DE60203702T2

DE60203702T2 - Verwendung eines adenosin-a3-rezeptor-agonisten zur hemmung der virenreplikation

Info

Publication number: DE60203702T2
Application number: DE60203702T
Authority: DE
Inventors: Pnina Fishman; Kamel Khalili
Original assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Current assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2002-01-13
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2022-01-14
Also published as: HK1064948A1; EP1365776B1; US20040106572A1; BR0206492A; JP2004517864A; WO2002055085A2; DE60203702D1; CA2434906C; WO2002055085A3; EP1365776A2; AU2002219497B2; CA2434906A1; CN1489470A; ATE292973T1; CN1259056C; IL156704A0; JP4012070B2; US7589075B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung befindet sich allgemeinen auf dem Gebiet der anti-Infektiva und genauer gesagt betrifft sie zweite medizinische Verwendungen zum Inhibieren der viralen Replikation innerhalb von Zellen.
STAND DER TECHNIK
Die folgende Liste ist eine Liste des Standes der Technik, die als maßgebend für die Beschreibung des Standes der Technik auf dem Gebiet der Erfindung angesehen wird.
Verweis auf diese Referenzen wird hier gemacht durch Angabe der Nummer aus der Liste unten in Klammern.

1. Linden J. The FASEB J. 5:2668-2676 (1991);
2. Stiles G. L. Clin. Res. 38:10-18 (1990);
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11. R. Cole und J. de Vellis. 1997. In: Protocols for neural cell culture. S. Fedoroff und Richardson (Eds.) Human Press, Totowa, NJ, pp. 117-130;
12. S. Gartner und M. Popovic. 1990. In: Techniques on HIV research. A. Aldovini and B.D. Walker (Eds.) Stockton Press, New York, NY, pp. 53-70;
13. V.W. Yong und J.P. Antel, 1997, In: Protocols for neural cell culture. S. Fedoroff und A. Richardson (Eds.) Humana Press, Totowa, NJ, pp. 157-172.
14. US 5,688,774 .
15. US 5,773,423
16. US 6,048,865
17. WO 95/02604
18. WO 99/20284
19. WO 99/06053
20. US 5,688,774
21. US 773,423
22. WO 94/21195
23. US 6,048,865
24. WO 99/06053
25. WO 95/02604
26. US 5,573,772 .

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Humane Immundefizienz-Viren-Typen 1 und 2 (Human immunodeficiency viruses types 1 and 2, HIV-1 und HIV-2) sind Retroviren, welche das "Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) im Menschen hervorrufen. AIDS resultiert aus niedrigen Spiegeln an CD4-positiven T-Lymphozyten in HIV-infizierten Individuen.
HIV-1 infiziert T-Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen, Dendriten-Zellen und Mikroglia. Alle diese Zellen exprimieren das Oberflächen-Glycoprotein CD4, welches als ein Rezeptor für HIV-1 und HIV-2 dient. Effizientes Eindringen von HIV-1 in Target-Zellen hängt von der Bindung des vitalen Hüll-Glycoproteins gp120 an CD4 ab. Darüber hinaus fungieren verschiedene Chemokin-Rezeptoren als HIV-Co-Rezeptoren und bestimmen die effiziente Infektion verschiedener Zelltypen mit HIV-1-Strängen. Nach Binden mediatisieren Hüll-Glycoproteine die Fusion von vitalen und Wirtszell-Membranen, um den Eindring-Prozess zu vervollständigen. Sobald innerhalb der Zelle angekommen, tritt ein Prozess der vitalen Replikation auf, und durch einen Knospungsprozess werden replizierte Viren aus infizierten Zellen freigesetzt. Dies führt eventuell zur zytolytischen Zerstörung der infizierten Zellen. Diese Sequenz wiederholt sich viele Male, wobei signifikant die Anzahl der Target-Zellen im Körper reduziert wird, was ein ernsthafter und lebensbedrohlicher materieller Zustand ist, der häufig zum eventuellen Tod des infizierten Individuums führt.
Adenosin ist ein Purin-Nukleosid, welches im Plasma und in anderen extrazellulären Flüssigkeiten vorliegt. Es wird in den extrazellulären Zwischenraum von verschiedenen Zelltypen freigesetzt und bringt einen Effekt auf andere Zellen durch Binden an G- Protein assoziierte Rezeptoren auf der Zellmembran zur Geltung^(1-2). Die Interaktion von Adenosin mit seinen Rezeptoren initiiert den Signalübertragungspfad (signal transduction pathway), welcher in erster Linie das Adenylat-Cyclase-Effektorsystem vorantreibt, welches cAMP als einen second messenger einsetzt. G-Protein-assoziierte Adenosin-Rezeptoren werden in vier Gruppen klassifiziert, die als A1, A2a, A2b und A3 bezeichnet werden. A1 und A3-Rezeptoren sind mit G_i-Proteinen gekoppelt und inhibieren folglich Adenylat-Cyclase, was zu einer Verminderung im Spiegel der intrazellulären cAMP führt. Die A2a und A2b-Rezeptoren sind an G_s-Proteine gekoppelt und aktivieren folglich Adenylat-Cyclase, wodurch die cAMP-Spiegel erhöht werden⁽³⁾.
Unter den physiologischen Effekten von extrazellulärem Adenosin sind die Inhibierung von Cytokinfreisetzung, die Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation, die Induktion der Erythropoietin-Produktion sowie die Modulation der Lymphozyten-Funktion zu nennen⁽ ^4-6). Adenosin ist auch in die Modulation von einigen Funktionen des zentralen Nervensystems (central nervous system; CNS) involviert, in die Wundheilung, in Diurese und in die Schmerzkontrolle. Adenosin ist in der Lage, die Proliferation in einem weiten Bereich normaler Zelltypen zu induzieren ^(7-10).
Zusammensetzungen umfassend Verbindungen verwendet in der vorliegenden Anmeldung als Adenosin-Rezeptor Agonisten wurden veröffentlicht^(18,20-26), unter diesen Verbindungen sind N⁶-2-(4-aminophenyl)ethyladenosin (APNEA)^(22,26), N⁶-4-amino-3-iodobenzyl)adenosin-5'-(N-methyl-uronamid)(AB-MECA)⁽²⁴⁾, 1-deoxy-1-{6-[({3-iodophenyl}methyl)amino]-9H-purin-9-YL}-Nmethyl-beta-D-ribofuranronamid (IB-MECA)^(19,24) und 2-chloro-N⁶-(3-iodobenzyl)-adenosin-5'-N-methyluronamid (CI-IB-MECA)^(19,24).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der gefundenen Erkenntnis, dass Adenosin-Rezeptor-Agonisten die virale Replikation innerhalb von Zellen inhibieren. Folglich wird in Übereinstimmung mit der Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Inhibieren der viralen Replikation in Zellen zur Verfügung gestellt, umfassend das Präsentieren einer effektiven Menge von zumindest einem Adenosin A3-Rezeptoragonisten (A3RAg) für die Zellen.
Der Agonist verwendet in dieser Erfindung, entweder ein vollständiger oder partieller Agonist für den Adenosin A₃-Rezeptor. Wie hier verwendet, ist eine Verbindung ein „vollständiger Agonist" eines Adenosin A₃-Rezeptors, falls sie in der Lage ist, vollständig Adenylat-Cyclase (A₃) zu inhibieren, und eine Verbindung ist ein „partieller Agonist" des Adenosin A₃-Rezeptors, falls sie in der Lage ist, Adenylat-Cyclase (A₃) teilweise zu inhibieren.
Auch zur Verfügung durch die Erfindung gestellt wird die Verwendung eines A3RAg zur Herstellung mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung viraler Replikation.
Die Erfindung ist insbesondere bedeutsam, obwohl nicht darauf limitiert, für die Inhibierung der Replikation von HIV-Virus in menschlichen Zellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die pharmazeutisch oder therapeutisch „effektive Menge" für die Zwecke hier wird durch solche Betrachtungen bestimmt, wie sie im Stand der Technik bekannt sein können. Die Menge muss effektiv sein, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen, welcher vom Typus und von der Art der Behandlung abhängt. Wie für den Fachmann klar ist, sollte die effektive Menge effektiv sein, um die Rate der viralen Replikation innerhalb der Zelle zu reduzieren, den Spiegel der viralen Partikel in klinischen Proben zu reduzieren oder, eine Verbesserung im Zustand eines Individuums mit einer viralen Infektion zu erhalten, eine Verbesserung oder eine Eliminierung von Symptomen oder irgendwelche andere Indikationen zugänglich als geeignete Messgrößen für die Fachleute auf dem Gebiet zu erhalten. Ein Beispiel einer effektiven Menge ist eine tägliche Verabreichung eines A3RAGs innerhalb des Bereiches von zwischen ungefähr 1 mg/kg Körpergewicht und ungefähr 10 mg/kg Körpergewicht. Solch eine Menge von A3RAg wird typischerweise verabreicht in einer einzelnen täglichen Dosis, obwohl zur gegebenen Zeit eine tägliche Dosis in mehrere Dosen aufgeteilt werden kann, welche über den Tag verteilt verabreicht werden, oder zur gegebenen Zeit mehrere tägliche Dosen in eine einzelne Dosis kombiniert werden können, die dem Patienten einmal alle paar Tage verabreicht wird, insbesondere falls die Verabreichung in einer Formulierung zur verzögerten Freisetzung erfolgt.
In einer Ausführungsform ist das aktive Ingredienz ein Nukleosidderivat. Die Bezeichnung "Nukleosid" bedeutet irgendeine Verbindung umfassend einen Zucker, vorzugsweise Ribose oder Deoxyribose, oder eine Purin- oder Pyrimidin-Base oder eine Kombination eines Zuckers mit einer Purin oder eine Pyrimidin-Base vorzugsweise aneinander gebunden durch eine N-glycosidische Bindung. Die Bezeichnung „Nukleosid-Derivat" wird verwendet, um ein natürlich vorkommende Nukleosid zu bezeichnen, ein synthetisches Nukleosid oder ein Nukleosid, welches chemischen Modfikationen unterzogen worden ist mit Hilfe von einer oder mehrerer Insertionen, Deletionen, exozyklischen oder endozyklischen Substitutionen von einer oder mehreren Gruppen darin, oder konformatorischen Modifikationen, welche ein Derivat mit gewünschtem biologischen Effekt zur Verfügung stellen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das aktive Ingredienz ein Nukleosid-Derivat der folgenden allgemeinen Formel (I):
wobei

– R₁ Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl oder Cyanoalkyl oder eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel (II) ist:
in welcher:
– Y Sauerstoff, Schwefel oder CH₂ ist;
– X₁ H, Alkyl, R^aR^bNC(=O)- oder HOR^c- ist, wobei R^a und R^b gleich oder verschieden sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Amino; oder einem substituierten oder unsubstituierten Alkyl, Haloalkyl, Aminoalkyl, BOC-Aminoalkyl und Cycloalkyl oder gemeinsam verknüpft sind, um einen heterozyklischen Ring auszubilden, welcher 2-5 Kohlenstoffatome enthält, und R^c ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl, Amino, Haloalkyl, Aminoalkyol, geschütztem Aminoalkyl (beispielsweise -BOC-Aminoalkyl), und Cycloalkyl;
– X₂ gleich H, Hydroxyl, Alkylamino, Alkylamido oder Hydroxyalkyl ist;
– X₃ und X₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl, Amino, Amido, Azido, Halo, Alkyl, Alkoxy, Carboxy, Nitrilo, Nitro, Trifluoro, Aryl, Alkaryl, Thio, Ester, Thioester, Ether, Thioether, -OCOPh oder -OC(=S)OPh sind, oder X₃ und X₄ sind beide sauerstoffverknüpft an >C-S, um einen 5-gliedrigen Ring auszubilden, oder X₂ und X₃ bildenden Ring der Formel (III) aus, wobei R' and R'' unabhängig voneinander niedriges Alkyl sind;
– R₂ ausgebildet ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halo, Alkylether, Amino, Hydrazido, Alkylamino, Alkoxy, Thioalkoxy, Pyridylthio, Alkenyl; Alkynyl, Thio, and Alkylthio; und
– R₃ eine N-NR₄R₅ Gruppe ist, wobei R₄ ein Wasserstoff ist oder eine Gruppe ausgewählt aus Alkyl, substitutiertem Alkyl oder Aryl-NH-C(Z)-, wobei Z, O, S, oder NR^a ist mit R^a mit den oben genannten Bedeutungen, und R₅ eine Gruppe ausgewählt aus Heteroaryl-NR^a-C(Z)-, Heteroaryl-C(Z)-, Alkaryl-NR^a-C(Z)-, Alkaryl-C(Z)-, Aryl-NR-C(Z)- und Aryl-C(Z)-, wobei R^a und Z die oben definierten Bedeutungen aufweisen; oder wenn R⁴ ein Wasserstoff ist, ist R⁵ gleich R oder S-1-Phenylethenzyl, Phenylethyl oder Anilid, wobei alle optional substituiert sind in einer oder mehrerer Position mit einem Substituenten ausgebildet aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Amino, Halo, Haloalkyl, Nitro, Hydroxyl, Acetoamido, Alkoxy und Sulfonsäure oder Salzen davon; oder wenn R⁴ Benzodioxanemethyl, Furfuryl, L-Propylalanyl-Aminobenzyl, β-Alanylamino-benzyl, T-BOC-β-Alanylaminobenzyl, Phenylamino, Carbamoyl, Phenoxy oder Cycloalkyl ist; ist R⁵ eine Gruppe der folgenden Formel:
oder ein geeignetes Salz der Verbindung, wie oben definiert, beispielsweise einem Triethylammoniumsalz davon.

Das aktive Ingredienz ist vorzugsweise ein Nukleosidderivat der allgemeinen Formel (IV):
wobei X₁, R₂, R₄ und R₅, wie oben definiert sind.
Bevorzugte aktive Ingredienzien gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung können im allgemeinen als N⁶-Benzyladenosin-5'-Uronamide und Derivate davon bezeichnet werden, welche sich als A3-selektive Adenosin-Rezeptoragonisten herausstellen. Beispiele für solche Derivate sind N⁶-2-(4-Aminophenyl)ethyladenosine (APNEA), N⁶-(4-Amino-3-iodobenzyl)adenosine-5'-(N-methyl-uronamide) (AB-MECA) und 1-Deoxy-1-{6-[({3-Iodophenyl}Methyl) Amino]-9H-Purin-9yl}-N-Methyl-β-D-Ribofuranuron-Amid, wobei das letztgenannte auch auf dem Gebiet als N⁶-3-iodobenzyl-5' oder -methylcarboxamidoadenosin oder als N⁶-(3-iodobenzyl)adenosin-5'-N-methyluronamid und hier oben wie unten durch die Abkürzung IB-MECA bezeichnet wird. Ein chloriertes Derivat von IB-MECA (R₂=Cl) stellt auch einen Teil dieser Gruppe dar und wird hier als CI-IB-MECA bezeichnet; IB-MECA und CI-IB-MECA sind derzeit bevorzugt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das aktive Ingredienz ein Adenosin-Derivat sein, welches allgemein als ein N⁶-Benzyl-Adenosin-5'-Alkyluronamid-N¹-Oxid oder N⁶-Benzyladenosin-5'-N-Dialyluron-Amid-N¹-Oxid bezeichnet wird.
Einige der oben definierten Verbindungen und ihre Synthese-Prozeduren können in den Publikationen 14 bis 19, wie oben aufgeführt, gefunden werden.
Die Kohlenwasserstoff-Ketten, wie hier verwendet, können geradkettige oder verzweigte Ketten einschließen. Insbesondere bezieht sich die Bezeichnung „Alkyl" auf monovalente geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkyl-Gruppen, vorzugsweise mit zwischen 1 und 20 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt 1-10 Kohlenstoffatom („niedriges Alkyl") und am meisten bevorzugt 1 bis 6 Atome. Diese Bezeichnung wird beispielhaft dargestellt durch Gruppen, wie z.B. Methyl, Ethyl, N-Propyl, Iso-Propyl, N-Butyl, Iso-Buty, N-Hexyl und dergleichen.
Die Bezeichnung „Alkylen" und „niedriges Alkylen" beziehen sich auf divalente Radikale des korrespondierenden Alkans. Desweiteren weisen, wie hier verwendet, andere Gruppen mit Namen abgeleitet von Alkanen, wie z.B. Alkoxyl, Alkanoyl, Alkenyl, Cycloalkenyl, etc., wenn sie um die Bezeichnungen „niedriger" modifiziert werden, Kohlenstoffketten von 10 oder weniger Kohlenstoffatomen auf. In diesen Fällen, wo die minimale Anzahl von Kohlenstoffatomen größer als eins ist, beispielsweise Alkenyl (minimale Zahl zwei Kohlenstoffe) und Cycloalkyl (minimale Zahl drei Kohlenstoffe) versteht es sich, dass „niedriger" zumindest die minimale Anzahl an Kohlenstoffen bedeutet.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „subsituiertes Alkyl" auf eine Alkylgruppe mit von 1 bis 4 Substituenten und vorzugsweise 1 bis 3 Substituenten, wie oben definiert. Wie hier verwendet, soll der vorangestellte Zusatz „substituiert" einen oder mehrere Substituenten, wie oben aufgeführt, soll der vorangestellte Zusatz „substituiert" einen oder mehrere Substituenten, wie oben aufgeführt, enthalten.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Alkoxy" auf die Gruppe „Alkyl-O" wobei Alkyl, wie oben definiert ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Alkenyl" auf Alkenlyl-Gruppen, vorzugsweise mit zwischen 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und mehr bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und weist zumindest eine vorzugsweise zwischen 1 und 2 Stellen der Alkenyl-Doppelbindung auf, wohingegen die Bezeichnung „Alkinyl" sich auf Alkinylgruppen von vorzugsweise mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bezieht, die außerdem zumindest eine und bevorzugt zwischen 1 und 2 Stellen für die Alkinyl-Dreifachbindung aufweisen.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Aryl" auf eine ungesättigte aromatische carbozyklische Gruppe von zwischen 6 und 14 Kohlenstoffatomen mit einem einzelnen Ring (beispielsweise Phenyl) oder multiplen kondensierten (fusionierten) Ringen (beispielsweise Naphthyl oder Anthryl). Bevorzugte Aryle schließen Phenyl, Naphthyl und dergleichen ein. Solange nichts anderes durch die Definition für den Arylsubstituenten angegeben wird, können solche Arylgruppen optional mit zwischen 1 und 5 Substituenten und vorzugsweise 1 und 3 Substituenten substituiert sein, wie z.B. diejenigen, wie oben zur Verfügung gestellt.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Cykloalkyl" auf zyklische Alkylgruppen von zwischen 3 und 12 Kohlenstoffatomen mit einem einzelnen zyklischen Ring oder multiplen kondensierten Ringen. Solche Cykloalkyl-Gruppen schließen als Beispiele einzelne Ringstrukturen, wie z.B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclooctyl und dergleichen, ein oder multiple Ringstrukturen, wie z.B. Adamantanyl und dergleichen.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Heteroaryl" auf aromatische carbocyklische Gruppen von zwischen 1 und 15 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel innerhalb zumindest eines Rings (falls mehr als ein Ring auftritt) . Solange nichts anderes angegeben wird, können solche Heteroarylgruppen optional mit zwischen 1 und 5 Substituenten substituiert sein und vorzugsweise 1 und 3 Substituenten, wie angegeben.
Wie für jede der oben genannten Gruppen, welche eine oder mehrere Substituenten enthalten, versteht es sich selbstverständlich, dass solche Gruppen nicht irgendwelche Substituenten oder Substitutionsmuster enthalten, welche sterisch unpraktikabel und/oder synthetisch nicht realisierbar sind.
Gegebenenfalls kann der oben definierte A3RAg als das aktive Ingredienz Schutzgruppen oder blockierende Gruppen enthalten. Die Bezeichnung "Schutzgruppe" oder "blockierende Gruppe" bezieht sich auf irgendeine Gruppe, welche, wenn sie an eine oder mehrere Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen der Verbindungen gebunden wird, Reaktionen davon abhält, dass sie an diesen Gruppen auftreten, wobei die Schutzgruppen durch konventionelle chemische oder enzymatische Schritte entfernt werden können, um die Hydroxyl-, Amino- oder Carboxyl-Gruppen wieder herzustellen. Bevorzugte entfernbare amino-schützende Gruppen schließen konventionelle Substituenten, wie z.B. t-Butoxycarbonyl (t-BOC wie oben angegeben), wie auch andere wie z.B. Benzyloxycarbonyl (CBZ) und dergleichen ein, welche durch konventionelle Bedingungen, kompatibel mit der Natur des Produktes, entfernt werden können.
Der A3RAg verwendet innerhalb der Erfindung kann, wie oben definiert sein oder kann in der Form von Salzen oder Solvaten davon vorliegen, insbesondere in der Form von physiologischen akzeptablen Salzen und Solvaten davon. Desweiteren, wenn es ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome enthält, kann das aktive Ingredienz Isomere und Diastereomere der oben genannten aktiven Ingredienzien oder Mischungen davon enthalten.
Pharmazeutisch akzeptable Salze der oben angegebenen aktiven Ingredienzien schließen diejenigen ein, abgeleitet von pharmazeutisch akzeptablen anorganischen oder organischen Säuren. Beispiele geeigneter Säuren schließen Salzsäure, Bromwasserstoff, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Tolulol-p-Sulfonsäure, Weinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Benzolsäure, Malonsäure, Naphthalin-2-Sulfonsäure und Benzensulfonsäure ein.
Der A3RAg kann als nicht-aktive Substanz (beispielsweise Pro-Pharmakon) verabreicht werden und kann nur durch weitere Modifikation/en durch einen natürlichen Prozess an einer spezifischen Stelle in dem Subjekt aktiviert werden. In jedem Fall wird das Derivat so sein, dass die therapeutische Funktionalität der pharmazeutischen Zusammensetzung bewahrt werden wird. Solche Pro-Pharmaka sind auch durch die Bezeichnung "aktives Ingredienz" abgedeckt. In ähnlicher Art und Weise sollte sich die Bezeichnung „A3RAg" verstehen als einschließlich Pro-Pharmaka, welche – obwohl a priori keine Agonistenaktivität aufweisen – aktiv in vivo werden.
Um einen Adenosin A3-Rezeptor Agonisten auszuwählen, der in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden kann, können Kandidatenverbindungen für solche Verbindungen gescreent werden, welche die Fähigkeit haben, virale Replikationen in einer Art und Weise, die derjenigen von IB-MECA oder CI-IB-MECA gleichkommt, zu inhibieren. Ein geeignetes Screening-Verfahren ist ein in vitro Assay der Art wie im Abschnitt "Experimentelle Resultate" unten beschrieben. Jedoch kann eine Vielzahl anderer Assays, welche per se bekannt sind, auch verwendet werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung innerhalb der Erfindung kann den A3RAg als solches enthalten, kann aber auch mit anderen Ingredienzien kombiniert werden, welche einen pharmazeutisch akzeptablen Carrier, ein Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff, ein Additiv und/oder Adjuvans, wie sie für den Fachmann bekannt sind, darstellen können, beispielsweise für die Zwecke des Zusatzes von Aromen, Farben, Gleitmitteln oder dergleichen zur pharmazeutischen Zusammensetzung. Es ist evident, dass sich die pharmazeutisch akzeptablen Carrier, Verdünner, Hilfsstoff/e, Additive/a, eingesetzt in Übereinstimmung mit vorliegenden Erfindung, im allgemeinen auf inerte, nicht-toxische feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünner oder verkapselte Materialien beziehen, welche bevorzugt nicht mit den Verbindungen innerhalb der Zusammensetzung der Erfindung reagieren.
Viele A3RAgs sind bioverfügbar, wenn sie oral verabreicht werden. Folglich kann abhängig vom aktiven Ingrediens die pharmazeutische Zusammensetzung verwendet innerhalb der Erfindung zur oralen Verabreichung formuliert werden. Solch eine orale Zusammensetzung kann des weiteren einen pharmazeutisch akzeptablen Carrier, Verdünner, Hilfsstoffe, Additiva oder ein Adjuvans geeignet zur oralen Verabreichung umfassen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, verwendet innerhalb der Erfindung, werden verabreicht und dosiert in Übereinstimmung mit guter medizinischer Praxis, wobei die klinischen Zustände des individuellen Patienten, die Stelle sowie das Verfahren der Verabreichung, der Plan der Verabreichung, das Alter des Patienten, das Geschlecht, das Körpergewicht und andere Faktoren, die dem praktizierenden Art bekannt sind, berücksichtigt werden.
Die Verbindung kann innerhalb der Erfindung auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Sie kann oral, subkutan oder parenteral einschließend intravenös, intraarteriell, intramuskulär, intraperitioneal oder per intranasaler Verabreichung verabreicht werden, wie auch durch intrathekale sowie Infusionstechniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
Die Behandlung weist ein Gesamtlängen-Kontingent je nach Länge des Erkrankens-Prozesses und der Effektivität des aktiven Wirkstoffes auf. Der therapeutische Verabreichungsplan kann einzelne Dosen oder multiple Dosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder mehr einschließen.
Bei der Verabreichung der Zusammensetzungen verwendet innerhalb der vorliegenden Erfindung in parenteraler Weise, werden sie im allgemeinen in einer injizierbaren Einheits-Dosisform (Lösung, Suspension, Emulsion) formuliert werden. Die pharmazeutischen Formulierungen, geeignet zur Injektion schließen sterilen wässrigen Lösungen oder Dispersionen und sterile Puder zur Rekonstitution in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen ein. Der eingesetzte Carrier kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersions-Medium sein, enthaltend beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylen, Glycol, Lipid-Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Mischungen davon oder Pflanzenöle.
Nicht wässrige Vehikel, z.B. Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Sonnenblumenöl oder Erdnussöl und Ester, wie z.B. Isopropylmyristat, können gegebenenfalls auch als Lösungsmittel-Systeme für das aktive Ingrediens verwendet werden.
Desweiteren können verschiedene Additive, welche die Stabilität, Sterilität und Isotonizität der Zusammensetzungen verbessern, antimikrobielle Konservierungsstoffe, Antioxidantien, gelatbildende Wirkstoffe und Puffer zugesetzt werden. Der Schutz gegen die Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Wirksubstanzen gewährleistet werden, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und der gleichen.
Zum Zwecke der oralen Verabreichung kann das aktive Ingrediens in der Form von Tabletten, Suspension, Lösungen, Emulsionen, Kapseln, Pulvern, Sirupen und dergleichen formuliert werden, welche geeignet sind und durch Techniken, die den Pharmazeuten wohl bekannt sind, erhalten werden können.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Hilfe von Beispielen unter Verweis auf experimentelle Resultate unten, sowie die beigefügten Figuren beschrieben. Es sollte sich ver stehen, dass Terminologien, welche verwendet wurden, sich auf die Natur von Bezeichnungen der Beschreibung beziehen und nicht auf Einschränkungen.
Während die oben genannte Beschreibung im Detail nur wenige spezfische Ausführungsformen der Erfindung beschreibt, wird es sich für den Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass die Erfindung nicht darauf limitiert ist und dass andere Variationen in Form und Details möglich sein können, ohne vom Umfang, wie in den beigefügten Ansprüchen dargestellt, abzuweichen.
EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE
Material und Methoden:
Herstellung der primären menschlichen fötalen Astrozyten und Mikroglia.
Aufgereinigte primäre menschliche fötale Astrozyten und Mikroglia-Zellen wurden her gestellt von 16 bis 20 Wochen alten menschlichen fetalen Gehirngeweben durch eine modifizierte Prozedur basierend auf dem Verfahren von Cole und de Vellis¹¹ und Yong und Antel¹³. Gehirngewebe wurde in eiskalter Hank's balancierter Salzlösung (Hank's Balanced Salt Solution HBSS) gewaschen, enthaltend die Antibiotika Gentamycin und Amphotericin B. Blutgefäße und Hirnhaut wurden entfernt und das Gewebe wurde in kleine Stücke zerteilt. Nach Zerteilen wurde das Gewebe enzymatisch dissoziiert durch Inkubation in 0,05% Trypsin und mechanisch zerkleinert durch mehrmaliges Passieren über einen 75 μm Nylonmesh-Filter. Die resultierende singuläre Zell-Suspension wurde gewaschen, pelletiert und plattiert in einer Dichte von 2-10 × 10⁶ Zellen pro 162 cm² Behälter in DMEM:F12 enthaltend 10% fetales Kälberserum, Insulin, Gentamycin und L-Glutamin. Nach 7 bis 10 Tagen an Wachstum wurden die Mikroglial-Zellen isoliert durch platzieren in einem Rotations-Schüttler bei 200 rpm in einem 37°C Inkubator über Nacht. Die nicht-adherenten Zellen wurden entfernt und man ließ sie in einem neuen Gefäß für 1 bis 3 Stunden anwachsen. Nach dem Anwachsen wurden die Zellen gewaschen und erneut mit Medium enthaltend 10% fötales Kälberserum, Insulin, Gentamycin, L-Glutamin und N1-Supplement versorgt. Astrocyten wurden subkultiviert von adherenten Zellen in Medium enthaltend 15% fötales Kälberserum, Insulin, Gentamycin und L-Glutamin und kontaminierende Mikroglia wurde entfernt durch wiederholtes Rotations-Schütteln. Kultivierte Astrocyten und Mikroglia-Zellen wurden plattiert in einer Dichte von 2,5 × 10^–5 pro Well in 6-Well-Platten zur nachfolgenden Infektion.
Herstellung des HIV-1-Virus
Von Gehirnen erhaltende primäre HIV-1-Isolate SF162 und JR-FL wurden in menschlichen peripheralen Blut-Mononuklear-Zellen (peripheral blood-mononuclear cells, PBMC) kultiviert, essentiell, wie von Gartner und Popovic¹² beschrieben. PBMC wurden isoliert aus menschlichem Leukozytenfilm per Ficoll-Gradient und in einer Dichte 2,5 × 10⁶ pro ml RPMI plattiert enthaltend 10% fetales Kälberserum und Gentamycin. Die Zellen wurden stimuliert durch Zugabe von 5 ug/ml an Phytohemagglutinin (PHA) für 48 Stunden. Nach Stimulation wurden die Zellen entweder mit SF162 und JR-FL infiziert und für 7 bis 10 Tage kultiviert, bis hohe Titer von HIV-1 in Überstand durch p24-ELISA-Assay detektiert wurden. Wenn die virale Produktion optimal war, wurden die Zellen pelletiert, der Überstand enthaltend HIV-1 wurde aliquotiert und bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Der P24 ELISA-Assay wurde auf einem Aliquot an Stammlösung durchgeführt, um den viralen Titer zu bestimmen.
Infektion von primären menschlichen fetalen Astrozyten und Mikroglial-Zellen und Behandlung mit CI-IB-MECA
2,5 × 10⁵ Mikroglia- und Astrozyten-Zellen wurden pro Well in 6-Well-Platten plattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen gewaschen und erneut mit frischem Medium versorgt. 2 × 10⁴ p24 Einheiten entweder von SF162 oder JR-FL Virus wurde pro Well zugegeben in einer Gesamtmenge von 1 ml an viralem Inoculum. In Kontrollexperimenten wurde der Virus nicht zugegeben. Die Zellen wurden inkubiert mit Virus über Nach bei 37°C, extensiv mit PBS gewaschen und mit 2 ml frischem Medium versorgt. Die Kulturen wurden behandelt mit IB-MECA oder CI-IB-MECA bei einer Konzentration von 0,01 μM alle 24 Stunden. 500 μl an Medium wurden entfernt zur gegebenen Zeit folgend auf die Infektion und bei –70°C für die spätere Analyse gelagert. Zu jeder Zeit, zu der das Medium entfernt wurde, wurde eine Volumenmenge an frischem Medium hinzugegeben. In Kontrollexperimenten wurden IB-MECA und CI-IB-MECA weggelassen.
p24-ELISA Assay
Der ELISA-Assay, zur Detektion des HIV-I-viralen Kern-Proteins, p24, wurde durchgeführt auf 50 μl an gesammeltem Überstand einsetzend den kommerziell erhältlichen p24 ELISA-Kit (NEN/Dupont) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers.
Ergebnisse
Wein den Tabellen 1 bis 3 zu sehen ist, ist die Menge an p24 Protein, welche in Kulturmedium gesammelt von HIV-infizierten Zellen vorliegt, signifikant vermindert in HIV-infizierten Zellen, welche mit IB-MECA (HIV und IB-MECA) oder CI-IB-MECA (HIV und CI-IB-MECA) behandelt wurden im Vergleich zu Kontrollen, welche weder mit IB-MECA noch mit CI-IB-MECA behandelt worden waren (HIV).
Tabelle 1 zeigt den Effekt von IB-MECA und CI-IB-MECA auf die HIV-Replikation in JR-FL-infizierten Astroglia-Zellen, wobei das p24-Protein (pg/ml) im Medium von Zellkulturen 5 Tage nach der HIV-Infektion gemessen wurde.
Tabelle 2 zeigt den Effekt von IB-Meca und CI-IB-MECA auf die HIV-Replikation in SF162 infizierten Astroglia, wobei das p24-Protein (pg/ml), wie oben angegeben, gemessen wurde.
Tabelle 3 zeigt den Effekt von IB-MECA und CI-IB-MECA auf die HIV-Replikation in SF126 infizierten Mikroglia/SF, wobei das p24-Protein (pg/ml) im Medium von Zellkulturen 5 Tage und 10 Tage nach der HIV-Infektion gemessen wurde.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3

Claims

Verwendung von zumindest einem A3 Rezeptor-Agonisten (A3RAg) für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der Replikation eines Virus.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Virus ein HIV ist.
Die Verwendung der Ansprüche 1 oder 2, wobei A3RAg ein Nukleotidderivat der folgenden generischen Formel (I) ist:
wobei R₁ gleich Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl oder Cyanoalkyl ist oder eine Gruppe der folgenden generischen Formel (II):
in welcher: – Y gleich Sauerstoff, Schwefel oder CH₂ ist; – X, gleich H, Alkyl, R^aR^bNC(=O)- oder HOR^c ist, wobei R^a und R^b gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Amino; oder einem substituierten oder unsubstituierten Alkyl, Haloalkyl, Aminoalkyl, geschütztem Aminoalkyl, und Cycloalkyl oder beide verknüpft miteinander sind, um einen heterozyklischen Ring auszubilden, der zwei bis fünf Kohlenstoffatome enthält, und R^c ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aminohaloalkyl, Aminoalkyl, BOC-Aminoalkyl und Cycloalkyl; – X₂ gleich H, Hydroxyl, Alkylamino, Alkylamino oder Hydroxyalkyl ist; – X₃ und X₄ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyl, Amino, Amido, Azido, Halo, Alkyl, Alkoxy, Carboxy, Nitrilo, Nitro, Trifluoro, Aryl, Alkaryl, Thio, Ester, Thioester, Ether, Thioether, -COPh, OC(=S) OPh sind, oder X₃ und X₄ beide via Sauerstoff verknüpft an >C= S sind, um einen 5-gliedrigen Ring auszubilden, oder X₂ und X₃ einen Ring der Formel (III):
ausbilden, wobei R' and R'' unabhängig voneinander Alkyl sind; – R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Halo, Alkylether, Amino, Hydrazido, Alkylamino, Alkoxy, Thioalkoxy, Pyridylthio, Alkenyl; Alkynyl, Thio, and Alkylthio; und – R₃ eine N-NR₄R₅ Gruppe ist, wobei R₄ ein Wasserstoff ist oder eine Gruppe ausgewählt aus Alkyl, substitutiertem Alkyl oder Aryl-NH-C(Z)-, wobei Z, O, S oder NR^a ist, mit R^a mit den oben genannten Bedeutungen, und R₅ eine Gruppe ausgewählt aus Heteroaryl-NR^a-C(Z)-, Heteroaryl-C(Z)-, Alkaryl-NR^a-C(Z)-, Alkaryl-C(Z)-, Aryl-NR-C(Z)- und Aryl-C(Z)- ist, wobei R^a und Z die oben definierten Bedeutungen aufweisen; oder wenn R⁴ ein Wasserstoff ist, R⁵ gleich R- oder S-1-Phenylethyl ist, Benzyl, Phenylethyl oder Anilid, wobei alle optional substituiert sind an einer oder mehreren Positionen mit einem Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Amino, Halo, Haloalkyl, Nitro, Hydroxyl, Acetoamido, Alkoxy und Sulfonsäure oder Salzen davon; oder wenn R⁴ Benzodioxanmethyl, Furfuryl, L-Propylalanyl-aminobenzyl, β-Alanylamino-benzyl, T-geschütztes-β-Alanylaminobenzyl, Phenylamino, Carbamoyl, Phenoxy oder Cycloalkyl ist; R₅ eine Gruppe der folgenden Formel ist,
oder ein geeignetes Salz der Verbindung, wie oben definiert, beispielsweise ein Triethylammoniumsalz, wobei die Bezeichnungen "Alkyl" sich auf monovalente, geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkylgruppen, vorzugsweise mit zwischen 1-20 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt zwischen 1-10 Kohlenstoffatomen („niedriges Alkyl"), und am meisten bevorzugt von 1 bis 6 Atome bezieht; Gruppen mit Namen, die sich von Alkanen ableiten, wie z. B. Alkoxyl, Alkanoyl, Alkenyl, Cycloalkenyl, etc., wenn sie durch den Begriff „niedrig" modifiziert werden, Kohlenstoffketten von zehn oder weniger Kohlenstoffatomen aufweisen; die Bezeichnung „Alkoxy" sich auf eine Gruppe „Alkyl-O-„ bezieht, wobei Alkyl, wie oben definiert ist; die Bezeichnung „Aryl" sich auf eine ungesättigte aromatische carbozyklische Gruppe von 6-14 Kohlenstoffatomen mit einem einzelnen Ring oder vielen kondensierten (anelierten) Ringen bezieht; die Bezeichnung „Cycloalkyl" sich auf zyklische Alkylgruppen von zwischen 3 bis 12 Kohlenstoffatomen mit einem einzelnen zyklischen Ring oder vielen kondensierten Ringen bezieht; die Bezeichnung „Heteroaryl" sich auf eine aromatische carbozyklische Gruppe von 1 bis 15 Kohlenstoffatomen and 1 bis 4 Heteroatomen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel innerhalb zumindest eines Ringes bezieht (falls mehr als ein Ring auftritt).
Die Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei besagtes A3RAg ein Nucleosidderivat der allgemeinen Formel (IV) darstellt:
wobei X₁, R₂, R₄ und R₅ wie in Anspruch 3 definiert sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das aktive Ingredients ein N⁶-Benzyladenosin-5'-Uronamid ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei besagter A3RAg ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N⁶-2-(4-Aminophenyl)ethyladenosin (APNEA), N⁶-(4-Amino-3-iodobenzyl)adenosin-5'-(N-methyl-uronamid) (AB-MECA) und 1-Deoxy-1-{6-[({3-iodophenyl}methyl)amino]-9H-purin-9yl}-N-methyl-β-D-ribofuranuron-Amid (IB-MECA) und 2-chloro-N⁶-(3-iodobenzyl)-adenosin-5'-N-methyl-uronamid (CI-IB-MECA).
Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei besagter A3RAg gleich IB-MECA oder CI-IB-MECA ist.
Ein Verfahren zum Inhibieren der Replikation eines Virus in Zellen umfassend das Inkontaktbringen der Zellen in vitro mit einer effektiven Menge von zumindest einem Adenosin A3 Rezeptor-Agonisten (A3RAg).
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Virus ein HIV ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei der A3RAg, wie in irgendeinem der Ansprüche 3 bis 7 definiert ist.