DE69937904T2 - Antivirale verwendungen von leflunomid produkten - Google Patents

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Description

  • Erfindungshintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft generell neue Antivirusmaterialien und Verfahren, die sich mit Leflunomidprodukten befassen.
  • Das Leflunomid (HWA-486) ist ein Isoxazolderivat mit dem chemischen Namen N-(4-Trifluoromethylphenyl)-5-Methylisoxazol-4-Karboxamid. Nach der Verabreichung wird die Verbindung schnell in ihre aktive, offene Ringform N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-Zyano-3-Hydroxykrotonamid (A771726) umgewandelt, die dann schnell einem Keto-Enol-Tautomerismus unterliegt, um das folgende N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-Zyano-3-Oxobutyramid zu bilden:
    Figure 00010001
    (Stecher et al., „Ann. Report Med. Chem.", 18, S. 171–179, 1983). Das Leftlunomid stammt aus einer Reihe von Verbindungen, die als landwirtschaftlich genutzte Herbizide von Wissenschaftlern der Hoechst AG benannt wurden. Es wurde später festgestellt, das es eine antientzündliche und immununterdrückende Aktivität entwickelt, und es wurde in tierischen Modellen der Autoimmunkrankheit und der Transplantatabstoßung verwertet. Das Stoffwechselprodukt zeigt zwei Aktivitätsmechanismen: die Hemmung der Protein-Tyrosin-Kinase-Aktivität und die Hemmung der Dihydroorotat- Dehydrogenase, eines Schlüsselenzyms bei der Biosynthese von Pyrimidin-Nukleotid-Triphosphaten, s. generell Silva et al., „Am. J. Med. Sci.". 313(5), S. 289–301, 1997, und „Principles of Drug Development in Transplantation and Autoimmunity" von Liebermann und Mukherjee, Herausgeber R. G. Landes Co., Austin, 1996). Das Arzneimittel wird von Tieren und Menschen gut vertragen und ist zur Zeit unter klinischer Beobachtung bei menschlichen Patienten mit fortgeschrittener Rheuma-Arthritis. Von einer Antivirusaktivität für das Leftlunomid oder dessen Stoffwechselprodukt ist bisher nicht berichtet worden.
  • Das US-Patent 4 087 535 mit dem Erfinder Heubach beschreibt eine Gruppe von 5-methyl-ioxazol-4-kKarboxylischen Säureaniliden, die eine antientzündliche und schmerzlindernde Aktivität aufweisen. Das US-Patent 4 351 841 mit den Erfindern Kammerer et al. offenbart, dass das als Leflunomid bezeichnete, bestimmte Anilid eine sehr hohe antientzündliche Wirkung und eine verminderte Giftigkeit entfaltet. Im US-Patent 4 351 841 wird dargelegt, dass das Leflunomid immunopathologische Prozesse in zwei jugendlichen Rattenarthritismodellen und einem allergischen Rattenenzephalitismodell hemmt. Das US-Patent 4 965276 mit den Erfindern Bartlett et al. beschreibt die Verwendung von Leflunomid zur Behandlung von chronischem Transplantat gegen Wirtskrankheit (CgvH) und andere Autoimmunkrankheiten, beispielsweise systemische Hauttuberkulose-Erythematose (SLE).
  • Die menschlichen Herpesviren sind eine Familie von verwandten Viren, die den Herpessimplexvirus 1 (HSV-1), den HSV-2, den Varicella-Zoster-Virus (VZV), den Epstein-Barr-Virus (EBV), den Cytomegalovirus (CMV), den menschlichen Herpesvirus 6 (HHV-6) den HHV-7 und den HHV-8 (der auch als Kaposi-Sarkom-Herpesvirus oder KSHV bekannt ist. Die Herpesviren weisen eine ähnliche Morphologie, die durch eine elektronische Mikroskopie fast nicht unterscheidbar ist, einen ähnlichen Entwicklungszyklus und die gemeinsame Fähigkeit auf, eine langdauernde Wartezeit bzw. ein langes Beharrungsvermögen im infizierten Wirt aufrecht zu erhalten. Ein typisches Herpesvirion besteht aus einem Kern, der eine lineare Doppelstrang-DNA, ein Icosadeltahedral-Protein-Kapsid mit etwa einen Durchmesser von 100–110 nm und 162 Kapsomere aufweist, wobei ein als Hülle bezeichnetes, amorphes Material das Kapsid umgibt; eine lipidhaltige Außenhülle mit viralen Glykoprotein-Spitzen auf der Oberfläche umgibt den Kern.
  • Die Glieder der Familie Herpesviridae sind gemäß ihren biologischen Eigenschaften in drei Unterfamilien klassifiziert worden, in die Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae und Gammaherpesvirinae. Die Alphaherpesvirinae (die HSV-1, HSV-2 und VZV umfassen) besitzen einen variablen Wirtsbereich, einen relativ kurzen Reproduktionszyklus, eine schnelle Ausbreitung in der Kultur, einen wirksamen Abbau von infizierten Zellen und das Vermögen, latente Infektionen vorwiegend in der sensorischen Ganglia aufzubauen. Die Betaherpesvirinae (einschließlich CMV) weisen einen beschränkten Wirtsbereich, einen langen Reproduktionszyklus, einen langsamen Infektionsfortschritt in der Kultur, eine häufige Vergrößerung (Cytomegalia) der infizierten Zellen und das Vermögen auf, eine Wartezeit in den Sekretdrüsen, Lymphzellen, Nieren und anderen Geweben aufrecht zu erhalten. Die Gammaherpesvirinae (einschließlich EBV) weisen einen beschränkten Wirtsbereich auf, sind spezifisch entweder für T-Lyphozyten oder für B-Lymphozyten ausgebildet, infizieren häufig in einer prälytischen oder lytischen Stufe ohne Produktion einer ansteckenden Nachkommenschaft und halten häufig eine Wartezeit im Lymphgewebe aufrecht, s. generell Kapitel 1 im Artikel „The Human Herpesviruses" von den Erfindern Roizman et al., Herausgeber Raven Press, New York, 1993, den Artikel „Harrison's Principles of Internal Medicine", Ausgabe 13, Isselbacher et al., Herausgeber McGraw-Hill, NY, 1994, Frenkel et al. in „Dev. Biol. Stand" 76, S. 259–265, 1992, Gillison et al in „Curr. Opin. Oncol." 9, S. 440–449, 1997.
  • In einigen Fällen ergibt die Infektion von Zellen mit dem Herpesvirus keinen Zelltod. Stattdessen wird das Virusgenom durch die Zelle in unterdrücktem Zustand gehalten, der mit dem Überleben und mit normalen Aktivitäten der Zelle verbunden ist; dieser Zustand wird Wartezeit genannt. Darauf kann die Aktivierung des Virusgenoms erfolgen, die eine Virusreplikation und Reaktivierung der pathogenen Krankheit zur Folge hat, insbesondere bei immungefährdeten Patienten.
  • Die HSV-Infektionen treten weltweit auf. Über 90% der Erwachsenen weisen Antikörper gegen HSV-1 in den Fünfzigerjahren auf. In den unteren, sozialwirtschaftlichen Populationen erwerben die meisten Personen eine HSV-1-Infektion, bevor sie dreißig Jahre alt werden. Die klinischen Symptome und der Verlauf des HSV hängen vom Infektionsort, dem Alter und dem Immunzustand des Wirts sowie vom Virustyp ab. Das HSV kann nahezu alle Eingeweide- oder Schleimhautstellen infizieren und beispielsweise Pharingitis oder Gingivostomatitis, Ophthalmitis (der häufigste Grund für die Hornhaut-Blindheit in den USA), Encephalitis (verursacht 10–20% aller Encephalitisfälle) oder Krankheiten des Zentralnervensystems (CNS), eine Infektion von Eingeweideorganen, beispielsweise Esophagus, Lunge oder Leber, die gewöhnlich von der Viremia stammt, und andere Komplikationen einschließlich monoartikuläre Arthritis, Nebennierennekrose, idiopathische Thrombocytopenia und Glomerulonephritis verursachen. Neugeborene (< 6 Wochen alt) erkranken am häufigsten an Eingeweide- und/oder CNS-Infektionen von jeder HSV-infizierten Patientenpopulation. Ohne Therapie beträgt die Gesamtsterblichkeit an herpeserkrankten Neugeborenen 65%, und weniger als 10% der Neugeborenen mit einer CNS-Infektion durchlaufen eine normale Entwicklung. Die Antivirus-Chemotherapie hat die Sterblichkeit der an Herpes leidenden Neugeborenen auf 25% vermindert, doch ist die Sterblichkeit noch sehr hoch, insbesondere wenn Kleinkinder mit HSV-2-CNS betroffen sind.
  • Das HSV kann durch eine histologische Prüfung von Proben aus Verletzungen festgestellt werden. Das Einfärben nach Wright, Giemsa (Tzanck-Präparation) oder nach Papanicolaou zeigt charakteristische Riesenzellen oder intranukleare Einschlüsse, die für eine Herpesvirusinfektion typisch sind. Eine Bestätigung der HSV-Infektion wird am besten durch eine Isolierung des Virus in einer Gewebekultur oder durch den Nachweis des HSV-Antigens oder der HSV-DNA in Verletzungen erreicht. Für die Schleimhautinfektionen hat sich Acyclovir als Hauptstütze der Therapie erwiesen. Idoxuridin, Trifluorothymidin und Vidarabin sind für die örtliche Verwendung bei HSV-Augeninfektionen verfügbar. Für die HSV-Encephalitis ist intravenöses Acycovir zur Behandlung die erste Wahl. Für HSV-Infektionen bei Neugeborenen sind hochdosiertes, intravenöses Vidarabin und Acyclovir wirksam.
  • Das VZV verursacht zwei bestimmte, klinische Anzeigen: die Varicella, die auch als Windpocken bekannt ist, und Herpeszoster, das auch als Gürtelrose bekannt ist. Das VZV wird höchstwahrscheinlich durch die Atmungswege übertragen, worauf eine lokale Replikation an einem undefinierten Ort folgt, vermutlich die Nasopharynx, die zur Verbreitung des reticuloendothelialen Systems mit primär Viremia führt. Die charakteristischen Hautverletzungen bei Windpocken sind das hervorragendste Symptom. Die Windpocken sind sehr ansteckend mit einer Befallrate von mindestens 90% unter anfälligen oder seronegativen Individuen. Kinder im Alter zwischen 5 und 9 Jahren werden in 50% aller Fälle betroffen.
  • Immungefährdete Individuen weisen zahlreichere Verletzungen auf, die eine längere Heilungszeit brauchen, und tragen ein größeres Risiko von Eingeweidekomplikationen, die in 30–50% der Fälle auftreten und die in 15% der Fälle verhängnisvoll ausgehen. Eine Varicella-Infektion bei Neugeborenen ist mit einer Sterblichkeitsrate von 30% verbunden. Andere Komplikationen der VZV-Infektion umfassen CNS, Varicella-Pneumonie, Mycocaritis, Hornhautverletzungen, Nephritis, Arthritis, blutende Diathe se, akute Glomerulonephritis und Hepatitis. Einige hepatitische Schwierigkeiten sind bei Windpocken üblich und gewöhnlich asymptomatisch.
  • Der Mechanismus der Reaktivierung des VZV, der zu Herpeszoster führt, ist unbekannt. Es wird angenommen, dass der Virus die Rückenwurzel-Nervenknoten während der Windpocken infiziert; in diesen Nervenknoten bleibt es wahrscheinlich bis zur Reaktivierung latent. Die Reaktivierung im immungefährdeten Wirt ist ernster als beim normalen Individuum. Unter den Patienten mit kutaner Weitergabe besteht ein um 5–10% erhöhtes Risiko von Lungenentzündung, Meningoencephalitis, Hepatitis und anderen, ernsten Komplikationen. Aber sogar bei immungefährdeten Patienten ist die weitergegebene Zoster kaum tödlich. Patienten mit einem Knochenmarkstransplantat weisen ein besonderes Risiko der VZV-Infektion auf; 45% dieser Patienten weisen eine die Haut oder die Eingeweide betreffende Weitergabe auf, und die Gesamtsterblichkeitsrate beträgt 10%.
  • Eine VZV-Infektion wird durch einen charakteristischen Hautausschlag der Windpocken in typischer Weise klinisch diagnostiziert. Eine unzweideutige Bestätigung der Diagnose ist durch eine Isolierung des Virus in anfälligen Gewebekultur-Zelllinien oder durch den Nachweis der Serumumwandlung oder eines vierfachen oder mehrfachen Antikörperanstiegs bei einem Genesenden gegenüber akuten Proben möglich. Eine Immunprophylaxe kann durch Verabreichung eines geeigneten Immunglobulins erreicht werden. Sowohl Windpocken als auch Herpeszoster im immungefährdeten Wirt sollte mit intravenösem Vidarabin oder vorzugsweise mit intravenösem Acyclovir (bevorzugt wegen seiner verminderten Giftigkeit) mit eine Dosis von 10–12,5 mg/kg alle acht Stunden für sieben Tage behandelt werden.
  • Das EBV besitzt eine weltweite Verbreitung und wird vorwiegend durch den Speichel oder weniger üblich durch eine Bluttransfusion übertragen. In Industrieländern haben etwa 50% der jugendlichen Individuen eine primäre EBV-Infektion erlitten; bei den Erwachsenen sind die meisten Individuen EBV-serumpositiv. Die Primärinfektion mit EBV während der Kindheit wird gewöhnlich nicht klinisch erfasst, aber die meisten Jugendlichen und Erwachsenen entwickeln das klinische Syndrom der infektiösen Momnukleosis, bei der Symptome des Unwohlseins, der Appetitlosigkeit und des Fröstelns dem Beginn des Rachenkatarrhs, des Fiebers und der Lymphadenopathie mehrere Tage vorhergehen. Etwa die Hälfte alle Patienten entwickelt eine Splenomegalie. Andere Komplikationen der EBV-Infektion umfassen Hepatitis, hematologische Komplikationen, beispielsweise autoimmun-hämolytische Anemia, milde Thrombocytopenia und Granulocytopenia; ferner treten neurologische Komplikationen, beispielsweise Kopfnervenlähmungen und Encephalitis, und seltene Herzkomplikationen auf, beispielsweise Pericarditis und Myocarditis. Der als X-verbundene Lymphoproliferationssyndrom (XLP) oder Duncansches Syndrom bekannte Zustand ergibt den Tod von 40% der beeinflussten Männer während der primären EBV-Infektion. Die EBV-Infektion ist auch mit gewissen Krebs- und Lympferkrankungen verbunden, die die Afrikanische-Burkitt-Lymphoma, das anaplastische, nasopharyngische Karzinom, die lymphozytische Lymphoma und die B-Zellen-Bösartigkeit, insbesondere bei immungefährdeten Individuen, umfassen.
  • Die EBV-Reaktivierung in immungefährdeten Individuen, beispielsweise die CMV-Reaktivierung, ist häufig mit einer Rückkehr der immunregulatorischen Abnormalitäten verbunden, die für die primäre Immunantwort auf diese Viren charakteristisch sind. Die zelluläre Hypoansprechbarkeit, die mit der EBV-Reaktivierung verbunden ist, ist generell weniger intensiv und weniger aufschiebbar als diejenige, die mit CMV verbunden ist, aber sie kann zur Sterblichkeit des immungefährdeten Individuen beitragen.
  • Die primäre EBV-Infektion kann aufgrund der Anzeichen und Symptome der infektiösen Mononukleosis klinisch diagnostiziert werden, die eine relative und absolute Lymphocytosis mit atypischer Morphologie umfasst. Das Vorhandensein von heterophilen Antikörpern kann bei der Diagnose helfen, aber spezifischere und sensitivere Tests verwenden EBV-spezifische Antikörper. Das Isolieren des EBV in einer Kultur diagnostiziert keine primäre Infektion wegen der Allgegenwart des Virus in EBV-serumpositiven Individuen. Generell reicht die unterstützende Therapie für die EBV-Infektion aus. Das Acyclovir, Alphainterferon und Ganciclocir sind aktive Hemmer der EBV-Replikation in vitro.
  • Obwohl wenig über das neuerlich entdeckte HHV-6 und HHV-7 bekannt ist (beide scheinen vorwiegend lymphotrop zu sein), zeigen epidermiolgische Studien, dass beide wie andere Glieder der Herpesfamilie unter normalen, gesunden Erwachsenen weit verbreitet sind und dass beide zu einer Vielfalt von Krankheitsverläufen im immungefährdeten Individuum beitragen. HHV-8, das jüngst entdeckte, menschliche Herpesvirus, ist als ursächlicher Wirkstoff oder wichtiger Beitragsfaktor bei der Entwicklung des Kaposi-Sarkoms, der Castleman-Krankheit und der primären Ergusslymphomas betrachtet worden.
  • Das Cytomegalovirus (CMV) hat eine weltweite Verbreitung und ist ein wichtiges Pathogen in allen Altersgruppen. Zusätzlich zur Induzierung ernster Geburtsdefekte verursacht das CMV ein weites Spektrum an Störungen bei älteren Kindern und Erwachsenen, wobei diese Störungen von einer asymptomatischen, subklinischen Infektion bis zu einem mononukleosis-ähnlichen Syndrom und zu einer Eingeweidekrankheit bei einem immungefährdeten Patienten reichen. Der Krankheitsname stammt aus der Beobachtung von charakteristischen, zytomegalischen Zellen, von denen angenommen wird, dass sie infizierte Epithelialzellen sind. Sie sind zweimal bis viermal größer als die umgebenden Zellen und enthalten oft einen intranuklearen Einschluss in der Größe von 8–10 μm, wobei dieser Einschluss exzentrisch angeordnet und von einem klaren Halo umgeben ist, so dass dieser Einschluss wie ein „Eulenauge" aussieht.
  • Etwa 1% der Neugeborenen in den USA sind mit dem CMV infiziert, und der Prozentsatz ist in vielen unterentwickelten Ländern höher. Die Krankheit des zytomegalischen Einschlusses entwickelt sich in etwa 5% von congenitalen, fötalen CMV-Infektionen und ist für Petechiae, Hepatosplenomegalie und Gelbsucht in 60–80% der Patienten, für Mikrocephalie, intrauterine Wachstumsverzögerung und für die Frühreife in 30–50% der Patienten charakteristisch. Sogar asymptomatische Kleinkinder können eine bedeutenden Psychomotor, Hör-, Augen- oder Zahnabnormalitäten entwickeln. Eine Infektion bei Neugeborenen ist gewöhnlich asymptomatisch, kann aber zu einer interstitialen Pneumonitis, Adenopathie, einem Hautausschlag, einer Hepatitis, Blutarmut und zu einer atypischen Lymphozytose führen.
  • Eine CMV-Infektion bei gesunden Kindern und Erwachsenen ist typischerweise subklinisch, kann aber ein heterophil-antikörper-negatives, mononukleosis-ähnliches Syndrom bilden, das eine atypische Lymphozytose umfasst. Bei der CMV-Mononukleosis sind aber der austretende Rachenkatarrh und die Halslymphadenopathie selten. Wenn ein Individuum infiziert worden ist, trägt es den Virus wahrscheinlich lebenslang. Die Infektion bleibt meistens latent. Doch kann eine Reaktivierung erfolgen, wenn die T-lmphocyten-vermittelte Immunität gestört ist, beispielsweise nach einer Organtransplantation oder in Verbindung mit einem lymphoiden Neoplasmus und gewissen, erworbenen Immunschwächen. Das CMV kann selbst zu einer weiteren T-Lymphozyten-Beantwortung beitragen, die oft einer Superinfektion mit anderen, opportunistischen Pathogenen, beispielsweise mit Pneumocystiscarinii, vorhergeht.
  • Eine CMV-Infektion ist nur bei einem immungefährdeten Wirt ernst. Das CMV ist als wichtiges Pathogen bei Patienten mit AIDS erkannt worden. Die CMV-Infektion ist fast allgegenwärtig bei Patienten mit AIDS und verursacht oft Retinitis, Hepatitis, Atmungs- und gastrointestinale Erkrankungen und weitergegebene Erkrankungen. Fötale CMV-Infektionen sind oft mit fortdauernder Viremia und multiplen Organsystemerkrankungen verbunden.
  • Das CMV scheint auch das häufigste und wichtigste, virale Pathogen zu sein, das die Organtransplantation erschwert. Die meisten primären CMV-Infektionen in Organtransplantatempfängern stammen von der Übertragung des Virus im Transplantat selbst oder von einer Blutübertragung. in Nieren-, Herz-, Lungen- und Lebertransplantatempfängern umfasst das CMV eine Vielfalt von Syndromen, einschließlich Fieber und Leukopenia, Hepatitis, Pneumonitis, Esophagitis, Gastritis, Colitis und Retinitis. Die maximale Periode des Risikos beträgt 1–4 Monate nach der Transplantation, obwohl die Ritinitis eine spätere Komplikation hervorrufen kann. Sogar Transplantatempfänger, die von einer vorhergehenden Infektion serumpositiv sind, sind noch von einer Reinfektion mit einer abweichenden, geberabgeleiteten CMV-Reaktivierungsinfektion gefährdet, obwohl diese häufig generell weniger ernst ist. Die CMV-Pneumonia tritt in etwa 15–20% der Rückenmarktransplantatempfänger auf, wobei die Sterblichkeitsrate 84–88% beträgt. Ferner ist die CMV-Infektion als Beitragsfaktor bei der Abstoßung von Alltransplantaten verwickelt.
  • Das CMV wird vorzugsweise durch eine Isolierung des Virus von geeigneten, klinischen Proben diagnostiziert, die auf menschlichen Fibroblastmonoschichten kultiviert werden. Die Feststellung der CMV-Viremia ist ein gute Vorhersage für eine akute Infektion. Das CMV kann auch durch Feststellung des dem CMV unmittelbar vorhergehenden Antigens oder der CMV-DNA in peripheren Blutleukozyten diagnostiziert werden. Das CMV-Immunglobulin soll, wie berichtet worden ist, die CMV-verbundenen Syndrome und Superinfekte einiger Patientenpopulationen vermindern. Die CMV-Infektionen werden üblicherweise mit Glanciclovir behandelt, das eine beträchtlich größere Aktivität gegen das CMV als das congenäre Acyclovir oder das Foscarnet entwickelt. Die gebräuchliche Dosis gegen die CMV-Ritinitis beträgt 5 mg/kg IV-Ganciclovir zweimal täglich für 14–21 Tage, wobei dieser Gabe 5 mg/kg täglich für 5–7 Tage je Woche folgen. Die übliche Dosis von Foscarnet für die CMV-Ritinitis ist eine Einführung von 60 mg/kg IV alle acht Stunden für 14–21 Tage, wobei dieser Gabe eine tägliche Erhaltungsinfusion mit 90–120 mg/kg folgt.
  • Die Virusreplikation weist sowohl eine nukleare Phase als auch eine zytoplasmische Phase auf. Die Anfangsschritte der Replikation umfassen die Befestigung des Virus an der Wirtszelle und die Verschmelzung mit der Wirtszellenmembran, um das Nukleokapsid in das Zytoplasma der Zelle freizusetzen, worauf ein Abbau des aufzulösenden Nukleokapids und der viralen DNA folgt. Das Virus fängt zuerst mit der Transkription eines Satzes aus viralen Genen an, die α-Gene oder auch „unmittelbar frühere" Gruppe genannt werden. Das Vorhandensein von α-Genprodukten ist für die Sythese der folgenden Polypeptidgruppe, der β-Polypeptide, erforderlich, von denen viele regulatorische Proteine und Enzyme sind, die für die DNA-Replikation erforderlich sind. Die meisten, gegenwärtigen, antiviralen Medikamente unterbrechen die β-Proteine derart, dass das virale DNA-Polymerase-Enzym gebildet wird. Die ditte (γ) Klasse von viralen Genprodukten bilden die meisten der Aufbauproteine des Virus.
  • Nach der Replikation des viralen Genoms und der Synthese der Aufbauproteine werden die Nukleokapside im Kern der Wirtszelle zusammengebaut. Obwohl viele Einzelheiten hinsichtlich der Bildung der Decke und der Hülle sowie auch des Transports des Virions zur Zelloberfläche zu lösen bleiben, haben einige Studien nahegelegt, dass die Umhüllung dann erfolgt, wenn die Nukleokapside durch die innere, nukleare Membran in den perinuklearen Raum gebracht werden. Die Vironen können dann über das endoplasmische Retikulum und den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche transportiert werden.
  • Die meisten der verfügbaren, antiviralen Medikamente arbeiten mit dem Sperren der viralen DNA-Replikation, s. generell Kapitel 142 im Artikel „Antiviral Chemotherapy" in „Harrison's Principles of Internal Medicine", Ausgabe 13, von den Erfindern Isselbacher et al., Herausgeber McGraw-Hill, NY, 1994. Das Glanciclovir, nämlich das 9-([1,3-Dihydroxy-2-Propoxy]-Methyl)-Guanin, ist ein Nukleosid-Analogon des Guanosins. Die Triphosphatform ist in der replizierenden, viralen DNA enthalten, in der ihr Vorhandensein dramatisch eine Kettenverlängerung durch die virale DNA-Polymerase verhindert. Das Glanciclovir weist eine Aktivität gegen alle Herpesviren, aber eine bemerkenswert erhöhte Aktivität gegen das CMV auf. Es ist nur für eine intravenöse Verabreichung verfügbar und wird zumeist mit einer therapeutischen Anfangsdosis von 5 mg/kg zweimal täglich für 14–21 Tage verabreicht, der eine Aufrechterhaltungsdosis von 5 mg/kg je Tag oder fünfmal je Woche folgt, möglicherweise so lange, wie die Immununterdrückung dauert.
  • Die Verabreichung von Glanciclovir war mit starker Knochenmarksunterdrückung verbunden, insbesondere bei der Neuropenia, die eine Hauptbeschränkung bei der Gabe von Glanciclovir an viele Patienten darstellt. Die Knochenmarksgiftigkeit wird vervielfältigt, wenn andere Knochenmarksunterdrücker, beispielsweise Zidovudin, begleitend verwendet werden.
  • Das Foscarnet (Natriumphosphonoformat oder PFA) ist eine pyrophosphathaltige Verbindung, die ein potentes Sperrmittel gegen Herpesviren einschließlich von CMV bildet. Es verhindert die virale DNA-Replikation durch eine direkte Anbindung an die virale DNA-Polymerase. Das Foscarnet ist schwer löslich und muss intravenös in einer Verdünnungslösung gegeben werden, die 1–2 Stunden lang eingespritzt wird. Die am meisten übliche Anfangsdosis von Foscarnet beträgt 60 mg/kg alle acht Stunden für 14–21 Tage, der eine Aufrechterhaltungsdosis von 90–120 mg/kg einmal am Tag folgt. Das Foscarnet zeigt eine beträchtliche Giftigkeit, die eine Nierendysfunktion, Hypomagnemia, Hypomagnesemia, Hypokalemia, Hypokalzemia, Anfälle, Fieber und Rachenkatarrh umfasst, wobei jede dieser Krankheiten in mehr als 5% der Empfänger auftritt. Obwohl hematologische Abnormalitäten ebenfalls beobachtet worden sind, wirkt Foscarnet nicht generell myelounterdrückend.
  • Das Cidofovir, das kürzlich zur Verwendung bei der CMV-Retinitis zugelassen wurde, ist ein monophosphoryliertes Nukleosidanalogon, das ähnlich wie Glanciciovir durch zelluläre Kinasen weiter phosphoryliert ist, wodurch die virale DNA-Synthese äußerst erschwert wird, wobei die Aufnahme in freiwerdende Stränge folgt. Die dokumentierte Nephrotoxität dieses Mittels erfordert jedoch eine sorgfältige Patientenauswahl und auch eine begleitende, intravenöse und orale Hydrierung sowie eine sondenhafte Verabreichung. Die Neutropenia ist ebenfalls in etwa 10% der Empfänger beobachtet worden.
  • Das Acyclovir, nämlich das 9-(2-Hydroxyethoxy-Methyl)-Guanin, ist ein azyklisches Analogon des Guanosins. Die Triphosphatform bindet sich an die virale DNA-Polymerase und wirkt als DNA-Kettenendglied. Es ist relativ unwirksam bei CMV-Infektionen. Die Hauptgegenanzeige ist die Änderung der Nierenfunktion. Hohe Dosen können eine Anhebung des Serumkreatinins in 50% der Empfänger verursachen und können gelegentlich eine akute Nierendysfunktion bewirken. Es gibt auch Berichte über eine gewisse Giftigkeit für das zentrale Nervensystem nach einer intravenösen Verabreichung.
  • Das Vidarabidin, nämlich 9-β-D-Arabinofuranosyladenin, ist ein reines Nukleosidanalogon, das die virale DNA-Synthese durch seine Triphosphatform unterbindet. Bei höheren Dosen ist das Medikament mit hematopoietischen Nebenwirkungen verbunden, die Blutarmut, Leukopenia und Thrombozytopenia umfassen. Über eine Nervengiftigkeit ist ebenfalls berichtet worden.
  • Die Rhinoviren sind hauptsächlich bekannte, ursächliche Mittel für Erkrankungen der oberen Atmungswege bei Erwachsenen, beispielsweise für Erkältungen. Sie werden von etwa 15–40% der Erwachsenen mit diesen Erkrankungen isoliert. Nur 4–5% der Kinder mit einer Erkrankung der oberen Atmungswege sind rhinoviruspositiv. Die Rhinoviren bilden eine Untergruppe der Picornavirusfamilie und besitzen gewisse, gemeinsame Merkmale, die eine geringe Größe (15–30 nm), einen RNA-Kern, eine Widerstandsfähigkeit gegen Ether und eine vollständige oder fast vollständige Inaktivierung bei einem pH-Wert von 3 umfassen (im Gegensatz zu den Enteroviren, die bei einem pH-Wert von 3 stabil sind). Es gibt über 100 verschiedene Rhinovirus-Serumtypen. Im Allgemeinen wird die virale Rhinitis durch Gewichtszunahme, Hyperemia und Edema der nasalen Mukosa mit sekretorischer Hyperaktivität der mukussekretabgebenden Drüsen begleitet.
  • Measles ist eine akute, höchstansteckende, virale Erkrankung, die durch Fieber, Schnupfen, Husten, Bindehautentzündungen, Enanthen und Exanthem gekennzeichnet ist. Ihre Sterblichkeit ändert sich sehr mit dem Wirt und den Umgebungsfaktoren. Der Measles-Virus ist ein eingehüllter RNA-Paramyxovirus, dessen Durchmesser 120–250 nm beträgt und der anderen Gliedern der Paramyxovirusfamilie (Art Morbillivirus) ähnelt, dem jedoch eine Neuraminidase fehlt. Sein einzelner, antigener Serumtyp ist viele Jahre lang weltweit sehr stabil gewesen. Das Virus enthält sechs Hauptpolypeptide, die für eine Anzahl von Aufbau- und Funktionseigenschaften verantwortlich sind, einschließlich der Hemagglutination der Erythrozyten, der Hämolysis, der Zellverschmelzung, des viralen Zusammenbaus und der Virusdurchdringung. Klinisch werden nach einer Inkubationszeit von etwa 11 Tagen Symptome von Fieber, Un wohlsein, Muskelschmerz und Kopfschmerzen beobachtet, denen dicht Augensymptome der Photophobie und ein brennender Schmerz, eine Entzündung des Atmungswegs und manchmal Verletzungen der Palat-, Pharynx- oder Buccalmukosa folgen. Der charakteristische Measles-Rachenkatarrh folgt diesen prodomalen Symptomen 2–4 Tage und tritt im Gesicht und Nacken auf, wobei er sich nach unten über den Rumpf und gegebenenfalls bis zu den Extremitäten ausbreitet. Obwohl die unkomplizierte Measles-Erkrankung selten ernste Folgen hat, ist eine seltene (0,1%), aber ernste Folge der Measles-Erkrankung eine Encephalomyelitis, die zum Tod in etwa 10% der Patienten und zu bleibenden Wirkungen bei etwa der Hälfte der Patienten führen kann.
  • Die akute, virale Hepatitis kann durch eine Anzahl von viralen Mitteln verursacht werden und eine relative oder absolute Vorliebe für die Hepatozyten aufweisen. Das Spektrum der Hepatitisinfektion reicht von der subklinischen Infektion bis zur schnell voranschreitenden und fatalen Erkrankung. Nach einer veränderlichen Inkubationszeit erreicht die virale Replikation in der Leberzelle ein Maximum, dem ein Auftreten von viralen Komponenten in Körperflüssigkeiten, eine Leberzellennekrose und damit verbundene, in Labortests ermittelte Änderungen der Leberfunktion und klinische Anzeichen einer Leberzerstörung folgen. Die Hepatitis A ist ein RNA-Enterovirus. Der Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein ganz unterschiedlicher Virus, der eine große Vielfalt von akuten und chronischen, hepatischen und extrahepatischen Erkrankungen verursacht. Das HBV ist ein DNA-Virus mit einer Größe von 42 nm, mit antigenbestimmter Oberfläche und mit Kernkomponenten. Etwa 90% der mit HBV-infizierten Patienten genesen vollständig; von den verbleibenden 10% entwickeln weniger als 1% massive, hepatische Nekrose, aber eine bedeutende Anzahl kann eine chronische Hepatitis entwickeln. Es ist gezeigt worden, dass das Famciclovir die HBV-Replikation verhindert, und es wird überlegt, ob es für die Behandlung der chronischen Hepatitis B geeignet ist. Weitere Hepatitisviren sind entdeckt worden, die Hepatitis C, D und E umfassen.
  • Die WO 9842338 offenbart die immununterdrückende Wirkung oder Aktivität von Leflunomid oder dessen Stoffwechselprodukt.
  • Die Europäische Patentanmeldung 0607775 und die EP 0607776 offenbaren die Fähigkeit des nicht dem Stoffwechsel ausgesetzten Leflunomids, die Sekretion von IL-Iβ-Pegel bzw. den TNFα-Pegel zu modulieren.
  • Ein Artikel von J. K. Limb et al. mit dem Titel „Analgesic, Anti-flammatory and Anti-viral Effects of Melandrin Derivates", Yakhak Hoechi, Vol, 38, Nr. 3, 1994, Seiten 345–350, betrifft eine Untersuchung von vierzehn Melandrinderivaten auf schmerzunempfindliche, antienzündliche und antivirale Eigenschaften.
  • Die WO 9424095 lehrt die immundilatorische Aktivität von Isaxazolverbindungen bei gewissen Krankheitszuständen.
  • Es bleibt aber nötig, zusätzliche antivirale Mittel zu schaffen, die vorzugsweise einen Arbeitsmechanismus aufweisen, der sich von dem der bekannten, antiviralen Mittel unterscheidet und der in idealer Weise größere Wirkungen aufweist, wenn er mit anderen antiviralen Mitteln kombiniert wird.
  • Gemäß einer ersten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Leflunomidprodukts vorgesehen, das die Formel (II) für die Herstellung eines Medikaments für die Verwendung zur Behandlung einer viralen Infektion durch Verhindern eines viralen Virionzusammenbaus aufweist.
  • Die vorliegende Erindung schafft neue, antivirale, therapeutische Verwendungen für Leflunomidprodukte der Formel (II) und ist auf die Entdeckung gegründet, dass Leflunomid die Replikation von Viren verhindert. Die Leflunomidprodukte der Formel (II) sind entdeckt worden, um das virale Wachstum in einer Weise zu verhindern, die von der anderer, üblicher, antiviraler Mittel unterschiedlich ist, die typischerweise mit dem Verhindern einer viralen DNA-Replikation in früheren Stufen der Infektion arbeiten. Im Gegensatz dazu arbeiten die Leflunomidprodukte der Formel (II) offensichtlich durch Verhindern des Virionzusammenbaus. Daher umfassen die therapeutisch wirksamen, antiviralen Auswirkungen der Leflunomidprodukte der Formel (II) Auswirkungen, die für das Verhindern des viralen Wachstums oder das Verhindern des Virionzusammenbaus wirksam sind. Der einzigartige Mechanismus der Wirkung der Leflunomidprodukte der Formel (II) erlaubt, dass diese Medikamente gegen Viren wirksam sind, die gegen andere, übliche, antivirale Mittel einschließlich der gegen Vielfachmedikamente resistenten Viren resistent sind.
  • Gemäß einem Aspekt werden therapeutisch wirksame Auswirkungen der Leflunomidprodukte der Formel (II) offenbart, die Lebewesen einschließlich der Säugetiere verabreicht werden, die an einer viralen Infektion leiden, insbesondere an einer Infektion, die durch Herpesviren (einschließlich CMV, HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV-7 und HHV-8), Paramyxoviren (einschließlich Parainfluenza, Mumps, Meales und atmungssynzytialem Virus), Picornaviren (einschließlich Enteroviren und Rhinoviren) und Hepatitisviren (einschließlich Hepatitis A, B, C, D und E) verursacht werden. Das Leflunomidprodukt kann an Menschen mit einer Dosis verabreicht werden, die 0,1–80 mg täglich beträgt und sich zwischen Kindern und Erwachsenen ändert, oder die vorzugsweise 15–25 mg täglich beträgt, oder die äquivalente Dosen bei längeren Intervallen aufweist.
  • Es ist ins Auge gefasst worden, Leflunomidprodukte der Formel (II) mit anderen, bekannten, antiviralen Mitteln laufend zu verabreichen; in diesem Fall kann die Dosierung jedes Mittels, das für die Erzielung einer therapeutischen Wirkung während der Kombinationstherapie erforderlich ist, geringer als die Dosierung sein, die für die monotherapeutische Wirksamkeit nötig ist.
  • Gemäß einem anderen Aspekt wird ein Leflunomidprodukt der Formel (II) offenbart, das zusammen mit einem Pyridin, beispielsweise Uridin, verabreicht wird, um die Giftigkeit des Leflunomidprodukts zu vemindern, dessen Wirksamkeit aber aufrecht zu erhalten. Es ist ins Auge gefasst worden, dass die Verabreichung zusammen mit einem Pyridin die Verabreichung einer antiviralen, therapeutisch wirksamen Menge des Leflunomidprodukts der Formel (II) mit verminderten, immununterdrückenden oder giftigen Nebenwirkungen erlauben kann.
  • Ein weiterer Aspekt der Anwendung offenbart ein Verfahren zum Verhindern einer viralen Replikation durch Kontaktieren einer Zelle, die durch einen Virus infiziert worden ist, mit einer antiviralen Menge des Leflunomidprodukts der Formel (II).
  • Tierärztliche, antivirale Anwendungen des Leflunomidprodukts der Formel (II) sind ebenfalls ins Auge gefasst worden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt fleckförmige Analysedaten, die eine durch A771726 vermittelte Abschwächung der Herstellung des CMV-Stamms 8 in menschlichen Vorhautfibroblasten (HFF) und des MV-Stamms VHL/E in menschlichen Endothelialzellen einer Nabelvene (HUVEC) darstellen.
  • 2 zeigt fleckförmige Analysedaten der mit A771726 behandelten, CMV-infizierten Zellen mit oder ohne exogenösem Uridin.
  • 3 zeigt Daten einer Northern-Blot-Analyse einer mRNA, die von mit A771726 behandelten, CMV-infizierten Zelle abgezogen wurde, wobei diese Daten das Ausmaß der unmittellbar früheren (IE1) oder späteren (gB) Glykoprotein-Transkription darstellen.
  • 4 zeigt Daten einer biochemischen Analyse einer CMV-DNA-Polymerase-Aktivität in CMV-infizierten Zellen in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von A771726.
  • 5 zeigt die Überlagerung der fleckförmigen Analysedaten und Polymeraseanalysedaten sowie ferner den Mangel der Wirkung von A771726 auf die CMV-DNA-Polymeraseaktivität sogar bei einer Konzentration, die die CMV-Fleckbildung verhindert.
  • 6 zeigt fleckförmige Analysedaten, die die äquivalente Empfindlichkeit eines medikamentempfindlichen CMV-Stamms P8 und eines vielfachmedikament-resistenten CMV-Stamms D16 auf die antivirale Wirkung des A771726 darstellt.
  • 7 zeigt fleckförmige Analysedaten von Geweben eines repräsentativen Tiers, das mit dem CMV belastet und mit Leflunomid (Bezugsverbindung) behandelt ist.
  • 8 zeigt fleckförmige Analysedaten, die die Aktivität des A771726 gegen den HSV darstellen.
  • 9 zeigt Daten einer biochemischen Analyse der HSV-DNA-Polymeraseaktivität in HSV-infizierten Zellen.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung sieht neue, antivirale, therapeutische Anwendungen von Leflunomidprodukten der Formel (II) vor und ist auf die hier beschriebene Entdeckung gegründet, dass das durch Leflunomid aktive Stoffwechselprodukt N-(4-Trifluoromethylphenyl)-2-Zyano-3-Hydroxykrotonamid (A771726) die Replikation einer Vielfalt von Viren in vitro verhindert, die CMV, HSV, den Measles-Virus, Rhinovirus, den Hepatitis-B-Virus und den Hepatitis-C-Virus umfassen, und dass das A771726 bestätigt hat, dass die virale Replikation in vivo verhindert wird. im Gegensatz zu bekannten, antiviralen Mitteln wirkt dieses Leflunomidprodukt als späte Stufe bei der Virionreifung und des Virionzusammenbaus durch Verhindern der Hüllenbildung durch virale Nukleokapside. Die sich ergebenden, unvollständigen Virionen sind nicht aktiv und können deshalb nicht andere Zellen infizieren. Obwohl die Kenntnis der Aufbauorganisation der Herpesvirushülle unvollständig ist, sind viele der Haupthüllenproteine Phosphoproteine, für die eine kinas-vermittelte Phosphorylierung erforderlich ist. Daher kann das Leflunomidprodukt der Formel (II) den Hüllenzusammenbau durch Verhindern der Proteinphosphorylierung durch sein Verhindern der Tyrosinkinaseaktivität aufhalten.
  • Der einzigartige Mechanismus der Wirkung von Leflunomidprodukten der Formel (II) erlaubt diesen Medikamenten, gegen Viren aktiv zusein, die gegen andere, übliche antivirale Mittel resistent sind. Von einem gegen ein Vielfachmedikament resistenten Stamm des CMV wird hier nachgewiesen, dass er genau so empfindlich auf das Leflunomidprodukt der Formel (II) wie medikamentempfindliche Stämme des CMV reagiert.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden therapeutisch wirksame Mengen eines Leflunomidprodukts an Lebewesen verabreicht, die Säugetiere umfassen, die an viraler Infektion leiden. Die Erfindung beabsichtigt die Behandlung einer Infektion durch jeden Virus, der die Herpesviren (einschließlich CMV, HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7 und HHV-8), die Paramyxoviren (einschließlich Parainfluenza, Mumps, Measles und den atmungssynzytialen Virus [RSV]), Picornaviren (einschließ lich Enteroviren und Rhinoviren), Togaviren, Koronaviren, Arenaviren, Bunyaviren, Rhabdoviren, Orthomyxoviren, (einschließlich Viren der Influenza A, B und C), Reoviren (einschließlich Reoviren, Rotaviren und Orbiviren), Parviviren, Adenaviren, Hepatitisviren (einschließlich A, B, C, D und E) und Retroviren (einschließlich HTLV und HIV) umfasst. Die Behandlung sowohl der akuten Infektion als auch der chronischen Infektion sind beabsichtigt.
  • Antivirale, therapeutisch wirksame Mengen der Leflunomidprodukte der Formel (II) sind Mengen, die zum Verhindern des viralen Wachstums, d. h. der Replikation, oder zum Verhindern des Virionaufbaus wirksam sind. Die Leflunomidprodukte können an Menschen mit Dosen verabreicht werden, die 0,1–80 mg/Tag oder mehr je nach der Behandlung von Kindern und Erwachsenen betragen, oder vorzugsweise mit Dosen verabreicht werden, die 15–25 mg/Tag für Erwachsene betragen. Am besten sind Dosen, die derart berechnet werden, dass sie einen Blutkreislaufpegel von 40–60 μM aufweisen. Eine äquivalente Dosierung der Leflunomidprodukte der Formel (II) kann bei längeren Intervallen, beispielsweise größere Dosn einmal oder zweimal wöchentlich, aufgrund der längeren Halblebenszeit von 2–5 Tagen des Leflunomidprodukts bei Menschen verabreicht werden. Die therapeutisch wirksame Dosis kann derart eingestellt werden, dass eine maximale Verminderung der viralen Replikation oder der Infektion auftritt, ohne dass sich eine exzessive Giftigkeit ergibt. Die für die Erzeugung antiviraler Wirkungen erforderliche Dosis der Leflunomidprodukte der Formel (II) ist auch erwartungsgemäß geringer als die Dosis, die für die Schaffung immununterdrückender Wirkungen erforderlich sind. In Tierversuchen ergaben bei extrem hohen Dosen von Leflunomid eine Leber- und Herzvergiftung. Bei Menschen besteht eine Nebenwirkung der Häufung des Stoffwechselprodukts Trifluoromethyl-Anilins in einer Heinz-Körper-hämolitischen Blutarmut; das Auftreten einer Blutarmut in einem Patienten kann daher ein frühes, empfindliches Anzeichen für nachteilige Nebenwirkungen aufgrund der Leflunomidproduktverabreichung und ein Maß für eine entsprechende Medikamentdosierung sein.
  • Leflunomidprodukte der Formel (II) können systematisch über beispielsweise orale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Wege verabreicht werden. Das Medikament kann für eine pulverförmige Verabreichung aerosolisiert werden, in einem Spray für eine nasale Verabreichung enthalten sein, intraventrikulär oder intrathekal in der Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit oder intravenös mittels einer Infusionspumpe ständig verabreicht werden. Die Medikamente können auch örtlich über beispielsweise Tropfen (insbesondere Augentropfen), Salbe, Pflaster oder durch den Mastdarm über beispielsweise Suppositorien oder Einläufe verabreicht werden. Für Kombinationsbehandlungen können die Leflunomidprodukte und andere, antivirale Mittel gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden.
  • Diese Ausbildung der Erfindung beabsichtigt daher die Anwendung eines Leflunomidprodukts der Formel (II) beim Präparieren eines Medikaments zur Behandlung einer viralen Infektion.
  • Die Erfindung kann auch durch Verabreichung einer Leflunomidproduktkombination mit therapeutisch wirksamen Mengen eines oder mehrerer antiviraler Mittel, die keine Leflunomidprodukte sind und die Acyclovir, Ganciclovir, Vidarabidin, Foscarnet, Cidofovir, Amantidin, Ribavirin, Trifluorothymidin, Interferon-alpha, Zidovudin, Didanosin oder Zalcitabin umfassen. Die therapeutisch wirksamen Dosen all dieser Medikamente bei der Kombinationstherapie werden niedriger als die üblichen Dosen für jedes Medikament sein, das für ein einzelnes Medikament bei der Monotherapie verwendet wird.
  • Eine virale Infektion, insbesondere die Herpesvireninfektion, ist mit einer erhöhten Anfälligkeit von Krebsen verbunden. Es wird erwartet, dass die Behandlung mit dem Leflunomidprodukt der Formel (II) das Wachstum dieser Krebse verhindern oder vermindern kann. Beispielsweise ist das EBV mit der Afrikanischen Burkitt-Lymphoma, dem anaplastischen, nasopharyngealen Krebs, der lymphozytischen Lymphoma und B-Zellen-Bösartigkeit verbunden, während das HHV-8 mit dem Kaposi-Sarkom verbunden ist.
  • Eine weitere Ausbildung der Erfindung beabsichtigt das Verhindern der viralen Replikation durch Kontaktierung einer mit einem Virus infizierten Zelle, mit einer antiviralen Menge des Leflunomidprodukts. Die Erfindung beabsichtigt das Verhindern der Replikation jedes Virus, der die Herpesviren (einschließlich CMV, HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7 und HHV-8), Paramyxoviren (einschließlich Parainfluenza, Mumps, Meales und das atmungssyncytiale Virus [RSV]), Picornaviren (einschließlich Enteroviren und Rhinoviren), Togaviren, Koronaviren, Arenaviren, Bunyaviren, Rhabdoviren, Orthomyxoviren, (einschließlich Viren der Influenza A, B und C), Reoviren (einschließlich der Reoviren, Rotaviren und Orbiviren), Parvoviren, Adenoviren, Hepatitisviren (einschließlich A, B, C, D und E) und Retroviren (einschließlich HTLV und HIV) umfasst.
  • Die hier verwendete Bezeichnung „Leflunomidprodukt" bedeutet das aktive Stoffwechselprodukt der Formel (II), nämlich das N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-Zyano-3-Hydroxykrotonamid (A771726) oder andere davon abgeleitete Derivate, die im US-Patent 5 519 042 (Formel II) beschrieben sind, s. Formel des Anspruchs 1.
  • Diese Produkte können durch an sich bekannte Verfahren präpariert werden, die solche umfassen, die in den US-Patenten 4 087 535 , 4 351 841 und 4 965 276 beschrieben sind. Eine für das Verhindern viralen Wachstums oder der Replikation fähi ge Behandlung ist eine solche, die die Reifung des vollständigen Virions aufhält oder verhindert und damit die Ausbreitung der Infektion auf andere Wirtszellen aufhält oder vermindert.
  • Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, Patienten bei einem Risiko einer viralen Infektion oder Patienten, die bereits mit einem Virus infiziert sind, zu behandeln. Der hier verwendete Begriff „Behandlung" bedeutet dabei sowohl eine prophylaktische Behandlung als auch eine therapeutische Behandlung. Es ist beabsichtigt, dass die Leflunomidprodukte der Formel (II) insbesondere zur Behandlung von Patienten nützlich sind, die Organtransplantate einschließlich Haut, Herz, Lunge, Niere, Leber, Inselzellen der Bauchspeicheldrüse, Knochenmarkstransplantate, andere Allotransplantate, Kombinationsallotransplantate, beispielsweise Herz-Lunge, und Xenotransplantate umfassen. Diese Patienten besitzen ein hohes Risiko einer Entwicklung von ernsten, viralen Infektionen, insbesondere CMV-Infektionen, nach der Transplantation. Aufgrund seiner niedrigen Giftigkeit und zweifachen Arbeitsweise als transplantaterhaltender Immununterdrücker und als antivirales Mittel, das sogar gegen medikamentresistente Viren wirksam ist, wird das Leflunomidprodukt der Formel (II) vorteilhaft diesen Patienten anstelle oder als Teil einer laufenden, immununterdrückenden Diät verabreicht.
  • Gemäß einer weiteren Ausbildung der Erfindung wird ein Leflunomidprodukt der Formel (II) zusammen mit einem Pyrimidin, beispielsweise Uridin, verabreicht, um die potentielle Giftigkeit dieses Produkts zu vermindern, während dessen therapeutische Wirksamkeit aufrecht erhalten bleibt. Es ist beabsichtigt, dass die Verabreichung zusammen mit einem Pyridin eine Verabreichung einer antiviralen, therapeutisch wirksamen Menge des Leflunomidprodukts erlauben kann, wobei die immununterdrückenden oder giftigen Nebenwirkungen vermindert werden. Antivirale Mengen des Leflunomidprodukts können verabreicht werden, um immunfähige Individuen, Neuge borene, oder immungefährdete Patienten zu heilen, die Patienten, die an AIDS leiden, oder Patienten, die an Krebs leiden oder einer Chemotherpie ausgesetzt sind, oder Patienten mit anderen Defekten in ihrem Immunsystem umfassen, ohne dass eine bedeutende, weitere Schwächung ihres Immunsystems verursacht wird.
  • Der hier verwendete Begriff „Pyrimidin" bedeutet Verbindungen, die entweder direkt oder als Zwischenmittel in Wegen zur Zuführung von Pyrimidinnukleotiden (Uridin, Zytidin und Thymidin) nützlich sind. Ein bevorzugtes Pyrimidin ist Uridin. Andere, geeignete Pyrimidine umfassen die Pyrimidinzwischenmittel Orotsäure und Orotidin. Weitere exemplarische Pyrimidine umfassen Zytidin und Thymidin, möglicherweise mit höheren Dosen.
  • Pyrimidinzusammensetzungen werden grundsätzlich in Dosen verabreicht, die 1–5000 mg/kg je Tag unter oraler Gabe, vorzugsweise in Dosen von 50–200 mg/kg je Tag unter oraler Gabe oder in äqivalenter Dosierung bei längeren oder kürzeren Intervallen betragen. Die Pyrimidine werden grundsätzlich nicht gut oral absorbiert, so dass andere, systemische Verabreichungswege, beispielsweise die intravenöse Verabreichung, bevorzugt werden, um geeignete Serumpegel des Uridins aufrecht zu erhalten. Menschen mit orotischer Aciduria wird grundsätzlich eine Uridin-Unterstützung mit Dosen von 150 mg/kg gegeben.
  • Die Dosierung des Leflunomidprodukts und/oder des Pyrimidins kann erhöht oder vermindert werden, und die Behandlungsdauer kann verkürzt oder verlängert werden, wie es der behandelnde Arzt festlegt. Die Häufigkeit der Dosierung hängt von pharmacokinetischen Parametern der Mittel und vom Verbreichungsweg ab. Die optimale, pharmazeutische Formulierung wird durch einen Fachmann abhängig vom Verabreichungsweg und der gewünschten Dosierung festgelegt, s. beispielsweise „Remington's Pharmaceutical Sciences", Ausgabe 18, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, S. 1435–1712. Diese Formulierungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die in-vivo-Freigabe, und die Rate der in-vivo-Beseitigung der verabreichten Mittel beeinflussen.
  • Der Fachmann wird selbstverständlich die wirksamen Dosierungen und die laufenden Verabreichungsarten optimieren, wie es guter medizinischer Brauch ist, und den klinischen Zustand des Patienten berücksichtigen. Ohne Rücksicht auf die Verabreichungsart kann die spezifische Dosis gemäß dem Körpergewicht, dem Körperflächenbereich oder der Organgröße berechnet werden. Eine weitere Verbesserung der Berechnungen, die für die Festlegung einer geeigneten Dosierung für die Behandlung nötig sind, wobei diese Dosierung jede der oben genannten Formulierungen umfasst, wird routinemäßig von den Fachleuten vorgenommen, ohne dass unpassende Versuche nötig sind, insbesondere im Licht der Dosierungsinformation und der hier offenbarten Analysen sowie auch der pharmacokinetischen Daten, die bei den oben dargelegten, menschlichen, klinischen Versuchen festgestellt wurden. Geeignete Dosierungen können durch Verwendung der aufgestellten Analysen zur Festlegung der Dosierungen der Blutpegel in Verbindung mit geeigneten Dosisrückmeldedaten festgelegt werden. Die endgültige Dosierung wird durch den behandelnden Arzt festgelegt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, die die Wirkung der Medikamente ändern, beispielsweise die spezifische Aktivität des Medikaments, die Schwere der Schädigung und die Reaktion des Patienten, das Alter, den Zustand, das Körpergewicht, die Sexualität und die Diät des Patienten, die Schwere jeder Infektion, die Verabreichungszeit und andere, klinische Faktoren. Wie Studien ergeben haben, helfen ferner Informationen über die geeigneten Dosierungspegel zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen und Zuständen.
  • Weitere Ausbildungen und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Betrachtung der folgenden, bildlich dargestellten Beispiele hervor. Das Beispiel 1 ist auf die in-vitro-Wirkung des A771726 auf die CMV- und HSV-Replikation gerichtet. Das Beispiel 2 ist auf die in-vitro-Wirkung des A771726 mit Uridin auf die CMV-Replikation gerichtet. Die Beispiele 3 und 4 sind auf die Wirkung des A771726 auf die CMV-DNA-Replikation gerichtet. Das Beispiel 5 ist auf die Wirkung des A771726 auf den CMV-Virion-Zusammenbau gerichtet. Das Beispiel 6 ist auf die Wirkung des A771726 auf einen CMV-Stamm gerichtet, der gegen ein Vielfachmedikament resistent ist. Das Beispiel 7 ist auf die antivirale Wirkung der Leflunomidbezugsverbindung auf den HSV in vivo gerichtet. Das Beispiel 8 ist auf die Wirkung des A771726 auf den HSV gerichtet. Die Beispiele 9 und 10 sind auf die Wirkung von mehreren Leflunomidprodukten auf eine Vielfalt von Viren gerichtet.
  • Beispiel 1
  • Fleckanalyse der Wirkung des Leflunomidprodukts auf die ansteckende Virusproduktion
  • Um die Wirkung von Leflunomid auf die Produktion der ansteckenden CMV in Fibroblasten zu bestimmen, wurden Standarfleckanalysen durchgeführt in Gegenwart von A771726, des aktiven Stoffwechselprodukts des Leflunomids, in einem Bereich von Konzentrationen, die denen äquivalent waren, die gezeigt worden sind, um die Immunaktivierung durch verschiedene Stimulationsverbindungen in vitro zu senken.
  • Menschliche Vorhautfibroblasten (HFF) wurden mit dem klinischen CMV-Ausscheidungsmittel P8 geimpft, das mit einem Mittel überlagert war, das 0,3% Agarose und 0–100 μM A771726 enthielt. Dann wurde diese Mischung 10–14 Tage lang bebrütet, bevor die Fleckbenummerung unter einem Mikroskop geringer Leistung vorgenommen wurde. Die Versuche wurden folgendermaßen ausgeführt. Menschliche Vorhautfibroblasten (HFF, Viromed, Minneapolis, MN) wurden in Eagles MEM (GivcoBRL, Grand Island, NY) vermehrt, die mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurden. Menschliche MRC-5-Fibroblastzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden in MEM (Gibco) vermehrt, die durch 10% fötalem Rinderserum (Hyclone, Logan, UT), 1% essentiellen Aminosäuren, 2% nicht essentiellen Aminosäuren und 5% Vitaminen (Sigma, St. Louis, MO) ergänzt wurden. Die CMV-Stämme P8 (gegen Ganciclovir empfindlich) und D16 (gegen Ganciclovir resistent) wurden aus einem Bronchialabstrich eines Herzallotransplantatempfängers gewonnen und in HFF-Zellen vermehrt.
  • Um die CMV-Produktion in Fibroblasten mengenmäßig festzulegen, wurden die FFB in Kulturplatten von 24-iger-Behältern mit dem Stamm P8 oder dem Stamm D16 bei Titern geimpft, die zur Erzeugung von 30–60 Flecken/Behälter ausreichten. Die Impfmengen wurden in 3–4 Stunden absorbiert, entfernt, und die Monoschichten wurden mit einem Mittel überlagert, das mit 0,3% Agarose und verschiedenen Konzentrationen des A771726 (4 Behälter/Konzentration) ergänzt wurde. Die Kulturen wurden 10–14 Tage lang bebrütet, und die Flecken wurden mittels eines Phasenkontrastmikroskops niedriger Leistung gezählt.
  • Die Wirkung des A771726 auf die CMV-Aktivität in menschlichen Endothelialzellen der Nabelvene (HUVEC) und die Wirkung des Medikaments auf die HSV-Aktivität sind auch untersucht worden. Da die HUVEC das agarose-unterstützte Medium nicht gut tolerieren, war eine Zwei-Schritt-Prozedur nötig. Die HUVEC wurden mit dem CMV-Stamm VHL/E oder dem Stamm BUR/E (getrennte, klinische Trennmittel, deren natürliche, endotheliale Zytopathogenizität durch Vermehrung in den HUVEC beibehalten worden ist) geimpft, und 7–10 Tage lang in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen (0–200 μM) der A771726-Zellen bebrütet, wobei diese Konzentrationen denen äquivalent waren, von denen gezeigt worden ist, dass sie die Immunaktivität durch verschiedene Stimulierungsmittel in vitro vermindern. Die Zellen wurden dann abgeerntet und durch Beschallung gespaltet. Die ansteckende Aktivität in den resultierenden Lysaten wurde mengenmäßig durch eine Fleckanalyse auf MRC-5-Fibroblasten erfasst.
  • Die Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt. Die menschlichen Endothelialzellen der Nabelzellen (HUVEC) wurden aus Kordbehältern getrennt, wie vorher beschrieben worden ist, und in einem Wachstumsmedium für Endothelialzellen (ECGM) vermehrt, das aus M-199 (Gibco) bestand, das durch 20% FBS (Hyclon), 50 μg/ml Rinderhirnextrakt [43], 12 U/ml Natriumheparin (Sigma) und 20 mM HEPES-Puffer ergänzt wurde. Alle Wachstumsflächen für die HUVEC wurden mit menschlichem Fibronektin (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) mit einer Menge von 25 μg/ml vorbehandelt. Die Reinheit aller endothelialen Trennungen wurde beim Durchgang 3 durcheine Immunoperoxidase-Durchseihung für den von-Willebrand-Faktor gewährleistet. Die Abwesenheit der kontaminierenden Leukozyten wurde durch eine gleichmäßige Negativität für das leukozyteneigene Antigen (CD45), das B-Zellen-Antigen und das monozytenspezifische Antigen (CDI1c) gewährleistet. Der CMV-Stamm VHL/E, der aus einem duodenalen Biopsiematerial von einem Knochenmarkstransplantatempfänger abgetrennt wurde, und der Stamm BUR/E, der aus dem Urin eines Nierentransplantatempfänger abgetrennt wurde, wurden in HUVEC vermehrt, um deren natürliche Endothelialzytopathogenizität beizubehalten.
  • Um die CMV-Produktion in Endothelialzellen mengenmäßig zu erfassen, wurden die zusammenströmenden HUVEC-Monoschichten in Kulturplatten von 24-iger-Behältern in dreifacher Ausfertigung eine Stunde lang mit ECGM vorbehandelt, dem verschiedene Konzentrationen des A771726, Tacolismus (FK506, Fujisawa, Deerfield, IL) Zyklosporin A (CsA, Sandoz, East Hanover, NJ), Phosphonoformat (PFA [Foscarnet], Sigma) oder Ganciclovir (Cytovene, Syntex, Morris Plains, NJ) zugesetzt wurde. Nach der Vorbehandlung wurden die Monoschichten mit phosphatgepufferter, physio logischer Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, mit dem CMV-Stamm VHL/E oder BUR/E (0,2–2 fleckbildende Einheit [PFÜ]/ml) und 30 Minuten lang bei 300 ×g zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde das Impfmittel entfernt, und die Monoschichten wurden zweimal mit PBS gewaschen, bevor frisches ECGM zugesetzt wurde, dem die oben aufgezählten Mittel zugegeben waren. Die Zellen wurden kultiviert bei ständigem Vorhandensein dieser Mittel unter Mediumaustausch alle 48 Stunden. Nach einer Inkubationszeit von 7–10 Tagen wurden die Zellen mit PBS zweimal gewaschen, durch kurze Typsinaufnahme (0,005% Trypsin/0,01% EDTA) abgeerntet durch Beschallung getrennt und in einer seriellen Lösung in den zusammenströmenden MRC5-Fibroblast-Monoschichten für die Fleckanalyse geimpft, wie an anderer Stelle noch genauer beschrieben wird. Die Daten wurden als Mittel der dreifachen oder vierfachen Behälter ±1 Standardabweichung geplotted und mit unbehandelten, CMV-infizierten Kontrollmitteln normalisiert.
  • Die in 1 gezeigten Daten, die für 3–4 Replikationsversuche repräsentativ sind, zeigen eine A771726-vermittelte, dosisabhängige Verminderung der ansteckenden Virusproduktion sowohl in Fibroblastzellen (Stamm P8 in HFF) als auch in Endothelialzellen (Stamm VHL/E in HUVEC). Datenpunkte bedeuten mittlere Flecknummern, die in 3–4 Replikationskulturbehältern erzeugt werden und die als Prozentsatz von denjenigen ausgedrückt werden, die in unbehandelten, mit CMV infizierten Kontrollmitteln erzeugt werden. Wichtig ist, dass die Dosisreaktionskurven sich nicht zwischen den beiden Virusstämmen bezüglich der Wirtszelltypen dieser Stämme bedeutend unterscheiden und ein gemeinsame ID50 von 40–60 μM anzeigen.
  • Um festzustellen, ob die antiviralen Eigenschaften des Leflunomids bei anderen, bekannten, immununterdrückenden Mitteln ebenfalls vorhanden sind, wurden ähnliche Analysen in Gegenwart von Cyclosporin (CsA) oder Tacrolimus (FK 506) bei Kon zentrationen durchgeführt, von denen gezeigt worden ist, dass sie die Immunaktivierung durch verschiedene Stimulationsmittel in vitro vermindern. Daher wurden die HUVEC mit entweder dem CMV-Stamm VHL/E oder BUR/E geimpft und in Gegenwart von A771726 (200 μm), CsA (100 ng/ml) oder FK 506 (1 ng/ml) bebrütet. Als positive Kontrollen für die Virussperrung wies jeder Versuch Zellen auf, die mit 1 mM Phosphonoformat (PFA, Foscarnet) oder 10 μg/ml Ganciclovir (GCV) behandelt waren. Diese Daten zeigten wieder eine dramatische und statistisch bedeutende, A771726-vermittelte Verminderung der CMV-Produktion (p < 0,001) mit keiner bedeutenden Sperrung durch das FK 506. Seltsamerweise wurde vom CsA beständig beobachtet, das es die Produktion des ansteckenden Virus im Vergleich mit den Aktivitäten in unbehandelten, infizierten Zellen bedeutend vergrößerte.
  • In vorläufigen Versuchen zeigte eine ähnliche Analyse, die HSV anstelle von CMV verwendete, dass A771726 eine bestimmte, beobachtete Verminderung der Fleckproduktion erzeugte.
  • Beispiel 2
  • Antivirale Wirkung des Leflunomidprodukts in Gegenwart von exogenem Uridin
  • Um festzustellen, ob die Verminderung de intrazellulären Pyrimidin-Nukleotid-Pools für die antiviralen Wirkungen des Leflunomidprodukts verantwortlich war, wurden die HUVEC mit CMV-VHL/E geimpft, wie es oben beschrieben wurde, und dann vier Tage lang in Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 mM A711726, 200 mM exogenem Uridin oder mit beidem bebrütet. Uninfizierte HUVEC waren in jedem Versuch als negatives Kontrollmittel eingeschlossen. Die Zellen wurden abgeerntet, und kleine Stichproben jeder Gruppe wurden beschallt und analysiert für die Fleckbildung auf MRC-%-Monoschichten, wie es oben beschrieben wurde. Der Rest der Zellen wurde in trichlorsaurer Säure und dann in Tri-n-Oktylamin und 1,1,2-Trichloro-Trifluoro-Ethan extrahiert. Die intrazellulären Pyrimidin-Nukleotid-(pyNTP)-Pegel wurden durch HPLC mengenmäßig erfasst.
  • Zusammenströmende HUVEC-Monoschichten in Kulturplatten von 6-ser-Behältern wurden eine Stunde lang mit frischem ECGM allein oder mit ECGM vorbehandelt, das mit 20 μM A771726, 200 μM Uridin oder mit beidem (6 Behälter/Behandlung) ergänzt wurde. Nach der Vorbehandlung wurden die Monoschichten mit dem CMV-Stamm VHL/E (1,0 PFU/Zelle) geimpft und dann bei ständiger Gegenwart von Mitteln vier Tage lang unter Zufügung von frischem Medium für 48 Stunden bebrütet. Die Zellen wurden dann durch kurze Trypsinaufnahme abgeerntet, zweimal in PBS gewaschen, auf Eis in 0,4 M trichlorsaurer Säure und dann mit Tri-n-Oktylamin und 1,1,2-Trichloro-Trifuoro-Ethan gemäß Verfahren extrahiert, die von Khym beschrieben worden sind. Die intrazellulären Nukleotid-Triphosphat-Mengenfeststellung wurde durch HPLC (Waters Associates, Milford, MA) durchgeführt, wobei eine 616-Pumpe, ein 600-S-Gradientkontroller, ein automatischer 717-plus-Probenehmer und ein 996-PDA-Detektor verwendet wurde. Dabei wurde eine starke Anionaustauschsäule von Partisil-10 SAX (Alltech Assoc. Inc., Deerfield, IL) verwendet, die mit einem Gradienten von 10–500 mM Kaliumphosphat (pH-Wert 4,5) eluiert wurde. Die vier Nukleotid-Triphosphat-Spitzen wurden durch Integration und Vergleich mit Standardmustern mengenmäßig erfasst. Um die intrazellulären Nukleotidkonzentrationen zur viralen Aktivität in Beziehung zu setzen, wurden Zellproben aus jeder Behandlungsgruppe (aufbewahrt vor dem Extrahieren) durch Beschallung gespaltet und durch Fleckbildung auf Monoschichten analysiert, wie es oben beschrieben wurde.
  • Die intrazellulären pyNTP-Pegel wurden in unbehandelten, CMV-infizierten HUVEC im Vergleich mit nicht infizierten Kontrollzellen vermindert, wurden aber nicht weiter in infizierten Zellen vermindert, die mit A771726 behandelt waren. Der Grund hierfür be steht darin, dass die HUVEC bei der Analyse in einer stationären Ruhephase waren, in der ein minimaler, intrazellulärer NZP-Verbrauch erwartet werden konnte. Das Zufügen von exogenem Uridin erhöhte die pyNZP-Pegel sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit des A771726.
  • In wichtiger Weise bildete das Zufügen von exogenem Uridin die ansteckende Virusproduktion in A771726-behandelten, CMV-infizierten EC nicht neu (Ergebnisse sind in 2 gezeigt). Daher scheint die A771726-vermittelte Sperrung der CMV-Aktivität von den Sperrwirkungen dieses Mittels auf die pyNTP-Synthese unabhängig zu sein.
  • Beispiel 3A
  • Die Wirkung des Leflunomidprodukts auf die Expression von vialem Protein
  • Versuche wurden durchgeführt, um festzustellen, bei welchem Punkt des viralen Replikationszyklus Leflunomid seine Sperrwirkungen ausübt. Unmittelbar nach der Durchdringung der Wirtszelle verlagert sich das untere CMV-Matrixprotein pp65, eine Komponente der viralen Hülle, zum Zellkern. Obwohl die nuklearen Funktionen von pp65 zu lösen bleiben, wirkt ein anderes Hüllenprotein (pp71), das in ähnlicher Weise wandert, zusammen mit zellulären Proteinen derart, dass eine schnelle Transkription von unmittelbar vorhergehenden (IE), viralen Genen gefördert wird. IE-Genprodukte sind vorwiegend Regulatorien, die eine frühere Gentranskription aktivieren, dessen Produkte für die virale DNA-Replikation wichtig sind. Die Aktivierung der späten Gene, die die Proteinaufbaukomponenten des Virions primär kodieren, tritt im Replikationszyklus spät auf und hängt von der viralen DNA-Replikation ab.
  • Um potentielle, A771726-induzierte Verletzungen in dieser zeitlichen Ereignisfolge zu orten, wurde ein Querschnitt von CMV-Proteinen in infizierten Zellen zunächst durch immunohistochemische Einfärbung folgendermaßen sichtbar gemacht. Mit dem CMV-Stamm VHL/E geimpfte HUVEC-Monoschichten, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 μM A771726 oder 1 mM Phosphonoformat (PFA) (als positive Kontrolle der Sperrung des späten Antigens) bebrütet waren, wurden in verschiedenen Intervallen fixiert und mit mAb, das für pp65, 72 kD IE1, spezifisch ist, oder mit spätem Aufbauglykoprotein B (gB) eingefärbt. Zusammenströmende HUVEC-Monoschichten in Kammerschlitten von 8-ter-Behältern (Nalge Nunc International, Naperville, IL) wurden eine Stunde lang mit frischem ECGM allein oder mit ECBM, dem 200 μM A771726 oder 1,0 mM PFA zugefügt war, vorbehandelt und dann mit dem CMV-Stamm VHL/E (2 PFU/Zelle) geimpft, wie es oben beschrieben wurde. Die Schlitten wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Mitteln in verschiedenen Intervallen bebrütet, azetonfixiert und durch das Immunoperoxidase-Verfahren eingefärbt. Primäre Antikörper waren für das Antigen, das das unmittelbar vorhergehende (IE) für das 72-kDa-CMV war (DuPont, Wilmington, DE), für das untere CMV-Matrixprotein pp65 (ViroStat, Portland, ME), das späte CMV-Aufbauglykoprotein B (gB, mAb 7–17, das generell von Dr. William J. Britt, University of Birmingham, AL, zur Verfügung gestellt wird) spezifisch oder waren irrelevante, isotyp-angepasste Antikörper als Spezifitätskontrollen.
  • Keines dieser viralen Proteine wurde daran gehindert, sich in A771726-behandelten Zellen auszudrücken. 24 Stunden nach der Impfung (pi) konnte eine nukleare Ansammlung von pp65 (rote Einfärbung) sowohl in unbehandelten als auch in A771726-behandelten Monoschichten beobachtet werden, woraus geschlossen werden kann, dass dieses Mittel weder den viralen Eintritt noch die nukleare Verlagerung stört. Die IE1-Expression schien auch durch das A771726 (IE, 48 Stunden pi) unbeeinflusst zu sein. Schließlich wurden typische gB-Einfärbemuster nach 96 Stunden pi sowohl in behandelten als auch in unbehandelten Kulturen beobachtet. Im Gegensatz dazu waren die infizierten Zellen, die mit PFA, einem Sperrmittel der CMV-DNA-Polymerase, behandelt waren, unfähig, gB auszudrücken, während pp65 und IE1 an der Expression in diesen Kulturen nicht gehindert waren.
  • Die Daten zeigten eine Erhöhung der Anzahl der infizierten Zellen in den unbehandelten Monoschichten, aber nicht in denen, die in Anwesenheit von A771726 bebrütet waren. In unbehandelten Zellen behielt der CMV-Stamm VHL/E zusätzlich zur Aufrechterhaltung seiner natürlichen, endothelialen Zytopthogenität die natürliche Neigung des CMV, eng zellverbunden zu bleiben, wobei sie sich langsam durch die geimpften Monoschichten durch eine direkte Zell-zu-Zell-Übertragung ausbreitete. Es wurde auch beobachtet, dass, während in unbehandelten Monoschichten sich der Virus zu benachbarten Zellen ausbreitete, wobei multizelluläre, infizierte Brennpunkte gebildet wurden, die Behandlung mit A771726 die virale Aktivität auf die individuellen Zellen, die durch das primäre Impfmittel infiziert waren, in hohem Maß zu beschränken schien.
  • Beispiel 3B
  • Wirkung des Leflunomidprodukts auf die viale Genexpression
  • Eine „Northern blot analysis" (Amerikanische Fleck-Analyse) wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das A771726 die Transkription von viralen, unmittelbar vorhergehenden (IE1) oder späten Glykoprotein-(gB)-mRNA mengenmäßig beeinflusst.
  • HUVEC-Monoschichten in 6-ser-Behälter-Kulturplatten wurden mit dem CMV-Stamm VHL/E (0,5 PFU/Zelle) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 μM A771726 und/oder 200 μM Uridin (6 Behälter/Behandlung) geimpft, wie oben beschrieben wurde, und für die Dauer von 48 Stunden bebrütet. Jeder Versuch umfasste auch infizierte Kulturen, die mit 1 mM PFA und 1,2 mM Ganciclovir (positive Kontrolle für die Ver hinderung der gB-Expression) behandelt waren, und auch nicht infizierte Kontrollen. 10 μg der gesamten RNA jeder Probe wurden auf einer 1,4% Agarose/0,22 M Formaldehyd-Gel getrennt, auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham Corp, Arlington Heights, IL) übertragen und mit klassifizierten Sonden untersucht, die für IE1, gB und GAPDH (eine Belastungskontrolle) spezifisch sind. Die cDNA-Sonden für CMV-IE1 und CMV-gB waren mit radioaktiven Atomen durch PCR folgendermaßen markiert. 50 ng von IE1 und gB voller Länge wurden in einer 50 μl-PCR-Reaktion bebrütet, die eine Nukleotid-Triphosphat-Mischung aufwies, die 700 nM α-(32P)dCTP (Amersham) und entweder IE1-Primer (IE1-Richtung 5' GAG GCT ATT GTA GCC TAC ACT TTG G 3' [SEQ-ID-Nr. 1] und IE1-Gegenrichtung 5' CAG CAC CAT CCT CCT CCT CCT CTG G 3' [SEQ-ID-Nr. 2]) oder gB-Primer (bG-Richtung 5 CAC CAA GTA CCC CTA TCG 3' [SEQ-ID-Nr. 3] und gB-Richtung 5' TTG TAC GAG TTG AAT TCG CGC 3' [SEQ-ID-Nr. 4]) enthielt. Eine cDNA-Sonde für GAPDH wurde mit radioaktiven Atomen markiert, die ein Zufallsprimerkit (Decaprime II, Ambion, Austin, TX) verwendete, wie vorher beschrieben worden ist. Nicht eingebaute Isotope wurden aus den klassifizierten Sonden entfernt, wobei eine G-50-Drehsäule (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) verwendet wurde. Die Membranen wurden hybridisiert, gewaschen, und die gebundene Sonde wurde durch Autoradiografie detektiert, wie vorher beschrieben worden ist. Die Membranen wurden freigelegt und wieder für die GAPDH-Sonde vorbereitet. Eine Abtastdichtemessung wurde verwendet, um die IE1-Dichte und die gB-Dichte mengenmäßig zu erfassen und um diese Werte mit denen der GAPDH zur normalisieren.
  • Die Ergebnisse, die für zwei Replikationsversuche repräsentativ sind, sind in 3 dargestellt. Die IE1- und gB-Banddichten (die durch die Abtastdichtemessung festgestellt wurden) sind als Verhältnisse mit denen der GAPDH geplotted. Wie in dieser Figur gezeigt ist, übt das A771726, während die gB-mRNA-Expression in Zellen vollständig unterdrückt wurde, die mit PFA/GCV behandelt waren, keine Verhinderungswirkung auf die Transkription des IE1-Gens oder des gB-Gens aus.
  • Beispiel 4
  • Wirkung des Leflunomidproduktes auf die CMV DNA Polymerase-Tätigkeit
  • A. Wirkung des Leflunomidprodukts auf die CMV-DNA-Synthese
  • Da die Expression von späten Strukturproteinen (wie etwa gB) von der CMV-DNA-Replikation abhängt, zeigte das Ergebnis des Beispiels 3 an, dass im Gegensatz zu den zur Zeit verwendeten Antiviren Therapeutika und Leflunomide die virale DNA-Synthese nicht hemmen. Um dies zu bestätigen, wurde die virale DNA im Anschluss an die Bebrütung der CMV-infizierten Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von A771726 durch einen Dot-Blot ermittelt. HUVEC- oder HFF-Monoschichten in 24-iger-Behälter-Kulturplatten wurden mit CMV-VHL/E (1 PFU/Zelle) beziehungsweise CMV-P8 (0,3 PFU/Zelle) geimpft und in Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 μM (HUVEC) oder 100 μM (HFF) A771726 bebrütet. Alle Versuche schlossen ansteckende Kulturen, ausgebrütet in Gegenwart von 1 mM PFA, sowie nicht ansteckende Kontrollen ein. Nach eine 48-stündigen Impfung wurden die Zellen mittels der Trypsin-Aufnahme abgeerntet, in der PBS gewaschen und für 12 Stunden bei 50°C in 0.1 mg/ml Proteinase K (Sigma) in einem Aufnahmepuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) bebrütet. Die DNA wurde in Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ammoniumazetat/Ethanol ausgeschieden und im TE-Puffer wieder aufgeschlämmt. Im Anschluss an eine Ausgleichung der Konzentrationen wurde die extrahierte DNA in 96-ger-Behälter-Mikrotiterplatten reihenweise verdünnt, und 0,4 M NaOH/10 mM EDTA wurde zu jedem Behälter hinzugefügt. Die DNA wurde in versiegelten Platten denaturiert, indem sie für 10 Minuten in einem 100°C-Wasserbad erwärmt wurde, danach mittels einer Vakuum-Dot-Blot-Sammelleitung (Bio-Rad Laboratories, Herkules, CA) in Nylonmembranen (Hybond N, Amersham) weitergeleitet und durch eine UV-Vernetzung unbeweglich gemacht. Die cDNA-Sonde wurde durch Aufnahme von HindIII des Cosmids pCM 1015 (Fleckenstein et al., Gene, 18, S. 39, 1982) erzeugt, das 45 kb der UL-Region des CMV-AD169-Genoms enthält. Die Sonde wurde als α-(32-P)dCTP durch Zufallseinlass klassifiziert. Das nicht eingeschlossene Isotop wurde durch die Verwendung einer G-50-Drehsäule (Worthington Biochemicals) von der klassifizierten Sonde entfernt. Die Membranen wurden Hybridisiert, gewaschen, und die gebundene Sonde wurde mittels Autoradiografie festgestellt.
  • Die Mengen der Virus-DNA, die in CMV-infizierter HFF synthetisiert und in Gegenwart von A771726 ausgebrütet wurden, waren etwa ungefähr gleichwertig mit den Mengen, die sich in unbehandelten, infizierten Zellen angesammelt hatten. Im Gegensatz dazu enthielten die enthaltenen PFA-behandelten Zellen keine feststellbare CMV-DNA. Identische Ergebnisse wurden in ähnlich behandeltem HUVEC beobachtet. Die Genauigkeit der Sonde wurde durch die Abwesenheit der Hybridisierung in der DNA gewährleistet, die aus nicht infizierten Zellen extrahiert wurde.
  • B. Wirkung des Leflunomidprodukts auf die CMV-DNA-Polymerase-Aktivität
  • Um die Wirkung von Leflunomid auf die virale DNA-Polymerase direkt zu prüfen, wurde die spezifische Enzymtätigkeit durch eine biochemische Analyse mengenmäßig ermittelt. Grobe Proteinextrakte, die aus CMV-infizierten HUVEC oder HFF oder von nicht infizierten Kontrollzellen vorbereitet wurden, wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des A771726 oder PFA mit aktivierten (teilweise Einzelstränge) DNA-, dATP-, dGTP-, dCTP- und (3H)TTP-Vorlagen in einem Hochsalzpuffer (hemmend für ein Säugetier, aber nicht für die CMV-DNA-Polymerase) zur Reaktion gebracht. Die Einbeziehung der Radiomarkierung in die DNA-Vorlage wurde durch eine β-Szintillationszählung gemessen, und diese Werte wurden dazu verwendet, die spezifische Enzymtätigkeit als eine Funktion der Reaktionszeit und Gesamtprotein-Konzentration der Extrakte zu bestimmen.
  • Die HUVEC wurden mit dem CMV-Stamm VHL/E oder BUR/E geimpft, und das HFF wurde mit dem CMV-Stamm P8 geimpft. Die Kulturen wurden bebrütet, bis eine etwa 100%-ige Infektion erreicht wurde, wie es durch die zytopathische Änderung bestimmt ist, dann durch eine kurze Trypsinaufnahme abgeerntet, zweimal in PBS gewaschen und durch Zentrifugierung pelletiert. Das CMV-spezifische DNA-Polymerase-Analyse beruhte auf die vorher beschriebenen Verfahren. Zellkügelchen (etwa 2 × 106 Zellen) wurden in einem 0,5 ml-Extraktionspuffer (50 mM-Tris-HC1 [pH-Wert 8,0], 3 mM Dithiothreitol, 200 mM KCL, 2 mM ATP, 2 mM MgCl2, 0,2 mM PMSF und 10% [v/v] Glyzerin) aufbewahrt und durch Beschallung getrennt. Die resultierenden Homogenate wurden durch Zentrifugierung geklärt. Jede DNA-Polymerase-Reaktionsmischung enthielt in einem Gesamtvolumen von 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 150 mM KCl, 4 mM MgCl2, 8 μg Rinderserum Albumin, 1 mM Dithiothreitol, 2,25% (v/v) Glyzerin, 100 μM jeweils von dATP, dCTP, dGTP, 1,712 μM (3H)dTTP, 14,6 μg der aktivierten Kalb-Thymus-DNA, 10 μl der CMV-infizierten oder nicht infizierten Zelllysate und verschiedene Konzentrationen von A771726 oder Phosphoformat (PFA) (3 Replikationsreaktionen/Konzentration). Jeder Versuch schloss auch eine Zeitkontrolle und Messung der ganzen, verfügbaren Radiomarkierung ein. Analysen wurden für 1 Stunde bei 37°C in Rundboden-Mikrotiter-Platten bebrütet, dann auf 96-ger-Behälter-Unifilter-GF/C-Filterplatten (Packard, Meriden, CT) abgeerntet und der Vorgang sofort durch drei Wäschen mit kaltem, 5%-TCA/1%-Natrium-Pyrophosphat beendet. Behälter, die zum Messen der gesamten, verfügbaren Markierung verwendet wurden, wurden nicht gewaschen. Im Anschluss an eine abschließende Ethanolwäsche wurden die Filterplatten getrocknet, mit einem 25 μl-Behälter-Microscint-20-Szintillations-Cocktail (Packard) versorgt und auf einer Mikroplatten-Szintillationszähler (Top-Count, Packard) gezählt. Die spezifische Tätigkeit der Polymerase wurde als Radiomarkierungs-Einbeziehungsrate pro mg des Zelllysat-Gesamtproteins (analysiert durch das BioRad-Verfahren) ausgedrückt.
  • Während die nicht infizierten Zellenextrakte die Enzymtätigkeit nicht nachweisbar hemmten, haben die Extrakte aus den CMV-infizierten, in Abwesenheit von A771726 oder PFA geprüften Zellen spezifische, virale DNA-Polymerase-Aktivitäten im Bereich des 276–379 nM-Aufnahme/h/mg-Proteins. Repräsentative Ergebnisse der Versuche, die mit Extrakten der VHL/E-infizierten HUVEC oder P8-infizierten HFF (2–4 Replikationsversuche je Virus-Zell-Kombination) durchgeführt wurden, werden in den 4 und 5 dargestellt. In 4 gezeigte Daten (spezifische als Prozentsatz von PFA/A771726-freien Kontrollen ausgedrückte Enzymtätigkeit) zeigen, dass das gezeigte A771726, während PFA die virale DNA-Polymerase-Tätigkeit in einer von der Konzentration abhängigen Weise reduzierte (mit einer vollstandigen Hemmung bei 1 Mm), keine feststellbare, hemmende Tätigkeit sogar in Konzentrationen, die die Fleckbildung (5) drastisch reduzierten, zeigte. Versuche, die mit Extrakten durchgeführt wurden, die aus dem CMV-Stamm BUR/E/infizierter HUVEC präpariert waren, zeigten im Wesentlichen identische Ergebnisse.
  • Beispiel 5
  • Wirkung des Leflunomidprodukts auf den Virionzusammenbau
  • Die Elektronübertragungsmikroskopie wurde verwendet, um die Virion-Morphologie innerhalb der A771726-behandelten oder unbehandelten, CMV-infizierten HUVEC direkt zu untersuchen. HUVEC-Monoschichten in 6-er-Behälter-Kulturplatten wurden, wie oben beschrieben, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 μM A771726 mit dem CMV-Stamm VHL/E (1,0 PFU/Zelle) geimpft und 4–7 Tage lang bebrütet. Die Zellen wurden durch eine kurze Trypsin-Aufnahnme abgeerntet, zweimal in PBS gewaschen, dann durch Hinzufügung von 1 ml 2%-igem phosphat-gepufferten Gluteraldehyd fixiert und durch Zentrifugierung wieder pelletiert. Proben wurden danach in 1%-igem, phosphatgepuffertem Osmiumtetroxid (1 Stunde) fixiert und dann in abge stufter Ethanol-Wäsche dehydriert. Die Proben wurden in das Spur-Einbettungsmedium (SEM) mit niedriger Viskosität eingebettet. Die Blöcke wurden für ein Minimum von 12 Stunden bei 70°C konserviert. Dünne Abschnitte (etwa 100 nm) wurden von den kondervierten Blöcken mit Hilfe eines Ultramikrotoms (LKB Nova) abgeschnitten und auf einem Kupfergitter mit 200 Maschen angeordnet. Die Gitter wurden mit Schwermetallen gefärbt, und zwar durch das standardmäßige, zweistufige Uranylazetat/Bleizitrat-Verfahren, danach untersucht und durch eine Person ohne Kenntnis über das Wesen der Untersuchung mit einem Zeiss-EM900-Elektronübertragungsmikroskop bei 80 kV fotografiert.
  • Typische nackte Herpes-Typ-Viruskapside mit einem Durchmesser von etwa 100 nM sind innerhalb der Kerne von infizierten Zellen erkennbar, und zwar ohne sichtbare Unterschiede in der Kapsidmenge oder Morphologie der A771726-behandelten und unbehandelten Zellen. Das deutet darauf hin, dass weder der Nukleokapsid-Zusammenbau noch die virale DNA-Verpackung durch das Leflunomid behindert werden. Jedoch erschienen tiefgründige Unterschiede innerhalb des Zytoplasmas dieser Zellen. Während die Hülle und Außenmembran in unbehandelten Zellen auf normale Weise erworben wurden, die dann das Auftreten von vollständigen Virionen mit einem Durchmesser von 200 Nm ergaben, schienen die Viruspartikel nicht weit über das 100 nM-Stadium des nackten Kapsids in Gegenwart von A771726 reif geworden zu sein. Außerdem scheinen dichte Körper, amorphe zytoplasmatische Virusprotein-Anhäufungen, die in erster Linie aus pp65 bestehen, klar in den unbehandelten Zellen membrangebunden zu sein, aber nicht in A771726-behandelten Zellen. Die Bedeutung dieser letzten Beobachtung ist nicht klar, kann aber einen zusätzlichen A771726-vermittelten Defekt in der Organisation von Virionbestandteilen darstellen.
  • Beispiel 6
  • Wirksamkeit des Leflunomidprodukts gegen den medikamentenresistenten CMV
  • Alle gegenwärtigen Anti-CMV-Chemotherapien richten sich auf die Hemmung der Virus-DNA-Replikation, obwohl sich spezifische Mechanismen unter verschiedenen Mitteln leicht verändern. Es sind klinische Stämme erschienen, die eine Kreuzresistenz gegen eine Vielfalt von Medikamenten aufweisen. Die Wirkung des Leflunomidprodukts auf die Tätigkeit des medikamentenresistenten Virus wurde folgendermaßen bewertet. Der CMV-Stamm D16 wurde von demselben Patienten isoliert wie der Stamm P8, jedoch weist D16 im Unterschied zu P8 eine Multimedikamenten-Resistenz auf. Die Fleckverminderungsanalysen, die in HFF-Kulturen durchgeführt wurden, wie oben beschrieben worden ist (Ergebnisse sind in 6 gezeigt), offenbarten Eine gleichwertige Empfindlichkeit dieser zwei Trennmittel auf A771726 (ID50 etwa 40–60 μM). Deshalb kommt die leflunomidvermittelte Hemmung der Virentätigkeit unabhängig von der Resistenz gegen gegenwärtige, klinische, chemotherapeutische Mittel vor.
  • Beispiel 7
  • Antivirentätigkeit von Leflunomid in vivo (Vergleichsbeispiele)
  • Um die Wirksamkeit von Leflunomid in der Kontrolle der Virenlast in vivo zu bestimmen, wurden immunodefiziente, nackte Ratten mit der Ratten-CMV intraperitoneal geimpft (RCMV RA67, Maastricht-Stamm, Bruggeman et al., „Arch. Virol." 76, S. 189, 1983) und das bei einer Forderungsdosis von 105 PFU/Tier, und mit Leflunomid (15 mg/kg/Tag für 14 Tage), Ganciclovir (10 mg/kg/Tag für 5 Tage) oder einem gleichen Volume des Vehikels (1% Methylcellulose) (3 Tiere/Gruppe) behandelt. Der Versuch schloss auch nicht infizierte, negative Kontrollen ein. 14 Tage nach der Imp fung wurden die Ratten euthanisiert, und Speicheldrüsen, Lungen- und Milzorgane wurden für die Analyse gesammelt. Teile von Geweben wurden abgetrennt und für die histologische Untersuchung eingefärbt. Der Rest von jedem Gewebeteil wurde homogenisiert, und mittels der Fleckanalyse wurden Monoschichten auf den fibroblastischen Rattenembryos auf den Virusertrag hin geprüft. Die erfolgreiche Infektion der Tiere wurde durch die Anwesenheit klassischer, zytomegaler, epithelialer Drüsenzellen demonstriert und zwar durch die immunohistochemische Überprüfung ders intrazellulären Expression von RCMV-Proteinen und durch die Wiederherstellung des ansteckenden Virus in der Fleckanalyse. Außerdem verminderte die Leflunomidbehandlung tatsächlich die Anhäufung von RCMV in allen drei Geweben. Daten, die durch die Fleckanalyse des Gewebe-Homogenats ermittelt wurden und von einem vertretenden Tier jeder Behandlungsgruppe erstellt und zur RCMV-infizierten, nicht behandelten Kontrolle normalisiert wurden, werden in 7 gezeigt. Obwohl die absoluten PFU-Werte, die aus den infizierten, unbehandelten Tieren abgeleitet wurden, beträchtlich zwischen Speicheldrüse (1,0 × 106 PFU/gm), Lunge und Milz (3,4 × 103 PFU/gm, 1,5 × 103 PFU/gm, in einzelner Weise) variierten, hat in allen Fällen Leflunomid die Virenlast in geimpften Tieren wesentlich vermindert.
  • Leflunomid zeigte eine bedeutende In-vivo-Antivirenwirkung in diesem anfänglichen Versuch, ungeachtet der Tatsache, dass der Dosierungsplan deutlich nicht optimal war. Bei der Befolgung der Verabreichung mit 15 mg/kg kulminiert die Serumkonzentration von A771726 bei etwa 280 μM, fällt in 6 Stunden auf die subtherapeutischen Niveaus und schließlich auf einen 24-Stunden-Tiefstwert von < 10 μM. Daten aus In-vitro-Studien haben gezeigt, dass 10 μM eine niedrige oder keine Antivirenwirkung haben (s. 1). Deshalb wird erwartet, dass weitere Versuche, die ein häufigeres Dosierungsregime anwenden, eine noch bessere Antivirenwirkung aufweisen können.
  • Beispiel 8
  • Antivirentätigkeit des Leflunomidprodukts gegen den HSV
  • A. Wirkung auf die Produktion des ansteckenden Virus
  • Um den Einfluss des Leflunomidprodukts auf die Produktion von ansteckenden HSV zu bestimmen, wurden Fleckanalysen (wie im Beispiel 1 beschrieben) mit dem HSV-Stamm KOS und mit vier individuellen, frischen, klinischen HSV-ITrennmitteln sowohl in VERO-Zellen als auch in HUVEC durchgeführt, wobei für die positive Kontrolle für die Virenhemmung Ganciclovir durch Acyclovir (ACV) ersetzt wurde. Daten, die durch die Fleckanalyse von zwei Trennmitteln (REC, SCH) in VERO-Zellen berechnet wurden und in 8 dargestellt werden, zeigen, dass die Tätigkeit von A771726 gegen HSV ähnlich wie die Tätigkeit ist, die gegen CMV beobachtet wurde. Studien von allen HSV-Trennmitteln lieferten ähnliche Ergebnisse sowohl in VERO-Zellen als auch in HUVEC.
  • B. Wirkung des Leflunomidprodukts auf die HSV-DNA-Polymerase-Tätigkeit
  • Um die Wirkung von Leflunomid auf die HSV-DNA-Polymerase direkt zu prüfen, wurde die spezifische Enzymtätigkeit durch eine biochemische Fleckanalyse bestimmt, die im Beispiel 4B beschrieben wurde. Ergebnisse, die für die Studien aller HSV-Trennmittel sowohl in VERO-Zellen als auch in HUVEC repräsentativ sind, werden in 9 dargestellt. Wie in CMV-Versuchen (Beispiel 4B) beobachtet wurde, hatte A771726 keine feststellbare, hemmende Wirkung auf die HSV-DNA-Polymerase-Tätigkeit.
  • C. Die Wirkung des Leflunomidprodukts auf den Virionzusammenbau
  • Die Elektronübertragungsmikroskopie (wie im Beispiel 5 beschrieben) wurde verwendet, um die Virionmorphologie innerhalb von behandelten A771726 oder unbehandelten, HSV-infizierten HUVEC direkt erkennbar zu machen. Die Beobachtungen waren den Beobachtungen von CMV-infizierten Zellen sehr ähnlich. Speziell in Gegenwart von A771726 scheinen HSV-Nukleokapside keine Hülle in der zytoplasmatischen Phase des Zusammenbaus zu erzeugen.
  • Beispiel 9
  • Wirkung von Leflunomidprodukten auf verschiedene Viren
  • Die Antivirentätigkeit von verschiedenen Leflunomidprodukten wurde gegen eine Vielfalt von Viren, die verantwortlich für Atmungsinfektionen sind, gemäß dem folgenden Verfahren geprüft.
  • Folgende Leflunomidprodukte wurden getestet: A771726 (bezeichnete Verbindung Nr. 99–125), N-(4-Trifluoromethylphenyl)-3-Methylisoxazol-4-Karboxamid (bezeichnete Verbindung Nr. 99–126) und N-(3-Trifluoromethylphenyl)-5-Methylisoxazol-4-Karboxamid (bezeichnete Verbindung Nr. 99–127) (bei beiden Vergleichsbeispielen die zwei letzten Verbindungen).
  • Die Viren wurden in der passenden Zellkultur kultiviert. Influenza-A- und -B-Viren wurden in Madin Darby Hundenieren-(MDCK)-Zellen gezüchtet. Der respiratorische Synzytial-Virus (RSV) (A2; ATCC) und der Parainfluenza-Virus Typ 3 (14702; klinisch isoliert vom Krankenhaus St Justine, Montreal, Kanada) wurden in den afrikanischen, grünen Affennieren-(MA-104)-Zellen gezüpchtet. Das Masern-Virus (Chicago-Stamm; CDC) wurde in den afrikanischen, grünen Affennieren-(CV-1)-Zellen gezüchtet. Adenovirus-Typ 1 (65089/Chicago) wurde in menschlichen Lungenkarzinom-(A549)-Zellen gezüchtet.
  • Leflunomidprodukte wurden auf die Hemmung der viralen, zytopathischen Wirkung (CPE) folgendermaßen getestet, wie allgemein von Barnard et al. in Antivirenchem. Chemother. 8, S. 223–233, 1997, und von Huffman et al. in Antivirenchem. Chemother. 8, S. 75–83, 1997, beschrieben worden ist. Der Test wird in 96-er-Behälter-Flachboden-Mikrotiterpltten durchgeführt. Siebeneinhalb log10-Verdünnungen jeder Testverbindung wurden zur Zellmonoschicht hinzugefügt; innerhalb von 5 Minuten wird das Virus hinzugefügt, und die Platte wird versiegelt und bei 37°C bebrütet. Der CPE wird mikroskopisch gelesen, wenn unbehandelte, infizierte Kontrollzellen ein 3 bis 4+ CPE (etwa 72 bis 96 Stunden) entwickeln. Ein bekanntes positives Kontrollmedikament wird parallel zu den Testmedikamenten bewertet. Das positive Kontrollmedikament ist Ribavirin für Influenza-, Masern-, RSV- und Parainfluenza-Viren, und die positive Kontrolle ist (S)-1-(3-Hydroxy-2-Phosphonylmethoxyprophyl)-Adenin (HPMPA) für den Adenovirus.
  • Die Daten sind in der folgenden Tabelle 1 angeführt und als wirksame, virushemmende Konzentrationen von 50% (EC50) gezeigt.
  • Ein weiterer Test, der die Neutralrot-Farbstoff-Aufnahme misst, wird durchgeführt, um die CPE-Hemmung, die im anfänglichen Test beobachtet wurde, allgemein gemäß McManus (Appl. Environment. Microbiol., 31, S. 35–38, 1976) zu bestätigen. Der Test verwendet dieselben 96-er-Behälter-Platten, nachdem der CPE bestimmt worden ist. Neutralrot wird zum Medium in jedem Behälter hinzugefügt. Durch das Virus nicht beschädigte Zellen nehmen einen größeren Anteil des Farbstoffs auf, was spektrofotometrisch auf einem computerisierten Autoleser bestimmt wird. Ein anderer EC50-Wert wird vom Farbstoff-Aufnahme-Test bestimmt.
  • Verbindungen, die sowohl durch die CPE-Hemmung als auch durch die NR-Farbstoff-Aufnahme als aktiv betrachtet werden, werden für die Verminderung des Virusertrags bewertet, der dieselben 96-er-Behälter-Platten verwendet. Der Virustiter, der in eingefrorenem und geschmolzenem Eluaten von jedem Behälter zurückbleibt, wird durch die Serienverdünnung auf Monoschichten von empfindlichen Zellen und das Beobachten der Entwicklung von CPE in diesen Zellen bestimmt (der eine Anzeige der Anwesenheit des ansteckenden Virus ist). Ein bekanntes, aktives Medikament wird auch parallel als eine positive Kontrolle verwendet. Die Daten werden verwendet, um die wirksame Konzentration von 90% (EC90) zu berechnen, die die Testmedikament-Konzentration ist, die den Virusertrag durch 1 log10 hemmt.
  • Die Zytotoxität jeder Testverbindung wird auch folgendermaßen bewertet. In den anfänglichen CPE-Hemmungstests werden zwei von nicht infizierten Zellen, die mit jeder Konzentration der Testverbindung behandelt wurden, parallel mit infizierten, behandelten Behältern Quellen geführt. Wenn der CPE mikroskopisch bestimmt wird, werden die Giftigkeitskontrollzellen auch mikroskopisch auf irgendwelche Änderungen im Zelläußeren im Vergleich zu normalen nicht infizierten, unbehandelten Kontrollzellen untersucht. Änderungen, die sich als Vergrößerung, Körnung, zerfranste Ränder, dünnes Äußeres, Abrundung, Abtrennung von der Oberfläche des Behälters) sichtbar machen können, oder andere Änderungen, erhalten die Bezeichnung T (100% toxisch), PVH (teilweise toxische bis sehr schwere 80%), PH (teilweise toxische bis schwere 60%), P (teilweise toxische 40%), PS (teilweise toxische-geringe-20%) oder 0 (nicht toxisch 0%) in Übereinstimmung mit dem beobachteten Zytotoxizitätsgrad. Eine 50% hemmende (zytotoxische) Zellkonzentration (IC50) wird durch die Rüskgangsanalyse dieser Daten bestimmt. Ein neutraler, roter IC50 wird ebenfalls, beruhend auf der Aufnahme des neutralen, roten Farbstoffes durch die Giftigkeitskontrollzellen bestimmt.
  • Die zytotoxische Wirkung von Verbindungen, die sowohl in CPE- und Neutralrot-Tests antivirusaktiv sind, wird weiter folgendermaßen ermittelt. Kulturplatten werden mit Zellen (ausreichend, wenn diese etwa zu 20% konfluent im Behältern sind) besäht und unterschiedlichen Konzentrationen des Testmedikaments ausgesetzt, während sich die Zellen schnell teilen. Die Platten werden dann in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 72 Stunden bebrütet, neutrales Rot wird hinzugefügt, und der Grad der Farbintensität, der die Zahl von lebensfähigen Zellen anzeigt, wird spektrofotometrisch bestimmt. Ein IC50 wird durch die Rückgangsanalyse bestimmt.
  • Die Aktivität jeder Verbindungwird als Selektivitätsindex (SI) ausgedrückt, der das IC50 oder IC90 geteilt durch das EC50 ist. Allgemein wird ein SI von 10 oder größer als Anzeichen für eine gute Antivirentätigkeit betrachtet, obwohl andere Faktoren, wie ein niedriger SI für die positive Prüfung auch berücksichtigt werden.
  • Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt und weisen darauf hin, dass A771726 sehr aktiv gegen Masern als auch gegen den Rhinovirus wirkt. Während die Leflunomidprodukte nicht allzu bedeutend aktiv gegen RSV zu sein schienen, haben andere Versuche in verschiedenen Systemen demonstriert, dass A771726 eine gewisse Anti-RSV-Aktivität aufweist.
  • Die Verbindungen 99–126 und 99–127 werden als Bezugsverbindungen verwendet. Tabelle 1
    CPE-Hemmungstest Neutralrot-Aufnahme-Test (NRU-Test)
    Test cpd Virus EC50 C50 SI EC50 IC50 SI
    99–125 Influenza A (H1 N1) mit Testmedikament > 20 29 < 1.4 63 63 1.0
    99–125 Influenza A (H1N1) mit positiver Medikamentenprüfung 5.8 > 100 > 17 5.6 > 100 > 18
    99–125 Influenza A (H3N2) mit Testmedikament 63 30 0.5 63 69 1.1
    99–125 Influenza A (H3N2) mit positiver Medikamentenprüfung 5.2 > 100 > 19 5.4 > 100 > 19
    99–125 Influenza B mit Testmedikament > 200 50 < 0.2 60 65 1.1
    Test Virus EC50 IC50 SI EC50 IC50 SI > 22
    cpd 99–125 Influenza B mit positiver Medikamentenprüfung 2.8 > 100 > 36 4.6 > 100
    99–125 Adenovirus Typ 1 mit Testmedikament > 1000 560 0 560 580 1
    99–125 Adenovirus Typ 1 mit positiver Medikamentenprüfung 39 310 8 23 > 460 > 20
    99–125 Masernvirus mit Testmedikament < 1 > 660 > 560 < 1 > 100 > 100
    99–125 Masernvirus mit positiver Medikamentenprüfung 41 2290 56 41 2000 49
    99–125 Parainfluenza-Virus Typ 3 mit Testmedikament 60 30 0 70 50 0
    99–125 Parainfluenza-Virus Typ 3 mit positiver Medikamentenprüfung 230 2290 10 120 4100 33
    99–125 Respiratorisches Synzytial-Virus mit Testmedikament 60 20 0 200 143 0
    99–125 Respiratorisches Synzytial-Virus mit positiver Medikamentenprüfung 290 2310 8 82 2700 33
    99–125 Rhinovirus Typ 5 mit Testmedikament 10 1000 100 10 500 50
    99–125 Rhinovirus Typ 5 mit positiver Medikamentenprüfung < 0.27 217 > 803 < 0.27 > 270 > 1000
    99–126 Influenza A (H1N1) mit Testmedikament > 20 63 < 3.2 48 48 1.0
    99–126 Influenza A (H1N1) mit mit positiver Medikamentenprüfung 5.8 > 100 > 17 5.6 > 100 > 18
    99–126 Influenza A (H3N2) mit Testmedikament > 200 72 0 30 30 1.0
    99–126 Influenza A (H3N2) mit positiver Medikamentenprüfung 5.2 > 100 > 19 5.4 > 100 > 18
    99–126 Influenza B mit Testmedikament 60 72 1.2 46 46 1.0
    99–126 Influenza B mit positiver Medikamentenprüfung 2.8 > 100 > 36 4.6 > 100 > 22
    99–126 Adenovirus Typ 1 mit Testmedikament > 100 60 0 > 100 60 0
    99–126 Adenovirus Typ 1 mit positiver Medikamentenprüfung 39 310 8 23 > 460 > 20
    99–126 Masernvirus mit Testmedikament 10 60 6 14 25 2
    99–126 Masernvirus mit positiver Medikamentenprüfung 41 2290 56 41 2000 49
    99–126 Parainfluenza-Virus Typ 3 mit Testmedikament > 100 11 0 20 20 1
    99–126 Parainfluenza-Virus Typ 3 mit positiver Medikamentenprüfung 230 2290 10 120 4100 33
    99–126 Respiratorisches Synzytial-Virus mit Testmedikament > 100 40 0 > 100 30 0
    99–126 Respiratorisches Synzytial-Virus mit positiver Medikamentenprüfung 290 2310 8 82 2700 33
    99–126 Rhinovirus Typ 5 mit Testmedikament 100 100 1 > 100 > 100 0
    99–126 Rhinovirus Typ 5 mit positiver Medikamentenprüfung < 0.27 217 > 803 < 0.27 > 270 > 1000
    99–127 Influenza A (H1N1) mit Testmedikament > 200 > 200 0 66 66 1.0
    99–127 Influenza A (H1N1) mit positiver Medikamentenprüfung 5.8 > 100 > 17 5.6 > 100 > 18
    99–127 Influenza A (H3N2) mit Testmedikament > 200 63 0 46 46 1.0
    99–127 Influenza A (H3N2) mit positiver Medikamentenprüfung 5.2 > 100 > 19 5.4 > 100 > 18
    99–127 Influenza B mit Testmedikament > 200 > 200 0 47 60 1.1
    99–127 Influenza B mit positiver Medikamentenprüfung 2.8 > 100 > 36 4.6 > 100 > 22
    99–127 Masernvirus mit Testmedikament > 100 60 0 > 100 30 0
    99–127 Masernvirus mit positiver Medikamentenprüfung 41 2290 56 41 2000 49
    99–127 Parainfluenza-Virus Typ 3 mit Testmedikament > 100 20 0 > 100 15 0
    99–127 Parainfluenza-Virus Typ 3 mit positiver Medikamentenprüfung 230 2290 10 120 4100 33
    99–127 Respiratorisches Synzytial-Virus mit Testmedikament > 100 30 0 > 100 20 0
    99–127 Respiratorisches Synzytial-Virus mit positiver Medikamentenprüfung 290 2310 8 82 2700 33
  • Die Verbindungen 99–125, –126 und –127 wurden gegen HSV-1, HSV-2 und hCMV getestet, wobei ein ähnöiches Protokoll angewendet wurde, mit der Ausnahme jedoch, dass das Medikament eine Stunde (anstatt 5 Minuten) vor der Infizierung hinzugefügt wurde, so dass das Analysesystem Hemmstoffe von frühen Replikationsschritten, wie etwa Adsorption oder Penetration, sowie auch spätere Ereignisse entdecken kann. Bei den Analysen wurden mindestens sechs Medikamentenkonzentrationen in 5-fachen Abstufungen verwendet, die von 100 μg/ml bis 0.03 μg/ml reichten. Die Angaben wurden zur Berechnung der Medikamentendosis verwendet, die die Virusreplikation um 50% (EC50) hemmt. Unter Verwendung des Neutralrot-Farbstoff-Tests wurde auch eine cytotoxische Konzentration 50 (CC50) berechnet. Die Verbindungen 99–128 (A771726) zeigten eine gute Aktivität gegen das menschliche CMV, aber nicht gegen HSV-1 und HSV-2. Der Unterschied zwischen diesen Ergebnissen und den Ergebnissen in Bezug auf HSV, der oben im Beispiel 8 beschrieben wurde, wird durch die Tatsache erklärt, dass dieses Protokoll nur CPE bewertete und eben nicht den Virusertrag von den geimpften Kulturen und dass dieses Protokoll eine höhere, impfende Antikörperkonzentrationen (Titer) hätte verwenden können. Obwohl es so scheint, dass A771726 die Virus-Nucleokapsid-Hüllenbildung hemmt, indem es die Produktion von vollständigen, ansteckenden Virionen durch infizierte Zellen drastisch vermindert, verhindert es weder dem primären Impfstoff den Zugang in die Gastgeberzellen noch die Entwicklung von morphologischen, zytopathischen Änderungen innerhalb der infizierten Zellen. Deshalb bietet eine einfache Beobachtung von CPE keinen Hinweis auf das Ausmaß der ansteckenden Virusproduktion, insbesondere im Anschluss an eine hohe Titerilmpfung, und CPE konnte trotz der Verminderung des durch das Leflunomidprodukt zur Verfügung gestellten Virusertrags beobachtet werden.
  • Beispiel 10
  • Wirkung des Leflunomidprodukts auf Hepatitis B- und -C-Viren
  • Die antivirale Wirkung von Leflunomidprodukten auf den Hepatits-B-Virus (HBV) allein und auch in Kombination mit Uridin wurde folgendermaßen gemäß Korna et al., „Antiviral Res." 217, S. 217, 1991, allgemein geprüft.
  • HBV chronisch erzeugende, menschliche 2.2.15-Leberzellen (Aos et al., „Proc. Nat'l Acad. Sci." 84, S. 4641, 1987) wurden in 24-er-BehälterI-Gewebekulturplatten dauerhaft geimpft und gezüchtet, damit sie zusammenwachsen. Testverbindungen wurden täglich für eine kontinuierliche, 9-tägige Periode hinzugefügt, und das Kulturmedium wurde täglich während der Behandlungsperiode geändert. Das Kulturmedium wurde gesammelt und aufbewahrt, um eine Analyse der extrazellulären (Virion) HBV-DNA nach 0, 3, 6 und 9 Behandlungstagen vornehmen zu können. Behandelte Zellen wurden 24 Stunden nach dem 9. Behandlungdtag lysiert, damit die intrazelluläre HBV-Genom-DNA analysiert werden konnte. Die HBV-DNA wurde dann auf eine quantitative und qualitative Weise auf die gesamten Niveaus der HBV-DNA (sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre DNA-Niveaus) und auf die Verhältnisrate der HBV-Replikation (angezeigt durch intrazelluläre DNA-Niveaus) analysiert.
  • HBV-DNA wurde mit Hilfe der Blot-Hybridisierungsverfahren (Southern and Slot Blot) und 32P-klassifizierten, HBV-spezifischen Sonden geprüft. Die HBV-DNA-Pegel wurden durch Vergleich mit bekannten Mengen von HBV-DNA-Standardwerten bestimmt, die jeder Nitrozellulosemembran (Gel oder Slor-Blot) zugeführt. Ein AMBIS-Beta-Abtaster wurde verwendet, um den radioaktiven Zerfall der hybridisierten Sonden direkt von der Nitrozellulosemembran zu messen. Durch vielfache Analysen erzeugte Standardkurven wurden verwendet, um cpm-Messungen mit den verhältnismäßigen HBV-DNA-Zielniveaus in Übereinstimmung zu bringen. Die Niveaus der ex trazellulären HBV-Virion-DNA wurden mittels dem Slot-Blot-Hybridisierung-Verfahren analysiert. Die Wirkung der Medikamentenbehandlung wurde anhand eines Vergleichs der HBV-DNA-Niveaus mit den Niveaus am Tag 0 bewertet. Den Replikationszustand bestimmte man durch die Messung der HBV-DNA-Niveaus in jeder der drei Klassen von Virengenomformen (episomale Monomere, DNA-Replikationszwischenprodukt und integrierte HBV-DNA). Die Niveaus der Replikationszwischenprodukte und episomaler Monomere wurden als ein Hinweis des Verhältnisniveaus der HBV-Replikation verwendet, während die Niveaus der integrierten HBV-DNA dazu verwendet wurden, um die Verhältnismengen der DNA in jedem Weg zu normalisieren (von der integrierten HBV-DNA wird erwartet, dass sie auf der Pro-Zellbasis unveränderlich bleibt).
  • Die Giftigkeit von Testverbindungen in Bezug auf Kulturen von 2.2.15-Zellen wurde folgendermaßen bestimmt. Vier Konzentrationen jeder Verbindung wurden geprüft und mit unbehandelten Kontrollkulturen verglichen. Die Giftigkeit wurde durch die Aufnahme des neutralen, roten Farbstoffes festgelegt, wie es durch den Absorptionsgrad bei 510 nm hinsichtlich unbehandelter Zellen bestimmt wird.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Sie deuten darauf hin, dass A771726 und N-(4-Trifluoromethylphenyl)-3-Methylisoxazol-4-Karboxamid (Bezugsverbindung) eine gewisse Antivirenwirkung auf HBV aufweisen, die erhöht wird, wenn das Leflunomidprodukt mit Uridin kombiniert wird. Tabelle 2
    Verbindung EC50 EC90 CC50 SI
    99–125 > 100 > 100 71 ND
    99–126 > 100 > 100 110 ND
    99–127 11 96 67 0.7
    99–125 mit Uridin 34 337 78 0.2
    99–126 mit Uridin 4.3 73 99 1.4
    99–127 mit Uridin 4.2 31 84 2.7
    Uridin allein > 100 > 100 > 100 ND
  • Außerdem führte die klinische Behandlung eines menschlichen Patienten, der unter chronischer Hepatitis-C-Infektion leidet, mit Leflunomid (HWA-486; Bezugsverbindung) zu einer Abnahme der CMV-Virenlast des Patienten. Der Patient ist ein 62 Jahre alter Mann (mit weißer Hautfarbe), der im Januar 1990 eine Leberverpflanzung wegen Hepatitis C erhielt. Im Laufe der folgenden neun Jahre entwickelte er eine indolente Hepatitis C mit leicht erhöhten Leberenzymen. Wegen der langsam progressiven Nierenschwächung, die vermutlich auf die Kombination einer chronischen Hepatitis C und einer langzeitigen Zyklosporin-Behandlung zurückzuführen ist, ist bei ihm mit der Leflunomid-Behandlung angefangen worden. Zu Beginn dieser Behandlung wurde eine Leberbiopsie durchgeführt, die eine leichte Fibrose und milde Portalentzündung übereinstimmend mit einer chronischen Hepatitis C zeigte. Nach einer anfänglichen, täglichen Leflunomid-Ladungsdosis von 300 mg, die für zwei Tage bestimmt war, ist mit einer Wartungsdosis von 50 mg täglich begonnen worden.
  • Seine Blutwerte von A771726 haben sich anfänglich auf 113 μg/ml erhöht. Als sein A771726-Blutwert 40 μg/ml betrug, wurde seine Zyklosporin-Dosis von 160 mg täglich auf 60 mg täglich allmählich vermindert, und seine 12-Stunden-Cyklosporin-Grundblutwerte fielen von 150 ng/ml bei Beginn der Therapie auf 70 ng/ml zum Zeitpunkt der wiederholten Hepatitis-CUntersuchung. Seine tägliche Prednison-Dosis von 10 mg ist nicht geändert worden.
  • Weil das neue Behandlungsprogramm eingeführt wurde, verbesserte sich seine Nierenfunktion; sein Serumkreatinin fiel von 3,6 mg/dl auf 2,2 mg/dl, und sein Blut-Harnstoff-Stickstoff fiel von 94 mg/dl auf 55 mg/dl. Kurz bevor die Leflunomidbehandlung gestartet wurde, lag seine Hepatitis-C-Virenlast im peripherischen Blut bei 3.120.000 Kopien, gemessen durch die quantitative PCR-Analyse (Quest Diagnostics). Nach sechs Wochen Leflunomid-Therapie war seine Hepatitis-C-Virenlast auf 1.480.000 Kopien gefallen, gemessen durch dieselbe PCR-Analyse.
  • Diese Daten weisen darauf hin, dass die Leflunomid-Therapie in Zusammenhang mit einem Abfall von 50% in der Hepatitis-C-Virenbelastung des Patienten stand.

Claims (18)

  1. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge des Antirheumaprodukts Leflunomid zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass das Leflunomidprodukt durch folgende Formel II dargestellt wird:
    Figure 00580001
    wobei R1 bedeutet a) Methyl, b) (C3-C6)-Zykloalkyl, c) (C2-C6)-Alkyl, das mindestens eine Dreifach- oder Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen aufweist, R2 bedeutet a) -CF3 oder b) -CN, R3 bedeutet a) (C1-C4)-Alkyl oder b) Wasserstoffatom, und X bedeutet a) -CH-Gruppe oder b) Stickstoffatom und dass diese Verbindung als solche oder in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes vorhanden ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 bedeutet a) Methyl, b) Zyklopropyl oder c) -CH2-CH2C-CH, R2 bedeutet -CF3, R3 bedeutet Methyl oder Wasserstoffatom und X bedeutet -CH-Gruppe.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 bedeutet Methyl, R2 bedeutet -CF3, R3 bedeutet Wasserstoffatom, und X bedeutet -CH-Gruppe.
  4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, die physiologisch annehmbaren Salze der Verbindungen der Formel II Alkali-Metall-, Alkali-Erdmetall- oder Ammoniumsalze sind, wobei die Salze der physiologisch annehmbaren, organischen Ammoniumbasen eingeschlossen sind.
  5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Paramyxovirus, Pikornavirus oder Hepatitis-Virus ist.
  6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein CMV-Virus, Herpes-simplex-Virus (HSV), Measles-Virus, Rhinovirus, Hepatitis B oder Hepatitis C ist.
  7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Hepatitis-Virus ist.
  8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Herpes-Virus ist.
  9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Zytomegalo-Virus (CMV) ist.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Leflunomidprodukt N-(4-Trifluormethylphenyl)-2-zyano-3-hydroxykrotonamid (A771726) ist.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verordnete Menge des Leflunomidprodukts im Bereich von 0,1–80 mg/Tag liegt.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament eine Menge an Leflunomidprodukt aufweist, die das virale Wachstum wirksam verhindert.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament eine Menge an Leflunomidprodukt aufweist, die einen viralen Virionaufbau wirksam verhindert.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus gegen Antiviralwirkmittel resistent ist, die eine virale DNA-Replikation verhindern.
  15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zusammen mit einem anderen Antiviralwirkmittel verschrieben wird.
  16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zusammen mit einem Pyrimidin verschrieben wird, das die Niveaus von Uridin, Zytidin oder Thymidin in einem Patienten erhöhen kann.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Pyrimidin Uridin, Orotsäure oder Orotidin ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Pyrimidin Orotsäure oder Orotidin ist.
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