab sich das oben genannte System als validiert.
Erste Definition der Verwendung der vorliegenden Erfindung
Um dann die mögliche Eignung der Verwendung des Binukleations-/Multinukleations-Zustandes als einen "differenzierenden Zustand" zu verifizieren, wurde eine Assay-Serie unter Verwendung von CD ausgeführt und als ein vernichtendes Agens Trifluorthymidin (3FT), ein sehr starkes cytotoxisches Mittel, verwendet.
In allen drei Kulturtypen wurden beide Zelltypen (normal und Tumor) in aktiv proliferierenden Zuständen gehalten, um Verzerrungen in den Ergebnissen, die durch den möglichen Zellzyklusarrest bedingt sind, aus Gründen zu vermeiden, die unabhängig von der Verbindungsverabreichung sind.
Die kombinierte Verabreichung besagter zwei Verbindungen resultierte tatsächlich in einer Tumorzellvernichtung.
Als Konsequenz wurden CD und 3FT dann bei verschiedenen Dosierungen und Zeiten verabreicht, wobei darauf geachtet wurde, dass immer die notwendigen Verifizierungen durchgeführt wurden, um die wirksamste Kombination der verabreichten Zeit-/Konzentrations-Parameter aufzufinden.
Die am meisten signifikanten Assay-Serien, die sich auf optimale Parameter-Kombinationen beziehen, fanden schließlich heraus, dass die Erreichung einer vollständigen Vernichtung der Tumorzellen und eines wirksamen Schutzes der normalen Zellen ausgiebig in den Beispielen 3 (qualitative Assays) und 4 (quantitative Assays) offenbart werden.
In dieser Weise wurden die Verfahrensschritte in der bevorzugten Ausführungsform abgeleitet, worin alle Tumorzellen vernichtet werden und die meisten proliferierenden normalen Zellen geschützt werden, wie oben in der Zusammenfassung der Erfindung (siehe auch 1) beschrieben wird.
Die Auswahl des kolonienbildenden Assays (der eine direkte Anzeige des klonogenen Potentials der Zellen zur Verfügung stellt) als operativer Assay anstatt anderer Assays (wie z. B. die Plattenzellzahl), der in der Messung der proliferativen Fähigkeit verwendet wird, ist nicht nur für die stringente Verifizierung der Induktion notwendig, sondern auch für die Umkehrbarkeit des differenzierenden Wachstumsarrest- "Zustandes" in normalen Zellen.
Insbesondere in Bezug auf den Vorbehandlungsschritt ist die korrespondierende Dauer von 24 Stunden, die in dem Schema von 1 gezeigt wird, etwas länger als die Zellzykluszeit der verwendeten C3H10T1/2-Zellen. Obwohl die in diesem Assay berichtete Cytochalasin D-Konzentration 400 nM beträgt, zeigten sich sogar Konzentrationen im Bereich von 50 nM – 1,6 μM als wirksam.
Betreffend den kombinierten Behandlungsschritt: Dieser wurde für 48 Stunden durchgeführt (die Zeit, die für die C3H10T1/2v-src/v-myc-Tumorzellen für die Vervollständigung von zwei Zellzyklen notwendig ist und zudem die minimale Zeit, die für das vollständige Zell-Nachbehandlungs-Abtöten mit dem Klasse B-Medikament allein notwendig ist).
Die Cytochalasin D-Konzentration wurde in Bezug auf die Vorbehandlung konstant gehalten. Die verabreichte 3FT-Konzentration betrug 40 μM, jedoch erwiesen sich auch Konzentrationen in einem Bereich von 10 – 800 μM als nützlich.
Betreffend den Nachbehandlungsschritt: der Waschschritt wurde für einen Zeitraum von 12 Stunden durchgeführt, der Zeit, die als Funktion (genauer, sie ist umgekehrt proportional zu) der katabolen Geschwindigkeit des Klasse B-Medikaments berechnet wurde.
Statt dessen betreffend die Proliferations-Wiederaufnahme der normalen Zellen, da diese per Definition variable ist, in dem spezifischen Fall eines Kolonie- bildenden Assays in vitro, wurde sie als die Zeit festgesetzt, die notwendig ist, um sichtbare Kolonien zu erhalten (diese variiert gemäß dem vorher gewählten Zelltyp).
In den Assay-Serien, die stattdessen darauf gerichtet waren, eine vollständige Vernichtung der Tumorzellen zu erhalten sowie den vollständigen Schutz der vielen normalen Zellen, ist sie die Zeit, die für eine korrekte Umbildung einer normalen Zell-Monoschicht und für das Auftreten von möglichen sichtbaren Zellfoci notwendig ist (d. h. mit einer Dimension von mindestens 2 mm) (siehe Beispiel 4).
In dieser Hinsicht, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erhalten, wurde eine Zeit – und sollte immer, auf der Basis der Synchronisation der Test-Kontrollgruppe berechnet. Die unterschiedliche Proliferations-Aufnahmezeit der Kontrollzellen sollte entsprechend berücksichtigt werden. Tatsächlich haben die letztgenannten Zellen eine kürzere Wiederaufnahmezeit in Bezug auf die behandelten Zellen, die nach dem Stillstand längere koloniebildende Zeiten in Bezug darauf gemäß den oben genannten Standards aufweisen.
Genauer gesagt, unter Berücksichtigung der Zeiten der Assay-Kontrollgruppe, beträgt eine solche Zeit in den Assays, die mit dem System der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, 7 bis 15 Tage. Insbesondere, wenn z. B. die Kontrollzellen (sowohl normale wie auch transformierte) eine siebentägige Nachbehandlungszeit haben, haben die mit Cytochalasin D behandelten Zellen einen 10-Tages-Zeitraum, usw.
Von den Daten her ist es ersichtlich, dass, während normale und transformierte Zellen gleichermaßen durch die 3FT-Behandlung getötet werden, dass die CD/3Ft-kombinierte Behandlung einen selektiven Index von mindestens dem 500fachen gegenüber transformierten Zellen aufzeigt: d. h. normale Zellen wurden mindestens 500fach resistenter gegenüber 3Ft-lethalen Wirkungen als Ergebnis des Schützens durch die CD-Verabreichung, wohingegen transformierte Zellen vollständig empfänglich verblieben.
Definition der Klasse A-Verbindung
Als Ergebnis der oben genannten Assays wurden, während genaue Indikationen in Bezug auf die gemeinsame Verwendung erhalten wurden, positive Indikationen gleichzeitig über die Eignung von Cytochalasin C und 3FT für die selektive Vernichtung von Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg erhalten.
Insbesondere CD als die Verbindung, die den schützenden "differenzierenden Zustand" und 3FT als das vernichtende Mittel. In diesem Zusammenhang wurde, um die relevanten äquivalenten Verbindungen zu verifizieren (hierin jeweils als Klasse A- und Klasse B-Verbindung definiert) in einem ersten Fall eine Assay-Serie durchgeführt, um zu verifizieren, welche Eigenschaften jeweils für die Fähigkeit der Induktion eines solchen Zustandes und zur Vernichtung der Tumorzellen darin verantwortlich waren.
In Bezug auf CD wurde zuerst hypothetisiert, dass die relevanten Eigenschaften des Zellsystems der vorliegenden Erfindung aus das Folgende zurückzuführen sind:

1. die Fähigkeit der Hemmung der Cytodierese (Zellteilung) von normalen Zellen;
2. die Umkehrbarkeit einer solchen Hemmung und
3. die Fähigkeit der Nicht-Hemmung der biologischen Wirkung einer zweiten Verbindung (hiernach als Klasse B-Verbindung oder Medikament bezeichnet).

Im Prinzip stellen die drei oben beschriebenen Eigenschaften die wesentlichen Eigenschaften dar, die jegliches Medikament aufzeigen muss, um in dem Schutz von normalen Zellen verwendet zu werden. Tatsächlich:

– die Medikamenten-induzierte Hemmung der Cytodierese (Zellteilung) aktiviert einen Kontrollpunkt, der zum Wachstumsstop in normalen Zellen, aber nicht in Tumorzellen mit einem unterbrochenen p53-Stoffwechselweg führt;
– der Medikamenten-induzierte Wachstumsstop muss vollständig umkehrbar sein, so dass normale Zellen die Proliferation wieder aufnehmen können und ihre qualitativen und quantitativen Funktionen durchführen können;
– sollte das Medikament auch den intrazellulären Transport des sekundären chemotherapeutischen Medikaments (d. h. der Klasse B-Verbindung) über eine akzeptable Grundmenge hinaus betreffen, dann muss die Tumorzelltötung durch das Klasse B-Medikament dementsprechend in der kombinierten Behandlung verringert werden.

Solche Hypothesen wurden in zwei Assay-Serien verifiziert, die in erster Linie auf die Verifikation der oben genannten Merkmale von CD gerichtet sind.
In Bezug auf die ersten Assay-Serien, die ausgiebig im Beispiel 5 beschrieben werden, wurden die ersten zwei Merkmale (Fähigkeit der reversiblen Hemmung der Cytodierese in normalen Zellen) untersucht.
Die dritte Eigenschaft wurde mit einer weiteren Assay-Serie verifiziert, und bestand insbesondere aus einem koloniebildenden Assay in einem System, das ausschließlich aus Tumorzellen gebildet wurde, worin die Wirkungen der Cytochalasin D-Verabreichung mit denen der Verabreichung von Cytochalasin B (CB) verglichen wurden.
Als Ergebnis eines solchen Assays, der ausgiebig in Beispiel 6 beschrieben wird, wird beobachtet, dass, während CB eindeutig mit 3FT-toxischen Wirkungen wechselwirkt, was einen bestimmten Grad an Überleben der Tumorzellen sicherstellt, dass CD keinerlei Überleben von solchen Zellen (siehe Tabelle 6) ermöglicht. Die 3FT-Verabreichung, die tatsächlich mit der CD-Verabreichung kombiniert wird und gemäß den Parametern der vollständigen und maximalen selektiven Vernichtung durchgeführt wird, bestimmt die vollständige Vernichtung der kultivierten Tumorzellen, wohingegen die CB-Verabreichung unter den gleichen Bedingungen lediglich eine teilweise Vernichtung bewirkt. Solch eine teilweise Vernichtung ist durch die oben genannte Wechselwirkung bedingt und nicht durch eine bestimmte Einstellung der oben genannten Parameter und ist dementsprechend nicht steuerbar. Als Konsequenz bestätigt ein solcher Assay nicht nur, dass die dritten oben genannten Eigenschaften auf CD zurückzuführen sind, sondern auch die Abwesenheit des besagten Merkmals in CB. Die korrespondierende Nichteignung von CB, eine selektive, vollständige und steuerbare Vernichtung zu erhalten, ist eine erste Beobachtung, die den Gedanken unterstützt, dass solch ein Merkmal in Verbindung mit den anderen zwei Merkmalen eine notwendige Bedingung für eine Verbindung ist, um in der Lage zu sein, einen differenzierenden Zustand zu induzieren.
Um weiter zu verifizieren, ob das Aufweisen besagter Eigenschaften eine notwendige und ausreichende Bedingung für eine Verbindung ist, um eine Klasse A-Verbindung zu sein, wurde eine anschließende Assay-Serie in der folgenden Reihenfolge durchgeführt.

– In einem ersten Fall, um zu verifizieren, dass die besagten Eigenschaften für einige Kandidatenverbindungen vorhanden sind, die aus denjenigen ausgewählt wurden, von denen bekannt ist, dass sie in der Lage sind, Multinukleation zu indizieren;
– danach, um die Eignung der positiven Verbindungen in den oben beschriebenen Verfahren zu verifizieren, in der Form, dass sie in der vollständigen Vernichtung der Tumorzellen und maximalem Schutz der normalen Zellen resultieren.

In diesem Zusammenhang wurden die gleichen Assay-Serien, die für CD durchgeführt wurden und in den Beispielen 5 und 6 beschrieben wurden, mit anderen Kandidatenverbindungen durchgeführt (siehe Beispiele 7 und 8). Insbesondere wurden Mitglieder der Latrunculine, der Jasplakinolide und der Chondramide untersucht. All die untersuchten Verbindungen und insbesondere Latrunculin B, Jasplakinolid, Chondramid B zeigen Ergebnisse, die in allem äquivalent zu denen von Cytochalasin D sind.
Insbesondere zeigen in dem Modellsystem Jasplakinolid und Chondramid eine extrem umkehrbare Wirkung in einem solchen Ausmaß, dass diese Substanzen in Tumorzellen mit der Polymerisation des Actincytoskeletts Wechselwirken, allerdings ohne jegliche stabile Cytodieresehemmung. Jedoch behindert diese Wirkung weder die Wirksamkeit der Klasse B-Verbindung auf die Tumorzellen, noch die Wirksamkeit der gleichen schützenden Wirkung davon auf normale Zellen.
Wenn einem tritierten Thymidin-Aufnahmeassay ausgesetzt, wie ausgiebig in Beispiel 8 gezeigt wird, zeigen diese alle die Fähigkeit der Nichthemmung der 3H-Thymidin-Aufnahme.
Diese Ergebnisse deuten an, dass positiv identifizierte Klasse A-Verbindungen nicht ausreichend mit der intrazellulären Aufnahme von Nukleosiden Wechselwirken, einschließlich des Nukleosidanalogons, das zur Klasse B gehört, wie es hierin definiert wird. Dieses Beispiel ist nicht dahingehend gemeint, die Eigenschaften der Klasse B-Verbindungen einzuschränken, sondern illustrativ dafür, wie eine Wechselwirkung durch eine Klasse A-Verbindung mit einem Klasse B-Medikament stark die Effizienz der Tumorzellvernichtung verringern kann.
Im Ergebnis zu besagten Assay-Serien wurden alle diese Verbindungen in dem System unter der Bedingung für die vollständige Vernichtung der Tumorzellen in Kultur untersucht.
Das positive Ergebnis besagter Assays, die mit den Assays korrespondieren, die intensiv in den Beispielen 3 und 7 offenbart werden, bestätigt auf der einen Seite die Eignung dieser Verbindungen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, auf der anderen Seite die oben erwähnten Eigenschaften als notwendige und ausreichende für eine Verbindung, um in der Lage zu sein, den "differenzierenden Zustand" zu induzieren und somit eine Klasse A-Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zu sein.
Chondramide, Jasplakinolide und Latrunculine haben sich daher als Klasse A-Verbindungen erwiesen, die für die gleichen Zeiten verwendet werden können, die für das Cytochalasin D offenbart sind sowie in einem Konzentrationsbereich von 1 nM bis 40 μM.
Ich Lichte dieser Tests wurden die CAP- und CACT-Werte, die verschiedenen Klasse A-Verbindungen zugeordnet werden, als der Konzentrationsbereich bestimmt, der den Cytodieresestop ergibt und ist innerhalb des besagten Konzentrationsbereiches der Wert der minimalen Konzentration, die notwendig ist, um diese Wirkung zu erhalten, was die bevorzugte Ausführungsform ausmacht. Diese Werte sind solche, die in der Zusammenfassung der Erfindung genannt werden.
Als Konsequenz all dieser Assays, aus der Analyse der spezifischen Eigenschaften der positiven Verbindungen könnte die Klasse A als eine funktionelle Klasse von Verbindungen definiert werden, die in der Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
In diesem Zusammenhang definiert ein positiver Ausgang einer Assay-Serie der Beispiele 7 und 8, wie er mit einer Kandidatenverbindung durchgeführt wird, diese automatisch als eine Klasse A-Verbindung.
Definition der Klasse B-Verbindung
Analog zu dem, was für die Klasse A-Verbindung gesagt wurde und insbesondere für Cytochalasin D, wurden die Eigenschaften, die die Wirkung von 3FT kennzeichnen, zuerst hypothetisch dargestellt und dann untersucht. Notwendige und ausreichende Merkmale zur Definition einer Verbindung als zur Klasse B gemäß der vorliegenden Erfindung zugehörig sind die folgenden Fähigkeiten:

– das Aufweisen einer cytotoxischen Wirkung gegenüber aktiv proliferierenden Zellen und
– das nicht-beeinträchtigen des prolieferierenden Potentials und der Überlebensfähigkeit von Interphasenzellen.

Besagte Merkmale sind tatsächlich korrekt für 3FT, so, wie sie aus den Assays resultieren, die im Beispiel 3 und 4 gezeigt werden.
Während viele Medikamente und Verbindungen bekannt sind, die wirksam replizierende Zellen töten, ist das wichtige Merkmal des Verrichtungsmittels, das erfolgreich in der Kombinationsbehandlung, wie sie hierin definiert ist, verwendet wird, dass es keinerlei nachteilige Aktivität auf Interphasenzellen aufweist. Solch eine Eigenschaft ist wichtig, da sie direkt die Effizienz des normalen Zellschutzes durch Klasse A-Verbindungen beeinflusst.
Die gleichen Eigenschaften wurden in Kandidatenverbindungen untersucht, die wiederum selbst den Assays von Beispiel 3 und 4 anstatt 3FT ausgesetzt wurden.
Von besonderer Bedeutung sind die Assays, die mit zwei Medikamenten durchgeführt wurden, die üblicherweise in der Chemotherapie verwendet werden: das Ara C (a.k.a. Cytarabin) oder das 2-Chlordeoxyadenosin (2CIAd, o.k.a. Cladribin), die für die Wirkung auf hoch-proliferierende Zellen bekannt sind, wie ausgiebig in Beispiel 9 beschrieben wird.
Die relevante Aussage ist, dass in beiden Fällen (Ara C und 2CIAd) eine drastische Verringerung, wenn nicht insgesamt die Abwesenheit der Transformationsfoci und die gleichzeitige Ausbildung der normalen Monoschicht beobachtet wurde (siehe Beispiel 9).
Jedoch bildete sich in dem Fall der kombinierten Behandlung mit dem 2CIAd die normale Zellmonoschicht langsamer wieder (eine 14tägige Proliferations-Wiederaufnahmezeit war gegenüber der ungefähr 7 Tage dauernden Zeit des Verfahrens, das mit Ara C oder 3FT durchgeführt wurde, notwendig), was nahezu die Wiederaufnahmezeit in Bezug auf die anderen beiden untersuchten Medikamente verdoppelt.
Zudem haben solche Monoschicht-Zellen eine Alterungserscheinung und die Monoschicht-Sättigungsdichte (Anzahl von Zellen pro Oberflächeneinheit) ist deutlich geringer in Bezug auf die anderen zwei Fälle.
Diese Daten zeigen in Bezug auf die Zeit der Proliferations-Wiederaufnahmephase und die Morphologie der normalen Zellen nach der gesamten Behandlung die Existenz einer bestimmten toxischen Wirkung des 2CIAd auch auf normale Zellen in der kombinierten Behandlung.
Daher wurde eine weitere Assay-Serie ausgeführt, um die Abwesenheit der Cytotoxizität auf Zellen in der intermitotischen Phase der Kandidatenverbindungen zu verifizieren, was ausgiebig in Beispiel 10 beschrieben wurde.
Solche Assays waren darauf gerichtet, die antimetabolische Toxizität auf Zellen durch Konfluenz oder Serumentzug zu analysieren, die in der G0/G1-Phase still stehen (das Zellzyklusstadium, bei welchem normale Zellen durch die Verabreichung von Klasse A-Verbindungen anhalten). Durch Untersuchung der Anzahl der überlebenden Zellen und der Anzahl von solchen, die auch in der Lage sind, den Zyklus wieder aufzunehmen, wurden die Ergebnisse der Assays des Beispiels 9 bestätigt. Tatsächlich zeigten sich auch in diesem Fall von den 5 verwendeten Antimetaboliten diejenigen 3, die in dem in Beispiel 9 offenbarten Test positiv waren (3FT, Ara C, 6ThG), als vollständig funktionell.
Als einzige resultierten 2CIAd, das Cytotoxizitätsprobleme in dem vorausgegangenen Test gemäß Beispiel 9 bewirkte und Doxorubicin, von dem angenommen wurde, dass es potenziell funktional gemäß dem Stand der Technik ist, statt dessen in einer vollständigen Hemmung des Eingangs in die S-Phase. Zudem zeigte Doxorubicin auch eine starke cytotoxische Wirkung.
Somit werden als Ergebnis der oben genannten Assays Ara C und 6ThG als Klasse B-Verbindungen angesehen, wohingegen 2CIAd und Doxorubicin, bedingt durch ihre Toxizität, verworfen wurden.
Zusätzlich zu den im Ergebnis besagten Assays wurden die oben erwähnten Eigenschaften als ausreichende und notwendige Bedingung für eine Verbindung bestätigt, um als Klasse B-Verbindung angesehen zu werden.
Im Allgemeinen sind alle Verbindungen mit einer Toxizität, die im Wesentlichen nicht die Zellvitalität und das Proliferationspotential von Zellen in der intermitotischen Phase sowie die zelltypische spezifische Physiologie verändern, tatsächlich Klasse B-Verbindungen.
In diesem Zusammenhang definiert ein positiver Ausgang von Assay-Serien, wie sie in den Beispielen 9 und 10 beschrieben werden, mit einer Kandidatenverbindung, diese automatisch als eine Klasse B-Verbindung.
Im Licht dieser Assays, um die Validität der verwendeten Konzentrationen zu bestimmen und zudem die Möglichkeit der Erhöhung der letzteren und/oder der Verabreichungszeit der Klasse B-Medikamente, wurde eine Assay-Serie durchgeführt, die ausgiebig in Beispiel 11 beschrieben wurde, worin die Konsequenzen von Klasse B-Medikamenten bei verschiedenen Konzentrationen bis zu einer 10-20fachen Erhöhung davon untersucht wurden.
Natürlich würde dieses einen weiteren Vorteil ausmachen, der sich aus der Anwendung der Verwendung der vorliegenden Erfindung ergibt, da es offensichtlich ist, dass die meisten Tumore sicherlich durch die Behandlungen mit chemotherapeutischen Medikamenten-Konzentrationen vernichtet werden würden, die zehnfach in Bezug auf die tatsächlich verwendeten erhöht sind. Bis heute bleibt dieses nicht durchführbar, weil die verabreichbare chemotherapeutische Dosierung durch die Toxizität dieser eingeschränkt ist.
Das in Beispiel 11 beschriebene Ergebnis der Assay-Serien ist, dass Trifluorthymidin bei 800 μM anfängt, toxisch zu sein, wohingegen die Ara C-Toxizität zwischen 200 und 400 μM beginnt. Natürlich sind zwei wirklich toxische Medikamente bereits von der Klasse B ausgenommen (2CIAd und Doxorubicin), die als positive Kontrolle verwendet wurden, und eine starke Toxizität bereits bei minimalen funktionellen Konzentrationen aufzeigen.
Aus diesen Ergebnissen kann umso besser, wenn sie mit solchen verglichen werden, die mit den zwei wirklich toxischen und sowieso nicht Klasse B-Medikamenten verwandt sind, gesagt werden, dass die chemotherapeutische Medikamenten-Konzentration, bedingt durch die Chemoprotektion, die selektiv für normale Zellen durch die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird, bis auf das 10-20fache erhöht werden kann. Obwohl eine bestimmte Toxizität nach dem Erhöhen der Konzentration mit den Verbindungen nachgewiesen wurde, die in der Klasse B, wie sie definiert ist, mit umfasst sind, bleibt diese Toxizität bei sehr geringen Mengen im Vergleich zu denen von 2CIAd und Doxorubicin.
Für Ara C allein als ein Klasse B-Medikament beginnt eine relevante Toxizität bei einer 6fachen Dosierung.
Übertragung der Validität der erhaltenen Ergebnisse auf das menschliche System
Wie oben berichtet, wurde das Modellsystem ausgewählt, um die in vivo- und die ex vivo-Bedingungen so zuverlässig wie möglich zu reproduzieren. Als eine weitere Bestätigung von deren Anwendbarkeit auf die pathologische Situation in dem menschlichen System in vivo, wurde die Assay-Serie, die intensiv in Beispiel 12 beschrieben wird, durchgeführt.
Der relevante Ausgang bestätigt, dass die Verabreichung der Klasse A-Verbindungen auf menschliche Tumor- (Lipari- Glioblastomas, T97, U973) und normale (LH- und DH-Fibroblasten) Zellen die gleichen Wirkungen bestimmt, die jeweils für die Modellsystemzellen CH310T1/2v-src/v-myc und C3H10T1/2 aufgenommen wurden.
Somit wurde die vollständige Validität der kombinierten Verwendung der Medikamente der beiden Klassen, wie sie oben offenbart werden, für das menschliche System vollständig nachgewiesen.
Definition des Verwendung der vorliegenden Erfindung
Im Hinblick auf die Ergebnisse, die als Ausgang der Assays oben erhalten wurden, wurden letztendlich die Klasse A-Verbindungen (insbesondere Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chrondramin B und Latrunculin B) und Klasse B-Verbindungen (insbesondere Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin) dann bei verschiedenen Dosierungen und Zeiten zu den Zellsystemen der vorliegenden Erfindung verabreicht, wobei darauf geachtet wurde, dass immer die notwendigen Verifikationen durchgeführt wurden, um die funktionelle und wirksame Kombination der verabreichten Zeit-/Konzentrations-Parameter aufzufinden. Es wurden daher Verwendungen einschließlich nur der kombinierten Behandlung und der kombinierten Behandlung zusammen mit Vorbehandlung und/oder Nachbehandlung, wie sie in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben werden, durchgeführt und die relevanten Parameterwerte abgeleitet.
Des Weiteren wurden entsprechend die Merkmale der Verwendungen, Kits und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, wie sie in der Zusammenfassung der Erfindung oben dargestellt werden, abgeleitet.
Eine hierin zuvor gemachte allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung wurde zur Verfügung gestellt. Hiernach wird mit Hilfe der folgenden Beispiele eine detailliertere Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen davon gegeben, die darauf gerichtet ist, die Aufgaben, Merkmale, Vorteile und Operationsmodi davon besser zu verstehen.
Beispiele
Beispiel 1
Der Binukleations-/Multinukleationszustand als Ergebnis eines inaktivierten p53-Stoffwechselweges Um zu verifizieren, welche molekularen Faktoren eine Multinukleation in Tumorzellen bewirken, und um dadurch Tumorzellen und Tumorformen zu identifizieren, auf die ein Binukleations-/Multinukleations-differenzierender Zustand anwendbar ist, wurde eine Assay-Serie ausgeführt, die darauf gerichtet ist, solche Formen zu verifizieren, die auf den Verlust eines oder mehrerer Gene zurückzuführen sind, die Zellfunktionen regulieren. Solche Assays wurden insbesondere mit Zellen ausgeführt, die aus Knockout-Mäusen für die Rb- (Retinoblastom), p21- oder p53-Funktion abgeleitet sind. In jedem Zelltyp existiert die relevante Knockout-Funktion nicht, daher sind daraus erhaltene Daten automatisch auf den Verlust der damit verbundenen Funktion zurückzuführen.
Jede Zellkultur wurde auf 35 mm-Platten bei einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/Platte unter den folgenden Bedingungen ausplattiert, die hierin als Standardbedingungen angesehen werden. Zellen wurden auf einem Plastiksubstrat (Falcon-BD) in einem Kulturmedium, das aus Dulbecco's modified Eagle's Medium hergestellt wurde, das mit 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 10 % fötalem Kälberserum supplementiert worden war, bei 37°C mit 5 % CO₂ und 90 % Luftfeuchtigkeit wachsen gelassen. Die folgenden Assays wurden daher durchgeführt.
In einer ersten Zeit von 12 Stunden c.ca (ein Schritt, der auch für die anderen, hierin berichteten Assays üblich ist) wurden Zellen aufwachsen gelassen, aber in einer Dichte, die deren Proliferation erlaubt, wodurch sichergestellt wird, dass die höchste Zuverlässigkeit des Assays resultiert, der anderweitig durch Zellen verändert werden könnte, die aus Gründen stillstehen, die nicht auf die Verbindungsverabreichung zurückzuführen sind. Nach diesem ersten Schritt wurden die folgenden Verabreichungen durchgeführt.
In einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM Citochalasin D für 72 h (T0 – T72) an Maus-Embryofibroblasten (MEF) – Zellen verabreicht, bei denen jeweils die Rb oder p21-Funktionen ausgeschaltet waren.
In einer zweiten Assay-Serie für 72 h (T0 – T72) wurde dieses MEF und dermalen Fibroblasten (MDF) als Wildtyp-Kontrollzellen verabreicht.
In einer dritten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) an Balb C (10/1) (für die p53-Funktion abgeschaltete Zellen) bei 32 °C und 37 °C verabreicht.
In einer vierten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) an Balb C (10/1)p53Va15 bei 32 °C und 37 °C verabreicht (Knockout-Zellen für die p53-Funktion, wobei eine temperaturempfindliche p53-Mutante eingeführt wurde).
Unbehandelte Kontrollzellen zeigen weniger als 2 % binukleare (2N) oder multinukleare (>3N)-Zellen.
Die Verabreichung wurde ausschließlich auf proliferierenden Zellen durchgeführt. Nach der Behandlung wurden die Zellen prozessiert und analysiert.
Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
In den Zeilen 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6, 7 und 8 werden jeweils die Ergebnisse der ersten, zweiten, dritten und vierten Assay-Serien gezeigt. Insbesondere zeigen die Spalten 2, 3, 4 und 5 Prozentanteile an mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen Zellen, die als Ergebnis besagter Assays nachgewiesen wurden. In Spalte 1 werden stattdessen die verwendeten Zelltypen und die relevanten Assay-Temperaturen gezeigt.
Die Ergebnisse aller dieser Assays zeigen, dass nach Verabreichung von CD an sowohl Rb^–/– und p21^–/– Zellen sowie an MEF- und MDF-Kontrollen, die Zellen in einem binuklea ren Zustand (siehe Zeile –4) anhalten, was nachweist, dass die Abwesenheit der Rboder p21-Funktionen nicht ausreicht, um eine Multinukleation nach der Verabreichung von Cytochalasin D zu induzieren.
Dieses impliziert, dass die Rb- und p21-Gene, die als wichtige Faktoren bekannt sind, die eine DNA-Endoreduplikation nach Hemmung der Mitose unterdrücken, nicht für die Verhinderung der Multinukleation nach der Verabreichung von CD und somit die Cytodieresehemmung verantwortlich sind.
Mit Balb/c(10)1-Zellen erhaltene Ergebnisse zeigen stattdessen die Bedeutung der p53-Funktion(en) in der Multinukleations-Zustandsbestimmung nach Cytokineseblockade durch CD (siehe insbesondere die Gesamtzahl der Zellen mit einer Nukleianzahl von mehr als 2 in den Zeilen 5 und 6).
Die Tatsache, dass der Verlust von solch einer Funktion ausreichend zur Induzierung der Multinukleation in Zellen ist, wird auch durch den Assay bestätigt, der mit BalbC(10/1) durchgeführt wird, in die eine ts (temperaturempfindliche) – p53-Mutante eingeführt wurde, so dass diese Zellen ein inaktives p53-Protein (p53 inaktive Funktion) bei 37 °C aufzeigen und ein aktives p53-Protein (p53 aktive Funktion) bei 32 °C aufzeigen.
Die Ergebnisse der besagten, in den Zeilen 7 und 8 gezeigten Assays bestätigen, dass die Multinukleation nach der Hemmung der Cytokinese nur in Zellen mit inaktiver p53-Funktion beobachtet wird (siehe Zeile 8 im Vergleich zu Zeile 7).
Beispiel 2
Verifikation der Übertragbarkeit der p53-bezogenen Daten auf das menschliche System Um zu bestätigen, dass p53-Funktion(en) der "Schalter" ist, der den CD-induzierten Multinukleationszustand in Zellen reguliert (an, wenn inaktiv und aus, wenn aktiv), wurden die gleichen Assays, die in Beispiel 1 beschrieben werden, mit menschlichen Lungen-Fibroblasten (LHF) durchgeführt, die mit 2 Papillomavirus-Onkogenen (E6 und E7) transfiziert worden waren. E6 ist tatsächlich ein Onkogen, dessen Produkt in der Lage ist, p53 abzufangen und zu hemmen, wohingegen E7 ein anderes Onkogen ist, dessen Produkt in der Lage ist, die Rb-Funktion aufzuheben. Diese Assay-Serie ermöglicht tatsächlich entsprechend den Wachstumsstop im binuklearen Zustand durch CD auf menschliche Zellen zu übertragen, als Bedingt durch einen aktiven p53-Stoffwechselweg in normalen Zellen und bestätigt zur gleichen Zeit die Nichteinmischung von Rb darin.
Nach der ersten Zeit von 12 h c.ca (siehe oben) wurden insbesondere die folgenden Assays durchgeführt.
In einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) oder 0,11 % DMSO für 72 h (T0 – T72) als Kontrolle dafür an menschliche Kontroll-Lungenfibroblasten (HF LXSN) verabreicht.
In einer zweiten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) und 0,11 % DMSO für 72 h (T0 – T72) als Kontrolle dafür an menschliche Lungenfibroblasten verabreicht, die mit E6 transformiert sind (HF E6).
In einer dritten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) und 0,11 % DMSO für 72 h (T0 – T72) als Kontrolle dafür an menschliche Lungenfibroblasten verabreicht, die mit E7 transformiert sind (HF E7).
Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
In den Zeilen 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6 werden jeweils die Ergebnisse der ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt. In den Spalten 3, 4, 5 und 6 werden Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen Zellen als Ergebnis der besagten Assays gezeigt. In Spalte 1 und 2 werden stattdessen das verabreichte Medikament und die untersuchte Zelle gezeigt.
Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass während in der Gegenwart von CD die E6-transformierten Fibroblasten multinuklear sind (siehe Zeile 4), die E7-Fibroblasten dieses nicht sind (siehe Zeile 6), was die Daten des vorangegangenen Beispiels 1 bestätigt, die mit murinen Zellen erhalten wurden.
Beispiel 3
Schutz normaler Zellen durch kombinierte CD/3FT-Verwendung: eine qualitative Beurteilung
Um die pharmakologischen Wirkungen der kombinierten CD/3FT-Verwendung zu verifizieren, wurde die Bildung transformierter Foci in einer gemischten Kultur von normalen und Tumorzellen untersucht, wobei das System C3H10T1/2 als normale Zellen und C3H10T1/2v-src/v-myc oder L-Zellen als Tumorzellen umfasst (um Daten zu erhalten, die nicht auf ein spezifisches Zellsystem eingeschränkt sind).
In jedem der Assays wurden die oben erwähnten Zellen in 60 mm Platten ausplattiert. Insbesondere wurden C3H10T1/2 bei einer Dichte von 10⁴ Zellen pro Platte ausplattiert, C3H10T1/2v-src/v-myc bei einer Dichte von 5 × 10²-Zellen pro Platte und L-Zellen bei einer Dichte von 5 × 10² Zellen pro Platte.
Solch ein Unterschied in der Dichte von normalen und Tumorzellen reproduziert tatsächlich eine in vivo-neoplastische pathologische Situation, in der Tumorzellen effektiv weniger als normale sind, und ermöglicht es auch, diskrete und quantifizierbare Transformationsregionen, bedingt durch unkontrolliertes Tumorzellwachstum, zu erhalten. Kulturbedingungen sind die Standardbedingungen von Beispiel 1.
Nach der ersten Zeit von 12 Stunden c.ca (siehe Beispiel 1 oben) wurden die folgenden Assays mit den zwei Zellsystemen durchgeführt, da eine C3H10T1/2 – C3H10T1/2v-src/v-myc und das andere C3H10T1/2 – L-Zellen. Zuerst wurde die folgende Assayserie mit C3H10T1/2 – C3H10T1/2v-src/v-myc – Zellsystemen durchgeführt.
In einer ersten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400 nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an eine Kultur von C3H10T1/2 allein verabreicht.
In einer zweiten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400 nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an eine Kultur C3H10T1/2v-src/v-myc allein verabreicht.
In einer dritten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400 nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an eine gemischte Kultur aus C3H10T1/2 und C3H10T1/2v-src/v-myc verabreicht.
Danach wurden die folgenden weiteren Assay-Serien mit dem C3H10T1/2 – L-Zellsystem durchgeführt.
In einer vierten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400 nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT zu einer Kultur von C3H10T1/2 allein verabreicht.
In einer fünften Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400 nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an eine Kultur von L-Zellen allein verabreicht.
In einer sechsten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400 nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT zu einer gemischten Kultur von C3H10T1/2 und L-Zellen verabreicht.
Die Verabreichungen von nur CD und 3FT wagen auf die Messung der Wirkungen davon auf besagte Zellsysteme gerichtet, die kombinierte CD/3FT-Verabreichung auf die Messung der Wirkungen der kombinierten CD/3FT-Verwendung, während die Verabreichung von DMSO als Kontrolle durchgeführt wurde.
Die Behandlungszeitverkürzung von 72 auf 24 h in Bezug auf die Assays, die mit primären Zellen der Beispiele 1 und 2 durchgeführt wurde, ist durch die Tatsache bedingt, dass letztere eine längere Zellzykluszeit in Bezug auf die von C3H10T1/2 haben, wodurch es notwendig war, jeglichen möglichen Zweifel zu vermeiden, der sich auf die binuklearen Formen bezieht, die nach CD-Behandlung zu finden sind.
Nach jeder Behandlung wurden Zellen in Kultur für einen Zeitraum aufbewahrt, der zum Nachweis der Foci-Bildung notwendig ist; die einzelnen experimentellen Gruppen – z. B. die unbehandelte (-/-) und die nur mit CD behandelte (CD/-) wurden zur gleichen Zeit untersucht.
An dem Ende von jedem Assay wurden die Zellen 2 × mit PBS gewaschen und 2 × mit 5 % Trichloressigsäure bei 4 °C für 15 Minuten fixiert, 2 × mit 70 % Ethanol gewaschen und mit 5 % Giemsa-Lösung für 30 Minuten gefärbt, um eindeutig die Transformations-Foci herauszuheben und die normale Zellmonoschicht sichtbar zu machen, wie zuvor beschrieben wurde (17). Die relevanten Ergebnisse werden jeweils in den Abschnitten A und B der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
In Abschnitt A werden die Ergebnisse des Assays gezeigt, der mit dem C3H10T1/2 – C3H10T1/2v-src/v-myc – Zellsystem durchgeführt wurde. Insbesondere in den Zeilen 1, 2 und 3 werden jeweils die Ergebnisse der ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt.
In Abschnitt B werden die Ergebnisse des Assays gezeigt, der mit dem C3H10T1/2 – L-Zellsystem durchgeführt wurde. Insbesondere in den Zeilen 4, 5 und 6 werden die Ergebnisse der vierten, fünften und sechsten Assay-Serien gezeigt.
In den Spalten 2, 3, 4 und 5 werden die Ergebnisse der Behandlung jeweils nur mit Trägermitteln (DMSO für CD und H₂O für 3FT), das CD allein, das 3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte 1 wird dort die untersuchte Zelle gezeigt.
Die relevanten erhaltenen Werte, die als Prozentanteile von Behandelten in Bezug auf Unbehandelte ausgedrückt sind, identifizieren die Anzahl der Transformations-Foci, die nach dem Assay nachgewiesen werden. Die Definition "konfluent" zeigt eine vollständig ausgebildete Monoschicht in der Platte an. Jeder Prozentanteilswert wurde aus den Durchschnittsdaten berechnet, die für Duplikatplatten bestimmt wurden.
Die durch diese Serien von Experimenten mit normalen und Tumorzellen erhaltenen Ergebnisse zeigen eine selektive, schützende Wirkung von CD auf normale Zellen, die mit einer vollständigen und selektiven Vernichtungswirkung von 3FT auf Tumorzellen keinhergeht.
Insbesondere in der Tatsache in der Abwesenheit einer jeglichen Behandlung werden normale Zellen in beiden Systemen konfluent unter Ausbildung einer Monoschicht, wohingegen die Tumorzellen, eine bestimmte Anzahl von Foci bilden, (Wert "100" wird als Referenzwert verwendet), wie in Spalte 2 gezeigt wird.
Wenn Cytochalasin D während der gesamten Behandlung verabreicht wird (24 h Vorbehandlung, plus 48 h kombinierte Behandlung, plus 12 h Waschen, bis zu einer Gesamtheit von 84 h), wird nur eine kleine Verringerung des Tumorzell-verwandten Werts in Bezug auf die Kontrolle am Ende der Behandlung nachgewiesen (siehe Spalte 3). Diese Verringerung wird in sowohl in den zwei Tumorzell-Monokulturen (Zeilen 2 und 5) wie auch in den zwei gemischten Kulturen (Zeilen 3 und 6) nachgewiesen und ist durch den multinuklearen Zellzustand bedingt, welcher auch eine schwierigere Wiederaufnahme der Zellproliferation bewirkt.
Wenn nur 3FT verabreicht wird, wird offensichtlich der vollständige Tod beider Zelltypen nachgewiesen (siehe Spalte 4).
Nur in dem Falle einer Durchführung einer kombinierten Behandlung von CD und 3FT, insbesondere unter Befolgung der oben beschriebenen Schritte (Spalte 5) wird nach einer 7-tägigen Zellproliferations-Wiederaufnahmephase ein vollständiger und selektiver Schutz durch CD von normalen Zellen, die eine konfluente Zellmonoschicht ausbilden, im Gegensatz zu einer vollständigen und selektiven Vernichtung von Tumorzellen erhalten (siehe Spalte 5).
Beispiel 4
Schutz von normalen Zellen durch die Verwendung von kombiniertem CD/3FT: eine quantitative Beurteilung
Um die Wirkungen der kombinierten CD/3FT-Verwendung des oben genannten Beispiels 3 zu quantifizieren, wurden die ersten, zweiten und dritten Assay-Serien, die im Beispiel 4 beschrieben wurden, mit Monokulturen bei einer Zelldichte durchgeführt, die zählbare Kolonien erlaubt.
Die Kulturbedingungen, Verbindungskonzentrationen und Behandlungen sind die gleichen, wie sie im Beispiel 3 beschrieben werden, mit der Ausnahme des verwendeten Zellsystems; für die erste Assay-Serie eine Monokultur von C3H10T1/2-Zellen bei klonalen Dichten von 1 × 10³, 5 × 10³ und 1 × 10⁴, für die zweiten Assay-Serien eine Monokultur von C3H10T1/2v-src/v-myc-Zellen bei den klonalen Dichten von 5 × 10², 1 × 10³ und 5 × 10³, und für die dritte Assay-Serie eine Monokultur von L-Zellen bei klonalen Dichten von 5 × 10², 1 × 10³ und 5 × 10³.
Nach jeder Verabreichung wurden die Zellen 2 × mit PBS gewaschen und für die notwendige Zeit zur Kolonieausbildung kultiviert (wie in Beispiel 2, die einzelnen Testgruppen wurden gleichzeitig fixiert) und dann wie im Beispiel 3 beschrieben prozessiert.
Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
In Zeile 1 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien, wie sie mit C3H10T1/2-Monokultur durchgeführt werden, bei klonalen Dichten von 1 × 10³ (Unterzeile a), 5 × 10³ (Unterzeile b) und 1 × 10⁴ (Unterzeile c) gezeigt. In Zeile 2 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien, wie sie mit C3H10T1/2v-src/v-myc-Monokultur durchgeführt werden, bei klonalen Dichten von 5 × 10² (Unterzeile a), 1 × 10³ (Unterzeile b) und 5 × 10³ (Unterzeile c) gezeigt.
In Zeile 3 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien gezeigt, wie sie mit L-Zellmonokulturen durchgeführt wurden, bei den klonalen Dichten von 5 × 10² (Unterzeile a), 1 × 10³ (Unterzeile b) und 5 × 10³ (Unterzeile c) gezeigt.
In Spalten 2, 3, 4 und 5 werden die Ergebnisse der Behandlung jeweils mit Trägermittel allein (DMSO für CD und H₂O für 3FT), das CD allein, das 3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte 1 werden stattdessen die untersuchten Zellen und relevanten Dichten gezeigt.
Die in Tabelle 4 gezeigten erhaltenen relevanten Werte korrespondieren mit der Anzahl der Kolonien, die nach dem Assay nachgewiesen wurden. Die Definition "konfluent" zeigt eine vollständige Zellmonoschicht in der Platte an. Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde jeder Wert von den mittleren Daten berechnet, die sich aus zwei Doppelproben ergeben.
Die Ergebnisse dieser Assay-Serien bestätigen den durch die Assays von Beispiel 3(2) gezeigten Schutz und erlauben zudem, diesen zulässig zu quantifizieren.
Insbesondere in den Fällen, in denen in den Zellen erlaubt wird bei Verabreichung von nur DMSO und H₂O für einen Zeitraum zu proliferieren, der dem Behandlungszeitraum von Beispiel 2 gleicht (84 Stunden), ergeben beide normale und Tumorzellen konfluente Kulturen bei den zwei größeren anfänglichen Dichten und diskrete einzelne Kolonien bei der geringeren Dichte (Spalte 3, Kontrolldaten).
Wenn stattdessen CD allein (Spalte 4), 3FT allein (Spalte 5) oder beide (Spalte 6) zu jeder Zellkultur bei der geringeren Anfangsdichte verabreicht wurden, was für das klonogene Zellpotenzial Indikativ ist, dann wurden die folgenden Werte erhalten.
Für C3H10T1/2 resultiert die Behandlung mit CD in einer Verringerung des Wertes von 76 auf 49, was signifikant für eine bestimmte toxische Wirkung ist, die Behandlung mit 3FT, den vorausgesagten Wert 0 und die kombinierte Behandlung resultiert letztendlich in einem Wert 19, welcher stattdessen signifikant für den vorgekommenen Schutz ist.
Für C3H10T1/2 v-src/v-myc resultiert die Behandlung mit CD in einer Verringerung in dem Wert von 86 auf 18, das signifikant für eine CD-toxische Wirkung auf Tumorzellen ist, die stärker ist als auf normale Zellen, wobei die Behandlung mit 3FT der vorausgesagten Wert 0 ist und die kombinierte Behandlung resultiert dieses Mal in dem Wert 0, welcher signifikant für die vollständige Abwesenheit schützender Wirkungen einer solchen Behandlung für diese Art von Tumorzellen ist.
Für L-Zellen resultiert die Behandlung mit CD in einer Verringerung des Wertes von 88 auf 55, was signifikant für eine CD-toxische Wirkung auf Tumorzellen ist, die stärker ist als auf normale Zellen, aber geringer als auf C3H10T1/2 v-src/v-myc-Tumorzellen, wobei die Behandlung mit 3FT den angenommenen Wert 0 hat, und die kombinierte Behandlung auch in diesem Fall in dem Wert 0 resultiert, was signifikant für die vollständi ge Abwesenheit schützender Wirkungen einer solchen Behandlung auf diese Tumorzelltypen ist.
Diese Daten werden auch durch die Assays bestätigt und validiert, die mit höheren ursprünglichen Zelldichten durchgeführt werden, sogar wenn mit solchen hohen Werten angefangen wird, ist die Anzahl der nach der kombinierten Behandlung erhaltenen Tumorzell-Foci signifikanter Weise immer 0.
Durch den Vergleich solcher Werte, die getrennt durch quantitative Messungen in verschiedenen Systemen erhalten wurden, konnte ein Selektivitätsindex des chemotherapeutischen Mittels abgeschätzt werden. Insbesondere, wenn allein verwendet, erwies sich das chemotherapeutische Mittel als letal für sowohl normale wie auch Tumorzellen, wohingegen, wenn es mit CD kombiniert war, insbesondere gemäß dem hierzu beschriebenen Protokoll, 3FT in einer mindestens 500 – 1000-fach wirksameren Tötung der Tumorzellen resultierte.
Letztendlich jedoch zeigen die oben genannten Ergebnisse weiterhin, dass 3FT, während es cytotoxische Wirkungen auf proliferierende Tumorzellen hat, keinerlei toxische Wirkung auf abgestoppte normale Zellen hat, da nach dem Unterbrechen der kombinierten Behandlung die letzteren in der Lage sind, zu proliferieren bis sie eine konfluente Monoschicht ausbilden.
Beispiel 5
Hemmung der Cytodierese und anschließende DNA-Replikation in normalen Zellen durch Cytochalasin D und die Umkehrbarkeit davon
Um die Fähigkeit von Cytochalasin D zu verifizieren, die Cytodierese und anschließende Phasen des Zellzyklus in normalen Zellen zu hemmen, wurde eine Serie von koloniebildenden Assays mit C3H10T1/2 und C3H10T1/2/v-src/myc durchgeführt, worin die Hemmung der DNA-Synthese durch Bromdeoxyuridin (BrdU)-Aufnahme nachgewiesen wurde.
Jede Zellkultur wurde auf 35 mm Platten bei einer Dichte von 10 × 10⁴ Zellen/Platte unter den Standardbedingungen, die in Beispiel 1 beschrieben werden, ausplattiert. Nach der ersten Zeit von 12 Stunden c.ca (siehe Beispiel 1 oben) wurden die folgenden Assays durchgeführt.
In einer ersten Assay-Serie wurde CD für 48 h (T0 – T48) und auch BrdU in den letzten 24 h (T24 – 48) zum Nachweis des Prozentanteils der Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen (hierin als %S bezeichnet) jeweils an C3H10T1/2 und C3H10T1/2/v-src/v-myc verabreicht.
In einer zweiten Assay-Serie wurde CD für 48 h (T0 – T48) gefolgt durch eine 24 h Ruhephase zur Ermöglichung einer Medikamenten-Katabolyse und dann BrdU für weitere 24 h (T72 – 96) zum Nachweis des %S an C3H10T1/2 allein verabreicht.
In einer Kontroll-Assay-Serie davon wurde nur BrdU und 0,11 % DMSO an C3H10T1/2- und an C3H10T1/2/v-src-/v-myc-Zellen für 24 h (T0 – T24) als eine Kontrolle der Proliferationsphase verabreicht.
In jedem der oben genannten Assays waren die CD- und BrdU-Konzentrationen die gleichen, nämlich jeweils 400 nM und 20 nM. Die Verabreichung wurde nur auf proliferierenden Zellen durchgeführt. Die gleichzeitige Messung der BrdU-Aufnahme und des %S sicherte die höchste Stringenz der Ergebnisse der DNA-Replikation. Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen, tri/tetranuklearen und >4 nuklearen resultierenden Zellen wurden auch gemessen. Nach der Behandlung wurden die Zellen prozessiert und wie in Referenz 18 berichtet, analysiert.
Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
In den Zeilen 3 und 4 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien gezeigt. In Zeile 5 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien gezeigt. In den Zeilen 1 und 2 werden die Ergebnisse der Kontroll-Assay-Serien gezeigt.
In Spalte 1 werden die untersuchten Zellen und die relevante Behandlung einschließlich der Verabreichungszeit in Stunden gezeigt.
In den Spalten 2, 3 und 4 werden die gesamte Nukleianzahl für jeden Assay, die Anzahl der Nuklei mit aufgenommenem BrdU (die damit DNA synthetisiert haben) in jedem Assay, der Prozentanteil von Zellen mit synthetisierter DNA in jedem Assay (die Daten sind direkt aus den vorangegangenen zwei Spalten abgeleitet) gezeigt. In den Spalten 5, 6, 7 und 8 werden die Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4 nuklearen Zellen, die als Ergebnis besagter Assays nachgewiesen wurden, gezeigt. Auf der Basis der oben genannten Ergebnisse können die folgenden Überlegungen gemacht werden.
Die in den Zeilen 3 und 4 berichteten Assay-Ergebnisse %S zeigen einen geringen Prozentanteil an normalen Zellen, die in die S-Phase (23 %) übergehen im Gegensatz zu einem hohen Prozentanteil (88 %) der transformierten nach der gleichen Behandlung (siehe Spalte 4).
Diese Daten korrespondieren mit den Normal/Tumor-%S-Verhältnissen nach einer Behandlung mit CD oder dem gesamten Vektor, welcher tatsächlich jeweils 1:4 (23:97) und 1:1,1 (88:99) sind und durch nukleationsbezogene Daten bestätigt werden, die in den Spalten 4 und 7 der Tabelle gezeigt werden. Für normale und Tumorzellen können tatsächlich jeweils 98 % und 97 % mononukleare Zellen nach Kontroll-Assays (siehe Zeilen 1 und 2) gegenüber jeweils 67 % und 35 % binuklearer Zellen und jeweils 6 % und 47 % der drei-tetranuklearen oder sogar mit >4 nuklearen Zellen nach CD-Behandlung beobachtet werden.
Eine selektive Hemmung der Cytodierese und die anschließende DNA-Replikation der normalen Zellen in Bezug auf Tumorzellen durch CD ist daher vollständig nachgewiesen.
Die oben erwähnten Assays zeigen jedoch ein weiteres wichtiges Merkmal der CD-Wirkung auf das System: Umkehrbarkeit.
Nach normaler Zellbehandlung, wie sie in Zeile 5 gezeigt wird, die für eine Zeit durchgeführt wurde, die der Behandlung gleicht, die in Zeile 3 gezeigt wird (CD-Verabreichung von T0 bis T48, Ruhe von T48 bis T72, wobei die BrdU-Aufnahme von T72 bis T96 gemessen wurde), wurde tatsächlich letztendlich beobachtet, dass bis zu 92 % besagter Zellen wiederum mononuklear sind (vs. 98 % der Kontrollzellen). Zudem zeigen sich bis zu 96 % der plattierten Zellen vs. 97 % der Kontrollzellen weiterhin in der Lage zur Aufnahme des BrdU. Die wissenschaftliche Validität dieses Schlusses wird durch nukleationsbezogene Daten und BrdU-Aufnahme bezogene Daten untermauert und durch den gemessenen Prozentanteil von Zellen, der in die S-Phase nach Behandlung eingeht.
Die Umkehrbarkeit der CD-Wirkung auf normale Zellen ist daher gemäß diesen Daten sehr hoch.
Beispiel 6
Der Mangel von Cytochalasin D in der Wechselwirkung mit 3FT-toxischen Wirkungen auf Tumorzellen
Um jede mögliche Wechselwirkung zwischen CD- und FT-Wirkungen auf Tumorzellen zu verifizieren, wurde eine Reihe von koloniebildenden Assays mit C3H10T1/2(v-src/v-myc) durchgeführt.
Die Zellen wurden dafür auf 60 mm Platten bei einer Dichte von 5 × 10² Zell/60 mm bei den in Beispiel 3 beschriebenen Kulturbedingungen ausplattiert und wurden nach der ersten Zeit von 12 Stunden den folgenden Behandlungen ausgesetzt.
In einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM CD von T0 bis T84, zusammen mit 30 μM 3FT von T24 bis T72 zur Verifizierung einer möglichen Wechselwirkung in der CD/3FTkombinierten Verwendung verabreicht.
In einer zweiten Assay-Serie wurden 3 μM CB von T0 bis T84, zusammen mit 30 μM 3FT von T24 bis T72 zur Verifizierung einer möglichen Wechselwirkung in der CB/3FT-kombinierten Verwendung verabreicht.
In einer dritten Assay-Serie wurden 400 nM CD von T0 bis T84, 3 μM CB von T0 bis T84 und 30 μM 3FT von T24 bis T72 als Kontrollen der CD/3FT- und CB/3FT-kombinierten Verwendung verabreicht.
In einer vierten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H₂O von T0 bis T84 als Systemkontrolle zur Berechnung der Standardabweichung verabreicht.
Nach den oben genannten Verabreichungen wurden die Zellen wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt. Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
In den Zeilen 5 und 6 werden jeweils die Ergebnisse der ersten und zweiten Assay-Serie gezeigt. In den Zeilen 2, 3 und 4 werden die Ergebnisse der dritten Assay-Serien (innere Kontrollassays) gezeigt. In Zeile 1 werden die Ergebnisse der sechsten Assay-Serie (Kontroll-Assay) gezeigt.
In den Spalten 1, 2 und 3 werden jeweils die Ergebnisse der verschiedenen Behandlungen, die mit C3H10T1/2-v-src/v-myc-Zellen durchgeführt wurden, die Koloniezahlen, die aus jeder Behandlung resultieren und die Standardabweichung gezeigt.
Die oben genannten Ergebnisse zeigen die Abwesenheit einer Wechselwirkung mit dem 3FT-abhängigen Töten von Tumorzellen durch CD gegenüber einer starken Wechselwirkung durch CB damit.
Nach der kombinierten CD/3FT-Behandlung, die in Zeile 5 gezeigt wird, wurden tatsächlich 3 Kolonien gegenüber 41 Kolonien der inneren Kontrolle (Zeile 2) und den 111 der Systemkontrolle (Zeile 1) beobachtet, was eine fast vollständige Vernichtung darstellt.
Nach der kombinierten CB/3FT-Behandlung in Zeile 6 wurden 19 Kolonien gegenüber den 46 der inneren Kontrolle und den 111 der Systemkontrolle beobachtet, was nur eine teilweise Vernichtung darstellt.
Auf diese Art wurde die Eignung von Cytochalasin B für eine vollständige Vernichtung von Tumorzellen ausgeschlossen.
Diese Ergebnisse bestätigen die Aufnahme des Cytochalasin D in die Klasse A und den Ausschluss von Cytochalasin B daraus.
Beispiel 7
Hemmung der Cytodierese und anschließende DNA-Replikation in normalen Zellen durch Verbindungen, die nicht Cytochalasin D sind und die Umkehr davon
Um die Fähigkeit von Verbindungen, die nicht Cytochalasin D sind, zu verifizieren, die Cytodierese von normalen Zellen zu hemmen, wurde eine Serie von koloniebildenden Assays, die in Beispiel 5 beschrieben werden, mit C3H10T1/2, C3H10T1/2(v-src/v-myc) oder mit MEF-Zellen mit einigen Verbindungen durchgeführt, die potenzielle CD-Analoga sind.
Insbesondere wurde die erste Assay-Serie von Beispiel 5 mit 650 nM Latrinculin B, 700 nM Jasplakinolid und 100 nM Condramid B anstatt mit CD durchgeführt. Die zweite Assay-Serie von Beispiel 5 wurde mit 16 μM 13,14,21,22-Tetrahydrocytochalasin B, 2 μM 21,22-Dihydrocytochalasin B, 1 μM Deoxyphomin, 4 μM Cytochalasin F (CF), 8 μM Cytochalasin V (CV) und 0,5 μM CD als Kontrolle mit MEF-Zellen durchgeführt.
Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
In den Zeilen 1, 2 und 3 werden die Ergebnisse der ersten Beispiel 5 Assay-Serien gezeigt, wie sie durch die jeweilige Verabreichung von Latruculin B, Jasplakinolid und Chondramid B durchgeführt werden. In den Zeilen 4 bis 9 werden die Ergebnisse der Beispiel 5 zweiten Assay-Serie gezeigt, wie sie mit MEF-Zellen durchgeführt werden, denen 13,14,21,22-Tetrahydrocytochalasin B, 21,22-Dihydrocytochalasin B, Deoxyphomin, Cytochalasin F (CF), Cytochalasin V (CV) und CD als Kontrolle verabreicht wurde, durchgeführt werden.
In den Spalten 3, 4, 5 und 6 werden jeweils die Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen nachgewiesenen Zellen als Ergebnis be sagten Assays gezeigt. In Spalte 7 werden die %S-Werte in Bezug auf die Kontrolle gezeigt. In den Spalten 1 und 2 werden jeweils die verabreichten Medikamente und untersuchten Zellen gezeigt.
Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass solche Verbindungen vollständig in der Lage sind, mit der Ausbildung des kontraktilen Ringes von den normalen Zellen zu Wechselwirken, wobei die Mehrheit davon in einem binuklearen Zustand verbleibt (siehe Spalte 4, unter Zeile a).
Auf transformierte Zellen haben stattdessen alle drei untersuchten Verbindungen (Latrunculin B, Jasplakinolid und Chondramid B), obwohl sie in der Lage sind, mit der Polymerisation des Actincytoskeletts zu Wechselwirken, eine destabilisierende Wirkung in einem solchen Ausmaß, dass die Cytodieresehemmung nicht nachweisbar ist (siehe Spalten 3 – 6, Unterzeilen b). Jedoch, da diese Verbindungen nicht mit der Proliferation in Tumorzellen Wechselwirken, wie in Spalte 7 gezeigt wird, sind sie in diesem Zusammenhang für eine kombinierte Verwendung mit 3FT oder einem Analogon davon geeignet.
In jedem Fall werden als Ergebnis der oben genannten Behandlung %S-Phasen und %mononukleare Zellen auch verifiziert und in der folgenden Tabelle 8 gezeigt, worin einige Ergebnisse der ersten Assay-Serien, die in Beispiel 6 beschrieben werden, mit C3H10T1/2 durchgeführt werden, wobei nur die oben genannten Verbindungen verabreicht werden und in Bezug auf % zur Kontrolle gezeigt werden. Tabelle 8
In den Zeilen 2 bis 6 werden die Ergebnisse der Beispiel 6 ersten Assay-Serien gezeigt, die durch Verabreichung von Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Latrunculin B, Jasplakinolid und Chondramid B durchgeführt werden. In Zeile 1 werden die Ergebnisse des Beispiel 6 Kontroll-Assays gezeigt, der durch Verabreichung von nur DMSO durchgeführt wurde.
In Spalte 1 werden die verabreichten Medikamente und Konzentrationen davon gezeigt. In Spalte 2 bis 3 werden die Prozentanteile der Zellen gezeigt, die DNA nach T0 – T48 Medikamentenverabreichungen synthetisieren und die T0 – T96 BrdU-Aufnahme, die mononuklearen Zell-Prozentanteile, die bei T96 gemessen wurden, gefolgt von den T0 – T48-Medikamentenverabreichungen und der T0 – T96 BrdU-Aufnahme in Bezug auf die Kontrolle und den Kolonie-Prozentanteil, gemessen an dem 12. Tag nach den T0 – T72-Medikamentenverabreichungen, gefolgt durch Medikamentenentfernung und Zugabe von frischem Medium vom 4. bis zum 12. Tag.
Die Beispiel 6 ersten Assay-Serien wurden insbesondere zur Verifizierung der Umkehrbarkeit von jeder der untersuchten Verbindungen und der Klonierungseffizienz der Zellen nach der relevanten Behandlung durchgeführt.
Die in der Tabelle gezeigten relevanten Ergebnisse sind insbesondere solche, die sich auf die Verabreichung von 650 nM Lantrunculin B, 700 nM Jasplakinolid, 100 nM Condramid B, 2 μM Dihydrocytochalasin B und 400 nM Cytochalasin D als Kontrolle beziehen. Im Hinblick auf besagte beobachtete Ergebnisse wurde die Umkehrbarkeit für die untersuchte Verbindung und die anschließende Eignung in dieser Hinsicht für die 3FT- (oder äquivalente) kombinierte Verwendung gezeigt.
Die Ergebnisse der in Beispiel 4 oben beschriebenen Assayserien, die unter Verwendung von Dehydrocytochalasin B (als H2CB in der Tabelle bezeichnet) und 3FT durchgeführt wurden, werden in der folgenden Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
In Zeile 1 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien von Beispiel 4, die mit C3H10T1/2-Monokultur bei klonalen Dichten von 1 × 10³ (Unterzeile a), 5 × 10³ (Unterzeile b) und 1 × 10⁴ (Unterzeile c) durchgeführt werden, gezeigt. In Zeile 2 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien von Beispiel 4, die mit C3H10T1/2v-src/v-myc-Monokultur bei den klonalen Dichten von 5 × 10² (Unterzeile a), 1 × 10³ (Unterzeile b) und 5 × 10³ (Unterzeile c) durchgeführt werden, gezeigt.
In den Spalten 2, 3, 4 und 5 werden die Ergebnisse der Behandlung jeweils nur mit Trägern (DMSO für CD und H2O für 3FT), das CD allein, das 3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte 1 werden stattdessen die untersuchten Zellen und relevanten Dichten gezeigt.
Beispiel 8
Keine-Wechselwirkung von Verbindungen, die nicht CD sind, mit 3FT-Aufnahme durch Tumorzellen Um eine mögliche Wechselwirkung mit der 3FT-Aufnahme durch Tumorzellen zu verifizieren, wurden die in Beispiel 7 erwähnten Verbindungen mit C3H10T1/2v-src/v-myc-Zellen untersucht, wobei die Aufnahme von tritiertem Thymidin gemessen wurde. Es ist wohl bekannt, dass tatsächlich der Aufnahmemechanismus von Letzterem und dem von 3FT (und im Allgemeinen der Antimetaboliten) die gleichen sind (6).
Zellen wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen mit 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung plattiert und die Assays wurden unter Standard-Kulturbedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben werden, durchgeführt.
Nach dem anfänglichen Zeitraum von 12 Stunden c.ca (siehe oben, Beispiel 1) wurden die folgenden Assays durchgeführt. In einem ersten Assay wurden 3000 nM CB für 24 h, in einem zweiten Assay wurden 400 nM CD für 24 h, in einem dritten Assay wurden 650 nM Latrunculin B für 24 h, in einem vierten Assay wurden 700 nM Jasplakinolid für 24 h und in einem fünften Assay wurden 100 nM Condramid für 24 h an C3H10T1/2v-src/v-myc verabreicht.
Nach besagten Verabreichungen wurde eine 4 μCi/ml tritierte Thymidinaufnahme für 5 h für jeden Assay durchgeführt, wobei die oben erwähnten Verbindungen immer noch vorhanden waren. Zellen wurden daher 2 × mit PBS gewaschen, mit 5 % kalter Trichloressigsäure extrahiert und anschließend NaOH-lysiert.
Die verschiedenen Proben wurden nach Zugabe von Szintillationsflüssigkeit in einem β-Zähler analysiert. Die Emissionswerte, die für die Menge an Proteinen in jeder Probe abgeglichen wurden (durch das Lowry-Verfahren quantifiziert) werden in Zahlenwerten für Min/Microgramm Protein in Spalte 3 gezeigt. Als Kontrollen wurde das Folgende berücksichtigt:

– eine erste C3H10T1/2v-src/v-myc – Zellkultur, die über den gesamten Assay proliferieren gelassen wurde (12 h + 24 h + 5 h), deren Radioaktivität im (3-Zähler bestimmt wurde.
– eine zweite C3H10T1/2v-src-myc – Zellkultur, die für die ersten 12 h frei proliferieren gelassen wurde und für den pharmakologischen Behandlungs-Assay (12 h + 24 h), dann einer Aufnahme von 4 μCi/ml tritiertem Thymidin für 5 h unterzogen wurde und anschließend einer Aufnahmebestimmung im β-Zähler unterzogen wurde.

Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10
In den Zeilen 3 bis 7 werden jeweils die Ergebnisse des ersten, des zweiten, des dritten, des vierten und fünften Assays gezeigt. In den Zeilen 1 und 2 werden die Ergebnisse des ersten und zweiten Kontrollassays gezeigt.
In den Spalten 1, 2 und 3 werden jeweils die Menge an verabreichtem Thymidin (H³), die verabreichten Medikamente und die Konzentration davon sowie die Emissionswerte in cpm/μg gezeigt. Die oben gezeigte Ergebnisanalyse bestätigt, dass Cytochalasin B den Nukleosid- und damit den Antimetaboliten-Transport hemmt (223 cpm/μg versus 505 cpm/μg), wohingegen Cytochalasin D dieses im Wesentlichen nicht tut (391 cpm/μg versus 505 cpm/μg) was in Übereinstimmung mit den Assay-Ergebnissen von Beispiel 6 (siehe oben) ist. Bezüglich der anderen untersuchten Verbindungen zeigen Jasplakinolid und Chondramid nicht die Hemmung des Nukleosidtransports mit jeweils einem Wert von 559 cpm/μg und 562 vpm/μg versus 505 cpm/μg der Kontrolle, wohingegen Latrunculin B eine teilweise Hemmung mit einem Wert von 283 cpm/μg aufzeigt.
Solche Verbindungen sind daher für die 3FT-kombinierte Verwendung geeignet. Das Ergebnis dieser Assays und der in Beispiel 7 oben beschriebenen wurden tatsächlich zusätzlich durch das Aussetzen all dieser Verbindungen in den in Beispiel 2 und 3 beschriebenen Assays und dem positiven Ergebnis dieser bestätigt.
Beispiel 9
Nachgewiesene Cytotoxizität auf proliferierenden Zellen und Abwesenheit einer Cytotoxizität auf abgestoppten normalen Zellen der Klasse B Kandidatenverbindungen die nicht 3FT sind
Um die Cytotoxizität von Verbindungen auf proliferierenden Zellen zu verifizieren, die nicht 3FT sind, die jedoch eine dazu analoge Wirkung aufzeigen, wurden die in Beispiel 3 oben beschriebenen Assays unter Verwendung von 2-Chlor-deoxyadenosin (2CIAd) und Cytarabin (Ara C) anstatt 3FT durchgeführt.
Die fokusbildenden Assay-Bedingungen sind solche, die im Beispiel 3 für die erste, zweite und dritte Assay-Serie beschrieben werden, außer dass anstatt 3FT 80 μM 2CIAd und 40 μM Ara C verabreicht wurden. Solche Konzentrationen sind derartige, die als minimale zum Abtöten von mindestens 90 % der prolieferierenden Zellen innerhalb der Zeit der kombinierten Behandlung als Funktion des Zellzyklus der verwendeten Tumorzellen (48 h in diesem Fall) vorbestimmt wurden.
Die relevanten Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen 11A (2CIAd) und B (Ara C) gezeigt. Tabelle 11A
Tabelle 11 B
In Tabelle 11A (Zeilen 1, 2 und 3) werden jeweils die Ergebnisse der Beispiel 3 ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt, wie sie unter Verabreichung von 2CIAd anstatt von 3FT durchgeführt werden.
In Tabelle 11 B (Zeilen 1, 2 und 3) werden jeweils die Ergebnisse der Beispiel 3 ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt, wie sie unter Verabreichung von Ara C anstatt von 3FT durchgeführt werden.
In den Spalten 2, 3, 4 und 5 von beiden Tabellen werden Ergebnisse der Behandlung mit jeweils den einzelnen Trägern (DMSO für CD und H2O für 3FT), das CD allein, das 3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte 1 werden die untersuchten Zellen gezeigt. Sowohl in den Assay-Serien, die durch Verabreichung von Ara C und denen, die unter Verabreichung von 2CIAd durchgeführt wurden, wurde eine drastische Verringerung oder sogar eine Abwesenheit von Tumorzellkolonien und Transformations-Foci und auch die Umbildung der normalen Zellmonoschicht (siehe Spalte 4 in beiden Tabellen) beobachtet.
Jedoch, während sich die Monoschicht von Zellen, die der CD/AraC kombinierten Behandlung ausgesetzt wurden, normal reformieren, verdoppelt sich die notwendige Zeit für die normale Monozellschicht zur Reformierung nach der CD/2CIAd kombinierten Behandlung gegenüber den zwei anderen untersuchten Verbindungen (von 5 Tagen des Assays, der mit Ara C und 3FT durchgeführt wurde auf 10/12 Tage des Assays, der mit 2CIAd durchgeführt wurde). Zudem ist die Monoschicht-Sättigungsdichte (Anzahl der Zellen pro Oberflächeneinheit) die nach der 2CIAd-Behandlung neu gebildet wurde, deutlich geringer in Bezug auf die anderen Fälle (ungefähr 1/3) und die Zellen sind deutlich gealtert.
Diese auf die Proliferations-Neustartphase und auf das erneute Wachstum von normalen Zellen gerichteten Daten am Ende der gesamten Behandlung zeigen eine selektive cytotoxische Wirkung von AraC auf Tumorzellen im Gegensatz zu einer bestimmten toxischen Wirkung von 2CIAd nicht nur auf Tumorzellen, sondern auch auf normale nach der kombinierten Behandlung. Diese Daten werden daher mit den in den folgenden Beispielen 10 und 11 gezeigten Assays verifiziert.
Beispiel 10
Abwesenheit einer Cytotoxizität bei wachstumsgehemmten Zellen durch 3FT und Test von Klasse B-Kandidatenverbindungen die nicht 3FT sind
Eine Serie von DNA-Synthese-Reaktivierungs-Assays nach Behandlungen mit den oben im Beispiel 9 beschriebenen Verbindungen (AraC und 2CIAd) und mit anderen Verbindungen mit einer zu 3FT analogen Wirkung (6-Thioguanin (6ThG) und Doxorubicin) wurden mit C3H10T1/2-Zellen durchgeführt, die reversibel in der G0/G1 durch Wachstumsfaktorentzug angehalten wurden.
Die Wahl der Durchführung der Assays mit Zellen, die in der G0/G1-Phase durch Wachstumsfaktorentzug abgestoppt sind, anstatt mit Zellen, die mit Cytochalasin D oder Analogen davon behandelt wurden, wurde zur Erleichterung der Untersuchung durchgeführt. Die Daten daraus werden als relevant für die vorliegende Diskussion erachtet, da normale Zellen, die mit Cytochalasin D behandelt wurden, beobachtet wurden, dass sie in einem binuklearen Zustand in der G0/G1-Phase des Zellcyclus (19) anhalten.
Die Zellen wurden bei einer 10⁵-Dichte pro 35 mm Platte ausplattiert und die Kulturbedingungen sind die Standardbedingungen, die in Beispiel 1 definiert sind.
Nach dem anfänglichen Zeitraum von 12 Stunden c.ca (siehe Beispiel 1 oben) wurden die Zellen in ein Medium mit wenig Wachstumsfaktor (1 % FCS-supplementiertes DMEM) transferiert, um besagte Proliferation abzustoppen. 48 h später (nach Bestimmung eines Zellzustandes in allen Analogen zur Situation bei T24 gemäß dem Behandlungsschema, das in 1 gezeigt wird und in den Beispielen 3 und 4 beschrieben wird) wurden die folgenden pharmakologischen Behandlungen durchgeführt.
In einem ersten Assay wurden 40 μM 3FT für 48 h, in einem zweiten Assay wurden 40 μM Ara C für 48 h, in einem dritten Assay wurden 80 μM 2CIAd für 48 h, in einem vierten Assay wurden 100 μM 6-Thioguanin (6ThG) für 48 h, in einem fünften Assay wurden 1 μg/ml Doxorubicin (Doxo) für 48 h zu G0/G1-abgestoppten C3H10T1/2-Zellen verabreicht.
Die oben genannten Konzentrationen sind die Minimalen zum Abtöten von proliferierenden Zellen, die auf der Basis der Zellzyklusdauer berechnet wurden.
In einem sechsten Assay wurde 1 μM Ethidiumbromid (EtBr) für 48 h und in einem siebenten Assay wurden 20 mM BrdU für 48 h als jeweils positive und negative Kontrolle verabreicht.
Die Behandlungszeit gleicht derjenigen der Beispiel 3 dritten Assay-Serien oben, die jedoch mit C3H10T1/2-abgestoppten Zellen durchgeführt wurden.
Nach Freisetzung von der Medikamentenbehandlung wurden die Zellen 2 x gewaschen und in niedrigem Serum für weitere 12 h gelassen, um ein Auswaschen verbleibender Medikamente unter nicht-proliferierenden Bedingungen zu ermöglichen.
Nach dem 24 h Zeitraum in geringem Serum wurde Proliferationsmedium (DMEM + 10 % FCS), das mit 20 μM BrdU supplementiert worden war, um DNA-synthetisierende Zellen zu markieren, zu der Zellkultur hinzugefügt. Nach einer 24 h Stimulation wurden die Zellen fixiert und wie in Grossi et al. 1991 (18) beschrieben prozessiert. Der Prozentanteil DNA-synthetisierender Zellen in dem 24 h Markierungszeitraum wurde durch Immunfluoreszenz, wie sie in Grossi et al. 1991 (18) beschrieben wird, nachgewiesen.
Sowohl die Gesamtzellanzahl, die eine direkte Anzeige der cytotoxischen Wirkung der Verbindungen ist (ausgedrückt als Prozentanteil in Bezug auf die nicht behandelte Probe) wie auch die Anzahl der Zellen, die ein intaktes Proliferationspotenzial beibehalten (d. h. Zellen, die in der Lage sind, ihre DNA zu replizieren) wurde nachgewiesen. Auf diese Art wurden die nicht behandelten Kontrollen jeweils mit einbezogen. Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12
In den Zeilen 2 bis 6 werden die Ergebnisse der ersten, zweiten, dritten, vierten und fünften Assay-Serien gezeigt. In den Zeilen 7 und 1 werden jeweils die Ergebnisse der sechsten und siebenten Assays (positive und negative Kontrolle) gezeigt.
In den Spalten 2 bis 4 wird die Gesamtanzahl der beobachteten Nuclei, die Anzahl der Nuclei, die BrdU nach Behandlung aufgenommen haben, und der Prozentanteil von Zellen, die in die S-Phase übergehen, jeweils auf der Basis der in den Spalten 2 und 3 ge zeigten Daten extrapoliert, gezeigt. In Spalte 5 werden die Prozentanteile der Zellen, die in die S-Phase eingehen, für jeden Assay gezeigt, die auf der Basis der Daten, die in Spalte 4 gezeigt werden, extrapoliert worden sind. In Spalte 6 werden die Prozentanteile von Zellen für jeden Assay gezeigt, die immer noch auf der Platte nach der Behandlung vorhanden sind (im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle). In Spalte 1 werden die verschiedenen verabreichten Medikamente und die verwendeten Konzentrationen gezeigt.
Auf der Basis der oben genannten überlebenden Zellzahl und der Anzahl von Zellen, von denen nachgewiesen wurde, dass sie noch in der Lage sind, den Zellzyklus am Ende dieser Assays wieder aufzunehmen, wurden die Ergebnisse des Beispiel 7 Assays in Bezug auf 2CIAd bestätigt. Nach 2CIAd-Verabreichung, obwohl ein hoher Prozentanteil verbleibender haftender Zellen (97 %) beobachtet wurde, behielten wenige davon tatsächlich ihr Proliferationspotenzial (lediglich 3 % – 6 % im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle). Dementsprechend wurde bestätigt, dass die DNA-Synthese fast vollständig unabhängig von der Beobachtung der einzelnen vorhandenen Zelle gehemmt wurde.
In Bezug auf andere untersuchte Medikamente (3FT, Ara C, 6ThG) zeigten sich diese statt dessen als nicht-toxisch in Bezug auf Zellen, die in der intermitotischen Phase festgehalten wurden, wohingegen Doxorubicin, obwohl es auf dem Gebiet als potentielles Medikament zur Verwendung zur Tumorzellvernichtung angesehen wird, sich als zu toxisch mit normalen Zellen, die in der Interphase wachstumsgestoppt wurden, zur Aufrechterhaltung eines proliferativen Potenzials erwies. Entsprechend, während 3FT, Ara C, 6ThG zeigten, dass sie in Kombination mit CD und Analogen davon für eine vollständige und selektive Vernichtung von Tumorzellen nützlich sind, waren 2CIAd und Doxorubicin dieses nicht.
Beispiel 11
Cytotoxizitäts-Quantifizierung von 3FT und Analogen durch Erhöhung der relevanten Konzentrationen
Um zu verifizieren, ob und in welchem Ausmaß Konzentrationen von 3FT und Analogen davon, die in den Assay-Serien, die in Beispiel 10 gezeigt werden (worin die minimalen es ermöglichen, eine cytotoxische Wirkung auf proliferierende Tumorzellen zu erhalten), zur Verstärkung der Vernichtungs-Effektivität pro Zeiteinheit variiert werden können, wurden die Assay-Serien, die in Beispiel 10 mit erhöhenden Konzentrationen von besagten Verbindungen gezeigt wurden, mit C3H10T1/2-Zellen durchgeführt, die reversibel in der G0/G1b-Phase durch Wachstumsfaktorentzug angehalten wurden.
Die Kultur- und Assay-Bedingungen sind solche, die in Beispiel 10 beschrieben werden, außer für die pharmakologische Behandlung, welche in der folgenden Assay-Serie aus dem Folgenden besteht.
In einer ersten Assay-Serie wurden Ara C 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM und als Kontrolle Cytidin 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM für 48 h den oben erwähnten abgestoppten Zellen verabreicht.
In einer zweiten Assay-Serie wurden 3FT 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM und als Kontrolle Thymidin 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM für 48 h den oben erwähnten Zellen verabreicht.
Bestimmte Assays, die mit Cytidin für das Ara C und Thymidin für das 3FT durchgeführt wurden, wurden, um jegliche mögliche Toxizitätsdatenverzerrung zu vermeiden, die sich aus der Verwendung erhöhter Nukleosid-Konzentrationen ergibt, durchgeführt.
Drei weitere Kontroll-Assays, worin 20 μM BrdU, 80 μM 2CIAd und 1 μg/ml Doxorubicin für 48 h den oben erwähnten Zellen verabreicht wurden, wurden jedoch durchgeführt.
Die höchsten Verbindungskonzentrationen in all diesen Assays waren eine 10 – 20-fache Erhöhung in Bezug auf die minimale Dosis, die zur Zellvernichtung in dieser kombinierten Verbindung mit CD oder Analogen davon notwendig war. Dieses ermöglichte es, zu verifizieren, ob die Vernichtungswirksamkeit verbessert werden könnte (in Bezug auf die in vivo- oder ex vivo-Behandlung) durch Erhöhung der Konzentration des chemotherapeutischen Medikaments, wodurch die Dosierungseinschränkung bedingt durch die Toxizität desselben überwunden wird.
Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13
In Zeilen 9 bis 13 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien gezeigt. In Zeilen 4 bis 8 werden die Ergebnisse der relevanten Kontroll-Assay-Serien gezeigt. In Zeile 19 bis 23 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien gezeigt. in Zeilen 14 bis 18 werden die Ergebnisse der relevanten Kontrollserien gezeigt. In Zeilen 1 bis 3 werden die Ergebnisse der drei weiteren Kontroll-Assays unter Verabreichung von BrdU, 2CIAd und Doxorubicin gezeigt.
In den Spalten 2 bis 4 werden jeweils die Gesamtanzahl der beobachteten Nuklei, die relative Anzahl von Nuklei mit aufgenommenem BrdU nach Behandlung und der Prozentanzahl von Zellen gezeigt; der die S-Phase eingeht; wie auf der Basis der in Spalten 2 und 3 jeweils gezeigten Daten berechnet. In Spalte 5 werden für jeden Assay die Prozentanteile der Zellen gezeigt, die in die S-Phase eingehen, in Bezug auf nicht behandelte Kontrollzellen von Zeile 1, berechnet auf der Basis der Daten, die in Spalte 4 gezeigt werden. In Spalte 6 werden die Prozentanteile der Zellen für jeden Assay gezeigt, die letztendlich immer noch nach der Behandlung anhafteten (im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle). In Spalte 1 werden die unterschiedlichen verabreichten Medikamente und die verwendeten Konzentrationen gezeigt.
Die oben gezeigten Ergebnisse beweisen, dass Trifluorthymidin toxisch bei 400 – 800 μM wird, da der Prozentanteil von Zellen, die in die S-Phase eingehen, unverändert ist in Bezug auf die anderen Assays, aber die Anzahl der beobachteten Zellen sich ungefähr halbiert (siehe Zeilen 22 bis 23) hat, wohingegen das Ara-C bei 200 – 400 μM anfängt toxisch zu werden, da in diesem Fall die Anzahl der beobachteten Zellen gleich bleibt, aber der Prozentanteil von Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, sich verringert (siehe Zeilen 11-12).
Auf der Basis dieser Ergebnisse, sogar und über alles, im Vergleich zu solchen, die sich auf die zwei Kontrollverbindungen 2CIAd und Doxo beziehen, die in 0 Wachstum resultieren, kann gesagt werden, dass bedingt durch die kombinierte Verwendung mit Cytochalasin D (oder einem Analogon davon) die Konzentration der oben genannten Verbindung (oder eines Analogons davon) bis zum 10-fachen erhöht werden kann, da eine bestimmte Toxizität davon jedoch vernachlässigbar ist. Betreffend die optimalen Dosierungen scheint 3FT bis zu 400/800 μM – Konzentrationen gut tolerierbar zu sein. Statt dessen scheint AraC bei einer Dosierung von 400 μM toxisch zu werden.
Beispiel 12
Bestätigungsverfahren zur Übertragbarkeit auf menschliche Tumor- und normale Zellinien
Alle oben beschriebenen Assays wurden in einem System durchgeführt, das spezifisch entwickelt wurde, um pathologische Situationen im Menschen in vivo zu reproduzieren. Um die volle Anwendbarkeit der Ergebnisse auf menschliche Zellen zu bestätigen, die mit C3H10T1/2-Zellen durchgeführt wurden, wurden Assay-Serien mit kultivierten Zellen, die aus Glioblastoma stammen, durchgeführt.
Kultur- und experimentelle Bedingungen sind identisch zu denen, die in Beispiel 1 gezeigt werden, außer dass die verwendeten Zellen Lipari-, T97- und U973- Glioblastomas waren und dass Nukleations-Zustandsdaten nach den folgenden Behandlungen beobachtet wurden.
In einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM Cytochalasin D für 48 h (T0 – T48) zusammen mit BrdU (T24 – 48) in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozentanteils von Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari-, T97- und U973-Zellen verabreicht.
In zweiten Assay-Serien wurden 650 nM Latrunculin B für 48 h (T0-T48) zusammen mit BrdU (T24 – 48) in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozentanteils von Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari- (Zeile 12), T97- (Zeile 12) und U973-(Zeile 13) Zellen verabreicht.
In einer dritten Assay-Serie wurden 700 nM Jasplakinolid für 48 h (T0 – T48) zusammen mit BrdU (T24 – 48) in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozenanteils von Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari- (Zeile 14), T97- (Zeile 15) und U973- (Zeile 16) Zellen verabreicht.
In einer vierten Assay-Serie wurden 100 nM Chondramid B für 48 h (T0 – T48) zusammen mit BrdU (T24 – 48) in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozenanteils von Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari- (Zeile 17), T97- (Zeile 18) und U973- (Zeile 19) Zellen verabreicht.
In einer fünften Assay-Serie wurden 400 nM Cytochalasin D für 48 h (T0 – T48) zusammen mit BrdU (T24 – 48) in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozenanteils von Zellen, die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lungen (9) und Dermis (10) menschlichen Fibroblasten verabreicht.
In Kontrollassays wurden nur 20 μM BrdU für 48 h an Lipari- (Zeile 1), T97- (Zeile 2) und U973- (Zeile 3) Zellinien, Lungen- (4) und dermalen (5) Fibroblasten verabreicht.
Insbesondere wurden zuerst die oben erwähnten ersten bis vierten Assays mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt, danach wurde nach positivem Ausgang als weitere Bestätigung der fünfte Assay mit Lungen-Fibroblasten (gleiche Verfahren wie für die Beispiel 2 Assays) durchgeführt und Dermis-Fibroblasten wurden nur unter Verabreichung von CD durchgeführt. Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 14 gezeigt. Tabelle 14
In Zeilen 6 bis 8 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien, wie sie mit Lipari, T97 und U973 jeweils durchgeführt werden, gezeigt. In Zeilen 11 bis 13 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien, wie sie mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt werden, gezeigt. In den Zeilen 14 bis 16 werden die Ergebnisse der dritten Assay-Serien, wie sie mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt wurden, gezeigt. In den Zeilen 17 bis 19 werden die Ergebnisse der vierten Assay-Serien, wie sie mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt wurden, gezeigt. In Zeilen 9 und 10 werden die Ergebnisse der fünften Assay-Serie, wie sie mit Lipari, T97 und U973 jeweils durchgeführt werden, gezeigt. In den Zeilen 1 bis 5 werden die Ergebnisse der Kontroll-Assays, wie sie jeweils mit Lipari, T97, 0973, Lungen und Dermis-Fibroblasten durchgeführt wurden, gezeigt.
In den Spalten 3, 4, 5 und 6 werden die Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen Zellen gezeigt, die am Ausgang der Ergebnisse nachgewiesen werden. In Spalte 1 und 2 werden statt dessen das verabreichte Medikament und die untersuchte Zelle gezeigt.
Die Ergebnisse all dieser Assay-Serien betonen die Multinukleation aller menschlicher Zellen, die mit den oben genannten Verbindungen behandelt wurden (siehe die Ergebnisse, die sich auf den Prozentanteil von tri-, tetra- oder >4-nukleare Zellen beziehen, die jeweils in den Spalten 5 und 6 gezeigt werden).
Insbesondere zeigt Chondramid B eine besonders wirksame Wirkung, da es nicht nur Multinukleation von Tumorzellen induziert, sondern auch in der Lage ist, deren Ablösung zu bewirken.
Selbst wenn die Daten hierin nicht gezeigt werden, wurde auch die Umkehrbarkeit der Wirkung besagter Verbindungen in solchen menschlichen Zellen nachgewiesen, wie sie für murine Zellen gezeigt wurden (siehe Bsp. 5, 7). Dieses bestätigt die Anwendbarkeit der kombinierten Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung auch auf das menschliche System und die volle Übertragbarkeit der Ergebnisse auf das menschliche System, die durch das Modellsystem erhalten werden, wodurch letzteres auf jeden Fall validiert wird.
Glossar

– Der Begriff "Tumorzellen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich: in vivo auf Zellen, die verschiedene Tumorformen aufzeigen; in vitro auf in vitro transformierte Zellen (d. h. solche, die entweder spontan oder durch eine Oncogenexpression tumorgen wurden) oder sich von Tumorexplantaten ableiten, die jedoch nicht die Voraussetzungen erfüllen, die für die Definition von normalen in vitro Zellen (1 – 3) üblich sind.
– Der Begriff "normale Zellen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich: in vivo auf jegliche Körperzelle, die nicht in einem transformierten oder tumorösen Zustand ist; in vitro auf primäre oder Kultur-stabilisierte Zellen, die die Eigenschaften beibehalten, die als normal im Stand der Technik angesehen werden, d: h:
– Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren zur Proliferation;
– Unfähigkeit zur Ausbildung von Tumoren, wenn sie in immundefizitäre Mäuse injiziert werden;
– Unfähigkeit zur Ausbildung von Transformations-Foci in den Assays, die für diesen Zweck zur Verfügung gestellt werden; und
– Abhängigkeit von einer Verankerung für das Wachstum (nur für solche Zellen, die normalerweise haftend wachsen).
– Mit der Bezeichnung "funktioneller P53-Stoffwechselweg", wie er hierin verwendet wird, wird der Komplex von Genen bezeichnet, dessen Produkte stromaufwärts und stromabwärts des p53-Gens wirken oder dessen Genprodukt und die zur korrekten Funktion von p53 in der Regulation des Zellzyklus und der Genomstabilität notwendig sind.

Literaturverweise

1. De vita VT, Helman S, Rosenberg SA – CANCER 5^th edition; Lipincott-Raven.
2. Natori S – Toxic cytochalasins. Mycotoxins 1978 May 24.;: 559-81 Kunze B, Jansen R,
3. Bray D – Cytochalasin action Nature 1979 Dec 13; 282 (5740):671
4. Smith GF, Ridler MA, Faunch JA – Action of cytochalasin B on cultured human lymphocytes. Nature 1967 Dec 16;216(120):1134-5
5. Kelly F, Sambrook J – Differential effect of cytochalasin B on normal and transformed mouse cells. Nat New Biol 1973 Apr 18;242(120):217-9
6. Plagemann PG, Estensen RD – Cytochalasin B. VI. Competitive inhibition of nucleoside transport by cultured Novikoff rat hepatoma cells. J Cell Biol 1972 Oct;55(1):179-85
7. Zylka JM, Plagemann PG – Purine and pyrimidine transport by cultured Novikoff cells. Specificities and mechanism of transport and relationship to phosphoribosylation. J Biol Chem 1975 Aug 10;250(15):5756-67
8. Tanaka K, Kuwano M, Endo H – Effect of cytochalasin-B on the transport of 5-fluorouracil in cultured mammalian cells. Gann 1975 Jun;66(3):331-4
9. Scott VR, Boehme R, Matthews TR- New class of antifungal agents: jasplakinolide, a cyclodepsipeptide from the marine sponge, Jaspis species. Antimicrob Agents Chemother 1988 Aug; 32(8):1154-7
10. Sasse F, Hofle G, Reichenbach H – Chondramides A approximately D, new antifungal and cytostatic depsipeptides from Chondromyces crocatus (myxobacteria). Production, physico-chemical and biological properties. J. Antibiot (Tokio) 1995 48(11):1262-6
11. Udagawa Taturo, D'Amato RJ, Shah JH – Cytochalasin and Isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis. World patent WO98/41205 (18.03.98)
12. Spector I, Shochet NR, Kashman Y, Groweiss A – Latrunculins: novel marine toxins that disrupt microfilament organization in cultured cells. Science 1983 Feb 4;219 (4584):493-5
13. McClatchey Al, Jacks T Tumor suppressor mutations in mice: the next generation. Curr Opin Genet Dev 1998 Jun;8(3):304-10
14. Prives C, Hall PA – The p53 pathway. J Pathol 1999 jan; 187(1): 112-26
15. Waldman T, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B – Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature 1996 381: 643-644
16. O'Neill FJ, Miller TH, Hoen J, Stradley B, Devlahovich V – Differential response to cytochalasin B amog cells transformed by DNA and RNA tumor viruses. J Natl. Cancer Inst 1975 Oct;55(4):951-5
17. Bignami M, Rosa S, La Rocca SA, Falcone G, Tatò F – Differential influence of adjacent normal cells on the proliferation of mammalian cells transformed by the viral oncogenes myc, ras and src. Ondogene 1988 May; 2(5):509-14
18. Grossi M, Calconi A, Tatò F – v-jun oncogene prevents terminal differentiation and suppresses muscle-specific gene expression in ASV-17-infected muscle cells. Oncogene 1991 Oct;(10):1767-73
19. Zanetti A, Grossi M, Tatò F – Manuskript in der Ausarbeitung

Claims

Verfahren zum Schützen von proliferierenden normalen Zellen in einer in vitro-Kultur vor der eradikativen Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung (Klasse B-Verbindung), wobei die Kultur die proliferierenden normalen Zellen und Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg umfasst, wobei das Verfahren das Verabreichen der chemotherapeutischen Verbindung in Kombination mit einer schützenden Verbindung (Klasse A-Verbindung) an die Kultur umfasst, wobei die chemotherapeutische Verbindung die Fähigkeit hat – eine cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben, – das Überleben und proliferative Potenzial von Interphasezellen nicht zu beeinträchtigen, wobei die schützende Verbindung die Fähigkeit hat – die Zellteilung (cytodieresis) von normalen Zellen reversibel zu hemmen, – die biologische Wirkung der chemotherapeutischen Verbindung nicht zu hemmen, und wobei eine Vorbehandlung mit der schützenden Verbindung vor der kombinierten Behandlung mit Klasse A- und Klasse B-Verbindungen durchgeführt wird und die Verabreichung der schützenden Verbindung dazu führt, dass wenigstens ein Teil der proliferierenden normalen Zellen geschützt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vorbehandlung mit der schützenden Verbindung dazu führt, das wenigstens ein Teil der normalen Zellen in der Interphase angehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Vorbehandlung während eines Zeitraums erfolgt, der größer oder gleich der Dauer des Zellzyklus der proliferierenden normalen Zelle ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 3, wobei nach der kombinierten Behandlung eine Nachbehandlung erfolgt, welche das Unterbrechen der Verabreichung der Klasse B-Verbindung und das Abwaschen der Klasse B-Verbindung von der Kultur unter Beibehaltung der Verabreichung der Klasse A-Verbindung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die kombinierte Behandlung während eines Zeitraums erfolgt, der größer oder gleich der Dauer des Zellzyklus der Tumorzellen mit einem inaktivierten p53-Stoffwechselweg ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, wobei der Waschschritt während eines Zeitraums erfolgt, der größer oder gleich 3 Stunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die kombinierte Behandlung, Vorbehandlung und/oder Nachbehandlung zweimal oder öfter wiederholt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cytochalasinen, Jasplakinoliden, Chondramiden, Isoindolinonen und Latrunculinen, wobei Cytochalasin B ausgeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und Latrunculin B.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Folat-Inhibitoren, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Inhibitoren, Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten und Topoisomerase-Inhibitoren.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptopurin,-Gem-cytabin; Fludarabin,- Floxuridin, Florafur; -Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan, 9-Amino-S(20)-camptothecin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei C3H10T1/2-Zellen oder davon abgeleitete Zellen als Modellzellen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei C3H10T1/2-Zellen oder davon abgeleitete Zellen als Modellzellen zum Identifizieren einer schützenden Verbindung und/oder einer chemotherapeutischen Verbindung verwendet werden.
Verwendung einer schützenden Verbindung mit der Fähigkeit – die Zellteilung von normalen Zellen reversibel zu hemmen, – die biologische Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung nicht zu hemmen, wobei diese chemotherapeutische Verbindung die Fähigkeit hat – eine cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben, aber – das Überleben und proliferative Potenzial von Interphasezellen nicht zu beeinträchtigen, für die Herstellung eines Medikaments zum Schützen von normalen Zellen vor der eradikativen Wirkung der chemotherapeutischen Verbindung bei einer Behandlung einer Tumorform mit einem inaktivierten p53-Stoffwechselweg.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die kombinierte Behandlung mit der schützenden Verbindung und der chemotherapeutischen Verbindung auf eine Vorbehandlung mit der schützenden Verbindung allein folgt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Vorbehandlung während eines Zeitraums erfolgt; der größer oder gleich der Dauer des Zellzyklus der proliferierenden normalen Zelle ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Tumorform eine Tumorform mit einem niedrigen Proliferationspotenzial ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Tumorform eine hyperproliferative Läsion ist, die durch ein Papillomavirus verursacht wird.
Verwendung einer schützenden Verbindung, wie sie in Anspruch 14 definiert ist, für die Herstellung eines Medikaments zum Schützen von normalen Zellen vor der eradikativen Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung bei einer Behandlung einer pathologischen Infektion, die durch Mikroorganismen verursacht wird, die keine p53-Funktion aufweisen.
Verwendung einer schützenden Verbindung, wie sie in Anspruch 14 definiert ist, für die Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und Behandeln von Alopezie, die mit einer systemischen Verabreichung einer chemotherapeutischen Verbindung bei einer Behandlung von Zellen mit einem inaktivierten p53-Stoffwechselweg assoziiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cytochalasinen, Jasplakinoliden, Chondramiden, Isoindolinonen und Latrunculinen, wobei Cytochalasin B ausgeschlossen ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und Latrunculin B.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Folat-Inhibitoren, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Inhibitoren, Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten und Topoisomerase-Inhibitoren.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptopurin, Gemcytabin, Fludarabin, Floxuridin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan, 9-Amino-S(20)-camptothecin.
Pharmazeutische Zusammensetzung zum selektiven Eradizieren von Zellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg, umfassend therapeutisch wirksame Mengen einer schützenden Verbindung, einer chemotherapeutischen Verbindung und eines pharmazeutisch annehmbaren Vehikels, Trägers oder Hilfsmittels, wobei die chemotherapeutische Verbindung die Fähigkeit hat – eine cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben, – das Überleben und proliferative Potenzial von Interphasezellen nicht zu beeinträchtigen, wobei die schützende Verbindung die Fähigkeit hat – die Zellteilung von normalen Zellen reversibel zu hemmen, – die biologische Wirkung der chemotherapeutischen Verbindung nicht zu hemmen, wobei die Freisetzung der chemotherapeutischen Verbindung im Hinblick auf die Freisetzung der schützenden Verbindung verzögert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Folat- Inhibitoren, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Inhibitoren, Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten und Topoisomerase-Inhibitoren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptopurin, Gemcytabin, Fludarabin, Floxuridin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan, 9-Amino-S(20)-camptothecin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cytochalasinen, Jasplakinoliden, Chondramiden, Isoindolinonen und Latrunculinen, wobei Cytochalasin B ausgeschlossen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und Latrunculin B.
Teilekit zum selektiven Eradizieren von Zellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg und selektiven Schützen von proliferierenden normalen Zellen, umfassend eine schützende Verbindung und eine chemotherapeutische Verbindung, wobei die chemotherapeutische Verbindung die Fähigkeit hat – eine cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben, – das Überleben und proliferative Potenzial von Interphasezellen nicht zu beeinträchtigen, wobei die schützende Verbindung die Fähigkeit hat – die Zellteilung von normalen Zellen reversibel zu hemmen – die biologische Wirkung der chemotherapeutischen Verbindung nicht zu hemmen, wobei der Kit für die aufeinanderfolgende Verabreichung der schützenden Verbindung allein zuerst und anschließend der Assoziation der schützenden und chemotherapeutischen Verbindungen in einer in vivo- und/oder ex vivo-Therapie einer Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg bestimmt ist.
Teilekit nach Anspruch 30, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cytochalasinen, Jasplakinoliden, Chondramiden, Isoindolinonen und Latrunculinen, wobei Cytochalasin B ausgeschlossen ist.
Teilekit nach Anspruch 30, wobei die schützende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid B und Latrunculin B.
Teilekit nach Anspruch 30, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Folat-Inhibitoren, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Inhibitoren, Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten und Topoisomerase-Inhibitoren.
Teilekit nach Anspruch 33, wobei die chemotherapeutische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptopurin, Gemcytabin, Fludarabin, Floxuridin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan, 9-Amino-S(20)-camptothecin.
Teilekit nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei die Tumorform eine hyperproliferative Läsion ist, die durch eine Papillomavirusinfektion verursacht wird.
Teilekit nach einem der Ansprüche 30 bis 34 in der Therapie einer pathologischen Infektion, die mit einem Mikroorganismus assoziiert ist, der keine p53-Funktion aufweist, wobei die Verabreichung der kombinierten Verbindungen auf die Verabreichung der schützenden Verbindung allein folgt.
Teilekit nach einem der Ansprüche 30 bis 34 zum selektiven Eradizieren von Zellen mit einer inaktiven p53-Funktion und zum selektiven Schützen von proliferierenden normalen Zellen in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.