ES2263449T3 - Beta-d-2',3'-didehidro-2',3'-dideoxi-5-fluorocitidina para uso en el tratamiento de infecciones vih. - Google Patents
Beta-d-2',3'-didehidro-2',3'-dideoxi-5-fluorocitidina para uso en el tratamiento de infecciones vih.Info
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de â- D-D4FC o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como una preparación combinada para uso para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un ser humano.
Description
\beta-D-2',3'-didehidro-2',3'-dideoxi-5-fluorocitidina
para uso en el tratamiento de infecciones VIH.
Esta invención está subvencionada parcialmente
por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud de Estados
Unidos bajo la subvención Nº 1R01-
A1-41980-01. El gobierno de los
Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.
Esta solicitud reivindica prioridad a la
solicitud provisional de patente de Estados Unidos Nº 60/116.773,
presentada en 22 de enero de 1999.
En 1983, la causa etiológica del SIDA se
determinó que era el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En
1985, se reseñó que el nucleósido sintético
3'-azido-3'-desoximitidina
(AZT) inhibe la réplica del virus de inmunodeficiencia humana.
Desde entonces, un número de otros nucleósidos sintéticos,
incluyendo 2',3'-didesoxi (DDI),
2',3'-didesoxicitidina (DDC),
2',3'-2',3'-dideshidrotimidina
(D4T),
cis-2-hidroximetil-5-%-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano
(FTC),
(-)-cis-2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano
(3TC), se han probado que son eficaces contra el VIH. Después de al
fosforilación celular del 5'-trifosfato por las
quinasas celulares estos nucleósidos sintéticos se incorporan en una
hebra de crecimiento del ADN viral, provocando la terminación de la
cadena debido a la ausencia del grupo 3'-hidroxi.
Por lo tanto también pueden inhibir la enzima viral transcriptasa
inversa.
Se ha reconocido que las variantes resistentes a
fármacos del VIH pueden emerger después de un tratamiento
prolongado con un agente antiviral. La resistencia a fármacos en la
mayoría de los casos ocurre típicamente mediante mutación de un gen
que codifica una enzima usada en la replicación viral, y en la
mayoría de los casos típicamente en el caso de VIH, transcriptasa
inversa, proteasa, o ADN polimerasa. Recientemente, se ha
demostrado que la eficacia de un fármaco contra la infección por VIH
se puede prolongar, aumentar, o reestablecer administrando el
compuesto en combinación o alternancia con un segundo compuesto, y
quizás antiviral tercero compuesto antiviral que induce una mutación
diferente de la causada por el fármaco principal. Como alternativa,
la farmacocinética, distribución biológica, u otro parámetro del
fármaco se puede alterar mediante tal combinación o terapia de
alternancia. En general, la terapia de combinación se prefiere
típicamente sobre la terapia de alternancia debido a que induce
múltiples presiones simultáneas en el virus. Sin embargo, no se
puede predecir, que las mutaciones inducirán en el genoma del
VIH-1 por un fármaco dado, si la mutación es
permanente o transitoria, o cómo una célula infectada con una
secuencia de VIH-1 mutada responderá a la terapia
con otros agentes en combinación o alternancia. Esto se agrava por
el hecho que de existe una penuria de datos en al cinética de la
resistencia a fármacos en los cultivos celulares a largo plazo
tratados con modernos agentes antirretrovirales.
Las variantes de VIH-1
resistentes a
3'-azido-3'-desoxitimidina
(AZT), 2'-3'-didesoxicitidina (DDC)
se han aislado de pacientes que reciben monoterapia a largo plazo
con estos fármacos (Larder BA, Darby G, Richman DD. Science 1989;
243: 1731-4; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, y col
Science 1991, 253: 1557-9, St Clair MH, Martin JL,
Tudor WG, y col., Science 1991, 253: 1557-9, y
Fitzgibbon JE, Howell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin
DT. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 153 - 7). La evidencia
clínica creciente indica que la resistencia de AZT es un vaticinador
del pobre resultado clínico tanto en niños como en adultos (Mayers
DL, Conferencia en la 32ª Conference Interscience sobre Agentes
Antimicrobianos y Quimioterapia (Anaheim, CA, 1992); Tudor -
Willians G, St Clair MH, McKinney RE, y col Lancet 1992; 339:
15-9; Ogino MT, Dankner WM, Spector SA, J. Pediatr
1993; 123:
1 - B; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VA, y col. Tercer taller sobre resistencia viral (Gaithersburg, MD. 1993); y Mayers D, y el grupo de estudio de RV43. Tercer taller sobre resistencia viral (Gaithersburg, MD. 1993)). El rápido desarrollo de resistencia a VIH-1 a los inhibidores de la transcriptasa inversa de no nucleósidos (NNRTIs) también se ha reseñado tanto en cultivo de células como en ensayos clínicos humanos (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ y col., J. Virol 1991; 65 (9): 4887-92; Richman D, Shih CK, Lowy I, y col., Proc Natl Acad Sci (Estados Unidos) 1991: 88: 11241-5; Mellors JW, Dutschman GE, Im GJ, Tramontao E, Winkler SR, Cheng YC. Mol Pharm 1992; 41: 446 - 51;
Richman DD y el equipo de estudio ACTG 164/168. Segundo taller internacional de resistencia de fármacos al VIH-1 (Noordwijk, Holanda 1993), y Saag MS, Emini EA, Laskin OL, y col., N. Engl J Med 1993; 329: 1065-1072). En el caso de NNRTI L'697.661, el VIH-1 resistente a fármacos surgió dentro de las 2 - 6 semanas de iniciar la terapia en asociación con el regreso de viremia a niveles de pretratamiento (Saag MS, Emini EA, Laskin OL, y col., N. Engl J Med 1993; 329: 1065 - 1072). También se ha indicado un descubrimiento importante en la viremia asociada con la aparición de las cepas resistentes a fármacos con otras clases de inhibidores de VIH-1, que incluyen inhibidores de la proteasa (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil K, Mous J. Tercer taller sobre resistencia viral
(Gaithersburg, ND, 1993)). Esta experiencia ha conducido a la realización de que el potencial para la resistencia a fármacos de VIL-1 se debe determinar temprano en la evaluación preclínica de todas las terapias nuevas para
1 - B; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VA, y col. Tercer taller sobre resistencia viral (Gaithersburg, MD. 1993); y Mayers D, y el grupo de estudio de RV43. Tercer taller sobre resistencia viral (Gaithersburg, MD. 1993)). El rápido desarrollo de resistencia a VIH-1 a los inhibidores de la transcriptasa inversa de no nucleósidos (NNRTIs) también se ha reseñado tanto en cultivo de células como en ensayos clínicos humanos (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ y col., J. Virol 1991; 65 (9): 4887-92; Richman D, Shih CK, Lowy I, y col., Proc Natl Acad Sci (Estados Unidos) 1991: 88: 11241-5; Mellors JW, Dutschman GE, Im GJ, Tramontao E, Winkler SR, Cheng YC. Mol Pharm 1992; 41: 446 - 51;
Richman DD y el equipo de estudio ACTG 164/168. Segundo taller internacional de resistencia de fármacos al VIH-1 (Noordwijk, Holanda 1993), y Saag MS, Emini EA, Laskin OL, y col., N. Engl J Med 1993; 329: 1065-1072). En el caso de NNRTI L'697.661, el VIH-1 resistente a fármacos surgió dentro de las 2 - 6 semanas de iniciar la terapia en asociación con el regreso de viremia a niveles de pretratamiento (Saag MS, Emini EA, Laskin OL, y col., N. Engl J Med 1993; 329: 1065 - 1072). También se ha indicado un descubrimiento importante en la viremia asociada con la aparición de las cepas resistentes a fármacos con otras clases de inhibidores de VIH-1, que incluyen inhibidores de la proteasa (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil K, Mous J. Tercer taller sobre resistencia viral
(Gaithersburg, ND, 1993)). Esta experiencia ha conducido a la realización de que el potencial para la resistencia a fármacos de VIL-1 se debe determinar temprano en la evaluación preclínica de todas las terapias nuevas para
\hbox{el VIH-1.}
2',3'-Didesoxi-2',3'-dideshidro-5-fluorocitidina
(D4FC) es un compuesto conocido. La Publicación de la Solicitud de
Patente Europea Nº 0 409 227 A2 presentada por Ajinomoto Co., Inc.,
describe \beta-D-D4FC (ejemplo 2)
y su uso para tratar la hepatitis B. La patente holandesa Nº 8901258
presentada por Stichting Rega V. Z. W. describe generalmente
derivados de
5-halógeno-2',3'-didesoxi-2',3'-didesoxicitidina
para uso en el tratamiento de VIH y hepatitis B ("VBH"). La
patente de Estados Unidos nº 5.703.058 describe un procedimiento
para el tratamiento de infección por VIH y VBH que incluye la
administración de una cantidad eficaz de
\beta-D-D4FC en combinación o
alternancia con
cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosn-1-il)-1,3-oxatiolano,
cis-2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano,
9-[4-(hidroximetil)-2-ciclopenten-1-il)-guanina
(carbovir), 9-[(2-hidroxietoxi9metil]guanina
(aciclovir), interferón
3'-desoxi-3'-azidotimidina
(AZT), 2',3'-didesoxiinosina (DDI),
2',3'-didesoxicitidina (DDC),
(-)-2'-fluoro-5-metil-\beta-L-ara-uridina
(L-FMAU) o 2',3'-
2',3'-dideshidrotimidina (D4T). La patente de
Estados Unidos Nº 5.905.070 describe un procedimiento para el
tratamiento de infección por VIH y VBH que incluye la administración
de una cantidad eficaz de
\beta-D-D4FC en combinación o
alternancia con
cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosn-1-il)-1,3-oxatiolano,
cis-2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano,
9-[4-(hidroximetil)-2-ciclopenten-1-il)-guanina
(carbovir), 9-[(2-hidroxietoxi9metil]guanina
(aciclovir), interferón
3'-desoxi-3'-azidotimidina
(AZT), 2',3'-didesoxiinosina (DDI),
2',3'-didesoxicitidina (DDC),
(-)-2'-fluoro-5-metil-\beta-L-ara-uridina
(L-FMAU) o 2',3'-
2',3'-dideshidrotimidina (D4T) para el tratamiento
de VIH.
Es un objeto de la presente invención determinar
la administración óptima de
\beta-D-D4FC para el tratamiento
de VIH.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento y composición que incluye
\beta-D-D4FC para el tratamiento
de pacientes infectados con VIH que muestra farmacocinética,
distribución biológica, metabolismo, resistencia u otros parámetros
ventajosos o mejorados sobre la administración de
\beta-D-D4FC solo.
Es todavía otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de
pacientes infectados con VIH en los que
\beta-D-D4FC se administra en
combinación o alternancia con un segundo compuesto que actúa de
manera sinérgica con \beta-D-D4FC
contra el virus.
Es todavía otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de
pacientes infectados con VIH en los que
\beta-D-D4FC se administra en
combinación o alternancia con un segundo compuesto que actúa de
manera sinérgica con \beta-D-D4FC
contra el virus.
Es todavía otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de
pacientes infectados con una forma resistente a fármacos de VIH.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para evaluar cómo administrar mejor
\beta-D-D4FC.
Se ha descubierto que
\beta-D-D4FC induce mutaciones en
VIH-1 en los codones 70 (K a N), 90 y 172 de la
región de la transcriptasa inversa del virus. Basándose en este
descubrimiento, se proporciona un procedimiento para tratar VIH que
incluye la administración de
\beta-D-D4FC o su sal o profármaco
farmacéuticamente aceptable a un ser humano en necesidad de terapia
en combinación o alternancia con un fármaco que induce una mutación
en el VIH-1 en una localización distinta de la de
los codones 70 (K a N), 90 o 172 de la región de la transcriptasa
inversa. Esta invención se puede practicar con relación a los
patrones de mutación publicados para fármacos
anti-VIH conocidos, o determinando el patrón de
mutación para un nuevo fármaco.
En particular, la presente invención proporciona
una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de
\beta-D-D4FC o su sal o profármaco
farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir,
opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como una
preparación combinada para uso para el tratamiento o profilaxis de
una infección por VIH en un ser humano.
La presente invención además proporciona un uso
de una cantidad eficaz de
\beta-D-D4FC o su sal o profármaco
farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir,
opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de
una infección por VIH en un ser humano.
La combinación descrita, alternancia, o
regímenes de salvamento son útiles en la prevención y tratamiento
de infecciones por VIH y otras afecciones relacionadas tales como
completo relacionado con SIDA (ARC), linfoadenopatía generalizada
persistente (PGL), afecciones neurológicas relacionadas con SIDA,
afecciones positivas de anticuerpo anti-VIH y
positivas de VIH, sarcoma de Karposi, tromocitopenia purpúrea e
infecciones aprovechadas. Además, estos compuestos o formulaciones
se pueden usar de manera profiláctica para prevenir o retardar la
progresión de una enfermedad clínica en individuos que son positivos
en anticuerpos anti-VIH o antígenos VIH o que se han
expuestos a VIH.
La figura 1 es un dibujo de
\beta-D-D4FC.
La figura 2 es un gráfico de la concentración de
\beta-D-D4FC en micromolar frente
el porcentaje de inhibición de la producción de antígeno p24. La
figura ilustra la selección de virus con sensibilidad reducida a
\beta-D-D4FC.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "virus resistente" se refiere a un virus que muestra un
incremento de tres, y más típicamente cinco o más veces en
CE_{50} comparado con el virus simple en una línea celular
constante, incluyendo, pero sin limitación a células mononucleares
de sangre periférica (PBMCs), o células MT2 o MT4.
El término D-D4FC se usa de
manera indistintamente con el término
\beta-D-D4FC más adelante.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "sustancialmente puro" o "sustancialmente en la forma
de un isómero óptico" se refiere a una composición de
nucleósidos que incluye al menos el 95% al 98%, o más,
preferiblemente el 99%, de un enantiómero individual de ese
nucleósido. En una realización preferente
\beta-D-D4FC se administra en
forma sustancialmente pura de las indicaciones descritas.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "profármaco" se refiere a los derivados 5' y N^{4}
acilado, alquilado, o fosforilado (incluyendo los ésteres mono, si,
y trifosfato así como fosfatos estabilizados y fosfolípidos) de
D-D4FC. En una realización, el grupo acilo es un
éster de ácido carboxílico en el que el resto no carbonilo del grupo
éster se selecciona entre alquilo lineal, ramificado, o cíclico,
alcoxialquilo incluyendo metoximetilo, aralquilo incluyendo bencilo,
ariloxialquilo incluyendo fenoximetilo, arilo incluyendo fenilo
opcionalmente sustituido por halógeno, alquilo, o alcoxi, ésteres
sulfonatos tales como alquil o aralquil sulfonilo incluyendo
metanosulfonilo, tritilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido,
trialquilsililo, o difenilmetilsililo. Los grupos arilo en los
ésteres comprenden de manera
óptima un grupo fenilo. El grupo alquilo puede ser lineal, ramificado o cíclico y es preferiblemente C_{1} a C_{18}.
óptima un grupo fenilo. El grupo alquilo puede ser lineal, ramificado o cíclico y es preferiblemente C_{1} a C_{18}.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales
farmacéuticamente aceptables que, tras la administración al
receptor, son capaces de proporcionar directa o indirectamente,
\beta-D-D4FC, o que muestran
actividad ellos mismos.
Las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta
memoria descriptiva se describen en la tabla 1.
Tanto los enantiómeros D- y L- de,
\beta-2',3'-dideshidro-2',3'-didesoxi-5-fluorocitidina
(D4FC) son inhibidores selectivos de VIH-1, aunque
el enantiómero D es más selectivo. El desarrollo in vitro de
resistencia a D-D4FC se evalúan mediante subcultivo
en serie de VIH-I_{LAI} en células
MT-2 y células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) en presencia de concentraciones crecientes de fármaco. Las
variantes resistentes a D-D4FC surgidos solamente
después de la exposición prolongada al fármaco. Los virus obtenidos
después de 20 subcultivos en células MT-2 mostraron
resistencia de 5,3 veces resistencia a D-D4FC. El
virus resistente no se podría aislar en PBMC a pesar de múltiples
intentos. La secuenciación del ADN de la TR a partir de virus
seleccionados en células MT-2 reveló dos mutaciones:
K65R y V179D. La selección del virus resistente a
D-D4FC se repitió en las células
MT-2 y las variantes que muestran una resistencia de
19,3 veces codificaban tres mutaciones de la RT novedosas: K70N,
V90I y R172K. Un virus de VIH-I_{LAI}
recombinante K65R mostró una resistencia de 3,9 veces a
D-D4FC. La V179D, una mutación que confiere
resistencia a inhibidores de la RT no nucleósido, es los más
probable compensatoria para K65R. el papel de otras mutaciones en la
resistencia a D-D4FC también se evaluó mediante la
construcción de virus recombinante con mutaciones individuales y
múltiples, sin embargo, ninguno de los recombinantes ensayados
demostró una resistencia > 2 veces.
Compuestos químicos.
D-D4FC se sintetizó en uno de nuestros 4
laboratorios como se ha descrito previamente (Shi y col., 1999). Se
preparó en forma de soluciones madre 10 mM en agua estéril y se
almacenó a -20ºC. El compuesto se descongeló y e diluyó hasta la
concentración seseada inmediatamente antes de uso.
Células. Se cultivaron células
MT-2 /Programa de reactivo de referencia y de
investigación del SIDA, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades
Infecciosas, Institutos Nacionales de salud, aportado por D.
Richman) en RPMI 1640 (Whittaker M. A., Bioproducts, Walkersville,
MD) suplementado con suero fetal bovino al 10%, tampón HEPES 10 mM,
penicilina (50 IU/ml) y estreptomicina (50 \mug/ml).
Virus. VIH-1_{LAI}, un
aislamiento clínico clonado molecularmente, se usó tanto como el
virus de partida para la selección de resistencia así como para la
generación de mutantes recombinantes. Las preparaciones de las
soluciones madre de VIH-1_{LAI}, se prepararon
mediante electroporación 5-10 jig de ADN de plásmido
proviral en 1,3 x 10^{7} células MT-2. A efecto
citopático viral máximo (generalmente 7 días después de la
infección), se recogió el sobrenadante de los cultivos infectados,
se tomaron alícuotas y se almacenaron a -80ºC hasta uso. Las
preparaciones de los virus de valoraron mediante dilución de punto
final tres veces en células MT-2, y se calculó el
valor de TCID_{50} con la ecuación de Reed y Muench.
Selección de virus resistentes. Antes de
comenzar la selección de virus resistentes a D-D4FC,
el virus de partida (VIH-1_{LAI}) se se
subcultivó como virus libre de células durante 10 ciclos en células
MT-2 en ausencia de fármaco. Los virus resistentes
a D-DAFC se seleccionó mediante subcultivo en serie
de VIH-1_{LAI} en células MT-2 en
presencia de concentraciones crecientes gradualmente de
D-D4FC. La selección de virus resistentes a
D-D4FC se llevó a cabo dos veces. la selección se
inició inoculando 1 x 10^{6} células MT-2 con
0,01 moles de virus. Al máximo de efecto citopático
(4-7 días después de la infección), el sobrenadante
de los cultivos infectados se recogió y se usaron posteriormente
0,1-0,3 ml posteriormente para inicial otro ciclo de
infección. También del sobrenadante se recogieron alícuotas y se
almacenaron a -80ºC para caracterización de los virus seleccionados.
El virus se subcultivó al menos tres veces a cada concentración, el
número de ciclos a cualquier concentración dada de fármaco que era
dependiente de la capacidad del virus de crecer a una concentración
particular de D-D4FC. Durante el primer
procedimiento d selección, el virus se subcultivó una vez en
ausencia de fármaco antes de incrementar la concentración de fármaco
(Tabla 2). Como control, el virus también se subcultivó en paralelo
en la ausencia de fármaco. La primera selección se inició a 0,75
\muM y se incrementó de manera gradual hasta 4,0 \muM durante el
curso de 37 ciclos del subcultivo libre de células. La segunda
selección se inició a 0,2 \muM y se incrementó de manera gradual
hasta 6,2 \muM durante el curso de 27 ciclos de subcultivo libre
de células (Tabla 2).
Selección Nº 1 | Selección Nº 2 | ||
Número de subcultivos | [D-Fd4C] \muM | Número de subcultivos | [D-Fd4c] \muM |
1-2 | 0,75 | 1-3 | 0,2 |
3-4 | 1,5 | 4-6 | 0,4 |
5 | 1,0 | 7-9 | 0,8 |
6 | 0 | 10-12 | 1,6 |
Selección Nº 1 | Selección Nº 2 | ||
Número de subcultivos | [D-Fd4C] \muM | Número de subcultivos | [D-Fd4c] \muM |
7-9 | 1,5 | 13 | 3,2 |
10-12 | 2,0 | 14-16 | 1,6 |
13-16 | 3,0 | 17-19 | 3,2 |
7 | 0 | 20-22 | 4,8 |
18-20 | 4,5 | 23-25 | 6,2 |
21 | 0 | 26 | 12,0 |
22-35 | 4,5 | 27 | 6,2 |
36-38 | 1,0 | ||
38-41 | 2,0 | ||
42-43 | 4,0 |
Ensayos de susceptibilidad antiviral. La
susceptibilidad del virus a D- D4FC se midió midiendo el porcentaje
de inhibición de la producción de antígeno p24. En resumen, células
MT-2 (1 x 10^{5} células/ml) se infectaron con
virus a una multiplicidad de infección de 0,01 en presencia de
diluciones en serie de D-D4FC. Cada dilución se
ensayó por triplicado. Los sobrenadantes de los cultivos se
recogieron el día 7 después de la infección y se ensayaron para
evaluar la producción del antígeno p24 usando un ensayo comercial
(DuPont, NEN Products, Wilmington, Del). La susceptibilidad del
virus se expresó como la concentración de fármaco requerida para
inhibir la producción del antígeno p24 en un 50% (CE_{50}).
Secuenciación de ADN de transcriptasa inversa
de virus seleccionado. El ARN viral (ARNv) del virus
seleccionado se aisló usando reactivo TRIzol (GibcoBRL, Grand
Island, NY). La región codificadora de la RT de longitud completa se
amplificó mediante RT-PCR. El producto de PCR se
purificó posteriormente usando preparaciones de PCR de Wizard
(Promega, Madison, WI) y se secuenció.
Producción de VIH-1
recombinante mutante. La RT mutante se generó usando el sistema
de mutagénesis in vitro SitesII alterado (Promega, Madison,
WI). La mutagénesis se llevó a cabo en
VIH-1_{LAI}, RT se clonó en un vector mutagénico
(PALTER, Promega). La presencia de la mutación deseada se determinó
mediante secuenciación directa del gen de la RT. La RT mutante se
ligó posteriormente en el vector pxxVIH-1. Las
soluciones madre de virus mutantes se prepararon después mediante
electroporación de 5 - 10 \mu de ADN en 1,3 x 10^{7} de células
MT-2 como se ha descrito anteriormente.
Determinación del fenotipo de virus
resistente. El virus resistente a D-D4FC se
seleccionó después de 37 (selección nº 1) y 20 (selección nº 2)
ciclos de infección en células MT-2. La evaluación
de la susceptibilidad de D-D4FC del virus del
subcultivo 37 de la selección nº 1 (p37 D-D4FC nº 1)
demostró que p37 D-D4FC nº 1 es 19,4 veces menos
sensible a D-D4FC que el tipo salvaje como se
demuestra por un incremento en la CE_{50} desde 0,21 \muM a 4,07
\muM (figura 2, tabla 3). La evaluación de la susceptibilidad a
D-D4FC del virus del subcultivo 20 de la selección
nº 2 (p20 D-D4FC nº 2) demostró que p20
D-D4FC nº 2 es 5,3 veces menos sensible a
D-D4FC que el tipo salvaje como se demuestra por un
incremento en la CE_{50} desde 0,21 \muM a 1,1 \muM (figura 2,
tabla 3).
Determinación del genotipo de virus
resistente. ARNv de p37 D-D4FC nº 1 y p20 D-
D4FC nº 2 se aisló y se sometió a amplificación por
RT-PCR. La secuenciación del producto de la PCR
reveló la presencia de tres mutaciones novedosas en p37
D-D4FC nº 1: K70N (AAA \rightarrow 4AAT), V901
(GTT \rightarrow ATT) y R172K (AGA \rightarrow AAA) (Tabla 2).
Se identificaron dos mutaciones diferentes en p20
D-D4FC nº 2: K65R (AAA \rightarrow AGA) y V179D
(GTT \rightarrow GAT (tabla 3). No se encontraron otras mutaciones
en los genes de la RT de estos virus (a partir de los aminoácidos
B-3309. Adicionalmente. no se encontraron mutaciones
en los virus de control subcultivados en paralelo en la ausencia del
fármaco.
El asilamiento de virus resistentes a
D-D4FC con diferentes mutaciones asociadas podría
ser el resultado de las técnicas de selección diferentes usados
para< aislar virus resistente a D-D4FC. En la
selección nº 1, la presión selectiva se retiró durante un ciclo de
infección antes de incrementar la concentración del fármaco. esto
no se hizo durante el segundo procedimiento de selección. De manera
adicional, la concentración de partida se D-D4FC
usada para cada uno de los procedimientos de selección variaba
aproximadamente 3 veces. Se usó una concentración mucho más alta del
fármaco para la selección nº 1 (0,75 \muM). Estas dos diferencias
son probablemente la acusa de las diferentes mutaciones en los virus
seleccionados.
VIH-1 recombinante
mutante. Las mutaciones que contenían el VIH-1
recombinante mutante identificadas en los virus seleccionados se
generaron mediante mutaciones dirigidas al lugar. La tabla 4 enumera
cada uno de los virus recombinantes mutantes generados a sí como la
CE_{50} correspondiente. Aunque el virus
xxVIH-1_{LAI}, K65R demostró una disminución de
3,9 veces en la susceptibilidad a D-D4FC, ninguno de
los otros virus mostró una resistencia de > de 3,3 veces. Se debe
apreciar, sin embargo, que el triple mutante
(xxVIH-1_{LAI}, K70N/V90/R172K) no crecían bien, y
esto podría ser la causa de la incapacidad de reproducir la
resistencia observada en el virus seleccionado in vitro.
Virus | CE_{50} (\muM) | Veces de resistencia | Mutaciones desde el |
estado inicial | |||
VIH-1L_{AIP}0 | 0,21 | - - | - - |
VIH-1p37 | 4,07 | 19,4 | K70N |
D-Fd4Cnº1 | V90I | ||
R172K | |||
VIH-1p20 | 1,11 | 5,3 | K65R |
D-Fd4Cnº2 | V179D |
Virus | CE_{50} | Veces de resistencia |
xxLAI | 0,32 | - - |
xxK65R | 1,24 | 3,9 |
xxLAI | 0,17 | - - |
xxK70N | 0,24 | 1,4 |
xxV90I | 0,25 | 1,5 |
xxLAI | 0,28 | - - |
xxR172K | 0,23 | 0,8 |
xxV901/R172K | 0,36 | 1,3 |
xxLAI | 0,13 | - - |
xxK70N/V901/R172K | 0,056 | 0,4 |
La tabla 5 proporciona los valores de
concentración media eficaz e índices de combinaciones (I. C.) para
D-D4FC solo y en combinación con AZT y D4T en
células de PBM humanas extremadamente infectadas
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr \cr \cr}
\newpage
En general, durante la terapia de alternancia,
una dosificación eficaz de cada agente se administró en serie,
mientras que en la terapia de combinación, una dosis eficaz de dos o
más agentes se administran juntos. En la terapia de alternancia, por
ejemplo, se pueden administrar uno o más primeros agentes en una
cantidad eficaz durante un período de tiempo eficaz para tratar la
infección viral, y después uno o más segundos agentes sustituidos
por los primeros agentes
en la rutina de terapia y del mismo modo proporcionados en una cantidad eficaz durante un período de tiempo eficaz.
en la rutina de terapia y del mismo modo proporcionados en una cantidad eficaz durante un período de tiempo eficaz.
Las dosificaciones dependerán de factores tales
como absorción, distribución biológica, metabolismo y velocidades de
excreción para cada fármaco así como otros factores conocidos por
los expertos en la técnica. Se ha de indicar que los valores de
dosificación también variarán con la gravedad de la afección
aliviar. Se ha de entender adicionalmente que para cualquier sujeto
particular, los regímenes y programas de dosificación específicos se
deben ajustar durante un tiempo de acuerdo con la necesidad
individual y el juicio profesional de la persona que administra o
supervisa la administración de las composiciones. Los ejemplos de
intervalos de dosificación adecuadas para los compuestos anti VIH,
que incluyen los derivados de nucleósidos (por ejemplo, AZT, D4T,
DDi, y 3TC) o inhibidores de proteasa, por ejemplo, nelfinavir e
indinavir, se pueden encontrar en la bibliografía sintética en la
referencia de escritorios de los médicos. Muchos ejemplos de
intervalos de dosificación adecuados para otros compuestos descritos
en esta memoria descriptiva también se encuentran en la bibliografía
pública o se puede identificar usando procedimientos conocidos.
estos intervalos de dosificación se pueden modificar según se desee
para lograr el resultado deseado.
En otra realización preferida, el
D-D4FC se administra en combinación con con abacavir
(1592U89) que es succinato de (1S,
4R)4-[2-amino-6-ciclopropil-amino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol.
En otra realización, el D-D4FC
se administra en combinación con un inhibidor de la transcriptasa
inversa de no nucleósido tal como DMP-266
((S)-6-cloro-4-ciclorpopiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona
(SUSTIVA, véase por ejemplo la patente de Estados Unidos Nº
5.519.021); delaviridina;
(1-[3-(1-metil-etil)amino]-2-piridinil-4-[[5-[(metilsulfonil)amino]-1H-indol-2-il]carbonil]-,
monoetanosulfonato), nevirapina, o delaviridina.
En otra realización, el v se administra en
combinación o alternancia con un inhibidor de la integrasa de VIH o
un inhibidor de quimioquina.
Los procedimientos y kits similares a los
descritos en las patentes de Estados Unidos Nº 5.409.810 de Larder
y col., para AZT, pero basándose en el perfil de mutación para
D-D4FC, se pueden usar para analizar la presencia de
mutaciones inducidas por D-D4FC y de este modo
forman parte de la invención presentada en esta memoria descriptiva.
Además para incorporar la patente de Larder por referencia en su
totalidad, estas técnicas se establecen más adelante.
Un procedimiento de evaluación de la
sensibilidad de una muestra de VIH-1 a
T3-D4FC, incluye:
- (i)
- aislar ácido nucleico de la muestra,
- (ii)
- hibridizar un oligonucleótido al ácido nucleico, siendo los oligonucleótidos complementarios a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia de ADN mutante (o su ARN correspondiente),
- (iii)
- intentar la polimerización del ácido nucleico a partir del extremo 3' del oligonucleótido,
- (iv)
- averiguar si o no un producto extendido del cebador de oligonucleótido está presente.
Es posible usar ADN o ARN aislado a partir de
muestras de VIH-1 en esta metodología. Las células
adecuadas para reforzar el crecimiento de aislado de
MV-1 se incuban durante un período de tiempo. Las
células se recubren mediante centrifugación. Después se puede aislar
ADN mediante digestión de las células con proteinasa K en presencia
de EDTA y un detergente tal como SDS, seguido de extracción con
fenol.
Los procedimientos de extracción y purificación
bien conocidos están disponibles para el aislamiento de ADN de una
muestra. El ARN se puede aislar usando la siguiente metodología. Las
células adecuadas se infectan y se incuban durante un período de
tiempo. las células se recubren mediante centrifugación. las células
se vuelven a suspender en tampón de extracción de ARN seguido de la
digestión usando un tampón de digestión de proteinasa y digestión
con la proteinasa K. Las proteínas se retiran en presencia de una
mezcla de fenol/cloroformo. Después el ARN se pueden recubrir
después de unas etapas de centrifugación adicionales (Maniatis, T.,
y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).
Aunque es posible usar ácido nucleico no
amplificado, debido a la escasez relativa de ácido nucleico en una
muestra de VIH-1 es preferible amplificarlo. el
ácido nucleico se puede amplificar selectivamente usando la técnica
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es un
procedimiento in vitro para producir grandes cantidades de
fragmento de ácido nucleico específico de longitud definida y
secuencia de cantidades pequeñas de un molde.
La PCR está comprendida de reactivos
convencionales usando concentración de Mg^{2}, cebadores de
oligonucleótido y condiciones de ciclación de temperatura para la
amplificación del gen de la RT usando los cebadores. Los cebadores
se eligen de tal manera que amplificarán el gen entero de la RT o
una secuencia seleccionada que incorpora los nucleótidos
correspondientes a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje
de VIH-1 que induce el codón que está mutado.
El ARN no se puede amplificar directamente
mediante PCR, su ADNc correspondiente se debe sintetizar. la
síntesis de ADNc normalmente se lleva a cabo mediante transcripción
inversa cebada usando cebadores de oligo-dt. De
manera ventajosa, los cebadores se eligen de manera que
simplificarán la secuencia de ácido nucleico para la RT o una
secuencia seleccionada que incorpora los nucleótidos
correspondientes a la región de ARN correspondiente a la secuencia
de ADN de tipo salvaje o a la región de la secuencia de ADN mutada
correspondiente al codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la
transcriptasa inversa. Esto se podría lograr preparando un cebador
de oligonucleótido que es complementario a la hebra de ARN que está
corriente arriba de al secuencia correspondiente de la secuencia de
ADN de tipo salvaje. El ADNc preparado mediante esta metodología
(véase Maniatis, T., y col., supra) se puede después usar de
al misma forma que para el ADN ya descrito.
La siguiente fase de la metodología es hibridar
al ácido nucleico un oligonucleótido que es complementario a una
región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN
correspondiente) o a una región de la secuencia de ADN mutante (o su
ARN correspondiente).
Las condiciones y reactivos se proporcionan
después para permitir la polimerización del ácido nucleico a partir
del extremo 3' del cebador de oligonucleótido. Tales reacciones de
polimerización se conocen bien en la técnica.
Si el cebador de oligonucleótido tiene en su
extremo 3' un nucleótido que es complementario a un genotipo
mutante, ese genotipo es un genotipo que tiene un cambio de
nucleótido en el codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la RT,
después la polimerización de la secuencia de ácido nucleico
solamente se producirá si el ácido nucleico de la muestra es el
mismo que el genotipo mutante. La polimerización de una secuencia de
ácido nucleico de tipo salvaje no se producirá a al menos no en un
grado significativo debido a una falta de coincidencia de
nucleótidos en el extremo 3' del cebador de oligonucleótido y la
secuencia de ácido nucleico de al muestra.
Si el cebador de oligonucleótido tiene en
extremo 3' del nucleótido que es complementario al genotipo de tipo
salvaje, que es un genotipo que tiene el nucleósido de tipo salvaje
en el codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la RT, después
existirá la polimerización de una secuencia de ácido nucleico que es
de tipo salvaje en esa posición. No existirá polimerización de un
ácido nucleico que tiene un nucleótido mutante en la posición
3'.
La longitud preferida de cada oligonucleótido es
15 - 20 nucleótidos. Los oligonucleótidos se pueden preparar de
acuerdo con la metodología bien conocida por los expertos en la
técnica (Koster, H., Drug Research, 30 p548 (1980); Koster, H.,
Tetrahedron Letters p 1527 (1972); Caruthers, Tetrahedron Letters,
p179, (1980); Tetrahedron Letters, p1859, (1981); Tetrahedron
Letters 24, p 245, (1983); Gate. M. Nuceic Acid Research, 8, p1081,
(1980)) y en general se prepara usando un sintetizador de ADN
automático tal como un sintetizador de Applied Biosystems 381A.
Es conveniente determinar la presencia de un
producto extendido de cebador de oligonucleótido. Los medios para
llevar a cabo al detección es usando una marca apropiada.
La marca se puede unir de manera conveniente al
cebador de oligonucleótido a alguna otra molécula que se unirá al
producto de polimerización extendido del cebador.
La marca puede ser por ejemplo una enzima,
radioisótopo o fluorocromo. Una marca preferida puede ser biotina
que se podría posteriormente detectar usando estreptavidina
conjugada a una enzima tal como peroxidasa y fosfatasa alcalina. La
presencia de un producto de polimerización extendido del cebador se
puede detectar por ejemplo llevando a cabo la reacción de
polimerización sobre un gel de azarosa y observando un fragmento de
ADN específico marcado con bromuro de etidio, o transferido por
Southern y autorradiografiado para detectar la presencia o ausencia
de bandas correspondientes a producto polimerizado. Si la banda
predominante está presente y corresponde solamente al
oligonucleótido marcado entonces esto indica que al polimerización
se ha producido. Si las bandas están presentes en el tamaño predicho
correcto, esto indicaría que la polimerización se ha producido.
Por ejemplo, el ADN aislado a partir de
linfocitos de pacientes como se describe en esta memoria descriptiva
se usa como un molde para la amplificación de PCR usando cebadores
de oligonucleótidos sintéticos que o bien coinciden o no coinciden
con las secuencias amplificadas. La viabilidad de la PCR en la
detección de tales mutaciones ya se ha demostrado. La PCR que usa
el sistema de mutación refractario a amplificación ("ARMS")
(Newton, C. R., y col., Nucleic Acids Research, 17 p2503, (1989))
Los oligonucleótidos sintéticos se producen para hibridizarse a las
regiones adyacentes a una que incluye las mutaciones específicas
tales como la 3' ENDE del oligonucleótido o bien coincide o no
coincide con una secuencia mutante o de tipo salvaje. La PCr se
lleva a cabo y da como resultado la identificación de un fragmento
de ADN (usando electroforesis de gel) conde se ha producido una
coincidencia o ningún fragmento donde se ha producido una no
coincidencia.
El ADN se extrae a partir de células T
infectadas con VIH-1 como se describe en esta
memoria descriptiva y se somete a análisis de PCR de "ARMS"
usando estos cebadores.
La presencia de un fragmento se identifica
usando un cebador de oligonucleótido como se ha descrito
anteriormente, es decir, mediante el intento de polimerización
usando un cebador de oligonucleótido que se puede marcar para el
fragmento de ADN amplificado en condiciones rigurosas que solamente
permiten la hibridación de ADN complementario (la única diferencia
es que la hibridación diferencial no tiene que realizarse como
fragmentos de ADN amplificados por el procedimiento de "ARMS"
será el mismo si se deriva de un ADN mutante o de tipo salvaje, de
este modo se puede usar un oligonucleótido común para detectar la
presencia de estos fragmentos. La secuencia de tal oligonucleótido
se deriva de una secuencia de ADN dentro de un fragmento de ADN que
se conserva entre las cepas de VIH-1).
El ensayo de PCR anterior se puede adaptar para
que permitir la detección directa de mutaciones asociadas a la
resistencia de A-D4FC en ADN de muestras de PBL de
individuos infectados que no se han cultivado para obtener virus.
Como este material generalmente contienen considerablemente menos
ADN de VIH-1 que la que hay en los cultivos
linfoides infectados un protocolo de "PCr doble" (o
jerarquizados) se puede usar (Simmonds, P., Balfe, P, Peutherer, J.
F., Ludlam, C. A., Bishop, J. O. y Leigh Brown, A. J., J. Virol.,
64, 864 - 872, (1990)) para reforzar la cantidad de señal de ADN de
la RT de VIH-1 diana en las muestras. La doble PCR
supera el problema de la amplificación limitada de una secuencia
rara de molde. Una cantidad pequeña del material
pre-amplificado se puede usar en la segunda PCR con
pares de cebadores que permiten la discriminación de residuos de
tipo salvaje y mutante.
Un kit de ensayo adecuado para uso en un
conjunto para determinar el estados de resistencia de una muestra
de VIH-1 a D-D4FC que hace uso de la
metodología precedente comprende un oligonucleótido que es
complementario a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje
(o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia mutante de
ADN como se describe en esta memoria descriptiva, otros materiales
requeridos para la polimerización del ácido nucleico a partir del
extremo 3' del oligonucleótido y medios para determinar la presencia
de un producto extendido del cebador de oligonucleótido. Dichos
otros materiales incluyen enzimas apropiadas, tampones y soluciones
de lavado, y una marca y un sustrato para la marca si es necesario.
si la PCR se usa para amplificar ácido nucleico entonces materiales
adicionales tales como cebadores de oligonucleótidos apropiados que
amplificarán una región de la secuencia de ADN de tipo
salvaje(o su ARN correspondiente) o una región de la
secuencia de ADN mutante como se describe en esta memoria
descriptiva (o su ARN correspondiente) y dNTP's se debe incluir.
Un procedimiento para determinar la sensibilidad
de una muestra de VIH-1 a D-D4FC
comprende:
- (i)
- aislar el ácido nucleico de la muestra,
- (ii)
- hibridizar el ácido nucleico con un oligonucleótido que es complementario a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia de ADN mutante expuesta en la FIG. 1 (o su ARN correspondiente) que contienen uno o más de los nucleótidos en al región del codón 70 (K a N), 90 0 172 en la región de la RT; y
- (iii)
- averiguar si cualquiera de los híbridos resultantes del oligonucleótido y ácido nucleico tiene o no nucleótidos complementarios en una de estas posiciones.
Preferiblemente el oligonucleótido se diseña de
esta manera para formar un híbrido perfectamente coincidente con su
complemento.
El ácido nucleico (ADN o ARN) se aísla a partir
de una muestra mediante los procedimientos anteriormente mencionados
como se descrito para el primer aspecto de la invención.
De manera similar, la PCR se puede usar para
amplificar el ADN de la RT (o su correspondiente ARN) o
preferiblemente para amplificar una región del ADN de la RT (o su
correspondiente ARN) que incorpora ADN (o su correspondiente ARN)
que contiene uno o más de los nucleótidos en la posición
designada.
En la segunda fase de esta metodología el ácido
nucleico después se usa para hibridizarse a oligonucleótidos
complementarios a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje
(o su correspondiente ARN) o a una región de la secuencia de ADN
mutante.
El oligonucleótido puede ser de cualquier
longitud dependiendo del número de posiciones de nucleótidos de
interés que se están examinando. si el oligonucleótido se diseña
para que incluya un nucleótido en una posición de interés solamente
entonces este nucleótido está preferiblemente en o cerca de una
posición central del oligonucleótido.
Con el fin de determinar si o no la secuencia de
oligonucleótido y ácido nucleico han formado un híbrido
coincidente, las condiciones de hibridación se establecen de manera
que un híbrido solamente se forma cuando el nucleótido o
nucleótidos en el codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la
transcriptasa inversa son complementarios con el nucleótido o
nucleótidos correspondientes del oligonucleótido que o bien permite
la hibridación o no la hibridación. Es importante establecer por
ejemplo la temperatura de reacción y la concentración de al solución
de sal antes de llevar a cabo la etapa de hibridación para encontrar
condiciones que son los suficientemente rigurosas para garantizar la
especificidad (Maniatis, T., y col., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989). Si
la sonda de oligonucleótido tiene una secuencia de ADN que es
complementaria con al secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje en
uno o más de sus nucleótidos que corresponden al codón 70 (K a N),
90 0 172 de la región de la transcriptasa inversa entonces este
oligonucleótido se hibridará perfectamente al ácido nucleico de tipo
salvaje. Si no se hibrida perfectamente a un ácido nucleico de tipo
salvaje. Si no existe hibridación entonces esto sugerirá que el
ácido nucleico aislado de la misma contiene una o más
mutaciones.
Si la sonda de oligonucleótido tiene una
secuencia de ADN que es complementaria d una secuencia de ácido
nucleico mutante entonces este oligonucleótido se hibridizara a un
ácido nucleico mutante. Si no existe hibridación esto sugeriría que
el ácido nucleico aislado a partir de la muestra contiene ninguna de
tal mutación o mutaciones. Las sondas de oligonucleótidos se pueden
marcar como un medio de detección como para el primer aspecto de la
invención.
La hibridación y posterior retirada de los
ácidos nucleicos no hibridizados se realiza en condiciones rigurosas
que solamente permiten la hibridación del ADN complementario y no el
oligonucleótido que contiene una no coincidencia 8 es decir,
hibridación específica de oligonucleótido como se describe para la
detección de la mutación de células falciformes usando el gen de la
\beta-globina o HLA-DQ\alpha
(Saikt, R. K., y col., Nature, 324, 9 163 (1986), el gen Ras
activado (Ver Laan-de, Vries, M., y col., Gene, 50,
313, (1986) y la \beta-talasemia Wong, C., y col.,
Nature, 330, p 384, (1987)).
La hibridación se puede llevar a cabo mediante
la inmovilización de la secuencia de ácido nucleico de la RT en
nitrocelulosa, nylon u otra matriz sólida (por ejemplo transferencia
de puntos). Es conveniente determinar la presencia de de un híbrido
usando los medios de una marca. Por ejemplo, las sondas de
oligonucleótidos sintetizados químicamente se pueden marcar de
manera adecuada usando enzima, radioisótopo o fluorocromo. Una marca
preferida puede ser biotina que se podría detectar posteriormente
usando estreptavidina conjugada a una enzima tal como peroxidasa o
fosfatas alcalina.
Como alternativa la hibridación se puede llevar
a cabo mediante inmovilización de los oligonucleótidos sintetizados
químicamente mencionados anteriormente, que están sin marcar, en un
soporte sólido mencionado anteriormente y la hibridación posterior
mediante una secuencia de ácido nucleico de la RT marcada como se ha
descrito previamente.
En ambas situaciones descritas anteriormente
para la hibridación se incorporará, reacciones de control adecuadas
para determinar que se ha producido la hibridación eficaz (por
ejemplo, la hibridación de oligonucleótidos a un oligonucleótido
complementario).
Los resultados se interpretarían fácilmente ya
que el ácido nucleico aislado se hibridaría a o bien el
oligonucleótido de tipo salvaje o al oligonucleótido mutante.
Un kit de ensayo adecuado para uso en un ensayo
para determinar la sensibilidad de una muestra de
VIH-1 a D-D4FC que utiliza una
metodología de acuerdo con el segundo aspecto de la invención
comprende un oligonucleótido que es complementario a una región de
la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su correspondiente ARN) a la
región pertinente de al secuencia de ADN mutante, junto con otros
materiales requeridos para permitir la hibridación. Tales materiales
incluyen los tampones apropiados y soluciones de lavado y una marca
y un sustrato para la marca si es necesario. Normalmente el
oligonucleótido estaría marcado. Si se usa la PCR para amplificar el
ácido nucleico antes de la hibridación entonces los materiales
adicionales tales como cebadores de oligonucleótidos adecuados que
amplificarán una región de al secuencia de ADN de tipo salvaje (o su
correspondiente ARN) o una región de la secuencia de ADN mutante,
enzimas apropiadas y dNTP's (trifosfato de desoxi nucleótidos) se
deben incluir.
En un formato alternativo del ensayo, los dNTP's
en la amplificación pueden o no pueden estar acoplados a una
molécula detectora tal como un radioisótopo, biotina, fluorocromo o
enzima.
También es posible detectar mutaciones
resistentes a zidovudina en el ARN de VIH-1 aislado
de muestras clínicas usando un sistema de amplificación de ARN.
Usando al metodología descrita por Guatelli y col., (Proc. Natl.
Acad. Sci, (Estados Unidos), 8/7, 1874-1878, (marzo
de 1990)) se puede replicar (amplificar) una secuencia de ácido
nucleico diana exponencialmente in vitro en condiciones
isotérmicas usando estas actividades enzimáticas esenciales para la
replicación retroviral: transcriptasa inversa, ARNasa H y una ARN
polimerasa dependiente de ADN. Tal metodología se puede emplear
seguido de una etapa de hibridación para distinguir los nucleótidos
mutantes de los de tipo salvaje como se ha descrito previamente.
Los humanos que padecen los efectos provocados
por por cualquiera de las enfermedades descritas en esta memoria
descriptiva, y en particular, virus por VIH, se pueden tratar
mediante la administración al paciente de una cantidad eficaz de
D-D4FC o una sal o fármaco farmacéuticamente
aceptable del mismo en presencia de un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de las indicaciones o
modos de administración como se ha descrito anteriormente en detalle
en esta memoria descriptiva. Los materiales activos se pueden
administrar mediante cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía
oral, parenteral, entérica, intravenosa, intradérmica, subcutánea,
transdérmica, intranasal o tópica, en forma líquida o sólida.
El (los) compuesto(s) activo(s)
incluido(s) en el vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable en cantidades suficientes para distribuir a un paciente
una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para inhibir la
replicación viral in vivo, especialmente la replicación de
VIH, sin provocar efectos tóxicos graves en el paciente tratado. Por
"cantidad inhibidora" se quiera decir una cantidad de
ingrediente activo suficiente para ejercer un efecto inhibidor como
se mide, por ejemplo, mediante un ensayo tal como los descritos en
esta memoria descriptiva.
Una dosis preferida del compuesto para todas las
afecciones anteriormente mencionadas estarán en ele intervalo entre
aproximadamente 1 y aproximadamente 75 mg/kg, preferiblemente 1 a 20
mg/kg, de peso corporal al día, más generalmente 0,1 a
aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal del receptor al día.
El intervalo de dosificación eficaz de los derivados
farmacéuticamente aceptables se pueden calcular basándose en el peso
del nucleósido precursor a distribuir. Si el derivado muestra una
actividad por sí mismo, la dosificación eficaz se puede estimar como
antes usando el peso del derivado, o mediante otros medios conocidos
por los expertos en la técnica.
Los compuestos se administran de manera
conveniente en cualquier forma adecuada de dosificación unitaria,
incluyendo, pero sin limitación, a una que contienen 7 a 3000 mg,
preferiblemente 7 a 1400 mg de ingrediente activo por forma de
dosificación unitaria. Una dosificación oral de 50 a 1000 mg es
usualmente conveniente.
De manera ideal, el ingrediente activo se debe
administrar para lograr concentraciones en plasma máximas del
compuesto activo de entre aproximadamente 0,02 y 70 micromolar,
preferiblemente aproximadamente 0,5 a 10 mM. Se puede lograr, por
ejemplo, mediante la inyección intravenosa de una solución al 0,1 a
25% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o
administrada en forma de un bolo del ingrediente activo.
La concentración de compuesto activo en la
composición de fármaco dependerá de la absorción, distribución,
metabolismo y velocidades de excreción de fármaco así como otros
factores conocidos por los expertos en la técnica. Se ha de indicar
que los valores de dosificación también variarán con la gravedad de
la afección a aliviar. Se ha de entender adicionalmente que para
cualquier sujeto particular, se deben ajustar regímenes de
dosificación específica con el tiempo de acuerdo con la necesidad
individual y el juicio profesional de la persona que administra o
supervisa la administración de las composiciones, y que los
intervalos de concentración establecidos en esta memoria descriptiva
son solamente ejemplares y no se pretende limitar el alcance o
práctica de de la composición reivindicada. El ingrediente activo se
puede administrar una vez, o se puede dividir en un número de dosis
más pequeñas a administrar a intervalos de dosis variables.
Un modo preferido de administración del
compuesto activo es oral. Las composiciones orales generalmente
incluirán un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar
contenidos en cápsulas de gelatina o en comprimidos. Para el
propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo
se puede incorporar con excipientes y usarse en la forma de
comprimidos, trociscos, o cápsulas. Los agentes de unión
farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden
incluir como parte de la composición.
Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y
similares contienen cualquier de los siguientes ingredientes, o
compuestos de naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa
microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal
como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido
algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como
estearato magnésico o Sterotex; un agente deslizante tal como
dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa
o sacarina; o un agente aromatizante tal como pipermín, salicilato
de metilo o aromatizante de naranja. Cuando la forma de dosificación
unitaria es una cápsula puede contener, además del material del tipo
anterior, un vehículo líquido tal como un ácido graso. Además, las
formas de dosificación unitaria pueden contener otras sustancias
diversas que modifican la forma física de la unidad de dosificación,
por ejemplo, revestimientos de azúcar, goma de laca u otros agentes
entéricos.
Los compuestos se pueden administrar como un
componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, goma de mascar o
similares. Un jarabe puede contener además de los compuestos
activos, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservantes,
tintes y colorantes y aromatizantes.
Los compuestos o sus sales o derivados
farmacéuticamente aceptables de los mismos también se pueden mezclar
con otros materiales activos que no alteran la acción deseada, o
con materiales que suplementan la acción deseada, tal como
antibióticos, antifúngicos, antiinflamatorios, inhibidores de
proteasa, u otros agentes antivirales nucleósidos o no nucleósidos,
como se ha descrito en detalla anteriormente. Las soluciones o
suspensiones para la aplicación parenteral, intradérmica,
subcutánea, o tópica puede incluir los siguientes componentes: un
diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina,
aceites estables, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u
otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como
alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido
ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o
fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro
sódico o dextrosa. La preparación parenteral puede estar contenida
en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos
de vidrio o plástico.
Si se administra por vía intravenosa, los
vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución
salina tamponada con fosfato (PBS).
Las suspensiones de liposomas (incluyendo
liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos
monoclonales a antígenos virales) se prefieren también como
vehículos farmacéuticamente aceptables, éstas se pueden preparar de
acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en l técnica,
por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº
4.522.811 (que se incorpora en esta memoria descriptiva en su
totalidad por referencia). Por ejemplo, las formulaciones de
liposomas se pueden preparar disolviendo un (unos) lípido(s)
apropiado(s) (tal como estearoil fosfatidil etanolamina,
estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, y
colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora,
dejando detrás una película delgada de lípido seco sobre la
superficie del recipiente. una solución acuosa del compuesto activo
o sus derivados monofosfato, sifosfato, y/o trifosfato se introducen
después en el recipiente. el recipiente se agita después a mano para
dejar libre el material lipídico en los laterales del recipiente y
dispersar los agregados lipídicos, formando por lo tanto la
suspensión de liposomas.
Todas las patentes de Estados Unidos citadas en
esta sección en formulaciones de liberación controlada se
incorporan por referencia en su totalidad.
El campo de los polímeros biodegradables se ha
desarrollado rápidamente ya que la síntesis y biodegradabilidad de
poli (ácido láctico) se reseñó por Kulkami y col., en 1996
("Polilactic acid for surgical implants", Arch. Surg., 93:
839). Los ejemplos de otros polímeros que se han reseñado como
útiles como un material de matriz para los dispositivos de
distribución incluyen plianhídridos, poliésteres tales como
poliglicolidas y
polilactida-co-pglicolidas, poli
(aminoácidos) tal como polilisina, polímeros y copolímeros de óxido
de polietileno, óxido de polietileno terminado en acrílico,
poliamidas, poliuretanos, poliortoésetres, poliacrilonitrilos, y
polifosfacenos. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos
números 4.891.225 y 4.906.474 de Langer (polianhídridos), 4.767.628
de Hutchinson (ácido
polilactida-co-glicolida) y
4.530.840 de Tice y col., (polilactida, poliglicolida, y
copolímeros). Veáse también la patente de Estados Unidos nº
5.626.863 de Hubbell y col., que describe los hidrogeles
biodegradables fotopolimerizables como tejido que se pone en
contacto con materiales y vehículos de liberación controlada
(hidrogeles de macrómeros polimerizados y reticulados que comprende
oligómeros hidrófilos que tienen extensiones monoméricas u
oligoméricas biodegradables, que son monómeros con capucha en el
extremo u oligómeros capaces de polimerización y reticulación); y el
documentó PCT WO 97/05185 presentado por Focal, Inc. se refiere a
hidrogeles de bloques múltiples para uso como agentes de liberación
controlada para la distribución de fármacos y agentes de tratamiento
de tejidos.
Los materiales degradables de origen biológico
son bien conocidos, por ejemplo, gelatina reticulada. El ácido
hialurónico se ha reticulado y usado como un polímero hinchable
degradable para aplicaciones biomédicas (patente de Estados unidos
Nº 4.957.744 de Della Valle y col.,(1991). "Surface modification
of polymeric biomaterials for reduced thrombogenicity", Polym.
Mater. Sci. Eng., 62: 731-735).
Muchos sistemas de dispersión están actualmente
en uso, o se están explorando para uso como, vehículos o sustancias,
particularmente compuestos biológicamente activos. Los sistemas de
dispersión usados para formulaciones farmacéuticas y cosméticas se
pueden clasificar en categorías como o bien suspensiones o
emulsiones. Las suspensiones se definen como partículas sólidas que
varían en tamaño desde unos pocos nanómetros hasta cientos de
micrones, dispersados en un medio líquido usando agentes de
suspensión. Las partículas sólidas incluyen microesferas,
microcápsulas, y nanoesferas. Las emulsiones se definen como
dispersiones de un líquido en otro, estabilizados mediante una
película interfacial o emulsionantes tales como tensioactivos y
lípidos. Las formulaciones de emulsiones incluyen emulsiones de agua
en aceite, y aceite en agua, emulsiones múltiples, microemulsiones,
microgotitas, y liposomas. Las microgotitas son vesículas de de
fosfolípidos unilamelares que constan de una capa lipídica esférica
con una fase oleosa en su interior, como se define en las patentes
de Estados Unidos números 4.622.219 y 4.725.442 emitida por Haynes.
Los liposomas son vesículas de fosfolípidos preparadas mezclando
lípidos insolubles en agua con una solución acuosa. la entropía
desfavorable provocada por la mezcla del lípido insoluble en el agua
produce un conjunto altamente ordenado de membranas cerradas
concéntricas de fosfolípido con solución acuosa atrapada.
La patente de Estados unidos Nº 4.938.763 de
Dunn y col., describe un procedimiento para formar un implante
in situ, disolviendo un polímero termoplástico insoluble en
agua en un disolvente soluble en agua biocompatible para formar un
líquido, colocando el líquido dentro del cuerpo, y permitiendo que
el disolvente se disipe para producir un implante sólido. La
solución de polímeros se puede colocar en el cuerpo mediante una
jeringa. El implante puede asumir la forma de la cavidad que le
rodea. En una realización alternativa, el implante se forma a partir
de polímeros oligoméricos líquidos, reactivos que no contienen
disolvente y que se curan en el lugar para formar sólidos,
usualmente con la adición de un catalizador de curado.
Numerosas patentes describen sistemas de
distribución de fármacos que se pueden usar para administrar
D-D4FC o un nucleótido u otro profármaco definido
del mismo. La patente de Estados Unidos Nº 5.749.847 describe un
procedimiento para la distribución de oligonucleótidos en organismos
mediante electroporación. La patente de Estados Unidos nº 5.718.921
describe microesferas que comprenden polímero y fármaco dispersados
dentro. La patente de Estados Unidos nº 5.629.009 describe un
sistema de distribución para la liberación controlada de factores
bioactivos. La patente de Estados Unidos nº 5.578.325 describe
nanopartículas y micropartículas de copolímeros de bloques
múltiples hidrófilos hidrófobos. La patente de Estados Unidos nº
5.545.409 describe un sistema de distribución para la liberación
controlada de factores bioactivos. La patente de Estados Unidos nº
5.494.682 describe microcápsulas poliméricas iónicamente
reticuladas.
La patente de Estados Unidos nº 5.782.402 de
Andrx Pharmaceuticals, Inc. describe una formulación de liberación
controlada que incluye una fase interna que comprende el fármaco
activo, su sal o profármaco, en mezcla con un hidrogel que forma
agente, y una fase interna que comprende un revestimiento que
resiste la disolución en el estómago. Las patentes de Estados Unidos
números 5.736.159 y 5.558.879 de Andrx Pharmaceuticals, Inc,
describe una formulación de liberación controlada para fármacos con
poca solubilidad en agua en el que se forma un pasillo in
situ. La patente de Estados Unidos nº 5.567.441 de Andrx
Pharmaceuticals, Inc. describe una formulación de liberación
controlada una vez al día. La patente de Estados Unidos nº 5.508.040
describe un sistema de distribución de fármaco por pulsos de
multipartículas. La patente de Estados Unidos nº 5.472.708 describe
un sistema de distribución de fármaco basado en partículas por
pulsos. La patente de Estados Unidos nº 5.458.888 describe una
formulación de comprimidos de liberación controlada que se puede
preparar haciendo uso de una mezcla que tiene una fase que contiene
fármaco interno y una fase externa que comprende un polímero de
polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de peso de entre
3.000 y 10.000. La patente de Estados Unidos nº 5.419.917 describe
procedimientos para la modificación de de la velocidad de liberación
de una forma de fármaco un hidrogel que se basa en el uso de una
cantidad eficaz de un compuesto ionizable farmacéuticamente
aceptable que es capaz de proporcionar una velocidad de liberación
de orden cero sustancialmente de fármaco a partir del hidrogel. La
patente de Estados Unidos nº 5.458.888 describe una formulación de
comprimidos de liberación controlada.
La patente de Estados Unidos nº 5.641.745 de
Elan Corporation, plc describe una formulación farmacéutica de
liberación controlada que comprende el fármaco activo en un polímero
biodegradable para formar microesferas o nanoesferas. El polímero
biodegradable es adecuadamente
poli-D,L-lactida o una mezcla de
poli-D,L-lactida y
poli-D,L-lactida-co-glicolida.
La patente de Estados Unidos nº 5.616.345 de Elan Corporation, plc
describe una formulación de absorción controlada para la
administración una vez al día que incluye el compuesto activo en
asociación con un ácido orgánico, y una membrana de capas múltiples
que rodea el núcleo y contiene una proporción principal de un
polímero sintético insoluble en agua, que forma película
farmacéuticamente aceptable y una proporción secundaria de un
polímero sintético insoluble en agua, que forma película
farmacéuticamente aceptable. La patente de Estados Unidos nº
5.641.515 describe una formulación de liberación controlada basada
en nanopartículas biodegradables. La patente de Estados Unidos nº
5.637.320 describe una formulación de absorción controlada para la
administración una vez al día. La patente de Estados Unidos números
5.580.580 y 5.540.938 se refieren a formulaciones y su uso en el
tratamiento de enfermedades neurológicas. La patente de Estados
Unidos nº 5.533.995 se refiere a un dispositivo transdérmico pasivo
con distribución de fármaco controlada. La patente de Estados Unidos
nº 5.505.962 describe una formulación farmacéutica de liberación
controlada.
D-D4FC o cualquiera de los
nucleósidos u otros compuestos que se describen en esta memoria
descriptiva para uso en terapia de combinación o alternancia con
D-D4FC o sus compuestos relacionados se pueden
administrar como un profármaco acilado o un profármaco de
nucleótido como se describe en detalle más adelante.
Cualesquiera de los nucleósidos descritos en
esta memoria descriptiva u otros compuestos de contienen una
función hidroxilo o amina se pueden administrar como u profármaco de
nucleótido para incrementar la actividad, disponibilidad biológica,
estabilidad o de otra manera alterar las propiedades del nucleósido.
Se conocen numerosos profármacos de nucleósidos. en general, la
alquilación, acilación u otra modificación lipófila del grupo
hidroxilo del compuesto o el mono, di o trifosfato del nucleósido
incrementará la estabilidad del nucleótido. Los ejemplos de grupos
sustituyentes que pueden reemplazar uno o más hidrógenos en el resto
fosfato o hidroxilo son alquilo, arilo, esteroides, carbohidratos,
incluyendo azúcares, 1,2-diacilglicerol y
alcoholes. Muchos se describen en R. Jones y N. Bischofberger,
Antiviral Research, 27 (1995) 1-17. Cualquiera de
éstos se puede usar en combinación con los nucleósidos descritos u
otros compuestos para lograr el efecto deseado.
El nucleósido activo u otro compuesto que
contiene hidroxilo también se puede proporcionar en forma de un
éter lípido (y particularmente como el 5' -éter lípido para un
nucleósido), como se describe en las siguientes referencias, que se
incorporan por referencia en esta memoria descriptiva:
Kucera, L.S., N. Iyer, E.
Leake, A. Raben, Modest E.K., D.L. W., and C.
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activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other
antiviral nucleosides". J. Biol. Chem. 265:61127.
Los ejemplos no limitantes de las patentes de
Estados Unidos que describen sustituyentes lipófilos adecuados se
pueden incorporar de manera covalente en el nucleósido u otro
compuesto que contiene hidroxilo o amina, preferiblemente en al
posición 5'-Oh de las preparaciones de nucleósidos o
lipófilas, incluyen las patentes de Estados Unidos números
5.149.794 (22 de septiembre de 1992, Yatvin y col.); 5.194.654 (16
de marzo de 1993, Hostetler y col., 5.223.263 (29 de junio de 1993),
Hostetler y col.) 5.256.641 (26 de octubre de 1993, Yatvin y col.);
5.411.947 (2 de mayo de 1995, Hostetler y col); 5.463.092 (31 de
octubre de 1995, Hostetler y col.); 5.543.389 (6 de agosto de 1996,
Yatvin y col.); 5.543.390 (6 de agosto de 1996, Yatvin y col.);
5.543.391 (6 de agosto de 1996, Yatvin y col.); y 5.554.728 (10 de
septiembre de 1996; Basava y col.) todas las cuales se incorporan en
esta memoria descriptiva por referencia. Las solicitudes de patente
anteriores que describen sustituyentes lipófilos que se pueden unir
a los nucleósidos de la presente invención, o preparaciones
lipófilas, incluyen los documentos WO 89/02733, WO 90/00555, WO
91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0
350 287, EP 93917054.4, y WO 91/19721.
Los ejemplos no limitantes de profármacos de
nucleósidos se describen en las siguientes referencias:
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Ueda, T. (1988) Pharm. Bull. 36,
209-217. An example of a useful phosphate prodrug
group is the
S-acyl-2-thioethyl
group, also referred to as "SATE".
Esta invención se describe con referencia a sus
realizaciones preferidas. Las variaciones y modificaciones de la
invención, serán obvias para los expertos en la técnica a partir de
la anterior descripción detallada de la invención. Se pretende que
todas estas variaciones y modificaciones estén incluidas dentro del
ámbito de esta invención.
Claims (9)
1. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad eficaz de
\beta-D-D4FC o su sal o profármaco
farmacéuticamente aceptable opcionalmente en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir
opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como una
preparación combinada para uso para el tratamiento o profilaxis de
una infección por VIH en un ser humano.
2. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que los compuestos eficaces se administran
en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable
es adecuado para la administración oral, administración intravenosa,
administración parenteral, administración intradérmica,
administración subcutánea o administración tópica.
4. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que los compuestos están en la forma de una
unidad de dosificación.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que la unidad de dosificación contiene de 10
a 1500 mg de cada compuesto.
6. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 4, en la que la unidad de dosificación es un
comprimido o cápsula.
7. Uso de una cantidad eficaz de una composición
de acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por
VIH en un ser humano.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que los compuestos activos se administran en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en
el vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para la
administración oral, administración intravenosa, administración
parenteral, administración intradérmica, administración subcutánea o
administración tópica.
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