PL189618B1 - Kompozycje przeciwwirusowe i przeciwzapalne oraz zastosowanie tych kompozycji - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja przeciwwirusowa i przeciwzapalna zawierajaca mieszanine niejono- wego srodka powierzchniowo czynnego i skladnika aktywnego w farmaceutycznie akcep- towalnym rozcienczalniku lub nosniku, znamienna tym, ze niejonowy srodek powierzch- niowo czynny jest oktoksynolem, a skladnikami aktywnymi sa alkohole stearylowy, erucy lowy, brazydylowy, behenylowy (n-dokozanol), arachidylowy, n-dokozan, kwas behenowy (n-dokozanowy), amid kwasu erukowego, kwas stearynowy, pojedynczo lub w mieszaninie, przy czym wagowy stosunek zawartosci srodka powierzchniowo czynnego i skladnika ak- tywnego wynosi od 1:1 do 10:1. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje przeciwwirusowe i przeciwzapalne oraz ich zastosowanie.

Zarażenia wirusowe powodują znaczną niewygodę i choroby i mogą być śmiertelne. Takie wirusy jak wirusy opryszczki zwykłej (HSV-1 i HSV-2), wirus cytomegalii (CMV), wirus Epsteina-Barra (EBV), wirus ospy wietrznej i półpaśca (VZV), wirusy grypy, wirusy limfotropowe ludzi (na przykład HTLV-1) i wirusy niedoboru odporności ludzi (na przykład HIV-1) powodują znaczną chorobowość i śmiertelność. Wirusy HSV-1 i HSV-2 są związane z występowaniem stanów zapalnych i uszkodzeń skóry i błon śluzowych, włącznie z opryszczką warg i uszkodzeniami opryszczkowymi narządów płciowych. VZH powoduje półpasiec, a EBV jest związany z mononukleozą.

Wirusy grypy powodują objawy grypy i mogą być śmiertelne. HIV wywołuje zespół nabytego niedoboru odpornościowego, który osłabia i zabija zarażone osoby. Chociaż te wirusy mogą pozostawać uśpione w niektórych komórkach przez różne okresy czasu, to zwykle rozmnażanie wirusowe powoduje nieodwracalne zniszczenie zarażonych komórek i wywołuje różne objawy kliniczne chorób, jakie powodują.

Przeciwwirusowa i przeciwzapalna aktywność alkoholi alifatycznych zawierających od 20 do 32 atomów węgla jest znana w stanie techniki, jak ujawniono w amerykańskich dokumentach patentowych nr nr 4 874 794, 5 071 879, 5 166 219, 5 194 451 i 5 534 554. Kompozycje zawierające alkohole alifatyczne i podobne związki o działaniu leczniczym są ujawnione w tych dokumentach.

Alkohol alifatyczny C22, n-dokozanol, rozproszony w środku powierzchniowo czynnym wykazuje silne działanie przeciwwirusowe względem takich wirusów jak wirus opryszczki zwykłej, HIV-1 i syncytialny wirus oddechowy in vitro i wirus Frienda in vivo (Katz, D. H., i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10825-10829, 1991; amerykański dokument patentowy nr 5 534 554). Chociaż nie jest znany mechanizm tego hamowania aktywności wirusowej, to n-dokozanol nie dezaktywuje wirusa bezpośrednio i dlatego jest niepodobny do nienasyconych alkoholi od CIO do C18, które wykazują aktywność podobną do detergentów (Katz, D. H., i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10825-10829, 1991; Snipes, W. i inni, Antimicrob. Agents Chemother. 11: 98-104, 1977).

Postępujące wiązanie i pobieranie n-do-kozanolu przez komórki może być powodem jego aktywności przeciwwirusowej, ponieważ wstępne inkubowanie komórek alkoholem powoduje optymalną aktywność przeciwwirusową. Podczas inkubacji 40% zasocjowanego z komórkami n-dokozanolu znajduje się w błoniastych składnikach komórek, a reszta jest zasocjowana z rozpuszczalnymi frakcjami komórek (Katz, D. H., i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10825-10829, 1991.

Wprowadzanie n-dokozanolu do komórek nie hamuje wiązania wirusów przez powierzchnię komórek. Natomiast wczesna synteza wirusowego białka jest zahamowana w ilości powyżej 80% i wirusy nie lokalizują się w jądrach (Marcelletti, J. F. i inni, Drugs of the Future 17(19): 879-882, 1992). Jakkolwiek wewnątrzkomórkowe konwersje metaboliczne n-dokozanolu mogą być przyczyną jego przeciwwirusowej aktywności (Katz, D. H., i inni, Annals N.Y. Acad. Sciences, 724: 472-488, 1994), to alkohol nie jest cytotoksyczny w stężeniach do 300 mM.

Donoszono o dezaktywacji wirusów przy użyciu nienasyconych długołańcuchowych alkoholi C14 do C20 mających od 1do 4 wiązań nienasyconych. Najskuteczniejszym był alkohol y-linolenylowy z wiązaniami podwójnymi w położeniach 8, 9 i 12; podczas gdy alkohol C18 z jednym podwójnym wiązaniem cis i alkohol C20 z czterema podwójnymi wiązaniami były znacznie mniej skuteczne (Sands i inni, Antimicrob. Agents & Chemother. 15: 67-73, 1979). Podawano, że kompozycje zawierające kwas oleinowy (C18, jedno potrójne wiązanie) są środkami aktywnymi przeciwko opryszce (zgłoszenie patentowe PCT, WO 96/02244A1).

Niektóre związki, które są strukturalnie podobne do długołańcuchowych alkoholi alifatycznych, także łączy się z aktywnością przeciwwirusową. Na przykład amerykański dokument patentowy nr 4 513 008 ujawnia wirusobójczą aktywność liniowych C20 do C24 wielonienasyconych kwasów, aldehydów lub alkoholi mających od 5 do 7 podwójnych wiązań. Związki mające długołańcuchową grupę acylową, zawierające co najmniej 3 do 4 nienasyco189 618 nych wiązań, związane z nukleozydem lub analogiem nukleozydu ujawniono w leczeniach przeciwwirusowowych w amerykańskim dokumencie patentowym nr 5 218 142.

Podobny amerykański dokument patentowy nr 5 276 020 ujawnia związki przeciwwirusowe zawierające C16, C18 lub C20 długołańcuchową grupę kwasu tłuszczowego związaną z analogiem nukleozydu i sposób leczenia infekcji wirusowej przy użyciu tych związków.

Aktywność biologiczną przydatną w leczeniu nowotworów, chorób pierwotniakowych i grzybicowyh, choroby autoagresyjnej i uszkodzenia szpiku kostnego przypisano fosfolipidom mającym łańcuchy erucylowe i brazydylowe, takim jak erucylofosfocholina (amerykański dokument patentowy nr 5 436 234).

Jakkolwiek niektóre długołańcuchowe alkohole tłuszczowe i kwasy tłuszczowe powodują wzrost komórek, to takie efekty nie są obecnie potwierdzone. Na przykład n-heksakozanol, czyli alkohol C26, promuje wzrost neuronowy, podczas gdy inne długołańcuchowe tłuszczowe n-alkohole zawierające 16, 20, 22, 24 i 30 atomów węgla nie promują wzrostu (Borg, J. i inni, FEBS Lett. 213(2): 406-410, 1987).

Kwas dokozaheksaenowy, czyli kwas tłuszczowy C22 zawierający 6 podwójnych wiązań jest zatężany w ośrodkowym układzie nerwowym i w siatkówce, chociaż nie określono jego roli fizjologicznej (Bazan, N., Prog. Clin. Biol. Res. 312: 95-112,1989).

Aktywność przeciwwirusową zanotowano dla lipozomalu AL721, mieszaniny obojętnych glicerydów, fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy (Antional, L. i inni, Neurosci. Biobehav. Rev. 11: 399-413, 1997). Kompozycje przeciwbakteryjne do leczenia miejscowego zawierające monoester C15 gliceryny kwasu laurynowego łub monoester alkoholu wielowodorotlenowego kwasu laurynowego z mieszaniną kwasów tłuszczowych (kwasy kaprynowe C10 i kwasy kaprylowe C8) ujawniono w amerykańskim dokumencie patentowym nr 5 208 257.

Sposób zapobiegania podrażnieniom skóry i zmniejszania tego podrażnienia przez nakładanie środka ochronnego zawierającego polimery kwasów tłuszczowych C12 do C26 przed wystawieniem na działanie czynnika alergenowego ujawniono w amerykańskim dokumencie patentowym nr 4 076 799. Korzystne polimery mają od 2 do 4 grup karboksylowych lub solnych grup karboksylowych, korzystnie trietanolową sól dimeryzowanego kwasu linoleinowego lub jego nasyconej pochodnej.

Inne polimery przeciwzapalne, zawierające aromatyczne reszty heterocykliczne lub reszty acylowe w homopolimerach lub w heteropolimerach (na przykład estry winylowe kwasów tłuszczowych od C8 do C18; ciężar cząsteczkowy od 2000 do 1000000) i mające większą aktywność niż składowe monomery ujawniono w amerykańskim dokumencie patentowym nr 3 946 035.

Leczenie uszkodzeń opryszczkowych przy miejscowym stosowaniu kompozycji zawierających środek znieczulający, środek powierzchniowo czynny i miejscowy nośnik ujawniono w amerykańskim dokumencie patentowym nr 5 380 754.

Sposób leczenia zapalenia przez stosowanie miejscowe cis,cis-(9,12-oktadekadienolanu etylu) ujawniono w amerykańskim dokumencie patentowym nr 4 025 645 jako leczenie opryszczki.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca mieszaninę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i składnika aktywnego w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku.

Istotą wynalazku jest to, że niejonowy środek powierzchniowo czynny jest oktoksynolem, a składnikami aktywnymi są alkohole stearylowy, erucylowy, brazydylowy, behenylowy (n-dokozanol), arachidylowy, n-dokozan, kwas behenowy (n-dokozanowy), amid kwasu erukowego, kwas stearynowy, pojedynczo lub w mieszaninie, przy czym wagowy stosunek zawartości środka powierzchniowo-czynnego i składnika aktywnego wynosi od około 1:1 do około 10:1

Korzystnie, kompozycja zawiera mieszaninę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i składnika aktywnego w stosunku wagowym od około 5:1 do około 10:1.

W innym korzystnym wariancie kompozycja zawiera mieszaninę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i kwasu stearynowego w stosunku wagowym od około 4:1 do około 10:1.

189 618

Korzystnie, kompozycja zawiera ponadto dodatkowy niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany z grupy zawierającej polimer blokowy o ciężarze cząsteczkowym od około 1000 do około 25000, dezoksycholan oraz ich mieszaninę.

Korzystnie, polimer blokowy zawiera tlenek etylenu i tlenek propylenu i ma masę cząsteczkową około 8400.

Korzystnie, niejonowy środek powierzchniowo-czynny wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.

Korzystnie, mieszanina zawiera oktoksynol i kwas behenowy (n-dokozanowy) w stosunku wagowym około 5:1.

Korzystnie, mieszanina zawiera od około 5% do około 20% wagowych kwasu stearynowego i dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.

Korzystnie, mieszanina zawiera od około 10% do około 12% wagowych alkoholu behenylowego (n-dokozanolu) i dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.

Korzystnie, mieszanina zawiera zawiesinę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i kwasu stearynowego w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku.

Korzystnie, niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.

Korzystnie, polimer blokowy zawiera polioksyalkilenową pochodną glikolu propylenowego i posiada ciężar cząsteczkowy około 25000.

Korzystnie, składnik aktywny zawiera alkohol behenylowy (n-dokozanol).

Korzystnie, mieszanina stanowi zawiesinę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i alkoholu behenylowego (n-dokozanolu) w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku,

Korzystnie, niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.

Korzystnie, mieszanina zawiera dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.

W innym korzystnym przypadku, kompozycja zawiera mieszaninę oktoksynolu i alkoholu behenylowego (n-dokozanolu) w stosunku wagowym od około 1:1 do około 10:1 w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku.

Korzystnie, oktoksynol jest wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.

Korzystnie, mieszanina zawiera od około 5% do około 20% wagowych alkoholu behenylowego (n-dokozanolu).

W innym korzystnym wariancie mieszanina zawiera od około 10% do około 12% wagowych alkoholu behenylowego (n-dokozanolu).

Korzystnie, mieszanina zawiera dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.

W kolejnym korzystnym wariancie mieszanina zawiera oktoksynol i alkohol behenylowy (n-dokozanoł) w stosunku wagowym od około 5:1 do około 10:1.

W jeszcze innym korzystnym wariancie mieszanina zawiera oktoksynol i alkohol behenylowy (n-dokozanol) w stosunku wagowym od około 4:1 do około 10:1.

W kolejnym korzystnym wariancie mieszanina zawiera oktoksynol i alkohol behenylowy (n-dokozanol) w stosunku wagowym około 5:1.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca mieszaninę według wynalazku, do zastosowania jako lek hamujący wzrost lub namnażanie komórek.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca mieszaninę według wynalazku do zastosowania jako lek do zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowej.

Korzystnie, infekcja wirusowa jest wywołana jest przez wirusa wybranego z grupy obejmującej wirus opryszczki zwykłej, wirus cytomegaln, wirus Epsteina-Barra, wirus ospy wietrznej, wirus grypy, ludzki wirus limfocytotropowy, wirus brodawczaka lub wirus RSV (syncytialny wirus oddechowy).

Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca mieszaninę według wynalazku do zastosowania jak lek do leczenia zapalenia skóry lub błon śluzowych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca mieszaninę według wynalazku do zastosowania jako lek do leczenia oparzeń.

189 618

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji według wynalazku do przygotowania leku odpowiedniego do stosowania miejscowego, przezbłonowego lub pozajelitowego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji według wynalazku do przygotowania leku do zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowych.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji według wynalazku do przygotowania leku do leczenia oparzeń.

Wynalazek jest przedstawiony na rysunku, na którym:

Figura 1 jest wykresem pokazującym hamowanie wytwarzania płytek w komórkach Vero in viiro przez zawiesiny n-dokozanolu (C22, h), n-tetrakozanolu (alkoholu lignocerylowego (C24, 0), n-heksakozanolu (C26, ®) i n-oktakozanolu (C28, Δ) przy stężeniach pokazanych na osi X (dane dotyczą procentowej zawartości obserwowanych płytek w porównaniu do hodowli kontrolnych poddanych działaniu zawiesiny środka powierzchniowo czynnego nie zawierającego długołańcuchowego alkoholu).

Figura 2A jest wykresem pokazującym, że zwiększanie stosunku środka powierzchniowo czynnego do n-dokozanolu zmniejsza wytwarzanie płytek, gdy komórki Vero są inkubowane zawiesiną w ciągu 12 h przed dodaniem wirusa HSV-2; stosunki środka powierzchniowo czynnego do n-dokozanolu były równe: 1:1 (β), 3;2 (Δ), 5:1 (♦) i 10:1 (o).

Figura 2B przedstawia odpowiednie próbki kontrolne, takie jak na fig. 2A, przy użyciu takiego samego stężenia dla każdego stosunku środka powierzchniowo czynnego do n-dokozanolu przedstawionego na fig. 2A, lecz bez n-dokozanolu (z zastosowaniem takich samych symboli jak na fig. 2A).

Figura 3 jest wykresem przedstawiającym, że zawiesiny oktoksynolowego środka powierzchniowo czynnego w n-dokozanolu (a) hamują tworzenie się płytek HSV-2 w komórkach Vero inkubowanych zawiesiną i HSV-2 w ciągu 48 h ze wzrostem hamowania skorelowanym ze wzrostem stężenia n-dokozanolu, podczas gdy hodowle kontrolne inkubowane FISV-2 i oktoksynolowym środkiem powierzchniowo czynnym (o) nie wykazywały hamowania (to jest odpowiadały nie poddanym obróbce próbkom kontrolnym mającym około 50 płytek na 1 dołek); odcinki powyżej i poniżej punktów danych pokazują odchylenie standardowe dla podwójnych próbek.

Figura 4 jest wykresem przedstawiającym, że zawiesiny środka powierzchniowo czynnego w n-dokozanolu (a) i zawiesiny środka powierzchniowo czynnego w n-dokozanolu (Δ) hamują tworzenie się płytek wirusowych HSV-2 w hodowanych komórkach Vero inkubowanych ze związkami w ciągu 12 h przed dodaniem HSV-2.

Figura 5 jest wykresem przedstawiającym, że zawiesiny alkoholu stearylowego (08, 6) i alkoholu arachidylowego (C20, Δ) są toksyczne dla hodowanych B komórek nototworowych inkubowanych w ciągu 48 h zawiesinami o stężeniach wskazanych na osiach X w porównaniu z próbkami kontrolnymi inkubowanymi zawiesinami środka powierzchniowo czynnego bez alkoholu (o) lub ze środkiem powierzchniowo czynnym i n-dokozanolem (C22, e), jak oznaczono przez włączenie ³H-tymidyny do DNA (dane dotyczą procentowej ilości próbek kontrolnych inkubowanych jedynie środkami).

Figury 6A i 6B pokazują schematycznie wpływ zawiesin zawierających środek powierzchniowo czynny i n-dokozanol (a) na nie rozmnażanie się fibroblastów napletka w porównaniu do komórek inkubowanych w zawiesinach środek powierzchniowo czynny i n-dokozanol (Δ) lub próbkami kontrolnymi inkubowanymi zawiesiną środka powierzchniowo czynnego bez aktywnego składnika (o) przy stężeniach pokazanych na osiach X (wartości średnie dla badań podwójnych po inkubowaniu w ciągu 96 h komórek szczepionych za pomocą 1000 komórek na 1 dołek (fig. 6A) iub 30000 komórek na i dołek (fig. 6B) w płytkach z 96 dołkami.

Figura 7 jest wykresem przedstawiającym zależność czasową przeciwrozrostowego wpływu na komórki zawiesin środka powierzchniowo czynnego i n-dokozanolu po 72 h () i po 96 h (o) inkubacji przy użyciu sposobów opisanych dla fig. 6A.

Sposoby syntezy n-dokozanolu i alkoholu erucylowego (cis-13-dokozen-l-olu) są znane fachowcom (patrz na przykład amerykański dokument patentowy nr 4 186 211).

189 618

Alkohol stearylowy można otrzymywać sposobem Browna i in., J. Am. Chem. Soc., 78: 2582, 1956). Sposoby otrzymywania alkanów, alifatycznych alkoholi, amidów i alifatycznych kwasów są znane fachowcom (na przykład patrz A. Steitwieser, Jr. & C. H. Heathcock, Introduction to Organie Chemistry).

Kompozycje według niniejszego wynalazku odpowiednie do zastosowania w celu zapobiegania lub leczenia zarażeń wirusowych zawierają aktywny składnik lub mieszaninę związków jako aktywny składnik, wybrany z grupy zawierającej nasycone alkohole alifatyczne, mononienasycone alkohole alifatyczne, alifatyczne alkany, mononienasycone amidy alifatyczne i kwasy alifatyczne o długości łańcucha węglowego od 18 do 28 atomów węgla (C18 do C28).

Korzystna kompozycja zawiera jako składnik aktywny alkohol stearylowy, alkohol erucylowy, alkohol brazydylowy, alkohol behenylowy (n-dokozanol), alkohol arachidylowy, n-dokozan, kwas behenowy (n-dokozanowy) amid kwasu erukowego i kwas stearowy lub ich mieszaniny, w połączeniu ze środkiem powierzchniowo czynnym.

Środkiem powierzchniowo czynnym jest korzystnie niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak dwufukcyjny polimer blokowy będący polioksyalkilenową pochodną glikolu propylenowego o ciężarze cząsteczkowym od około 1Οθ0 do około 25000 lub większym.

Korzystnie środkiem powierzchniowo czynnym jest kopolimer blokowy tlenu propylenu z tlenkiem etylenu (polaksamer 188) o ciężarze cząsteczkowym około 8400 (na przykład Pluronic F-68®).

Innymi korzystnymi środkami powierzchniowo czynnymi są oktoksynol-9 i/lub oktoksynol-10 (na przykład Triton X-100j, dezoksycholan i mieszaniny niejonowych środków powierzchniowo czynnych.

Aktywne składniki stanowią od około 0,1 do około 50% wagowych końcowej kompozycji, korzystnie od około 1 do około 10 % wagowych.

Optymalna aktywność przeciwwirusowa aktywnych składników zależy do stosunku środka powierzchniowo czynnego do aktywnego składnika, który może zmieniać się w stosunku wagowym od 1:1 do 10:1, korzystnie wynosi 5:1.

Sposoby wytwarzania zawiesin alkoholi alifatycznych, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i długołańcuchowych alkanów są znane w stanie techniki. Jednym z odpowiednich sposobów wytwarzania takiej zawiesiny jest rozcieńczanie niejonowego detergentowego środka powierzchniowo czynnego do stężenia od 1 do 100 mg/ml w wodzie lub w wodnym roztworze, takim jak roztwór soli fizjologicznej i ogrzewanie roztworu (na przykład w temperaturze od 37 do 50°C).

Następnie dodaje się składnik aktywny do tego roztworu środka powierzchniowo czynnego w celu wytworzenia pożądanego końcowego stężenia składnika aktywnego i całość miesza się (na przykład sposobem mieszania obrotowego lub zwrotnego lub mieszania pod działaniem ultradźwięków) w celu wytworzenia zawiesiny globulamych cząstek (o średniej średnicy od około 0,1 mm do 100 mm).

Innymi odpowiednimi nośnikami są emulsje (typu olej-w-wodzie lub woda-w-oleju), roztwory, kremy, płyny, maści, pianki, żele i aerozole, przy czym wszystkie z nich można wytwarzać znanymi sposobami.

Składniki aktywne i środki powierzchniowo czynne miesza się z nośnikiem, który jest fizjologicznie kompatybilny ze skórą i z tkanką błonową ludzi i zwierząt, którym jest podawany. Znaczy to, że nośnik jest zasadniczo nieaktywny oprócz jego właściwości jako środka powierzchniowo czynnego, wykorzystywanych podczas wytwarzania zawiesiny aktywnych składników.

Kompozycje mogą zawierać inne składniki aktywne fizjologicznie, które nie przeszkadzają w skuteczności nasyconych alkoholi alifatycznych, mononienasyconych alkoholi alifatycznych, alifatycznych alkanów i alifatycznych kwasów. Przykładową kompozycję ujawniono w amerykańskim dokumencie patentowym nr 3 592 920.

Odpowiednimi nośnikami są wodne lub olejowe nośniki, takie jak na przykład biała wazelina, mirystynian izopropylu, lanolina lub alkohole lanolinowe, olej mineralny, monooleinian sorbitanu, glikol propylenowy, alkohol cetylostearylowy (razem lub w różnych mieszaninach) z detergentem (na przykład z polioksylostearynianem lub laurylosiarczanem sodowym) i zmieszane z wodą w celu wytworzenia płynu, żelu, kremu lub półstałej kompozycji.

189 618

Inne odpowiednie nośniki składają się z mieszanin emulgatorów i środków zmiękczających z rozpuszczalnikami, takimi jak stearynian sacharozy, kokoanian sacharozy, distearynian sacharozy, olej mineralny,^glikol propylenowy, 2-etylo-l,3-heksanodiol, 15-stearyloeter polioksopropylenowy i woda. Środki konserwujące mogą także być nośnikami włącznie z metyloparabenem, propyloparabenem, alkoholem benzylowym i solami etylenodiaminoczterooctowymi.

Rozcieńczone zawiesiny bez zagęszczaczy są najbardziej odpowiednie do nanoszenia na powierzchnie skóry jako rozpylacze aerozolowe przy użyciu dobrze znanych sposobów nanoszenia.

Kompozycja może także zawierać plastyfikator, taki jak glicerol lub glikol poletylenowy (m. w. 800 do 20000) i środki zwilżające takie, jak l-dodecyloazacykloheptan-2-on (azon).

Kompozycja nośnika może mieć różny skład o ile nie koliduje on z aktywnością farmakologiczną substancji czynnych.

Kompozycje mogą także zawierać środki przeciwbakteryjne, inne środki przeciwwirusowe, środki przeciwgrzybicze, przeciwutleniacze, środki buforujące, filtry słoneczne i środki kosmetyczne, takie jak barwniki, środki zapachowe, środki poślizgowe i nawilżacze lub środki suszące. Środki przeciwbakteryjne nadające się do zastosowania w kompozycjach obejmują polimyksynę B i tetracyklinę.

Inne środki przeciwwirusowe zawarte w preparatach mogą być analogami nukleozydowymi, takimi jak acyklowir lub cylokiny. Środki przeciwgrzybicze, które mogą być zawarte to mikonazol (l-[2,4-dichloro-beta-(2,4-dichlorobertfyloksy)fenyloetylo]-lH-imidazol) i tinaktyna (N-metylo-N-(3-tolilo)tionokarbaminian nafylu). W skład kompozycji mogą wchodzić również środki przeciwutleniające, takie jak witamina E, filtry słoneczne, takie jak kwas paraaminobenzoesowy. Mogące wchodzić w skład kompozycji środki suszące są dobrze znane, jak na przykład fenol i alkohol benzylowy. W skład kompozycji mogą wchodzić również środki poślizgowe, takie jak syntetyczny lub naturalny wosk pszczeli. Środki zagęszczające dodawane do kompozycji mogą obejmować pullulan, ksantan, poliwinylopirolidon lub karboksymetylocelulozę.

Optymalnie, kompozycje efektywnie zmniejszają całkowitą ilość wirusów u leczonego osobnika, szczególnie w leczeniu systemowym i w uszkodzeniach, szczególnie w leczeniu miejscowym zainfekowanych powierzchni skóry lub błony śluzowej.

Ujawnione kompozycje zmniejszają także objawy infekcji wirusowej (np. ból związany z uszkodzeniami wywołanymi przez wirusy) i umożliwiają szybsze gojenie niż obserwowane bez leczenia.

Wynalazek obejmuje stosowanie kompozycji zawierającej substancję czynną i środek powierzchniowo czynny w celu zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowej u ludzi lub zwierząt. Stosowanie korzystnie dotyczy skóry lub błony śluzowej przy użyciu kremu, płynu kosmetycznego, żelu, maści, zawiesiny, rozpylacza aerozolowego lub preparatów półstałych (np. czopków), wszystkie wytworzone przy użyciu sposobów dobrze znanych z literatury. Zastosowanie kompozycji zawierających substancję czynną i środek powierzchniowo czynny skuteczny w zapobieganiu lub leczeniu infekcji wirusowej polega na jednym do dziesięciu podań 10 mg do 10 g przez jeden do czternastu dni. Kompozycje podaje się zwykle raz na 12 godzin do, najwyżej, jednego razu na cztery godziny. Korzystnie dwie do czterech dawek kompozycji dziennie w ilości około 0,1 g do 5 g na dawkę przez jeden do siedmiu dni jest wystarczające do zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowej. Dla stosowania miejscowego, kompozycje są korzystnie stosowane na uszkodzenia, codziennie tak długo, jak długo obserwowane są objawy (np. ból, obrzęk lub zapalenie). Kompozycje i sposoby są użyteczne w zapobieganiu i leczeniu różnych infekcji, takich jak infekcje wywoływane przez wirusy herpes włącznie z HSV-1, HSV-2 i HS-ó, cytomegaiowirusem (CMV), wirusem Epsteina-Barra (EBv) i wirusem varicella zoster (VZV), wirusy grypy, ludzkie wirusy limfotropowe (np. HTLV-1), ludzkie wirusy niedoboru odporności (np. HlV-1), wirus papilloma i syncytialny wirus oddechowy. Ze względu na działanie cytostatyczne niektórych kompozycji, kompozycje i sposoby są także użyteczne do hamowania wzrostu komórek nowotworowych i/lub przerzutów. To hamowanie komórkowe może być łączone z dobrze znanymi sposobami leczenia raka (np. napromieniowanie i/lub chemioterapia) prowadząc do całkowitej lub częściowej remisji guza lub innych wzrostów komórek nowotworowych.

189 618

O ile nie określono tego inaczej, to wszystkie określenia naukowe i techniczne stosowane w niniejszym opisie mają takie samo znaczenie, jak jest zwykle rozumiane przez fachowców z danej dziedziny. O ile nie stwierdzono, że jest inaczej, to techniki stosowane lub proponowane w niniejszym wynalazku są znane zwykłym fachowcom w tej dziedzinie. Przykłady wykonania odmian niniejszego wynalazku podano tylko w celu przedstawienia wynalazku.

Przykład 1

Aktywność przeciwwirusowa alkoholi alifatycznych C21-C28

Wytworzono zawiesinę alkoholi alifatycznych w środku powierzchniowo czynnym PLURON1C F-68® (BASF Corp., Parsippany, NJ), z zastosowaniem następującej procedury opisanej dla n-dokozanolu (czystość > 98%; z firmy M. Michel, New York, NY).

Środek powierzchniowo czynny rozcieńczono do 10 mg/ml, w temperaturze 37°C, w preparacie Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, modyfikowanym odczynnikiem Eagl'a (DMEM; Whittakor Baproducts, Walkersville, MD) i następnie roztwór ogrzano do temperatury 50°C.

Do roztworu środka powierzchniowo czynnego dodano n-dokozanol dla uzyskania ostatecznego stężenia 30 mM i następnie mieszaninę poddano działaniu ultradźwięków przez 21 minut, z mocą wyjściową 65 W, z zastosowaniem urządzenia ultradźwiękowego Brenson 450, co spowodowało ogrzanie się zawiesiny do 88°C.

Otrzymana zawiesina zawierała cząstki kuliste o średnich rozmiarach około 0,3 pm, jak to stwierdzono za pomocą mikroskopu elektronowego. Stosując takie samo postępowanie, wytworzono roztwory kontrolne zawierające PLURON1C F-68® bez dodatku alkoholu alifatycznego oraz zawiesiny zawierające środek powierzchniowo czynny i/lub n-dokozanol o różnych stężeniach.

Wytworzono zawiesiny alkoholu stearylowego (Cis), alkoholu arachidylowego (C20), heneikozanolu (C21), alkoholu lignocerylowego (C24) i n-heksakozanolu (C26) z zastosowaniem takiej samej procedury jak w przypadku zawiesin n-dokozanolu. W przypadku alkoholi alifatycznych dłuższych od C22, mieszaniny ogrzewano przed poddaniem ich działaniu ultradźwięków, w przypadku alkoholu lignocerylowego (C24) do 80°C, w przypadku n-heksakozanolu (C26) i 1-oktakozanolu (C23) do 90°C. n-Heksadekanol pochodził z firmy Aldrih Chemicals (Milwaukee, WI), alkohole stearylowy i arachidylowy pochodziły z firmy M. Michel (New York, NY), a inne związki pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

W celu oznaczenia działania zawiesiny alkoholu alifatycznego na wydajność tworzenia się płytek, do zakażenia komórek nerkowych afrykańskiej małpy zielonej (komórki Vero, numer ATCC CCL 81) zastosowano szczep MS wirusa opryszczki 2 (HSV-2, z ATCC, Rockville, MD; numer VR-540).

Komórki Vero hodowano z zastosowaniem 6 x 10⁵ komórek w 1,8 ml pożywki na płytce 35 mm lub 3 x 10⁵ komórek w 0,8 ml pożywki na płytce 16 mm, w DMEM uzupełnionym 5% surowicą krwi z płodu cielęcego, pirogronianem sodowym, L-glutaminą, penicyliną/streptomycyną i 1 mM buforu Hepes, w 37°C, w nawilżanym inkubatorze z zawartością 10% CO2.

Na początku hodowli dodano kontrolną zawiesinę środka powierzchniowo czynnego lub zawiesiny zawierającej alkohole alifatyczne.

Po 24 godzinach do hodowli dodano wirus HSV-2, stosując 175 PFU (jednostek fizjologicznych)/płytkę 35 mm i/lub 50 PFU/płytkę 16 mm.

Po około 42 godzinach od dodania HSV-2 hodowlę przemyto jeden raz roztworem soli fizjologicznej. Komórki utrwalono i zabarwiono metanolem zawierającym kompleks karbol-Fuchsin (1,25 mg/ml) i błękit metylenowy (2,5 mg/ml) i poddano ocenie na ilość płytek.

Uzyskane dane przedstawiają średnią z podwójnych hodowli, które zwykle różnią się o mniej niż 10%, porównanie statystyczne wykonano z zastosowaniem testu Studenta.

Zawiesiny zawierające alkohole alifatyczne C21, C24, C26 lub C28 wykazują hamowanie wytwarzania płytek w komórkach Vero, podobnie jak to się dzieje w przypadku n-dokozanolu (C22).

Typowe wyniki pokazano na fig. 1. ,

Skuteczne stężenia (nM), niezbędne dla 50% hamowania (EC50) wytwarzania płytek przedstawione są w tabeli 1.

189 618

Tabela 1

Hamowanie tworzenia się płytek HSV-2 przez zawiesinę alkoholową

Długość łańcucha węglowego	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM*) 50% hamowania
18	284,6	toksyczny**
20	298,6	toksyczny**
21	312,6	16,0
22	326,6	8,6
24	354,6	14,1
26	382,6	8,4
28	410,6	10,5

*) ··)

Procent hamowania tworzenia płytek przez HSV-2 dodanego do komórek Vero zmierzono po 20 godzinach inkubowania komórek ze wskazanym alkoholem o różnych stężeniach i sporządzono wykres hamowania jako funkcję stężenia alkoholu. Stężenie alkoholu wymagane dla 50% hamowania oznaczono metodą regresji liniowej

Określenie „toksyczny” oznacza, że pojedyncza warstwa komórek została zniszczona na końcu okresu 12-to godzinnej hodowli z zawiesiną zawierający co najmniej 1,5 mM alkoholu. Odnotowano nie toksyczne stężenia o nieznaczącej aktywności przeciwwirusowej

Nie stwierdzono oczywistego wpływu długości łańcucha na hamowanie formowania płytek HSV-2. Wszystkie alkohole C-21 do C-28 hamowały tworzenie się płytki i żaden ze związków nie wykazywał znacząco większej aktywności niż C-22. Związek z dodatkowym łańcuchem, heneikozanol (C-21) także hamował tworzenie płytek przez HSV-2, wykazując, że nie ma oczywistego wpływu długości łańcucha (np. nieparzyste cząsteczki łańcucha funkcjonują tak dobrze, jak nieparzyste). Zawiesiny alkoholu stearylowego (C-18) i alkoholu arachidylowego (C-20) były toksyczne dla komórek Vero, gdy dodano je w ilościach umożliwiających obserwację aktywności przeciwwirusowej n-dokozanolu. W stężeniach, które nie były cytotoksyczne (0,2 dla alkoholu stearylowego i 2 μΜ dla alkoholu arachidylowego) równe stężenia alkoholi alifatycznych C-18 i C-20 wykazały brak hamowania wytwarzania płytek. Kontrolne zawiesiny środka powierzchniowo czynnego bez alkoholu alifatycznego nie były cytotoksyczne i nie wykazywały działania przeciwwirusowego.

Przykład 2

Wpływ zwiększenia ilości środka powierzchniowo czynnego w stosunku do alkoholu alifatycznego

Wpływ na działanie przeciwwirusowe zwiększenia stosunku (wagowego) środka powierzchniowo czynnego w stosunku do alkoholu alifatycznego, przedstawiono z zastosowaniem zwiększonych stosunków PLURONIC F-68® do n-dokozanolu (w porównaniu do przykładu 1, w którym użyto środek powierzchniowo czynny i alkohol w stosunku 1:1 (wagowo)). Zawiesina 1:1 ma stosunek cząsteczkowy n-dokozanolu (m. cz. 326,57) do środka powierzchniowo czynnego (m. cz. 8400) wynoszący 26:1. Zwykle, wzrost ilości środka powierzchniowo czynnego powoduje zmniejszenie wymiaru cząstki w zawiesinie i powoduje tworzenie się raczej niniejszych pęcherzyków jednopłytkowych niż wielopłytkowych (Sandra, A. i R. E. Pagano, J. Biol Chem. 254: 2244-2249, 1979). To powoduje, że więcej alkoholu występuje na powierzchni cząsteczki, gdzie jest on dostępny do interakcji z komórkami.

Zawiesiny n-dokozanolu wytworzono zasadniczo jak opisano w przykładzie 1, przy użyciu stałych ilości alkoholu, lecz przy wzrastającej ilości środka powierzchniowo czynnego w celu uzyskania stosunku 3:1, 5:1 i 10:1 (wagowo) PLURONIC F-68® do n-dokozanolu w końcowej zawiesinie. Wzrost stosunku środka powierzchniowo czynnego do alkoholu zwiększał przeciwwirusową skuteczność tej zawiesiny w kulturach komórek Vero (fig. 2). To jest zawiesina o stosunku 3:1 środka powierzchniowo czynnego do alkoholu wykazywała większą aktywność przeciwwirusową niż zawiesina o stosunku 1:1 (przy n-dokozanolu >8 mM), zawiesina o stosunku 5:1 wykazywała zwiększoną aktywność przeciwwirusową w porównaniu z zawiesiną o stosunku 1:1 (przy n-dokozanolu > 4 mM) i stosunek 10:1 wyka12

189 618 zywał większą aktywność przeciwwirusową w porównaniu z zawiesiną o stosunku 1:1 (przy n-dokozanolu > 1 mM). Aktywność powierzchniowa zależała od n-dokozanolu w zawiesinie, ponieważ hodowle kontrolne inkubowane w takim samym stężeniu środka powierzchniowo czynnego, dla każdego badanego stosunku, wykazywała zasadniczo brak aktywności przeciwwirusowej (rys. 2B).

Zwiększony stosunek środka powierzchniowo czynnego do alkoholu także wykazywał korelację ze zwiększeniem ilości n-dokanozolu związanego z komórką, jak określono przy użyciu komórek Vero inkubowanych przez 24 godziny z zawiesinami środka powierzchniowo czynnego n-[l-¹⁴C]-dokozanolu. Komórki inkubowane z zawiesinami zawierającymi stosunek 4:1 środka powierzchniowo czynnego do n-dokozanolu łączyły 7,9 x 10-6 gg/komórkę, podczas gdy równoważna kultura inkubowana z zawiesiną o stosunku 1:1 łączyła 3,1 x 10-6 gg/komórkę. Optymalne działanie przeciwwirusowe n-dokozanolu uzyskano z zawiesinami 0 stosunkach środka powierzchniowo czynnego do alkoholu około 4:1 do 5:1 (wagowo).

Aktywność przeciwwirusową związków alifatycznych nie jest właściwością unikalnej kombinacji związku alifatycznego i szczególnej zawiesiny niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Inne detergenty również wytwarzają skuteczne przeciwwirusowe zawiesiny alkoholu alifatycznego. Zawiesiny n-dokozanolu z niejonowym detergentem oktoksynolem (TRITON Χ-100®, Rohm & Haas) sporządzano przez a) rozpuszczanie 2,5 g n-dokozanolu z 1,5 g detergentu w 90°C, b) mieszanie rozpuszczonego roztworu z 500 ml soli w 90°C i 1,15 g poliwinylopirolidonu (PVP), c) przetwarzanie gorącej mieszaniny przez mikrofluidyzer przy 1300 psi przez 5 cykli i d) ultrafiltrację przetworzonej mieszaniny przez kasetę o wydrążonych włóknach w celu eliminacji nadmiaru detergentu i PVP. Zawiesina detergentu kontrolnego była przygotowana w podobny sposób z wyjątkiem tego, że pominięto n-dokozanol. Zawiesiny n-dokozanolu w dezoksycholanie (stosunek środka powierzchniowo czynnego do alkoholu 1:1, wagowo) były przygotowywane zasadniczo jak opisano powyżej.

Zarówno zawiesiny oktoksynolowe, jak i dezoksyholanowe n-dokozanolu hamowały płytki HSV-2 w teście komórek Vero. Typowe wyniki przedstawiono na fig. 3. Zawiesina oktoksynol/n-dokozanol hamowała formowanie płytek względem oktoksynolu jako kontroli, przy stężeniach n-dokozanolu większych lub równych 2 mM przy EC50 około 4,5 mM. Niejonowy środek powierzchniowo czynny używany do wytworzenia zawiesiny alkoholu alifatycznego nie wpływa na przeciwwirusową aktywność zawiesiny.

Zwiększający się stosunek środka powierzchniowo czynnego do n-dokozanolu znacząco zwiększał aktywność przeciwwirusową zawiesiny. To jest, ilość n-dokozanolu w zawiesinie konieczna do zahamowania wzrostu na płytkach o 50% uległa zmniejszeniu (np. z 15 mM do 3 mM).

Przykład 3

Aktywność przeciwwirusową alkanu alifatycznego/n-dokozanu

Zawiesinę środek powierzchniowo czynny/n-dokozan (Sigma Chemical Co.) otrzymano sposobem według przykładu 1. Aktywność przeciwwirusową porównywano z zawiesiną środek powierzchniowo czynny/n-dokozanol, z zastosowaniem testu z komórką Vero, dla pomiaru hamowania tworzenia się płytek HSV-2, zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 1. Jak to pokazano na fig.4, zawiesina środek powierzchniowo czynny/n-dokozan hamowała wytwarzanie płytek przez HSV-2 hodowli komórek Vero w stopniu odpowiadającym krzywej podobnej do tej dla zawiesiny środek powierzchniowo czynny/n-dokozanol. Zawiesiny wPLURONIC F-68® dokozanolu (a) i n-dokozanie (Δ) hamowały tworzenie się płytek wirusa HSV-2 w hodowli komórek Vero, inkubowanej z zawiesinami przez 12 godzin przed dodaniem HSV-2. Kontrolne zawiesiny środka powierzchniowo czynnego wykazały brak aktywności przeciwwirusowej (wyników nie pokazano). Tak więc, zarówno alkohol alifatyczny C22 jak i alkan ujawniły porównywalną aktywność przeciwwirusową, wykazując że grupa hydroksylowa nie jest konieczna dla ich aktywności, jak to zmierzono przez hamowanie tworzenia się płytek wirusowych.

Przykład 4

Utlenianie grupy 1-hydroksylowej n-dokozanolu powodujące cytotoksyczność

Wytworzono zawiesinę niejonowy, detergentowy środek powierzchniowo czynny/kwas n-dokozanowy (Sigma Chemical Co.) i testowano jej aktywność przeciwwirusową z zastoso189 618 waniem komórek Vero i HSV-2, w sposób opisany w przykładzie 1. Kwas tłuszczowy C22 wykazywał toksyczność w stosunku do komórek Vero, gdy stosowano go w stężeniu równoważnym do tego, przy którym występowało hamowanie wirusowe z n-dokozanolem (patrz tabela 2).

Gdy zawiesiny kwasu n-dokozanowego przy 4 mM do 15 mM były dodawane do hodowli, komórki stawały się okrągłe i odczepiały się od podłoża. Przy możliwych do zaakceptowania stężeniach kwasu n-dokozanowego (< 2 mM), aktywność przeciwwirusowa była mniej więcej równa aktywności obserwowanej z zawiesinami n-dokozanolu 4 do 15 mM. I tak, kwas tłuszczowy C-22 wykazuje pewną aktywność przeciwwirusową w rozcieńczeniach tolerowanych przez komórki, lecz posiada zwiększoną cytotoksyczność w porównaniu z odpowiednim alkoholem alifatycznym.

Tabela 2

Procentowe hamowanie tworzenia się płytek”)

Mm*	Dokozanol	Dokozan	Kwas dokozanowy	Alkohol erucylowy	Alkohol brazydylowy
15	66	58	toksyczny^	toksyczny	ND
8	44	55	toksyczny	toksyczny	48
4	36	42	toksyczny	toksyczny	44
2	40	31	30	toksyczny	35
1	14	28	16	93	27
0,5	NDJ	ND	26	91	ND
0,25	ND	ND	ND	70	ND

Stężenia mM n-dokozanolu (m. cz. 326,6), n-dokozanu (m. cz. 310,6), kwas n-dokozanowego (m. cz. 340,6) i alkoholu erucylowego (m. cz. 324,6) w zawiesinie z PLURONIC F-69® (m. cz. 8.400) i alkoholu brazydylowego (m. cz. 324,6) w zawiesinie z TETRONIC- 908® (m. cz. 25000) w hodowlach komórek Vero w 12 godzin przez dodaniem wirusa SHV-2, z wyjątkiem zawiesin alkoholu erucylowego i brazydylowego, które zostały dodane w tym samym momencie co wirus /Toksyczny” oznacza, że monowarstwa komórkowa została zniszczona w przeciągu 24 godzin po dodaniu zawiesiny o stężeniu alkoholu lub kwasu tłuszczowego podanym w kolumnie pierwszej j„ND” oznacza „nie określono”

Hamowanie tworzenia płytki określono względem infekcji kontrolnej komórek Vero, do których nie podawano żadnej zawiesiny. Inną kontrolą była zawiesina środka powierzchniowo czynnego, do którego nie dodano składnika aktywnego, zawiesina ta następnie podana do zainfekowanych komórek Vero, wykazała 5% lub mniejesze hamowanie względem infekcji wirusowych komórek Vero, do których zawiesina została dodana

Przykład 5

Aktywność przeciwwirusowa mononienasyconych alkoholi alifatycznych C22

Wytworzono zawiesinę środek powierzchniowo czynny/alkohol erucylowy (cis-13-dokozen-1-ol, Sigma Chemical Co.) i testowano jej aktywność przeciwwirusową z zastosowaniem komórek Vero i HSV-2, w sposób opisany w przykładzie 1, w celu określenia działania wiązania nienasyconego w łańcuchu węglowodorowym. Zawiesina środek powierzchniowo czynny/alkohol erucylowy wykazywała toksyczność w stosunku do komórek Vero po dodaniu jej do hodowli, przy stężeniach przy których n-dokozanol był skuteczny (2-15 mM). Jednakże, jak to pokazano w tabeli 2, stężenia tolerowane przez komórki (< 1 mM) wykazują znaczące hamowanie wytwarzania płytek HSV-2 (do 93%). Ponadto, nie obserwuje się toksyczności komórkowej przy stężeniu alkoholu erucylowego wynoszącym 1 mM. Skuteczne stężenie potrzebne dla 50% hamowania tworzenia się płytki, w przypadku alkoholu erucylowego (EC50 = 0,15 mM) było 60 razy niższe od stężenia potrzebnego w przypadku n-dokozanolu (ECĘo = 9 mM). Tak, więc indeks terapeutyczny jest większy od 6,7 lub równy tej wartości (to znaczy 1 mM/0,1 mM).

Podobnie określono aktywność przeciwwirusową izomeru trans alkoholu mononienasyconego C-22, alkoholu brazydylowego (trans 13-dokozen-1-ol). Zawiesiny wytworzono z innym niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym, TETRONIC-908® (BASF)

189 618 i przeprowadzono testy hamujące namnażanie się wirusów używając zamiast HSV-2 HSV-1, stosując procedury zasadniczo opisane w przykładzie 1. Jak przedstawiono w tabeli 2, alkohol brazydylowy wykazuje skuteczność przeciwwirusową podobną do n-dokozanolu. Toksyczność komórkowa alkoholu brazydylowego była znacznie mniejsza niż alkoholu eurycylowego.

W oparciu o te wyniki, dodatek w pozycji 13 jednego wiązania podwójnego o konfiguracji cis (a nie trans), w alkoholu alifatycznym C-22 znacznie zmieniał aktywność przeciwwirusową. Alkohol z podwójnym wiązaniem w konfiguracji trans był mniej toksyczny niż alkohol o konfiguracji cis. Zwiększona cytotoksyczność może być wynikiem zagięcia cząsteczki spowodowanego przez podwójne wiązanie o konfiguracji cis.

Zawiesiny środka powierzchniowo czynnego/alkoholu eurycylowego nie wykazują bezpośredniego działania wirusobójczego. To jest, inkubacja wirusa HSV-2 z zawiesiną środka powierzchniowo czynnego/alkoholu eurycylowego przez 2 godziny nie inaktywuje wirusa, jak stwierdzono na podstawie tworzenia płytek przez komórki Vero.

Przykład 6

Testowanie amidu kwasu erukowego w hodowlach komórek ssaka

Amid kwasu erukowego (cis-13-dokozenoamid, m. cz. = 337,59) jest amidem o długim łańcuchu C22 z pojedynczym wiązaniem podwójnym, o budowie podobnej do alkoholu erucylowego. Zawiesinę niejonowy, detergentowy środek powierzchniowo czynny/amid kwasu erukowego (Aldrich Chemical Co.) wytworzono z zastosowaniem preparatu TETRONIC-9O8® i testowano jej aktywność przeciwwirusową z użyciem komórek Vero i HSV-2, w zasadzie podobnie jak to opisano w przykładzie 1. Amid C22 użyty w stężeniach 3 mM lub wyższych wykazywał toksyczność wobec komórek „Vero”, podobną do toksyczności wykazywanej przez alkohol erucylowy i kwas n-dokozanowy (patrz tabela 2). Gdy zawiesiny amidu kwasu erukowego o stężeniach od 3 mM do 15 mM dodano do hodowli, komórki stały się obłe i oddzieliły się od płytki. W niższych stężeniach amidu kwasu erukowego w zawiesinie obserwowano znaczący efekt przeciwwirusowy. W tolerowanych stężeniach amidu kwasu erukowego (< 1,7 mM) przeciwwirusowa aktywność zawiesiny amidu kwasu erukowego była niniejsza niż zasadniczo równoważnych stężeń zawiesin alkoholu erucylowego, lecz większa niż zawiesin n-dokozanolu, n-dokozanu, kwasu n-dokozanowego lub alkoholu brazydylowego. To jest, procent hamowania tworzenia się płytki dla zawiesin amidu kwasu erukowego wynosił 78% przy 1,7 mM; 68% przy 1,5 mM; 58% przy 1,2 mM; 44% przy 0,59 mM i 34% przy 0,03 mM. Zatem, amid C-22 wykazuje znaczną aktywność przeciwwirusową w rozcieńczeniach tolerowanych przez komórki lecz posiada zwiększoną cytotoksyczność względną wobec nasyconego alkoholu alifatycznego z odpowiednim mononienasyconym alkoholem erucylowym C-22.

Przykład 7

Cytotoksyczność w hodowlach komórek ssaka n-Dokozanol wykazuje minimalną cytotoksyczność w stosunku do hodowanych komórek, nawet przy przedłużonym okresie inkubowania. Stosowano trzy testy dla ilościowego określenia oddziaływania alkoholi alifatycznych na przetrwanie i rozmnażanie się komórki:

1) liczenie komórek przy pomocy hemocytometru i oznaczanie komórek które eliminuje błękit trypanowy;

2) pomiar wprowadzenia ³H-tymidyny do komórkowego DNA, przez dodanie 'ΊΜνιηίdyny (z firmy New England Nuclear) do pożywki hodowlanej, lizowanie komórek wodą i zbieranie dNa na papierze filtracyjnym; oraz

3) pomiar całkowitej ilości białka komórkowego przy zastosowaniu testu sulforodaminowego przystosowanego do użycia na płytkach do mikromiareczkowania z 96 zagłębieniami (Skehan P. i inni L Nati. Cancer Inst. 82, 1107-1112, 1990). Wszystkie te sposoby są dobrze znanymi testami żywotności komórki i cytotoksyczności.

Badania komórek obejmowały komórki Vero (patrz przykład 1), WI-38, ludzkie embrionalne diploidalne linie komórek płuc (ATCC nr CCL 75), HFL1, ludzką płodową linię komórek diploidalnych płuc (ATCC nr CCL 153) oraz ludzką płodową skórę (ATCC nr 1635). Linię komórek myszy B hybrydoma (oznaczoną MBI-9) skonstruowano i hodowano jak opisano uprzednio (Marcelletti, J. F. i wsp. J. immnnol. 148: 3857-3863, 1992) pomimo, że inne linie guza i hybrydoma, takie jak dowolna z ATCC TIB lub HB mogłyby również być stoso189 618 wane określania wpływu na proliferację komórek, związków alifatycznych w zawiesinach. Wszystkie komórki były hodowane w DMEM uzupełnionym 10% osoczem płodu cielęcego, pirogronianem sodu, L-glutaminą i penicyliną/streptomycyną przy użyciu sposobów dobrze znanych w literaturze. Zawiesiny alkoholi alifatycznych przygotowano zasadniczo jak opisano w przykładzie 1.

Przy użyciu pierwszego testu, komórki Vero (z nerki małpy zielonej) hodowano do 72 godzin w obecności 9 mM n-dokozanolu obecnego w zawiesinach środka powierzchniowo czynnego bez obserwowanego niekorzystnego efektu, gdy hodowle były wysiane przy 6 x 10⁵ komórek na 0,8 ml pożywki na dołek o średnicy 16 mm. Tabela 3 przedstawia typowe dane, wykazujące, że całkowita liczba zdolnych do życia komórek Vero i fibroblastów skóry nie zmieniła się po 24 do 72 godz. inkubacji z zawiesiną alkoholu alifatycznego. Inne badane linie komórkowe, włącznie z normalnymi fibroblastami skóry (ATCC CRL 1900), komórki płuc WI-38, ludzkie komórki płodowe płuc i hybrydoma komórek B wykazywały podobną zdolność do życia w obecności zawiesiny n-dokozanolu, jeśli komórki były wysiane we względnie dużych gęstościach. Zawiesiny kontrolne środka powierzchniowo czynnego bez alkoholu alifatycznego także nie wykazały cytotoksyczności dla komórek Vero, lecz wykazywały zależną od czasu cytotoksyczność względem komórek skóry płodowej, która nie była obserwowana w przypadku zawiesiny zawierającej alkohol. Dla linii komórek skóry płodowej, dodatek alkoholu alifatycznego wyraźnie zmniejszał działanie cytotoksyczne środka powierzchniowo czynnego.

Tabela 3

Żywotność komórki po ekspozycji na działanie zawiesin środka powierzchniowo czynnego z n-dokozanolem lub bez niego

		Komórki Vero	Komórki napletka płodowego
Terapia’)	Czas inkubacjj(h)	Liczba komórek żywotnych’’	% w stosunku do próby kontrolnej	Liczba komórek żywotnych	% w stosunku do próby kontro-nej’
n-dokozanol + środek powierzchniowo czynny	24	7,48 x 105	101	2,41 x 105	131
n-dokozanol + środek powierzchniowo czynny	48	8,69 x 105	137	2,78 x 105	118
n-dokozanol + środek powierzchniowo czynny	72	8,61 x 105	120	2,72 x 105	118
Środek powierzchniowo czynny	24	7,10 x 105	95,7	1,55 x 105	84
Środek powierzchniowo czynny	48	7,20 x 105	107	1,66 x 105	70
Środek powierzch- nizwn c^tdv .— _ —	72	6,60 x 105	89,0	1,00 x 105	43

*) Komórki Vero lub komórki napletka płodowego inkubowano z 9 mM n-dokozanolem w postaci zawiesiny w 1,4 mM w środku powierzchniowo czynnym lub inkubowano z pożywką zawierającą 1,4 mM środka powierzchniowo czynnego. Stosunek środka powierzchniowo czynnego do n-dokozanolu wynosił w zawiesinie 4:1 (wagowo) **) Po podanym czasie inkubowania, komórki zadano trypsyną i liczbę komórek żywotnych oznaczonych przez eliminację błękitem trypanowym ***) Próbki kontrolne inkubowano w obecności tylko pożywki

189 618

Pomimo, że linie komórkowe pozostawały nieprzepuszczalne dla błękitu trypanu nawet po 72 godz. inkubacji z n-dokozanolem, normalne fibroblasty skóry, komórki WI-38 i ludzkie komórki płuc płodu wykazywały wykrywalną zmianę morfologii przy badaniu za pomocą mikroskopu świetlnego. Po 72 godz. inkubacji z zawiesinami alkoholu, liczne przejrzyste pola pojawiły się w cytoplazmie komórek i komórki wyglądały na zwakuolizowane. Komórki testowane kontrolnym środkiem powierzchniowo czynnym po 72 godz. inkubacji nie były zwakuolizowane.

W przeciwieństwie do braku cytotoksyczności generalnie obserwowanej w przypadku zawiesin n-dokozanolu, zawiesiny alkoholu stearylowego (C-18) i arachidylowego (C-20) były ekstremalnie cytotoksyczne dla wszystkich badanych linii komórkowych. W obecności tych _ alkoholi alifatycznych C-18 i C-20, komórki rosną w pojedynczej warstwie odłączone od płytki i ulegają lizie. Takie zawieszone komórki ulegają lizie, jeśli zostaną poddane działaniu zawiesiny alkoholu arachidowego i alkoholu stearydowego.

Zdolność do życia jest obliczona w różnych liniach komórkowych przez pomiar włączania ³H-tymidyny do DNA lub przez pomiar całkowitego stężenia białka komórkowego stosując barwienie sulforodaminą B. Typowe wyniki są przedstawione na fig. 5. przedstawiającej hamowanie włączania 3H-tymidyny do DNA hybrydoma komórek B w różnych stężeniach alkoholi alifatycznych C-18, C-2o i C-22. Wartość IC50 dla alkoholu stearylowęgo (C-18) dla linii komórek B i innych linii komórkowych była mniejsza niż 35 μΜ, a dla alkoholu arachidylowego (C-20) wynosiła około 1,7 mM. Wręcz przeciwnie, wartość IC50 dla n-dokozanolu wyznaczona przez ekstrapolację wynosi około 20 mM i jest większa niż obserwowana dla samego środka powierzchniowo czynnego. Zatem, stwierdzono około 50-krotny spadek LC50, jeśli alkohol alifatyczny C-20 został skrócony o dwa węgle.

Dane przedstawione na fig. 5 uzyskano po 48 godz. inkubacji z zawiesinami, jednakże już w ciągu 24 godz. inkubacji widoczna była toksyczność. Zawiesiny heneikozanolu (C-21) i zawiesiny alkoholi o dłuższych łańcuchach, alkoholu lignocerylowego* (C-24), n-heksanozolu (C-26) i n-oktanozolu (C-28) wykazały taki sam minimalny poziom cytotoksyczności, jak obserwowano w przypadku zawiesin n-dokozanolu.

Skutki działania zawiesin n-dokozanolu i n-dokozanu na proliferację komórek (cytostaza) obliczono stosując test barwienia sulforodaminą na hodowlach ludzkich fibroblastów skóry inkubowanych na płytkach mikrotitracyjnych 96-dołkowych. Wyniki przedstawione na rys. 6A i 6B wykazują, że działanie hamujące zawiesiny n-dokozanolu in vitro zależało od początkowej gęstości komórek w hodowli, podczas gdy zawiesiny n-dokozanu nie wykazywały znaczących działań antyproliferacyjnych w porównaniu z zawiesiną kontrolną środka powierzchniowo czynnego, w hodowli o dowolnej gęstości komórek. Wyniki przedstawione na fig. 7 wykazują, że komórki, które weszły w kontakt z zawiesiną n-dokozanolu wykazywały większe zahamowanie proliferacji w zależności od całkowitego okresu inkubacji. To jest, dłuższa inkubacja powodowała większe zahamowanie proliferacji komórek.

Fibroblasty skóry były umieszczane na płytkach z lub bez zawiesin alkoholi alifatycznych lub kontrolnej zawiesiny środka powierzchniowo czynnego przy 1000 komórek (fig 6A i 7) lub 30000 komórek (fig. 6B) na płytkach do mikromiareczkowania o 96 dołkach. Po inkubacji przez 72 godz. lub 96 godz. w 37°C, komórki wytrącano za pomocą kwasu trójchlorooctowego, barwiono sulforodaminą i liczono w płytkowym czytniku przez pomiar OD540. Fig. 6 przedstawia wyniki otrzymane dla komórek otrzymanych po 72 godz. w porównaniu z 96 godz.

Zawiesiny o stężeniu n-dokozanolu wyższym niż 3 mM hamowały proliferację komórek na płytkach zawierających po 1000 komórek/dołek, badanych po 96 godz. inkubacji (fig. 6A). w przeciwieństwie do tego, zawiesina alkoholu c-22, n-aokozanu wykazywała minimalny wpływ antyproliferacyjny w porównaniu z kontrolnym środkiem powierzchniowo czynnym (fig. 6A). Przy wyższych początkowych gęstościach komórek (fig. 6B) lub krótszym czasie inkubacji lub przy stężeniach niższych niż 3 mM, n-dokozanol nie hamował proliferacji komórek w porównaniu z kontrolą (sam środek powierzchniowo czynny w zawiesinie). Podobne wyniki obserwowano, gdy komórki WI-38, ludzkie płodowe komórki płuc i normalne fibroblasty skóry inkubowano z n-dokozanolem, przy użyciu tego samego testu proliferacji, jak opisano dla fig. 6 i 7. Zawiesiny zawierające alkohole alifatyczne dłuższe niż C-20 wykazują

189 618 niewielką toksyczność komórkową. Widoczny wpływ cytostatyczny obserwowano jedynie, jeśli komórki umieszczono na płytkach w większych gęstościach i inkubowano z n-dokozanolem o stężeniu wyższym niż 3 mM, przez 72 lub więcej godzin. Zawiesiny kontrolne bez alkoholu alifatycznego nie wykazywały działania cytostatycznego. Długość łańcucha alkoholu alifatycznego wpływała na jego toksyczność komórkową, w przeciwieństwie do wyników przedstawionych w przykładzie 1, ukazującym brak widocznego wpływu długości łańcucha na aktywność przeciwwirusową. Obliczone wartości IC50 zmniejszały się od powyżej 15 mM dla alkoholi C-22 lub C-21 do 1,5 mM dla alkoholi C-20 do poniżej 35 jxM dla alkoholu C-18. Znaczący wzrost toksyczności alkoholu alifatycznego o długości łańcucha C-18 był nieoczekiwany.

Przykład 8

Przeciwwirusowa aktywność kompozycji kwasu stearynowego

Mierzono aktywność przeciwwirusową i cytotoksyczność kwasu stearynowego (m. cz. 284,5) rozpuszczonego w etanolu lub w zawiesinie w preparacie TETRONIC-908 , zasadniczo sposobem opisanym w przykładzie 1. Aktywność przeciwwirusową mierzono jako wyrażone w procentach hamowanie tworzenia się płytek HSV-2 w hodowli komórek Vero, prowadzonej w sposób opisany w przykładzie 1. Cytotoksyczność badano przez kontrolę mikroskopową komórek, oceniając wzrost i integralność płytek hodowlanych w porównaniu z hodowlami kontrolnymi, na które nie działano kompozycją. Jako niedostrzegalną toksyczność określano warstwy jednorodne komórek, na które działano kompozycją i które były nierozróżnialne z komórkami, na które nie działano kompozycją. Umiarkowana toksyczność określano jako rozcieńczenie warstwy jednorodnej komórek, w porównaniu do hodowli kontrolnych. Toksyczność określano jako stężenia, przy których warstwa jednorodna komórek, na którą działano kompozycją została uszkodzona, co uwidoczniało się oderwaniem się komórek od płytki hodowlanej. Nie obserwowano widocznej toksyczności w przypadku 11 pM i 22 μΜ zawiesiny kwasu stearynowego w Tetronic 908 i 3,5 pM roztworu kwasu stearynowego etanolu. Wszystkie te procedury wykazały mniejsze niż 10% hamowanie formowania płytki HSV-2 względem zainfekowanych komórek kontrolnych. Po zastosowaniu zawiesiny 44 pM kwasu stearynowego w Tetronic 908 i 35 pM roztworu kwasu stearynowego w etanolu obserwowano średnią toksyczność; aktywność przeciwwirusową nie mogła być zmierzona ze względu na stan komórek. Zawiesiny i roztwory 88 pM i 350 jXM kwasu stearynowego były toksyczne i aktywność przeciwwirusową nie mogła być określona, ponieważ warstwa komórek została zniszczona.

Przykład 9

Aktywność przeciwwirusową kompozycji zawierającej n-dokozanol lub kwas stearynowy, stosowanej miejscowo na modelu zwierzęcym .

Aktywność przeciwwirusową kompozycji zawierających kwas stearynowy potwierdzono in vivo na modelu zakażenia HSV-2 świnki morskiej. Nieowłosione świnki morskie (sześć samców na jeden test, każdy o wadze 200-300 g, z Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) znieczulono i zaszczepiono HSV-2 (szczep ATCC VR-540, hodowany w komórkach Vero i oczyszczany z zastosowaniem metod standardowych). Od dnia 0 każde zwierzę szczepiono w sześciu miejscach szczepienia na boku na obszarze 4 cm2, przy użyciu 75 p1 roztworu soli fizjologicznej zawierającej 9,75 x 106 PFU/ml. Zaczynając od 24 godzin po zaszczepieniu (dzień 1) zwierzęta trzy lub pięć razy dziennie leczono miejscowo kremami opisanymi poniżej lub wodą jako negatywną próbą kontrolną i kontynuowano leczenie w ten sam sposób przez 2, 3 i 4 dni. W trakcie 2, 3 i 4 dnia miejsca leczone badano na występowanie podrażnienia skóry i tworzenia się pęcherzy. Podrażnienia oceniano w skali od 0 do 4: 0 dla skory normalnej bez rumienia; 1 dla łagodnego rumienia; 2 dla średniego rumienia; 3 dla ostrego rumienia; i 4 dla ostrego rumienia z towarzyszącym krwawieniem. Pęcherze definiowano jako białe krosty napełnione płynem.

Kompozycjami do miejscowego stosowania były: krem zawierający n-dokozanol, krem zawierający kwas stearynowy i placebo. Krem z n-dokozanolem zawierał 10% (wagowo) n-dokozanolu (Michel and Co, New York, NY, USA); 5% (wagowo) stearynianu sacharozy (Croda, Inc., New York, NY, USA); 8% (wagowo) oleju uniwersalnego NF (Witco Corp., Newark, NJ), 5% (wagowo) glikolu propylenowego USP; 2,7% (wagowo) alkoholu benzylowe18

189 618 go (Ruger Chemical Co, Irvington, NJ); i 69,3% oczyszczonej wody USR Oba kremy przygotowano w następujący sposób: wszystkie składniki z wyjątkiem wody zmieszano i podgrzano do 80°C, a następnie składniki zostały wymieszane z prędkością 400 ± 5 obrotów/min. (przy użyciu mieszadła Heidolph RZR 2051), do których w temperaturze 85°C dodano wodę jednocześnie zwiększając obroty do 1900 ± 5 obr/min. Po 3 min. w temperaturze 80°C mieszaninę pozostawiono do schłodzenia, ciągle mieszając do temperatury 30°C (około 8 min.). Placebo wytworzono przez ogrzewanie 70% glikolu polietylenowego (PEG) 400 NF i 30% PEG 3350 NF do 65°C do momentu, gdy PEG 3350 rozpuścił się całkowicie, następnie mieszaninę poddawano mieszaniu z prędkością 400 obr./min. do chwili osiągnięcia przez tę mieszaninę temperatury 30°C.

Wyniki testów zestawiono w tabeli 4. Oznaczenia w dniu 2 wykonano po 48 godzinach po posiewie, w dniu 3-72 godziny po posiewie (całkowita ilość 6 miejsc/oznaczenie). Jak można zauważyć w tabeli 4, w 2 dniu żaden krem nie wpływał znacznie na liczbę pęcherzyków porównaniu z grupą kontrolną traktowaną wodą i wszystkie miejsca wykazywały brak podrażnienia. W dniu 3 miejsca leczone n-dokozanolem, wykazywały znaczne zmniejszenie pojawiania się pęcherzyków w stosunku do grupy kontrolnej traktowanej wodą. Wydaje się, że 3 dawki dziennie kremu z n-dokozanolem są wystarczające, ponieważ 5 dawek dziennie daje zasadniczo taki sam stopień zmniejszenia liczby pęcherzyków. W trzecim dniu miejsca leczone kremem z kwasem stearynowym wykazywały umiarkowane zahamowanie pęcherzyków w porównaniu z grupą kontrolną traktowaną wodą, podczas gdy miejsca leczone 5 razy dziennie wykazywały statystycznie znamienne zahamowanie pojawiania się pęcherzyków. Zastosowanie placebo z PEG 5 razy dziennie nie zmieniało istotnie liczby pęcherzyków w porównaniu z grupą kontrolną traktowaną wodą w jakimkolwiek czasie.

Trzeciego dnia obserwowano pewne podrażnienie, zarówno w przypadku kremu z n-dokozanolem, jak i kwasem stearynowym. W dniu czwartym leczenie trzy razy dziennie kremem z n-dokozanolem znacząco obniżało liczbę pęcherzyków w porównaniu z grupą kontrolną, mimo, iż obserwowano nieznaczne podrażnienie. W dniu 4 leczenie 5 razy dziennie kremem z n-dokozanolem lub z kwasem stearynowym znacząco obniżało liczbę pęcherzyków w porównaniu z grupą kontrolną i placebo, mimo, że obserwowano nieznaczny rumień po podaniu obu preparatów.

Wyniki badań in vivo wykazują, że leczenie miejscowe infekcji HSV-2 kremami zawierającymi n-dokozanol jako substancję czynną lub kwas stearynowy jako substancję czynną może znacząco ograniczyć liczbę pęcherzyków spowodowanych infekcją. Krem zawierający n-dokozanol jako substancję czynną wydaje się bardziej skuteczny w leczeniu infekcji wirusowych, ponieważ znaczne ograniczenia liczby pęcherzyków były obserwowane przy jedynie 3 dawkach dziennie potrzeba było do stwierdzenia redukcji liczby pęcherzyków, gdy krem zawierał tylko kwas stearynowy jako substancję czynną.

Tabela 4

Leczenie miejscowe HSV-2 na modelu świnki morskiej

Leczenie	Liczba pęcherzy	Ocena podrażnienia
Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 4
Woda	45	34	19	0	0	0
n-Dokozanol (3 x /dzień)	40	12	3	0	1,2	0,8
n-Dokozanol (5 x /dzień)	43	5	3	0	1,3	1,3
Kwas stearynowy ( 3x /dzień)	49	17	11	0	1,2	0,8
Kwas stearynowy (5 x /dzień)	49	13	5	0	1,7	2
Placebo (5 x /dzień)	41	30	15	0	0	0

189 618

Przykład 10

Miejscowe leczenie oparzeń

Zastosowano model mysi miejscowego zapalenia skóry (oparzenie) w celu przetestowania skuteczności terapeutycznej miejscowo stosowanych kremów zawierających 5% w/w stearynian sacharozy i posiadających substancje aktywne: kwas stearynowy (5%, 10% i 20% w/w) lub n-dokozanol (10% i 12% w/w) w porównaniu z nie leczonymi zwierzętami kontrolnymi lub myszami leczonymi maścią PEG z placebo. Kremy i maść z placebo przygotowano zasadniczo jak opisano w przykładzie 9. W każdej badanej grupie ogolono brzuchy myszy CAF-1 i zastosowano mieszaninę fenolu i chloroformu (1:1 v/v zawierającą 0,2% merkaptoetanol nasycony buforem IM Tris, pH = 8) na 2 obnażone miejsca u każdej myszy (5 μΐ/miejsce o powierzchni około 5-8 mm²) i wysuszono powietrzem. Na miejsca oparzeń zastosowano krem lub maść z placebo po 0,5, 3 i 6 godzinach po zastosowaniu mieszaniny chloroformu i fenolu i oceniano po 8 godzinach po zastosowaniu mieszaniny fenolu i chloroformu. Miejsca oparzeń oceniono numerycznie jak następuje: 0 dla skóry normalnej, 1 dla lekkiego zapalenia, 2 dla skóry czerwonej, 3 dla skóry bardzo czerwonej z czerwonym marginesem wokół miejsca i 4 dla owrzodzenia. Większe lub mniejsze nasilenie tych ocen numerycznych oceniono jako wzrost lub spadek od 0,33 do 0,5. Wyniki tych testów są zestawione w tabeli 5.

Tabela 5

Skuteczność terapeutyczna kremów zawierających n-donozanol albo kwas stearynowy w leczeniu oparzeń wywołanych fenolem

Leczenie	Liczba miejsc	Średni wynik
Brak	6	4,1
Maść z placebo	2	4,2
Krem zawierający 10% n-dokozanolu	4	0,9
Krem zawierający 12% n-donozanolu	4	1,0
Krem zawierający 10% kwasu stearynowego	2	2,7
Krem zawierający 10% kwasu stearynowego	4	2,1
Krem zawierający 10% kwasu stearynowego	4	1,7

Te wyniki ukazują, że leczenie oparzeń kremami zawierającymi kwas stearynowy i n-donozanol znacznie ogranicza natężenie uszkodzeń w porównaniu z grupą kontrolną leczoną placebo, która wykazywała ciężki rumień lub owrzodzenie. Terapeutyczne korzyści z leczenia uszkodzeń za pomocą 5%, 10% i 20% w/w kremów kwasu stearynowego były znacznie mniejsze niż leczenie zmian porównywalnymi dawkami 10% lub 12% w/w kremów zawierających n-dokozanol. Zarówno dla kremów zawierających kwas stearynowy, jak i dla kremów zawierających n-dokozanol, obserwowano nieliniowy wzrost efektu terapeutycznego leczonych oparzeń wraz ze wzrostem stężenia substancji czynnych.

Przykład 11

Działanie przeciwwirusowe miejscowo stosowanych kompozycji zawierających n-dokozanol i kwas stearynowy w badaniach klinicznych na ludziach

Działanie przeciwwirusowe kompozycji zawierających kwas stearynowy zostało potwierdzone in vivo w badaniach klinicznych nad leczeniem 648 immunokompetentnych pacjentów, którzy rozpoczęli leczenie w ciągu 12 godzin od wystąpienia miejscowego zakażenia jamy ustnej wirusem herpes (np. początkowy objaw proodromowy, rumień lub krostki, lecz nie pęcherzyki). U tych pacjentów stwierdzano ostre nawroty opryszczki wargowej ze średnim okresem trwania nie leczonych epizodów wynoszącym 8,9 dnia (od początku objawów i/lub rumienią do całkowitego wyleczenia). Ten okres trwania jest zgodny ze zwykłym okresem

189 618 trwania opryszczki wargowej 8 do 10 dni w opublikowanych raportach na temat choroby (R. J. Whitley, Fields Virology at p. 2316).

W tych badaniach pacjenci byli losowani w celu podania im kremów zawierających albo 10% n-dokozanol, albo 10% kwas stearynowy przygotowane zasadniczo jak w przykładzie 9. Pacjenci stosowali krem miejscowo na miejsca zainfekowane wirusem herpes pięć razy dziennie przez minimum pięć dni (25 przepisanych aplikacji z powtórzeniem po intensywnych ćwiczeniach, prysznicu lub kąpieli, powtórzenia nie były liczone jako przepisane aplikacje). Jeżeli infekcja wirusem herpes utrzymywała się po pięciu dniach, pacjent kontynuował stosowanie kremu do 10 dni (50 przepisanych aplikacji). Tylko 20 pacjentów kontynuowało leczenie powyżej 10 dni. Pacjenci prowadzili karły dawkowania i objawów uszkodzeń i swędzenia i byli badani dwa razy dziennie w ciągu okresu leczenia w celu oceny jego skuteczności. Kryteria stosowane do oceny leczenia obejmowały czas wyleczenia, który obejmował zanik objawów (definiowany jako całkowite wyleczenie objawów przed osiągnięciem fazy pęcherzykowej) lub częściowe wyleczenie (definiowane jako nieobecność strupów przy braku objawów aktywnego uszkodzenia z lub bez wtórnych objawów zmian skórnych, jak rumień, łuszczenie się lub asymetria); czas ustąpienia wysiewu wirusów (tylko dla badania nr 1); czas ograniczenia bólu; czas ustąpienia bólu; czas ustąpienia swędzenia i czas do wystąpienia fazy twardego strupa. Dla porównania, stosowano dane pacjentów i opublikowane wyniki (S. L. Spruance et. al., „The Natural History of Recurrent Herpes Simplex Labialis”, New Eng. J. Med. 297: 69-75, 1977). Tabela 6 ukazuje wyniki dwóch niezależnych badań (wskazanych przez cyfry w nawiasach w tabeli). Te dane ukazują, że czas trwania zmian wywołanych przeziębieniem spada znacznie do średnio 5,5 dnia po leczeniu kremem zawierającym n-dokozanol lub kremem zawierającym kwas stearynowy w porównaniu ze średnią 8,9 dnia zmian nie leczonych. I tak, czas trwania był znacznie skrócony o powyżej 35% (P < 0,0001), gdy pacjenci byli leczeni wcześnie kremem z n-dokozanolem lub z kwasem stearynowym. Co więcej, wczesna faza leczenia którymkolwiek kremem skraca czas trwania objawów bólowych związanych z nawracającym zakażeniem wirusem herpes z około 6 dni, gdy choroba jest nie leczona do mniej niż 3 dni dla miejsc leczonych.

Tabela 6

Wyniki badań klinicznych przeprowadzonych na ludziach dotyczące miejscowego leczenia opryszczki wargowej

	Pacjenci leczeni kremem zawierającym n-dokozanol	Pacjenci leczeni kremem zawierającym kwas stearynowy	Nie leczeni0
Czas wyleczenia	(1) 123±4,9	(1) 124±5,2	(1)215±0,4
(godz.§)	(2) 141 ±5 2,2	(2) 143 ±4,0	(2)211±0,4
Zakończenie wysie-	(1)47±2,4	(1)49±1,9	Od 74 do 83*
wu wirusów (godz. §)	(2) ND**	(2) ND
Redukcja bólu	(1)27±2,3	(1)31±3,4	NR**
(godz.5)	(2) 55±4,1	(2) 50 ±3 3,8
Całkowite zniesienie	(1)63±4,4	(1 68±4,5	Od 111 do 178*
bólu (godz.§)	(2) 96± 5,8	(2) 86±5,0
Zniesienie swędzenia	(1 58 ±4,9	(1 51±3,4	NR
z »
(gOUZ.-J	6^3 ±5 2	77 /υ jjO
Faza twardych stru-	(1 61±3,2	(1)62±2,5	NR
pów (godz. §)	(2) 87 ±4,4	(2) 94±4,9

° czasy leczenia oparto na historiach choroby pacjentów, wszystkie inne dane w tej kolumnie zaczerpnięto z S. L. Spruance et al., „The Natural History of Recurrent Herpes Simplex Labialis”, New Ene. J, Med. 297: 69-75,1977 § opisano jako średnia ± błąd standardowy średniej * zakres reprezentuje średnie wielkości uszkodzeń dla zmian mierzących mniej niz 77,5 mm i zmian mierzących powyżej „77,5 mm „ND” oznacza „nie wykonano” i „NR” oznacza „nie obserwowano”

189 618

Przykład 12

Nasilone leczenie uszkodzeń wywołanych HSV-1 po miejscowym zastosowaniu preaparatu n-dokozanu pacjentom z historią występowania zakażeń twarzy HSV-1 (zmiany na skutek przeziębienia) podano krem zawierający 5,0 mg/ml n-dokozanu zawieszonego w 20 mg/ml środka powierzchniowo czynnego kopolimeru blokowego poloksameru; kremy zawierały 5-8% wagowych oleju mineralnego NF jako środka zmiękczającego, 5% wagowych glikolu propylenowego USP jako substancji pochłaniającej wilgoć i konserwującej, 1-3% wagowych alkoholu benzylowego NF jako dodatkowego środka konserwującego i zbilansowaną oczyszczoną wodę jako wodny nośnik.

Pacjentom polecono zastosować krem na uszkodzenia lub wczesne stany zapalne wokół ust, gdy pacjent zauważy zmianę wywołaną przeziębieniem. Pacjenci posiadali historię choroby trwającej średnio 10 dni, gdy była nieleczona, z wszystkimi nieleczonymi zmianami przekształcającymi się w pęcherzyki, które ewentualnie pokrywały się strupami lub zanikały. Pacjentom polecono zastosować krem na zakażone miejsca skóry, co najmniej dwa razy dziennie do czterech razy dziennie. Pacjentom polecono także zapisywać stadia infekcji (od rumienia do krostek, pęcherzyków, obrzęku, strupa), które obserwowali i zapisywać subiektywne obserwacje na temat bólu związanego ze zmianami wywołanymi przez HSV-1. Każdy pacjent leczył co najmniej jedną zmianę w trakcie terapii. Wszyscy pacjenci zgłaszali zmniejszenie bólu, gdy zmiany były leczone kremem zawierającym n-dokozan w stosunku do poprzednich zmian, które nie były leczone. Dla każdego pacjenta czas trwania infekcji HSV-1 w porównaniu z przeszłymi infekcjami zmniejsza się od 20% do 60% (np. czas trwania 4 do 8 dni z zależności od osobnika). U co najmniej połowy pacjentów uczestniczących w badaniu, którzy leczyli zmiany 4 razy dziennie kremem zawierającym n-dokozan, zmiany nie rozwijały się do stadium pęcherzyków. Zamiast tego, gdy zmiany wywołane HSV-1 są miejscowo leczone w stadium rumienia lub krostek, zmiany generalnie nie rozwijają się poza stadium krostek i goją się bez dalszego rozwoju uszkodzeń. Te wyniki ukazują, że preparaty zawierające n-dokozan są skuteczne w zapobieganiu i leczeniu infekcji wirusowych, gdy są stosowane miejscowo.

Przykład 13

Leczenie infekcji grypowych alkoholem erucylowym lub preparatami amidu kwasu erukowego

Wodna zawiesina 0,15 mM alkoholu erucylowego w 1,4 mM niejonowego środka powierzchniowo czynnego poloksameru 188 zawierającego glikol propylenowy USP (0,5% wagowych) i alkohol benzylowy NF (2% wagowe) jako środki konserwujące, przygotowano w standardowej elastycznej butelce od rozpylacza, zdolnej do wytwarzania aerozolu z zawiesiny, gdy butelka jest naciskana. Podobnie, preparat zawierający 1,5 mM amidu kwasu erukowego jest wytwarzany i produkowany w pojemnikach do rozpylaczy donosowych w celu wytworzenia aerozolu z zawiesiny. Preparaty zostały dostarczone w sezonie grypowym dla dwóch grup (jedna do testowania alkoholu erucylowego i druga do testowania amidu kwasu erukowego) 20 zdrowych pacjentów, którzy nie byli zaszczepieni przeciwko wirusowi grypy w ciągu przeszłych 12 miesięcy. Pacjentom polecono zastosowanie zawiesiny, którą dostarczono im w formie rozpylacza donosowego raz do pięciu razy dziennie (jeden do dwóch rozpylaczy do otworu nosowego w odstępach 2-4 godzinnych), gdy stwierdzą oni objawy grypy (niedrożność dróg oddechowych, bóle, wrażliwość oczu, gorączka, mdłości lub kombinacja tych objawów). Pacjentom polecono zapisywanie subiektywnych i obiektywnych obserwacji nasilenia obiawów ervnv iczas trwania obiawów. temneratura ciała w razie poraczki. długość a d y x \ j '} -i. - d u * i nasilenie bólów) podczas okresu, w czasie którego stwierdzali objawy. Pacjentom polecono także zapisywanie zużycia zawiesiny rozpylacza donosowego (liczba zastosowań i czas stosowania) w tym czasie. Pacjentów poproszono o zsumowanie ich subiektywnych obserwacji nasilenia objawów grypy w czasie stosowania aerozoli środek powierzchniowo czynny/alkohol erucylowy lub środek powierzchniowo czynny/amid kwasu erukowego w porównaniu z przeszłymi doświadczeniami z infekcjami grypy. Około połowy uczestników badań stosujących aerozol zawierający środek powierzchniowo czynny/alkohol erucylowy jak zalecono zgłosiło zmniejszenie objawów grypy w porównaniu z przeszłymi jej przypadkami.

189 618

Ci, którzy stosowali aerozol średnio 5 razy dziennie (jeden do dwóch rozpylaczy do każdego otworu nosowego) zgłaszali znaczne zmniejszenie niedrożności dróg oddechowych związanej z infekcją grypową w porównaniu z nieleczonymi pacjentami. Ci, którzy stosowali aerozol średnio 5 razy dziennie zgłaszali znaczne zmniejszenie częstotliwości gorączki (raz do trzech razy w ciągu infekcji) w porównaniu z nieleczonymi osobnikami (dwa do pięciu razy w ciągu infekcji) i znaczne zmniejszenie najwyższej zanotowanej temperatury ciała (średnio 37,8°C) w porównaniu z nieleczonymi osobnikami (średnio 38,9°C). Średnia długość trwania objawów grypy u około połowy osobników leczonych aerozolem środek powierzchniowo czynny/alkohol erucylowy wynosiła 1,7 dnia, podczas gdy w przypadku nieleczonych pacjentów 3 dni. Te wyniki ukazują, że zawiesina środek powierzchniowo czynny/alkohol erucylowy wywiera działanie przeciwwirusowe, gdy jest stosowana na błony śluzowe. Podobne wyniki uzyskano w przypadku pacjentów leczonych rozpylaczem donosowym zawiesiny amidu kwasu erukowego. Około połowa pacjentów zgłaszała zmniejszenie objawów grypy w stosunku do poprzednich przypadków grypy, gdy używali oni rozpylacza zawierającego środek powierzchniowo czynny/amid kwasu erukowego, jak tylko zaobserwowali objawy. Większość pacjentów doświadczyła znacznie zmniejszonej niedrożności dróg oddechowych, gdy używali oni aerozolu średnio trzy razy dziennie (jeden do dwóch ropzylaczy do każdego otworu nosowego) w porównaniu z poprzednimi epizodami grypy. Większość pacjentów stosujących aerozol średnio trzy razy dziennie zgłaszało pojedyncze przypadki gorączki podczas infekcji grypy ze średnią pacjentów stosujących aerozol co najmniej trzy razy dziennie wynosił dwa dni w porównaniu z pacjentami nie leczonymi, u których wynosił trzy dni. Te wyniki ukazują, że aerozol zawiesiny środek powierzchniowo czynny/amid kwasu erukowego wywiera terapeutyczne działanie przeciwwirusowe, gdy stosowany jest na błony śluzowe układu oddechowego.

Przykład 14

Przezbłonowe leczenie membranowe infekcji HSV-2 alkoholem brazydylowym

Czopki zawierające 8 mM alkoholu brazydylowego w niejonowej zawiesinie detergentu, przygotowane zasadniczo jak w przykładach 1 i 5, są tworzone przez dodanie bezwodnej dekstrozy (300-400 mg/czopek), skrobi roślinnej (300-400 mg/czopek) i stearynianu magnezu (5-10 mg/czopek) w celu wytworzenia mieszaniny, z której wytwarzane są czopki (1-10 g na czopek) w celu stosowania dopochwowego. 15 kobiet zakażonych HSV-2 z historią pochwowych i/lub okołopochwowych zmian wywołanych przez wirusy herpes otrzymało czopki i polecono im stosować jeden do czterech czopków dziennie, gdy zauważą zmiany wywołane przez wirusy herpes lub stwierdzą dyskomfort wywołany przez ten wirus. Kobietom polecono zapisywać obserwacje dotyczące czasu trwania aktywnej infekcji, nasilenia zmian (rumień, krostki, pęcherzyki, obrzęk lub faza strupów), liczbę zmian w porównaniu z przeszłymi aktywnymi infekcjami i subiektywną oceną bólu lub dyskomfortu związanego z aktywną infekcją. Kobietom polecono zastosować czopki, jak tylko wykryją objawy aktywnej infekcji. W przeszłości u kobiet zmiany trwały średnio 12 dni i tworzyły się w formie pęcherzyków; gdy nie były leczone. We wszystkich przypadkach każda kobieta leczyła co najmniej jeden epizod aktywnej infekcji wirusem herpes w czasie badania. Wszystkie kobiety zgłaszały zmniejszenie bólu i dyskomfortu, gdy infekcja była leczona czopkami w porównaniu z przeszłymi nieleczonymi epizodami. We wszystkich przypadkach średni czas trwania aktywnej infekcji HSV-2 uległ skróceniu do 7-8 dni po leczeniu czopkami, a u 5 kobiet do, średnio, 3-4 dni. W większości przypadków, w których używano czopków 4 razy dziennie i leczenie rozpoczęto w stadium rumienia lub krostek, infekcja nie rozwinęła się do fazy pęcherzyków i zagoiła po osiągnięciu stadium krostek. Alternatywnie, z zawiesiny środek powierzchniowo czynny/alkohol brazydylowy tworzy się maść zawierającą 50-80% miękkiej parafiny, która jest rozpuszczana w 60°C w celu dodania i dyspersji zawiesiny środek powierzchniowo czynny/alkohol brazydylowy przed ochłodzeniem. Maść umieszczana jest w ściśliwych tubkach z instrukcją stosowania 2 do 5 razy dziennie w zależności od potrzeby pierwotnie do zewnętrznego stosowania na genitalia aktywnie zainfekowane wirusem herpes. Osobnikom polecono używać ilości wystarczającej do pokrycia zmian wywołanych HSV-2 w rejonie genitalnym i okołopochwowym raz do czterech razy dziennie, jak tylko wystąpią objawy. Co najmniej połowa osobników używających maści zgłaszała zmniejszenie bólu i dyskomfortu, skrócenie czasu gojenia i nie rozwinęła się u nich faza pęcherzyków przed zagojeniem. Te wy189 618 niki ukazują, że zawiesiny środek powierzchniowo czynny/alkohol brazydylowy wywierają terapeutyczny efekt przeciwwirusowy, gdy są stosowane miejscowo na błony śluzowe.

Przykład 15

Leczenie infekcji EBV (zakaźna mononukleoza) zawiesinami długołańcuchowych alkoholi alifatycznych młodych dorosłych (wiek 14-19 lat) ze zdiagnozowaną zakaźną mononukleozą (ból gardła, gorączka, złe samopoczucie, uogólniona limfioadenopatia, nietypowe limfocyty T mononukleozy we krwi obwodowej, całkowita liczba białych krwinek 12000-18000 we krwi) leczono systematycznie sterylną wodną zawiesiną niejonowego środka powierzchniowo czynnego zawierającego 10 mM n-heksakozanolu przygotowanego zasadniczo jak w rzykładzie 1. Zawiesina jest wstrzykiwana (domięśniowo lub dożylnie) w dawkach 0,001 g/kg do 1 gm/kg alkoholu alifatycznego stosowanego przez lekarza w warunkach klinicznych. Objawy pacjentów były monitorowane przez tydzień i co tydzień przez 3 miesiące we wskazaniach zakaźnej mononukleozy. U wszystkich pacjentów stwierdzono pozytywny test EBV na końcu badanego okresu, co stwierdzono przez detekcję przeciwciał anty-EBV w surowicy przy użyciu standardowych testów immunologicznych. U wszystkich pacjentów nastąpiło wyleczenie bólu gardła i gorączki w ciągu tygodnia stosowania zawiesiny środek powierzchniowo nzynny/n-^lneksakozanol i zmniejszenie ogólnych objawów chorobowych wciągu 2 tygodni stosowania. 8 z leczonych pacjentów wykazywało spadek uogólnionej limfoadenektomii w czasie 2 do 3 tygodni stosowania zawiesiny alkoholu alifatycznego i powrót sił życiowych. U wszystkich leczonych pacjentów stwierdzono spadek liczby atypowych limfocytów T mononukleozy we krwi obwodowej w ciągu 4 tygodni stosowania z normalną całkowitą liczbą białych krwinek we krwi w ciągu 2 miesięcy po terapii. Podobne wyniki uzyskano u pacjentów zainfekowanych EBV wykazujących objawy mononukleozy zakaźnej, których leczono systemowo zawiesinami n-dokozanolu, alkoholu lignocerylowego i n-oktakosanolu w stężeniach efektywnych. Te wyniki ukazują że systemowe stosowanie wybranych długołańcuchowych alkoholi alifatycznych w zawiesinach wodnych wywiera terapeutyczne działanie przeciwwirusowe.

Przykład 16

Leczenie choroby limfoproliferacyjnej zawiesinami długolańcuchowych alkoholi alifatycznych pacjentów w wieku 35 do 55 łat z chorobą Hodgkin'a (faza I lub II-A formy limfocytamo-histionytamej charakteryzującej się obfitym i rozsianym naciekiem dojrzałych limfocytów zmieszanych z histiocytami w węzłach chłonnych) leczono cotygodniowymi wstrzyknięciami sterylnych wodnych zawiesin 2 mM kwasu n-dokozanowego w Tel^ironic-908 przygotowanym zasadniczo jak opisano w przykładzie 1.

Dawki wynosiły 0,1 mg/kg do 10 mg/kg z preferowanym sposobem podania dożylnego w ciągu 1-2 godzin w roztworze soli fizjologicznej. 4 pacjenci, którym podano zawiesinę kwasu n-dokozanowego raz w tygodniu przez 8 tygodni wykazało znaczną poprawę w zakresie objawów włącznie z obniżeniem częstotliwości lub brakiem przypadków znaczącej gorączki i/lub nocnych potów. Co więcej, żaden z tych 4 pacjentów nie wykazywał spadku wagi w trakcie leczenia i dwóch zgłosiło wzrost wagi ciała o około 5%. U żadnego z 4 pacjentów·', którzy zareagowali pozytywnie na leczenie nie stwierdzono progresji choroby do dodatkowych węzłów chłonnych lub pozalimfatycznych narządów lub tkanek w 12 do 16 tygodni po zastosowaniu zawiesin alkoholowych. Podobne wyniki uzyskano przy stosowaniu cotygodniowych wstrzyknięć zawiesin wodnych zawierających nie-jonowy detergent i 20 pM alkoholu stearylowego lub 1 mM alkoholu arachidylowego. Te wyniki ukazują, że cytotoksyczne wybranych dhugolańcuchowyyh alkchoh może t>y^ć wykorzystywane do leczenia chorób cytoproliferacyjnych.

Pomimo, że wynalazek został opisany w kontekście określonych przykładów i korzystnych zastosowań, jest zrozumiałe, że wynalazek nie ogranicza się do tych zastosowań i jest zdefiniowany przez następujące zastrzeżenia.

189 618

3-ASH sue^oąnpuT pfąAid

189 618

2-ASH Mo/ąAjąAft εςζοτχ

kontrolne stężenie Tritonu Χ-100

189 618 iooa

qoAuTOJ4uo){ χθ^φσά op n^unsoąs λ xeąA^d %

189 618

Ο

P

-Η

Χ2

-Η

JCZ

C ł-ł

Ο ϊ>.

« ο

u» «

ο 'e ο

€>ί β

ο

S.

Próbka kontrolna pluronowa (%} ejoąTą-ęuuT etuspóTS ωθρθχβζΛ ΛυΛρτιιιΑρ-{Η_ε) Csuozo^a ρ^οχτ

189 618

Μ

O

P •H

X)

Ή

C w

<0 o

m ra ° § s

O 3

K>

Ch •S o o «I — P '© £ Ό Ul Cu .O ’ó flq co

189 618

Oli

Ceu-rojąuoif τχςςυά araezeuuizoi %

-dokozanol

189 618

904

Η

Ο

4->

•Η

JQ •Η

-C ίΖ

qoAuTOjąuox χβςρσά op mfunsoąs λ χβ^Αξά %

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (39)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja przeciwwirusowa i przeciwzapalna zawierająca mieszaninę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i składnika aktywnego w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku, znamienna tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny jest oktoksynolem, a składnikami aktywnymi są alkohole stearylowy, erucylowy, brazydylowy, behenylowy (n-dokozanol), arachidylowy, n-dokozan, kwas behenowy (n-dokozanowy), amid kwasu erukowego, kwas stearynowy, pojedynczo lub w mieszaninie, przy czym wagowy stosunek zawartości środka powierzchniowo czynnego i składnika aktywnego wynosi od 1:1 do 10:1.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mieszaninę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i składnika aktywnego w stosunku wagowym od około 5:1 do około 10:1.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mieszaninę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i kwasu stearynowego w stosunku wagowym od około 4:1 do około 10:1.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto dodatkowy niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany z grupy zawierającej polimer blokowy o ciężarze cząsteczkowym od około 1000 do około 25000, dezoksycholan oraz ich mieszaninę.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że polimer blokowy zawiera tlenek etylenu i tlenek propylenu i ma masę cząsteczkową około 8400.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina zawiera oktoksynol i kwas behenowy (n-dokozanowy) w stosunku wagowym około 5:1.
8. 8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina zawiera od około 5% do około 20% wagowych kwasu stearynowego i dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.
9. 9. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, ze mieszanina zawiera od około 10% do około 12% wagowych alkoholu behenylowego (n-dokozanolu) i dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.
10. 10. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina zawiera zawiesinę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i kwasu stearynowego w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku.
11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.
12. 12. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 1, do zastosowania jako lek hamujący wzrost lub namnażanie komórek.
13. 13. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 1, do zastosowania jako lek do zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowej.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że infekcja wirusowa jest wywołana jest przez wirusa wybranego z grupy obejmującej wirus.opryszczki zwykłej, wirus cytomegalii, wirus Epsteina-Barra, wirus ospy wietrznej, wirus grypy, ludzki wirus limfocytotropowy, wirus brodawczaka lub wirus RSV (syncytialny wirus oddechowy).
15. 15. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 1, do zastosowania jako lek do leczeniu zapalenia skóry lub błon śluzowych.
16. 16. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 1, do zastosowania jako lek do leczenia oparzeń.

    189 618
17. 17. Zastosowanie kompozycji zawierającej mieszaninę określoną w zastrz. 1, do przygotowania leku odpowiedniego do stosowania miejscowego, przezbłonowego lub pozajelitowego.
18. 18. Zastosowanie kompozycji zawierającej mieszaninę określoną w zastrz. 1, do przygotowania leku do zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowych
19. 19. Zastosowanie kompozycji zawierającej mieszaninę określoną w zastrz. 1, do przygotowania leku do leczenia oparzeń.
20. 20. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że polimer blokowy zawiera polioksyalkilenową pochodną glikolu propylenowego i posiada ciężar cząsteczkowy około 25000.
21. 21. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że składnik aktywny zawiera alkohol behenylowy (n-dokozanol).
22. 22. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina stanowi zawiesinę niejonowego środka powierzchniowo czynnego i alkoholu behenylowego (n-dokozanolu) w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku.
23. 23. Kompozycja według zastrz. 22, znamienna tym, że niejonowy środek powierzchniowo czynny wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.
24. 24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, ze mieszanina zawiera dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.
25. 25. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera mieszaninę oktoksynolu i alkoholu behenylowego (n-dokozanolu) w stosunku wagowym od około 1:1 do około 10:1 w farmaceutycznie akceptowalnym rozcieńczalniku lub nośniku.
26. 26. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że oktoksynol jest wybrany jest z grupy obejmującej oktoksynol-9, oktoksynol-10 oraz ich mieszaninę.
27. 27. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że mieszanina zawiera od około 5% do około 20% wagowych alkoholu behenylowego (n-dokozanolu).
28. 28. Kompozycja według zastrz. 27, znamienna tym, że mieszanina zawiera od około 10% do około 12% wagowych alkoholu behenylowego (n-dokozanolu).
29. 29. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że mieszanina zawiera dodatkowo ester kwasu stearynowego i cukru.
30. 30. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że mieszanina zawiera oktoksynol i alkohol behenylowy (n-dokozanol) w stosunku wagowym od około 5:1 do około 10:1.
31. 31. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że mieszanina zawiera oktoksynol i alkohol behenylowy (n-dokozanol) w stosunku wagowym od około 4:1 do około 10:1.
32. 32. Kompozycja według zastrz. 25, znamienna tym, że mieszanina zawiera oktoksynol i alkohol behenylowy (n-dokozanol) w stosunku wagowym około 5:1.
33. 33. Kompozycja zawierająca mieszaninę według zastrz. 25, do zastosowania jako lek hamujący wzrost lub namnażanie komórek
34. 34. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 25, do zastosowania jako lek do zapobiegania lub leczenia infekcji wirusowej.
35. 35. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 25, do zastosowania jako lek do leczenia zapalenia skóry lub błon śluzowych.
36. 36. Kompozycja zawierająca mieszaninę określoną w zastrz. 25, do zastosowania jako lek do leczenia oparzeń.
37. 37. Zastosowanie kompozycji zawierającej mieszaninę określoną w zastrz. 25, do przygotowania leku odpowiedniego do stosowania miejscowego, przezbłonowego lub pozajelitowego.
38. 38. Zastosowanie kompozycji zawierającej mieszaninę określoną w zastrz. 25, do przyu Ickn do zdpobi cgdti rn iuu iCiacinf infekcji wirusowych.
39. 39. Zastosowanie kompozycji zawierającej mieszaninę określoną w zastrz. 25, do przygotowania leku do leczenia oparzeń.

    189 618