DE60027691T2

DE60027691T2 - Beta-D-2',3'-didehydro-2',3'-didesoxy-5-fluorcytidin für die Verwendung in der Behandlung von HIV Infektionen

Info

Publication number: DE60027691T2
Application number: DE60027691T
Authority: DE
Inventors: F. Raymond Decatur SCHINAZI; Jennifer Pittsburgh HAMMOND; W. John Pittsburgh MELLORS; C. Dennis McDonough LIOTTA
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2020-01-22
Also published as: DE60027691D1; PL198237B1; KR20020068260A; NO323586B1; NO20013599L; WO2000043014A8; ES2263449T3; RU2254133C2; NO20013599D0; WO2000043014A2; EP1143976A2; WO2000043014A3; CN1337880A; PT1143976E; EP1143976B1; ATE324894T1; CN101219148A; CA2360039A1; AU2627000A; KR100745408B1

Description

Diese Erfindung wird teilweise durch Fördergelder der nationalen Gesundheitsinstitute der Vereinigten Staaten (United States National Institutes of Health) unter der Fördergeld Nr. 1R01-A1-41980-01 gefördert. Die US Regierung besitzt bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US Provisional Patentanmeldung Nr. 60/116,773, die am 22. Januar 1999 eingereicht wurde.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Jahre 1983 wurde berichtet, dass das humane Immundefizienz Virus (HIV) als die etiologische Ursache von AIDS bestimmt wurde. Im Jahr 1985 wurde berichtet, dass das synthetische Nukleosid 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT) die Replikation des humanen Immundefizienz Virus inhibiert. Seit damals wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von anderen synthetischen Nukleosiden, einschließlich 2',3'-Didesoxyinosin (DDI), 2',3'-Didesoxycytidin (DDC), 2',3'-Didesoxy-2',3'-didehydrothymidin (D4T), cis-2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (FTC), (–)-cis-2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (3TC) wirksam gegen HIV sind. Nach der zellulären Phosphorylierung an dem 5'-Triphosphat durch zelluläre Kinasen werden diese synthetischen Nukleoside in einen wachsenden Strang von viraler DNA eingebaut, was einen Kettenabbruch aufgrund der Abwesenheit der 3'-Hydroxyl Gruppe bewirkt. Sie können auch das virale Enzym reverse Transkriptase inhibieren.
Es wurde erkannt, dass Arzneimittel resistente Varianten von HIV nach verlängerter Behandlung mit einem antiviralen Mittel auftreten können. Arzneimittel Resistenz tritt am typischsten durch Mutation eines Gens auf, das für ein Enzym kodiert, das in der viralen Replikation verwendet wird, und am typischsten im Fall von HIV, reverse Transkriptase, Protease oder DNA Polymerase. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Wirksamkeit eines Arzneimittels gegen HIV Infektion verlängert, erhöht oder wiederhergestellt werden kann durch das Verabreichen der Verbindung in Kombination oder abwechselnd mit einer zweiten und möglicherweise dritten antiviralen Verbindung, die eine andere Mutation induziert im Vergleich zu jener, die durch das Haupt Arzneimittel verursacht wird. Alternativ dazu können die Pharmakokinetiken, die Bioverteilung und andere Parameter des Arzneimittels durch eine solche Kombination oder abwechselnde Therapie verändert werden. Im Allgemeinen ist die Kombination typischerweise gegenüber der abwechselnden Therapie bevorzugt, weil sie unterschiedlichen gleichzeitigen Druck auf das Virus induziert. Es kann jedoch nicht vorhergesagt werden, welche Mutationen in dem HIV-1 Genom durch ein gegebenes Arzneimittel induziert werden, ob die Mutation dauerhaft oder vorübergehend ist oder wie eine infizierte Zelle mit einer mutierten HIV-1 Sequenz auf die Therapie mit anderen Mitteln in Kombination oder abwechselnd ansprechen wird. Dies wird durch die Tatsache gesteigert, dass es einen Mangel an Daten über die Kinetiken von Arzneimittel Resistenz in Langzeit Zellkulturen gibt, die mit modernen antiretroviralen Mitteln behandelt wurden.
HIV-1 Varianten, die gegenüber 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT), 2',3'-Didesoxyinosin (DDI) oder 2',3'-Didesoxycytidin (DDC) resistent sind, wurden aus Patienten isoliert, die eine Langzeit Monotherapie mit diesen Arzneimitteln erhielten (Larder BA, Darby G, Richman DD. Science 1989; 243: 1731–4; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, et al. Science 1991; 253: 1557–9; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, et al. Science 1991; 253: 1557–9; und Fitzgibbon JE, Howell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin DT. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 153–7). Wachsender klinischer Beweis zeigt, dass AZT Resistenz eine Vorhersage für einen schlechten klinischen Ausgang in sowohl Kindern als auch Erwachsenen ist (Mayers DL. Vortrag auf der 32. wissenschaftl. Konferenz über antimikrobielle Mittel und Chemotherapie. (Anaheim, CA. 1992); Tudor-Williams G, St Clair MH, McKinney RE, et al. Lancet 1992; 339: 15–9; Ogino MT, Dankner WM, Spector SA. J Pediatr 1993; 123: 1–8; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VA, et al. Dritter Arbeitskreis über Virale Resistenz. (Gaithersburg, MD. 1993); und Mayers D, und die RV43 Studiengruppe. Dritter Arbeitskreis über virale Resistenz (Gaithersburg, MD. 1993)). Über die schnelle Entwicklung von HIV-1 Resistenz gegenüber Nicht Nukleosid reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTIs) wurde ebenfalls in Zellkultur als auch in klinischen Versuchen mit Menschen berichtet (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ, et al. J Virol 1991; 65 (9): 4487–92; Richman D, Shih CK, Lowy I, et al. Proc Natl Acad Sci (USA) 1991; 88: 11241–5; Mellors JW, Dutschmann GE, Im GJ, Tramontano E, Winkler SR, Cheng YC. Mol Pharm 1992; 41: 446–51; Richman DD und das ACTG 164/168 Studienteam. Zweiter Internationaler HIV-1 Arzneimittel Resistenz Arbeitskreis. (Noordwijk, Niederlande, 1993); und Saag MS, Emini EA, Laskin OL, et al. N Engl J Med 1993; 329: 1065–1072). Im Fall des NNRTI L'697,661 trat Arzneimittel resistentes HIV-1 innerhalb von 2–6 Wochen nach Beginn der Therapie in Zusammenhang mit der Rückkehr von Virämie auf Mengen vor der Behandlung auf (Saag MS, Emini EA, Laskin OL, et al. N Engl J Med 1993; 329: 1065–1072). Eine ausbrechende Virämie, die mit dem Auftreten von Arzneimittel resistenten Stämmen assoziiert ist, wurde auch mit anderen Klassen von HIV-1 Inhibitoren, einschließlich Protease Inhibitoren beobachtet (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil K, Mous J. Dritter Arbeitskreis über virale Resistenz. (Gaithersburg, MD, 1993)). Diese Erfahrung hat zu der Erkenntnis geführt, dass das Potenzial für HIV-1 Arzneimittel Resistenz früh in der präklinischen Bewertung von allen neuen Therapien für HIV-1 bewertet werden muss.
2',3'-Didesoxy-2',3'-didehydro-5-fluorcytidin (D4FC) ist eine bekannte Verbindung. Die Veröffentlichungsschrift der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 409 227 A2, eingereicht von Ajinomoto Co., Inc., offenbart β-D-D4FC (Beispiel 2) und seine Verwendung, um Hepatitis B zu behandeln. Das niederländische Patent Nr. 8901258, eingereicht von Stichting Rega V. Z. W. offenbart allgemein 5-Halogen-2',3'-didesoxy-2',3'-didehydrocytidin Derivate für die Verwendung in der Behandlung von HIV und Hepatitis B ("HBV"). Das US Patent Nr. 5,703,058 offenbart ein Verfahren für die Behandlung von HIV und HBV Infektion, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge von β-L-D4FC in Kombination oder abwechselnd mit cis-2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan, cis-2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan, 9-[4-(Hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1-yl)-guanin (Carbovir), 9-[(2-Hydroxyethoxy)methyl]-guanin (Acyclovir), Interferon, 3'-Desoxy-3'-azido-thymidin (AZT), 2',3'-Didesoxyinosin (DDI), 2',3'-Didesoxycytidin (DDC), (–)-2'-Fluor-5-methyl-β-L-ara-uridin (L-FMAU) oder 2',3'-Didehydro-2',3'- didesoxythymidin (D4T) umfasst. Das US Patent Nr. 5,905,070 offenbart ein Verfahren für die Behandlung von HIV und HBV Infektion, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge von β-D-D4FC in Kombination oder abwechselnd mit cis-2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan, cis-2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan, 9-[4-(Hydroxymethyl)-2-cyclopenten-1-yl)-guanin (Carbovir), 9-[(2-Hydroxyethoxy)methyl]guanin (Acyclovir), Interferon, 3'-Desoxy-3'-azido-thymidin (AZT), 2',3'-Didesoxyinosin (DDI), 2',3'-Didesoxycytidin (DDC), (–)-2'-Fluor-5-methyl-β-L-ara-uridin (L-FMAU) oder 2',3'-Didehydro-2',3'-didesoxythymidin (D4T) umfasst.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die optimale Verabreichung von β-D-D4FC für die Behandlung von HIV zu bestimmen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Zusammensetzung bereitzustellen, die β-D-D4FC für die Behandlung von Patienten, die mit HIV infiziert sind, einschließt, die vorteilhafte und verbesserte Pharmakokinetik, Bioverteilung, metabolische, Resistenz oder andere Parameter gegenüber der Verabreichung von β-D-D4FC alleine zeigt.
Es ist noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Zusammensetzung für die Behandlung von Patienten bereitzustellen, die mit HIV infiziert sind, in der β-D-D4FC in Kombination oder abwechselnd mit einer zweiten Verbindung verabreicht wird, die synergistisch mit β-D-D4FC gegen das Virus wirkt.
Es ist noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Zusammensetzung für die Behandlung von Patienten bereitzustellen, die mit einer Arzneimittel resistenten Form von HIV infiziert sind.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und einen Kit bereitzustellen, um zu bewerten, wie β-D-D4FC am besten verabreicht wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde entdeckt, dass β-D-D4FC Mutationen in HIV-1 an dem Kodon 70 (K nach N), 90 und 172 der reversen Transkriptase Region des Virus induziert. Basierend auf dieser Entdeckung wird ein Verfahren für die Behandlung von HIV bereitgestellt, welches das Verabreichen von β-D-D4FC oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Vorläufer Arzneimittels an einen Menschen, der einen Bedarf einer Therapie aufweist, in Kombination oder abwechselnd mit einem Arzneimittel bereitstellt, das eine Mutation in HIV-1 an einer anderen Stelle als dem Kodon 70 (K nach N), 90 oder 172 der reverse Transkriptase Region induziert. Diese Erfindung kann durchgeführt werden, indem auf veröffentlichte Mutationsmuster für bekannte anti-HIV Arzneimittel Bezug genommen wird, oder durch Bestimmen des Mutationsmusters für ein neues Arzneimittel.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine wirksame Menge von β-D-D4FC oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Vorläufer Arzneimittels, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, mit einer wirksamen Menge von Abacavir, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, als eine kombinierte Präparation für die Verwendung für die Behandlung oder Prophylaxe einer HIV Infektion in einem Menschen umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Verwendung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung bereit, die eine wirksame Menge von β-D-D4FC oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Vorläufer Arzneimittels, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, mit einer wirksamen Menge von Abacavir, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe einer HIV Infektion in einem Menschen umfasst.
Die offenbarte Kombination, Alternation oder Wiederverwendung sind nützlich in der Vorbeugung und Behandlung von HIV Infektionen und anderen verwandten Zuständen, wie AIDS bezogener Komplex (engl.: AIDS-related complex (ARC)), persistierende generalisierte Lymphadenopathie (PGL, AIDS bezogene neurologische Zustände, anti-HIV Antikörper positive und HIV positive Zustände, Kaposi Sarkom, Thrombozytopenie purpurea und opportunistische Infektionen. Zusätzlich können diese Verbindungen oder Formulierungen prophylaktisch verwendet werden, um die Progression von klinischer Erkrankung in Individuen, die für anti-HIV Antikörper oder für HIV Antigen positiv sind, oder die gegenüber HIV exponiert waren, zu verhindern oder zu verzögern.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Darstellung von β-D-D4FC.
2 ist eine Graphik der Konzentration von β-D-D4FC in Mikromol gegenüber der prozentualen Inhibition von p24 Antigen Herstellung. Die Figur stellt die Selektion von Virus mit verringerter Sensitivität gegenüber β-D-D4FC dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Definitionen
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "resistentes Virus" ein Virus, das einen dreifachen, und noch typischer, einen fünffachen oder noch größeren Anstieg im EC₅₀ im Vergleich zu nativem Virus in einer konstanten Zelllinie zeigt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf periphere Blut mononukleäre Zellen (PBMCs) oder MT2 oder MT4 Zellen.
Der Betriff D-D4FC wird austauschbar mit dem Begriff β-D-D4FC unten verwendet.
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "im Wesentlichen rein" oder "im Wesentlichen in der Form eines optischen Isomers" eine Nukleosid Zusammensetzung, die mindestens 95 bis 98% oder mehr, vorzugsweise 99% bis 100% eines einzigen Enantiomers dieses Nukleosids einschließt. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform wird β-D-D4FC in im Wesentlichen reiner Form für irgendeine der offenbarten Indikationen verabreicht.
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vorläufer Arzneimittel" die 5' und N⁴ acylierten, alkylierten, oder phosphorylierten (einschließlich Mono-, Di- und Triphosphatester, ebenso wie stabilisierte Phosphate und Phospholipid) Derivate von D-D4FC. In einer Ausführungsform ist die Acylgruppe ein Carbonsäureester, in dem der nicht Carbonyl Rest der Estergruppe ausgewählt ist aus linearem, verzweigtem oder zyklischem Alkyl, Alkoxyalkyl, einschließlich Methoxymethyl, Aralkyl einschließlich Benzyl, Aryloxyalkyl einschließlich Phenoxymethyl, Aryl einschließlich Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, Alkyl, Alkyl oder Alkoxy, Sulfonatestern, wie Alkyl oder Aralkylsulfonyl, einschließlich Methansulfonyl, Trityl oder Monomethoxytrityl, substituiertes Benzyl, Trialkylsilyl oder Diphenylmethylsilyl. Die Arylgruppen in den Estern umfassen gegebenenfalls eine Phenylgruppe. Die Alkylgruppe kann linear, verzweigt oder zyklisch sein, und sie ist vorzugsweise C₁ bis C₁₈.
So wie hier verwendet, betrifft der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" die pharmazeutisch verträglichen Salze, die nach der Verabreichung an den Empfänger in der Lage sind, direkt oder indirekt β-D-D4FC bereitzustellen, oder die selbst Aktivität zeigen.
Die Abkürzungen der hier verwendeten Aminosäuren sind in Tabelle 1 beschrieben.
Tabelle 1
II. Mutationen in der HIV-1 reversen Transkriptase, ausgewählt für β-D-D4FC
Beide D- und L-Enantiomere von β-2',3'-Didehydro-2',3'-didesoxy-5-fluorcytidin (D4FC) sind potente und selektive Inhibitoren von HIV-1, obwohl das D-Enantiomer selektiver ist. Die in vitro Entwicklung von Resistenz gegenüber D-D4FC wurde durch serielle Passagierung von HIV-1_LAI in MT-2 Zellen und peripheren Blut mononuklearen Zellen (PBMC) in der Anwesenheit von steigenden Konzentrationen des Arzneimittels bewertet. Varianten, die resistent gegenüber D- D4FC waren, traten nur nach der verlängerten Exposition gegenüber dem Arzneimittel auf. Virus, das nach 20 Passagen in MT-2 Zellen erhalten wurde, zeigte 5,3-fache Resistenz gegenüber D-D4FC. Resistentes Virus konnte nicht in PBMC isoliert werden, trotz vielfacher Versuche. Die DNA Sequenzierung von RT aus Virus, das in MT-2 Zellen selektiert wurde, zeigte zwei Mutationen: K65R und V179D. Die Selektion von D-D4FC resistentem Virus wurde in MT-2 Zellen wiederholt, und Varianten, die eine 19,3-fache Resistenz zeigten, kodierten drei neue RT Mutationen: K70N, V90I und R172K. Ein K65R rekombinantes HIV-1_LAI Virus zeigte 3,9-fache Resistenz gegenüber D-D4FC. V179D, eine Mutation, die Resistenz gegenüber Nicht Nukleosid RT Inhibitoren verleiht, kompensiert wahrscheinlich K65R. Die Rolle der anderen Mutationen in der Resistenz gegenüber D-D4FC wurde ebenfalls durch Konstruktion von rekombinantem Virus mit einer einzelnen und mehreren Mutationen bewertet, jedoch zeigte keine der Rekombinanten eine > 2-fache Resistenz.
Materialien und Methoden
Chemikalien. D-D4FC wurde in einem unserer Laboratorien, wie zuvor beschrieben (Shi et al., 1999), synthetisiert. Es wurde als eine 10 mM Stock Lösung in sterilem Wasser hergestellt und bei –20°C gelagert. Die Verbindung wurde unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut und auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
Zellen. MT-2 Zellen (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, bereitgestellt von D. Richman) wurden in RPMI 1640 (Whittaker M. A., Bioproducts, Walkersville, MD) kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum, 10 mM HEPES Puffer, Penicillin (50 IU/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) ergänzt wurde.
Viren. HIV-1_LAI ein molekular kloniertes klinisches Isolat, wurde sowohl als Ausgangsvirus für die Resistenz Selektion als auch für Herstellung von rekombinanten Mutanten verwendet. Stock Herstellungen von HIV-1_LAI wurden durch elektrophoretische Trennung von 5–10 jig proviraler Plasmid DNA in 1,3 × 10⁷ MT- 2 Zellen hergestellt. Als sich der stärkste virale zytophatische Effekt (im Allgemeinen 7 Tage nach der Infektion) zeigte, wurde der Überstand aus infizierten Kulturen gesammelt, aliquotiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Die Virus Präparationen wurden durch dreifache Endpunkt Verdünnung in MT-2 Zellen titriert, und der TCID₅₀ wurde mit der Reed und Muench Gleichung berechnet.
Auswahl von resistentem Virus. Vor dem Beginn der Selektion von D-D4FC resistentem Virus wurde das Ausgangsvirus (HIV-1_LAI) als zellfreies Virus für 10 Zyklen in MT-2 Zellen in der Abwesenheit von Arzneimittel passagiert. D-D4FC resistentes Virus wurde durch serielles Passagieren von HIV-1_LAI in MT-2 Zellen in der Anwesenheit von schrittweise steigenden Konzentrationen von D-D4FC ausgewählt. Die Selektion von D-D4FC resistentem Virus wurde zweimal durchgeführt. Die Selektion wurde durch Inokulieren von 1 × 10⁶ MT-2 Zellen mit 0,01 mol des Virus initiiert. Als der virale zytophatische Effekt am stärksten war (4–7 Tage nach der Infektion) wurde der Überstand aus den infizierten Kulturen gesammelt, und 0,1–0,3 ml wurden anschließend verwendet, um einen anderen Infektionszyklus zu starten. Der Überstand wurde auch aliquotiert und bei –80°C für die Charakterisierung des selektierten Virus gelagert. Das Virus wurde mindestens dreimal bei jeder Konzentration passagiert, wobei die Zahl der Zyklen bei irgendeiner gegebenen Konzentration des Arzneimittels, abhängig war von der Fähigkeit des Virus, bei der bestimmten Konzentration von D-D4FC zu wachsen. Während des ersten Selektionsvorgangs wurde das Virus einmal in der Abwesenheit des Arzneimittels vor dem Anstieg der Arzneimittel Konzentration (Tabelle 2) passagiert. Als eine Kontrolle wurde das Virus auch parallel dazu in der Abwesenheit von Arzneimittel passagiert. Die erste Selektion wurde bei 0,75 μM initiiert und schrittweise auf 4,0 μM während eines Verlaufs von 37 Zyklen der zellfreien Passagierung angehoben. Die zweite Selektion wurde bei 0,2 μM initiiert und stieg schrittweise auf 6,2 μM während des Verlaufs von 27 Zyklen der zellfreien Passagierung (Tabelle 2).
Tabelle 2
Assay für die antivirale Empfänglichkeit. Die Virus Empfänglichkeit gegenüber D-D4FC wurde gemessen, indem die Prozent Inhibition von p24 Antigen Herstellung gemessen wurde. In Kürze, MT-2 Zellen (1 × 10⁵ Zellen/ml) wurde mit Virus bei einer MOI von 0,01 in der Anwesenheit von D-D4FC Reihenverdünnungen infiziert. Jede Verdünnung wurde dreifach getestet. Die Kultur Überstände wurden am 7. Tag nach der Infektion geerntet und hinsichtlich p24 Antigen Herstellung unter Verwendung eines kommerziellen Assays gemessen (DuPont, NEN Products, Wilmington, Del.). Die Virus Empfänglichkeit wird ausgedrückt als die Konzentration des Arzneimittels, das benötigt wird, um die Herstellung von p24 Antigen um 50% (EC₅₀) zu inhibieren.
DNA Sequenzierung von ausgewählter Virus reverser Transkriptase. Die virale RNA (vRNA) von ausgewähltem Virus wurde unter Verwendung von TRIzol Reagens isoliert (GibcoBRL, Grand Island, NY). Die Gesamtlängen RT kodierende Region wurde durch RT-PCR amplifiziert. Das PCR Produkt wurde anschließend unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega, Madison, WI) gereinigt und sequenziert.
Herstellung von mutantem rekombinanten HIV-1. Mutante RT wurde unter Verwendung des Altered Sitesll in vitro Mutagenese Systems (Promega, Madison, WI) gebildet. Die Mutagenese wurde an HIV-1_LAI durchgeführt, die RT wurde in einen Mutagenese Vektor (PALTER, Promega) kloniert. Die Anwesenheit der gewünschten Mutation wurde durch direktes Sequenzieren des RT Gens bestimmt. Die mutante RT wurde anschließend in dem pxxHIV-1_LAI Vektor kloniert. Stocks von mutantem Virus wurden anschließend durch Elektroporation von 5–10 μg DNA in 1,3 × 10⁷ MT-2 Zellen, wie oben beschrieben, hergestellt.
Ergebnisse und Diskussion
Phänotypisierung von resistentem Virus. Virus, das resistent gegenüber D-D4FC ist, wurde nach 37 (Selektion #1) und 20 (Selektion #2) Infektionszyklen in MT-2 Zellen selektiert. Die Untersuchung der D-D4FC Empfänglichkeit von Virus aus Selektion #1 Passage 37 (p37 D-D4FC#1) zeigte, dass p37 D-D4FC#1 9,4-fach weniger sensitiv gegenüber D-D4FC ist, als der Wildtyp, wie durch einen Anstieg in der EC₅₀ von 0,21 μM auf 4,07 μM (2, Tabelle 3) gezeigt wurde. Die Untersuchung der D-D4FC Empfänglichkeit von Virus aus Selektion #2 Passage 20 (p20 D4FC #2) zeigte, dass p20 D-D4FC#2 5,3-fach weniger sensitiv gegenüber D-D4FC ist als der Wildtyp, wie durch einen Anstieg in der EC₅₀ von 0,21 μM auf 1,1 μM (2, Tabelle 3) gezeigt wurde.
Genotypisierung von resistentem Virus. vRNA aus p37 D-D4FC#1 und p20 D-D4FC#2 wurde isoliert und der Amplifikation durch RT-PCR unterzogen. Die Sequenzierung des PCR Produkts zeigte die Anwesenheit von drei neuen Mutationen in p37 D-D4FC#1: K70N (AAA→4AAT), V90I (GTT→ATT) und R172K (AGA→AAA) (Tabelle 2). Zwei verschiedene Mutationen wurden in p20 D-D4FC#2 identifiziert: K65R (AAA→AGA) und V179D (GTT→GAT) (Tabelle 3). Es wurden keine anderen Mutationen in den RT Genen aus diesen Viren gefunden (von Aminosäuren 8 – 330). Zusätzlich wurden keine Mutationen in den Kontrollviren, die parallel in der Abwesenheit von Arzneimittel passagiert wurden, gefunden.
Die Isolierung von D-D4FC resistenten Viren mit verschiedenen assoziierten Mutationen könnte das Ergebnis von verschiedenen Selektionstechniken sein, die verwendet wurden, um D-D4FC resistentes Virus zu isolieren. In der Selektion #1 wurde der selektive Druck für einen Infektionszyklus vor dem Anstieg der Arzneimittel Konzentration entfernt. Dies wurde durchgeführt während des zweiten Selektionsvorgangs. Zusätzlich variierte die Ausgangskonzentration von D-D4FC, die für jeden der Selektionsvorgänge verwendet wurde, um ungefähr 3-fach. Eine viel höhere Ausgangskonzentration des Arzneimittels wurde für Selektion #1 (0,75 μM) verwendet. Es ist sehr wahrscheinlich, dass diese zwei Unterschiede die verschiedenen Mutationen verursachen, die in den selektierten Viren beobachtet werden.
Mutantes rekombinantes HIV-1. Mutantes rekombinantes HIV-1, das die Mutationen enthält, die in den selektierten Viren identifiziert wurden, wurde über seitengerichtete Mutagenese hergestellt. Die Tabelle 4 zeigt jedes der hergestellten mutanten rekombinanten Viren ebenso wie den korrespondierenden EC₅₀. Während das xxHIV-1_LAI K65R Virus einen 3,9-fachen Abfall in der Empfänglichkeit gegenüber D-D4FC zeigte, zeigte keines der anderen Viren eine > 3,0-fache Resistenz. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass eine dreifach Mutante (xxHIV-1_LAI, K70N/V90I/R172K) nicht gut wuchs, und dies könnte die Ursache für die Unfähigkeit sein, die Resistenz, die in dem in vitro selektiertem Virus beobachtet wurde, zu reproduzieren.
Tabelle 3 Empfänglichkeit und assoziierte Mutationen von D-D4FC selektiertem Virus in MT-2 Zellen
Tabelle 4 D-D4FC Empfänglichkeit von rekombinantem HIV-1 in MT-2 Zellen
Die Tabelle 5 stellt die mittlere wirksame Konzentration und die Kombinationsindex (engl.: Combinations Index (C. I.)) Werte für D-D4FC alleine und in Kombination mit AZT und D4T in akut infizierten humanen PBM Zellen (Tag 6) bereit. Die Tabelle 6 beschreibt die Wirkung von β-D und β-L-D4FC gegenüber HIV-1 und klonierten Viren I humanen PBM Zellen. TABELLE 5 Mittlere wirksame Konzentration und Kombinationsindex (C. I.) Werte für D-D4FC alleine und in Kombination mit AZT und D4T in akut infizierten humanen PBM Zellen (Tag 6).

^a m ist die Steigung ± S. E., EC₅₀ ist die mittlere wirksame Konzentration, und R ist der Korrelationskoeffizient, wie aus einem mittleren Wirksamkeitsplot bestimmt wurde.
^b C. I. < 1, gleich 1 oder > 1 zeigt Synergie, Additivität und Antagonismus; Fa ist ein Bestandteil der mittleren Wirksamkeitsgleichung, die sich auf die betroffene Fraktion des Systems bezieht (z.B. 0,50 bedeutet den C. I. bei einer 50% Reduktion der RT Aktivität). Die C. I. Werte wurden für eine gegenseitige nicht exklusive Interaktion bestimmt (die Werte in kursiv stehen für eine gegenseitig exklusive Interaktion, die weniger stark ist).

Tabelle 6
Wirkung von β-D- und β-L-D4FC gegenüber HIV-1 und klonierten Viren in humanen PBM Zellen

FI₅₀

= EC₅₀ Daten von resistenten Virus EC₅₀ Daten von HIV-1_LAV oder xxBRU_PITT.

FI₉₀

= EC₉₀ Daten von resistenten Virus EC₉₀ Daten von HIV-1_LAV oder xxBRU_PITT.
Werte in Fett zeigen eine FI > 10.
^a In MT-2 Zellen: Freundliche Gabe von Dr. J. Mellors (Pittsburgh)
^b Zusätzliche Mutationen: 203D, 207A, 211K, 214F, 245M, 277N, 283I, 284K, 200D, 311R

FI₅₀

= EC₅₀ Daten von resistenten Virus EC₅₀ Daten von HIV-1_LAB oder xxBRU_PITT.

FI₉₀

= EC₉₀ Daten von resistenten Virus EC₉₀ Daten von HIV-1_LAV oder xxBRU_PITT.
Werte in fett zeigen eine FI > 10.
^a In MT-2 Zellen: Freundliche Gabe von Dr. J. Mellors (Pittsburgh)
^b Zusätzliche Mutationen: 203D, 207A, 211K, 214F, 245M, 277N, 283I, 284K, 200D, 311R

III: Kombination oder Abwechslung von HIV Mitteln
Im Allgemeinen wird während einer abwechselnden Therapie eine wirksame Dosis für jedes Mittel nacheinander verabreicht, wohingegen in der Kombinationstherapie eine wirksame Dosis von zwei oder mehr Mitteln gleichzeitig verabreicht wird. In der abwechselnden Therapie kann zum Beispiel eines oder mehrere erste Mittel in einer wirksamen Menge für einen wirksamen Zeitraum verabreicht werden, um die virale Infektion zu behandeln, und anschließend wird ein oder mehrere zweite Mittel gegen jene erste Mittel in der Therapieroutine ausgetauscht, und wiederum in einer wirksamen Menge für einen wirksamen Zeitraum verabreicht.
Die Dosierungen werden von solchen Faktoren wie Absorption, Bioverteilung, Metabolismus und Ausscheidungsraten für jedes Arzneimittel ebenso wie von anderen Faktoren abhängen, die dem Fachmann bekannt sind. Es muss angemerkt werden, dass die Dosiswerte auch mit der Schwere des zu lindernden Zustandes variieren werden. Es muss weiterhin verstanden werden, dass für irgendein bestimmtes Subjekt spezifische Dosierungsmuster und -pläne über die Zeit in Abhängigkeit von dem individuellen Bedürfnis und der professionellen Bewertung der Personen, welche die Verabreichung der Zusammensetzungen durchführt oder überwacht, eingestellt werden sollten. Beispiele von geeigneten Dosierungsbereichen für anti-HIV Verbindungen, einschließlich Nukleosid Derivaten (z.B. AZT, D4T, DDI und 3TC) oder Protease Inhibitoren, zum Beispiel Nelfinavir und Indinavir, können in der wissenschaftlichen Literatur und in der Tischreferenz eines Arztes gefunden werden. Viele Beispiele für geeignete Dosierungsbereiche für andere Verbindungen, die hier beschrieben sind, werden auch in der öffentlichen Literatur gefunden oder können unter Verwendung von bekannten Verfahren identifiziert werden. Diese Dosierungsbereiche können wie gewünscht modifiziert werden, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird D-D4FC in Kombination mit Abacavir (1592U89) verabreicht, das (1S,4R)-4-[2-Amino-6-cyclopropyl-amino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1-methanolsuccinat ist.
In einer anderen Ausführungsform wird D-D4FC in Kombination mit einem Nicht Nukleosid reverse Transkriptase Inhibitor, wie DMP-266 ((S)-6-Chlor-4-cyclopropylethynyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on (SUSTIVA, siehe US Patent Nr. 5,519,021); Delavirdin, (1-[3-(1-Methylethyl)amino]-2-pyridinyl-4-[[5-[(methylsulfonyl)-amino]-1H-indol-2yl]carbonyl]-, Monoethansulfonat), Nevirapin oder Delarvirdin verabreicht.
In anderen Ausführungsformen wird D-D4FC in Kombination oder abwechselnd mit einem HIV Integrase Inhibitor oder einem Chemokin Inhibitor verabreicht.
II. Analyse von D-D4FC induzierter Mutation des HIV Genoms
Verfahren und Kits, die ähnlich sind zu jenen, die in dem US Patent Nr. 5,409,810 an Larder et al., für AZT, beschrieben sind, aber basierend auf dem Mutationsprofil für D-D4FC können verwendet werden, um hinsichtlich der Anwesenheit von D-D4FC induzierten Mutationen zu analysieren, und sie bilden somit einen Teil der Erfindung, die hier dargestellt wird. Zusätzlich dazu, dass das Larder Patent durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen wird, sind diese Techniken unten beschrieben.
Ein Verfahren zum Untersuchen der Sensitivität einer HIV-1 Probe gegenüber D-D4FC schließt ein:

(i) Isolieren von Nukleinsäure aus der Probe,
(ii) Hybridisieren eines Oligonukleotids an die Nukleinsäure, das Oligonukleotid ist komplementär zu einer Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder seiner korrespondierenden RNA) oder zu einer Region der mutanten DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA),
(ii) Versuchen bzw. Unternehmen der Polymerisation der Nukleinsäure von dem 3'-Ende des Oligonukleotids,
(iv) Feststellen, ob ein durch den Oligonukleotid Primer verlängertes Produkt anwesend ist oder nicht.

Es ist möglich, genomische DNA oder RNA zu verwenden, die aus HIV-1 Proben mit dieser Methodik isoliert wurden. Geeignete Zellen für die Unterstützung des Wachstums eines HIV-1 Isolats werden für einen Zeitraum inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen. Die DNA kann anschließend durch Spalten der Zellen mit Proteinase K in der Anwesenheit von EDTA und einem Detergens wie SDS, gefolgt von Extraktion mit Phenol, gespalten werden.
Gut bekannte Extraktions- und Reinigungsverfahren stehen für die Isolierung von DNA aus einer Probe zur Verfügung. RNA kann unter Verwendung der folgenden Methodik isoliert werden. Geeignete Zellen werden infiziert und für einen Zeitraum inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellen werden in einem RNA Extraktionspuffer resuspendiert, gefolgt durch Spalten unter Verwendung eines Proteinase Spaltungspuffers und Spalten mit Proteinase K. Die Proteine werden in der Anwesenheit eines Phenol/Chloroform Gemisches entfernt. Die RNA kann anschließend unter Verwendung der weiteren Zentrifugationsschritte gewonnen werden. (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).
Obwohl es möglich ist, nicht amplifizierte Nukleinsäure zu verwenden, ist es aufgrund der relativen Knappheit von Nukleinsäure in einer HIV-1 Probe bevorzugt, sie zu amplifizieren. Die Nukleinsäure kann selektiv unter Verwendung der Technik der Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden, die ein in vitro Verfahren für die Herstellung großer Mengen von spezifischem Nukleinsäure Fragment einer definierten Länge und Sequenz aus kleinen Mengen einer Matrize ist.
Die PCR umfasst Standard Reagenzien unter Verwendung von Mg²⁺ Konzentration, Oligonukleotid Primern und schwankenden Temperaturzuständen für die Amplifikation des RT Gens unter Verwendung der Primer. Die Primer werden derart ausgewählt, dass sie das gesamte RT Gen oder eine ausgewählte Sequenz amplifizieren werden, die Nukleinsäuren einschließt, die einer Region der Wildtyp DNA Sequenz von HIV-1 entsprechen, die das Kodon einschließt, das mutiert ist.
RNA kann nicht direkt durch PCR amplifiziert werden. Seine korrespondierende cDNA muss synthetisiert werden. Die Synthese von cDNA wird normalerweise durch geprimte reverse Transkription unter Verwendung von oligo-dT Primern durchgeführt. Vorteilhafterweise werden die Primer derart ausgewählt, dass sie die Nukleinsäure Sequenz für RT oder einer ausgewählten Sequenz vereinfachen, die Nukleotide einschließt, die der Region von RNA entsprechen, die der Wildtyp DNA Sequenz oder der Region der mutierten DNA Sequenz entsprechen, die dem 70. (K nach N), dem 90. oder dem 172. Kodon der reversen Transkriptase Region entspricht. Dies könnte erreicht werden durch das Herstellen eines Oligonukleotid Primers, der komplementär ist zu einer Region des RNA Strangs, der oberhalb der korrespondierenden Sequenz der Wildtyp DNA Sequenz liegt. Die cDNA, die durch diese Methodik (siehe Maniatis, T., et al., supra) hergestellt wird, kann anschließend in derselben Weise verwendet werden, wie die DNA, die bereits diskutiert wurde.
Der nächste Schritt in der Methodik ist es, an die Nukleinsäure ein Oligonukleotid zu hybridisieren, das komplementär zu einer Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA) oder zu einer Region der mutierten DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA) ist.
Bedingungen und Reagenzien werden anschließend bereitgestellt, um die Polymerisation der Nukleinsäure von dem 3'-Ende des Oligonukleotid Primers zu erlauben. Solche Polymerisationsreaktionen sind im Stand der Technik gut bekannt.
Wenn der Oligonukleotid Primer an seinem 3'-Ende ein Nukleotid aufweist, das komplementär zu einem mutanten Genotyp ist, dies ist ein Genotyp, der einen Nukleotid Austausch an dem 70. (K nach N), 90. oder 172. Kodon in der RT Region aufweist, dann wird die Polymerisation der Nukleinsäure Sequenz nur stattfinden, wenn die Nukleinsäure der Probe die gleiche ist, wie der mutante Genotyp. Die Polymerisation einer Wildtyp Nukleinsäure Sequenz wird nicht oder wenigstens nicht in einem signifikanten Ausmaß stattfinden aufgrund einer Fehlpaarung von Nukleotiden an dem 3'-Ende des Oligonukleotid Primers und der Nukleinsäure Sequenz der Probe.
Wenn der Oligonukleotid Primer an seinem 3'-Ende ein Nukleotid aufweist, das komplementär zu dem Wildtyp Genotyp ist, dies ist ein Genotyp, der das Wildtyp Nukleotid an dem 70. (K nach N), 90. und 172. Kodon in der RT Region aufweist, dann wird eine Polymerisation einer Nukleinsäure Sequenz, die Wildtyp an dieser Position ist, stattfinden. Es wird keine Polymerisation einer Nukleinsäure stattfinden, die ein mutantes Nukleotid an der 3'-Position aufweist.
Die bevorzugte Länge jedes Oligonukleotids beträgt 15–20 Nukleotide. Die Oligonukleotide können gemäß einer Methodik, die dem Fachmann gut bekannt ist, hergestellt werden (Koster, H., Drug Research, 30 S. 548 (1980); Koster, H., Tetrahedron Letters S. 1527 (1972); Caruthers, Tetrahedron Letters, S. 719 (1980); Tetrahedron Letters, S. 1859 (1981); Tetrahedron Letters 24, S. 245 (1983); Gate. M. Nucleic Acid Research, 8, S. 1081, (1980)), und es wird im Allgemeinen unter Verwendung eines automatisierten DNA Synthetisiergeräts, wie einem Applied Biosystems 381A Synthetisiergerät, hergestellt.
Es ist geeignet, die Anwesenheit eines Oligonukleotid Primer verlängerten Produkts nachzuweisen. Das Mittel zum Durchführen des Nachweises ist die Verwendung einer geeigneten Markierung.
Die Markierung kann herkömmlich an den Oligonukleotid Primer oder an ein anderes Molekül angeheftet werden, welches das Primer verlängerte Polymerisationsprodukt binden wird.
Die Markierung kann zum Beispiel ein Enzym, Radioisotop oder Fluorchrom sein. Eine bevorzugte Markierung kann Biotin sein, die anschließend unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert an ein Enzym, wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase, nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit eines Oligonukleotid Primer verlängerten Polymerisationsprodukts kann zum Beispiel durch die Auftrennung einer Polymerisationsreaktion auf einem Agarosegel und das Beobachten eines spezifischen DNA Fragments, das mit Ethidiumbromid markiert ist, oder durch Southern Blotten und Autoradiographie, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Banden, die dem polymerisierten Produkt entsprechen, nachgewiesen werden. Wenn eine vorherrschende Bande anwesend ist, die nur dem markierten Oligonukleotid entspricht, dann zeigt dies, dass die Polymerisation stattgefunden hat. Wenn Banden der richtigen vorhergesagten Größe anwesend sind, würde dies anzeigen, dass eine Polymerisation stattgefunden hat.
Zum Beispiel wird DNA, die aus Lymphozyten von Patienten isoliert wurde, wie hier beschrieben, als eine Matrize für PCR Amplifikation unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotid Primern verwendet, die sich entweder mit den amplifizierten Sequenzen verbinden oder nicht ("Paarung" oder "Fehlpaarung"). Die Geeignetheit von PCR in dem Nachweis von solchen Mutationen wurde bereits gezeigt. PCR unter Verwendung des Amplification Refractory Mutation System ("ARMS") (Newton, C. R., et al., Nucleic Acids Research, 17, S. 2503, (1989)). Es werden synthetische Oligonukleotide hergestellt, die an die Regionen benachbart zu einer, einschließlich den spezifischen Mutationen anheften, so dass das 3'-Ende des Oligonukleotids sich entweder mit einer Mutanten oder der Wildtyp Sequenz paart oder nicht ("Paarung" oder "Fehlpaarung"). Es wird eine PCR durchgeführt, die zu der Identifizierung eines DNA Fragments (unter Verwendung von Gel Elektrophorese) führt, wo eine Paarung stattgefunden hat, oder es führt zu keinem Fragment, wo eine Fehlpaarung stattgefunden hat.
DNA wird aus HIV-1 infizierten T-Zellen, wie hier beschrieben, extrahiert, und der "ARMS" PCR Analyse unter Verwendung dieser Primer unterzogen.
Die Anwesenheit eines Fragments wird identifiziert durch die Verwendung eines Oligonukleotid Primers, wie oben beschrieben, d.h. durch das Versuchen bzw. Unternehmen der Polymerisation unter Verwendung eines Oligonukleotid Primers, der für das amplifizierte DNA Fragment markiert sein kann, unter stringenten Bedingungen, die nur die Hybridisierung von komplementärer DNA erlauben (der einzige Unterschied ist, dass keine differenzielle Hybridisierung durchgeführt werden muss, weil Fragmente von DNA, die durch das "ARMS" Verfahren amplifiziert wurden, dieselben sind, egal ob sie von der Mutanten oder Wildtyp DNA abgeleitet sind, so dass ein gemeinsames Oligonukleotid verwendet werden kann, um die Anwesenheit dieser Fragmente nachzuweisen. Die Sequenz eines solchen Oligonukleotids ist von einer DNA Sequenz innerhalb des DNA Fragments abgeleitet, das unter HIV-1 Stämmen konserviert ist).
Der obige PCR Assay kann angepasst werden, um den direkten Nachweis von Mutationen, die mit D-D4FC Resistenz assoziiert sind, in DNA aus PBL Proben von infizierten Individuen, die nicht kultiviert wurden, um Virus zu erhalten, zu erlauben. Weil dieses Material im Allgemeinen beachtlich weniger HIV-1 DNA enthält, als jenes in infizierten lymphoiden Kulturen, kann ein "doppeltes PCR" (oder nested set) Protokoll verwendet werden (Simmonds, P., Balfe, P., Peutherer, J. F., Ludlam, C. A., Bishop, J. O. und Leigh Brown, A. J., J. Virol., 64, 864–872 (1990)), um die Menge von Ziel HIV-1 RT DNA Signal in den Proben zu verstärken. Die doppelte PCR überwindet das Problem der begrenzten Amplifikation einer seltenen Matrizensequenz. Eine kleine Menge des präamplifizierten Materials kann in der zweiten PCR mit Primer Paaren verwendet werden, die gestaltet sind, um die Unterscheidung von Wildtyp und mutanten Resten zu erlauben.
Ein geeigneter Testkit für die Verwendung in einem Assay, um den Resistenz Status einer HIV-1 Probe gegenüber D-D4FC zu bestimmen, welche die vorhergehende Methodik verwendet, umfasst ein Oligonukleotid, das komplementär zu einer Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder seiner korrespondierenden RNA) oder zu einer Region der mutanten DNA Sequenz, so wie hier beschrieben, ist, andere Materialien, die für die Polymerisation der Nukleinsäure von dem 3'-Ende des Oligonukleotids und Mittel zum Bestimmen der Anwesenheit eines Oligo nukleotid Primer verlängerten Produkts. Solche anderen Materialien schließen geeignete Enzyme, Puffer und Waschlösungen, und eine Markierung und ein Substrat für die Markierung, falls notwendig, ein. Wenn PCR verwendet wird, um die Nukleinsäure zu amplifizieren, dann sollten zusätzliche Materialien, wie geeignete Oligonukleotid Primer, die eine Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder ihre korrespondierende RNA) oder eine Region der mutanten DNA Sequenz, wie oben beschrieben, (oder ihre korrespondierende RNA) amplifizieren werden, und dNTPs, eingeschlossen werden.
Ein Verfahren zum Bestimmen der Sensitivität einer HIV-1 Probe gegenüber D-D4FC umfasst:

(i) Isolieren der Nukleinsäure aus der Probe,
(ii) Hybridisieren der Nukleinsäure mit einem Oligonukleotid, das komplementär ist zu einer Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA) oder zu einer Region der mutierten DNA Sequenz, die in 1 angegeben ist (oder ihre korrespondierende RNA), die eines oder mehrere der Nukleotide an der Region des 70. (K nach N), 90. oder 172. Kodons in der RT Region enthält; und
(iii) Sicherstellen, ob irgendeines der resultierenden Hybride des Oligonukleotids und der Nukleinsäure komplementäre Nukleotide an einer dieser Positionen aufweisen, oder nicht.

Vorzugsweise ist das Oligonukleotid derart gestaltet, dass es ein perfekt übereinstimmendes Hybrid mit seinem Komplement bildet.
Die Nukleinsäure (DNA oder RNA) wird aus einer Probe durch die oben genannten Verfahren, wie für den ersten Aspekt der Erfindung beschrieben ist, isoliert.
Die PCR kann einfach verwendet werden, um die RT DNA (oder ihre korrespondierende RNA) zu amplifizieren, oder vorzugsweise, um eine Region der RT DNA (oder ihre korrespondierende RNA) zu amplifizieren, die DNA (oder ihre korrespondierende RNA) einschließt, die eines oder mehrere der Nukleotide an den ausgesuchten Positionen enthält.
In der zweiten Stufe dieser Methodik wird die Nukleinsäure anschließend verwendet, um die Oligonukleotide, die komplementär sind zu einer Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA) oder zu einer Region der Mutanten DNA Sequenz zu hybridisieren.
Das Oligonukleotid kann irgendeine Länge aufweisen, in Abhängigkeit von der Zahl der interessierenden Nukleotid Positionen, die untersucht werden. Wenn das Oligonukleotid derart gestaltet ist, dass es ein Nukleotid nur an einer interessierenden Position einschließt, dann liegt dieses Nukleotid vorzugsweise an oder nahe der zentralen Position des Oligonukleotids.
Um sicherzustellen, ob das Oligonukleotid und die Nukleinsäure Sequenz ein gepaartes Hybrid gebildet haben oder nicht, werden spezifische Hybridisierungsbedingungen vorgegeben, so dass ein Hybrid nur dann gebildet wird, wenn das Nukleotid oder die Nukleotide an dem 70. (K nach N), 90. und 172. Kodon der reversen Transkriptase Region komplementär sind zu dem korrespondierenden Nukleotid oder den Nukleotiden des Oligonukleotids, was entweder eine Hybridisierung oder keine Hybridisierung erlaubt. Es ist zum Beispiel wichtig, die Temperatur der Reaktion und die Konzentration der Salzlösung vor dem Durchführen des Hybridisierungsschritts zu etablieren, um die Bedingungen zu finden, die stringent genug sind, um Spezifität zu garantieren (Maniatis, T., et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Wenn die Oligonukleotid Sonde eine DNA Sequenz aufweist, die komplementär ist zu einer Wildtyp Nukleinsäure Sequenz an einem oder mehreren seiner Nukleotide, die dem 70. (K nach N), 90. oder 172. Kodon in der reversen Transkriptase Region entsprechen, dann wird dieses Oligonukleotid perfekt an die Wildtyp Nukleinsäure hybridisieren. Wenn es dieses nicht gibt, dann wird es perfekt an die Wildtyp Nukleinsäure hybridisieren. Wenn es keine Hybridisierung gibt, würde dies nahe legen, dass die Nukleinsäure, die aus demselben isoliert wurde, eine oder mehrere Mutationen enthält.
Wenn die Oligonukleotid Sonde eine DNA Sequenz aufweist, die komplementär ist zu einer mutanten Nukleinsäuresequenz, dann wird dieses Oligonukleotid an mutante Nukleinsäure hybridisieren. Wenn es keine Hybridisierung gibt, würde dies nahe legen, dass die Nukleinsäure, die aus der Probe isoliert wurde, keine solche Mutation oder Mutationen enthält. Die Oligonukleotid Sonden können als ein Mittel zum Nachweis wie für den ersten Aspekt der Erfindung markiert werden.
Die Hybridisierung und die anschließende Entfernung von nicht hybridisierten Nukleinsäuren werden unter stringenten Bedingungen durchgeführt, die nur die Hybridisierung der komplementären DNA und nicht des Oligonukleotids, das eine Fehlpaarung enthält (d.h. Oligonukleotid spezifische Hybridisierung, wie beschrieben für den Nachweis von Sichelzellmutation unter Verwendung von β-Globin oder HLA-DQα Gen (Saikt, R. K., et al., Nature, 324, S. 163 (1986)), des aktivierten Ras Gens (Ver Laan-de, Vries, M., et al., Gene, 50, 313 (1986) und des β-Thalassaemia; Wong, C., et al., Nature, 330, S. 384 (1987)), erlauben.
Die Hybridisierung kann durchgeführt werden durch Immobilisierung der RT Nukleinsäure Sequenz auf Nitrozellulose, Nylon oder eine andere feste Matrix (z.B. Dot-Blot). Es ist geeignet, die Anwesenheit eines Hybrids unter Verwendung des Mittels einer Markierung zu bestimmen. Zum Beispiel können die chemisch synthetisierten Oligonukleotid Sonden geeigneterweise unter Verwendung eines Enzyms, Radioisotops oder Fluorchroms markiert werden. Eine bevorzugte Markierung kann Biotin sein, die anschließend unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert an ein Enzym, wie Peroxidase oder alkalische Phosphatase, nachgewiesen werden kann.
Alternativ dazu kann die Hybridisierung durchgeführt werden durch Immobilisierung der obigen chemisch synthetisierten Oligonukleotide, die unmarkiert sind, auf einen obigen festen Träger und anschließende Hybridisierung durch eine markierte RT Nukleinsäure Sequenz, wie zuvor beschrieben.
In beiden oben beschriebenen Situationen für die Hybridisierung werden geeignete Kontrollreaktionen eingeschlossen sein, um zu bestimmen, dass eine effiziente Hybridisierung stattgefunden hat. (z.B. die Hybridisierung von Oligonukleotiden an ein komplementäres Oligonukleotid).
Die Ergebnisse wären einfach zu interpretieren, weil die isolierte Nukleinsäure entweder an das Wildtyp Oligonukleotid oder das mutante Oligonukleotid hybridisieren würde.
Ein geeigneter Testkit für die Verwendung in einem Assay, um die Sensitivität einer HIV-1 Probe gegenüber D-D4FC zu bestimmen, welche eine Methodik gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung verwendet, umfasst ein Oligonukleotid, das komplementär ist zu einer Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA) oder zu der entsprechenden Region der mutierten DNA Sequenz, zusammen mit anderen Materialien, die benötigt werden, um Hybridisierung zu erlauben. Solche Materialien schließen geeignete Puffer und Waschlösungen und eine Markierung und ein Substrat für die Markierung, falls notwendig, ein. Normalerweise wäre das Oligonukleotid markiert. Wenn PCR verwendet wird, um die Nukleinsäure vor der Hybridisierung zu amplifizieren, dann sollten zusätzliche Materialien, wie geeignete Oligonukleotid Primer, die eine Region der Wildtyp DNA Sequenz (oder ihrer korrespondierenden RNA) oder eine Region der mutanten DNA Sequenz amplifizieren werden, geeignete Enzyme und dNTPs (Desoxynukleotidtriphosphate) eingeschlossen werden.
In einem alternativen Format des Assays können die dNTPs in der Amplifikation an ein Nachweismolekül, wie ein Radioisotop, Biotin, Fluorchrom oder Enzym gekoppelt werden oder nicht.
Es ist auch möglich, Zidovudin resistente Mutationen in der HIV-1 RT RNA nachzuweisen, die aus klinischen Proben unter Verwendung eines RNA Amplifikationssystems isoliert wurde. Unter Verwendung der Methodik, die von Guatelli et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 8/7, 1874–1878, (März 1990)) beschrieben ist, kann eine Ziel Nukleinsäure Sequenz exponentiell in vitro unter isothermalen Bedingungen repliziert (amplifiziert) werden unter Verwendung von drei enzymatischen Aktivitäten, die essentiell für retrovirale Replikation sind: reverse Transkriptase, RNase H und eine DNA abhängige RNA Polymerase. Eine solche Methodik kann eingesetzt werden, gefolgt von einem Hybridisierungsschritt, um mutante von Wildtyp Oligonukleotiden, wie zuvor diskutiert, zu unterscheiden.
HERSTELLUNG VON PHARMAZEUTISCHEN ZUSAMMENSETZUNGEN
Menschen, die an den Wirkungen leiden, die durch irgendeine der hier beschriebenen Krankheiten verursacht werden, und insbesondere HIV Infektion, können behandelt werden durch Verabreichen an den Patienten einer wirksamen Menge an D-D4FC oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Vorläufer Arzneimittels davon in der Anwesenheit eines pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels, für irgendeine der Indikationen oder Verabreichungswege, die im Detail hier beschrieben sind. Die aktiven Materialien können durch irgendeinen geeigneten Weg, zum Beispiel oral, parenteral, interal, intravenös, intradermal, subkutan, transdermal, intranasal oder topisch, in flüssiger oder fester Form verabreicht werden.
Die aktive/n Verbindung/en ist/sind in den pharmazeutisch verträglichen Träger oder das Verdünnungsmittel in einer Menge eingeschlossen, die ausreichend ist, um an einen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu verabreichen, um die virale Replikation in vivo, insbesondere die HIV Replikation zu verhindern, ohne ernste toxische Wirkungen in dem behandelten Patienten zu bewirken. Unter "inhibitorischer Menge" wird eine Menge des aktiven Bestandteils verstanden, der ausreichend ist, um eine inhibitorische Wirkung hervorzurufen, wie zum Beispiel durch einen Assay, wie jene die hier beschrieben sind, gemessen wird.
Eine bevorzugte Dosis der Verbindung für alle die oben genannten Bedingungen wird im Bereich von ungefähr 1 bis 75 mg/kg, vorzugsweise 1 bis 20 mg/kg des Körpergewichts pro Tag, allgemeiner 0,1 bis ungefähr 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag liegen. Der wirksame Dosisbereich der pharmazeutisch verträglichen Derivate kann berechnet werden basierend auf dem Gewicht des zu verabreichenden Ausgangsnukleosids. Wenn das Derivat selbst Aktivität zeigt, kann die wirksame Dosis wie oben abgeschätzt werden, unter Verwendung des Gewichts des Derivats, oder durch andere Mittel, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Verbindungen werden geeigneterweise in einer Einheit in irgendeiner geeigneten Dosisform verabreicht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine, die 7 bis 3000 mg, vorzugsweise 70 bis 1400 mg des aktiven Bestandteils pro Einheit Dosisform enthält. Ein orale Dosis von 50 bis 1000 mg ist für gewöhnlich geeignet.
Idealerweise sollte der aktive Bestandteil verabreicht werden, um Spitzen Plasmakonzentrationen der aktiven Verbindung von ungefähr 0,02 bis 70 Mikromolar, vorzugsweise ungefähr 0,5 bis 10 mM zu erreichen. Dies kann zum Beispiel durch die intravenöse Injektion einer 0,1 bis 25% Lösung des aktiven Bestandteils, gegebenenfalls in Salzlösung oder durch Verabreichung als einen Bolus des aktiven Bestandteils erreicht werden.
Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Arzneimittel Zusammensetzung wird von der Absorption, Verteilung, dem Metabolismus und den Ausscheidungsraten des Arzneimittel ebenso abhängen wie von anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind. Es sei angemerkt, dass Dosiswerte auch mit der Schwere des Zustandes, der gelindert werden soll, schwanken. Es wird weiterhin verstanden, dass für irgendein bestimmtes Subjekt, spezifische Dosis Verabreichungspläne über die Zeit entsprechend den individuellen Bedürfnissen und der professionellen Bewertung der Person, welche die Zusammensetzungen verabreicht, oder die Verabreichung der Zusammensetzungen überwacht, eingestellt werden sollten, und dass die Konzentrationsbereiche, die hier angegeben sind, nur exemplarisch sind, und nicht beabsichtigen, den Schutzumfang oder die Ausführung der beanspruchten Zusammensetzung zu beschränken. Der aktive Bestandteil kann einmalig verabreicht werden, oder kann in eine Anzahl von kleine ren Dosen geteilt werden, um zu verschiedenen Zeitintervallen verabreicht zu werden.
Eine bevorzugte Verabreichungsweise der aktiven Verbindung ist oral. Orale Zusammensetzungen werden für gewöhnlich ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger einschließen. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder in Tabletten verpresst sein. Für den Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Trägerstoffen eingeschlossen und in der Form von Tabletten, Lutschpastillen oder Kapseln verwendet werden. Pharmazeutisch verträgliche Bindemittel und/oder Adjuvans Materialien können als ein Teil der Zusammensetzung eingeschlossen werden.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Lutschpastillen und ähnliches können irgendeinen der folgenden Bestandteile oder Verbindungen einer ähnlichen Natur enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Zellulose, Gummi Tragacanth oder Gelatine; einen Trägerstoff wie Stärke oder Lactose, ein zersetzendes Mittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotes, ein Schmiermittel, wie kolloidales Siliziumdioxid; ein Süßmittel, wie Sucrose oder Saccharin; oder ein Geschmacksmittel, wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmack. Wenn die Dosis Einheit Form in einer Kapsel vorliegt, kann sie zusätzlich zu dem Material des obigen Typs, einen flüssigen Träger, wie ein fettiges Öl enthalten. Zusätzlich können die Einheit Dosis Formen verschiedene andere Materialien enthalten, welche die physikalische Form der Dosis Einheit modifizieren, zum Beispiel Beschichtungen aus Zucker, Schellack oder anderen enterischen Mitteln.
Die Verbindungen können als ein Bestandteil eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Oblate, einer Kaugummis oder ähnlichem verabreicht werden. Ein Sirup kann, zusätzlich zu den aktiven Verbindungen, Sucrose als ein Süßmittel und bestimmte Konservierungsstoffe, Farbstoffe und Färbemittel und Geschmacksstoffe enthalten.
Die Verbindungen oder ihre pharmazeutisch verträglichen Derivate oder Salze davon können auch mit anderen aktiven Materialien gemischt werden, welche die gewünschte Wirkung nicht beeinflussen, oder mit Materialien, welche die gewünschte Wirkung ergänzen, wie Antibiotika, Antipilzmittel, Antientzündungsmittel, Protease Inhibitoren, oder andere Nukleosid oder Nicht Nukleosid antivirale Mittel, wie detaillierter oben diskutiert wurde. Lösungen oder Suspensionen, die für die parenterale, intradermale, subkutane oder topische Anwendung verwendet werden, können die folgenden Bestandteile einschließen: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser für die Injektion, Salzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Polypropylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidanzien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; chelatierende Mittel, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel für die Einstellung von Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einmalspritzen oder multiple Dosisgefäße, die aus Glas oder Plastik hergestellt sind, eingeschlossen werden.
Wenn intravenös verabreicht wird, sind bevorzugte Träger physiologische Salzlösung oder Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS).
Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die auf infizierte Zellen mit monoklonalen Antikörpern auf virale Antigene abzielen) sind ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Träger bevorzugt. Diese können gemäß den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel wie in dem US Patent Nr. 4,522,811 beschrieben ist (das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist). Zum Beispiel können Liposomen Formulierungen hergestellt werden durch das Lösen von geeignetem/geeigneten Lipid/en (wie Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterol) in einem anorganischen Lösungsmittel, das anschließend verdampft wird, was einen dünnen Film aus getrocknetem Lipid auf der Oberfläche des Behälters zurücklässt. Eine wässrige Lösung der aktiven Verbindung oder ihren Monophosphat, Diphosphat und/oder Triphosphat Derivaten wird anschließend in den Behälter eingeführt. Der Behälter wird dann mit der Hand geschüttelt, um freies Lipid Material von den Seiten des Behälters zu lösen und um lipide Aggregate zu verteilen, wodurch die liposomale Suspension gebildet wird.
Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung
Alle US Patente, die in diesem Abschnitt über Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung zitiert sind, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Das Gebiet der biologisch abbaubaren Polymere hat sich schnell entwickelt seit über die Synthese und biologische Abbaubarkeit von Polymilchsäure durch Kulkarni et al., im Jahr 1966 berichtet wurde ("Polylactic acid für surgical implants," Arch. Surg., 93: 839). Beispiele von anderen Polymeren, über die berichtet wurde, dass sie als ein Matrix Material für Verabreichungsvorrichtungen nützlich sind, schließen Polyanhydride, Polyester, wie Polyglykolide und Polylactid-co-glykolide, Polyaminosäuren, wie Polylysin, Polymere und Copolymere von Polyethylenoxid, durch Acryl abgeschlossenes Polyethylenoxid, Polyamide, Polyurethane, Polyorthoester, Polyacrylnitrile und Polyphosphazene, ein. Siehe zum Beispiel US Patent Nr. 4,891,225 und 4,906,474 an Langer (Polyanhydride), 4,767,628 an Hutchinson (Polylactid, Polylactid-co-glykolidsäure) und 4,530,840 an Tice, et al. (Polylactid, Polyglykolid und Copolymere). Siehe auch das US Patent Nr. 5,626,863 an Hubbell, et al., das photopolymerisierbare biologisch abbaubare Hydrogele als Gewebe enthaltende Materialien und Träger für die kontrollierte Freisetzung beschreibt (Hydrogele aus polymerisierten und vernetzten Makromeren umfassend hydrophile Oligomere mit biologisch abbaubaren monomeren oder oligomeren Verlängerungen, die an den Enden gekappte Monomere oder Oligomere sind, welche die Fähigkeit zur Polymerisation und Vernetzung aufweisen); und PCT WO 97/05185, eingereicht von Focal, Inc., die auf Multiblock biologisch abbaubare Hydrogele zur Verwendung als Mittel zur kontrollierten Freisetzung für die Arzneimittel Verabreichung und Gewebe Behandlungsmittel gerichtet ist.
Abbaubare Materialien biologischen Ursprungs sind gut bekannt, zum Beispiel vernetzte Gelatine. Hyaluronsäure wurde vernetzt und als ein abbaubares quellendes Polymer für biomedizinische Anwendungen verwendet (US Patent 4,957,744 an Della Valle et al.; (1991) "Surface modification of polymeric biomaterials for reduced thrombogenicity," Polym. Mater. Sci. Eng. 62: 731–735).
Viele Dispersionssysteme werden gegenwärtig verwendet als, oder sie werden untersucht zur Verwendung als Träger von Substanzen, insbesondere biologisch aktiven Verbindungen. Dispersionssysteme, die für pharmazeutische und kosmetische Formulierungen verwendet werden, können entweder als Suspensionen oder Emulsionen eingeteilt werden: Suspensionen werden definiert als feste Partikel, die in der Größe von einigen wenigen Nanometern bis zu Hunderten von Mikrometern reichen, die in einem flüssigen Medium unter Verwendung von Suspensionsmitteln verteilt sind. Die festen Partikel schießen Mikrosphären, Mikrokaspeln und Nanosphären ein. Die Emulsionen werden definiert als Dispersionen von einer Flüssigkeit in einer anderen, stabilisiert durch einen Grenzflächenfilm von Emulgatoren, wie Oberflächen aktiven Mitteln und Lipiden. Emulsionsformulierungen schließen Wasser-in-Öl und Öl-in-Wasser Emulsionen, multiple Emulsionen, Mikroemulsionen, Mikrotröpfchen und Liposomen ein. Mikrotröpfchen sind unilamellare Phospholipid Vesikel, die aus einer sphärischen Lipidschicht mit einer inneren Ölphase bestehen, wie in den US Patenten Nr. 4,622,219 und 4,725,442, erteilt an Haynes, definiert ist. Liposomen sind Phospholipid Vesikel, die hergestellt werden durch Mischen von wasserunlöslichen polaren Lipiden mit einer wässrigen Lösung. Die ungünstige Entropie, die verursacht wird durch das Mischen des unlöslichen Lipids in dem Wasser liefert eine hochgeordnete Anordnung von konzentrischen geschlossenen Membranen von Phospholipid mit darin eingeschlossener wässriger Lösung.
Das US Patent Nr. 4,938,763 an Dunn, et al., offenbart ein Verfahren zur Bildung eines Implantats in situ durch Lösen eines nicht reaktiven, wasserunlöslichen thermoplastischen Polymers in einem biologisch verträglichen, wasserlöslichen Lösungsmittel, um eine Flüssigkeit zu bilden, Anordnen der Flüssigkeit innerhalb des Körpers und Zulassen, dass das Lösungsmittel verschwindet, um ein festes Implantat herzustellen. Die Polymerlösung kann in dem Körper über eine Spritze angeordnet werden. Das Implantat kann die Form seines umgebenden Hohlraums annehmen. In einer alternativen Ausführungsform wird das Implantat aus reaktiven, flüssigen oligomeren Polymeren gebildet, die kein Lösungsmittel enthalten und die Heilen anstelle der Bildung von Feststoffen, für gewöhnlich unter Zugabe eines heilenden Katalysators.
Eine Vielzahl von Patenten offenbart Arzneimittel Verabreichungssysteme, die verwendet werden können, um D-D4FC oder ein Nukleotid oder ein anderes definiertes Vorläufer Arzneimittel davon zu verabreichen. Das US Patent Nr. 5,749,847 offenbart ein Verfahren zur Verabreichung bzw. zum Transport von Nukleotiden in Organismen durch Elektroporation. Das US Patent Nr. 5,718,921 offenbart Mikrosphären, die ein Polymer und ein darin verteiltes Arzneimittel aufweisen. Das US Patent Nr. 5,629,009 offenbart ein Verabreichungs- bzw. Transportsystem für die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Faktoren. Das US Patent Nr. 5,578,325 offenbart Nanopartikel und Mikropartikel aus nichtlinearen hydrophilen hydrophoben Multiblock Copolymeren. Das US Patent Nr. 5,545,409 offenbart ein Verabreichungs- bzw. Transportsystem für die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Faktoren. Das US Patent Nr. 5,494,682 offenbart ionisch vernetzte polymere Mikrokapseln.
Das US Patent Nr. 5,728,402 an Andrx Pharmaceuticals, Inc. beschreibt eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, die eine innere Phase, die ein aktives Arzneimittel, sein Salz oder ein Vorläufer Arzneimittel umfasst, in Mischung mit einem Hydrogel bildenden Mittel, und einer äußeren Phase, die eine Beschichtung umfasst, die sich der Auflösung im Magen widersetzt, einschließt. Die US Patente Nr. 5,736,159 und 5,558,879 an Andrx Pharmaceuticals, Inc. offenbaren eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung für Arzneimittel mit geringer Wasserlöslichkeit, in denen ein Durchtritt in situ gebildet wird. Das US Patent Nr. 5,567,441 an Andrx Pharmaceuticals, Inc. offenbart eine Formulierung zur einmal täglichen kontrollierten Freisetzung. Das US Patent Nr. 5,508,040 offenbart ein multipartikuläres pulsatiles Arzneimittel Verabreichungs- bzw. Transportsystem. Das US Patent Nr. 5,472,708 offenbart ein Arzneimittel Verabreichungs- bzw. Transportsystem auf der Basis eines pulsatilen Partikels. Das US Patent Nr. 5,458,888 beschreibt eine Tablettenformulierung zur kontrollierten Freisetzung, die hergestellt wird unter Verwendung eines Gemisches mit einer inneren Arzneimittel enthaltenden Phase und einer äußeren Phase, die ein Polyethylenglykolpolymer umfasst, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.000 bis 10.000 aufweist. Das US Patent Nr. 5,419,917 offenbart Verfahren für die Modifikation der Freisetzungsrate eines Arzneimittels aus einem Hydrogel, das auf der Verwendung einer wirksamen Menge einer pharmazeutisch verträglichen ionisierbaren Verbindung beruht, welche in der Lage ist, eine Freisetzungsrate des Arzneimittels aus dem Hydrogel in der im Wesentlichen nullten Ordnung bereitzustellen. Das US Patent Nr. 5,458,888 offenbart eine Tablettenformulierung zur kontrollierten Freisetzung.
Das US Patent Nr. 5,641,745 an Elan Corporation, plc offenbart eine pharmazeutische Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, welche das aktive Arzneimittel in einem biologisch abbaubaren Polymer umfasst, um Mikrosphären oder Nanosphären zu bilden. Das biologisch abbaubare Polymer ist geeigneterweise poly-D,L-Lactid oder ein Gemisch aus poly-D,L-Lactid und poly-D,L-Lactid-co-glykolid. Das US Patent Nr. 5,616,345 an Elan Corporation plc beschreibt eine Formulierung zur kontrollierten Absorption für die einmal tägliche Verabreichung, welche die aktive Verbindung in Assoziation mit einer organischen Säure und einer vielschichtigen Membran umfasst, die den Kern umgibt und einen Hauptteil eines pharmazeutisch verträglichen Film bildenden, wasserunlöslichen synthetischen Polymers und einen geringeren Anteil eines pharmazeutisch verträglichen Film bildenden wasserlöslichen synthetischen Polymers enthält. Das US Patent Nr. 5,641,515 offenbart eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, die auf biologisch abbaubaren Nanopartikeln beruht. Das US Patent Nr. 5,637,320 offenbart eine Formulierung zur kontrollierten Absorption für die einmal tägliche Verabreichung. Die US Patente Nr. 5,580,580 und 5,540,938 sind auf Formulierungen und ihre Verwendung in der Behandlung von neurologischen Erkrankungen gerichtet. Das US Patent Nr. 5,533,995 ist auf eine passive transdermale Vorrichtung mit kontrolliertem Arzneimittel Transport bzw. kontrollierter Arzneimittel Verabreichung gerichtet. Das US Patent Nr. 5,505,962 beschreibt eine pharmazeutische Formulierung zur kontrollierten Freisetzung.
Vorläufer Arzneimittel Formulierungen
D-D4FC oder irgendeines der Nukleoside oder anderen Verbindungen, die hier für die Verwendung in einer Kombinations- oder abwechselnden Therapie mit D-D4FC beschrieben sind, oder ihre verwandten Verbindungen können als ein acyliertes Vorläufer Arzneimittel oder ein Nukleotid Vorläufer Arzneimittel verabreicht werden, wie im Detail unten beschrieben ist.
Irgendeines der hier beschriebenen Nukleoside oder andere Verbindungen, die eine Hydroxyl oder Amin Funktion enthalten, können als ein Nukleotid Vorläufer Arzneimittel verabreicht werden, um die Aktivität, Bioverfügbarkeit, Stabilität oder auf andere Weise veränderte Eigenschaften des Nukleosids zu steigern. Eine Vielzahl von Nukleotid Vorläufer Arzneimittel Liganden sind bekannt. Im Allgemeinen werden Alkylierung, Acylierung oder eine andere lipophile Modifikation der Hydroxyl Gruppe der Verbindung oder des Mono-, Di- oder Triphosphats des Nukleosids die Stabilität des Nukleotids steigern. Beispiele von geeigneten Substituentengruppen, die eines oder mehrere der Kohlenstoffe an dem Phosphat Rest oder dem Hydroxyl ersetzen können, sind Alkyl, Aryl, Steroide, Kohlenhydrate, einschließlich Zucker, 1,2-Diacylglycerol und Alkohole. Viele sind beschrieben in R. Jones und N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1–17. Irgendeines davon kann in Kombination mit den offenbaren Nukleosiden oder anderen Verbindungen verwendet werden, um die gewünschte Wirkung zu erreichen.
Das aktive Nukleosid oder ein andere Hydroxyl enthaltende Verbindung können auch als entweder ein Etherlipid (und insbesondere ein 5'-Etherlipid für ein Nukleosid) bereitgestellt werden, wie in den folgenden Referenzen offenbart ist, die durch Bezugnahme hier eingeschlossen sind: Kucera, L. S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E. K., D. L. W., und C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation." AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6: 491–501; Piantadosi, C., J. Marasco, C. J., S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K. S. Ishaq; L. S. Kucera, N. Iyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi, und E. J. Modest. 1991: "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity." J. Med. Chem. 34: 1408–1414; Hosteller, K. Y., D. D. Richman, D. A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. M. T. van Wijk, und H. van den Bosch. 1992. "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3'-deoxythymidine." Antimicrob. Agents Chemother. 36: 2025–2029; Hostetler, K. Y., L. M. Stuhmiller, H. B. Lenting, H. van den Bosch, und D. D. Richman, 1990. "Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides." J. Biol. Chem. 265: 61127.
Nicht beschränkende Beispiele von US Patenten, die geeignete lipophile Substituenten offenbaren, die kovalent in die Nukleoside oder eine andere Hydroxyl oder Amin enthaltende Verbindung eingeschlossen werden können, vorzugsweise an der 5'-OH Position des Nukleosids oder der lipophilen Präparationen, schließen die US Patente Nr. 5,149,794 (22. Sep. 1992, Yatvin et al.); 5,194,654 (16. März 1993, Hostetler et al., 5,223,263 (29. Juni 1993, Hostetler et al.); 5,256,641 (26. Okt. 1993, Yatvin et al.); 5,411,947 (2. May 1995, Hostetler et al.); 5,463,092 (31. Okt. 1995, Hostetler et al.); 5,543,389 (6. Aug. 1996, Yatvin et al.); 5,543,390 (6. Aug. 1996, Yatvin et al.); 5,543,391 (6. Aug. 1996, Yatvin et al.); und 5,554,728 (10. Sep. 1996; Basava et al.), ein, von denen alle hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Ausländische Patentanmeldungen, die lipophile Substituenten offenbaren, die an die erfindungsgemäßen Nukleoside oder die lipophilen Präparationen angeheftet werden können, schließen die WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287 , EP 93917054.4 und WO 91/19721 ein.
Nicht beschränkende Beispiele von Nukleotid Vorläufer Arzneimitteln sind in den folgenden Referenzen beschrieben: Ho, D. H. W. (1973) "Distribution of Kinase and deaminase of 1β-D-arabinofuranosylcytosine in tissues of man and muse." Cancer Res. 33: 2816–2820; Holy, A. (1993) Isopolar phosphorous-modified Nukleotide analogues," In: De Clercq (Hrsg.), Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I, JAI Press, S. 179–231; Hong, C. I., Nechaev, A., und West, C. R. (1979a) "Synthesis and antitumor activity of 1β-D-arabino-furanosylcytosine conjugates of cortisol and cortisone." Biochem. Biophys. Rs. Commun. 88, 1223–1229; Hong, C. I., Nechaev, A., Kirisits, A. J. Buchheit, D. J. und West, C. R. (1980) "Nucleoside conjugates as potential antitumor agents. 3. Synthesis and antitumor activity of 1-(β-D-arabinofuranosyl) cytosine conjugates of corticosteroids and selected lipophilic alcohols." J. Med. Chem. 28, 171–177; Hosteller, K. Y., Stuhmiller, L. M., Lenting, H. B. M. van den Bosch, H. und Richman J. Biol. Chem. 265, 6112–6117; Hosteller, K. Y., Carson, D. A. und Richman, D. D. (1991); "Phosphatidylazidothymidine: mechanism of antiretroviral action in CEM cells." J. Biol. Chem. 266, 11714–11717; Hosteller, K. Y., Korba, B. Sridhar, C., Gardener, M. (1994a) "Antiviral activity of phosphatidyl-dideoxycytidine in hepatitis B-infected cells and enhanced hepatic uptake in mice." Antiviral Res. 24, 59–67; Hosteller, K. Y., Richman, D. D., Sridhar. C. N. Felgner, P. L. Felgner, J., Ricci, J., Gardener, M. F. Selleseth, D. W. und Ellis, M. N. (1994b) "Phosphatidylazidothymidine and phosphatidyl-ddC: Assessment of uptake in mouse lymphoid tissues and antiviral activities in human immunodeficiency virus-infected cells and in rauscher leukemia virus-infected mice." Antimicrobial Agents Chemother. 38, 2792–2797; Hunston, R. N., Jones, A. A. McGuigan, C., Walker, R. T., Balzarini, J., und DeClercq; E. (1984) "Synthesis and biological properties of some cyclic phosphotriesters derived from 2'-deoxy-5-fluorouridine." J. Med. Chem. 27, 440–444; Ji, Y. H., Moog, C., Schmitt, G., Bischoff, P. und Luu, B. (1990); "Monophosphoric acid esters of 7-β-hydroxycholesterol and of pyrimidine nucleoside as potential antitumor agents: synthesis and preliminary evaluation of antitumor activity." J. Med. Chem. 33 2264–2270; Jones, A. S., McGuigan, C., Walker, R. T., Balzarini, J. und DeClercq, E. (1984) "Synthesis, properties, and biological activity of some nucleoside cyclic phosphoramidates." J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1471–1474; Juodka, B. A. und Smart, J. (1974) "Synthesis of diribonucleoside phosph (P→N) amino acid derivatives." Coll. Czech. Chem. Comm. 39, 363–968; Kataoka, S., Imai, J., Yamaji, N., Kato, M., Saito, M., Kawada, T. und Imai, S. (1989) "Alkylated cAMP derivatives; selective synthesis and biological activities." Nucleic Acids Res. Sym. Ser. 21, 1–2; Kataoka, S., Uchida, "(cAMP) benzyl and methyl triesters." Heterocycles 32, 1351–1356; Kinchington, D., Harvey, J. J., O'Connor, T. J., Jones, B. C. N. M., Devine, K. G., Taylor- Robinson D., Jeffries, D. J. und McGuigan, C. (1992) "Comparison of antiviral effects of zidovudine phosphoramidate and phosphorodiamidate derivatives against HIV and ULV in vitro." Antiviral Chem. Chemother. 3, 107–112; Kodama, K., Morozumi, M., Saithoh, K. I., Kuninaka, H., Yosino, H. und Saneyoshi, M. (1989) "Antitumor activity and pharmacology of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine-5'-stearylphosphate; an orally active derivative of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine." Jpn. J. Cancer Res. 80, 679–685; Korty, M. und Engels, J. (1979) "The effects of adenosine- and guanosine 3',5' phosphoric and acid benzyl esters on guineapig ventricular myocardium." Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 310, 103–111; Kumar, A., Goe, P. L., Jones, A. S. Walker, R. T. Balzarini, J. und DeClercq, E. (1990) "Synthesis and biological evaluation of some cyclic phosphoramidate nucleoside derivatives." J. Med Chem, 33, 2368–2375; LeBec, C., und Huynh-Dinh, T. (1991) "Synthesis of lipophilic phosphate triester derivatives of 5-fluorouridine an arabinocytidine as anticancer prodrugs." Tetrahedron Lett. 32, 6553–6556; Lichtenstein, J., Barner, H. D. und Cohen, S. S. (1960) "The metabolism of exogenously supplied nucleotides by Escherichia coli.," J. Biol. Chem. 235, 457–465; Lucthy; J., Von Daeniken, A., Friederich, J. Manthey, B., Zweifel, J., Schlatter, C. und Benn, M. H. (1981) "Synthesis and toxicological properties of three naturally occurring cyanoepithioalkanes". Mitt. Geg. Lebensmittelunters. Hyg. 72, 131–133 (Chem. Abstr. 95, 127093); McGigan, C. Tollerfield, S. M. und Riley, P. A. (1989) "Synthesis and biological evaluation of some phosphate triester derivatives of the anti-viral drug Ara." Nucleic Acids Res. 17, 6065–6075; McGuigan, C., Devine, K. G., O'Connor, T. J., Galpin, S. A., Jeffries, D. J. und Kinchington, D. (1990a) "Synthesis and evaluation of some novel phosphoramidate derivatives of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) as anti-HIV compounds." Antiviral Chem. Chemother. 1 107–113; McGuigan, C., O'Connor, TJ., Nicholls, S. R. Nickson, C. und Kinchington, D. (1990b) "Synthesis and anti-HIV activity of some novel substituted dialkyl phosphate derivatives of AZT and ddCyd." Antiviral Chem. Chemother. 1, 355–360; McGuigan, C., Nicholls, S. R., O'Connor, T. J., und Kinchington, D. (1990c) "Synthesis of some novel dialkyl phosphate derivative of 3'-modified nucleosides as potential anti-AIDS drugs." Antiviral Chem. Chemother. 1, 25–33; McGuigan, C., Devin, K. G., O'Connor, T. J., und Kinchington, D. (1991) "Synthesis and anti-HIV activity of some haloalkyl phosphoramidate derivatives of 3'-azido-3'- deoxythylmidine (AZT); potent activity of the trichloroethyl methoxyalaninyl compound." Antiviral Res. 15, 255–263; McGuigan, C., Pathirana, R. N., Balzarini, J. und DeClercq, E. (1993b) "Intracellular delivery of bioactive AZT nucleotides by aryl phosphate derivatives of AZT." J. Med. Chem. 36, 1048–1052.
Alkylhydrogenphosphat Derivate des anti-HIV Mittels AZT können weniger toxisch als das Ausgangsnucleosid Analogon sein. Antiviral Chem. Chemother. 5, 271–277; Meyer, R. B., Jr., Shuman, D. A. und Robins, R. K. (1973) "Synthesis of purine nucleoside 3',5'-cyclic phosphoramidates." Tetrahedron Lett. 269–272; Nagyvary, J. Gohil, R. N., Kirchner, C. R. und Stevens, J. D. (1973) "Studies on neutral esters of cyclic AMP," Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1072–1077; Namane, A. Gouyette, C., Fillion, M. P., Fillion, G. und Huynh-Dinh, T. (1992) "Improved brain delivery of AZT using a glycosyl phosphotriester prodrug." J. Med. Chem. 35, 3039–3044; Nargeot, J. Nerbonne, J. M. Engels, J. und Leser, H. A. (1983) Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2395–2399; Nelson, K. A., Bentrude, W. G. Stser, W. N. und Hutchinson, J. P. (1987) "The question of chair-twist equilibria for the phosphate rings of nucleoside cyclic 3',5' monophosphates. ¹HNMR and x-ray crystallographic study of the diastereomers of thymidine phenyl cyclic 3',5'-monophosphate." J. Am. Chem. Soc. 109, 4058–4064; Nerbonne, J. M., Richard, S., Nargeot, J. und Lester, H. A. (1984) "New photoactivatable cyclic nucleotides produce intracellular jumps in cyclic AMP and cyclic GMP concentrations." Nature 301, 74–76; Neumann, J. M., Herv, M., Debouzy_; J. C., Guerra, F. I., Gouyette, C., Dupraz, B. und Huyny-Dinh, T. (1989) "Synthesis and transmembrane transport studies by NMR of a glucosyl phospholipid of thymidine." J. Am. Chem. Soc. 111, 4270–4277; Ohno, R., Tatsumi, N., Hirano, M., Imai, K. Mizoguchi, H., Nakamura, T., Kosaka, M., Takatuski, K., Yamaya, T., Toyama K., Yoshida, T., Masaoka, T., Hashimoto, S., Ohshima, T., Kimura, I. Yamada, K. und Kimura, J. (1991) "Treatment of myelodysplastic syndromes with orally administered 1-β-D-arabinouranosylcytosine-5' stearylphosphate." Oncology 48, 451–455. Palomino, E., Kessle, D. und Horwitz, J. P. (1989) "A dihydropyridine carrier system for sustained delivery of 2',3'-dideoxynucleosides to the brain." J. Med Chem. 32, 22–625; Perkins, R. M., Barney, S. Wittrock, R., Clark, P. H., Levin, R. Lambert, D. M., Petteway, S. R., Serafinowska, H. T., Bailey, S. M., Jackson, S., Harnden, M. R. Ashton, R., Sutton, D., Harvey, J. J. und Brown, A. G. (1993) "Activity of BRL47923 and its oral prodrug, SB203657A against a rauscher murine leukemia virus infection in mice." Antiviral Res. 20 (Suppl. I). 84; Piantadosi, C., Marasco, C. J., Jr., Norris-Natschke, S. L., Meyer, K. L., Gumus, F., Surles, J. R., Ishaq, K. S., Kucera, L. S. Iyer, N., Wallen, C. A., Piantadosi, S. und Modest, E. J. (1991) "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV-1 activity." J. Med. Chem. 34, 1408–1414; Pompon, A., Lefebvre, I., Imbach, J. L., Kahn, S. und Farquhar, D. (1994). "Decomposition pathways of the mono- and bis(pivaloyloxymethyl) esters of azidothymidine-5'-monophosphate in cell extract and in tissue culture medium; an application of the 'on-line ISRP-cleaning HPLC technique." Antiviral Chem Chemother. 5, 91–98; Postemark, T. (1974) "Cyclic AMP and cyclic GMP." Annu. Rev. Pharmacol. 14, 23–33; Prisbe, E. J., Martin, J. C. M., McGhee, D. P. C., Barker, M. F., Smee, D. F. Duke, A. E., Matthews, T. R. und Verheyden, J. P. J. (1986) "Synthesis and antiherpes virus activity of phosphate an phosphonate derivatives of 9-[(1,3-dihydroxy-2-propoxy)methyl]guanine." J. Med. Chem. 29, 671–675; Pucch, F., Gosselin, G., Lefebvre, I., Pompon, A., Aubertin, A. M. Dirn, und Imbach, J. L. (1993) "Intracellular delivery of nucleoside monophosphate through a reductase-mediated activation process." Antiviral Res. 22, 155–174; Pugaeva, V. P., Klochkeva, S. I., Mashbits, F. D. und Eizengart, R. S. (1969). "Toxicological assessment and health standard ratings for ethylene sulfide in the industrial atmosphere." Gig. Trf. Prof. Zabol. 14, 47–48 (Chem. Abstr. 72, 212); Robins, R. K. (1984) "The potential of nucleotide analogs as inhibitors of Retro viruses and tumors." Pharm. Res. 11–18; Rosowsky, A., Kim. S. H., Ross und J. Wick, M. M. (1982) "Lipophilic 5'-(alkylphosphate) esters of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine and its N⁴-acyl and 2,2'-anhydro-3'-O-acyl derivatives as potential prodrugs." J. Med. Chem. 25, 171–178; Ross, W. (1961) "Increased sensitivity of the walker turnout towards aromatic nitrogen mustards carrying basic side chains following glucose pretreatment." Biochem. Pharm. 8, 235–240; Ryu, E. K., Ross, R. J. Matsushita, T., MacCoss, M., Hong, C. I. und West, C. R. (1982). "Phospholipid-nucleoside conjugates. 3. Synthesis and preliminary biological evaluation of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine 5' diphosphate [–], 2-diacylglycerols." J. Med. Chem. 25, 1322–1329; Saffhill, R. und Hume, W. J. (1986) "The degradation of 5-iododeoxyuridine and 5-bromoethoxyuridine by serum from different sources and its consequences for the use of these compounds for incorporation into DNA." Chem. Biol. Interact. 57, 347–355; Saneyoshi, M., Morozumi, M., Kodama, K., Machida, J., Kuninaka, A. und Yoshino, H. (1980) "Synthetic nucleosides and nucleotides. XVI. Synthesis and biological evaluations of a series of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine 5'-alky or arylphosphates." Chem Pharm. Bull. 28, 2915–2923; Sastry, J. K., Nehete, P. N., Khan, S., Nowak, B. J., Plunkett, W., Arlinghaus, R. B. und Farquhar, D. (1992) "Membrane-permeable dideoxyuridine 5'-monophosphate analogue inhibits human immunodeficiency virus infection." Mol. Pharmacol. 41, 441–445; Shaw, J. P., Jones, R. J. Arimilli, M. N., Louie, M. S., Lee, W. A. und Cundy, K. C. (1994) "Oral bioavailability of PMEA from PMEA prodrugs in male Sprague-Dawley rats." 9. Jährliches AAPS Meeting. San Diego, CA (Abstrakt). Shuto, S., Ueda, S., Imamura, S., Fukukawa, K. Matsuda, A. und Ueda, T. (1987) "A facile one-step synthesis of 5' phosphatidiylnucleosides by an enzymatic two-phase reaction." Tetrahedron Lett. 28, 199–202; Shuto, S. Itoh, H., Ueda, S., Imamura, S., Kukukawa, K., Tsujino, M., Matsuda, A. und Ueda, T. (1988) Pharm. Bull. 36, 209–217. Ein Beispiel einer nützlichen Phosphat Vorläufer Arzneimittel Gruppe ist die S-Acyl-2-thioethyl Gruppe, die auch als "SATE" bezeichnet wird.
Diese Erfindung wurde unter Bezugnahme auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Variationen und Modifikationen der Erfindung sind für den Fachmann aus der vorangegangenen detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich. Es ist beabsichtigt, dass alle diese Variationen und Modifikationen in den Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen sind.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge an β-D-D4FC oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder Vorläufer Arzneimittels, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, mit einer wirksamen Menge an Abacavir, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger als eine kombinierte Präparation zur Verwendung für die Behandlung oder Prophylaxe einer HIV Infektion in einem Menschen.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die wirksamen Verbindungen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger für orale Verabreichung, intravenöse Verabreichung, parenterale Verabreichung, intradermale Verabreichung, subkutane Verabreichung oder topische Verabreichung geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindungen in der Form einer Dosierungseinheit vorliegen.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei die Dosierungseinheit 10 bis 1500 mg jeder Verbindung enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei die Dosierungseinheit eine Tablette oder Kapsel ist.
Verwendung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung wie in Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe einer HIV Infektion in einem Menschen.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die wirksamen Verbindungen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger für orale Verabreichung, intravenöse Verabreichung, parenterale Verabreichung, intradermale Verabreichung, subkutane Verabreichung oder topische Verabreichung geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Verbindungen in der Form einer Dosierungseinheit vorliegen.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Dosierungseinheit 10 bis 1500 mg jeder Verbindung enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Dosierungseinheit eine Tablette oder Kapsel ist.