DE60036862T2 - Synergistische hemmung von viralreplikation durch langkettigen kohlenwasserstoffe und nucleosid-analoge - Google Patents

Synergistische hemmung von viralreplikation durch langkettigen kohlenwasserstoffe und nucleosid-analoge Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen für die Behandlung viraler Infektionen unter Verwendung von n-Docosanol in Kombination mit Nukleosidanaloga oder Nukleotidanaloga und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Virale Infektionen stellen eine ernste Bedrohung für die Volksgesundheit dar. Viren wie Herpes-simplex-Viren (HSV-1 und HSV-2), das Zytomegalovirus (CMV), das Epstein-Barr-Virus (EBV), das Varizellen-Zoster-Virus (VZV), Influenzaviren, humane lymphotrope Viren (z. B. HTLV-1) und humane Immundefizienzviren (z. B. HIV-1) führen zu signifikanter Morbidität und Mortalität. HSV-1 und HSV-2 werden mit der Entzündung und Läsionen der Haut und der mukosalen Membranen in Verbindung gebracht, einschließlich Gesichtsherpes, Fieberbläschen und Genitalherpesläsionen. Das VZV verursacht Gürtelrose und das EBV wird mit Mononukleose in Verbindung gebracht. Influenzaviren verursachen Grippesymptome und können tödlich sein. HIV verursacht eine erworbene Immundefizienz, welche infizierte Individuen schwächt und tötet. Obwohl diese Viren in einigen Zellen und für variierende Zeiträume latent bleiben können, führt die Viralreplikation im Allgemeinen zu einer irreversiblen Zerstörung der infizierten Zelle, wodurch unterschiedliche klinische Manifestationen der durch die Viren verursachten Erkrankungen erzeugt werden.
  • Die meisten derzeitigen antiviralen Therapien setzen Nukleosidanaloga ein, wie das Purinnukleosidanalogon Acyclovir (ACV) und das Pyrimidinnukleosidanalogon Azidothymidin (AZT), welche störend auf die Viralreplikation innerhalb infizierter Wirtszellen wirken. Diese Nukleosidanaloga werden durch virale und/oder zelluläre Kinasen in ihre triphosphorylierten (Nukleotid-) Derivate umgewandelt, wobei sie die Verlängerung der Virus-DNA blockieren. Das Guaninanalogon 9-(2-Hydroxy)- ethoxymethylguanin, bezeichnet als ACV, besitzt potente antivirale Aktivität. Beispiele therapeutischer Nukleosidanaloga, die mit ACV verwandt sind, und Verfahren ihrer Herstellung sind in US-Patentschrift Nr. 4,199,574, 4,294,831 und 4,360,522 von Schaeffer, US-Patentschrift Nr. 5,580,571 von Hostetler, US-Patentschrift Nr. 5,756,737 von Turchetta et al. und US-Patentschrift Nr. 5,567,816 von Schloemer et al. offenbart. Die Hauptprobleme bei der Verwendung dieser Nukleosidanaloga sind ihre eingeschränkte Phosphorylierung in einigen Zellen und die zytotoxischen Nebenwirkungen der Triphosphate der Nukleosidanaloga. Darüber hinaus können diese antiviralen Arzneimittel potentiell als Mutagene und/oder Teratogene in Wirtszellen agieren. Somit wurden trotz der potenten antiviralen Aktivitäten der Nukleosidanaloga weniger toxische, wirksame Therapien gesucht.
  • Zu den Alternativen für die Nukleosidanaloga zur Behandlung viraler Infektionen zählen eine Vielzahl langkettiger Alkohole, Fettsäuren, Alkane und verwandte Verbindungen. Die bisherige Untersuchung derartiger Verbindungen konzentrierte sich auf ihre direkten viriziden Wirkungen. Zum Beispiel wurde von ungesättigten Alkoholen, die 14 bis 20 Kohlenstoffe und eine bis vier Doppelbindungen aufweisen, berichtet, dass sie antivirale Aktivität besitzen. Der wirksamste dieser ungesättigten Alkohole war γ-Linolenylalkohol, ein C18-Alkohol mit Doppelbindungen an den Positionen 6, 9 und 12 (Sands et al., Antimicrob. Agents & Chemother. 15: 67-73, 1979). Bei Zusammensetzungen, welche Ölsäure (C18, eine Doppelbindung) enthalten, wurde auch nachgewiesen, dass sie Anti-Herpesvirus-Aktivität zeigen (PCT Patentanmeldung WO 9602244A1 ).
  • Bei langkettigen aliphatischen Alkoholen, die 20 bis 32 Kohlenstoffe aufweisen, wurde nachgewiesen, dass sie antivirale und antiinflammatorische Aktivität besitzen. Therapeutische Zusammensetzungen, die solche langkettigen 5 aliphatischen Alkohole und verwandte Verbindungen enthalten, sind in US-Patentschrift Nr. 4,874,794 , US-Patentschrift Nr. 5,071,879 , US-Patentschrift Nr. 5,166,219 , US-Patentschrift Nr. 5,194,451 und US-Patentschrift Nr. 5,534,554 beschrieben.
  • Von einigen Verbindungen, die strukturell mit langkettigen aliphatischen Alkoholen verwandt sind, wurde auch berichtet, dass sie antivirale Aktivität besitzen. Zum Beispiel offenbart US-Patentschrift Nr. 4,513,008 die antivirale Aktivität von linearen, mehrfach ungesättigten C20- bis C24-Säuren, -Aldehyden oder -Alkoholen mit fünf bis sieben Doppelbindungen. Verbindungen mit einer langkettigen Fettacylgruppe, die mindestens drei ungesättigte Bindungen enthält, gebunden an ein Nukleosid oder Nukleosidanalogon, sind auch als antivirale Behandlungen in US-Patentschrift Nr. 5,216,142 offenbart. Die verwandte US-Patentschrift Nr. 5,276,020 offenbart antivirale Verbindungen mit einer langkettigen C16-, C18- oder C20-Fettsäuregruppe gebunden an ein Nukleosidanalogon und ein Verfahren der Behandlung von Virusinfektion unter Verwendung dieser Verbindungen. Tatsächlich berichteten Hostetler et al. kürzlich von verbesserter oraler Absorption und antiviraler Aktivität eines C18-Derivats von ACV, 1-D-Octadecyl-sn-glycero-3-phospho-ACV (Hostetler et al., Biochem. Pharmacol 53: 1815-1822, 1997).
  • Es wurde auch von topischen Therapien berichtet, die verschiedene Alkohole, Fettsäuren und Amine umfassen. Zum Beispiel wurde von antiviraler Aktivität bei liposomalem AL721, einer Mischung aus neutralen Glyceriden, Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin, berichtet (Antonian et al., Neurosci. Biobehav. Rev. 11: 399-413, 1987). Antimikrobielle Zusammensetzungen für die topische Behandlung, die einen C15-Glycerinmonoester der Laurinsäure oder einen mehrere Hydroxylgruppen enthaltenden Alkoholmonoester der Laurinsäure mit einer Mischung aus Fettsäuren (C10-Caprin- und C8-Caprylsäure) enthalten, wurden in US-Patentschrift Nr. 5,208,257 offenbart. Die Behandlung von Herpesläsionen unter Verwendung topisch verabreichter Zusammensetzungen, die ein Anästhetikum, einen oberflächenaktiven Stoff und einen topischen Träger enthalten, wurde in US-Patentschrift Nr. 5,380,754 offenbart. Ein Verfahren der Behandlung von Entzündungen durch die topische Anwendung von Ethylcis,cis(9,12)octadecadienoat (Ethyllinoleat) wurde in US-Patentschrift Nr. 4,025,645 als eine Gesichtsherpesbehandlung offenbart.
  • Katz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825-10829, 1991; US-Patentschrift Nr. 5,534,554 ) haben gezeigt, dass ein bestimmter langkettiger aliphatischer Alkohol, n-Docosanol (C22), potente systemische und topische antivirale Aktivität gegen eine Reihe von Viren, einschließlich des Herpes-simplex-Virus (in vitro und in vivo), HIV-1 (in vitro), des Respiratory-Syncytial-Virus (in vitro) und des Friend-Virus (in vitro und in vivo), besitzt. Im Gegensatz zu ungesättigten C10- bis C18-Alkoholen, die eine Detergens-ähnliche antivirale Aktivität zeigen, deaktiviert n-Docosanol Viren nicht direkt (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825-10829, 1991; Snipes et al., Antimicrob. Agents Chemother. 11: 98-104, 1977). Die progressive Bindung und Aufnahme von n-Docosanol durch Zellen kann zu seiner antiviralen Aktivität beitragen, weil die Vorinkubation von Zellen mit dem Alkohol optimale antivirale Aktivität erzeugt. Darüber hinaus finden sich 70% des zellassoziierten n-Docosanol in Zellmembrankomponenten und der Rest steht mit löslichen Zellfraktionen in Verbindung (Pope et al., J. Lipid Res. 37: 2167-2178, 1996). Die Plasmamembran-Inkorporation von n-Docosanol hemmt die Virusbindung an die Zelloberfläche nicht. Die frühe Virusproteinsynthese wurde zu mehr als 80% gehemmt und die Viren lokalisierten sich nicht an Kernen (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825-10829, 1991). Die Fusion des Virus mit der Plasmamembran der Zelle wurde verhindert (Pope et al., Antiviral Res. 40: 85-94, 1998).
  • Die Hemmung der Virusproteinsynthese und die antivirale Aktivität von n-Docosanol scheint den zellulären Metabolismus des Alkohols zu erfordern (Pope et al., J. Lipid Res. 37: 2167-2178, 1996; Katz et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 724: 472-488, 1994). Darüber hinaus ist, während die intrazellulären metabolischen Umwandlungen von n-Docosanol für seine antivirale Aktivität verantwortlich sein können (Katz et al., Annals N. Y. Acad. Sciences, 724: 472-488, 1994), n-Docosanol bei Konzentrationen von bis zu 300 mM nicht zytotoxisch.
  • Verbindungen wie n-Docosanol, deren pharmakologische Wirkungen durch zellulären Metabolismus mediiert werden, können die Art und Weise verändern, wie ein zweites Arzneimittel metabolisiert und exprimiert werden kann. Außerdem ist von Viren bekannt, dass sie den Wirtszellenmetabolismus drastisch verändern. Solche Arzneimittelinteraktionen können unerwünschte Wirkungen bei Patienten erzeugen, die mit mehreren Arzneimitteln behandelt werden. Es können jedoch auch vorteilhafte Arzneimittelinteraktionen auftreten. Tatsächlich gab es zahlreiche Berichte über Interaktionen zwischen Nukleosidanaloga wie ACV und Verbindungen, die den zellulären Metabolismus modulieren (Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1051-1055, 1989; O'Brien et al., Antimicrob. Agents Chemother. 34: 1178-1182, 1990; Hirsch et al., 1996, Antiviral agents, in Fields Virology Third Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, S. 431-466). Im Allgemeinen beinhaltet der Mechanismus die Modulation von einem oder mehreren Schritten bei der/beim zellulären Nukleosidaufnahme oder -metabolismus, was zu einer effizienteren Expression der antiviralen Aktivität führt.
  • Weil Patienten mit einer wiederkehrenden Herpesvirus-Erkrankung gleichzeitig mit 10%iger n-Docosanol-Creme und Acyclovir (ZOVIRAXTM) behandelt werden könnten, wurde das Potential für nachteilige bzw. vorteilige Arzneimittelinteraktionen untersucht. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass n-Docosanol die antivirale Aktivität von Nukleosidanaloga gegen die Replikation mehrerer Herpesviren und das Vakziniavirus synergistisch intensiviert hat.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine antivirale Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend n-Docosanol und ein Nukleosidanalogon oder ein Nukleotidanalogon in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, ferner umfassend einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff, wobei der nichtionische oberflächenaktive Stoff ein difunktionelles Blockpolymer ist, bei welchem es sich um ein Polyoxyalkylenderivat von Propylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 25.000, ein Blockcopolymer aus Ethylenoxid und Propylenoxid mit einem Molekulargewicht zwischen 6.000 und 12.000 oder Octoxynol-9 oder Octoxynol-10 handelt.
  • Das n-Docosanol liegt vorzugsweise mit einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,05% bis etwa 40% vor. Am bevorzugtesten wird das n-Docosanol mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1% bis etwa 20% verwendet. Das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon in der antiviralen Zusammensetzung ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ACV, Adefovir, Azidothymidin, Brivudin, Cidofovir, ddC, ddI, Famciclovir, Ganciclovir, Idoxuridin, Lamivudin, Lobucavir, Penciclovir, Ribavirin, Sorivudin, Trifluridin, Trimethoprim, Valaciclovir und Ara A. Das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon liegt vorzugsweise mit einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,1% bis etwa 10% vor.
  • Vorzugsweise umfasst die antivirale Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung n-Docosanol und ein Nukleosidanalogon aus der Gruppe bestehend aus ACV, Ribavirin, Trifluridin und Ara-A in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das n-Docosanol mit einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,05% bis etwa 40% und das Nukleosidanalogon mit einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,1% bis etwa 10% vorliegt.
  • Ein bevorzugter pharmazeutisch verträglicher Träger gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Saccharosestearat mit einer Konzentration von etwa 1% bis etwa 25%, Mineralöl mit einer Konzentration von etwa 1% bis etwa 25%, Propylenglycol USP mit einer Konzentration von etwa 1% bis etwa 25%, Benzylalkohol mit einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 10% und Wasser.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung kann ferner einen Penetrationsenhancer umfassen.
  • Die Zusammensetzung der Erfindung kann ferner weitere Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus antimikrobiellen Mitteln, anderen antiviralen Mitteln, antifungalen Mitteln, Antioxidanzien, Puffermitteln, Sonnenschutzmitteln, kosmetischen Mitteln, Duftstoffen, Gleitmitteln, Befeuchtungsmitteln, Trockenmitteln und Verdickungsmitteln umfassen.
  • Die offenbarten antiviralen Zusammensetzungen können bei der Behandlung einer viralen Infektion verwendet werden, wobei n-Docosanol zusammen mit dem Nukleosid- oder Nukleotidanalogon verabreicht wird. Das n-Docosanol und das Nukleosid- oder Nukleotidanalogon können zur Verabreichung von einmal bis fünfmal pro Tag über einen Weg ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus topischer, oraler, mukosaler, transmembranaler Penetration und intravenös unabhängig angepasst werden. Die Verwendung von n-Docosanol und dem Nukleosid- oder Nukleotidanalogon der vorliegenden Erfindung wird auch bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen Infektion angeführt. Das Medikament kann bei einer Dosis von etwa 0.01 bis etwa 10 Gramm mit einer Häufigkeit von etwa einmal bis fünfmal pro Tag für eine Dauer von etwa einem bis vierzehn Tagen verabreicht werden. Das Medikament kann über einen Weg ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus topischer, oraler, mukosaler transmembranaler Penetration und intravenös verabreicht werden.
  • Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann bei einer Behandlung einer viralen Infektion verwendet werden. Die Behandlung umfasst die Verabreichung einer Zusammensetzung der Erfindung, wobei die Zusammensetzung topisch drei- bis fünfmal pro Tag oder parenteral oder über transmembranale Penetration, den Magen-Darm-Trakt, das Atmungssystem oder das Urogenitalsystem verabreicht werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Behandlung einer viralen Infektion die Verabreichung einer Zusammensetzung umfassend n-Docosanol und entweder ACV, Ribavirin, Trifluridin oder Ara-A in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Die beigefügten Zeichnungen veranschaulichen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Grundlagen der Erfindung.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagram, welches die Hemmung der HSV-2-Plaquebildung in Vero-Zellen in vitro durch Suspensionen aus n-Docosanol (C22, ∎), n-Tetracosanol(Lignoceryl)-Alkohol (C24, o), n-Hexacosanol (C26, •) und n-Octacosanol (C28, Δ) mit den auf der X-Achse gezeigten Konzentrationen zeigt (die Daten sind der Prozentsatz von Plaques beobachtet im Vergleich zu Kontrollkulturen, die Suspensionen eines oberflächenaktiven Stoffes, denen der langkettige Alkohol fehlt, ausgesetzt wurden)
  • 2A ist ein Diagramm, welches zeigt, dass das Erhöhen des Verhältnisses von oberflächenaktivem Stoff zu n-Docosanol die virale Plaqueerzeugung verringert, wenn Vero-Zellen vor der Zugabe des HSV-2-Virus für 12 Stunden mit der Suspension inkubiert werden; die Verhältnisse oberflächenaktiver Stoff:n-Docosanol waren 1:1 (∎), 3:1 (Δ), 5:1 (♦) und 10:1 (o).
  • 2B zeigt die entsprechenden Kontrollen wie in 2A unter Verwendung der gleichen Konzentration von oberflächenaktivem Stoff in der Suspension wie für jedes in 2A gezeigte Verhältnis oberflächenaktiver Stoff:Alkohol, jedoch ohne n-Docosanol (unter Verwendung der gleichen Symbole wie in 2A).
  • 3 ist ein Diagram, welches zeigt, dass oberflächenaktive Octoxynol-Suspensionen von n-Docosanol (∎) die HSV-2-Plaquebildung in Vero-Zellen, die für 48 Stunden mit der Suspension und HSV-2 inkubiert wurden, hemmen, mit ansteigender Hemmung korreliert mit ansteigender Konzentration des n-Docosanol, wohingegen Kontrollkulturen, die mit HSV-2 und oberflächenaktivem Octoxynol (o) inkubiert wurden, keine Hemmung zeigten (d. h. äquivalent zu unbehandelten Kontrollen mit etwa 50 Plaques/Well); die Balken über und unter den Datenpunkten zeigen die Standardabweichung für Doppelproben.
  • 4 ist ein Diagram, welches zeigt, dass Suspensionen aus oberflächenaktivem Stoff/n-Docosanol (∎) und oberflächenaktivem Stoff/n-Docosan
    Figure 00090001
    die HSV-2-Virusplaquebildung in kultivierten Vero-Zellen, die für 12 Stunden vor der Zugabe des HSV-2 mit den Verbindungen inkubiert wurden, hemmen.
  • 5 ist ein Diagram, welches zeigt, dass Suspensionen aus Stearylalkohol (C18, ♦) und Arachidylalkohol (C20, Δ) für kultivierte B-Zell-Tumorzellen, die für 48 Stunden mit den Suspensionen mit den auf den X-Achsen angegeben Konzentrationen inkubiert wurden, im Vergleich zu Kontrollen, die mit Suspensionen aus oberflächenaktivem Stoff ohne Alkohol (o) inkubiert wurden, toxisch sind, was durch die 3H-Thymidin-Inkorporation in die DNA bestimmt wurde (die Daten sind der Prozentsatz der Kontrollen inkubiert nur mit Medium).
  • 6A und 6B zeigen in Diagramform die zellulären antiproliferativen Wirkungen von Suspensionen aus oberflächenaktivem Stoff/n-Docosanol (∎) auf Vorhautfibroblasten verglichen mit Zellen, die mit Suspensionen aus oberflächenaktivem Stoff/n-Docosan (Δ) inkubiert wurden, oder mit Kontrollen, die mit einer oberflächenaktiven Suspension ohne aktiven Inhaltsstoff inkubiert wurden (o), und zwar mit den auf den X-Achsen gezeigten Konzentrationen (Durchschnitte von Doppelassays quantifiziert nach 96 Stunden Inkubation der Zellen inokuliert mit 1.000 Zellen/Well (6A) oder 30.000 Zellen/Well (6B) in 96-Well-Platten).
  • 7 ist ein Diagramm, welches die Zeitabhängigkeit der zellulären antiproliferativen Wirkungen der Suspension aus oberflächenaktivem Stoff und n-Docosanol nach 72 h (∎) und 96 h (o) Inkubation unter Verwendung der wie für 6A beschriebenen Verfahren zeigt.
  • 8 zeigt die Hemmung der HSV-2-Hauterkrankung an haarlosen Meerschweinchen unter Verwendung einer Kombinationscremeformulierung aus n-Docosanol und ACV. Die Daten sind durchschnittliche Ergebnisse aus zwei unabhängig durchgeführten Experimenten und wurden unter Verwendung des Studentschen zweiseitigen t-Tests analysiert.
  • 9 zeigt synergistische Anti-HSV-Aktivität von n-Docosanol und ACV in Vero-Zellkulturen. Die Daten sind als Durchschnitte und Standardfehler von Plaques beobachtet in dreifachen Wells/Bestimmung ausgedrückt.
  • 10 zeigt die synergistische Hemmung der HSV-1-Produktion in Vero-Zellkulturen durch n-Docosanol und ACV. Die Daten sind als durchschnittliche PFU beobachtet in dreifachen Anfangszellkulturen ausgedrückt; Standardfehler überschritten 15% des entsprechenden Durchschnitts nicht (nicht gezeigt).
  • 11 zeigt die synergistische Hemmung der HSV-1-Replikation in vitro durch n-Docosanol und Nukleosidanaloga außer ACV. Die Daten sind als der EC90 für die Hemmung der HSV-1-Produktion abgeleitet von den durchschnittlichen PFU, die in dreifachen Anfangszellkulturen/Bestimmung beobachtet wurden, ausgedrückt.
  • 12 zeigt zusätzliche antivirale Aktivität von n-Docosanol und PFA gegen die HSV-1-Replikation und keine Interaktion gegen das Vakziniavirus. Die Daten sind als durchschnittliche PFU in vierfachen Kulturen ausgedrückt.
  • 13 zeigt die Verbesserung der antiviralen Aktivität von Nukleosidanaloga auf die Vakziniavirusreplikation durch n-Docosanol. Die Daten sind als der EC50 (Tafel A) oder EC90 (Tafel B) für die Hemmung der HSV-1-Produktion abgeleitet aus den durchschnittlichen PFU, die in dreifachen Anfangszellkulturen beobachtet wurden, ausgedrückt.
  • Verfahren der Synthese von n-Docosanol sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (siehe z. B. US-Patentschrift Nr. 4,186,211 ).
  • Das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon in der antiviralen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann aus der Gruppe bestehend aus ACV, Adefovir, Azidothymidin, Brivudin, Cidofovir, ddC, ddI, Famciclovir, Ganciclovir, Idoxuridin, Lamivudin, Lobucavir, Penciclovir, Ribavirin, Rifampin, Sorivudin, Trifluridin, Valaciclovir und Ara A ausgewählt sein. Das Nukleosidanalogon liegt mit einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,1% bis etwa 10% vor. Am bevorzugtesten wird ACV, PFA, Ribavirin, Trifluridin oder Ara-A mit einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1% bis etwa 10% verwendet.
  • Verfahren der Synthese von Nukleosidanaloga und Nukleotidanaloga gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der Technik gut bekannt. Acyclovirsynthesen sind in US-Patentschrift Nr. 4,199,574 von Schaeffer, US-Patentschrift Nr. 5,567,816 von Schloemer und US-Patentschrift Nr. 5,756,737 von Turchetta offenbart und dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
  • Vorzugsweise ist der oberflächenaktive Stoff ein Blockcopolymer aus Propylenoxid und Ethylenoxid (Poloxamer 188) mit einem Molekulargewicht zwischen 6.000 und 12.000, bevorzugter etwa 8.400 (z. B. PLURONIC F-68®). Weitere bevorzugte oberflächenaktive Stoffe sind Octoxynol-9 und/oder Octoxynol-10 (z. B. TRITON X-100®). Die aktiven Inhaltsstoffe (langkettige aliphatische Verbindung und Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon) umfassen vorzugsweise etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% der endgültigen Zusammensetzung, bevorzugter 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%. Die optimale antivirale Aktivität der aktiven Inhaltsstoffe ist abhängig vom Verhältnis des oberflächenaktiven Stoffes zu den aktiven Inhaltsstoffen, welches vorzugsweise zwischen 1:1 (Gew./Gew.) und 10:1 (Gew./Gew.) liegt und bevorzugter 5:1 (Gew./Gew.) ist.
  • Die aktiven Mittel und optionalen oberflächenaktiven Stoffe werden mit einem Träger kombiniert, der physiologisch kompatibel mit dem Haut- und Membrangewebe eines Menschen oder Tieres ist, an den/das er verabreicht wird. D. h. der Träger ist im Wesentlichen inaktiv, außer der Eigenschaften als oberflächenaktiver Stoff, die bei der Herstellung einer Suspension der aktiven Inhaltsstoffe verwendet werden. Die Zusammensetzungen können weitere physiologisch aktive Bestandteile enthalten, welche die Effizienz des n-Docosanol, der Nukleosidanaloga oder Nukleotidanaloga nicht beeinträchtigen.
  • Eine exemplarische Zusammensetzung ist in US-Patentschrift Nr. 3,592,930 offenbart.
  • Zu geeigneten Trägern zählen wässrige und ölige Träger, wie zum Beispiel weißes Petrolatum, Isopropylmyristat, Lanolin oder Lanolinalkohole, Mineralöl, Sorbitanmonooleat, Propylenglycol, Cetylstearylalkohol (zusammen oder in verschiedenen Kombinationen), mit einem Detergens (z. B. Polyoxylstearat oder Natriumlaurylsulfat) und gemischt mit Wasser zum Bilden einer Lotion, eines Gels, einer Creme oder einer halbfesten Zusammensetzung. Weitere geeignete Träger umfassen Mischungen aus Emulgatoren und Weichmachern mit Lösemitteln wie Saccharosestearat, Saccharosecocoat, Saccharosedistearat, Mineralöl, Propylenglycol, 2-Ethyl-1,3-hexandiol, Polyoxypropylen-15-stearylether und Wasser. Konservierungsstoffe können auch in dem Träger enthalten sein, einschließlich Methylparaben, Propylparaben, Benzylalkohol und Ethylendiamin-Tetraacetat-Salze. Verdünnte Suspensionen ohne Verdickungsmittel sind am besten geeignet für die Bereitstellung an Hautoberflächen als Aerosolsprays unter Verwendung gut bekannter Bereitstellungsverfahren. Die Zusammensetzung kann auch einen Weichmacher wie Glycerin oder Polyethylenglycol (Molekulargewicht 800 bis 20.000) und Penetrationsenhancer wie Azon enthalten. Die Zusammensetzung des Trägers kann variiert werden, solange dies die pharmakologische Aktivität der aktiven Inhaltsstoffe nicht beeinträchtigt.
  • Die Zusammensetzungen können auch antimikrobielle Mittel, andere antivirale Mittel, antifungale Mittel, Antioxidanzien, Puffermittel, Sonnenschutzmittel und kosmetische Mittel wie Farbstoffe, Duftstoffe, Gleitmittel und Befeuchtungsmittel oder Trockenmittel enthalten. Zu antimikrobiellen Mitteln von Nutzen für den Einschluss in die Zusammensetzungen zählen Polymyxin B und Tetracyclin. Andere antivirale Mittel, die in die Formulierungen eingefügt werden, können Zytokine sein. Antifungale Mittel, die enthalten sein können, sind Micatin oder Tolnaftat. Es können Antioxidanzien wie Vitamin E enthalten sein. Es können Sonnenschutzmittel wie Paraaminobenzoesäure enthalten sein. Trockenmittel, die enthalten sein können, sind gut bekannt, wie zum Beispiel Phenol und Benzylalkohol. Gleitmittel wie synthetisches oder natürliches Bienenwachs können auch enthalten sein. Zu Verdickungsmitteln, die zu den Zusammensetzungen zugegeben werden, können Pullulin, Xanthan, Polyvinylpyrrolidon oder Carboxymethylcellulose gehören.
  • Optimalerweise verringern die Zusammensetzungen wirksam den Gesamtvirustiter im behandelten Individuum, insbesondere bei systemischer Behandlung, und bei Läsionen, insbesondere bei topischer Behandlung der betroffenen Bereiche der Haut oder Schleimhaut. Die offenbarten Behandlungsverfahren verringern auch die Symptome der viralen Infektion (z. B. Schmerz in Verbindung mit virusverursachten Läsionen) und fördern eine schnellere Heilung als dies ohne Behandlung der Fall ist.
  • Die Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfasst die Verabreichung einer Zusammensetzung, welche aktive Inhaltsstoffe und optional einen oberflächenaktiven Stoff enthält, an einen Menschen oder ein Tier zum Behandeln oder Verhindern einer viralen Infektion. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf die Haut oder eine Schleimhaut mittels einer Creme, einer Lotion, eines Gels, einer Salbe, einer Suspension, eines Aerosolsprays oder einer halbfesten Formulierung (z. B. ein Suppositorium), welche alle unter Verwendung von Verfahren formuliert werden, die in der Technik gut bekannt sind. Jedoch gelten die parenterale und die transmembranale Penetration auch als in Übereinstimmung mit einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Wo topische oder transmembranale Penetration als ein Verabreichungsweg eingesetzt wird, kann die Zusammensetzung optional einen Penetrationsenhancer enthalten, der in der Technik gut bekannt ist, wie Azon und Dimethylsulfoxid. Die Anwendungen bestehen aus einer bis zehn Anwendungen von 10 mg bis 10 g pro Anwendung für einen bis vierzehn Tage. Die Anwendungen erfolgen im Allgemeinen einmal alle zwölf Stunden und bis zu einmal alle vier Stunden. Am bevorzugtesten sind zwei bis fünf Anwendungen der Zusammensetzung pro Tag von etwa 0,1 g bis 5 g pro Anwendung für einen bis sieben Tage ausreichend, um eine virale Infektion zu verhindern oder zu behandeln. Bei topischer Anwendung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise täglich auf die Läsionen aufgetragen, sobald Symptome (z. B. Schmerz, Schwellung oder Entzündung) festgestellt werden.
  • Die Zusammensetzungen und Behandlungen sind geeignet zur Verhinderung oder Behandlung einer Vielzahl viraler Infektionen, wie die verursacht durch Herpesviren, einschließlich HSV-1, HSV-2 und HSV-6, CMV, EBV und VZV, durch Influenzaviren, humane lymphotrope Viren (z. B. HTLV-1), humane Immundefizienzviren (z. B. HIV-1), das Papillomavirus und das Respiratory-Syncytial-Virus. Aufgrund der zytostatischen Aktivität einiger der Zusammensetzungen und der potentiellen Interaktionen mit Nukleosidanalogon-Antikrebsarzneimitteln können die Zusammensetzungen und Verfahren auch für die Hemmung von malignem Zellwachstum und/oder Metastasen von Nutzen sein. Diese zelluläre Hemmungs- und Kombinationschemotherapie kann mit gut bekannten Behandlungen für Krebs kombiniert werden (z. B. Bestrahlung und/oder chirurgische Eingriffe), um eine komplette oder teilweise Remission eines Tumors oder anderen kanzerösen Zellwachstums zu bewirken.
  • Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe die gleiche Bedeutung wie allgemein durch den Fachmann auf dem entsprechenden Gebiet verstanden wird. Wenn nicht anders angegeben, sind die hierin eingesetzten oder betrachteten Techniken Standardmethoden, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Die Beispiele der Ausführungsformen dienen lediglich der Veranschaulichung.
  • ARBEITSBEISPIELE
  • Quelle der Chemikalien und Reagenzien
  • n-Docosanol (> 98% rein, Molekulargewicht 326) wurde von M. Michel and Company, Inc., New York, NY erworben. Benzylalkohol, Mine ralöl, Propylenglycol, Stearinsäure und Saccharosestearat wurden von Croda Inc., New York, NY erhalten. Acyclovir-Pulver wurde von Burroughs Wellcome Co., Research Triangle Park, NC erhalten. Adenin-9-β-D-arabinofuranosid, Ribavirin, Rifampicin und Trifluridin-Deoxyribosid wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erworben. PLURONIC F-68® (Poloxamer 188) wurde von BASF, Parisappany, NJ erworben.
  • Quelle der Tiere, Viren und Zelllinien
  • Der Stamm MacIn--tyre von HSV-1 (#VR-539), der Stamm MS von HSV-2 (#VR-540), der Stamm Ellen des Varizellen-Zoster-Virus (VZV, #VR-1367), der Stamm Towne des Zytomegalovirus (CMV, #VR-977) und der Stamm WR des Vakzinia-Virus (#VR-119) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD erhalten. Vorräte des HSV und Vakziniavirus wurden in Vero-Zellen-Kulturen (African Green Monkey-Niere, ATCC #CCL-81) hergestellt, während Vorräte von VZV und CMV in der menschlichen Embryonallungenzelllinie MRC-5 (ATCC #CCL-171) erzeugt wurden. Die Levels von Plaque-bildenden Einheiten (PFU – plaque forming units) für diese Viren wurden in der Zelllinie des Ursprungs bestimmt und die Vorräte wurden bei –85°C gelagert.
  • Verfahren der Herstellung der antiviralen Zusammensetzung
  • Falls nicht anders angegeben, wurde die topische Cremeemulsion von n-Docosanol, die in den Arbeitsbeispielen verwendet wurde, mit (auf einer Gew.-%-Basis) 10% n-Docosanol, 5% Saccharosestearat, 8% Mineralöl, 5% Propylenglycol USP, 2,7% Benzylalkohol und dem Rest Wasser hergestellt (Katz et al., in Slow Infections of the Central Nervous System. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724: 472-488, 1994). Das Kontrollvehikel für die Creme enthielt 10% Stearinsäure, so dass insgesamt 10% aliphatischer Kohlenwasserstoff vorlagen. Die Bestandteile wurden auf 80°C erhitzt und während des Abkühlens auf Raumtemperatur gemischt. Die Mischung gerinnt normalerweise, wenn die Temperatur auf 30°C abgefallen ist. An jedem Behandlungstag wurden 0,3 ml frisch rekonstituiertes ACV (mit Wasser) mit 2,7 ml n-Docosanol-haltiger Creme gemischt, was in einem 5%igen ACV- und einem 9%igen n-Docosanol-Präparat resultierte; die entsprechenden Kontrollcremes wurden mit 0,3 ml Wasser gemischt. Die Mischungen wurden für 5 Minuten in einer SPEX-Phiole (SPEX Industries, Inc., Metuchen, NJ) unter Verwendung des SPEC-Mixers gemischt. n-Docosanol wurde auch wie beschrieben in PLURONIC F-68® (Poloxamer 188; Molekulargewicht 8400) suspendiert (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825-10829, 1991; Pope et al., J. Lipid Res. 37: 2167-2178, 1996). PLURONIC F-68® wurde bei 37°C in steriler Salzlösung auf 12 mM verdünnt und dann auf 50°C erhitzt. n-Docosanol wurde zu der PLURONIC F-68®-Lösung auf 90 mM zugegeben und die Mischung wurde mit einem Branson 450-Sonifier (Branson Ultrasonics, Danbury, CO) für 21 Min. mit einer Leistung von 65 W beschallt; dies erwärmt die Mischung auf 86°C. Die entstehende Suspension besteht aus sehr feinen kugelförmigen Partikeln mit einer Durchschnittsgröße von 0,1-0,5 Mikronen, wie durch Transmissions-Elektronenmikroskopie gemessen (Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10825-10829, 1991). Das Kontrollvehikel für diese Suspension enthielt nur PLURONIC F-68® in Salzlösung.
  • Verfahren zur Optimierung der antiviralen Aktivität
  • Die antivirale Aktivität pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche eine langkettige aliphatische Verbindung und ein Nukleosidanalogon umfassen, wurde unter Verwendung von vier unterschiedlichen Assays, einschließlich (1) HSV-Infektion von Meerschweinhaut, (2) HSV-Plaquebildung, (3) Zahlen von Herpesvirus-infizierten Zellen und (4) Hemmung der Virusnachkommenproduktion, optimiert.
  • Ein in vivo Assaysystem verwendete haarlose Meerschweinchen (250–400 gm), die von den Charles River Laboratories, Wilmington, MA erhalten wurden. Ihre Rücken wurden mit Ethanol und steriler Salzlösung gereinigt und sie wurden unter Vollnarkose mittels Ketamin (Parke-Davis, Morris Plains, NJ) und Nembutal (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) mit HSV-2 inokuliert. Salzlösung (75 μl), welche 5 × 105 PFU von HSV-2 enthielt, wurde auf 4 cm × 4 cm Stellen auf den Rücken der Meerschweinchen aufgetragen, gefolgt von Inokulation mit einem Tätowierinstrument. Dies ist ein allgemein akzeptiertes Experimentverfahren für die Bewertung topischer Therapien bei der Behandlung der HSV-mediierten Hauterkrankung (Spruance et al., Antiviral Res. 9: 295-313, 1988). Jedes Tier wies 6 Inokulationsstellen auf. Die Behandlung mit 200 μl Creme erfolgte durch Auftragen mit einem Glasröhrchen mit sanftem kreisförmigem Reiben 2 Mal/Tag. Die Stellen wurden nach der Anzahl der vesikulären Läsionen zu den angegebenen Zeitpunkten bewertet.
  • Das in vitro Plaquebildungsassay für HSV erfolgte unter Verwendung von Vero-Zellen, die mit 1,5 × 105/ml in 16-mm-Wells (1 ml) oder in 35-mm-Wells (2 ml) in DMEM ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 4 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 mg/ml Streptomycin und 10 mM HEPES-Puffer plattiert wurden. Variierende Konzentrationen der n-Docosanol-Suspension oder des entsprechenden Kontrollvehikels (dem das n-Docosanol fehlt) wurden zu Beginn der Kultur zugegeben. Nach 24 Stunden Inkubation wurde das antivirale Testarzneimittel (z. B. ACV) zugegeben und dann wurden alle Kulturen mit den erforderlichen PFU des HSV inokuliert. Die Kulturen wurden für weitere 44 Stunden inkubiert (10% CO2 in Luft; befeuchtet), eingefärbt (die Einfärbung/Fixierung besteht aus 1,25 mg/ml Carbol-Fuchsin plus 2,5 mg/ml Methylenblau in Methanol) und die HSV-induzierten Plaques wurden unter Verwendung eines Präpariermikroskops (10-Fache Vergrößerung) ausgezählt.
  • Die in vitro Virusproduktionsassays für HSV und das Vakziniavirus wurden wie für die HSV-Plaquebildung beschrieben in Vero-Zellen in 16-mm-Wells initiiert, jedoch wurden die Platten insgesamt 3 Tage nach der Inokulation mit 500 PFU/Well des Virus wie angegeben inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturüberstandsfluide entnommen und in frische Vero-Zellkulturen (1 × 105/ml, 0,1 ml/Well einer 96-Well-Platte) verdünnt, um den PFU-Gehalt zu untersuchen. Diese sekundären Platten wurden 72 Stunden vor der Fixierung, Einfärbung und Auszählung der HSV-Zytopathologie inkubiert.
  • Die Assays der CMV- und VZV-Infektion wurden mit MRC-5-Zellen wie oben für die HSV-PFU-Produktion beschrieben in 16-mm-Wells initiiert. Zwei Tage nach der Infektion wurde das Kulturmedium durch frisches Medium ohne den Inhibitor ersetzt. Nach weiteren 2 Tagen Inkubation wurden die Zellen durch Trypsinisierung entnommen und in einem Infectious-Center-Assay unter Verwendung von MRC-5-Zellen auf infizierte Zellen untersucht. Die trypsinisierten Zellen wurden kurz in MRC-5-Zellkulturen in 24-Well-Platten verdünnt. Nach 6 Tagen Inkubation wurden die sekundären Kulturen eingefärbt und für die VZV- und CMV-Zytopathologie ausgezählt.
  • BEISPIEL 1
  • Antivirale Aktivität von n-Docosanol
  • n-Docosanol wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens in dem oberflächenaktiven Stoff PLURONIC F-68® suspendiert. Der oberflächenaktive Stoff wurde in 37°C warmem hochglucosehaltigem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD.) auf 10 mg/ml verdünnt und die Lösung wurde auf 50°C erhitzt. n-Docosanol wurde auf eine abschließende Konzentration von 30 mM zu der oberflächenaktiven Lösung zugegeben und die Mischung wurde für 21 Min. mit einer Anfangsleistung von 65 W mit einem Sonifier (Branson 450) beschallt, wodurch die Suspension auf 88°C erhitzt wurde. Die entstehende Suspension enthält kugelförmige Partikel mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 0,3 μ, wie durch Transmissions-Elektronenmikroskopie bestimmt. Kontrolllösungen mit PLURONIC F-68® ohne zugegebenes n-Docosanol und Suspensionen mit unterschiedlichen Konzentrationen des oberflächenaktiven Stoffes und/oder n-Docosanol wurden im Wesentlichen mittels des gleichen Verfahrens hergestellt.
  • Der Stamm MS des Herpes-simplex-Virus 2 (HSV-2; von der American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC Nr. VR-540) wurde verwendet, um African Green Monkey-Nierenzellen (Vero-Zellen; ATCC Nr. CCL 81) zu infizieren, um die Wirkungen von n-Docosanol-Suspensionen auf die Wirksamkeit der Plaquebildung zu bestimmen. Vero-Zellen wurden mittels 6 × 105 Zellen in 1,8 ml Medium pro 35-mm-Well oder 3 × 105 Zellen in 0,8 ml Medium pro 16-mm-Well in DMEM ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum, Natriumpyruvat, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und 1 mM Hepes-Puffer bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 10% CO2 kultiviert. Oberflächenaktive Kontrollsuspensionen oder Suspensionen mit aliphatischen Alkoholen wurden zu Beginn der Kultur zugegeben. Nach 24 h wurde unter Verwendung von 175 PFU/35-mm-Well und/oder 50 PFU/16-mm-Well HSV-2-Virus zu den Kulturen zugegeben.
  • Etwa 42 h nach der Zugabe des HSV-2 wurden die Kulturen einmal mit einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden fixiert und mit Methanol mit Carbol-Fuchsin (1,25 mg/ml) und Methylenblau (2,5 mg/ml) eingefärbt und die Plaques ausgezählt. Die dargestellten Daten sind der Durchschnitt doppelter Kulturen, welcher im Allgemeinen um weniger als 10% variierte, und es wurden statistische Vergleiche mittels des Studentschen T-Tests angestellt.
  • Typische Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die wirksamen Konzentrationen (mM), die für eine 50%ige Hemmung (EC50) der Plaqueproduktion erforderlich sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt. TABELLE 1
    Alkoholsuspensionshemmung der HSV-2-Plaquebildung
    Länge Molekulargewicht Konzentration (mM) für 50% Hemmung*
    n-Docosanol 326,6 8,6
    • * Die prozentuale Hemmung der Plaquebildung durch HSV-2 zugegeben zu Vero-Zellen nach 12 h Inkubation der Zellen mit dem angegebenen Alkohol wurde als eine Funktion der Alkoholkonzentration eingezeichnet und die erforderliche Menge für eine 50%ige Hemmung wurde durch lineare Regression bestimmt.
  • Es wurde virushemmende Aktivität beobachtet. Kontrollsuspensionen des oberflächenaktiven Stoffes ohne n-Docosanol waren nicht zytotoxisch und zeigten keine antivirale Aktivität.
  • BEISPIEL 2
  • Wirkungen der Erhöhung des Verhältnisses des oberflächenaktiven Stoffes zum aliphatischen Alkohol
  • Die antivirale Wirkung der Erhöhung des Verhältnisses (Gew./Gew.) des oberflächenaktiven Stoffes zu n-Docosanol wurde unter Verwendung ansteigender Verhältnisse von PLURONIC F-68® zu n-Docosanol demonstriert (vergleiche mit Beispiel 1 unter Verwendung eines Verhältnisses von 1:1 (Gew./Gew.) des oberflächenaktiven Stoffes zu n-Docosanol). Die 1:1 Suspension weist ein Molekularverhältnis von 26:1 für n-Docosanol (Molekulargewicht 326,57) zu Molekülen des oberflächenaktiven Stoffes (Molekulargewicht 8.400) auf. Im Allgemeinen verringert die Erhöhung der Menge des oberflächenaktiven Stoffes die Partikelgröße in der Suspension und verursacht die Bildung kleinerer unilamellarer, anstatt multilamellarer, Vesikel (Sandra et al., J. Biol. Chem. 254: 2244-2249, 1979). Dies führt dazu, dass mehr von dem n-Docosanol an der Partikeloberfläche auftritt, wo es für die Interaktion mit Zellen zur Verfügung steht.
  • Suspensionen von n-Docosanol wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung einer konstanten Menge des Alkohols, jedoch unter Erhöhung der Menge des oberflächenaktiven Stoffes zum Erreichen eines 3:1, 5:1 und 10:1 (Gew./Gew.) Verhältnisses von PLURONIC F-68® zu n-Docosanol in der abschließenden Suspension hergestellt. Die Erhöhung des Verhältnisses von oberflächenaktivem Stoff zu Alkohol erhöhte die antivirale Wirksamkeit der Suspension in der Vero-Zellkultur (2). D. h. die Suspension mit einem 3:1 Verhältnis von oberflächenaktivem Stoff zu Alkohol zeigte eine höhere antivirale Aktivität als das 1:1 Verhältnis (mit n-Docosanol > 8 ml); die Suspension mit einem 5:1 Verhältnis zeigte erhöhte antivirale Aktivität im Vergleich zum 1:1 Verhältnis (mit n-Docosanol ≥ 4 ml); und das 10:1 Verhältnis zeigte mehr antivirale Aktivität im Vergleich zum 1:1 Verhältnis (mit n-Docosanol ≥ 1 ml). Die antivirale Aktivität war abhängig vom n-Docosanol in der Suspension, weil Kontrollkulturen, die mit der gleichen Konzentration des oberflächenaktiven Stoffes in der Suspension wie für jedes der oben getesteten Verhältnisse inkubiert wurden, im Wesentlichen keine antivirale Aktivität zeigten (2B).
  • Das erhöhte Verhältnis von oberflächenaktivem Stoff zu n-Docosanol korrelierte auch mit einer Erhöhung der Menge von Zell-assoziiertem n-Docosanol, wie unter Verwendung von Vero-Zellen, die für 24 Stunden mit Suspensionen aus oberflächenaktivem Stoff und n-[1-14C]Docosanol inkubiert wurden, bestimmt. Zellen, die mit Suspensionen inkubiert wurden, welche ein 4:1 Verhältnis von oberflächenaktivem Stoff zu n-Docosanol enthielten, banden mit 7,8 × 10–6 μg/Zelle, wohingegen eine äquivalente Kultur, die mit einer Suspension mit einem 1:1 Verhältnis inkubiert wurde, mit 3,1 × 10–6 μg/Zelle band. Eine optimale antivirale Aktivität des n-Docosanol erhielt man mit Verhältnissen von oberflächenaktivem Stoff zu Alkohol von etwa 4:1 bis 5:1 (Gew./Gew.).
  • Die antivirale Aktivität von n-Docosanol war keine Eigenschaft einer einmaligen Kombination des n-Docosanol und eines bestimmten nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes in der Suspension. D. h. auch andere Detergenzien erzeugten wirksame antivirale Suspensionen des n-Docosanol. Suspensionen von n-Docosanol mit einem nichtionischen Octoxynol-Detergens (TRITON X-100®, Rohm&Haas) wurden wie Folgt hergestellt: a) Schmelzen von 2,5 g n-Docosanol mit 1,5 g Detergens bei 90°C, b) Mischen der geschmolzenen Lösung mit 500 ml Salzlösung bei 90°C und 1,15 g Polyvinylpyrrolidon (PVP), c) Verarbeiten der heißen Mischung durch einen Mikrofluidizer bei 1300 psi für 5 Zyklen und d) Ultrafiltrieren der verarbeiteten Mischung durch eine Hohlfaserpatrone zum Eliminieren von überschüssigem Detergens und PVP. Eine Kontroll-Detergenssuspension wurde auf ähnliche Art und Weise hergestellt, außer dass das n-Docosanol weggelassen wurde. Deoxycholat-Suspensionen des n-Docosanol (Verhältnis von oberflächenaktivem Stoff zu Alkohol von 1:1 nach dem Gewicht) wurden im Wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt.
  • Sowohl die Octoxynol- als auch die Deoxycholat-Suspension des n-Docosanol hemmte die HSV-2-Plaquebildung im Vero-Zell-Assay. Typische Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Die Octoxynol/n-Docosanol-Suspension hemmte die Plaquebildung relativ zur Octoxynol-Kontrolle mit n-Docosanol-Konzentrationen von mehr als oder gleich 2 mM mit einem EC50 von etwa 4,5 mM. Der nichtionische oberflächenaktive Stoff, der zur Herstellung einer aliphatischen Alkoholsuspension verwendet wurde, ist nicht verantwortlich für die antivirale Aktivität der Suspension.
  • Die Erhöhung des Verhältnisses von oberflächenaktivem Stoff zu n-Docosanol erhöhte die antivirale Aktivität der Suspension erheblich. D. h. die Menge von n-Docosanol in der Suspension, die für eine 50%ige Hemmung der Plaquebildung erforderlich ist, verringerte sich (z. B. von 15 mM auf 3 mM).
  • BEISPIEL 3
  • Oxidation der 1-Hydroxyl-Komponente des n-Docosanol resultiert in Zytotoxizität
  • Eine Suspension aus nichtionischem oberflächenaktivem Detergens und n-Docosansäure (Sigma Chemical Co.) wurde hergestellt und auf antivirale Aktivität getestet, und zwar unter Verwendung von Vero-Zellen und HSV-2, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Die C22-Fettsäure war für Vero-Zellen toxisch, wenn sie mit Konzentrationen gleich denen verwendet wurde, mit denen virale Hemmung mit n-Docosanol stattfindet (siehe Tabelle 2). Wenn Suspensionen aus n-Docosansäure mit 4 mM bis 15 mM zu den Kulturen zugegeben wurden, wurden die Zellen gerundet und trennten sich von der Platte ab. Mit tolerierbaren Konzentrationen der n-Docosan säure (≤ 2 mM) war die antivirale Aktivität etwa gleich der, die mit n-Docosanol-Suspensionen mit den gleichen Konzentrationen beobachtet wurden, jedoch erheblich geringer als die, die mit 4 bis 15 mM n-Docosanolsuspensionen beobachtet wurde. Somit zeigt die C22-Fettsäure einige antivirale Aktivität mit Verdünnungen, die für Zellen tolerierbar sind, jedoch weist sie im Vergleich zum entsprechenden aliphatischen Alkohol eine erhöhte Zytotoxizität auf. TABELLE 2 Prozentuale Hemmung der Plaquebildung**
    Kegel* Docosanol
    15 66
    8 44
    4 36
    2 40
    1 14
    0,5 NDP‡
    0,25 ND
    • * Die mM-Konzentrationen von n-Docosanol (Molekulargewicht 326,6) in Suspension mit PLURONIC F-68® (Molekulargewicht 8.400) in der Vero-Zellkultur 12 h vor der Zugabe des HSV-2-Virus.
    • † „Toxisch" bedeutet, dass die Zellmonoschicht innerhalb von 24 h nach der Zugabe der Suspension mit den Konzentrationen von Alkohol oder Säure, die in der ersten Spalte gezeigt sind, zerstört wurde.
    • ‡ „ND" bedeutet nicht bestimmt.
    • ** Die Hemmung war relativ zu einer Kontrollinfektion von Vero-Zellen, zu welchen keine Suspension zugegeben wurde. Eine weitere Kontrolle war eine Suspension aus oberflächenaktivem Stoff, zu welcher kein aktiver Inhaltsstoff zugegeben wurde, die, wenn sie zu infizierten Vero-Zellen zugegeben wurde, eine 55%ige Hemmung relativ zur viralen Infektion von Vero-Zellen ohne hinzugefügte Suspension zeigte.
  • BEISPIEL 4
  • Zytotoxizität in Säugetierzellkulturen
  • n-Docosanol zeigt minimale Zytotoxizität für kultivierte Zellen, selbst bei längeren Inkubationen. Es wurden drei Assays verwendet, um die Wirkungen der aliphatischen Alkohole auf das Zellüberleben und die Proliferation zu quantifizieren: 1) Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer und Bestimmen der Anzahl der Zellen, welche Trypan-Blau ausschließen; 2) Messen der Inkorporation von 3H-Thymidin in zelluläre DNA durch Zugabe von 3H-Thymidin (von New England Nuclear) zum Kulturmedium, Lysieren der Zellen mit Wasser und Entnehmen der DNA auf Filterpaper und 3) Messen des gesamten Zellproteins unter Verwendung eines Sulforhodamin-Assays, welches für die Verwendung in 96-Well-Mikrotiterplatten geeignet ist (Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112, 1990). Alle diese Verfahren sind gut bekannte Zelllebensfähigkeits- und Zytotoxizitätsassays.
  • Zu den getesteten Zellen zählen Vero-Zellen (siehe Beispiel 1), WI-38-Zellen, eine humane embryonale diploide Lungenzelllinie (ATCC Nr. CCL 75), HFL1-Zellen, eine humane fötale diploide Lungenzelllinie (ATCC Nr. CCL 153) und humane fötale Vorhautzellen (ATCC Nr. 1635). Eine murine B-Zell-Hybridomlinie (bezeichnet mit MBI-9) wurde wie zuvor beschrieben erzeugt und kultiviert (Marcelletti et al., J. Immunol. 148: 3857-3863, 1992), obwohl auch andere Tumorlinien und Hybridome wie jede der ATCC TIB- oder HB-Zelllinien äquivalent verwendet werden könnten, um die Wirkungen aliphatischer Verbindungen in Suspension auf die Zellproliferation zu bestimmen. Alle Zellen wurden in DMEM ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, Natriumpyruvat, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind, kultiviert. Die Suspensionen der aliphatischen Alkohole wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Unter Verwendung des ersten Assays wurden Vero-Zellen bis zu 72 Stunden in Gegenwart von 9 mM n-Docosanol enthalten in Suspensionen von oberflächenaktivem Stoff kultiviert, ohne wahrnehmbare schädliche Wirkungen, wenn die Kulturen mit 6 × 105 Zellen in 1,8 ml Medium pro 35-mm-Well oder 3 × 105 Zellen in 0,8 ml Medium pro 16-mm-Well inokuliert wurden. Typische Daten sind in Tabelle 3 dargestellt, wo gezeigt wird, dass die Gesamtzahl lebensfähiger Vero-Zellen und Vorhautfibroblasten nach 24 h bis 72 h Inkubation mit der aliphatischen Alkoholsuspension unverändert war. Die anderen getesteten Zelllinien, einschließlich normaler Hautfibroblasten (ATCC CRL 1900), WI-38-Lungenzellen, humaner fötaler Lungenzellen und eines B-Zell-Hybridoms, zeigten eine ähnliche Zelllebensfähigkeit in Gegenwart von n-Docosanol-Suspensionen, wenn die Zellen mit relativ hohen Dichten inokuliert wurden. Kontrollsuspensionen von oberflächenaktivem Stoff ohne den aliphatischen Alkohol zeigten auch keine Zytotoxizität für die Vero-Zellen, zeigten jedoch eine zeitabhängige Zytotoxizität für die fötalen Vorhautzellen, welche mit der alkoholhaltigen Suspension nicht beobachtet wurden. Bei der fötalen Vorhautzelllinie verringerte die Zugabe des aliphatischen Alkohols anscheinend die zytotoxischen Wirkungen des oberflächenaktiven Stoffes. TABELLE 3 Zelllebensfähigkeit nach Aussetzung gegenüber Suspensionen von ober flächenaktivem Stoff mit oder ohne n-Docosanol
    Vero-Zellen Fötale Vorhautzellen
    Behandlung* Inkub. (h) Lebensf. Anz.** % Kontr.*** Lebensf. Anz.** % Kontr.***
    n-Docosanol + berfl.akt. St. 24 7,48 × 105 101 2,41 × 105 131
    n-Docosanol + berfl.akt. St. 48 8,69 × 105 137 2,78 × 105 118
    n-Docosanol + berfl.akt. St. 72 8,61 × 105 120 2,72 × 105 118
    Oberfl.akt. St. 24 7,1 × 105 95,7 1,55 × 105 84
    Oberfl.akt. St. 48 7,2 × 105 107 1,66 × 105 70
    Oberfl.akt. St. 72 6,6 × 105 89,0 1,0 × 105 43
    • * Vero- oder fötale Vorhautzellen wurden mit 9 mM n-Docosanol suspendiert in 1,4 mM oberflächenaktivem Stoff inkubiert, oder mit Medium, welches 1,4 mM oberflächenaktiven Stoff enthielt. Das Verhältnis von oberflächenaktivem Stoff zu n-Docosanol in der Suspension lag bei 4:1 (Gew./Gew.).
    • ** Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden die Zellen trypsinisiert und die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypan-Blau-Ausschluss bestimmt.
    • *** Kontrollproben wurden in Gegenwart von nur Medium inkubiert.
  • Obwohl die Zelllinien sogar nach 72 Stunden Inkubation mit n-Docosanol undurchlässig für Trypan-Blau blieben, zeigten normale Hautfibroblasten, Vorhautfibroblasten, WI-38-Zellen und humane fötale Lungenzellen eine erkennbare Veränderung in der Morphologie, wenn sie mittels Lichtmikroskopie untersucht wurden. Nach 72 h Inkubation mit den Alkoholsuspensionen erschienen zahlreiche lichtdurchlässige Bereiche im Zytoplasma der Zellen und die Zellen erschienen vakuolisiert. Zellen, die mit oberflächenaktiven Kontrollsuspensionen behandelt wurden, erschienen nach 72 h Inkubation nicht vakuolisiert.
  • Bei den n-Docosanol-Suspensionen wurde im Allgemeinen ein Fehlen von Zytotoxizität verzeichnet.
  • Die Lebensfähigkeit wurde in einer Vielzahl von Zelllinien entweder durch Messen der 3H-Thymidin-Inkorporation in DNA oder durch Messen des Gesamtzellproteins durch Einfärben mit Sulforhodamin B quantifiziert. Typische Ergebnisse sind in 5 veranschaulicht, welche die Hemmung der 3H-Thymidin-Inkorporation in DNA eines B-Zell-Hybridoms bei unterschiedlichen Konzentrationen des n-Docosanol zeigt. Der IC50 für n-Docosanol, geschätzt durch Extrapolation, beträgt etwa 20 mM und ist höher als der, der nur mit oberflächenaktivem Stoff beobachtet wurde.
  • Die in 5 gezeigten Daten wurden nach 48 h Inkubation mit den Suspensionen erhalten; jedoch zeigte sich offensichtliche Toxizität innerhalb von 24 Stunden der Inkubation.
  • Die Wirkungen der n-Docosanol-Suspensionen auf die Zellproliferation (Zytostase) wurden unter Verwendung des Sulforhodamin-Einfärbungs-Assays an Kulturen von humanen Vorhautfibroblasten inkubiert in 96-Well-Platten quantifiziert. Die in 6A und 6B gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass die inhibitorischen Wirkungen der n-Docosanol-Suspension von der anfänglichen Zelldichte der in vivo Kulturen abhingen. Die in 7 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass, abhängig vom Gesamtinkubationszeitraum, Zellen in Verbindung mit der n-Docosanol-Suspension eine größere Proliferationshemmung zeigten. D. h. eine längere Inkubation resultierte in mehr Hemmung der Zellproliferation.
  • Vorhautfibroblasten wurden mit oder ohne n-Docosanol-Suspensionen oder oberflächenaktive Kontrollsuspensionen mit 1.000 Zellen/Well (6A und 7) oder mit 30.000 Zellen/Well (6B) in 96-Well-Platten plattiert. Nach der Inkubation für 72 h oder 96 h bei 37°C wurde Zellen mit Trichloressigsäure präzipitiert, mit Sulforhodamin eingefärbt und durch Messen des OD540 in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät quantifiziert. 6 zeigt die Ergebnisse, die für Zellen erhalten wurden, die für 96 h inkubiert wurden, und 7 zeigt die Ergebnisse für Zellen, die nach 72 h im Vergleich zu 96 h (1000 Zellen/Well) erhalten wurden.
  • Suspensionen mit mehr als 3 mM n-Docosanol hemmten die Proliferation von Zellen, die mit 1.000 Zellen/Well plattiert waren, wie die Untersuchung nach 96 Stunden Inkubation ergab (6A). Bei höheren Anfangszelldichten (6B) oder kürzeren Inkubationszeiten (7) oder mit Konzentrationen von weniger als 3 mM hemmte n-Docosanol die Zellproliferation im Vergleich zu den Kontrollen (nur oberflächenaktiver Stoff in der Suspension) nicht. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn n-Docosanol mit WI-38-Zellen, humanen fötalen Lungenzellen und normalen Hautfibroblasten unter Verwendung des gleichen Proliferationsassays wie für 6 und 7 beschrieben inkubiert wurde.
  • Suspensionen, welche n-Docosanol enthielten, zeigten wenig Zelltoxizität.
  • BEISPIEL 5
  • Antivirale Aktivität von topisch angewandten Zusammensetzungen, welche n-Docosanol enthalten, in einem Tiermodell
  • Die Zusammensetzungen für die topische Behandlung waren: eine n-Docosanol-haltige Creme und ein Placebo. Die n-Docosanol-Creme enthielt 10 Gew.-% n-Docosanol (Michel and Co., New York, NY), 5 Gew.-% Saccharosestearat (Croda, Inc., New York, NY), 8 Gew.-% Mineralöl NF (Witco Corp., Newark, NJ), 5 Gew.-% Propylenglykol USP, 2,7 Gew.-% Benzylalkohol NF (Ruger Chemical Co., Irvington, NJ) und 69,3 Gew.-% aufgereinigtes Wasser USP. Die Creme wurde durch Kombination aller Inhaltsstoffe außer dem Wasser, Erhitzen auf 80°C und Rühren der Inhaltsstoffe bei 400 ± 5 U/min (unter Verwendung eines Heidolph RZR 2051 Rührers), zu dem das Wasser mit 85°C zugegeben wurde, während die Rührgeschwindigkeit auf 1900 ± 5 U/min erhöht wurde, hergestellt. Nach 3 Min. bei 80°C wurde die Mischung unter kontinuierlichem Rühren auf 30°C abkühlen lassen (etwa 8 Min.). Das Placebo wurde durch Erhitzen von 70% Polyethylenglycol (PEG) 400 NF und 30% PEG 3350 NF auf 65°C, bis das PEG 3350 komplett geschmolzen war, und anschließendes kontinuierliches Rühren der Mischung mit 400 U/min, bis die Mischung auf 30°C abgekühlt war, hergestellt.
  • Die Ergebnisse dieser Tests sind als Durchschnitte in Tabelle 4 zusammengefasst. Bestimmungen an Tag 2 erfolgten 48 h nach der Inokulation; an Tag 3 72 h nach der Inokulation und an Tag 4 96 h nach der Inokulation (insgesamt sechs Stellen pro Bestimmung). Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, beeinflusste die n-Docosanol-Creme an Tag 2 die Vesikelanzahl nicht signifikant relativ zur wasserbehandelten Kontrolle und alle Stellen zeigten keine Irritation. An Tag 3 zeigten die mit der n-Docosanol-Creme behandelten Stellen eine signifikante Hemmung der Anzahl der Vesikel relativ zur wasserbehandelten Kontrolle. Es scheint, dass drei Anwendungen pro Tag mit der n-Docosanol-haltigen Creme sättigend sind, weil fünf Anwendungen pro Tag im Wesentlichen zum gleichen Hemmungslevel führten. Die Anwendung des PEG-Placebos fünfmal am Tag verringerte die Vesikelzahlen relativ zu den wasserbehandelten Kontrollen zu keinem Zeitpunkt signifikant.
  • An Tag 3 wurde etwas Irritation mit dem n-Docosanol beobachtet. An Tag 4 verringerte die Behandlung dreimal täglich mit der n-Docosanol-Creme die Vesikelzahl relativ zu den Kontrollen signifikant, obwohl eine kleinere Irritation zu beobachten war. An Tag 4 verringerte die Behandlung fünfmal am Tag mit der n-Docosanol-Creme die Vesikelzahl relativ zu den Kontrollen und dem Placebo signifikant, obwohl ein leichtes Erythem zu beobachten war.
  • Diese in vivo Ergebnisse zeigen, dass die topische Behandlung der HSV-2-Infektion mit Cremes, welche n-Docosanol als aktiven Inhaltsstoff enthalten, die Vesikelzahl, die aus der Infektion resultiert, signifikant verringern kann. Die Creme, welche n-Docosanol als aktiven Inhaltsstoff enthält, scheint bei der Behandlung viraler Infektionen wirksamer zu sein, weil signifikante Verringerungen der Vesikelzahlen mit nur drei Behandlungen pro Tag zu sehen waren. TABELLE 4 Topische Behandlung von HSV-2 an einem Meerschweinchenmodell
    Behandlung Vesikelzahl Irritationsauszählung
    Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 2 Tag 3 Tag 4
    Wasser 45 34 19 0 0 0
    n-Docosanol (3×/Tag) 40 12 3 0 1,2 0,8
    n-Docosanol (5×/Tag) 43 5 3 0 1,3 1,3
    Placebo (5×/Tag) 41 30 15 0 0 0
  • BEISPIEL 6
  • Antivirale Aktivität von topisch angewandtem n-Docosanol in
  • humanklinischen Studien
  • Die antivirale Aktivität von Stearinsäure-haltigen Zusammensetzungen wurde in vivo in klinischen Studien der Behandlung von oralem Herpes bei 648 immunkompetenten Patienten bestätigt, die mit der Behandlung innerhalb von 12 h nach der Feststellung einer oralen Herpes-Episode begannen (d. h. beim anfänglichen Prodromgefühl, Erythem oder Knötchen, jedoch nicht bei einem Vesikel). Diese Patienten hatten eine Vorgeschichte von akutem Wiederauftreten von Herpes labialis mit einer verzeichneten Durchschnittsdauer unbehandelter Episoden von 8,9 Tagen (vom Beginn des Gefühls und/oder Erythems bis zur kompletten Heilung). Diese Dauer ist konsistent mit einem gewöhnlichen Verlauf von 8 bis 10 Tagen Dauer für orale Herpes-Episoden in veröffentlichten Berichten der Erkrankung (R. J. Whitley, in Fields Virology auf S. 2316).
  • In diesen Studien erhielten Patienten eine Creme, welche 10% n-Docosanol enthielt, im Wesentlichen hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Patienten trugen die Creme topisch fünf Mal am Tag für mindestens fünf Tage auf den lokalisierten, von Herpes betroffenen Bereich auf (25 geplante Auftragungen, mit erneuter Auftragung nach starker körperlicher Anstrengung, Duschen oder Baden, wobei diese erneuten Auftragungen nicht als geplante Auftragung zählten). Wenn sich die Herpes-Episode nach fünf Tagen fortsetzte, trugen die Patienten die Creme bis zu zehn Tagen weiter auf (50 geplante Auftragungen). Die Patienten führten ein Tagebuch der Auftragungszeiten, des Läsionsschmerzes und der Juckreizsymptome und wurden während des Behandlungszeitraums zweimal täglich untersucht, um die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten.
  • Die zur Bewertung der Behandlung verwendeten Kriterien umfassten die Zeit bis zur Heilung, welche einen Episodenabbruch beinhaltet (definiert als komplettes Verschwinden der mit der Episode in Verbindung stehenden Symptome vor dem Erreichen des Vesikelstadiums) oder die komplette Heilung (definiert als das Fehlen einer Kruste ohne Nachweis für eine aktive Läsion, egal ob es verbleibende Hautänderungen nach der Läsion wie Erythem, Schuppung oder Asymmetrie gab oder nicht); die Zeit bis zum Abklingen der Virusfreisetzung (nur bei Studie Nr. 1); die Zeit bis zum Nachlassen des Schmerzes; die Zeit bis zum Abklingen des Schmerzes; die Zeit bis zum Abklingen des Juckreizes und die Zeit bis zum harten Krustenstadium. Zum Vergleich wurden die Daten der Vorgeschichte der Patienten und veröffentlichte Ergebnisse (Spruance et al., New Eng. J. Med. 297: 69-75, 1977) für unbehandelte Läsionen verwendet.
  • Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse von zwei unabhängigen Studien (angegeben durch die Zahlen in Klammern in der Tabelle). Diese Daten zeigen, dass sich die Dauer von Gesichtsherpes nach der Behandlung mit der n-Docosanol-haltigen Creme signifikant auf einen Durchschnitt von 5,5 Tagen verringerte, im Vergleich zu dem verzeichneten vorgeschichtlichen Durchschnitt der Patienten von 8,9 Tagen Dauer des unbehandelten Gesichtsherpes. Somit wurde die Dauer signifikant um mehr als 35% verringert (P 50,0001), wenn die Patienten frühzeitig in der Episode mit der n-Docosanolhaltigen Creme behandelt wurden. Darüber hinaus verkürzte die Behandlung im frühen Stadium mit der n-Docosanol-Creme die Dauer der Schmerzsymptome in Verbindung mit wiederkehrenden Herpes-Episoden von etwa 6 Tagen, wenn die Erkrankung unbehandelt bleibt, im Vergleich zu weniger als 3 Tagen bei behandelten Bereichen. TABELLE 5 Ergebnisse der humanen klinischen Tests der topischen Behandlung von Herpes labialis
    n-Docosanol
    Creme behandelt Unbehandelt°
    Heilungszeit (h§) (1) 123 ± 4,9 (2) 141 ± 5,2 (1) 215 ± 0,4 (2) 211 ± 0,4
    Abklingen der Virusfreisetzung (h§) (1) 47 ± 2,4 (2) ND** 74 bis 83*
    Verringerung des Schmerzes (h§) (1) 27 ± 2,3 (2) 55 ± 4,1 NR**
    Komplettes Abklingen des Schmerzes (h§) (1) 63 ± 4,4 (2) 96 ± 5,8 111 bis 178*
    Abklingen des Juckreizes (h§) (1) 58 ± 4,9 (2) 63 ± 5,2 NR
    Hartes Krustenstadium (h§) (1) 61 ± 3,2 (2) 87 ± 4,4 NR
    • ° Die Heilungszeiten basieren auf den verzeichneten Vorgeschichten der Patienten; alle anderen Einträge in dieser Spalte sind entnommen aus Spruance et al., New Eng. J. Med. 297: 69-75, 1977.
    • § Verzeichnet als durchschnittlicher ± Standardfehler des Durchschnitts.
    • * Der Bereich repräsentiert die mittleren Läsionsgrößen für Läsionen kleiner als 77,5 mm2 und Läsionen größer als 77,5 mm2.
    • ** „ND" bedeutet „not done" (nicht durchgeführt] und „NR" bedeutet „not reported" (nicht verzeichnet].
  • Alle Individuen zeigen eine Heilung der Halsentzündungs- und Fiebersymptome innerhalb einer Woche nach der Verabreichung der Suspension aus oberflächenaktivem Stoff und n-Hexacosanol und eine Verringerung der fiebrigen Erkrankungssymptome im Allgemeinen innerhalb von zwei Wochen nach der Verabreichung. Acht der behandelten Individuen zeigen eine Verringerung der generalisierten Lymphadenopathie innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Verabreichung der aliphatischen Alkoholsuspension mit zurückgekehrter Vitalität. Alle behandelten Individuen zeigen eine Verringerung der atypischen Mononukleose-T-Lymphozyten im peripheren Blut innerhalb von vier Wochen nach der Verabreichung mit einer normalen Gesamtleukozytenzahl im Blut zwei Monate nach der Behandlung.
  • Ähnliche Ergebnisse werden bei EBV-infizierten Individuen erhalten, welche Symptome einer infektiösen Mononukleose zeigen, die systemisch mit Suspensionen aus n-Docosanol, Lignocerylalkohol und n-Octacosanol in wirksamen Konzentrationen behandelt werden.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass systemische Verabreichungen ausgewählter langkettiger aliphatischer Alkohole in wässrigen Suspensionen eine therapeutische antivirale Wirkung haben.
  • BEISPIEL 7
  • n-Docosanol und ACV zeigen Anti-HSV-Aktivität bei haarlosen Meerschweinchen
  • Das Potential für die antivirale Interaktion mit n-Docosanol und ACV wurde in vivo unter Verwendung des kutanen HSV-2-Modells an haarlosen Meerschweinchen untersucht. Hautstellen auf den Rücken haarloser Meerschweinchen wurden mit einem Tätowierinstrument mit HSV-2 inokuliert. Die infizierten Hautstellen wurden zweimal pro Tag wie angegeben behandelt, beginnend 2 Stunden nach der Virusinokulation. Die zweimal tägliche Behandlung, anstelle des üblichen drei- oder fünfmaligen Behandlungsregimes, wurde ausgewählt, weil Unterschiede zwischen der Kombinationscreme und einzelnen Cremeformulierungen besser beobachtet werden konnten, und die Vehikelkontrolle, welche Stearinsäure enthielt, zeigt keine positive Reaktion, wenn sie weniger als 5 Mal am Tag aufgetragen wird.
  • HSV-2-induzierte Vesikel waren 72 Stunden nach der HSV-2-Inokulation offensichtlich (Tafel A von 8). Die unbehandelten Stellen zeigten zu diesem Zeitpunkt einen Durchschnitt von 54 Vesikeln. Die Vesikelzahlen wurden entweder mit der n-Docosanol-Creme oder der ACV-Creme um 31% verringert, jedoch war eine solche Hemmung im Vergleich zur unbehandelten Gruppe statistisch nicht signifikant. Eine größere Hemmung (65%) wurde mit der Creme beobachtet, welche sowohl n-Docosanol als auch ACV enthält, und der Durchschnitt von 19 Vesikeln unterschied sich statistisch sowohl von der unbehandelten als auch von der Vehikel-behandelten Gruppe. Weder n-Docosanol noch ACV induzierten eine Entzündung oder Toxizität, selbst wenn beide Arzneimittel gleichzeitig angewandt wurden.
  • 96 Stunden nach der HSV-2-Inokulation zeigten die unbehandelten Stellen einen Durchschnitt von 27 Vesikeln. Eine signifikante Hemmung der Vesikelzahlen wurde an allen behandelten Stellen außer der Vehikelkontrolle beobachtet. Bei den mit den einzelnen Testformulierungen von n-Docosanol oder ACV allein behandelte Stellen verringerten sich die durchschnittlichen Vesikelzahlen um 63% bzw. 50%. Noch höhere inhibitorische Aktivität wurde an Stellen beobachtet, die mit der Kombinationscreme aus n-Docosanol und ACV behandelt wurden, nämlich eine Hemmung von 89%. Die mit der Kombinationscreme beobachtete Hemmung war statistisch höher als die, die mit den einzelnen n-Docosanol- oder ACV-Testformulierungen beobachtet wurde, nämlich p = 0,003 bzw. p = 0,0015. Wieder wurde keine n-Docosanol- und ACV-induzierte Entzündung oder Toxizität festgestellt, selbst bei Verwendung in Kombination.
  • Die Analyse des Bereichs unter der Kurve (AUC – area under the curve), definiert als die durchschnittliche Anzahl von Vesikeln multipliziert mit der Anzahl von Stunden, in der Vesikel beobachtet wurden, lässt auf die Bildung einer Synergie der Kombination von n-Docosanol und ACV schließen. Der durchschnittliche AUC für die unbehandelte Gruppe lag bei 698 Vesikelstunden. Die Behandlung mit n-Docosanol oder ACV allein resultierte in entsprechenden durchschnittlichen AUCs von 464 (34% Hemmung) und 496 (30% Hemmung). Ein theoretischer Additionseffekt von n-Docosanol und ACV hätte einen AUC von 322 ergeben (698 × verbleibende Fraktion nach Behandlung mit n-Docosanol [0,66] × verbleibende Fraktion nach Behandlung mit ACV [0,7]). Der durchschnittliche AUC für die Kombinationscreme lag bei 206 Vesikelstunden, 70% Hemmung, p = 0,01 im Vergleich zum theoretischen Additionseffekt. Somit lassen diese in vivo Beobachtungen auf eine Synergie von n-Docosanol und ACV bei der Hemmung der HSV-2-induzierten kutanen Erkrankung schließen, und sie zeigen an, dass n-Docosanol und ACV in vivo zumindest kutan nicht auf nachteilige Art und Weise interagieren.
  • BEISPIEL 8
  • n-Docosanol und ACV zeigen synergistische Anti-HSV-Aktivität in Vero-Zellkulturen
  • Das Potential für die antivirale Interaktion von n-Docosanol und ACV wurde in HSV-2-infizierten Vero-Zellkulturen ausführlicher untersucht. Vero-Zellen wurden in nur Medium oder in Medium mit 3 mM n-Docosanol oder 0,4 mM PLURONIC F-680 (die Menge in der 3 mM n-Docosanol-Kultur) kultiviert. Die Kulturen wurden für 24 Stunden inkubiert, dann ACV ausgesetzt und mit 50 Plaque-bildenden Einheiten von HSV-2 infiziert; die Plaquebildung wurde 44 Stunden danach ausgezählt. Wie in 9 gezeigt, zeigten unbehandelte (nur Medium) Kulturen einen Durchschnitt von 46 Plaques und ACV hemmte die Plaquebildung mit einer zu 50% wirksamen Konzentration (EC50) von 5 μM. Ein ähnlicher EC50 von ACV wurde für Zellen erhalten, die in PLURONIC F-68®-haltigem Medium kultiviert wurden. Kulturen, die n-Docosanol enthielten, zeigten 40% weniger Plaques als die unbehandelte oder PLURONIC F-68®-behandelte Kontrolle, eine Wiederspiegelung der antiviralen Aktivität des Arzneimittels. Insbesondere sei darauf hingewiesen, dass der EC50 für ACV in den n-Docosanol-haltigen Kulturen auf 0,2 μM verringert war. Ein Vergleich der Kurve für den theoretischen Additionseffekt von ACV und n-Docosanol bestätigt, dass diese 25-Fache Verbesserung der ACV-Aktivität höher war, als mit einem Additionseffekt zu erwarten gewesen wäre. Zelluläre Toxizität wie Zytoplasmavakuolen wurden in den ACV-haltigen Kulturen nicht beobachtet, ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit von n-Docosanol.
  • BEISPIEL 9
  • Synergistische Hemmung der HSV-1-Produktion durch n-Docosanol und ACV
  • Der Einfluss von ACV auf den EC50 von n-Docosanol für die Hemmung der HSV-2-Plaquebildung wurde auch untersucht. Obwohl nicht graphisch dargestellt, wurde ein EC50 von n-Docosanol von 2–3 mM für die Hemmung der HSV-2-Plaquebildung beobachtet, wenn es allein verwendet wurde, und, wenn es zusammen mit ACV im Bereich von 0,2–10 μM verwendet wurde, wurden EC50-Werte von n-Docosanol von 2–3 mM beobachtet. Wie in einem Isobologramm (nicht gezeigt) verzeichnet, lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass das ACV wenig Auswirkung auf die antivirale Aktivität von n-Docosanol hat, selbst wenn letztgenanntes Arzneimittel die Aktivität des erstgenannten wesentlich verbesserte.
  • Eine signifikante Verringerung des EC50 von ACV durch n-Docosanol wurde auch bei der Hemmung der HSV-1-Plaquebildung beobachtet (nicht gezeigt). Dies war verbunden mit einer wesentlichen Verringerung des EC90 von ACV für die Hemmung von HSV-1-Nachkommen (Tafel A von 10). Vero-Zellen wurden wie zuvor mit den angegebenen Konzentrationen von n-Docosanol, PLURONIC F-68® und ACV behandelt und mit HSV-1 infiziert (500 PFU pro Kultur, 0,002 PFU/Zelle). Die Kulturüberstände wurden 72 Stunden danach entnommen und auf HSV-1 untersucht. EC90-Werte von ACV von 10 μM für die Hemmung der HSV-1-Produktion wurden in Kulturen beobachtet, die nur Medium oder Medium plus PLURONIC F-68® enthielten. n-Docosanol mit einer Konzentration von 3,3 mM hemmte die PFU-Produktion um 55% und verringerte den EC90 des ACV um das 17-Fache. Eine größere Synergie wurde mit 10 mM n-Docosanol beobachtet (10), wo der EC90 40-Fach verringert wurde. Die Synergie war mit 30 mM des Arzneimittels sogar noch deutlicher (EC90 des ACV < 0,1 μM, nicht gezeigt).
  • Um ferner zu bestätigen, dass die Wirkungen der Kombination von n-Docosanol und ACV synergistisch waren, wurden die Daten in einem Isobologramm verzeichnet (Tafel B von 10). Die sich diagonal erstreckende gestrichelte Linie zeigt den theoretischen Verlauf für unabhängige Inhibitoren, eine Verschiebung der Kurve nach links zeigt synergistische Interaktion an, während eine Verschiebung nach rechts Antagonismus anzeigen würde (Spector et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1051-1055, 1989). Es ist eindeutig, dass die experimentellen Beobachtungen für die HSV-1-PFU- Produktion eine Synergie mit der Arzneimittelkombination n-Docosanol und ACV anzeigen.
  • BEISPIEL 10
  • n-Docosanol und ACV bilden eine Synergie zur Hemmung der Replikation des humanen Varizellen-Zoster-Virus (VZV) und des Zytomegalovirus (CMV) in MRC-5-Zellen
  • Aus den in Tabelle 6 gezeigten Ergebnissen werden zwei wichtige Punkte ersichtlich. Erstens wurde beobachtet, dass die synergistische Aktivität von n-Docosanol und ACV nicht von der Verwendung von Vero-Zellen abhängig war, sondern auch mit der normalen humanen MRC-5-Fibroblastenzelllinie dokumentiert werden konnte. Zweitens wurde beobachtet, dass eine solche Aktivität nicht auf HSV beschränkt war, sondern auch bei der Hemmung der humanen VZV- und CMV-Replikation demonstriert werden konnte. VZV- und CMV-induzierte Erkrankungen neigen dazu, relativ resistent gegenüber der Therapie mit ACV zu sein (Hirsch et al., in Fields Virology Third Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, S. 431-466, 1996). Somit könnte die n-Docosanol-mediierte Verbesserung der antiviralen Aktivität von ACV klinisch signifikant sein. TABELLE 6 n-Docosanol und ACV bilden eine Synergie zur Hemmung der Replikation des Varizellen-Zoster-Virus (VZV) und des Zytomegalovirus (CMV) in MRC-5-Zellkulturen
    IC pro Kultur × 10–4 ACV-Wirksamkeit
    Gruppe MRC-5-Kulturen Virus () = % Hemmung EC50 (μM) EC90 (μM)
    I Nur Medium VZV 35 3 10
    II n-Docosanol, 30 mM " 7 (80%) 0,3 2
    III n-Docosanol, 10 mM " 15 (57%) 0,6 4
    IV n-Docosanol, 33 mM " 21 (40%) 1 6
    V Pluronic F-68 " 33 (6%) 3 10
    VI Nur Medium CMV 20 30 250
    VII n-Docosanol, 30 mM " 3 (85%) 2 6
    VIII n-Docosanol, 10 mM " 8 (60%) 2 25
    IX n-Docosanol, 3,3 mM " 16 (20%) 8 35
    X Pluronic F-68 " 20 (0%) 30 250
  • MRC-5-Zellen (16-mm-Wells, 105 Zellen/ml, 1 ml/Well) wurden in nur Medium oder in Medium mit 30, 10 oder 3,3 mM n-Docosanol, oder diese Menge Pluronic F-68 enthalten in den 30 mM n-Docosanol-Kulturen, kultiviert. Nach Inkubation über Nacht wurde Acyclovir in verschiedenen Konzentrationen zugegeben und die Kulturen mit VZV (Gruppe I–V) oder CMV (Gruppe VI–X) infiziert. Nach 2 Tagen Inkubation wurde Medium, dem das n-Docosanol, Pluronic F-68 oder Acyclovir fehlte, zu allen Kulturen zugegeben. Nach weiteren 2 Tagen wurden Zellen aus den Kulturen entnommen und durch ein Infectious-Center-Assay auf infizierte Zellen (IC – infected cells) untersucht. Die Daten der infizierten Zellen sind als der Durchschnitt infizierter Zellen/Kultur abgeleitet aus vierfachen (VZV) oder dreifachen (CMV) Wells pro Anfangskulturgruppe ausgedrückt (Ref. JM 1290, 460L-134/9-23-96, rvsd. 4. April 1997).
  • Wie durch die Gruppen I–V der Tabelle 6 gezeigt, konnten vier Tage nach der Infektion mit MRC-5-Zellen mit 500 PFU des VZV in den Kulturen mit nur Medium 350.000 VZV-infizierte Zellen festgestellt werden. ACV hemmte die VZV-Infektion mit einem EC50 von 3 μM und einem EC90 von 10 μM. Die VZV-Replikation wurde durch n-Docosanol mit einem EC50 von etwa 10 mM gehemmt. Der EC50 und EC90 des ACV wurde mit der hohen 30 mM Konzentration von n-Docosanol um 90% bzw. 80% verringert.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden mit CMV erhalten (Gruppe VI–X, Tabelle 6). Vier Tage nach der Infektion von MRC-5-Zellen mit 500 PFU des CMV konnten 200.000 infizierte MRC-5-Zellen in den Kontrollkulturen festgestellt werden, und das ACV hemmte eine solche Infektion mit einem EC50 und EC90 von 30 bzw. 250 μM. n-Docosanol hemmte die CMV-Replikation mit einem EC50 von etwa 10 mM. Der EC50 und EC90 von ACV für die Hemmung der CMV-Replikation wurde mit n-Docosanol-Konzentrationen von 10–30 mM um 90% verringert.
  • BEISPIEL 11
  • Nukleosidanaloga außer ACV bilden auch Synergien mit n-Docosanol zum Hemmen der HSV-1-Replikation in vivo
  • Es war von Interesse zu bestimmen, ob die antivirale Synergie mit n-Docosanol auf ACV beschränkt ist, oder ob auch andere Nukleosidanaloga mit n-Docosanol interagieren könnten. Das Problem wurde mit der HSV-1-PFU-Produktion in Vero-Zellkulturen untersucht (11). Unbehandelte, n-Docosanol-behandelte (15 mM) und PLURONIC F-68®-behandelte Vero-Zellen wurden mit 500 PFU/Kultur HSV-1 infiziert und verschiedenen Konzentrationen der angegebenen antiviralen Nukleosidanalogon-Arzneimittel ausgesetzt. Drei Tage später wurden die Kulturüberstandfluide entnommen und auf Nachkommen-HSV-I-PFU untersucht. Ein typischer Anti-HSV-1-EC90 von ACV von 19 μM wurde in den Kontrollkulturen beobachtet, welcher in Gegenwart von n-Docosanol auf 0,9 μM verringert wurde (eine 21-Fache Verringerung). Das Nukleosidanalogon Adenin-Arabinosid (Ara-A) zeigte einen EC90 von etwa 22 μM, wenn es allein verwendet wurde, und einen EC90 von etwa 1,4 μM (eine 16-Fache Verringerung), wenn n-Docosanol in der Kultur enthalten war. Trifluridin zeigte einen EC90 von etwa 6,8 μM in Abwesenheit von n-Docosanol und einen EC90 von etwa 1,35 μM (eine 5-Fache Verringerung), wenn beide Arzneimittel vorlagen. Ähnlich hemmte Ribavirin, wenn es allein verwendet wurde, die HSV-1-Replikation mit einem EC90 von etwa 24,6 μM, welcher in Gegenwart von n-Docosanol auf etwa 0,33 μM verringert wurde (eine 75-Fache Verringerung). Obwohl nicht gezeigt, hemmte Rifampicin die HSV-Replikation ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit von n-Docosanol nicht.
  • BEISPIEL 12
  • n-Docosanol erhöht die Hemmung der Vakzinia-Virus-Replikation durch Nukleosidanaloga
  • Da das Vakzinia-Virus unempfindlich gegenüber der antiviralen Wirkung von n-Docosanol ist, war es möglich, die Beziehung zwischen der antiviralen Aktivität von n-Docosanol und der Synergie mit Nukleosidanaloga zu untersuchen. Wie zuvor für Tafel B von 12 beschrieben, zeigten unbehandelte Vero-Zellen 3 Tage nach der Infektion eine durchschnittliche Produktion von 5–6 × 105 PFU von Nachkommen-Vakzinia-Virus, ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit von n-Docosanol oder PLURONIC F-68®. Wie in Tafel A von 13 gezeigt, wurde die Vakzinia-Virus-Replikation in Kontrollkulturen (Medium oder PLURONIC F-68®) durch Trifluridin, Ara-A und Ribavirin mit EC50-Werten von etwa 2, 20 bzw. 25 μM gehemmt. Der EC50 für jedes dieser Nukleosidanaloga wurde in Kulturen, welche 15 mM n-Docosanol enthielten, mindestens 10-Fach verringert. Das Vakzinia-Virus ist normalerweise unempfindlich gegenüber der antiviralen Wirkung von ACV, und die Behandlung von Zellen mit n-Docosanol änderte diese Selektivität nicht. Tafel B von 13 stellt die EC90-Werte für diese gleichen Nukleosidarzneimittel dar, und es können vergleichbare Schlüsse aus den Ergebnissen abgeleitet werden. Diese Daten zeigen, dass ein Virus nicht empfindlich gegenüber der antiviralen Aktivität von n-Docosanol sein muss, damit das n-Docosanol die antivirale Aktivität der Nukleosidanaloga gegen dieses Virus erhöht.
  • Zusammenfassend zeigte n-Docosanol keine nachteilige Arzneimittel-Arzneimittel-Interaktion mit ACV bei einem der Testsysteme. Es wurde keine Hautirritation der Meerschweinchenhaut beobachtet, wenn die beiden Arzneimittel allein oder in Kombination angewandt wurden. Meerschweinchenhaut neigt dazu, mehr Sensibilität gegenüber Irritationen zu zeigen als humane Haut, was darauf schließen lässt, dass eine gleichzeitige Behandlung von Patienten mit n-Docosanol und ACV keine Irritation auslöst. Es wurde auch keine zelluläre Toxizität in vitro mit den beiden Arzneimitteln, entweder allein oder in Kombination, beobachtet. Eher verbesserte n-Docosanol die Anti-HSV-Aktivität von ACV in vitro und in vivo erheblich. Diese Verbesserung war in vitro synergistisch. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die gleichzeitige Behandlung der wiederkehrenden HSV-Erkrankung mit n-Docosanol und ACV eine hochvorteilhafte therapeutische Strategie wäre.
  • Die antivirale Synergie von n-Docosanol und ACV war nicht auf HSV-1 und HSV-2 beschränkt, sondern wurde auch bei VZV und CMV beobachtet. Diese letztgenannten Ergebnisse sind einleuchtend, da alle diese Herpesviren empfindlich gegenüber ACV sind (Hirsch et al., in Fields Virology Third Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, S. 431-466, 1996), wenn auch in variierendem Maße. Eine solche Synergie wurde auch mit den anderen getesteten Nukleosidanaloga, welche die HSV-Replikation hemmen, beobachtet. Dies wäre zu erwarten, da die unterschiedlichen Nukleosid- oder Nukleotidanaloga dazu neigen, gemeinsame zelluläre und virale Mechanismen für den Transport über die Plasmamembran hinweg, die metabolische Aktivierung und die antivirale Expression verwenden. Da VZV und CMV gemeinsame Replikationsschritte mit HSV aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass n-Docosanol auch Synergien mit anderen Nukleosidanaloga als ACV bildet, um auch diese Viren zu hemmen.
  • n-Docosanol bildete eine Synergie mit bestimmten getesteten Nukleosidanaloga bei der Hemmung der Vakzinia-Virus-Replikation. Die Vakzinia-Virus-Replikation wird durch n-Docosanol nicht gehemmt, wodurch angezeigt wird, dass ein Virus nicht anfällig gegenüber n-Docosanol sein muss, um eine Synergie mit einer zweiten Klasse von Arzneimitteln zu beobachten. Dies ist aus zwei Gründen ein wichtiges Ergebnis. Erstens könnte der Vergleich der Vakzinia-Virus-Reaktion mit der des Herpesvirus Informationen bezüglich molekularer Mechanismen für eine solche Synergie liefern. Zweitens, und noch wichtiger, lässt dies darauf schließen, dass die Verwendung von n-Docosanol nicht auf die Behandlung von Erkrankungen beschränkt sein muss, die durch Viren verursacht werden, die empfindlich gegenüber den antiviralen Wirkungen des Arzneimittels sind. Diese Ergebnisse zeigen auch an, dass n-Docosanol verwendet werden kann, um die Nukleosidanalogonaktivität unabhängig von einer Virusinfektion zur Behandlung anderer Erkrankungen wie Entzündungen, Autoimmunität und Krebs zu verbessern.
  • Die antivirale Selektivität der getesteten Nukleosid- und Nukleotidanaloga schien sich mit der n-Docosanol-Behandlung nicht zu verändern. Die Selektivität eines antiviralen Arzneimittels wie ACV ist abhängig von einer Eigenschaft des Virus, wie der Expression von viruscodierter Thymidinkinase. Dies erklärt das Fehlen der Hemmung der Vakzinia-Virus-Replikation durch ACV ungeachtet der Gegenwart oder Abwesenheit von n-Docosanol.
  • Das Maß, in welchem n-Docosanol interagierend mit einem gegebenen antiviralen Arzneimittel auf eine gegebene Klasse von Viren wirken kann, muss empirisch bestimmt werden. Die antivirale Synergie von PFA und n-Docosanol wurde bei HSV oder dem Vakzinia-Virus nicht beobachtet, was anzeigt, dass dies nicht mit allen antiviralen Verbindungen stattfindet. Bestimmte Vorhersagen sind jedoch möglich, wie die antivirale Synergie von n-Docosanol und Nukleosidanaloga wie AZT bei der Hemmung der HIV-Replikation. Das Influenzavirus und das Respiratory-Syncytial-Virus sind auch wahrscheinliche Kandidaten für diese synergistische Nukleosidanalogon/n-Docosanol-Reaktion.
  • Ungeachtet der Mechanismen, die der synergistischen antiviralen Aktivität von n-Docosanol und ACV zugrunde liegen, gibt es mehrere Vorteile einer Strategie der Kombinationstherapie mit Nukleosid- oder Nukleotidanaloga plus n-Docosanol. Erstens hat sich die Kombinationstherapie im Allgemeinen durch jüngste Erfolge bei der Behandlung von HIV-Infektionen und Krebs als hochwirksam herausgestellt. Ein allgemeines Merkmal einer solchen Therapie ist die Verwendung von zwei oder mehr Arzneimitteln, welche ungleiche Aktionsmechanismen aufweisen. Selbst ohne die synergistische antivirale Aktivität wäre die Kombinationstherapie der wiederkehrenden HSV-Erkrankung mit n-Docosanol und ACV basierend auf ihren nichtüberlappenden Aktionsmechanismen von Vorteil. Dennoch zeigt n-Docosanol synergistische antivirale Aktivität mit Nukleotidanaloga, möglicherweise indem die virusinfizierte Zelle veranlasst wird, höhere Levels der Arzneimittel zu konzentrieren. Daher wäre ein zweiter Vorteil der gleichzeitigen Verwendung eines sicheren Arzneimittels wie n-Docosanol die Fähigkeit, selektiv auf eine Zellpopulation gerichtet zu sein und die Wirksamkeit der Nukleosid- oder Nukleotidanaloga zu erhöhen, die Heilungszeit zu verkürzen, die Wahrscheinlichkeit der Auswahl arzneimittelresistenter Mutanten zu verringern und die Aussetzung des Patienten gegenüber potentiell toxischen und allergenen Nukleosid-Arzneimitteln zu reduzieren.
  • Eine logische Anwendung der Nukleosidanalogon- und n-Docosanol-Kombinationstherapie wäre die Verwendung einer homogenen Creme, Salbe oder Suspensionsmischung der Arzneimittel. Diese Art der Anwendung funktionierte in den Tierstudien gut (8) und kann mit ACV für die Behandlung von Patienten mit wiederkehrenden HSV-Erkrankungen verwendet werden. Mit dem Herpesvirus verwandte Erkrankungen wie Gürtelrose, CMV-Retinitis oder Kaposi-Sarkom können in Gegenwart von n-Docosanol auch besser auf die Nukleosidtherapie reagieren. Auf praktisch jedes erkrankte Gewebe, dass mit einer Creme oder Suspensionsformulierung aus n-Docosanol behandelt werden könnte, könnte auf diese Art und Weise eine verbesserte Nukleosidtherapie gerichtet sein, einschließlich der Haut, des Magen-Darm-Traktes, des Atmungssystems und bestimmter Organen des Fortpflanzungssystems. Eine Erweiterung dieser Anwendung wäre die systemische Verabreichung eines Nukleosid- oder Nukleotidanalogons und die lokale Behandlung mit n-Docosanol. Unter der Annahme, dass eine bewährte systemische Formulierung aus n-Docosanol entwickelt wird, könnte eine systemische n-Docosanol- und Nukleosid- oder Nukleotidanalogon-Kombinationstherapie auf praktisch jedes Organ im Körper gerichtet sein.
  • Die Verwendung von n-Docosanol zum Konzentrieren von Nukleosidanaloga auf erkranktes Gewebe ist möglicherweise nicht auf diejenigen beschränkt, welche durch Viren verursacht werden. Es muss noch bestimmt werden, ob die n-Docosanol/Nukleosid-Kombinationstherapie mit nichtmanipulierten Krebszellen funktionieren würde. Jedoch gab es jüngst Interesse an der Verwendung von Gentransfertechnologie für die Behandlung von Krebs unter Verwendung viruscodierter Gene und antiviraler Nukleosidarzneimittel; n-Docosanol könnte im Endeffekt eine Rolle bei dieser Strategie spielen. Tatsächlich machte die Transfektion von Melanomzellen mit dem HSV-Thymidinkinasegen die Zellen empfindlich gegenüber den toxischen Wirkungen des normalerweise HSV-selektiven Nukleosidarzneimittels Ganciclovir (Oliver et al., Virol 145: 84-93, 1985). Es ist möglich, dass die Behandlung von Hautkrebszellen mit n-Docosanol die Reaktion intensivieren würde. Auf Viruserkrankungen, welche schwierig zu behandeln sind, könnte auch auf diese Art und Weise abgezielt werden, da eine ähnliche Reaktion unter Verwendung der Suizidgentherapie und Nukleosidanaloga bei Epstein-Barr-Virus-infizierten humanen B-Lymphomzellen (Franken et al., Nature Medicine 2: 1379-1382, 1996) und bei HIV-1-infizierten humanen T-Zellen (Caruso et al., Virol 206: 495-503, 1995) beobachtet wurde.
  • Die offenbarte Behandlung für virale Infektionen umfasst die Verabreichung einer n-Docosanol-Aliphatketten-Verbindung zusammen mit einem Nukleosid- oder Nukleotidanalogon.
  • Vorzugsweise werden die aktiven Inhaltsstoffe mitverabreicht. In einer weiteren Ausführungsform werden die aktiven Inhaltsstoffe zusammengemischt und in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht. Wie hierin verwendet, bedeutet die Verabreichung von n-Docosanol zusammen mit einem Nukleosidanalogon, dass die Verbindungen an einen Patienten zu unterschiedlichen Zeiten und gemäß unterschiedlicher Dosierungs- und Behandlungsregime verabreicht werden können, wobei jedoch die Behandlungsregime überlappende in vivo Konzentrationen beider Verbindungen erzeugen, wodurch die worteiligen Interaktionen zwischen den beiden Arzneimittelklassen vereinfacht werden. Die Mitverabreichung einer aliphatischen Verbindung und eines Nukleosidanalogons bedeutet, dass die beiden aktiven Mittel zur gleichen Zeit verabreicht werden, jedoch nicht notwendigerweise auf dem gleichen Weg.
  • Das n-Docosanol kann von einmal bis fünfmal pro Tag durch topische, orale, mukosale, transmembranale Penetration und auf intravenösem Weg verabreicht werden. Ähnlich kann auch das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon von einmal bis fünfmal pro Tag durch topische, orale, mukosale, trans-membranale Penetration und auf intravenösem Weg verabreicht werden. Vorzugsweise wird das n-Docosanol lokal auf das erkrankte Gewebe aufgetragen, und das Nukleosid- oder Nukleotidanalogon wird systemisch angewandt. Die Dosen des n-Docosanol sind von 0,05% bis etwa 40%. Am bevorzugtesten wird das n-Docosanol mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1% bis etwa 20% verwendet.
  • Die synergistische Interaktion von n-Docosanol und Nukleosid- oder Nukleotidanaloga kann mittels eines Regimes der systemischen Nukleosidanalogon-Verabreichung gekoppelt mit der lokalen n-Docosanol-Auftragung auf das erkrankte Gewebe ausgenutzt werden. Zum Beispiel erzielte orales Acyclovir mit einer Dosis von 500 mg verabreicht 5 Mal pro Tag eine maximale durchschnittliche Acyclovir-Plasmakonzentration von etwa 0,7 μg/ml (Tyring et al., Arch. Dermatol. 134: 185-191, 1998). Orales Valacyclovir verabreicht zweimal pro Tag mit einer Dosis von etwa 1000 mg erzielte jeweils eine maximale Acyclovir-Plasmakonzentration von etwa 4,3 μg/ml. Die Infusion der Acyclovir-Suspension mit einer Dosis von 5 mg/kg durch 1-Stunden-Infusionen alle 8 Stunden erzielte eine stabile Acyclovir-Plasmakonzentration von etwa 10 μg/ml (Slum et al., Am. J. Med. 73: 186-192, 1982). Diese Dosisschemata in Verbindung mit der gleichzeitigen Verabreichung von n-Docosanol einmal bis fünfmal pro Tag topisch, oral, über den Urogenitaltrakt (mukosal), transmembranal oder intravenös sollte die worteiligen Interaktionen zwischen den beiden Arzneimittelklassen wirksam ausnutzen.

Claims (10)

  1. Antivirale Zusammensetzung, die n-Docosanol und ein Nukleosidanalogon oder ein Nukleotidanalogon in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, die Zusammensetzung umfasst weiter einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff, worin der nichtionische oberflächenaktive Stoff ein difunktionelles Blockpolymer, das ein Polyoxyalkylenderivat von Propylenglycol ist, mit einem Molekulargewicht von etwa 1 000 bis etwa 25 000, ein Blockcopolymer von Ethylenoxid-Propylenoxid mit einem Molekulargewicht von zwischen 6 000 und 12 000, Octoxynol-9 oder Octoxynol-10 umfasst.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die n-Docosanolverbindung bei einer Konzentration im Bereich von etwa 0,05% bis etwa 40% vorliegt.
  3. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: Acyclovir, Adefovir, Azidothymidin, Brivudin, Cidofovir, ddC, ddI, Famciclovir, Ganciclovir, Idoxuridin, Lamivudin, Lobucavir, Penciclovir, Ribavirin, Sorivudin, Trifluridin, Valaciclovir und Ara A.
  4. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon bei einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1% bis etwa 10% vorliegt.
  5. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, die weiter einen Penetrationsenhancer umfasst.
  6. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, die weiter andere Mittel umfasst, die aus der Gruppe ausge wählt sind, die aus Folgenden besteht: antimikrobiellen Mitteln, anderen antiviralen Mitteln, antifungalen Mitteln, Antioxidantien, Puffermitteln, Sonnenschutzmitteln, kosmetischen Mitteln, Duftstoffen, Gleitmitteln, Befeuchtungsmitteln, Trockenmitteln und Verdickungsmitteln.
  7. Antivirale Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Behandlung einer viralen Infektion, worin n-Docosanol zusammen mit dem Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon verabreicht wird.
  8. Antivirale Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das n-Docosanol und das Nukleosidanalogon oder Nukleotidanalogon zur Verabreichung von einmal bis fünfmal pro Tag über einen Weg, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus topisch, oral, mukosal, transmembranaler Penetration und intravenös besteht, unabhängig angepasst werden.
  9. Verwendung der antiviralen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen Infektion, worin das Medikament bei einer Dosis von 0,01 bis 10 Gramm bei einer Häufigkeit von einmal bis fünfmal pro Tag für eine Dauer von einem bis Vierzehn Tagen zu verabreichen ist.
  10. Verwendung der antiviralen Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das Medikament über einen Weg, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus topisch, oral, mukosal, transmembranaler Penetration und intravenös besteht, zu verabreichen ist.
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