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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Mittel, die es ermöglichen,
normale Zellen zu schützen,
während
Tumorzellen vernichtet werden, insbesondere diejenigen mit einer
geringen Proliferationsgeschwindigkeit in einer Umgebung, in der
sowohl Tumor- wie auch normale Zellen vorhanden sind und proliferieren.
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Hintergrund
der Erfindung
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Der
Hauptzweck einer jeden Krebsbehandlung ist die vollständige und
zur gleichen Zeit selektive Vernichtung von Tumorzellen aus Patientengeweben.
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Die
Vollständigkeit
der Tumorzellenvernichtung ist tatsächlich wesentlich zur Verhinderung
wiederkehrender Formen, die Selektivität wiederum, um den Patienten
vor Nebenwirkungen zu schützen.
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Beide
Merkmale sind daher wesentlich für
eine erfolgreiche Krebsbehandlung, sogar, wenn das vollständige Erreichen
beider zur gleichen Zeit im Hinblick auf die gegensätzlichen
technischen Wirkungen extrem schwierig ist, die jedem dieser zugrunde
liegen ("das Abtöten von
Zellen" vs. "das Retten von Zellen").
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In
den in vitro-Systemanwendungen, die damit verbunden sind (d. h.,
die auf die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen oder neuen therapeutischen
Verbindungen gerichtet sind) könnte
statt dessen sogar eine teilweise selektive und/oder eine teilweise
vollständige
Vernichtung der Tumorzellen auch vorteilhaft sein, wenn diese steuerbar
ist, da die Steuerbarkeit eine bessere Zuverlässigkeit der Daten sicherstellt.
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In
derzeitigen therapeutischen Ansätzen
wird die vollständige
Vernichtung der Tumorzellen in vivo durch die wiederholte Verabreichung
chemotherapeutischer Mittel zusätzlich
zu anderen operativen Eingriffen wie Radiotherapie und Chirurgie
versucht.
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Als
solches haben chemotherapeutische Mittel im Allgemeinen die Fähigkeit,
wirksam proliferierende Zellen in einer bevorzugten Weise zu töten; ein
therapeutischer Ansatz, der solche Mittel einsetzt, ermöglicht eine
selektive Vernichtung von Tumorzellen in Bezug auf normale Zellen,
die sich gewöhnlich
in einer nicht-proliferativen Phase befinden.
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Es
gibt jedoch einige normale Zellen, die physiologisch proliferieren
und damit in Bezug auf die Wirkung des chemotherapeutischen Mittels
zu Tumorzellen vollständig äquivalent
sind.
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Solch
eine "Aspezifität", die die Wirkung
eines chemotherapeutischen Mittels auf proliferierende Zellen kennzeichnet,
resultiert klinisch in einer deutlichen und allgemeinen Toxizität in proliferierenden
Geweben wie Knochenmark, der gastrointestinalen Schleimhaut und
Haut.
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Daher
ist die Unterbrechung der Behandlung oft die einzige klinische Lösung für Nebenwirkungen,
die aus einer solchen erhöhten
Toxizität
abgeleitet werden und entsprechend ist es unabhängig des bemerkenswerten therapeutischen
Potentials der chemotherapeutischen Medikamente schwer, eine vollständige Vernichtung
der Tumorzellen in den meisten Patienten zu erreichen.
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Dies
ist in der Tat zum Beispiel die Standardvorgehensweise im Falle
einer Toxizität
gegenüber
gastrointestinaler Schleimhaut, wohingegen im Falle einer Toxizität gegenüber den
hematopoetischen Vorstufen auch andere Ansätze praktiziert werden, von
denen sich jedoch gezeigt hat, dass sie in einem Wesentlichen Prozentanteil
der Fälle
nicht entscheidend sind. (1)
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Jedoch
können
im Hinblick auf ihre höchst
wirkungsvolle vernichtende Aktivität die meisten chemotherapeutischen
Verbindungen sogar bei Vorhandensein von Nebenwirkungen zur Behandlung
von Formen mit hohem Proliferationspotential wirksam verwendet werden,
sogar, wenn mit schweren Nachteilen in Bezug auf das Leiden des
Patienten zu rechnen ist.
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Keine
Anwendung ist stattdessen bei Formen mit geringem proliferativen
Potential wie Pankreaskrebs und einigen Lymphomen praktizierbar.
Gekennzeichnet durch eine Proliferationsgeschwindigkeit, die nahezu identisch
mit der von replizierenden normalen Geweben ist, würden derartige
Tumorformen tatsächlich
Behandlungszeiten und chemotherapeutische Dosierungen benötigen, die
aspezifisch auch die Gesamtheit der proliferierenden normalen Zellen
töten würden.
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Daher
gibt es einen dringenden Bedarf für alternative therapeutische
Ansätze,
die in der Lage sind, proliferierende normale Zellen vor der toxischen
Wirkung der chemotherapeutischen Medikamente zu schützen.
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Obwohl
auf dem Gebiet einige alternative Ansätze in dieser Hinsicht entwickelt
wurden, wurde ein wirksamer Schutz der normalen Zellen, der mit
einer vollständigen
und selektiven Zerstörung
der Tumorzellen einhergeht, bis jetzt nicht erhalten.
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Die
hauptsächliche
Schwierigkeit im Erzielen eines solchen Ergebnisses liegt in den
zu ähnlichen
Eigenschaften, die proliferierende normale und Tumorzellen teilen,
so dass in Bezug auf die Wirkung des chemotherapeutischen Medikaments
diese nahezu nicht unterscheidbar sind.
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Dementsprechend
ist es eine der möglichen
Ansätze
zur Lösung
des Problems von Chemotherapie-assoziierten Nebenwirkungen, Medikamente
zu definieren und aufzufinden, die helfen können, proliferierende normale
Zellen vor den nachteiligen Wirkungen bereits bekannter chemotherapeutischer
Medikamente zu schützen.
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Einige
Ansätze
wurden daher in vitro untersucht, um Verbindungen aufzufinden, die
in der Lage sind, einen Zustand zu etablieren, bei dem in Bezug
auf eine chemotherapeutische Intervention normale Zellen eine deutlich
verringerte oder eine nicht vorhandene Empfindlichkeit aufzeigen,
wohingegen die Empfindlichkeit der Tumorzellen unverändert bleibt
(dies wird hierin auch als "differenzierender
Status" bezeichnet).
Jedoch wurden bis jetzt keine signifikanten Daten in einer anwendbaren
und therapeutischen Perspektive erhalten.
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Dementsprechend
gibt es weiterhin die Notwendigkeit für experimentelle Ansätze und
Zellmodelle, die geeignet sind, eine neue Strategie zu definieren,
die geeignet ist, die Möglichkeit
der Definition von Bedingungen und Mechanismen zu ermöglichen,
die in der Lage sind, proliferierende normale Zellen vor den toxischen Wirkungen
chemotherapeutischer Mittel zu schützen.
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Tatsächlich wäre das beste
System für
diesen Zweck offensichtlich dasjenige, das durch proliferierende
normale menschliche Zellen aufgebaut ist, die in vivo chemotherapeutisch
assoziierten Nebenwirkungen ausgesetzt sind, d. h. proliferierende
Stammzellen von sich physiologisch selbst erneuernden Geweben. Jedoch
verändern
derartige Zellen ihren proliferativen Zustand, wenn sie in vitro
transferiert werden und sind daher nicht geeignet, Daten zu ergeben,
die relevant für
in vivo-Situationen sind.
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In
der Abwesenheit einer solchen Art eines Zellsystems, das mindestens
teilweise eine in vivo-Situation reproduziert, würden keinerlei Experimente
von Bedeutung sein, die auf die Auswahl von Verbindungen und Ansätzen in
einer anwendbaren Perspektive gerichtet sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Eine
erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Schützen von
proliferierenden normalen Zellen in einer in vitro- oder ex vivo-Kultur,
die besagte proliferierende normale Zellen umfasst, sowie Tumorzellen
mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg, vor der eradikativen Wirkung
einer chemotherapeutischen Verbindung (hierin auch als Klasse B-Verbindung
oder Medikament bezeichnet) mit der Fähigkeit
- – eine cytotoxische
Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben und
- – das Überleben
und proliferative Potential von Interphasenzellen nicht zu beeinträchtigen,
umfassend
eine
kombinierte Behandlung einschließlich der Verabreichung einer
schützenden
Verbindung zu besagter Kultur (hierin auch als Klasse A-Verbindung
oder Medikament bezeichnet) mit der Fähigkeit
- – die
Zellteilung (Cytodierese) von normalen Zellen reversibel zu hemmen,
- – die
biologische Wirkung der besagten Klasse B-chemotherapeutischen Verbindung
nicht zu hemmen,
in Verbindung mit besagter chemotherapeutischer
Verbindung, wobei die Verabreichung besagter schützender Verbindung in dem Schutz
von mindestens einem Teil besagter proliferierender normaler Zellen
resultiert.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf den überraschenden
Beobachtungen, dass der Binukleations-/Multinukleationszustand,
der durch Klasse A-Verbindungen jeweils in normalen/Tumorzellen
induziert wird, ein "differenzierender
Status" ist, wie
er hierin in Bezug auf die eradikative Wirkung von Klasse B-Verbindungen
definiert wird, und dass solch ein "differenzierender Zustand" strikt von dem Funktionieren
des p53-Stoffwechselweges in normalen Zellen und dem Mangel an einem
funktionellen p53-Stoffwechselweg in den meisten Tumorzellen abhängt.
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In
dem besagten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird besagter "differenzierender
Zustand" daher durch
eine Klasse A-Verbindung in proliferierenden normalen Zellen mit
einem aktiven p53-Stoffwechselweg, nicht aber in Tumorzellen mit
einem inaktiven p-53-Stoffwechselweg induziert, wodurch besagte
proliferierende normale Zellen von den toxischen Wirkungen der Klasse
B-Verbindungen geschützt
werden, welche eine spezifische Untergruppe chemotherapeutischer
Medikamente ist, die auf replizierende Zellen gerichtet sind.
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Solch
ein Schutz ermöglicht
die reversible Hemmung der Zellteilung, die zur Hemmung der weiteren DNA-Replikation
in normalen Zellen führt,
aber nicht in Tumorzellen, die einen inaktiven p53-Stoffwechselweg aufzeigen.
Dementsprechend wird ein hoher Grad an Selektivität gegenüber Tumorzellen
auf ansonsten nicht-selektive Medikamente vermittelt, so dass es
möglich
wird, eine vollständige
Vernichtung von Tumorzellen zu erreichen, insbesondere solche mit
einer geringen Proliferationsgeschwindigkeit, während normale Zellen verschont
bleiben, in einem Umfeld, in dem sowohl normale wie auch Tumorzellen
vorhanden sind und proliferieren.
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Die
Umkehrbarkeit der Wirkung der Klasse A-Verbindung nach der Entfernung
des Medikaments ermöglicht
die anschließende
Erholung der physiologischen proliferativen Fähigkeit besagter normaler Zellen.
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Dementsprechend
ist als Ergebnis des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ein vollständiger Schutz vieler
normaler Zellen, die in der intermitotischen Phase durch die Wirkung
der Klasse A-Verbindung stehen bleiben, vor der zerstörenden Wirkung
der Klasse B-Verbindung und eine vollständige Zerstörung der Tumorzellen mit einem
inaktiven p53-Stoffwechselweg erreichbar.
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Des
Weiteren sind gemäß der vorliegenden
Erfindung wie unten gezeigt wird sowohl der Schutz normaler Zellen
wie auch die Zerstörung
von Tumorzellen steuerbare Funktionen von bestimmten Parametern (CT:
Zeit der kombinierten Behandlung; CACT: Konzentration der Klasse
A-Verbindung in der kombinierten Behandlung; und CBCT: Konzentration
der Klasse B-Verbindung in der kombinierten Behandlung).
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Dementsprechend
kann der Schutz normaler Zellen und die Vernichtung von Tumorzellen
bis zur vollständigen
und selektiven Vernichtunung aller Tumorzellen in einer gemischten
Kultur und einem signifikanten und selektiven Schutz normaler Zellen
in der Kultur gesteuert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird vor der kombinierten Behandlung eine Vorbehandlung durchgeführt, die
die Verabreichung der schützenden
Verbindung, wie sie oben definiert wird, zu besagter Kultur umfasst,
wobei die Verabreichung besagter schützender Verbindung in dem Verbleib
von mindestens einem Teil besagter normaler Zellen in der Interphase
resultiert.
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In
diesem Fall, bei dem der Stillstand der normalen zu schützenden
Zelle vor der Verabreichung der Klasse B-Verbindung durchgeführt wird,
ist der dadurch erreichbare Schutz steuerbarer, bis hin zur Vollständigkeit
für viele
normale Zellen, die in der Lage sind, in der Kultur zu proliferieren.
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In
dieser Behandlung ist analog zur kombinierten Behandlung wie unten
gezeigt wird der Schutz normaler Zellen eine Funktion bestimmter
Parameter (PT: Vorbehandlungszeit; und CAP: Konzentration der in
der Vorbehandlung verwendeten Klasse A-Verbindung).
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In
jedem Fall muss zur Erreichung des möglichst vollständigen Schutzes
von normalen Zellen berücksichtigt
werden, dass bedingt durch die Umkehrbarkeit der Wirkung der Klasse
A-Verbindungen auf normale Zellen, die gleichzeitige Unterbrechung
der Behandlung mit beiden Verbindungen, den Tod eines kleinen aber messbaren
Prozentanteils normaler Zellen bestimmen kann.
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Tatsächlich ist
diese Wirkung auf die Wirkung der verbleibenden Klasse B-Verbindung
in den normalen Zellen zurückzuführen, die
in der Abwesenheit der Klasse A-Verbindung sofort zu proliferieren
beginnen.
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In
diesem Zusammenhang wird, obwohl die Verabreichung der Klasse A-
und Klasse B-Verbindung gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten
gemäß dem experimentellen
Zweck unterbrochen werden kann, in einer bevorzugten Ausführungsform
nach der kombinierten Behandlung eine Nachbehandlung durchgeführt, die
einen Waschschritt umfasst, worin
- – nach der
Unterbrechung der Verabreichung der besagten Klasse B-Verbindung,
besagte Klasse B-Verbindung aus der Kultur ausgewaschen wird, wobei
die Verabreichung von besagter Klasse A-Verbindung beibehalten wird.
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Nach
diesem Waschschritt kann die Verabreichung der Klasse A-Verbindung
gemäß dem experimentellen
Zweck unterbrochen werden.
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In
dem Verfahren, in dem der Waschschritt durchgeführt wird, kann jegliche verbleibende
cytotoxische Wirkung der Klasse B-Verbindung auf normale Zellen,
die durch die gleichzeitige Unterbrechung der Verabreichung der
Klasse A- und Klasse B-Verbindungen bedingt ist, vermieden werden.
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Als
Folge ist der weitere Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
in der Ausführungsform, die
eine Nachbehandlung umfasst, im Falle, dass die Vorbehandlung in
dem Stillstand aller normalen Zellen mit der Fähigkeit zu proliferieren resultiert,
die vollständig
selektive und vollständige
Vernichtung jeglicher Tumorzellart mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg
und der korrespondierende Schutz jeglicher normaler Zellen in Kultur
ist dadurch erreichbar.
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Eine
Klasse A-Verbindung (die in der Lage ist, solch einen "differenzierenden
Zustand" zwischen
normalen Zellen und Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg
zu induzieren) ist gemäß der vorliegenden
Erfindung jegliche Verbindung mit den folgenden Merkmalen:
- – der
Fähigkeit,
die Zellteilung (Cytodierese) in normalen Zellen zu hemmen,
- – die
Umkehrbarkeit besagter Hemmung der Zellteilung (Cytodierese) in
normalen Zellen und
- – die
Fähigkeit
der Nicht-Hemmung der biologischen Wirkung einer Klasse B-Verbindung.
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Die
Fähigkeit
der Hemmung der Cytodierese gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Fähigkeit,
die Tochter-Zellteilung und damit die anschließenden Phasen des Zellzyklus
in proliferierenden normalen Zellen mit einem funktionellen p53-Stoffwechselweg
durch direkte oder indirekte Wechselwirkung unter Veränderung des
Actomyosin-Cytoskeletts zu hemmen.
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Sie
resultiert im Allgemeinen in einem Zellzyklusstillstand im Binukleusstadium
in mindestens 40 % der Klasse A-Verbindung-behandelten proliferierenden
normalen Zellen unter Verwendung der minimalen Medikamentenkonzentration
(d. h., ausreichend, um reversibel seine Wirkungen auf Zielzellen
ohne Bewirkung eines signifikanten Schadens auszuüben, experimentell
durch Dosis/Reaktionskurven definiert), was das oben genannte Ergebnis
ohne signifikante Toxizität
ergibt und eine Inkubationszeit liegt im Allgemeinen abhängig vom Zelltyp
im Bereich von 12 bis 48 Stunden.
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Die
Umkehrbarkeit nach Medikamentenentzug von besagter hemmender Fähigkeit
ist mit der Wiedergewinnung eines proliferativen Potentials assoziiert, ähnlich dem,
das normale Zellen vor der Behandlung mit dem Klasse A-Medikament
aufzeigten.
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Besagte
Umkehrbarkeit der Wirkungen der Klasse A-Verbindung nach Medikamentenentfernung
umfasst im Allgemeinen:
- – einen Übergang von binuklearen zu
mononuklearen Zellen von mindestens 60 % der Zellen;
- – eine
wiedergewonnene Kompetenz zur DNA-Synthese in mindestens 70 % der
Zellen innerhalb von 48 Stunden nach Medikamentenentzug;
- – am
wichtigsten, eine Rückgewinnung
von mindestens 30 % des klonogenen Potentials im Vergleich zu unbehandelten
Kontrollzellen.
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Betreffend
hingegen die Fähigkeit
der Nicht-Hemmung der biologischen Wirkung einer Klasse B-Verbindung,
resultiert sie im Allgemeinen in der Verringerung der Aufnahme einer
Klasse B-Verbindung durch die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg
in einem Prozentanteil, der geringer oder gleich 50 % ist.
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Spezifische
bevorzugte Klasse A-Verbindungen sind Verbindungen, die zu den Familien
der Cytochalasine (2, 3, 4, 5) mit der Ausnahme von Cytochalasin
B (6, 7, 8) gehören,
die Jasplakinolide (9), Chondramide (10), Isoindolinone (11) und
die Latrunculine (12). Insbesondere Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin
B, Jasplakinolid, Chondramid B und Lactrunculin B.
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Eine
Klasse B-Verbindung (vernichtendes und/oder chemotherapeutisches
Mittel) gemäß der vorliegenden
Erfindung ist statt dessen jegliche Verbindung mit der Fähigkeit, eine
Cytotoxizität
gegenüber
aktiv proliferierenden Zellen aufzuzeigen, ohne das Proliferationspotential
und die Überlebensfähigkeit
von Interphasenzellen zu betreffen.
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Cytotoxizität gegenüber aktiv
proliferierenden Zellen geringer Dichte (102 – 103 Zellen/cm2) ist
eine Toxizität,
die im Allgemeinen in einer Verringerung von mindestens 90 % der
Anzahl der überlebenden
proliferierenden Zellen resultiert (im Vergleich zu nicht behandelten
Kontrollzellen), die mit der geeigneten (d. h. in der Lage, einen
irreversiblen Verlust an Überlebensfähigkeit
in mindestens 90 % der Zellen zu bewirken, wie durch Dosis/Reaktionsexperimente
bestimmt wurde) Medikamentenkonzentration für einen Zeitraum im Bereich
von 24 bis 96 Stunden behandelt wurden.
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Bezüglich der
Fähigkeit,
das proliferative Potenzial von Interphasenzellen nicht zu beeinträchtigen,
ist sie mit der Fähigkeit
einer Klasse B-Verbindung assoziiert, nicht-cytotoxisch gegenüber normalen
Zellen zu sein, die in der intermitotischen Phase als Folge der
Klasse A-Wirkung stillstehen. Sie resultiert im Allgemeinen nach
der Behandlungsunterbrechung in:
- – dem Aufrechterhalten
einer konstanten Interphasen-Zellzahl nach 24 – 48 Stunden Behandlung, was
zu mindestens 80 % der Interphasen-Zellzahl zu Beginn des Experiments
im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen resultiert;
- – der
Induktion der DNA-Synthese durch Serumstimulation, vorzugsweise
in 40 % der Interphasenzellen nach 24 – 48 Stunden Medikamentenbehandlung
im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen.
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Spezifische
bevorzugte Klasse B-Verbindungen sind Verbindungen, die zu den Familien
der Folat-Hemmer, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Hemmer, Vinca-Alkaloide,
Taxane, Colchicin-Derivate, Podophyllotoxin-Derivate und Topoisomerase-Hemmer
gehören
und insbesondere Trifluorthymidin-(2'-deoxy-5-trifluormethyluridin), Cytarabin,
6-Thioguanin, 6-Mercaptopturin, Gemcytabin, Fludarabin, Ftorafur,
Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff,
Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel,
Irinotecan, Topotecan, 9-Amino-20(S)-campothecin. Alle diese Verbindungen zielen
auf verschiedene Phasen des Zellzyklus und haben einen hohen Grad
an Toxizität
für hoch-proliferierende
Zellen (1) gemeinsam.
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In
Bezug auf die Behandlungen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
werden solche Klasse A- und Klasse B-Verbindungen in Kombination
verwendet, wie sie oben genannt wurden, Sie sind von bestimmten
Parametern abhängig.
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In
Bezug auf die Vorbehandlung sind die relevanten Parameter die Vorbehandlungszeit
(PT) und die Konzentration der Klasse A-Verbindung, die in dem Vorbehandlungsschritt
verwendet wird (CAP). Die PT ist die Zeit, die zur Induktion der
Binukleation in normalen Zellen notwendig ist, um diese gemäß dem experimentellen
Zweck zu schützen.
Die PT-Dauer ist
daher eine Funktion der Zellzykluszeit von normalen Zellen, die
zu schützen
sind. in vitro kann sich eine solche Zeit zwischen verschiedenen
Zelltypen unterscheiden, da verschiedene Zelltypen unterschiedliche
Zellzykluszeiten aufweisen (z. B. hat ein primärer Fibroblast unter Standardbedingungen
einen Zellzyklus von ungefähr
24 – 48
h, die C3H10T1/2 20 Stunden). Jedoch könnte ein Fachmann auf dem Gebiet
diese für
jeden Zelltyp auf der Basis des Standes der Technik bestimmen.
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In
einer ex vivo-Behandlung kann diese leicht für alle Zelltypen bestimmt werden,
da die Zellzykluszeit ex vivo (wie in vivo) stark standardisiert
ist.
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In
der bevorzugten Ausführungsform,
bei der die Gesamtheit der normalen Zellen in Kultur zu schützen ist,
ist die PT länger
oder gleich der Zellzyklusdauer von besagten proliferierenden normalen
Zellen in vitro oder ex vivo (in beiden Fällen ist sie die Zeit, die
von den meisten der physiologisch proliferierenden normalen Zellen
in der Kultur zum Stillstand ihres Wachstums benötigt wird). Gemäß einigen
experimentellen Daten liegt dieser Zeitraum unter Standardbedingungen
abhängig
von den Zelltypen zwischen 12 und 96 Stunden.
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Jedoch
kann gemäß dem, was
oben gesagt wurde, die PT abhängig
von dem unterschiedlichen Anteil proliferierender, zu schützender
normaler Zellen in den verschiedenen Anwendungen verlängert oder
gekürzt werden.
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In
Bezug auf den CAP-Parameter ist der korrespondierende Wert einer
Klasse A-Verbindungskonzentration, derjenige, der den Stillstand
von mindestens 40 % der normalen Zellen in dem intermitotischen
Stadium bewirkt; eine solche Konzentration wird experi mentell durch
Dosis/Reaktionsexperimente bestimmt, die den geeigneten Wertebereich
für verschiedene
Zelltypen und Verbindungen definieren.
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Die
relevanten Werte variieren als Funktion der Klasse A-Verbindung
und des verwendeten Zelltyps, aber dementsprechend, was oben gesagt
wurde, kann dieser für
jede einzelne Klasse B-Verbindung durch Fachleute auf dem Gebiet
auf Basis des Wissens des Standes der Technik und der Lehre der
vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
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Für die oben
genannten Klasse A-Verbindungen liegt dieser Wert unter Standardbedingungen
im Bereich zwischen 1 nM- bis 40 μM-Konzentrationen.
Zum Beispiel liegt unter Standardbedingungen der CAP-Wert für Cytochalasin
D vorzugsweise im Bereich von 20 nM – 2 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform
ist er 400 nM; für
das Dihydrocytochalasin B liegt er im Bereich von 600 nM – 8 μM und in
einer bevorzugten Ausführungsform
ist er 2 μM;
für das
Jasplakinolid liegt er im Bereich 50 nM – 3 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform
ist er 700 nM; für
Latrunculin B liegt er im Bereich von 500 nM – 2 μM und in einer bevorzugten Ausführungsform
ist er 650 nM; für
Chondramid B liegt er im Bereich 10 – 800 nM und in einer bevorzugten
Ausführungsform
ist er 100 nM. Besagte bevorzugte Konzentrationen sind die CAP-Werte, die
mit der minimalen Konzentration unter Standardbedingungen korrespondieren,
die notwendig sind, um den Stillstand in der intermitotischen Phase
der normalen zu schützenden
Zellen zu erreichen (minimale funktionelle Konzentration), sie könnten aber
auch höher
sein.
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Tatsächlich kann
jedoch wie die PT auch die CAP als Funktion des gewünschten
zu erreichenden Schutzes variiert werden. Im Allgemeinen kann die
Kombination CAP-PT durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf Basis
der oben genannten Informationen und des Standes der Technik als
Funktion der gewünschten schützenden
Wirkung variiert werden.
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In
Bezug auf die kombinierte Behandlung sind die relevanten Parameter
CT (Zeit der kombinierten Behandlung), CACT (Konzentration der Klasse
A-Verbindung in der kombinierten Behandlung) und CBCT (Konzentration
der Klasse B-Verbindung in der kombinierten Behandlung).
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In
Bezug auf die TC ist diese Zeit funktionell in Bezug auf die gewünschten
Tumorzellvernichtenden Wirkungen. Da Klasse B-Verbindungen replizierende
Zellen töten,
kann die optimale CT als äquivalent
zur durchschnittlichen Zellzykluszeit der zu vernichtenden Tumorzellen
vorausgesagt werden, wobei man der Regel folgt, je länger die
Behandlung, desto besser die Ergebnisse.
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Dementsprechend
ist die CT eine Funktion des Zellzyklus der Tumorzellen, auf die
die Klasse B-Verbindung gerichtet ist, dahingehend, dass sie gleich
oder kürzer
als oder länger
als die Tumorzellzykluszeit gemäß der verschiedenen
Verrichtungsprotokolle, die geplant werden können, ist.
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In
der bevorzugten Ausführungsform,
in der alle Tumorzellen, die zu zerstören sind, einen inaktiven p53-Stoffwechselweg
aufweisen, ist eine solche Zeit im Allgemeinen größer als
oder gleich der Zellzyklusdauer der Tumorzellen mit einem inaktiven
p53-Stoffwechselweg, die zu vernichten sind. Vorzugsweise ist sie
die minimale Zeit, die durch die Tumorzellen mit einem inaktiven
p53-Stoffwechselweg benötigt
wird, um mindestens einen Zellzyklus zu vervollständigen,
welches die Zeit ist, innerhalb der in Abwesenheit der Verabreichung
einer Klasse A-Verbindung alle Tumorzellen innerhalb der Kultur
durch die Klasse B-Verbindung vernichtet werden.
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Die
CT kann jedoch auch bis zu zwei oder mehr Zellzyklusäquivalenten
erhöht
werden, um sogar solche Tumorzellen zu vernichten, die vielleicht
nach dem ersten Zellcyclus überlebt
haben. Jedoch stellt ein CT-Äquivalent
von zwei Tumorzellzyklen keine Obergrenze dar und kann, falls notwendig,
weiter erhöht
werden.
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Eine
solche Zeit kann auch unter eine Zellzykluszeit in Fällen verringert
werden, bei denen eine langsamere vernichtende Wirkung von Nöten ist.
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In
jedem Fall variiert die Zellzykluszeit von Tumorzellen in vitro
von Zelltyp zu Zelltyp (wie oben für die normale Zellzykluszeit
festgestellt wurde). Die CT variiert gemäß dem zu vernichtenden Zelltyp.
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Da
die Zellzykluszeit für
jeglichen Zelltyp durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis
des Standes der Technik bestimmt werden kann, kann die CT auch entsprechend durch
einen Fachmann auf dem Gebiet als Funktion der gewünschten
vernichtenden Wirkung bestimmt werden.
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In
Bezug auf die Konzentration der Klasse A-Verbindung, die in der
kombinierten Behandlung zu verabreichen ist (CACT), ist diese die
Konzentration, die notwendig ist, um den Stillstand in der intermitotischen Phase
von mindestens 40 % der normalen Zellen zu erhalten, die zu schützen sind.
Somit variiert die CACT in einer Weise, die in allem analog zur
CAP ist, in der Funktion der Klasse A-Verbindung und des verwendeten Zelltyps.
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Im
Hinblick auf das, was oben in Bezug auf die Wirkung der Klasse A-Verbindung
gesagt wurde, kann der korrespondierende Wert für jede einzelne Klasse A-Verbindung
durch einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis des Wissens des
Standes der Technik und der vorliegenden Anmeldung bestimmt werden.
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Die
CACT korrespondiert im Allgemeinen mit der CAP und kann daher unter
Standardbedingungen für die
oben erwähnten
Verbindungen in dem Konzentrationsbereich liegen, der für die Vorbehandlung
gezeigt wurde. Obwohl die CACT im Allgemeinen dem CAP gleicht, könnte sie
sogar arbiträr
innerhalb oder außerhalb des
genannten Bereiches erhöht
oder verringert werden. In der bevorzugten Ausführungsform werden Klasse A-Verbindungen
ohne Unterbrechung während
beider Phasen verabreicht.
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In
Bezug auf die Konzentration der Klasse B-Verbindung (CBCT) liegt
diese in einem Bereich, der als Funktion der CT berechnet werden
sollte, des Ziel-Tumorzelltyps und der Halbwertszeit der verabreichten Klasse
B-Verbindung in Kultur. Insbesondere gleicht die CBCT der Medikamentenkonzentration,
die in der Lage ist, mindestens 50 % des Zieltumores innerhalb der
Dauer einer Zellzykluszeit zu töten,
es sei denn, eine langsamere Vernichtungsgeschwindigkeit wird benötigt. Üblicherweise
ist diese unter Standard-Kulturbedingungen für die oben genannten Klasse
B-Verbindungen größer als
oder gleich 100 nM.
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Insbesondere
für das
Trifluorthymidin ist diese Konzentration größer als oder gleich 40 μM, liegt
insbesondere im Bereich von 10 μM – 800 μM, vorzugsweise
50 μM; für das Cytarabin
ist diese Konzentration im Allgemeinen größer als oder gleich 40 μM, insbe sondere
im Bereich von 40 μM – 600 μM, vorzugsweise
40 μM; für das 6-Thioguanin
ist diese Konzentration im Allgemeinen größer als oder gleich 50 μM, insbesondere eine
Konzentration im Bereich von 50 μM – 600 μM, vorzugsweise
100 μM.
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Besagte
bevorzugte Konzentrationen sind die CBCT-Werte, die mit der minimalen
Konzentration unter Standardbedingungen korrespondieren, die notwendig
sind, um Tumorzellen in Kultur (minimale funktionelle Konzentration)
zu vernichten, sie könnten
aber auch höher
sein. Tatsächlich
kann diese Konzentration, bedingt durch die schützende Wirkung der Klasse A-Verbindung
auf normale Zellen, auch bis auf das 10 – 20-fach der erwähnten minimalen
Konzentration davon erhöht
werden.
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In
diesem Zusammenhang kann die Kombination CBTC-TC tatsächlich durch
einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis der oben genannten Information
und des Standes der Technik als Funktion der gewünschten vernichtenden Wirkung
variiert werden. Insbesondere kann sie in einer extrem erwähnenswerten Weise
sowohl in der in vitro wie auch der ex vivo-Behandlung erhöht werden,
aber über
alles in der Vorangegangenen.
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Wie
oben berichtet wurde, umfasst in Bezug auf die Nachbehandlung diese
im Allgemeinen das Auswaschen von mindestens der verabreichten Klasse
B-Verbindung aus der Kultur gemäß dem oben
erwähnten Waschschritt.
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Die
Waschschrittzeit (WST) in vitro hängt von der Erneuerungsgeschwindigkeit
des Mediums und von der Fähigkeit
der normalen Zellen ab, die Klasse B-Verbindung zu katabolisieren.
Dementsprechend kann sie im Allgemeinen aus einem Bereich zwischen
1 und 48 Stunden ausgewählt
werden. Vorzugsweise wird besagter Waschschritt für eine Zeit
durchgeführt,
die größer oder
gleich 3 Stunden ist. Auch könnte
sie in diesem Fall jedoch gemäß den Eigenschaften
des Zelltyps und der Klasse B-Verbindung variiert werden. Sowohl
in der Gegenwart wie auch der Abwesenheit des Waschschrittes nach
der Unterbrechung der Behandlung mit den Klasse A- und B-Verbindungen
wird im Allgemeinen die Erholung der Zellproliferation für einen
variablen Zeitraum ermöglicht,
der in vitro gemäß dem experimentellen
Zweck berechnet werden kann und in vivo gemäß der gewünschten Gewebeerholung.
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Die
minimale Abschätzung
des Schutzes, der durch das Verfahren der Erfindung in der Ausführungsform
zur Verfügung
gestellt wird, in der die normalen Zellen geschützt werden, liegt bei ungefähr 500/1000-fach.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
ist diejenige, in der die Reihenfolge der oben genannten Behandlungen
(Vorbehandlung, kombinierte Behandlung und Nachbehandlung) in der
Kultur zweimal oder mehrfach wiederholt wird, jedes Mal mit den
gleichen Modalitäten
oder mit unterschiedlichen Modalitäten als Funktion des experimentellen
Zwecks.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer
schützenden
Verbindung mit der Fähigkeit
- – die
Zellteilung von normalen Zellen reversibel zu hemmen,
- – die
biologische Wirkung einer chemotherapeutischen Verbindung nicht
zu hemmen, wobei diese chemotherapeutische Verbindung die Fähigkeit
hat
- – eine
cytotoxische Wirkung gegen aktiv proliferierende Zellen auszuüben, aber
- – das Überleben
und proliferative Potenzial von Interphasenzellen nicht zu beeinträchtigen,
für die
Herstellung eines Medikaments zum Schützen von normalen Zellen vor
der eradikativen Wirkung der chemotherapeutischen Verbindung bei
einer Behandlung einer Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg.
-
Eine
solche Verwendung ist die in vivo Anwendung der oben genannten in
vitro und ex vivo-Verfahren.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen,
die auf den Schutz aller normalen Zellen und auf die Vernichtung aller
Tumorzellen gerichtet sind, wird auch die Vorbehandlung und/oder
die Nachbehandlung, wie sie oben definiert ist, durchgeführt.
-
Insbesondere
umfasst die in vivo Vorbehandlung die Verabreichung der schützenden
Verbindung, wie sie oben definiert ist, an besagtes Objekt, das
derer bedarf, wobei die Verabreichung besagter schützender Verbindung
in dem Stillstand in der Interphase von mindestens einem Teil der
normalen Zellen resultiert. Die Nachbehandlung in vivo umfasst einen
Waschschritt, worin
- – nach der Unterbrechung der
Verabreichung besagter chemotherapeutischer Verbindung, besagte
chemotherapeutische Verbindung aus den Geweben des Subjekts herausgewaschen
wird, wobei die Verabreichung besagter Klasse A-Verbindung aufrechterhalten
wird.
-
Ein
erster Vorteil der in vivo-Verwendung der vorliegenden Erfindung
ist, dass ein vollständiger
Schutz vieler normaler Zellen, die in der intermitotischen Phase
stillstehen, vor der vernichtenden Wirkung der Klasse B-Verbindung
dadurch erhalten wird. Solche Zellen resultierten tatsächlich in
einem wirksamen Schutz und einer Umkehrbarkeit, um die Erholung
ihrer physiologischen proliferativen Fähigkeit zu ermöglichen.
Die vollständige
Vernichtung der Tumorzellen in Patientengeweben ist daher erreichbar,
da besagte Vernichtungsbehandlung normale Zellen nicht betreffen
kann, die in der intermitotischen Phase stillstehen, wenn Klasse
B-Verbindungen, wie sie hierin definiert sind, verwendet werden.
-
Ein
zweiter Vorteil der in vivo-Verwendung der vorliegenden Erfindung
ist, dass sowohl der Schutz normaler Zellen wie auch die Vernichtung
von Tumorzellen in jedem Fall als Funktionen der Parameter von jeder Behandlung,
wie hierin definiert ist, steuerbar ist.
-
Insbesondere
die PT und CAP der Vorbehandlung des besagten in vivo-Verfahrens
sind diejenigen, die den vollständigen
Schutz aller proliferierenden normalen Zellen ermöglichen,
die in Patientengeweben vorhanden sind, gemäß dem verfolgten therapeutischen
Ansatz.
-
Mit
spezifischem Bezug auf die PT ist die bevorzugte Zeit wie bei der
ex vivo-Behandlung,
die Zeit, die durch alle physiologisch proliferierenden normalen
Zellen in dem menschlichen Körper
benötigt
wird, bis ihr Wachstum anhält.
Eine solche Zeit kann für
alle Zelltypen vorbestimmt werden, da die Zellzykluszeit in vivo stark
standardisiert ist. Wie in den ex vivo- und in vitro-Verfahren oben
liegt diese Zeit zwischen 12 und 96 Stunden.
-
Jedoch
können
diese Zeiten in den verschiedenen Anwendungen verlängert oder
gekürzt
werden, abhängig
von den verschiedenen Merkmalen der proliferierenden normalen Zellen,
die zu schützen
sind.
-
In
Bezug auf den CAP-Parameter ist diese diejenige, der für die Medikamenten-Plasmakonzentration benötigt wird,
um eine Menge zu erreichen, die ausreichend ist, um proliferierende
normale zu schützende
Zellen in der intermitotischen Phase in verschiedenen normalen Zielgeweben
anzuhalten. In diesem Falle kann ein solcher Wert auch durch Fachleute
auf dem Gebiet für
jede einzelne Klasse A-Verbindung abhängig von dem Verabreichungsmodus
bestimmt werden, der gemäß dem Wissen
des Standes der Technik und den durch die vorliegende Erfindung
beschriebenen Regeln vorausgewählt
wird.
-
Im
Allgemeinen liegt eine solche Menge im oben genannten Bereich (1
nM – 40 μM). Jedoch
sollte auch in vivo für
jede Verbindung der CAP-Wert, der mit der minimalen Konzentration
korrespondiert, die für das
Erreichen des Stillstandes der normalen Zellen in der intermitotischen
Phase in den zu schützenden
Geweben (minimale funktionelle Konzentration) notwendig ist, wie
die oben gezeigten, als bevorzugt angesehen werden.
-
Die
Kombination CAP-TP kann in jedem Fall durch einen Fachmann auf dem
Gebiet auf der Basis der oben genannten Information und des Standes
der Technik als Funktion der gewünschten
schützenden
Wirkung variiert werden.
-
In
Bezug auf die kombinierte Behandlung sind analog zu der Vorbehandlung
auch die CT, CACT und CBCT diejenigen, die eine vollständige Vernichtung
der Tumorzellen in den Patientengeweben gemäß dem befolgten therapeutischen
Ansatz ermöglichen.
-
Insbesondere
kann die CT daher als die minimale Zeit definiert werden, die durch
die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg benötigt wird,
um mindestens einen Zellzyklus zu vervollständigen, aber sie ist vorzugsweise
die Zeit, die durch die Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg
benötigt wird,
um zwei oder mehr Zellzyklen zu vervollständigen, um sogar solche Tumorzellen
zu vernichten, die nach dem ersten Zellzyklus in der Anwesenheit
von Klasse A- und Klasse B-Verbindungen überlebt haben könnten. Auch
stellen die zwei Tumorzellzykluszeiten in vivo keine Obergrenze
für die
CT-Zeit dar, die weiter erhöht
werden kann (siehe oben).
-
Zusätzlich kann
auch eine kürzere
CT als eine Zellzykluszeit in einigen Vernichtungsprotokollen notwendig
sein (z. B., um eine langsamere Vernichtung des Tumors zu erreichen
und so potentielle schädliche entzündliche
Reaktionen bedingt durch die zu hohe Geschwindigkeit des Tumorzelltodes
zu vermeiden).
-
In
Bezug auf die Konzentration der Klasse B-Verbindung (CBCT) ist diese
eine Funktion der kombinierten Behandlungszeit, des Zielzelltyps
und der Halbwertszeit des verabreichten Klasse B-Medikaments in vivo.
-
Auch
kann diese in vivo 100 nM – 800 μM in den
Patientengeweben sein. Jedoch kann, bedingt durch die schützende Wirkung
der Klasse A-Verbindung, eine solche Konzentration bis zum 10 – 20-fachen
der erwähnten
minimalen Konzentration davon erhöht werden.
-
Diese
Möglichkeit
(gut für
die in vitro- und ex vivo-Behandlung, bei der jedoch die Behandlungszeit
und die Konzentrationen der verwendeten Medikamente recht leicht
durch den Operateur gesteuert werden können) ist am wichtigsten in
der in vivo-Behandlung,
in der die Variationen, die durch den Bluttransport des Medikaments
und die Halbwertszeit davon in dem Blut und in den Tumorgeweben
bedingt sind, berücksichtigt werden
müssen.
Zum Beispiel sind tatsächlich
alle Nukleosid-Analogachemotherapeutischen Medikamente im Allgemeinen
dahingehend bekannt, dass sie in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit
aufweisen (ungefähr
1 – 3 Stunden).
-
Zudem
werden transiente plasmatische Konzentrationsspitzen im Allgemeinen
nach der Verabreichung der Nukleosid-Analoga-Medikamente nachgewiesen.
Daher sollte, um eine konstante Konzentration auf der Zellebene
zu erhalten, eine längere
Behandlung zur Verfügung
gestellt werden, der derzeit schwere Nebenwirkungen folgen. Stattdessen
kann nach einer Behandlung mit einer Klasse A-Verbindung eine in
vivo-Perfusion des chemotherapeutischen Medikaments (Klasse B-Verbindung)
durchgeführt
werden.
-
In
diesem Zusammenhang (wie in den in vitro- und es vivo-Behandlungen)
kann die Verabreichungszeit des Klasse B-Medikaments (die mit der
CT-Zeit in dem Verfahren korrespondiert) und die Konzentration selbst
des Klasse B-Medikaments (die mit der CBCT-Konzentration in dem
Verfahren korrespondiert) in vivo in einer extrem erwähnenswerten
Weise erhöht
werden
-
Diese
Tatsache ermöglicht
es, auch in vivo die geeigneten Konzentrationen der Klasse B-chemotherapeutischen
Mittel, Medikamente und/oder die für die Vernichtung aller Tumorzellen
in dem ursprünglichen Kontext
notwendige Verabreichungszeit zu bestimmen.
-
In
Bezug auf die Nachbehandlung ist die WST in vivo neben der Fähigkeit
der Zelle, die Klasse B-Verbindung zu katabolisieren, auch eine
Funktion der intrinsischen, hematischen und/oder Gewebe-Halbwertszeit der
Klasse B-Verbindung selbst.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
ist diejenige, in welcher die Reihenfolge der Vorbehandlung, kombinierten
Behandlung und/oder Nachbehandlung mit den gleichen Modalitäten oder
mit verschiedenen Modalitäten
als Funktion des therapeutischen Zwecks zu wiederholen sind.
-
Die
in vivo-Verwendung der vorliegenden Erfindung kann entweder für eine systemische
Behandlung oder für
eine topische Behandlung verwendet werden. Zudem kann sie unter
der Voraussetzung, dass die Tumorzielzellen einen inaktivierten
p53-Stoffwechselweg aufweisen, auf einen malignen Tumor wie auch
auf gutartige Tumore angewendet werden, wie die hyperproliferativen
Lesionen, die durch eine Papillomavirus-Infektion bewirkt werden.
Sie kann auch in der Behandlung von pathologischen Infektionen angewendet
werden, die durch Mikroorganismen hervorgerufen werden, die keinen
p53-Stoffwechselweg aufweisen und somit keine p53-Funktion, und
in der Behandlung von Alopezia, die mit standardisierter systemischer
Chemotherapie assoziiert ist.
-
Dementsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung zusätzlich die Verwendung einer
schützenden Verbindung,
wie sie in Anspruch 14 definiert ist, für die Herstellung eines Medikaments
zum Schützen
von normalen Zellen vor der eradikativen Wirkung einer chemotherapeutischen
Verbindung bei einer Behandlung einer pathologischen Infektion,
die durch Mikroorganismen verursacht wird, die keine p53-Funktion
aufweisen.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
sind eine Vorbehandlung und/oder eine Nachbehandlung, wie sie in
dem Verfahren zum Schützen
proliferierender normaler Zellen einer Behandlung von Tumorformen
definiert sind, wie es oben beschrieben wird, mit umfasst.
-
Die
Behandlungen der Verwendung kann mittels systemischer und/oder topischer
Verabreichungen durchgeführt
werden. Mikroorganismen ohne p53-Funktion sind jegliche prokaryontischen
und eukaryontischen Mikroorganismen ohne F53-Stoffwechselweg, die
mit einer pathologischen Infektion assoziiert sind. Ein Subjekt,
das dieser Bedarf, kann ein Subjekt jeglicher Tierspezies sein,
vorzugsweise Menschen.
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung gemäß dem, was oben gesagt wurde,
ist auch eine Verwendung einer schützenden Verbindung, wie sie
in Anspruch 14 definiert ist, für
die Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und Behandeln von
Alopezia, die mit einer systemischen Verabreichung einer chemotherapeutischen
Verbindung bei einer Behandlung von Zellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg
assoziiert ist.
-
In
diesem Fall ist eine bevorzugte Form der Verabreichung der Klasse
A-Verbindung eine topische Verabreichung.
-
Analog
zu den oben genannten Verwendungen sind in bevorzugten Ausführungsformen
eine Vorbehandlung und/oder eine Nachbehandlung, wie sie zum Schutz
proliferierender normaler Zellen in einer Behandlung von Tumorformen
oben genannt werden, mit umfasst.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist auch ein pharmazeutisches Produkt,
das eine therapeutisch wirksame Menge einer schützenden Verbindung (Klasse
A-Verbindung), wie sie oben definiert wird, eine therapeutisch wirksame
Menge einer chemotherapeutischen Verbindung (Klasse B-Verbindung),
wie sie oben definiert wird, in einem pharmazeutisch verträglichen
Trägermittel,
Träger
oder Hilfsmittel umfasst.
-
Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die als ein Adjuvans, insbesondere in einer Behandlung
einer Tumorform mit einem inaktivierten p53-Stoffwechselweg geeignet
ist, insbesondere der Formen mit einem gering proliferierenden Potential,
einer hyperproliferierenden Lesion, die durch Papillomavirus hervorgerufen
wird und Alopezia, die mit systemischer Therapie assoziiert ist,
die eine therapeutisch wirksame Menge einer schützenden Verbindung (Klasse
A-Verbindung), wie sie
oben definiert ist, optional einer therapeutisch wirksamen Menge
einer chemotherapeutischen Verbindung (Klasse B-Verbindung), wie
sie oben definiert ist, und ein pharmazeutisch verträgliches
Trägermittel,
Träger oder
Hilfsmittel umfasst.
-
Eine
therapeutisch wirksame Menge der schützenden Verbindung gemäß der vorliegenden
Erfindung ist eine Menge, bei der die CAP- und/oder CATC-Konzentration,
wie sie oben gezeigt wird, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung
in Zielgeweben erhalten wird. Tatsächlich ermöglichen besagte CAP- und CATC-Konzentrationen
der schützenden
Verbindung der vorliegenden Erfindung ihre therapeutische Wirkung in
einem Zielgewebe auszuüben,
welche eine Adjuvanswirkung ist, die typischerweise in einem Zellschutz
besteht.
-
Eine
therapeutisch wirksame Menge der chemotherapeutischen Verbindung
gemäß der vorliegenden Erfindung
ist eine Menge, bei der die CBTC-Konzentration, wie sie oben gezeigt
wird, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Zielgeweben
erhalten wird. Tatsächlich
ermöglicht
besagte CBTC-Konzentration es der chemotherapeutischen Verbindung
der vorliegenden Erfindung, ihre chemotherapeutische Wirkung in
einem Zielgewebe auszuüben,
welche typischerweise Cytotoxizität ist.
-
In
diesem Zusammenhang kann eine therapeutisch wirksame Menge der schützenden
Verbindung und der chemotherapeutischen Verbindung, die als Adjuvantien
und wirksame Mittel in den verschiedenen oben gezeigten Verbindungen
wirksam sind, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
verschieden sein.
-
Zusätzlich können sowohl
die therapeutisch wirksame Menge der schützenden Verbindung und die therapeutisch
wirksame Menge der chemotherapeutischen Verbindung der vorliegenden
Erfindung zwischen systemischer und topischer Verabreichung, abhängig auch
von der Art der Verabreichung und dem Träger und/oder Trägermittel,
das verwendet wird, variieren.
-
Ein
Fachmann auf dem Gebiet kann jedoch solche Mengen auf Basis des
Standes der Technik und der hierin offenbarten Lehre ableiten.
-
In
dem Fall, in dem eine chemotherapeutische Verbindung mit umfasst
ist, wird die Zusammensetzung gemäß dem Stand der Technik derart
hergestellt, dass die pharmakologische Freisetzung der chemotherapeutischen
Verbindung vorzugsweise in Bezug auf die pharmakologische Freisetzung
der schützenden
Verbindung retardiert ist.
-
Vorzugsweise
wird die schützende
Verbindung aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Cytochalasinen mit der Ausnahme von Cytochalasin B, Jasplakinoliden,
Chondramiden, Isoindolinonen und den Latrunculinen, besteht, spezifisch
kann sie Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid
B und/oder Latrunculin B sein.
-
Vorzugsweise
wird die chemotherapeutische Verbindung aus der Gruppe ausgewählt, die
aus Folat-Hemmern, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Hemmern,
Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten
und Topoisomerase-Hemmern
besteht, insbesondere kann sie Trifluorthymidin, Cytarabin, 6-Thioguanin,
6-Mercaptoputrin, Gemcytabin, Fludarabin, Floxuridin, Ftorafur,
Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat, Lometrexol, Hydroxyharnstoff,
Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin, Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel,
Irinotecan, Topotectan und/oder 9-Amino-S(20)-camptothecin sein.
-
Ein
pharmazeutisch verträgliches
Trägermittel,
Träger
oder Hilfsstoff für
die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist
ein Trägermittel,
Trägerstoff
oder Hilfsmittel, von dem auf dem Gebiet bekannt ist, dass es mit
den oben erwähnten
beschriebenen Verbindungen kompatibel ist.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist auch der folgende Kit:
- • ein
Teilekit zum selektiven Vernichten von Zellen mit einem inaktiven
p53-Stoffwechselweg und selektiven Schützen von proliferierenden normalen
Zellen, umfassend:
- – eine
schützende
Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse A-Verbindung oder
Medikament);
- – eine
chemotherapeutische Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse
B-Verbindung oder Medikament) als Kombinationszubereitung zur simultanen,
separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in der in vivo- und/oder
ex vivo-Therapie von Tumorformen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg
(einschließlich gutartiger
Formen wie eine hyperproliferative Lesion, die durch Papillomavirus
bewirkt wird), vorzugsweise derjenigen mit einem geringen Proliferationspotenzial.
- • Einen
Teilekit zur selektiven Vernichtung von Zellen ohne p53-Funktion
und zum selektiven Schützen
proliferierender normaler Zellen, umfassend:
- – eine
schützende
Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse A-Verbindung oder
Medikament);
- – eine
chemotherapeutische Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse
B-Verbindung oder Medikament) als Kombinationszubereitung zur simultanen,
separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in der Therapie einer
pathologischen Infektion, die mit einem Mikroorganismus ohne p53-Funktion
assoziiert ist;
- • Einen
Teilekit zur selektiven Vernichtung von Zellen mit einem inaktiven
p53-Stoffwechselweg oder ohne p53-Stoffwechselweg und dem selektiven
Schützen
proliferierender normaler Zellen, umfassend:
- – eine
schützende
Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse A-Verbindung oder
Medikament);
- – eine
chemotherapeutische Verbindung, wie sie oben definiert ist (Klasse
B-Verbindung oder Medikament) als eine Kombinationszubereitung zur
simultanen, separaten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in dem
Verfahren zum Schützen
proliferierender normaler Zellen in einer in vitro-Kultur der vorliegenden
Erfindung.
-
In
den Kits der vorliegenden Erfindung wird die schützende Verbindung vorzugsweise
aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Cytochalasinen mit der Ausnahme von Cytochalasin B, Jasplakinoliden,
Chondramiden, Isoindolinonen und den Latrunculinen besteht, spezifisch
kann sie Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chondramid
B und/oder Latrunculin B sein.
-
Vorzugsweise
wird die chemotherapeutische Verbindung in den Kits der vorliegenden
Erfindung aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Folat-Hemmern, Nukleosid-Analoga, Nukleotidsynthese-Hemmern,
Vinca-Alkaloiden, Taxanen, Colchicin-Derivaten, Podophyllotoxin-Derivaten
und Topoisomerase-Hemmern besteht, spezifisch kann sie Trifluorthymidin,
Cytarabin, 6-Thioguanin, 6-Mercaptoputrin, Gemcytabin, Fludarabin,
Floxuridin, Ftorafur, Methotrexat, Trimetrexat, Raltitrexed, Edatrexat,
Lometrexol, Hydroxyharnstoff, Vincristin, Vinblastin, Vinorelbin,
Vindesin, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan, Topotecan und/oder
9-Amino-S(20)-campothecin sein.
-
Die
schützenden
und chemotherapeutischen Verbindungen der Kits der vorliegenden
Erfindung können
in dem Kit zusammen mit einem kompatiblen Trägermaterial mit umfasst sein,
welches in den Kits zur medizinischen Verwendung auch jeweils mit
einer schützenden
Zusammensetzung und einer therapeutischen Zusammensetzung pharmazeutisch
verträglich
ist.
-
Ein
kompatibles Trägermittel
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist jegliches Trägermittel,
das auf dem Gebiet als kompatibel mit den oben definierten Verbindungen
bekannt ist.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung sind zudem die Verwendung von C3H10T1/2-Zellen
oder von Zellen, die gemäß den auf
dem Gebiet zu diesem Zweck bekannten Techniken davon abgeleitet
sind, um Verfahren aus Kulturen zur Vernichtung von Tumorzellen
mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg herzustellen, die besagte
Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechsweg und normale Zellen
umfassen und insbesondere für
ein Verfahren für
eine Behandlung einer Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg.
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist zudem die Verwendung des Verfahrens
und der C3H10T1/2-Zellen oder von Zellen, die davon gemäß den für diesen
Zweck bekannten Techniken auf dem Gebiet abgeleitet sind, zur Identifizierung
schützender
Verbindungen und/oder chemotherapeutischer Verbindungen, wie sie
oben definiert sind.
-
Die
Erfindung wird besser mit Unterstützung der beigefügten Figur
beschrieben werden.
-
Beschreibung
der Figur
-
1 zeigt den zeitlichen Verlauf
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform
davon in tabellarischer Form, das mit einem System aus C3H10T1/2-
und C3H10/T1/2v-src/v-myc-Zellen ausgeführt wird.
-
Die
Begriffe T0h, T24h, T72h, T84h zeigen die Zeiten des Verfahrens
ausgedrückt
in Stunden an; insbesondere korrespondiert T0h mit 0 Stunden, T24h
mit 24 Stunden, T72h mit 72 Stunden und T84h mit 84 Stunden.
-
In
Zeile 1 wird die Zeit der Behandlung, die nur mit dem Klasse A-Medikament
von Zeit T0 bis Zeit T84 bewirkt wird, gezeigt.
-
In
Zeile 2 wird die Zeit der Behandlung, die nur mit dem Klasse B-Medikament
von Zeit T24 bis Zeit T72 bewirkt wird, gezeigt.
-
In
Zeile 3 werden die Zeiten des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung,
wie sie in ihrer bevorzugten Ausführungsform auf die oben gezeigten
Zellen angewendet wer den, gezeigt: insbesondere ist hervorgehoben,
wie die Behandlung mit dem Klasse A-Medikament in der Zeit T0 bis Zeit T84
bewirkt wird und die Behandlung mit dem Klasse B-Medikament überlappt
mit der Klasse A-Medikamentenbehandlung von Zeit T24 bis Zeit T72.
Die Zeit T0 – T24
ist die PT-Zeit, die Zeit T24-T72 ist die CT-Zeit, die Zeit T72 – T84 ist
die WST-Zeit, die Zeit 10 – 15
Tage ist die Zeit zum Ermöglichen
der Proliferation von normalen Zellen nach der Behandlung.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Ein
hauptsächliches
Merkmal der in vitro-Verfahren und der medizinischen Verwendungen
der vorliegenden Erfindung ist die relevante Anwendbarkeit auf jegliche
Tumorform mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg. Solch ein Merkmal
wurde aus verschiedenen Assays abgeleitet, die zuerst darauf gerichtet
waren, die molekularen Gründe
für den
Binukleations-/Multinukleations-Phenotyp in normalen/Tumorzellen
zu verifizieren.
-
Im
dem ersten Fall wurde daher eine Assay-Serie, die ausgiebig in Beispiel
1 beschrieben wird, durchgeführt,
um zu verifizieren, ob die Bestimmung eines solchen Zustands dem
Verlust der Funktionen zugeschrieben werden kann, die mit einem
oder mehreren Tumor-Suppressor-Genen (hiernach als TSG bezeichnet)
assoziiert sind (13).
-
Solche
Assays wurden mit "Knock-out"-Zellen (genetisch
Null) für
einzelne TSG-Funktionen ausgeführt,
da die relevanten Ergebnisse direkt signifikant für die Tumorformen
sind, mit denen sie normalerweise assoziiert sind (14).
-
Die
untersuchten TSG-Funktionen sind die relevantesten: Rb- (Retinoblastom),
p21- und p53-Gene. In den relevanten "Knock-out"-Zellen existiert die Funktion nicht,
daher können
die gewonnenen Daten auf den Verlust dieser spezifischen Funktion
zurückgeführt werden.
-
Der
Nukleui-Anzahl-Zustand der Knock-out-Zellen nach besagten Assays
(siehe Beispiel 1) zeigt, dass die p53-Funktion eine zentrale Rolle
in der Bestimmung des Multinukleuszustandes in den Tumorzellen hat,
während
Rb- und p21- Knock-out dieses nicht tun (die relevanten Knock-out-Zellen
behalten tatsächlich den
binuklearen Zustand). Der Wachstumsstillstand im binuklearen Zustand
in der Abwesenheit von p21- oder pRb
schlägt
deutlich vor, dass die Cytokinese-Blockade einen neuen wachstumshemmenden
Stoffwechselweg auslöst,
der einzigartig und unterschiedlich von dem ist, der mit Wachstumshemmung
assoziiert ist, die durch Microtubulie- destabilisierende Mittel
und Röntgenbestrahlung
induziert wird, von dem bekannt ist, dass er beide, p21 und pRb,
benötigt
(15).
-
Weitere
Assays mit p35-Knock-out-Zellen, die mit einem temperaturempfindlichen
Allel von p53 rekonstituiert wurden, haben, während sie die vorangegangenen
Daten (siehe Beispiel 1) bestätigen,
auch die p53-Funktion als Kontrollpunkt "Schalter" für
den binuklearen/multinuklearen Zustand in Zellen gezeigt. p53 wird
tatsächlich
als notwendig und ausreichend für
die Etablierung eines solchen "differenzierenden
Zustands" zwischen
Tumorzellen und proliferierenden normalen Zellen nachgewiesen.
-
Nach
diesen Assays, die mit murinen Zellsystemen durchgeführt wurden,
wurde die Validität
der relevanten Ergebnisse bestätigt
und auf menschliche Zelllinien erweitert, d. h., auf solche von
größerem Interesse. Die
verwendeten Zelllinien waren menschliche Lungen-Fibroblasten (LHF),
entweder normal oder durch Transfektion mit zwei Papillomavirus-Onkogenen
(E6 und E7) transformiert, die in der Lage sind, jeweils das p53
und die pRB-Genprodukte zu binden und funktionell zu inaktivieren.
-
Die
in Beispiel 2 beschriebene Assayserie übertrug die Validität der Daten
der murinen Zelldaten auf menschliche Zelllinien, wodurch der Schluss
unterstützt
wird, dass p53 einen Cytodierese (Zellteilungs)-Kontrollpunkt reguliert,
dessen Verlust einen Zustand darstellt, der zur Induktion eines
multinuklearen Zustands in Zellen ausreicht, bei denen die Cytokinese
blockiert ist.
-
Die
Inaktivierung des p53-Stoffwechselweges ist ein Zustand, der in
den meisten bekannten Tumorformen nachweisbar ist (14). Die meisten
von diesen haben tatsächlich
nicht nur eine inaktive p53-Funktion, sondern sind durch diese gekennzeichnet.
Jedoch ist sogar in unbekannten Tumorformen oder in Tumorformen,
für die
keine Information bezüglich
des p53-Stoffwechselweges vorhanden ist, im Hinblick auf die oben genannten
Ergebnisse ein inaktiver p53-Stoffwechselweg a priori ein Anhaltspunkt
für die
Fähigkeit
einer Multinukleation.
-
Um
zu verifizieren, ob und in welchem Ausmaß ein solcher Zustand als "differenzierender
Zustand" verwendet
werden könnte,
wurde ein in vitro-Modellsystem zur Verifizierung von Verbindungen
und Bedingungen, die für
die in vivo-Situation relevant sein könnten, abgeleitet.
-
Ableitung
eines Modellsystems
-
Um
ein solches System aufzubauen, welches wie oben im Überblick über den
Stand der Technik hervorgehoben wurde, auf dem Gebiet nicht verfügbar war,
wurde eine beträchtliche
Anzahl von Assays durchgeführt.
-
Um
Gegenstand quantitativer Tests zu sein, die das Modell bestätigen und
validieren, war ein neues System notwendig, das aus:
- a) normalen Zellen, die eine phenotypische Stabilität in Kultur
aufzeigen und den Stillstand nach der Verabreichung von Cytokinese-Hemmern
im Binukleusstadium aufrechterhalten;
- b) einem isogenes tumoröses
Gegenstück,
das auch phenotypische Stabilität
aufzeigt, aber in der Lage ist, Multinukleation in der Gegenwart
von Cytokinese-Hemmern zu durchlaufen (d. h. mit einer p53-Funktion, die
inaktiviert ist oder umgangen wird) aufgebaut ist.
-
Als
Konsequenz der schlechten Wachstumseigenschaften natürlicher
primärer
Zellen (die nicht in vitro in den experimentellen Ansätzen, die
auf die Messung klonogenen Potentials gerichtet sind, nützlich sind)
wurden übliche
verwendete Zelllinien untersucht.
-
Die
Mehrheit davon erwies sich jedoch als natürlich befähigt, einen transformierten
Zustand aufzunehmen (mit dem entsprechenden Verlust der Fähigkeit,
in einem binuklearen Zustand zu verbleiben).
-
Die
C3H10T1/2-Zellen (Maus-Fibroblasten) wurden letztendlich ausgewählt, da
sie tatsächlich
relativ stabil sind, klonogenes Potenzial in Kultur zeigen und die
Fähigkeit
auf zeigen, Binukleation nach der Verabreichung des Cytochalachalasins
D (CD) zu durchlaufen, das in diesen Assay-Serien verwendet wurde
(und in den vorausgegangenen, von denen in Beispiel 1 und 2 berichtet
wird), um Cytokinese in normalen Zellen zu hemmen.
-
Dann
musste das tumoröse
Gegenstück
von C3H10T1/2 hergestellt werden, was die Überwindung einiger Probleme
implizierte.
-
Das
Hauptsächliche
war die Notwendigkeit der Gewinnung stabil transformierter Zellen,
die gleichzeitig polyklonal sind, um die höchste Messzuverlässigkeit
für den
oben genannten Zweck zur Verfügung
zu stellen (Verifizierung, dass die Binukleation / Multinukleation
als "differenzierender
Zustand" geeignet
ist). Die einzige Behandlung, die eine stabile und polyklonale Tumorpopulation
für C3H10T1/2-Zellen
sicherstellt, die zu primären
Zellen extrem ähnlich
sind, ist tatsächlich
die kooperative Transformation mit zwei retroviralen Onkogenen nacheinander
wie den v-src und v-myc-Onkogenen.
-
In
jedem Fall war es durch die Vorurteile auf dem Gebiet bezüglich retroviraler
Onkogene (16) sowieso notwendig, die multinukleative Fähigkeit
der Zellen, die mit v-src und v-myc
transformiert worden waren, nach der Verabreichung von Cytochalasin
D zu untersuchen. Der positive Ausgang des relevanten Assays stellte auch
eine klare Indikation dahingehend zur Verfügung, dass die Transformation
mit v-src und v-myc nacheinander die Inaktivierung oder die Umgehung
des p53-abhängigen
Cytokinese Kontrollpunkts bewirkt.
-
Im
Lichte dieses Ergebnisses wurde ein Modellsystem aufgebaut, das
Kulturen von entweder C3H10T1/2 normalen Zellen oder C3H10T1/2v-src/v-myc-Tumorzellen
umfasst, die allein kultiviert werden, und eine gemischte, die aus
C3H10T1/2- und C3H10T1/2v-src/v-myc-Zellen
besteht. Die letztere wurde insbesondere so hergestellt, dass sie
hauptsächlich
aus normalen Zellen besteht und zu einem geringeren Anteil aus Tumorzellen
(ähnlich
einer in vivo-Situation).
-
Dann
wurde dieses System einer Assay-Serie ausgesetzt, die darauf gerichtet
ist, die Zell-Nuklei-Anzahl und die Fähigkeit derer, DNA-Synthese
in der Gegenwart oder Abwesenheit von Cytochalasin D durchzuführen, zu
analysieren.
-
Im
Hinblick auf den positiven Ausgang dieser Assay-Serien ergab sich
das oben genannte System als validiert.
-
Erste Definition
der Verwendung der vorliegenden Erfindung
-
Um
dann die mögliche
Eignung der Verwendung des Binukleations-/Multinukleations-Zustandes als einen "differenzierenden
Zustand" zu verifizieren,
wurde eine Assay-Serie unter Verwendung von CD ausgeführt und
als ein vernichtendes Agens Trifluorthymidin (3FT), ein sehr starkes
cytotoxisches Mittel, verwendet.
-
In
allen drei Kulturtypen wurden beide Zelltypen (normal und Tumor)
in aktiv proliferierenden Zuständen
gehalten, um Verzerrungen in den Ergebnissen, die durch den möglichen
Zellzyklusarrest bedingt sind, aus Gründen zu vermeiden, die unabhängig von
der Verbindungsverabreichung sind.
-
Die
kombinierte Verabreichung besagter zwei Verbindungen resultierte
tatsächlich
in einer Tumorzellvernichtung.
-
Als
Konsequenz wurden CD und 3FT dann bei verschiedenen Dosierungen
und Zeiten verabreicht, wobei darauf geachtet wurde, dass immer
die notwendigen Verifizierungen durchgeführt wurden, um die wirksamste
Kombination der verabreichten Zeit-/Konzentrations-Parameter aufzufinden.
-
Die
am meisten signifikanten Assay-Serien, die sich auf optimale Parameter-Kombinationen beziehen, fanden
schließlich
heraus, dass die Erreichung einer vollständigen Vernichtung der Tumorzellen
und eines wirksamen Schutzes der normalen Zellen ausgiebig in den
Beispielen 3 (qualitative Assays) und 4 (quantitative Assays) offenbart
werden.
-
In
dieser Weise wurden die Verfahrensschritte in der bevorzugten Ausführungsform
abgeleitet, worin alle Tumorzellen vernichtet werden und die meisten
proliferierenden normalen Zellen geschützt werden, wie oben in der
Zusammenfassung der Erfindung (siehe auch 1) beschrieben wird.
-
Die
Auswahl des kolonienbildenden Assays (der eine direkte Anzeige des
klonogenen Potentials der Zellen zur Verfügung stellt) als operativer
Assay anstatt anderer Assays (wie z. B. die Plattenzellzahl), der
in der Messung der proliferativen Fähigkeit verwendet wird, ist
nicht nur für
die stringente Verifizierung der Induktion notwendig, sondern auch
für die
Umkehrbarkeit des differenzierenden Wachstumsarrest- "Zustandes" in normalen Zellen.
-
Insbesondere
in Bezug auf den Vorbehandlungsschritt ist die korrespondierende
Dauer von 24 Stunden, die in dem Schema von 1 gezeigt wird, etwas länger als
die Zellzykluszeit der verwendeten C3H10T1/2-Zellen. Obwohl die
in diesem Assay berichtete Cytochalasin D-Konzentration 400 nM beträgt, zeigten
sich sogar Konzentrationen im Bereich von 50 nM – 1,6 μM als wirksam.
-
Betreffend
den kombinierten Behandlungsschritt: Dieser wurde für 48 Stunden
durchgeführt
(die Zeit, die für
die C3H10T1/2v-src/v-myc-Tumorzellen für die Vervollständigung
von zwei Zellzyklen notwendig ist und zudem die minimale Zeit, die
für das
vollständige
Zell-Nachbehandlungs-Abtöten
mit dem Klasse B-Medikament allein notwendig ist).
-
Die
Cytochalasin D-Konzentration wurde in Bezug auf die Vorbehandlung
konstant gehalten. Die verabreichte 3FT-Konzentration betrug 40 μM, jedoch
erwiesen sich auch Konzentrationen in einem Bereich von 10 – 800 μM als nützlich.
-
Betreffend
den Nachbehandlungsschritt: der Waschschritt wurde für einen
Zeitraum von 12 Stunden durchgeführt,
der Zeit, die als Funktion (genauer, sie ist umgekehrt proportional
zu) der katabolen Geschwindigkeit des Klasse B-Medikaments berechnet
wurde.
-
Statt
dessen betreffend die Proliferations-Wiederaufnahme der normalen
Zellen, da diese per Definition variable ist, in dem spezifischen
Fall eines Kolonie- bildenden Assays in vitro, wurde sie als die
Zeit festgesetzt, die notwendig ist, um sichtbare Kolonien zu erhalten
(diese variiert gemäß dem vorher
gewählten
Zelltyp).
-
In
den Assay-Serien, die stattdessen darauf gerichtet waren, eine vollständige Vernichtung
der Tumorzellen zu erhalten sowie den vollständigen Schutz der vielen normalen Zellen,
ist sie die Zeit, die für
eine korrekte Umbildung einer normalen Zell-Monoschicht und für das Auftreten
von möglichen
sichtbaren Zellfoci notwendig ist (d. h. mit einer Dimension von
mindestens 2 mm) (siehe Beispiel 4).
-
In
dieser Hinsicht, um ein zuverlässiges
Ergebnis zu erhalten, wurde eine Zeit – und sollte immer, auf der
Basis der Synchronisation der Test-Kontrollgruppe berechnet. Die
unterschiedliche Proliferations-Aufnahmezeit der Kontrollzellen
sollte entsprechend berücksichtigt
werden. Tatsächlich
haben die letztgenannten Zellen eine kürzere Wiederaufnahmezeit in
Bezug auf die behandelten Zellen, die nach dem Stillstand längere koloniebildende
Zeiten in Bezug darauf gemäß den oben
genannten Standards aufweisen.
-
Genauer
gesagt, unter Berücksichtigung
der Zeiten der Assay-Kontrollgruppe, beträgt eine solche Zeit in den
Assays, die mit dem System der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden,
7 bis 15 Tage. Insbesondere, wenn z. B. die Kontrollzellen (sowohl
normale wie auch transformierte) eine siebentägige Nachbehandlungszeit haben,
haben die mit Cytochalasin D behandelten Zellen einen 10-Tages-Zeitraum,
usw.
-
Von
den Daten her ist es ersichtlich, dass, während normale und transformierte
Zellen gleichermaßen durch
die 3FT-Behandlung getötet
werden, dass die CD/3Ft-kombinierte Behandlung einen selektiven
Index von mindestens dem 500fachen gegenüber transformierten Zellen
aufzeigt: d. h. normale Zellen wurden mindestens 500fach resistenter
gegenüber
3Ft-lethalen Wirkungen als Ergebnis des Schützens durch die CD-Verabreichung,
wohingegen transformierte Zellen vollständig empfänglich verblieben.
-
Definition der Klasse
A-Verbindung
-
Als
Ergebnis der oben genannten Assays wurden, während genaue Indikationen in
Bezug auf die gemeinsame Verwendung erhalten wurden, positive Indikationen
gleichzeitig über
die Eignung von Cytochalasin C und 3FT für die selektive Vernichtung
von Tumorzellen mit einem inaktiven p53-Stoffwechselweg erhalten.
-
Insbesondere
CD als die Verbindung, die den schützenden "differenzierenden Zustand" und 3FT als das
vernichtende Mittel. In diesem Zusammenhang wurde, um die relevanten äquivalenten
Verbindungen zu verifizieren (hierin jeweils als Klasse A- und Klasse B-Verbindung
definiert) in einem ersten Fall eine Assay-Serie durchgeführt, um
zu verifizieren, welche Eigenschaften jeweils für die Fähigkeit der Induktion eines
solchen Zustandes und zur Vernichtung der Tumorzellen darin verantwortlich
waren.
-
In
Bezug auf CD wurde zuerst hypothetisiert, dass die relevanten Eigenschaften
des Zellsystems der vorliegenden Erfindung aus das Folgende zurückzuführen sind:
- 1. die Fähigkeit
der Hemmung der Cytodierese (Zellteilung) von normalen Zellen;
- 2. die Umkehrbarkeit einer solchen Hemmung und
- 3. die Fähigkeit
der Nicht-Hemmung der biologischen Wirkung einer zweiten Verbindung
(hiernach als Klasse B-Verbindung oder Medikament bezeichnet).
-
Im
Prinzip stellen die drei oben beschriebenen Eigenschaften die wesentlichen
Eigenschaften dar, die jegliches Medikament aufzeigen muss, um in
dem Schutz von normalen Zellen verwendet zu werden. Tatsächlich:
- – die
Medikamenten-induzierte Hemmung der Cytodierese (Zellteilung) aktiviert
einen Kontrollpunkt, der zum Wachstumsstop in normalen Zellen, aber
nicht in Tumorzellen mit einem unterbrochenen p53-Stoffwechselweg
führt;
- – der
Medikamenten-induzierte Wachstumsstop muss vollständig umkehrbar
sein, so dass normale Zellen die Proliferation wieder aufnehmen
können
und ihre qualitativen und quantitativen Funktionen durchführen können;
- – sollte
das Medikament auch den intrazellulären Transport des sekundären chemotherapeutischen
Medikaments (d. h. der Klasse B-Verbindung) über eine akzeptable Grundmenge
hinaus betreffen, dann muss die Tumorzelltötung durch das Klasse B-Medikament dementsprechend
in der kombinierten Behandlung verringert werden.
-
Solche
Hypothesen wurden in zwei Assay-Serien verifiziert, die in erster
Linie auf die Verifikation der oben genannten Merkmale von CD gerichtet
sind.
-
In
Bezug auf die ersten Assay-Serien, die ausgiebig im Beispiel 5 beschrieben
werden, wurden die ersten zwei Merkmale (Fähigkeit der reversiblen Hemmung
der Cytodierese in normalen Zellen) untersucht.
-
Die
dritte Eigenschaft wurde mit einer weiteren Assay-Serie verifiziert,
und bestand insbesondere aus einem koloniebildenden Assay in einem
System, das ausschließlich
aus Tumorzellen gebildet wurde, worin die Wirkungen der Cytochalasin
D-Verabreichung mit denen der Verabreichung von Cytochalasin B (CB)
verglichen wurden.
-
Als
Ergebnis eines solchen Assays, der ausgiebig in Beispiel 6 beschrieben
wird, wird beobachtet, dass, während
CB eindeutig mit 3FT-toxischen Wirkungen wechselwirkt, was einen
bestimmten Grad an Überleben
der Tumorzellen sicherstellt, dass CD keinerlei Überleben von solchen Zellen
(siehe Tabelle 6) ermöglicht.
Die 3FT-Verabreichung, die tatsächlich
mit der CD-Verabreichung kombiniert wird und gemäß den Parametern der vollständigen und
maximalen selektiven Vernichtung durchgeführt wird, bestimmt die vollständige Vernichtung
der kultivierten Tumorzellen, wohingegen die CB-Verabreichung unter den gleichen Bedingungen lediglich
eine teilweise Vernichtung bewirkt. Solch eine teilweise Vernichtung
ist durch die oben genannte Wechselwirkung bedingt und nicht durch
eine bestimmte Einstellung der oben genannten Parameter und ist dementsprechend
nicht steuerbar. Als Konsequenz bestätigt ein solcher Assay nicht
nur, dass die dritten oben genannten Eigenschaften auf CD zurückzuführen sind,
sondern auch die Abwesenheit des besagten Merkmals in CB. Die korrespondierende
Nichteignung von CB, eine selektive, vollständige und steuerbare Vernichtung
zu erhalten, ist eine erste Beobachtung, die den Gedanken unterstützt, dass
solch ein Merkmal in Verbindung mit den anderen zwei Merkmalen eine
notwendige Bedingung für
eine Verbindung ist, um in der Lage zu sein, einen differenzierenden
Zustand zu induzieren.
-
Um
weiter zu verifizieren, ob das Aufweisen besagter Eigenschaften
eine notwendige und ausreichende Bedingung für eine Verbindung ist, um eine
Klasse A-Verbindung zu sein, wurde eine anschließende Assay-Serie in der folgenden
Reihenfolge durchgeführt.
- – In
einem ersten Fall, um zu verifizieren, dass die besagten Eigenschaften
für einige
Kandidatenverbindungen vorhanden sind, die aus denjenigen ausgewählt wurden,
von denen bekannt ist, dass sie in der Lage sind, Multinukleation
zu indizieren;
- – danach,
um die Eignung der positiven Verbindungen in den oben beschriebenen
Verfahren zu verifizieren, in der Form, dass sie in der vollständigen Vernichtung
der Tumorzellen und maximalem Schutz der normalen Zellen resultieren.
-
In
diesem Zusammenhang wurden die gleichen Assay-Serien, die für CD durchgeführt wurden
und in den Beispielen 5 und 6 beschrieben wurden, mit anderen Kandidatenverbindungen
durchgeführt
(siehe Beispiele 7 und 8). Insbesondere wurden Mitglieder der Latrunculine,
der Jasplakinolide und der Chondramide untersucht. All die untersuchten
Verbindungen und insbesondere Latrunculin B, Jasplakinolid, Chondramid
B zeigen Ergebnisse, die in allem äquivalent zu denen von Cytochalasin
D sind.
-
Insbesondere
zeigen in dem Modellsystem Jasplakinolid und Chondramid eine extrem
umkehrbare Wirkung in einem solchen Ausmaß, dass diese Substanzen in
Tumorzellen mit der Polymerisation des Actincytoskeletts Wechselwirken,
allerdings ohne jegliche stabile Cytodieresehemmung. Jedoch behindert
diese Wirkung weder die Wirksamkeit der Klasse B-Verbindung auf
die Tumorzellen, noch die Wirksamkeit der gleichen schützenden
Wirkung davon auf normale Zellen.
-
Wenn
einem tritierten Thymidin-Aufnahmeassay ausgesetzt, wie ausgiebig
in Beispiel 8 gezeigt wird, zeigen diese alle die Fähigkeit
der Nichthemmung der 3H-Thymidin-Aufnahme.
-
Diese
Ergebnisse deuten an, dass positiv identifizierte Klasse A-Verbindungen
nicht ausreichend mit der intrazellulären Aufnahme von Nukleosiden
Wechselwirken, einschließlich
des Nukleosidanalogons, das zur Klasse B gehört, wie es hierin definiert
wird. Dieses Beispiel ist nicht dahingehend gemeint, die Eigenschaften
der Klasse B-Verbindungen
einzuschränken,
sondern illustrativ dafür,
wie eine Wechselwirkung durch eine Klasse A-Verbindung mit einem
Klasse B-Medikament stark die Effizienz der Tumorzellvernichtung
verringern kann.
-
Im
Ergebnis zu besagten Assay-Serien wurden alle diese Verbindungen
in dem System unter der Bedingung für die vollständige Vernichtung
der Tumorzellen in Kultur untersucht.
-
Das
positive Ergebnis besagter Assays, die mit den Assays korrespondieren,
die intensiv in den Beispielen 3 und 7 offenbart werden, bestätigt auf
der einen Seite die Eignung dieser Verbindungen in dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung, auf der anderen Seite die oben erwähnten Eigenschaften
als notwendige und ausreichende für eine Verbindung, um in der
Lage zu sein, den "differenzierenden
Zustand" zu induzieren und
somit eine Klasse A-Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung
zu sein.
-
Chondramide,
Jasplakinolide und Latrunculine haben sich daher als Klasse A-Verbindungen
erwiesen, die für
die gleichen Zeiten verwendet werden können, die für das Cytochalasin D offenbart
sind sowie in einem Konzentrationsbereich von 1 nM bis 40 μM.
-
Ich
Lichte dieser Tests wurden die CAP- und CACT-Werte, die verschiedenen
Klasse A-Verbindungen zugeordnet
werden, als der Konzentrationsbereich bestimmt, der den Cytodieresestop
ergibt und ist innerhalb des besagten Konzentrationsbereiches der
Wert der minimalen Konzentration, die notwendig ist, um diese Wirkung
zu erhalten, was die bevorzugte Ausführungsform ausmacht. Diese
Werte sind solche, die in der Zusammenfassung der Erfindung genannt
werden.
-
Als
Konsequenz all dieser Assays, aus der Analyse der spezifischen Eigenschaften
der positiven Verbindungen könnte
die Klasse A als eine funktionelle Klasse von Verbindungen definiert
werden, die in der Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind.
-
In
diesem Zusammenhang definiert ein positiver Ausgang einer Assay-Serie
der Beispiele 7 und 8, wie er mit einer Kandidatenverbindung durchgeführt wird,
diese automatisch als eine Klasse A-Verbindung.
-
Definition
der Klasse B-Verbindung
-
Analog
zu dem, was für
die Klasse A-Verbindung gesagt wurde und insbesondere für Cytochalasin
D, wurden die Eigenschaften, die die Wirkung von 3FT kennzeichnen,
zuerst hypothetisch dargestellt und dann untersucht. Notwendige
und ausreichende Merkmale zur Definition einer Verbindung als zur
Klasse B gemäß der vorliegenden
Erfindung zugehörig
sind die folgenden Fähigkeiten:
- – das
Aufweisen einer cytotoxischen Wirkung gegenüber aktiv proliferierenden
Zellen und
- – das
nicht-beeinträchtigen
des prolieferierenden Potentials und der Überlebensfähigkeit von Interphasenzellen.
-
Besagte
Merkmale sind tatsächlich
korrekt für
3FT, so, wie sie aus den Assays resultieren, die im Beispiel 3 und
4 gezeigt werden.
-
Während viele
Medikamente und Verbindungen bekannt sind, die wirksam replizierende
Zellen töten, ist
das wichtige Merkmal des Verrichtungsmittels, das erfolgreich in
der Kombinationsbehandlung, wie sie hierin definiert ist, verwendet
wird, dass es keinerlei nachteilige Aktivität auf Interphasenzellen aufweist.
Solch eine Eigenschaft ist wichtig, da sie direkt die Effizienz
des normalen Zellschutzes durch Klasse A-Verbindungen beeinflusst.
-
Die
gleichen Eigenschaften wurden in Kandidatenverbindungen untersucht,
die wiederum selbst den Assays von Beispiel 3 und 4 anstatt 3FT
ausgesetzt wurden.
-
Von
besonderer Bedeutung sind die Assays, die mit zwei Medikamenten
durchgeführt
wurden, die üblicherweise
in der Chemotherapie verwendet werden: das Ara C (a.k.a. Cytarabin)
oder das 2-Chlordeoxyadenosin (2CIAd, o.k.a. Cladribin), die für die Wirkung
auf hoch-proliferierende Zellen bekannt sind, wie ausgiebig in Beispiel
9 beschrieben wird.
-
Die
relevante Aussage ist, dass in beiden Fällen (Ara C und 2CIAd) eine
drastische Verringerung, wenn nicht insgesamt die Abwesenheit der
Transformationsfoci und die gleichzeitige Ausbildung der normalen Monoschicht
beobachtet wurde (siehe Beispiel 9).
-
Jedoch
bildete sich in dem Fall der kombinierten Behandlung mit dem 2CIAd
die normale Zellmonoschicht langsamer wieder (eine 14tägige Proliferations-Wiederaufnahmezeit
war gegenüber
der ungefähr
7 Tage dauernden Zeit des Verfahrens, das mit Ara C oder 3FT durchgeführt wurde,
notwendig), was nahezu die Wiederaufnahmezeit in Bezug auf die anderen
beiden untersuchten Medikamente verdoppelt.
-
Zudem
haben solche Monoschicht-Zellen eine Alterungserscheinung und die
Monoschicht-Sättigungsdichte
(Anzahl von Zellen pro Oberflächeneinheit)
ist deutlich geringer in Bezug auf die anderen zwei Fälle.
-
Diese
Daten zeigen in Bezug auf die Zeit der Proliferations-Wiederaufnahmephase
und die Morphologie der normalen Zellen nach der gesamten Behandlung
die Existenz einer bestimmten toxischen Wirkung des 2CIAd auch auf
normale Zellen in der kombinierten Behandlung.
-
Daher
wurde eine weitere Assay-Serie ausgeführt, um die Abwesenheit der
Cytotoxizität
auf Zellen in der intermitotischen Phase der Kandidatenverbindungen
zu verifizieren, was ausgiebig in Beispiel 10 beschrieben wurde.
-
Solche
Assays waren darauf gerichtet, die antimetabolische Toxizität auf Zellen
durch Konfluenz oder Serumentzug zu analysieren, die in der G0/G1-Phase
still stehen (das Zellzyklusstadium, bei welchem normale Zellen
durch die Verabreichung von Klasse A-Verbindungen anhalten). Durch Untersuchung
der Anzahl der überlebenden
Zellen und der Anzahl von solchen, die auch in der Lage sind, den
Zyklus wieder aufzunehmen, wurden die Ergebnisse der Assays des
Beispiels 9 bestätigt.
Tatsächlich
zeigten sich auch in diesem Fall von den 5 verwendeten Antimetaboliten
diejenigen 3, die in dem in Beispiel 9 offenbarten Test positiv
waren (3FT, Ara C, 6ThG), als vollständig funktionell.
-
Als
einzige resultierten 2CIAd, das Cytotoxizitätsprobleme in dem vorausgegangenen
Test gemäß Beispiel
9 bewirkte und Doxorubicin, von dem angenommen wurde, dass es potenziell
funktional gemäß dem Stand
der Technik ist, statt dessen in einer vollständigen Hemmung des Eingangs
in die S-Phase. Zudem zeigte Doxorubicin auch eine starke cytotoxische
Wirkung.
-
Somit
werden als Ergebnis der oben genannten Assays Ara C und 6ThG als
Klasse B-Verbindungen angesehen,
wohingegen 2CIAd und Doxorubicin, bedingt durch ihre Toxizität, verworfen
wurden.
-
Zusätzlich zu
den im Ergebnis besagten Assays wurden die oben erwähnten Eigenschaften
als ausreichende und notwendige Bedingung für eine Verbindung bestätigt, um
als Klasse B-Verbindung angesehen zu werden.
-
Im
Allgemeinen sind alle Verbindungen mit einer Toxizität, die im
Wesentlichen nicht die Zellvitalität und das Proliferationspotential
von Zellen in der intermitotischen Phase sowie die zelltypische
spezifische Physiologie verändern,
tatsächlich
Klasse B-Verbindungen.
-
In
diesem Zusammenhang definiert ein positiver Ausgang von Assay-Serien,
wie sie in den Beispielen 9 und 10 beschrieben werden, mit einer
Kandidatenverbindung, diese automatisch als eine Klasse B-Verbindung.
-
Im
Licht dieser Assays, um die Validität der verwendeten Konzentrationen
zu bestimmen und zudem die Möglichkeit
der Erhöhung
der letzteren und/oder der Verabreichungszeit der Klasse B-Medikamente,
wurde eine Assay-Serie durchgeführt,
die ausgiebig in Beispiel 11 beschrieben wurde, worin die Konsequenzen von
Klasse B-Medikamenten bei verschiedenen Konzentrationen bis zu einer
10-20fachen Erhöhung
davon untersucht wurden.
-
Natürlich würde dieses
einen weiteren Vorteil ausmachen, der sich aus der Anwendung der
Verwendung der vorliegenden Erfindung ergibt, da es offensichtlich
ist, dass die meisten Tumore sicherlich durch die Behandlungen mit
chemotherapeutischen Medikamenten-Konzentrationen vernichtet werden
würden,
die zehnfach in Bezug auf die tatsächlich verwendeten erhöht sind.
Bis heute bleibt dieses nicht durchführbar, weil die verabreichbare
chemotherapeutische Dosierung durch die Toxizität dieser eingeschränkt ist.
-
Das
in Beispiel 11 beschriebene Ergebnis der Assay-Serien ist, dass
Trifluorthymidin bei 800 μM
anfängt,
toxisch zu sein, wohingegen die Ara C-Toxizität zwischen 200 und 400 μM beginnt.
Natürlich
sind zwei wirklich toxische Medikamente bereits von der Klasse B
ausgenommen (2CIAd und Doxorubicin), die als positive Kontrolle
verwendet wurden, und eine starke Toxizität bereits bei minimalen funktionellen
Konzentrationen aufzeigen.
-
Aus
diesen Ergebnissen kann umso besser, wenn sie mit solchen verglichen
werden, die mit den zwei wirklich toxischen und sowieso nicht Klasse
B-Medikamenten verwandt sind, gesagt werden, dass die chemotherapeutische
Medikamenten-Konzentration, bedingt durch die Chemoprotektion, die
selektiv für
normale Zellen durch die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung
zur Verfügung
gestellt wird, bis auf das 10-20fache erhöht werden kann. Obwohl eine
bestimmte Toxizität
nach dem Erhöhen
der Konzentration mit den Verbindungen nachgewiesen wurde, die in
der Klasse B, wie sie definiert ist, mit umfasst sind, bleibt diese Toxizität bei sehr
geringen Mengen im Vergleich zu denen von 2CIAd und Doxorubicin.
-
Für Ara C
allein als ein Klasse B-Medikament beginnt eine relevante Toxizität bei einer
6fachen Dosierung.
-
Übertragung
der Validität
der erhaltenen Ergebnisse auf das menschliche System
-
Wie
oben berichtet, wurde das Modellsystem ausgewählt, um die in vivo- und die
ex vivo-Bedingungen so zuverlässig
wie möglich
zu reproduzieren. Als eine weitere Bestätigung von deren Anwendbarkeit
auf die pathologische Situation in dem menschlichen System in vivo,
wurde die Assay-Serie, die intensiv in Beispiel 12 beschrieben wird,
durchgeführt.
-
Der
relevante Ausgang bestätigt,
dass die Verabreichung der Klasse A-Verbindungen auf menschliche Tumor-
(Lipari- Glioblastomas, T97, U973) und normale (LH- und DH-Fibroblasten) Zellen
die gleichen Wirkungen bestimmt, die jeweils für die Modellsystemzellen CH310T1/2v-src/v-myc
und C3H10T1/2 aufgenommen wurden.
-
Somit
wurde die vollständige
Validität
der kombinierten Verwendung der Medikamente der beiden Klassen,
wie sie oben offenbart werden, für
das menschliche System vollständig
nachgewiesen.
-
Definition
des Verwendung der vorliegenden Erfindung
-
Im
Hinblick auf die Ergebnisse, die als Ausgang der Assays oben erhalten
wurden, wurden letztendlich die Klasse A-Verbindungen (insbesondere
Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin B, Jasplakinolid, Chrondramin B
und Latrunculin B) und Klasse B-Verbindungen (insbesondere Trifluorthymidin,
Cytarabin, 6-Thioguanin) dann bei verschiedenen Dosierungen und
Zeiten zu den Zellsystemen der vorliegenden Erfindung verabreicht, wobei
darauf geachtet wurde, dass immer die notwendigen Verifikationen
durchgeführt
wurden, um die funktionelle und wirksame Kombination der verabreichten
Zeit-/Konzentrations-Parameter
aufzufinden. Es wurden daher Verwendungen einschließlich nur
der kombinierten Behandlung und der kombinierten Behandlung zusammen
mit Vorbehandlung und/oder Nachbehandlung, wie sie in der Zusammenfassung
der Erfindung beschrieben werden, durchgeführt und die relevanten Parameterwerte
abgeleitet.
-
Des
Weiteren wurden entsprechend die Merkmale der Verwendungen, Kits
und pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung,
wie sie in der Zusammenfassung der Erfindung oben dargestellt werden,
abgeleitet.
-
Eine
hierin zuvor gemachte allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung
wurde zur Verfügung
gestellt. Hiernach wird mit Hilfe der folgenden Beispiele eine detailliertere
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen davon gegeben,
die darauf gerichtet ist, die Aufgaben, Merkmale, Vorteile und Operationsmodi
davon besser zu verstehen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Der
Binukleations-/Multinukleationszustand als Ergebnis eines inaktivierten
p53-Stoffwechselweges Um zu verifizieren, welche molekularen Faktoren
eine Multinukleation in Tumorzellen bewirken, und um dadurch Tumorzellen
und Tumorformen zu identifizieren, auf die ein Binukleations-/Multinukleations-differenzierender
Zustand anwendbar ist, wurde eine Assay-Serie ausgeführt, die
darauf gerichtet ist, solche Formen zu verifizieren, die auf den
Verlust eines oder mehrerer Gene zurückzuführen sind, die Zellfunktionen
regulieren. Solche Assays wurden insbesondere mit Zellen ausgeführt, die
aus Knockout-Mäusen für die Rb-
(Retinoblastom), p21- oder p53-Funktion abgeleitet sind. In jedem
Zelltyp existiert die relevante Knockout-Funktion nicht, daher sind
daraus erhaltene Daten automatisch auf den Verlust der damit verbundenen
Funktion zurückzuführen.
-
Jede
Zellkultur wurde auf 35 mm-Platten bei einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Platte unter den folgenden Bedingungen
ausplattiert, die hierin als Standardbedingungen angesehen werden.
Zellen wurden auf einem Plastiksubstrat (Falcon-BD) in einem Kulturmedium,
das aus Dulbecco's
modified Eagle's
Medium hergestellt wurde, das mit 2 mM L-Glutamin, Antibiotika, 10 % fötalem Kälberserum
supplementiert worden war, bei 37°C mit
5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit wachsen
gelassen. Die folgenden Assays wurden daher durchgeführt.
-
In
einer ersten Zeit von 12 Stunden c.ca (ein Schritt, der auch für die anderen,
hierin berichteten Assays üblich
ist) wurden Zellen aufwachsen gelassen, aber in einer Dichte, die
deren Proliferation erlaubt, wodurch sichergestellt wird, dass die
höchste
Zuverlässigkeit
des Assays resultiert, der anderweitig durch Zellen verändert werden
könnte,
die aus Gründen
stillstehen, die nicht auf die Verbindungsverabreichung zurückzuführen sind.
Nach diesem ersten Schritt wurden die folgenden Verabreichungen
durchgeführt.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM Citochalasin D für 72 h (T0 – T72) an
Maus-Embryofibroblasten
(MEF) – Zellen
verabreicht, bei denen jeweils die Rb oder p21-Funktionen ausgeschaltet waren.
-
In
einer zweiten Assay-Serie für
72 h (T0 – T72)
wurde dieses MEF und dermalen Fibroblasten (MDF) als Wildtyp-Kontrollzellen
verabreicht.
-
In
einer dritten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) an Balb C (10/1) (für die p53-Funktion
abgeschaltete Zellen) bei 32 °C
und 37 °C
verabreicht.
-
In
einer vierten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) an Balb C (10/1)p53Va15
bei 32 °C
und 37 °C
verabreicht (Knockout-Zellen für
die p53-Funktion, wobei eine temperaturempfindliche p53-Mutante
eingeführt
wurde).
-
Unbehandelte
Kontrollzellen zeigen weniger als 2 % binukleare (2N) oder multinukleare
(>3N)-Zellen.
-
Die
Verabreichung wurde ausschließlich
auf proliferierenden Zellen durchgeführt. Nach der Behandlung wurden
die Zellen prozessiert und analysiert.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle
1
-
In
den Zeilen 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6, 7 und 8 werden jeweils die
Ergebnisse der ersten, zweiten, dritten und vierten Assay-Serien
gezeigt. Insbesondere zeigen die Spalten 2, 3, 4 und 5 Prozentanteile
an mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen Zellen, die als Ergebnis besagter
Assays nachgewiesen wurden. In Spalte 1 werden stattdessen die verwendeten
Zelltypen und die relevanten Assay-Temperaturen gezeigt.
-
Die
Ergebnisse aller dieser Assays zeigen, dass nach Verabreichung von
CD an sowohl Rb–/– und p21–/– Zellen
sowie an MEF- und MDF-Kontrollen, die Zellen in einem binuklea ren
Zustand (siehe Zeile –4)
anhalten, was nachweist, dass die Abwesenheit der Rboder p21-Funktionen
nicht ausreicht, um eine Multinukleation nach der Verabreichung
von Cytochalasin D zu induzieren.
-
Dieses
impliziert, dass die Rb- und p21-Gene, die als wichtige Faktoren
bekannt sind, die eine DNA-Endoreduplikation nach Hemmung der Mitose
unterdrücken,
nicht für
die Verhinderung der Multinukleation nach der Verabreichung von
CD und somit die Cytodieresehemmung verantwortlich sind.
-
Mit
Balb/c(10)1-Zellen erhaltene Ergebnisse zeigen stattdessen die Bedeutung
der p53-Funktion(en) in
der Multinukleations-Zustandsbestimmung nach Cytokineseblockade
durch CD (siehe insbesondere die Gesamtzahl der Zellen mit einer
Nukleianzahl von mehr als 2 in den Zeilen 5 und 6).
-
Die
Tatsache, dass der Verlust von solch einer Funktion ausreichend
zur Induzierung der Multinukleation in Zellen ist, wird auch durch
den Assay bestätigt,
der mit BalbC(10/1) durchgeführt
wird, in die eine ts (temperaturempfindliche) – p53-Mutante eingeführt wurde,
so dass diese Zellen ein inaktives p53-Protein (p53 inaktive Funktion)
bei 37 °C
aufzeigen und ein aktives p53-Protein (p53 aktive Funktion) bei
32 °C aufzeigen.
-
Die
Ergebnisse der besagten, in den Zeilen 7 und 8 gezeigten Assays
bestätigen,
dass die Multinukleation nach der Hemmung der Cytokinese nur in
Zellen mit inaktiver p53-Funktion
beobachtet wird (siehe Zeile 8 im Vergleich zu Zeile 7).
-
Beispiel 2
-
Verifikation
der Übertragbarkeit
der p53-bezogenen Daten auf das menschliche System Um zu bestätigen, dass
p53-Funktion(en) der "Schalter" ist, der den CD-induzierten
Multinukleationszustand in Zellen reguliert (an, wenn inaktiv und
aus, wenn aktiv), wurden die gleichen Assays, die in Beispiel 1
beschrieben werden, mit menschlichen Lungen-Fibroblasten (LHF) durchgeführt, die
mit 2 Papillomavirus-Onkogenen (E6 und E7) transfiziert worden waren.
E6 ist tatsächlich
ein Onkogen, dessen Produkt in der Lage ist, p53 abzufangen und
zu hemmen, wohingegen E7 ein anderes Onkogen ist, dessen Produkt
in der Lage ist, die Rb-Funktion aufzuheben. Diese Assay-Serie ermöglicht tatsächlich entsprechend
den Wachstumsstop im binuklearen Zustand durch CD auf menschliche
Zellen zu übertragen,
als Bedingt durch einen aktiven p53-Stoffwechselweg in normalen Zellen und
bestätigt
zur gleichen Zeit die Nichteinmischung von Rb darin.
-
Nach
der ersten Zeit von 12 h c.ca (siehe oben) wurden insbesondere die
folgenden Assays durchgeführt.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) oder 0,11 % DMSO für 72 h (T0 – T72) als
Kontrolle dafür
an menschliche Kontroll-Lungenfibroblasten (HF LXSN) verabreicht.
-
In
einer zweiten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) und 0,11 % DMSO für 72 h (T0 – T72) als
Kontrolle dafür
an menschliche Lungenfibroblasten verabreicht, die mit E6 transformiert
sind (HF E6).
-
In
einer dritten Assay-Serie wurden 400 nM CD für 72 h (T0 – T72) und 0,11 % DMSO für 72 h (T0 – T72) als
Kontrolle dafür
an menschliche Lungenfibroblasten verabreicht, die mit E7 transformiert
sind (HF E7).
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle
2
-
In
den Zeilen 1 und 2, 3 und 4, 5 und 6 werden jeweils die Ergebnisse
der ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt. In den Spalten
3, 4, 5 und 6 werden Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen
und >4-nuklearen Zellen
als Ergebnis der besagten Assays gezeigt. In Spalte 1 und 2 werden stattdessen
das verabreichte Medikament und die untersuchte Zelle gezeigt.
-
Die
oben genannten Ergebnisse zeigen, dass während in der Gegenwart von
CD die E6-transformierten Fibroblasten multinuklear sind (siehe
Zeile 4), die E7-Fibroblasten dieses nicht sind (siehe Zeile 6),
was die Daten des vorangegangenen Beispiels 1 bestätigt, die
mit murinen Zellen erhalten wurden.
-
Beispiel 3
-
Schutz normaler Zellen
durch kombinierte CD/3FT-Verwendung: eine qualitative Beurteilung
-
Um
die pharmakologischen Wirkungen der kombinierten CD/3FT-Verwendung
zu verifizieren, wurde die Bildung transformierter Foci in einer
gemischten Kultur von normalen und Tumorzellen untersucht, wobei das
System C3H10T1/2 als normale Zellen und C3H10T1/2v-src/v-myc oder
L-Zellen als Tumorzellen umfasst (um Daten zu erhalten, die nicht
auf ein spezifisches Zellsystem eingeschränkt sind).
-
In
jedem der Assays wurden die oben erwähnten Zellen in 60 mm Platten
ausplattiert. Insbesondere wurden C3H10T1/2 bei einer Dichte von
104 Zellen pro Platte ausplattiert, C3H10T1/2v-src/v-myc
bei einer Dichte von 5 × 102-Zellen pro Platte und L-Zellen bei einer
Dichte von 5 × 102 Zellen pro Platte.
-
Solch
ein Unterschied in der Dichte von normalen und Tumorzellen reproduziert
tatsächlich
eine in vivo-neoplastische pathologische Situation, in der Tumorzellen
effektiv weniger als normale sind, und ermöglicht es auch, diskrete und
quantifizierbare Transformationsregionen, bedingt durch unkontrolliertes
Tumorzellwachstum, zu erhalten. Kulturbedingungen sind die Standardbedingungen
von Beispiel 1.
-
Nach
der ersten Zeit von 12 Stunden c.ca (siehe Beispiel 1 oben) wurden
die folgenden Assays mit den zwei Zellsystemen durchgeführt, da
eine C3H10T1/2 – C3H10T1/2v-src/v-myc und das
andere C3H10T1/2 – L-Zellen.
Zuerst wurde die folgende Assayserie mit C3H10T1/2 – C3H10T1/2v-src/v-myc – Zellsystemen
durchgeführt.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O
von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400
nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an
eine Kultur von C3H10T1/2 allein verabreicht.
-
In
einer zweiten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O
von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400
nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an
eine Kultur C3H10T1/2v-src/v-myc allein verabreicht.
-
In
einer dritten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O
von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400
nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an
eine gemischte Kultur aus C3H10T1/2 und C3H10T1/2v-src/v-myc verabreicht.
-
Danach
wurden die folgenden weiteren Assay-Serien mit dem C3H10T1/2 – L-Zellsystem durchgeführt.
-
In
einer vierten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O
von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400
nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT zu
einer Kultur von C3H10T1/2 allein verabreicht.
-
In
einer fünften
Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O von
T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400
nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT an
eine Kultur von L-Zellen allein verabreicht.
-
In
einer sechsten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O
von T0 bis T84, 400 nM CD von T0 bis T84, 40 μM 3FT von T24 bis T72 und 400
nM CD von T0 bis T84 und von T24 bis T72 auch 40 μM 3FT zu
einer gemischten Kultur von C3H10T1/2 und L-Zellen verabreicht.
-
Die
Verabreichungen von nur CD und 3FT wagen auf die Messung der Wirkungen
davon auf besagte Zellsysteme gerichtet, die kombinierte CD/3FT-Verabreichung
auf die Messung der Wirkungen der kombinierten CD/3FT-Verwendung,
während
die Verabreichung von DMSO als Kontrolle durchgeführt wurde.
-
Die
Behandlungszeitverkürzung
von 72 auf 24 h in Bezug auf die Assays, die mit primären Zellen
der Beispiele 1 und 2 durchgeführt
wurde, ist durch die Tatsache bedingt, dass letztere eine längere Zellzykluszeit in
Bezug auf die von C3H10T1/2 haben, wodurch es notwendig war, jeglichen
möglichen
Zweifel zu vermeiden, der sich auf die binuklearen Formen bezieht,
die nach CD-Behandlung zu finden sind.
-
Nach
jeder Behandlung wurden Zellen in Kultur für einen Zeitraum aufbewahrt,
der zum Nachweis der Foci-Bildung notwendig ist; die einzelnen experimentellen
Gruppen – z.
B. die unbehandelte (-/-) und die nur mit CD behandelte (CD/-) wurden
zur gleichen Zeit untersucht.
-
An
dem Ende von jedem Assay wurden die Zellen 2 × mit PBS gewaschen und 2 × mit 5
% Trichloressigsäure
bei 4 °C
für 15
Minuten fixiert, 2 × mit
70 % Ethanol gewaschen und mit 5 % Giemsa-Lösung für 30 Minuten gefärbt, um
eindeutig die Transformations-Foci
herauszuheben und die normale Zellmonoschicht sichtbar zu machen,
wie zuvor beschrieben wurde (17). Die relevanten Ergebnisse werden
jeweils in den Abschnitten A und B der folgenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle
3
-
In
Abschnitt A werden die Ergebnisse des Assays gezeigt, der mit dem
C3H10T1/2 – C3H10T1/2v-src/v-myc – Zellsystem
durchgeführt
wurde. Insbesondere in den Zeilen 1, 2 und 3 werden jeweils die
Ergebnisse der ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt.
-
In
Abschnitt B werden die Ergebnisse des Assays gezeigt, der mit dem
C3H10T1/2 – L-Zellsystem durchgeführt wurde.
Insbesondere in den Zeilen 4, 5 und 6 werden die Ergebnisse der
vierten, fünften
und sechsten Assay-Serien gezeigt.
-
In
den Spalten 2, 3, 4 und 5 werden die Ergebnisse der Behandlung jeweils
nur mit Trägermitteln
(DMSO für
CD und H2O für 3FT), das CD allein, das
3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte 1 wird dort die untersuchte
Zelle gezeigt.
-
Die
relevanten erhaltenen Werte, die als Prozentanteile von Behandelten
in Bezug auf Unbehandelte ausgedrückt sind, identifizieren die
Anzahl der Transformations-Foci, die nach dem Assay nachgewiesen
werden. Die Definition "konfluent" zeigt eine vollständig ausgebildete
Monoschicht in der Platte an. Jeder Prozentanteilswert wurde aus
den Durchschnittsdaten berechnet, die für Duplikatplatten bestimmt
wurden.
-
Die
durch diese Serien von Experimenten mit normalen und Tumorzellen
erhaltenen Ergebnisse zeigen eine selektive, schützende Wirkung von CD auf normale
Zellen, die mit einer vollständigen
und selektiven Vernichtungswirkung von 3FT auf Tumorzellen keinhergeht.
-
Insbesondere
in der Tatsache in der Abwesenheit einer jeglichen Behandlung werden
normale Zellen in beiden Systemen konfluent unter Ausbildung einer
Monoschicht, wohingegen die Tumorzellen, eine bestimmte Anzahl von
Foci bilden, (Wert "100" wird als Referenzwert
verwendet), wie in Spalte 2 gezeigt wird.
-
Wenn
Cytochalasin D während
der gesamten Behandlung verabreicht wird (24 h Vorbehandlung, plus 48
h kombinierte Behandlung, plus 12 h Waschen, bis zu einer Gesamtheit
von 84 h), wird nur eine kleine Verringerung des Tumorzell-verwandten
Werts in Bezug auf die Kontrolle am Ende der Behandlung nachgewiesen (siehe
Spalte 3). Diese Verringerung wird in sowohl in den zwei Tumorzell-Monokulturen
(Zeilen 2 und 5) wie auch in den zwei gemischten Kulturen (Zeilen
3 und 6) nachgewiesen und ist durch den multinuklearen Zellzustand
bedingt, welcher auch eine schwierigere Wiederaufnahme der Zellproliferation
bewirkt.
-
Wenn
nur 3FT verabreicht wird, wird offensichtlich der vollständige Tod
beider Zelltypen nachgewiesen (siehe Spalte 4).
-
Nur
in dem Falle einer Durchführung
einer kombinierten Behandlung von CD und 3FT, insbesondere unter
Befolgung der oben beschriebenen Schritte (Spalte 5) wird nach einer
7-tägigen
Zellproliferations-Wiederaufnahmephase ein vollständiger und
selektiver Schutz durch CD von normalen Zellen, die eine konfluente Zellmonoschicht
ausbilden, im Gegensatz zu einer vollständigen und selektiven Vernichtung
von Tumorzellen erhalten (siehe Spalte 5).
-
Beispiel 4
-
Schutz von normalen Zellen
durch die Verwendung von kombiniertem CD/3FT: eine quantitative
Beurteilung
-
Um
die Wirkungen der kombinierten CD/3FT-Verwendung des oben genannten
Beispiels 3 zu quantifizieren, wurden die ersten, zweiten und dritten
Assay-Serien, die im Beispiel 4 beschrieben wurden, mit Monokulturen
bei einer Zelldichte durchgeführt,
die zählbare
Kolonien erlaubt.
-
Die
Kulturbedingungen, Verbindungskonzentrationen und Behandlungen sind
die gleichen, wie sie im Beispiel 3 beschrieben werden, mit der
Ausnahme des verwendeten Zellsystems; für die erste Assay-Serie eine
Monokultur von C3H10T1/2-Zellen bei klonalen Dichten von 1 × 103, 5 × 103 und 1 × 104, für
die zweiten Assay-Serien eine Monokultur von C3H10T1/2v-src/v-myc-Zellen
bei den klonalen Dichten von 5 × 102, 1 × 103 und 5 × 103, und für
die dritte Assay-Serie eine Monokultur von L-Zellen bei klonalen
Dichten von 5 × 102, 1 × 103 und 5 × 103.
-
Nach
jeder Verabreichung wurden die Zellen 2 × mit PBS gewaschen und für die notwendige
Zeit zur Kolonieausbildung kultiviert (wie in Beispiel 2, die einzelnen
Testgruppen wurden gleichzeitig fixiert) und dann wie im Beispiel
3 beschrieben prozessiert.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 4 gezeigt. Tabelle
4
-
In
Zeile 1 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien, wie sie mit
C3H10T1/2-Monokultur durchgeführt
werden, bei klonalen Dichten von 1 × 103 (Unterzeile
a), 5 × 103 (Unterzeile b) und 1 × 104 (Unterzeile c)
gezeigt. In Zeile 2 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien,
wie sie mit C3H10T1/2v-src/v-myc-Monokultur durchgeführt werden,
bei klonalen Dichten von 5 × 102 (Unterzeile a), 1 × 103 (Unterzeile
b) und 5 × 103 (Unterzeile c) gezeigt.
-
In
Zeile 3 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien gezeigt,
wie sie mit L-Zellmonokulturen durchgeführt wurden, bei den klonalen
Dichten von 5 × 102 (Unterzeile a), 1 × 103 (Unterzeile
b) und 5 × 103 (Unterzeile c) gezeigt.
-
In
Spalten 2, 3, 4 und 5 werden die Ergebnisse der Behandlung jeweils
mit Trägermittel
allein (DMSO für
CD und H2O für 3FT), das CD allein, das
3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte 1 werden stattdessen die untersuchten
Zellen und relevanten Dichten gezeigt.
-
Die
in Tabelle 4 gezeigten erhaltenen relevanten Werte korrespondieren
mit der Anzahl der Kolonien, die nach dem Assay nachgewiesen wurden.
Die Definition "konfluent" zeigt eine vollständige Zellmonoschicht in
der Platte an. Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde jeder Wert von
den mittleren Daten berechnet, die sich aus zwei Doppelproben ergeben.
-
Die
Ergebnisse dieser Assay-Serien bestätigen den durch die Assays
von Beispiel 3(2) gezeigten Schutz und erlauben zudem, diesen zulässig zu
quantifizieren.
-
Insbesondere
in den Fällen,
in denen in den Zellen erlaubt wird bei Verabreichung von nur DMSO
und H2O für einen Zeitraum zu proliferieren,
der dem Behandlungszeitraum von Beispiel 2 gleicht (84 Stunden), ergeben
beide normale und Tumorzellen konfluente Kulturen bei den zwei größeren anfänglichen
Dichten und diskrete einzelne Kolonien bei der geringeren Dichte
(Spalte 3, Kontrolldaten).
-
Wenn
stattdessen CD allein (Spalte 4), 3FT allein (Spalte 5) oder beide
(Spalte 6) zu jeder Zellkultur bei der geringeren Anfangsdichte
verabreicht wurden, was für
das klonogene Zellpotenzial Indikativ ist, dann wurden die folgenden
Werte erhalten.
-
Für C3H10T1/2
resultiert die Behandlung mit CD in einer Verringerung des Wertes
von 76 auf 49, was signifikant für
eine bestimmte toxische Wirkung ist, die Behandlung mit 3FT, den
vorausgesagten Wert 0 und die kombinierte Behandlung resultiert
letztendlich in einem Wert 19, welcher stattdessen signifikant für den vorgekommenen
Schutz ist.
-
Für C3H10T1/2
v-src/v-myc resultiert die Behandlung mit CD in einer Verringerung
in dem Wert von 86 auf 18, das signifikant für eine CD-toxische Wirkung
auf Tumorzellen ist, die stärker
ist als auf normale Zellen, wobei die Behandlung mit 3FT der vorausgesagten
Wert 0 ist und die kombinierte Behandlung resultiert dieses Mal
in dem Wert 0, welcher signifikant für die vollständige Abwesenheit
schützender
Wirkungen einer solchen Behandlung für diese Art von Tumorzellen
ist.
-
Für L-Zellen
resultiert die Behandlung mit CD in einer Verringerung des Wertes
von 88 auf 55, was signifikant für
eine CD-toxische Wirkung auf Tumorzellen ist, die stärker ist
als auf normale Zellen, aber geringer als auf C3H10T1/2 v-src/v-myc-Tumorzellen,
wobei die Behandlung mit 3FT den angenommenen Wert 0 hat, und die
kombinierte Behandlung auch in diesem Fall in dem Wert 0 resultiert,
was signifikant für
die vollständi ge
Abwesenheit schützender
Wirkungen einer solchen Behandlung auf diese Tumorzelltypen ist.
-
Diese
Daten werden auch durch die Assays bestätigt und validiert, die mit
höheren
ursprünglichen Zelldichten
durchgeführt
werden, sogar wenn mit solchen hohen Werten angefangen wird, ist
die Anzahl der nach der kombinierten Behandlung erhaltenen Tumorzell-Foci
signifikanter Weise immer 0.
-
Durch
den Vergleich solcher Werte, die getrennt durch quantitative Messungen
in verschiedenen Systemen erhalten wurden, konnte ein Selektivitätsindex
des chemotherapeutischen Mittels abgeschätzt werden. Insbesondere, wenn
allein verwendet, erwies sich das chemotherapeutische Mittel als
letal für
sowohl normale wie auch Tumorzellen, wohingegen, wenn es mit CD
kombiniert war, insbesondere gemäß dem hierzu
beschriebenen Protokoll, 3FT in einer mindestens 500 – 1000-fach
wirksameren Tötung
der Tumorzellen resultierte.
-
Letztendlich
jedoch zeigen die oben genannten Ergebnisse weiterhin, dass 3FT,
während
es cytotoxische Wirkungen auf proliferierende Tumorzellen hat, keinerlei
toxische Wirkung auf abgestoppte normale Zellen hat, da nach dem
Unterbrechen der kombinierten Behandlung die letzteren in der Lage
sind, zu proliferieren bis sie eine konfluente Monoschicht ausbilden.
-
Beispiel 5
-
Hemmung der
Cytodierese und anschließende
DNA-Replikation in normalen Zellen durch Cytochalasin D und die
Umkehrbarkeit davon
-
Um
die Fähigkeit
von Cytochalasin D zu verifizieren, die Cytodierese und anschließende Phasen
des Zellzyklus in normalen Zellen zu hemmen, wurde eine Serie von
koloniebildenden Assays mit C3H10T1/2 und C3H10T1/2/v-src/myc durchgeführt, worin
die Hemmung der DNA-Synthese durch Bromdeoxyuridin (BrdU)-Aufnahme
nachgewiesen wurde.
-
Jede
Zellkultur wurde auf 35 mm Platten bei einer Dichte von 10 × 104 Zellen/Platte unter den Standardbedingungen,
die in Beispiel 1 beschrieben werden, ausplattiert. Nach der ersten
Zeit von 12 Stunden c.ca (siehe Beispiel 1 oben) wurden die folgenden
Assays durchgeführt.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurde CD für 48 h (T0 – T48) und auch BrdU in den
letzten 24 h (T24 – 48)
zum Nachweis des Prozentanteils der Zellen, die in der Lage sind,
in die S-Phase einzugehen (hierin als %S bezeichnet) jeweils an
C3H10T1/2 und C3H10T1/2/v-src/v-myc verabreicht.
-
In
einer zweiten Assay-Serie wurde CD für 48 h (T0 – T48) gefolgt durch eine 24
h Ruhephase zur Ermöglichung
einer Medikamenten-Katabolyse und dann BrdU für weitere 24 h (T72 – 96) zum
Nachweis des %S an C3H10T1/2 allein verabreicht.
-
In
einer Kontroll-Assay-Serie davon wurde nur BrdU und 0,11 % DMSO
an C3H10T1/2- und
an C3H10T1/2/v-src-/v-myc-Zellen für 24 h (T0 – T24) als eine Kontrolle der
Proliferationsphase verabreicht.
-
In
jedem der oben genannten Assays waren die CD- und BrdU-Konzentrationen
die gleichen, nämlich jeweils
400 nM und 20 nM. Die Verabreichung wurde nur auf proliferierenden
Zellen durchgeführt.
Die gleichzeitige Messung der BrdU-Aufnahme und des %S sicherte
die höchste
Stringenz der Ergebnisse der DNA-Replikation. Prozentanteile der
mononuklearen, binuklearen, tri/tetranuklearen und >4 nuklearen resultierenden Zellen
wurden auch gemessen. Nach der Behandlung wurden die Zellen prozessiert
und wie in Referenz 18 berichtet, analysiert.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 5 gezeigt. Tabelle
5
-
In
den Zeilen 3 und 4 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien
gezeigt. In Zeile 5 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien
gezeigt. In den Zeilen 1 und 2 werden die Ergebnisse der Kontroll-Assay-Serien
gezeigt.
-
In
Spalte 1 werden die untersuchten Zellen und die relevante Behandlung
einschließlich
der Verabreichungszeit in Stunden gezeigt.
-
In
den Spalten 2, 3 und 4 werden die gesamte Nukleianzahl für jeden
Assay, die Anzahl der Nuklei mit aufgenommenem BrdU (die damit DNA
synthetisiert haben) in jedem Assay, der Prozentanteil von Zellen
mit synthetisierter DNA in jedem Assay (die Daten sind direkt aus
den vorangegangenen zwei Spalten abgeleitet) gezeigt. In den Spalten
5, 6, 7 und 8 werden die Prozentanteile der mononuklearen, binuklearen,
tri-tetranuklearen und >4
nuklearen Zellen, die als Ergebnis besagter Assays nachgewiesen
wurden, gezeigt. Auf der Basis der oben genannten Ergebnisse können die
folgenden Überlegungen
gemacht werden.
-
Die
in den Zeilen 3 und 4 berichteten Assay-Ergebnisse %S zeigen einen
geringen Prozentanteil an normalen Zellen, die in die S-Phase (23
%) übergehen
im Gegensatz zu einem hohen Prozentanteil (88 %) der transformierten
nach der gleichen Behandlung (siehe Spalte 4).
-
Diese
Daten korrespondieren mit den Normal/Tumor-%S-Verhältnissen
nach einer Behandlung mit CD oder dem gesamten Vektor, welcher tatsächlich jeweils
1:4 (23:97) und 1:1,1 (88:99) sind und durch nukleationsbezogene
Daten bestätigt
werden, die in den Spalten 4 und 7 der Tabelle gezeigt werden. Für normale und
Tumorzellen können
tatsächlich
jeweils 98 % und 97 % mononukleare Zellen nach Kontroll-Assays (siehe Zeilen
1 und 2) gegenüber
jeweils 67 % und 35 % binuklearer Zellen und jeweils 6 % und 47
% der drei-tetranuklearen oder sogar mit >4 nuklearen Zellen nach CD-Behandlung
beobachtet werden.
-
Eine
selektive Hemmung der Cytodierese und die anschließende DNA-Replikation
der normalen Zellen in Bezug auf Tumorzellen durch CD ist daher
vollständig
nachgewiesen.
-
Die
oben erwähnten
Assays zeigen jedoch ein weiteres wichtiges Merkmal der CD-Wirkung
auf das System: Umkehrbarkeit.
-
Nach
normaler Zellbehandlung, wie sie in Zeile 5 gezeigt wird, die für eine Zeit
durchgeführt
wurde, die der Behandlung gleicht, die in Zeile 3 gezeigt wird (CD-Verabreichung
von T0 bis T48, Ruhe von T48 bis T72, wobei die BrdU-Aufnahme von
T72 bis T96 gemessen wurde), wurde tatsächlich letztendlich beobachtet, dass
bis zu 92 % besagter Zellen wiederum mononuklear sind (vs. 98 %
der Kontrollzellen). Zudem zeigen sich bis zu 96 % der plattierten
Zellen vs. 97 % der Kontrollzellen weiterhin in der Lage zur Aufnahme
des BrdU. Die wissenschaftliche Validität dieses Schlusses wird durch
nukleationsbezogene Daten und BrdU-Aufnahme bezogene Daten untermauert
und durch den gemessenen Prozentanteil von Zellen, der in die S-Phase
nach Behandlung eingeht.
-
Die
Umkehrbarkeit der CD-Wirkung auf normale Zellen ist daher gemäß diesen
Daten sehr hoch.
-
Beispiel 6
-
Der Mangel von Cytochalasin
D in der Wechselwirkung mit 3FT-toxischen Wirkungen auf Tumorzellen
-
Um
jede mögliche
Wechselwirkung zwischen CD- und FT-Wirkungen auf Tumorzellen zu
verifizieren, wurde eine Reihe von koloniebildenden Assays mit C3H10T1/2(v-src/v-myc) durchgeführt.
-
Die
Zellen wurden dafür
auf 60 mm Platten bei einer Dichte von 5 × 102 Zell/60
mm bei den in Beispiel 3 beschriebenen Kulturbedingungen ausplattiert
und wurden nach der ersten Zeit von 12 Stunden den folgenden Behandlungen
ausgesetzt.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM CD von T0 bis T84, zusammen
mit 30 μM
3FT von T24 bis T72 zur Verifizierung einer möglichen Wechselwirkung in der
CD/3FTkombinierten Verwendung verabreicht.
-
In
einer zweiten Assay-Serie wurden 3 μM CB von T0 bis T84, zusammen
mit 30 μM
3FT von T24 bis T72 zur Verifizierung einer möglichen Wechselwirkung in der
CB/3FT-kombinierten
Verwendung verabreicht.
-
In
einer dritten Assay-Serie wurden 400 nM CD von T0 bis T84, 3 μM CB von
T0 bis T84 und 30 μM 3FT
von T24 bis T72 als Kontrollen der CD/3FT- und CB/3FT-kombinierten
Verwendung verabreicht.
-
In
einer vierten Assay-Serie wurden 0,11 % DMSO und H2O
von T0 bis T84 als Systemkontrolle zur Berechnung der Standardabweichung
verabreicht.
-
Nach
den oben genannten Verabreichungen wurden die Zellen wie in Beispiel
3 beschrieben behandelt. Die relevanten Ergebnisse werden in der
folgenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle
6
-
In
den Zeilen 5 und 6 werden jeweils die Ergebnisse der ersten und
zweiten Assay-Serie gezeigt. In den Zeilen 2, 3 und 4 werden die
Ergebnisse der dritten Assay-Serien (innere Kontrollassays) gezeigt.
In Zeile 1 werden die Ergebnisse der sechsten Assay-Serie (Kontroll-Assay)
gezeigt.
-
In
den Spalten 1, 2 und 3 werden jeweils die Ergebnisse der verschiedenen
Behandlungen, die mit C3H10T1/2-v-src/v-myc-Zellen durchgeführt wurden,
die Koloniezahlen, die aus jeder Behandlung resultieren und die
Standardabweichung gezeigt.
-
Die
oben genannten Ergebnisse zeigen die Abwesenheit einer Wechselwirkung
mit dem 3FT-abhängigen
Töten von
Tumorzellen durch CD gegenüber
einer starken Wechselwirkung durch CB damit.
-
Nach
der kombinierten CD/3FT-Behandlung, die in Zeile 5 gezeigt wird,
wurden tatsächlich
3 Kolonien gegenüber
41 Kolonien der inneren Kontrolle (Zeile 2) und den 111 der Systemkontrolle
(Zeile 1) beobachtet, was eine fast vollständige Vernichtung darstellt.
-
Nach
der kombinierten CB/3FT-Behandlung in Zeile 6 wurden 19 Kolonien
gegenüber
den 46 der inneren Kontrolle und den 111 der Systemkontrolle beobachtet,
was nur eine teilweise Vernichtung darstellt.
-
Auf
diese Art wurde die Eignung von Cytochalasin B für eine vollständige Vernichtung
von Tumorzellen ausgeschlossen.
-
Diese
Ergebnisse bestätigen
die Aufnahme des Cytochalasin D in die Klasse A und den Ausschluss von
Cytochalasin B daraus.
-
Beispiel 7
-
Hemmung der Cytodierese
und anschließende
DNA-Replikation in normalen Zellen durch Verbindungen, die nicht
Cytochalasin D sind und die Umkehr davon
-
Um
die Fähigkeit
von Verbindungen, die nicht Cytochalasin D sind, zu verifizieren,
die Cytodierese von normalen Zellen zu hemmen, wurde eine Serie
von koloniebildenden Assays, die in Beispiel 5 beschrieben werden,
mit C3H10T1/2, C3H10T1/2(v-src/v-myc) oder mit MEF-Zellen mit einigen
Verbindungen durchgeführt,
die potenzielle CD-Analoga sind.
-
Insbesondere
wurde die erste Assay-Serie von Beispiel 5 mit 650 nM Latrinculin
B, 700 nM Jasplakinolid und 100 nM Condramid B anstatt mit CD durchgeführt. Die
zweite Assay-Serie von Beispiel 5 wurde mit 16 μM 13,14,21,22-Tetrahydrocytochalasin
B, 2 μM
21,22-Dihydrocytochalasin B, 1 μM
Deoxyphomin, 4 μM Cytochalasin
F (CF), 8 μM
Cytochalasin V (CV) und 0,5 μM
CD als Kontrolle mit MEF-Zellen durchgeführt.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 7 gezeigt. Tabelle
7
-
In
den Zeilen 1, 2 und 3 werden die Ergebnisse der ersten Beispiel
5 Assay-Serien gezeigt, wie sie durch die jeweilige Verabreichung
von Latruculin B, Jasplakinolid und Chondramid B durchgeführt werden.
In den Zeilen 4 bis 9 werden die Ergebnisse der Beispiel 5 zweiten
Assay-Serie gezeigt, wie sie mit MEF-Zellen durchgeführt werden,
denen 13,14,21,22-Tetrahydrocytochalasin B, 21,22-Dihydrocytochalasin
B, Deoxyphomin, Cytochalasin F (CF), Cytochalasin V (CV) und CD
als Kontrolle verabreicht wurde, durchgeführt werden.
-
In
den Spalten 3, 4, 5 und 6 werden jeweils die Prozentanteile der
mononuklearen, binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen nachgewiesenen
Zellen als Ergebnis be sagten Assays gezeigt. In Spalte 7 werden
die %S-Werte in Bezug auf die Kontrolle gezeigt. In den Spalten
1 und 2 werden jeweils die verabreichten Medikamente und untersuchten
Zellen gezeigt.
-
Die
oben genannten Ergebnisse zeigen, dass solche Verbindungen vollständig in
der Lage sind, mit der Ausbildung des kontraktilen Ringes von den
normalen Zellen zu Wechselwirken, wobei die Mehrheit davon in einem
binuklearen Zustand verbleibt (siehe Spalte 4, unter Zeile a).
-
Auf
transformierte Zellen haben stattdessen alle drei untersuchten Verbindungen
(Latrunculin B, Jasplakinolid und Chondramid B), obwohl sie in der
Lage sind, mit der Polymerisation des Actincytoskeletts zu Wechselwirken,
eine destabilisierende Wirkung in einem solchen Ausmaß, dass
die Cytodieresehemmung nicht nachweisbar ist (siehe Spalten 3 – 6, Unterzeilen
b). Jedoch, da diese Verbindungen nicht mit der Proliferation in
Tumorzellen Wechselwirken, wie in Spalte 7 gezeigt wird, sind sie
in diesem Zusammenhang für eine
kombinierte Verwendung mit 3FT oder einem Analogon davon geeignet.
-
In
jedem Fall werden als Ergebnis der oben genannten Behandlung %S-Phasen
und %mononukleare Zellen auch verifiziert und in der folgenden Tabelle
8 gezeigt, worin einige Ergebnisse der ersten Assay-Serien, die
in Beispiel 6 beschrieben werden, mit C3H10T1/2 durchgeführt werden,
wobei nur die oben genannten Verbindungen verabreicht werden und
in Bezug auf % zur Kontrolle gezeigt werden. Tabelle
8
-
In
den Zeilen 2 bis 6 werden die Ergebnisse der Beispiel 6 ersten Assay-Serien
gezeigt, die durch Verabreichung von Cytochalasin D, Dihydrocytochalasin
B, Latrunculin B, Jasplakinolid und Chondramid B durchgeführt werden.
In Zeile 1 werden die Ergebnisse des Beispiel 6 Kontroll-Assays
gezeigt, der durch Verabreichung von nur DMSO durchgeführt wurde.
-
In
Spalte 1 werden die verabreichten Medikamente und Konzentrationen
davon gezeigt. In Spalte 2 bis 3 werden die Prozentanteile der Zellen
gezeigt, die DNA nach T0 – T48
Medikamentenverabreichungen synthetisieren und die T0 – T96 BrdU-Aufnahme,
die mononuklearen Zell-Prozentanteile, die bei T96 gemessen wurden,
gefolgt von den T0 – T48-Medikamentenverabreichungen
und der T0 – T96
BrdU-Aufnahme in Bezug auf die Kontrolle und den Kolonie-Prozentanteil,
gemessen an dem 12. Tag nach den T0 – T72-Medikamentenverabreichungen, gefolgt
durch Medikamentenentfernung und Zugabe von frischem Medium vom
4. bis zum 12. Tag.
-
Die
Beispiel 6 ersten Assay-Serien wurden insbesondere zur Verifizierung
der Umkehrbarkeit von jeder der untersuchten Verbindungen und der
Klonierungseffizienz der Zellen nach der relevanten Behandlung durchgeführt.
-
Die
in der Tabelle gezeigten relevanten Ergebnisse sind insbesondere
solche, die sich auf die Verabreichung von 650 nM Lantrunculin B,
700 nM Jasplakinolid, 100 nM Condramid B, 2 μM Dihydrocytochalasin B und
400 nM Cytochalasin D als Kontrolle beziehen. Im Hinblick auf besagte
beobachtete Ergebnisse wurde die Umkehrbarkeit für die untersuchte Verbindung
und die anschließende
Eignung in dieser Hinsicht für
die 3FT- (oder äquivalente)
kombinierte Verwendung gezeigt.
-
Die
Ergebnisse der in Beispiel 4 oben beschriebenen Assayserien, die
unter Verwendung von Dehydrocytochalasin B (als H2CB in der Tabelle
bezeichnet) und 3FT durchgeführt
wurden, werden in der folgenden Tabelle 9 gezeigt.
-
-
In
Zeile 1 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien von Beispiel
4, die mit C3H10T1/2-Monokultur bei klonalen Dichten von 1 × 103 (Unterzeile a), 5 × 103 (Unterzeile
b) und 1 × 104 (Unterzeile c) durchgeführt werden, gezeigt. In Zeile
2 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien von Beispiel 4,
die mit C3H10T1/2v-src/v-myc-Monokultur
bei den klonalen Dichten von 5 × 102 (Unterzeile a), 1 × 103 (Unterzeile
b) und 5 × 103 (Unterzeile c) durchgeführt werden, gezeigt.
-
In
den Spalten 2, 3, 4 und 5 werden die Ergebnisse der Behandlung jeweils
nur mit Trägern
(DMSO für
CD und H2O für
3FT), das CD allein, das 3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte
1 werden stattdessen die untersuchten Zellen und relevanten Dichten
gezeigt.
-
Beispiel 8
-
Keine-Wechselwirkung
von Verbindungen, die nicht CD sind, mit 3FT-Aufnahme durch Tumorzellen Um
eine mögliche
Wechselwirkung mit der 3FT-Aufnahme durch Tumorzellen zu verifizieren,
wurden die in Beispiel 7 erwähnten
Verbindungen mit C3H10T1/2v-src/v-myc-Zellen untersucht, wobei die Aufnahme
von tritiertem Thymidin gemessen wurde. Es ist wohl bekannt, dass
tatsächlich
der Aufnahmemechanismus von Letzterem und dem von 3FT (und im Allgemeinen
der Antimetaboliten) die gleichen sind (6).
-
Zellen
wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen mit 5 × 104 Zellen/Vertiefung
plattiert und die Assays wurden unter Standard-Kulturbedingungen,
wie sie in Beispiel 1 beschrieben werden, durchgeführt.
-
Nach
dem anfänglichen
Zeitraum von 12 Stunden c.ca (siehe oben, Beispiel 1) wurden die
folgenden Assays durchgeführt.
In einem ersten Assay wurden 3000 nM CB für 24 h, in einem zweiten Assay
wurden 400 nM CD für
24 h, in einem dritten Assay wurden 650 nM Latrunculin B für 24 h,
in einem vierten Assay wurden 700 nM Jasplakinolid für 24 h und
in einem fünften
Assay wurden 100 nM Condramid für
24 h an C3H10T1/2v-src/v-myc
verabreicht.
-
Nach
besagten Verabreichungen wurde eine 4 μCi/ml tritierte Thymidinaufnahme
für 5 h
für jeden
Assay durchgeführt,
wobei die oben erwähnten
Verbindungen immer noch vorhanden waren. Zellen wurden daher 2 × mit PBS
gewaschen, mit 5 % kalter Trichloressigsäure extrahiert und anschließend NaOH-lysiert.
-
Die
verschiedenen Proben wurden nach Zugabe von Szintillationsflüssigkeit
in einem β-Zähler analysiert.
Die Emissionswerte, die für
die Menge an Proteinen in jeder Probe abgeglichen wurden (durch
das Lowry-Verfahren quantifiziert) werden in Zahlenwerten für Min/Microgramm
Protein in Spalte 3 gezeigt. Als Kontrollen wurde das Folgende berücksichtigt:
- – eine
erste C3H10T1/2v-src/v-myc – Zellkultur,
die über
den gesamten Assay proliferieren gelassen wurde (12 h + 24 h + 5
h), deren Radioaktivität
im (3-Zähler
bestimmt wurde.
- – eine
zweite C3H10T1/2v-src-myc – Zellkultur,
die für
die ersten 12 h frei proliferieren gelassen wurde und für den pharmakologischen
Behandlungs-Assay (12 h + 24 h), dann einer Aufnahme von 4 μCi/ml tritiertem Thymidin
für 5 h
unterzogen wurde und anschließend
einer Aufnahmebestimmung im β-Zähler unterzogen wurde.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 10 gezeigt. Tabelle
10
-
In
den Zeilen 3 bis 7 werden jeweils die Ergebnisse des ersten, des
zweiten, des dritten, des vierten und fünften Assays gezeigt. In den
Zeilen 1 und 2 werden die Ergebnisse des ersten und zweiten Kontrollassays
gezeigt.
-
In
den Spalten 1, 2 und 3 werden jeweils die Menge an verabreichtem
Thymidin (H3), die verabreichten Medikamente
und die Konzentration davon sowie die Emissionswerte in cpm/μg gezeigt.
Die oben gezeigte Ergebnisanalyse bestätigt, dass Cytochalasin B den
Nukleosid- und damit den Antimetaboliten-Transport hemmt (223 cpm/μg versus
505 cpm/μg),
wohingegen Cytochalasin D dieses im Wesentlichen nicht tut (391 cpm/μg versus
505 cpm/μg)
was in Übereinstimmung
mit den Assay-Ergebnissen von Beispiel 6 (siehe oben) ist. Bezüglich der
anderen untersuchten Verbindungen zeigen Jasplakinolid und Chondramid
nicht die Hemmung des Nukleosidtransports mit jeweils einem Wert
von 559 cpm/μg
und 562 vpm/μg
versus 505 cpm/μg
der Kontrolle, wohingegen Latrunculin B eine teilweise Hemmung mit
einem Wert von 283 cpm/μg
aufzeigt.
-
Solche
Verbindungen sind daher für
die 3FT-kombinierte Verwendung geeignet. Das Ergebnis dieser Assays
und der in Beispiel 7 oben beschriebenen wurden tatsächlich zusätzlich durch
das Aussetzen all dieser Verbindungen in den in Beispiel 2 und 3
beschriebenen Assays und dem positiven Ergebnis dieser bestätigt.
-
Beispiel 9
-
Nachgewiesene Cytotoxizität auf proliferierenden
Zellen und Abwesenheit einer Cytotoxizität auf abgestoppten normalen
Zellen der Klasse B Kandidatenverbindungen die nicht 3FT sind
-
Um
die Cytotoxizität
von Verbindungen auf proliferierenden Zellen zu verifizieren, die
nicht 3FT sind, die jedoch eine dazu analoge Wirkung aufzeigen,
wurden die in Beispiel 3 oben beschriebenen Assays unter Verwendung
von 2-Chlor-deoxyadenosin (2CIAd) und Cytarabin (Ara C) anstatt
3FT durchgeführt.
-
Die
fokusbildenden Assay-Bedingungen sind solche, die im Beispiel 3
für die
erste, zweite und dritte Assay-Serie beschrieben werden, außer dass
anstatt 3FT 80 μM
2CIAd und 40 μM
Ara C verabreicht wurden. Solche Konzentrationen sind derartige,
die als minimale zum Abtöten
von mindestens 90 % der prolieferierenden Zellen innerhalb der Zeit
der kombinierten Behandlung als Funktion des Zellzyklus der verwendeten
Tumorzellen (48 h in diesem Fall) vorbestimmt wurden.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen 11A (2CIAd)
und B (Ara C) gezeigt. Tabelle
11A
Tabelle
11 B
-
In
Tabelle 11A (Zeilen 1, 2 und 3) werden jeweils die Ergebnisse der
Beispiel 3 ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt, wie
sie unter Verabreichung von 2CIAd anstatt von 3FT durchgeführt werden.
-
In
Tabelle 11 B (Zeilen 1, 2 und 3) werden jeweils die Ergebnisse der
Beispiel 3 ersten, zweiten und dritten Assay-Serien gezeigt, wie
sie unter Verabreichung von Ara C anstatt von 3FT durchgeführt werden.
-
In
den Spalten 2, 3, 4 und 5 von beiden Tabellen werden Ergebnisse
der Behandlung mit jeweils den einzelnen Trägern (DMSO für CD und
H2O für
3FT), das CD allein, das 3FT allein und CD/3FT gezeigt. In Spalte
1 werden die untersuchten Zellen gezeigt. Sowohl in den Assay-Serien,
die durch Verabreichung von Ara C und denen, die unter Verabreichung
von 2CIAd durchgeführt
wurden, wurde eine drastische Verringerung oder sogar eine Abwesenheit
von Tumorzellkolonien und Transformations-Foci und auch die Umbildung
der normalen Zellmonoschicht (siehe Spalte 4 in beiden Tabellen)
beobachtet.
-
Jedoch,
während
sich die Monoschicht von Zellen, die der CD/AraC kombinierten Behandlung
ausgesetzt wurden, normal reformieren, verdoppelt sich die notwendige
Zeit für
die normale Monozellschicht zur Reformierung nach der CD/2CIAd kombinierten
Behandlung gegenüber
den zwei anderen untersuchten Verbindungen (von 5 Tagen des Assays,
der mit Ara C und 3FT durchgeführt
wurde auf 10/12 Tage des Assays, der mit 2CIAd durchgeführt wurde).
Zudem ist die Monoschicht-Sättigungsdichte
(Anzahl der Zellen pro Oberflächeneinheit)
die nach der 2CIAd-Behandlung neu gebildet wurde, deutlich geringer
in Bezug auf die anderen Fälle
(ungefähr
1/3) und die Zellen sind deutlich gealtert.
-
Diese
auf die Proliferations-Neustartphase und auf das erneute Wachstum
von normalen Zellen gerichteten Daten am Ende der gesamten Behandlung
zeigen eine selektive cytotoxische Wirkung von AraC auf Tumorzellen
im Gegensatz zu einer bestimmten toxischen Wirkung von 2CIAd nicht
nur auf Tumorzellen, sondern auch auf normale nach der kombinierten
Behandlung. Diese Daten werden daher mit den in den folgenden Beispielen
10 und 11 gezeigten Assays verifiziert.
-
Beispiel 10
-
Abwesenheit einer Cytotoxizität bei wachstumsgehemmten
Zellen durch 3FT und Test von Klasse B-Kandidatenverbindungen die
nicht 3FT sind
-
Eine
Serie von DNA-Synthese-Reaktivierungs-Assays nach Behandlungen mit
den oben im Beispiel 9 beschriebenen Verbindungen (AraC und 2CIAd)
und mit anderen Verbindungen mit einer zu 3FT analogen Wirkung (6-Thioguanin
(6ThG) und Doxorubicin) wurden mit C3H10T1/2-Zellen durchgeführt, die
reversibel in der G0/G1 durch Wachstumsfaktorentzug angehalten wurden.
-
Die
Wahl der Durchführung
der Assays mit Zellen, die in der G0/G1-Phase durch Wachstumsfaktorentzug
abgestoppt sind, anstatt mit Zellen, die mit Cytochalasin D oder Analogen
davon behandelt wurden, wurde zur Erleichterung der Untersuchung
durchgeführt.
Die Daten daraus werden als relevant für die vorliegende Diskussion
erachtet, da normale Zellen, die mit Cytochalasin D behandelt wurden,
beobachtet wurden, dass sie in einem binuklearen Zustand in der
G0/G1-Phase des Zellcyclus (19) anhalten.
-
Die
Zellen wurden bei einer 105-Dichte pro 35
mm Platte ausplattiert und die Kulturbedingungen sind die Standardbedingungen,
die in Beispiel 1 definiert sind.
-
Nach
dem anfänglichen
Zeitraum von 12 Stunden c.ca (siehe Beispiel 1 oben) wurden die
Zellen in ein Medium mit wenig Wachstumsfaktor (1 % FCS-supplementiertes
DMEM) transferiert, um besagte Proliferation abzustoppen. 48 h später (nach
Bestimmung eines Zellzustandes in allen Analogen zur Situation bei
T24 gemäß dem Behandlungsschema,
das in 1 gezeigt wird
und in den Beispielen 3 und 4 beschrieben wird) wurden die folgenden
pharmakologischen Behandlungen durchgeführt.
-
In
einem ersten Assay wurden 40 μM
3FT für
48 h, in einem zweiten Assay wurden 40 μM Ara C für 48 h, in einem dritten Assay
wurden 80 μM
2CIAd für
48 h, in einem vierten Assay wurden 100 μM 6-Thioguanin (6ThG) für 48 h,
in einem fünften
Assay wurden 1 μg/ml
Doxorubicin (Doxo) für
48 h zu G0/G1-abgestoppten C3H10T1/2-Zellen verabreicht.
-
Die
oben genannten Konzentrationen sind die Minimalen zum Abtöten von
proliferierenden Zellen, die auf der Basis der Zellzyklusdauer berechnet
wurden.
-
In
einem sechsten Assay wurde 1 μM
Ethidiumbromid (EtBr) für
48 h und in einem siebenten Assay wurden 20 mM BrdU für 48 h als
jeweils positive und negative Kontrolle verabreicht.
-
Die
Behandlungszeit gleicht derjenigen der Beispiel 3 dritten Assay-Serien
oben, die jedoch mit C3H10T1/2-abgestoppten Zellen durchgeführt wurden.
-
Nach
Freisetzung von der Medikamentenbehandlung wurden die Zellen 2 x
gewaschen und in niedrigem Serum für weitere 12 h gelassen, um
ein Auswaschen verbleibender Medikamente unter nicht-proliferierenden
Bedingungen zu ermöglichen.
-
Nach
dem 24 h Zeitraum in geringem Serum wurde Proliferationsmedium (DMEM
+ 10 % FCS), das mit 20 μM
BrdU supplementiert worden war, um DNA-synthetisierende Zellen zu
markieren, zu der Zellkultur hinzugefügt. Nach einer 24 h Stimulation
wurden die Zellen fixiert und wie in Grossi et al. 1991 (18) beschrieben
prozessiert. Der Prozentanteil DNA-synthetisierender Zellen in dem
24 h Markierungszeitraum wurde durch Immunfluoreszenz, wie sie in
Grossi et al. 1991 (18) beschrieben wird, nachgewiesen.
-
Sowohl
die Gesamtzellanzahl, die eine direkte Anzeige der cytotoxischen
Wirkung der Verbindungen ist (ausgedrückt als Prozentanteil in Bezug
auf die nicht behandelte Probe) wie auch die Anzahl der Zellen,
die ein intaktes Proliferationspotenzial beibehalten (d. h. Zellen,
die in der Lage sind, ihre DNA zu replizieren) wurde nachgewiesen.
Auf diese Art wurden die nicht behandelten Kontrollen jeweils mit
einbezogen. Die relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle
12 gezeigt. Tabelle
12
-
In
den Zeilen 2 bis 6 werden die Ergebnisse der ersten, zweiten, dritten,
vierten und fünften
Assay-Serien gezeigt. In den Zeilen 7 und 1 werden jeweils die Ergebnisse
der sechsten und siebenten Assays (positive und negative Kontrolle)
gezeigt.
-
In
den Spalten 2 bis 4 wird die Gesamtanzahl der beobachteten Nuclei,
die Anzahl der Nuclei, die BrdU nach Behandlung aufgenommen haben,
und der Prozentanteil von Zellen, die in die S-Phase übergehen,
jeweils auf der Basis der in den Spalten 2 und 3 ge zeigten Daten
extrapoliert, gezeigt. In Spalte 5 werden die Prozentanteile der
Zellen, die in die S-Phase eingehen, für jeden Assay gezeigt, die
auf der Basis der Daten, die in Spalte 4 gezeigt werden, extrapoliert
worden sind. In Spalte 6 werden die Prozentanteile von Zellen für jeden
Assay gezeigt, die immer noch auf der Platte nach der Behandlung
vorhanden sind (im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle). In
Spalte 1 werden die verschiedenen verabreichten Medikamente und
die verwendeten Konzentrationen gezeigt.
-
Auf
der Basis der oben genannten überlebenden
Zellzahl und der Anzahl von Zellen, von denen nachgewiesen wurde,
dass sie noch in der Lage sind, den Zellzyklus am Ende dieser Assays
wieder aufzunehmen, wurden die Ergebnisse des Beispiel 7 Assays
in Bezug auf 2CIAd bestätigt.
Nach 2CIAd-Verabreichung, obwohl ein hoher Prozentanteil verbleibender
haftender Zellen (97 %) beobachtet wurde, behielten wenige davon tatsächlich ihr
Proliferationspotenzial (lediglich 3 % – 6 % im Vergleich zur nicht
behandelten Kontrolle). Dementsprechend wurde bestätigt, dass
die DNA-Synthese fast vollständig
unabhängig
von der Beobachtung der einzelnen vorhandenen Zelle gehemmt wurde.
-
In
Bezug auf andere untersuchte Medikamente (3FT, Ara C, 6ThG) zeigten
sich diese statt dessen als nicht-toxisch in Bezug auf Zellen, die
in der intermitotischen Phase festgehalten wurden, wohingegen Doxorubicin,
obwohl es auf dem Gebiet als potentielles Medikament zur Verwendung
zur Tumorzellvernichtung angesehen wird, sich als zu toxisch mit
normalen Zellen, die in der Interphase wachstumsgestoppt wurden,
zur Aufrechterhaltung eines proliferativen Potenzials erwies. Entsprechend,
während
3FT, Ara C, 6ThG zeigten, dass sie in Kombination mit CD und Analogen
davon für
eine vollständige
und selektive Vernichtung von Tumorzellen nützlich sind, waren 2CIAd und
Doxorubicin dieses nicht.
-
Beispiel 11
-
Cytotoxizitäts-Quantifizierung
von 3FT und Analogen durch Erhöhung
der relevanten Konzentrationen
-
Um
zu verifizieren, ob und in welchem Ausmaß Konzentrationen von 3FT und
Analogen davon, die in den Assay-Serien, die in Beispiel 10 gezeigt
werden (worin die minimalen es ermöglichen, eine cytotoxische Wirkung
auf proliferierende Tumorzellen zu erhalten), zur Verstärkung der
Vernichtungs-Effektivität
pro Zeiteinheit variiert werden können, wurden die Assay-Serien,
die in Beispiel 10 mit erhöhenden
Konzentrationen von besagten Verbindungen gezeigt wurden, mit C3H10T1/2-Zellen
durchgeführt,
die reversibel in der G0/G1b-Phase durch Wachstumsfaktorentzug angehalten
wurden.
-
Die
Kultur- und Assay-Bedingungen sind solche, die in Beispiel 10 beschrieben
werden, außer
für die pharmakologische
Behandlung, welche in der folgenden Assay-Serie aus dem Folgenden
besteht.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurden Ara C 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM und als Kontrolle Cytidin
50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM für 48 h den
oben erwähnten
abgestoppten Zellen verabreicht.
-
In
einer zweiten Assay-Serie wurden 3FT 50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM und als Kontrolle Thymidin
50 μM, 100 μM, 200 μM, 400 μM und 800 μM für 48 h den
oben erwähnten
Zellen verabreicht.
-
Bestimmte
Assays, die mit Cytidin für
das Ara C und Thymidin für
das 3FT durchgeführt
wurden, wurden, um jegliche mögliche
Toxizitätsdatenverzerrung
zu vermeiden, die sich aus der Verwendung erhöhter Nukleosid-Konzentrationen
ergibt, durchgeführt.
-
Drei
weitere Kontroll-Assays, worin 20 μM BrdU, 80 μM 2CIAd und 1 μg/ml Doxorubicin
für 48
h den oben erwähnten
Zellen verabreicht wurden, wurden jedoch durchgeführt.
-
Die
höchsten
Verbindungskonzentrationen in all diesen Assays waren eine 10 – 20-fache Erhöhung in Bezug
auf die minimale Dosis, die zur Zellvernichtung in dieser kombinierten
Verbindung mit CD oder Analogen davon notwendig war. Dieses ermöglichte
es, zu verifizieren, ob die Vernichtungswirksamkeit verbessert werden
könnte
(in Bezug auf die in vivo- oder ex vivo-Behandlung) durch Erhöhung der
Konzentration des chemotherapeutischen Medikaments, wodurch die
Dosierungseinschränkung
bedingt durch die Toxizität
desselben überwunden
wird.
-
Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 13 gezeigt. Tabelle
13
-
In
Zeilen 9 bis 13 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien gezeigt.
In Zeilen 4 bis 8 werden die Ergebnisse der relevanten Kontroll-Assay-Serien
gezeigt. In Zeile 19 bis 23 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien
gezeigt. in Zeilen 14 bis 18 werden die Ergebnisse der relevanten
Kontrollserien gezeigt. In Zeilen 1 bis 3 werden die Ergebnisse
der drei weiteren Kontroll-Assays unter Verabreichung von BrdU,
2CIAd und Doxorubicin gezeigt.
-
In
den Spalten 2 bis 4 werden jeweils die Gesamtanzahl der beobachteten
Nuklei, die relative Anzahl von Nuklei mit aufgenommenem BrdU nach
Behandlung und der Prozentanzahl von Zellen gezeigt; der die S-Phase
eingeht; wie auf der Basis der in Spalten 2 und 3 jeweils gezeigten
Daten berechnet. In Spalte 5 werden für jeden Assay die Prozentanteile
der Zellen gezeigt, die in die S-Phase eingehen, in Bezug auf nicht
behandelte Kontrollzellen von Zeile 1, berechnet auf der Basis der
Daten, die in Spalte 4 gezeigt werden. In Spalte 6 werden die Prozentanteile
der Zellen für
jeden Assay gezeigt, die letztendlich immer noch nach der Behandlung
anhafteten (im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle). In Spalte
1 werden die unterschiedlichen verabreichten Medikamente und die
verwendeten Konzentrationen gezeigt.
-
Die
oben gezeigten Ergebnisse beweisen, dass Trifluorthymidin toxisch
bei 400 – 800 μM wird, da
der Prozentanteil von Zellen, die in die S-Phase eingehen, unverändert ist
in Bezug auf die anderen Assays, aber die Anzahl der beobachteten
Zellen sich ungefähr
halbiert (siehe Zeilen 22 bis 23) hat, wohingegen das Ara-C bei
200 – 400 μM anfängt toxisch
zu werden, da in diesem Fall die Anzahl der beobachteten Zellen
gleich bleibt, aber der Prozentanteil von Zellen, die in der Lage
sind, in die S-Phase einzugehen, sich verringert (siehe Zeilen 11-12).
-
Auf
der Basis dieser Ergebnisse, sogar und über alles, im Vergleich zu
solchen, die sich auf die zwei Kontrollverbindungen 2CIAd und Doxo
beziehen, die in 0 Wachstum resultieren, kann gesagt werden, dass bedingt
durch die kombinierte Verwendung mit Cytochalasin D (oder einem
Analogon davon) die Konzentration der oben genannten Verbindung
(oder eines Analogons davon) bis zum 10-fachen erhöht werden
kann, da eine bestimmte Toxizität
davon jedoch vernachlässigbar
ist. Betreffend die optimalen Dosierungen scheint 3FT bis zu 400/800 μM – Konzentrationen
gut tolerierbar zu sein. Statt dessen scheint AraC bei einer Dosierung von
400 μM toxisch
zu werden.
-
Beispiel 12
-
Bestätigungsverfahren
zur Übertragbarkeit
auf menschliche Tumor- und normale Zellinien
-
Alle
oben beschriebenen Assays wurden in einem System durchgeführt, das
spezifisch entwickelt wurde, um pathologische Situationen im Menschen
in vivo zu reproduzieren. Um die volle Anwendbarkeit der Ergebnisse
auf menschliche Zellen zu bestätigen,
die mit C3H10T1/2-Zellen durchgeführt wurden, wurden Assay-Serien
mit kultivierten Zellen, die aus Glioblastoma stammen, durchgeführt.
-
Kultur-
und experimentelle Bedingungen sind identisch zu denen, die in Beispiel
1 gezeigt werden, außer
dass die verwendeten Zellen Lipari-, T97- und U973- Glioblastomas
waren und dass Nukleations-Zustandsdaten nach den folgenden Behandlungen
beobachtet wurden.
-
In
einer ersten Assay-Serie wurden 400 nM Cytochalasin D für 48 h (T0 – T48) zusammen
mit BrdU (T24 – 48)
in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozentanteils von Zellen,
die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari-, T97- und
U973-Zellen verabreicht.
-
In
zweiten Assay-Serien wurden 650 nM Latrunculin B für 48 h (T0-T48)
zusammen mit BrdU (T24 – 48)
in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozentanteils von Zellen,
die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari- (Zeile
12), T97- (Zeile 12) und U973-(Zeile
13) Zellen verabreicht.
-
In
einer dritten Assay-Serie wurden 700 nM Jasplakinolid für 48 h (T0 – T48) zusammen
mit BrdU (T24 – 48)
in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozenanteils von Zellen,
die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari- (Zeile
14), T97- (Zeile 15) und U973- (Zeile 16) Zellen verabreicht.
-
In
einer vierten Assay-Serie wurden 100 nM Chondramid B für 48 h (T0 – T48) zusammen
mit BrdU (T24 – 48)
in den letzten 24 h zur Steuerung des Prozenanteils von Zellen,
die in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lipari- (Zeile
17), T97- (Zeile 18) und U973- (Zeile 19) Zellen verabreicht.
-
In
einer fünften
Assay-Serie wurden 400 nM Cytochalasin D für 48 h (T0 – T48) zusammen mit BrdU (T24 – 48) in
den letzten 24 h zur Steuerung des Prozenanteils von Zellen, die
in der Lage sind, in die S-Phase einzugehen, Lungen (9) und Dermis
(10) menschlichen Fibroblasten verabreicht.
-
In
Kontrollassays wurden nur 20 μM
BrdU für
48 h an Lipari- (Zeile 1), T97- (Zeile 2) und U973- (Zeile 3) Zellinien,
Lungen- (4) und dermalen (5) Fibroblasten verabreicht.
-
Insbesondere
wurden zuerst die oben erwähnten
ersten bis vierten Assays mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt, danach
wurde nach positivem Ausgang als weitere Bestätigung der fünfte Assay
mit Lungen-Fibroblasten (gleiche Verfahren wie für die Beispiel 2 Assays) durchgeführt und
Dermis-Fibroblasten wurden nur unter Verabreichung von CD durchgeführt. Die
relevanten Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 14 gezeigt. Tabelle
14
-
In
Zeilen 6 bis 8 werden die Ergebnisse der ersten Assay-Serien, wie
sie mit Lipari, T97 und U973 jeweils durchgeführt werden, gezeigt. In Zeilen
11 bis 13 werden die Ergebnisse der zweiten Assay-Serien, wie sie
mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt werden, gezeigt. In den
Zeilen 14 bis 16 werden die Ergebnisse der dritten Assay-Serien,
wie sie mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt wurden, gezeigt. In den
Zeilen 17 bis 19 werden die Ergebnisse der vierten Assay-Serien,
wie sie mit Lipari, T97 und U973 durchgeführt wurden, gezeigt. In Zeilen
9 und 10 werden die Ergebnisse der fünften Assay-Serie, wie sie
mit Lipari, T97 und U973 jeweils durchgeführt werden, gezeigt. In den
Zeilen 1 bis 5 werden die Ergebnisse der Kontroll-Assays, wie sie jeweils
mit Lipari, T97, 0973, Lungen und Dermis-Fibroblasten durchgeführt wurden,
gezeigt.
-
In
den Spalten 3, 4, 5 und 6 werden die Prozentanteile der mononuklearen,
binuklearen, tri-tetranuklearen und >4-nuklearen Zellen gezeigt, die am Ausgang
der Ergebnisse nachgewiesen werden. In Spalte 1 und 2 werden statt
dessen das verabreichte Medikament und die untersuchte Zelle gezeigt.
-
Die
Ergebnisse all dieser Assay-Serien betonen die Multinukleation aller
menschlicher Zellen, die mit den oben genannten Verbindungen behandelt
wurden (siehe die Ergebnisse, die sich auf den Prozentanteil von
tri-, tetra- oder >4-nukleare
Zellen beziehen, die jeweils in den Spalten 5 und 6 gezeigt werden).
-
Insbesondere
zeigt Chondramid B eine besonders wirksame Wirkung, da es nicht
nur Multinukleation von Tumorzellen induziert, sondern auch in der
Lage ist, deren Ablösung
zu bewirken.
-
Selbst
wenn die Daten hierin nicht gezeigt werden, wurde auch die Umkehrbarkeit
der Wirkung besagter Verbindungen in solchen menschlichen Zellen
nachgewiesen, wie sie für
murine Zellen gezeigt wurden (siehe Bsp. 5, 7). Dieses bestätigt die
Anwendbarkeit der kombinierten Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung
auch auf das menschliche System und die volle Übertragbarkeit der Ergebnisse
auf das menschliche System, die durch das Modellsystem erhalten
werden, wodurch letzteres auf jeden Fall validiert wird.
-
Glossar
-
- – Der
Begriff "Tumorzellen", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich: in vivo auf Zellen, die verschiedene Tumorformen
aufzeigen; in vitro auf in vitro transformierte Zellen (d. h. solche,
die entweder spontan oder durch eine Oncogenexpression tumorgen
wurden) oder sich von Tumorexplantaten ableiten, die jedoch nicht
die Voraussetzungen erfüllen,
die für
die Definition von normalen in vitro Zellen (1 – 3) üblich sind.
- – Der
Begriff "normale
Zellen", wie er
hierin verwendet wird, bezieht sich:
in vivo auf jegliche Körperzelle,
die nicht in einem transformierten oder tumorösen Zustand ist;
in vitro
auf primäre
oder Kultur-stabilisierte Zellen, die die Eigenschaften beibehalten,
die als normal im Stand der Technik angesehen werden, d: h:
- – Abhängigkeit
von Wachstumsfaktoren zur Proliferation;
- – Unfähigkeit
zur Ausbildung von Tumoren, wenn sie in immundefizitäre Mäuse injiziert
werden;
- – Unfähigkeit
zur Ausbildung von Transformations-Foci in den Assays, die für diesen
Zweck zur Verfügung gestellt
werden; und
- – Abhängigkeit
von einer Verankerung für
das Wachstum (nur für
solche Zellen, die normalerweise haftend wachsen).
- – Mit
der Bezeichnung "funktioneller
P53-Stoffwechselweg",
wie er hierin verwendet wird, wird der Komplex von Genen bezeichnet,
dessen Produkte stromaufwärts
und stromabwärts
des p53-Gens wirken oder dessen Genprodukt und die zur korrekten
Funktion von p53 in der Regulation des Zellzyklus und der Genomstabilität notwendig
sind.
-
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