ES2263449T3 - Beta-d-2',3'-didehidro-2',3'-dideoxi-5-fluorocitidina para uso en el tratamiento de infecciones vih. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de â- D-D4FC o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como una preparación combinada para uso para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un ser humano.

Description

\beta-D-2',3'-didehidro-2',3'-dideoxi-5-fluorocitidina para uso en el tratamiento de infecciones VIH.

Campo de la invención

Esta invención está subvencionada parcialmente por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos bajo la subvención Nº 1R01- A1-41980-01. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de patente de Estados Unidos Nº 60/116.773, presentada en 22 de enero de 1999.

Antecedentes de la invención

En 1983, la causa etiológica del SIDA se determinó que era el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En 1985, se reseñó que el nucleósido sintético 3'-azido-3'-desoximitidina (AZT) inhibe la réplica del virus de inmunodeficiencia humana. Desde entonces, un número de otros nucleósidos sintéticos, incluyendo 2',3'-didesoxi (DDI), 2',3'-didesoxicitidina (DDC), 2',3'-2',3'-dideshidrotimidina (D4T), cis-2-hidroximetil-5-%-fluorocitosin-1-il)-1,3-oxatiolano (FTC), (-)-cis-2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano (3TC), se han probado que son eficaces contra el VIH. Después de al fosforilación celular del 5'-trifosfato por las quinasas celulares estos nucleósidos sintéticos se incorporan en una hebra de crecimiento del ADN viral, provocando la terminación de la cadena debido a la ausencia del grupo 3'-hidroxi. Por lo tanto también pueden inhibir la enzima viral transcriptasa inversa.

Se ha reconocido que las variantes resistentes a fármacos del VIH pueden emerger después de un tratamiento prolongado con un agente antiviral. La resistencia a fármacos en la mayoría de los casos ocurre típicamente mediante mutación de un gen que codifica una enzima usada en la replicación viral, y en la mayoría de los casos típicamente en el caso de VIH, transcriptasa inversa, proteasa, o ADN polimerasa. Recientemente, se ha demostrado que la eficacia de un fármaco contra la infección por VIH se puede prolongar, aumentar, o reestablecer administrando el compuesto en combinación o alternancia con un segundo compuesto, y quizás antiviral tercero compuesto antiviral que induce una mutación diferente de la causada por el fármaco principal. Como alternativa, la farmacocinética, distribución biológica, u otro parámetro del fármaco se puede alterar mediante tal combinación o terapia de alternancia. En general, la terapia de combinación se prefiere típicamente sobre la terapia de alternancia debido a que induce múltiples presiones simultáneas en el virus. Sin embargo, no se puede predecir, que las mutaciones inducirán en el genoma del VIH-1 por un fármaco dado, si la mutación es permanente o transitoria, o cómo una célula infectada con una secuencia de VIH-1 mutada responderá a la terapia con otros agentes en combinación o alternancia. Esto se agrava por el hecho que de existe una penuria de datos en al cinética de la resistencia a fármacos en los cultivos celulares a largo plazo tratados con modernos agentes antirretrovirales.

Las variantes de VIH-1 resistentes a 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2'-3'-didesoxicitidina (DDC) se han aislado de pacientes que reciben monoterapia a largo plazo con estos fármacos (Larder BA, Darby G, Richman DD. Science 1989; 243: 1731-4; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, y col Science 1991, 253: 1557-9, St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, y col., Science 1991, 253: 1557-9, y Fitzgibbon JE, Howell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin DT. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 153 - 7). La evidencia clínica creciente indica que la resistencia de AZT es un vaticinador del pobre resultado clínico tanto en niños como en adultos (Mayers DL, Conferencia en la 32ª Conference Interscience sobre Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia (Anaheim, CA, 1992); Tudor - Willians G, St Clair MH, McKinney RE, y col Lancet 1992; 339: 15-9; Ogino MT, Dankner WM, Spector SA, J. Pediatr 1993; 123:
1 - B; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VA, y col. Tercer taller sobre resistencia viral (Gaithersburg, MD. 1993); y Mayers D, y el grupo de estudio de RV43. Tercer taller sobre resistencia viral (Gaithersburg, MD. 1993)). El rápido desarrollo de resistencia a VIH-1 a los inhibidores de la transcriptasa inversa de no nucleósidos (NNRTIs) también se ha reseñado tanto en cultivo de células como en ensayos clínicos humanos (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ y col., J. Virol 1991; 65 (9): 4887-92; Richman D, Shih CK, Lowy I, y col., Proc Natl Acad Sci (Estados Unidos) 1991: 88: 11241-5; Mellors JW, Dutschman GE, Im GJ, Tramontao E, Winkler SR, Cheng YC. Mol Pharm 1992; 41: 446 - 51;
Richman DD y el equipo de estudio ACTG 164/168. Segundo taller internacional de resistencia de fármacos al VIH-1 (Noordwijk, Holanda 1993), y Saag MS, Emini EA, Laskin OL, y col., N. Engl J Med 1993; 329: 1065-1072). En el caso de NNRTI L'697.661, el VIH-1 resistente a fármacos surgió dentro de las 2 - 6 semanas de iniciar la terapia en asociación con el regreso de viremia a niveles de pretratamiento (Saag MS, Emini EA, Laskin OL, y col., N. Engl J Med 1993; 329: 1065 - 1072). También se ha indicado un descubrimiento importante en la viremia asociada con la aparición de las cepas resistentes a fármacos con otras clases de inhibidores de VIH-1, que incluyen inhibidores de la proteasa (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil K, Mous J. Tercer taller sobre resistencia viral
(Gaithersburg, ND, 1993)). Esta experiencia ha conducido a la realización de que el potencial para la resistencia a fármacos de VIL-1 se debe determinar temprano en la evaluación preclínica de todas las terapias nuevas para

\hbox{el VIH-1.}

2',3'-Didesoxi-2',3'-dideshidro-5-fluorocitidina (D4FC) es un compuesto conocido. La Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 0 409 227 A2 presentada por Ajinomoto Co., Inc., describe \beta-D-D4FC (ejemplo 2) y su uso para tratar la hepatitis B. La patente holandesa Nº 8901258 presentada por Stichting Rega V. Z. W. describe generalmente derivados de 5-halógeno-2',3'-didesoxi-2',3'-didesoxicitidina para uso en el tratamiento de VIH y hepatitis B ("VBH"). La patente de Estados Unidos nº 5.703.058 describe un procedimiento para el tratamiento de infección por VIH y VBH que incluye la administración de una cantidad eficaz de \beta-D-D4FC en combinación o alternancia con cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosn-1-il)-1,3-oxatiolano, cis-2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano, 9-[4-(hidroximetil)-2-ciclopenten-1-il)-guanina (carbovir), 9-[(2-hidroxietoxi9metil]guanina (aciclovir), interferón 3'-desoxi-3'-azidotimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (DDI), 2',3'-didesoxicitidina (DDC), (-)-2'-fluoro-5-metil-\beta-L-ara-uridina (L-FMAU) o 2',3'- 2',3'-dideshidrotimidina (D4T). La patente de Estados Unidos Nº 5.905.070 describe un procedimiento para el tratamiento de infección por VIH y VBH que incluye la administración de una cantidad eficaz de \beta-D-D4FC en combinación o alternancia con cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosn-1-il)-1,3-oxatiolano, cis-2-hidroximetil-5-(citosin-1-il)-1,3-oxatiolano, 9-[4-(hidroximetil)-2-ciclopenten-1-il)-guanina (carbovir), 9-[(2-hidroxietoxi9metil]guanina (aciclovir), interferón 3'-desoxi-3'-azidotimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (DDI), 2',3'-didesoxicitidina (DDC), (-)-2'-fluoro-5-metil-\beta-L-ara-uridina (L-FMAU) o 2',3'- 2',3'-dideshidrotimidina (D4T) para el tratamiento de VIH.

Es un objeto de la presente invención determinar la administración óptima de \beta-D-D4FC para el tratamiento de VIH.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento y composición que incluye \beta-D-D4FC para el tratamiento de pacientes infectados con VIH que muestra farmacocinética, distribución biológica, metabolismo, resistencia u otros parámetros ventajosos o mejorados sobre la administración de \beta-D-D4FC solo.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de pacientes infectados con VIH en los que \beta-D-D4FC se administra en combinación o alternancia con un segundo compuesto que actúa de manera sinérgica con \beta-D-D4FC contra el virus.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de pacientes infectados con VIH en los que \beta-D-D4FC se administra en combinación o alternancia con un segundo compuesto que actúa de manera sinérgica con \beta-D-D4FC contra el virus.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento y composición para el tratamiento de pacientes infectados con una forma resistente a fármacos de VIH.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para evaluar cómo administrar mejor \beta-D-D4FC.

Sumario de la invención

Se ha descubierto que \beta-D-D4FC induce mutaciones en VIH-1 en los codones 70 (K a N), 90 y 172 de la región de la transcriptasa inversa del virus. Basándose en este descubrimiento, se proporciona un procedimiento para tratar VIH que incluye la administración de \beta-D-D4FC o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable a un ser humano en necesidad de terapia en combinación o alternancia con un fármaco que induce una mutación en el VIH-1 en una localización distinta de la de los codones 70 (K a N), 90 o 172 de la región de la transcriptasa inversa. Esta invención se puede practicar con relación a los patrones de mutación publicados para fármacos anti-VIH conocidos, o determinando el patrón de mutación para un nuevo fármaco.

En particular, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de \beta-D-D4FC o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como una preparación combinada para uso para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un ser humano.

La presente invención además proporciona un uso de una cantidad eficaz de \beta-D-D4FC o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un ser humano.

La combinación descrita, alternancia, o regímenes de salvamento son útiles en la prevención y tratamiento de infecciones por VIH y otras afecciones relacionadas tales como completo relacionado con SIDA (ARC), linfoadenopatía generalizada persistente (PGL), afecciones neurológicas relacionadas con SIDA, afecciones positivas de anticuerpo anti-VIH y positivas de VIH, sarcoma de Karposi, tromocitopenia purpúrea e infecciones aprovechadas. Además, estos compuestos o formulaciones se pueden usar de manera profiláctica para prevenir o retardar la progresión de una enfermedad clínica en individuos que son positivos en anticuerpos anti-VIH o antígenos VIH o que se han expuestos a VIH.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un dibujo de \beta-D-D4FC.

La figura 2 es un gráfico de la concentración de \beta-D-D4FC en micromolar frente el porcentaje de inhibición de la producción de antígeno p24. La figura ilustra la selección de virus con sensibilidad reducida a \beta-D-D4FC.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "virus resistente" se refiere a un virus que muestra un incremento de tres, y más típicamente cinco o más veces en CE_{50} comparado con el virus simple en una línea celular constante, incluyendo, pero sin limitación a células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), o células MT2 o MT4.

El término D-D4FC se usa de manera indistintamente con el término \beta-D-D4FC más adelante.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "sustancialmente puro" o "sustancialmente en la forma de un isómero óptico" se refiere a una composición de nucleósidos que incluye al menos el 95% al 98%, o más, preferiblemente el 99%, de un enantiómero individual de ese nucleósido. En una realización preferente \beta-D-D4FC se administra en forma sustancialmente pura de las indicaciones descritas.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "profármaco" se refiere a los derivados 5' y N^{4} acilado, alquilado, o fosforilado (incluyendo los ésteres mono, si, y trifosfato así como fosfatos estabilizados y fosfolípidos) de D-D4FC. En una realización, el grupo acilo es un éster de ácido carboxílico en el que el resto no carbonilo del grupo éster se selecciona entre alquilo lineal, ramificado, o cíclico, alcoxialquilo incluyendo metoximetilo, aralquilo incluyendo bencilo, ariloxialquilo incluyendo fenoximetilo, arilo incluyendo fenilo opcionalmente sustituido por halógeno, alquilo, o alcoxi, ésteres sulfonatos tales como alquil o aralquil sulfonilo incluyendo metanosulfonilo, tritilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, trialquilsililo, o difenilmetilsililo. Los grupos arilo en los ésteres comprenden de manera
óptima un grupo fenilo. El grupo alquilo puede ser lineal, ramificado o cíclico y es preferiblemente C_{1} a C_{18}.

Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables que, tras la administración al receptor, son capaces de proporcionar directa o indirectamente, \beta-D-D4FC, o que muestran actividad ellos mismos.

Las abreviaturas de aminoácidos usadas en esta memoria descriptiva se describen en la tabla 1.

TABLA 1

1

II. Mutaciones en la transcriptasa inversa de VIH-1 seleccionadas mediante \beta-D-D4FC

Tanto los enantiómeros D- y L- de, \beta-2',3'-dideshidro-2',3'-didesoxi-5-fluorocitidina (D4FC) son inhibidores selectivos de VIH-1, aunque el enantiómero D es más selectivo. El desarrollo in vitro de resistencia a D-D4FC se evalúan mediante subcultivo en serie de VIH-I_{LAI} en células MT-2 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en presencia de concentraciones crecientes de fármaco. Las variantes resistentes a D-D4FC surgidos solamente después de la exposición prolongada al fármaco. Los virus obtenidos después de 20 subcultivos en células MT-2 mostraron resistencia de 5,3 veces resistencia a D-D4FC. El virus resistente no se podría aislar en PBMC a pesar de múltiples intentos. La secuenciación del ADN de la TR a partir de virus seleccionados en células MT-2 reveló dos mutaciones: K65R y V179D. La selección del virus resistente a D-D4FC se repitió en las células MT-2 y las variantes que muestran una resistencia de 19,3 veces codificaban tres mutaciones de la RT novedosas: K70N, V90I y R172K. Un virus de VIH-I_{LAI} recombinante K65R mostró una resistencia de 3,9 veces a D-D4FC. La V179D, una mutación que confiere resistencia a inhibidores de la RT no nucleósido, es los más probable compensatoria para K65R. el papel de otras mutaciones en la resistencia a D-D4FC también se evaluó mediante la construcción de virus recombinante con mutaciones individuales y múltiples, sin embargo, ninguno de los recombinantes ensayados demostró una resistencia > 2 veces.

Materiales y Procedimientos

Compuestos químicos. D-D4FC se sintetizó en uno de nuestros 4 laboratorios como se ha descrito previamente (Shi y col., 1999). Se preparó en forma de soluciones madre 10 mM en agua estéril y se almacenó a -20ºC. El compuesto se descongeló y e diluyó hasta la concentración seseada inmediatamente antes de uso.

Células. Se cultivaron células MT-2 /Programa de reactivo de referencia y de investigación del SIDA, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas, Institutos Nacionales de salud, aportado por D. Richman) en RPMI 1640 (Whittaker M. A., Bioproducts, Walkersville, MD) suplementado con suero fetal bovino al 10%, tampón HEPES 10 mM, penicilina (50 IU/ml) y estreptomicina (50 \mug/ml).

Virus. VIH-1_{LAI}, un aislamiento clínico clonado molecularmente, se usó tanto como el virus de partida para la selección de resistencia así como para la generación de mutantes recombinantes. Las preparaciones de las soluciones madre de VIH-1_{LAI}, se prepararon mediante electroporación 5-10 jig de ADN de plásmido proviral en 1,3 x 10^{7} células MT-2. A efecto citopático viral máximo (generalmente 7 días después de la infección), se recogió el sobrenadante de los cultivos infectados, se tomaron alícuotas y se almacenaron a -80ºC hasta uso. Las preparaciones de los virus de valoraron mediante dilución de punto final tres veces en células MT-2, y se calculó el valor de TCID_{50} con la ecuación de Reed y Muench.

Selección de virus resistentes. Antes de comenzar la selección de virus resistentes a D-D4FC, el virus de partida (VIH-1_{LAI}) se se subcultivó como virus libre de células durante 10 ciclos en células MT-2 en ausencia de fármaco. Los virus resistentes a D-DAFC se seleccionó mediante subcultivo en serie de VIH-1_{LAI} en células MT-2 en presencia de concentraciones crecientes gradualmente de D-D4FC. La selección de virus resistentes a D-D4FC se llevó a cabo dos veces. la selección se inició inoculando 1 x 10^{6} células MT-2 con 0,01 moles de virus. Al máximo de efecto citopático (4-7 días después de la infección), el sobrenadante de los cultivos infectados se recogió y se usaron posteriormente 0,1-0,3 ml posteriormente para inicial otro ciclo de infección. También del sobrenadante se recogieron alícuotas y se almacenaron a -80ºC para caracterización de los virus seleccionados. El virus se subcultivó al menos tres veces a cada concentración, el número de ciclos a cualquier concentración dada de fármaco que era dependiente de la capacidad del virus de crecer a una concentración particular de D-D4FC. Durante el primer procedimiento d selección, el virus se subcultivó una vez en ausencia de fármaco antes de incrementar la concentración de fármaco (Tabla 2). Como control, el virus también se subcultivó en paralelo en la ausencia de fármaco. La primera selección se inició a 0,75 \muM y se incrementó de manera gradual hasta 4,0 \muM durante el curso de 37 ciclos del subcultivo libre de células. La segunda selección se inició a 0,2 \muM y se incrementó de manera gradual hasta 6,2 \muM durante el curso de 27 ciclos de subcultivo libre de células (Tabla 2).

TABLA 2

Selección Nº 1	Selección Nº 2
Número de subcultivos	[D-Fd4C] \muM	Número de subcultivos	[D-Fd4c] \muM
1-2	0,75	1-3	0,2
3-4	1,5	4-6	0,4
5	1,0	7-9	0,8
6	0	10-12	1,6

TABLA 2 (continuación)

Selección Nº 1	Selección Nº 2
Número de subcultivos	[D-Fd4C] \muM	Número de subcultivos	[D-Fd4c] \muM
7-9	1,5	13	3,2
10-12	2,0	14-16	1,6
13-16	3,0	17-19	3,2
7	0	20-22	4,8
18-20	4,5	23-25	6,2
21	0	26	12,0
22-35	4,5	27	6,2
36-38	1,0
38-41	2,0
42-43	4,0

Ensayos de susceptibilidad antiviral. La susceptibilidad del virus a D- D4FC se midió midiendo el porcentaje de inhibición de la producción de antígeno p24. En resumen, células MT-2 (1 x 10^{5} células/ml) se infectaron con virus a una multiplicidad de infección de 0,01 en presencia de diluciones en serie de D-D4FC. Cada dilución se ensayó por triplicado. Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron el día 7 después de la infección y se ensayaron para evaluar la producción del antígeno p24 usando un ensayo comercial (DuPont, NEN Products, Wilmington, Del). La susceptibilidad del virus se expresó como la concentración de fármaco requerida para inhibir la producción del antígeno p24 en un 50% (CE_{50}).

Secuenciación de ADN de transcriptasa inversa de virus seleccionado. El ARN viral (ARNv) del virus seleccionado se aisló usando reactivo TRIzol (GibcoBRL, Grand Island, NY). La región codificadora de la RT de longitud completa se amplificó mediante RT-PCR. El producto de PCR se purificó posteriormente usando preparaciones de PCR de Wizard (Promega, Madison, WI) y se secuenció.

Producción de VIH-1 recombinante mutante. La RT mutante se generó usando el sistema de mutagénesis in vitro SitesII alterado (Promega, Madison, WI). La mutagénesis se llevó a cabo en VIH-1_{LAI}, RT se clonó en un vector mutagénico (PALTER, Promega). La presencia de la mutación deseada se determinó mediante secuenciación directa del gen de la RT. La RT mutante se ligó posteriormente en el vector pxxVIH-1. Las soluciones madre de virus mutantes se prepararon después mediante electroporación de 5 - 10 \mu de ADN en 1,3 x 10^{7} de células MT-2 como se ha descrito anteriormente.

Resultados y descripción

Determinación del fenotipo de virus resistente. El virus resistente a D-D4FC se seleccionó después de 37 (selección nº 1) y 20 (selección nº 2) ciclos de infección en células MT-2. La evaluación de la susceptibilidad de D-D4FC del virus del subcultivo 37 de la selección nº 1 (p37 D-D4FC nº 1) demostró que p37 D-D4FC nº 1 es 19,4 veces menos sensible a D-D4FC que el tipo salvaje como se demuestra por un incremento en la CE_{50} desde 0,21 \muM a 4,07 \muM (figura 2, tabla 3). La evaluación de la susceptibilidad a D-D4FC del virus del subcultivo 20 de la selección nº 2 (p20 D-D4FC nº 2) demostró que p20 D-D4FC nº 2 es 5,3 veces menos sensible a D-D4FC que el tipo salvaje como se demuestra por un incremento en la CE_{50} desde 0,21 \muM a 1,1 \muM (figura 2, tabla 3).

Determinación del genotipo de virus resistente. ARNv de p37 D-D4FC nº 1 y p20 D- D4FC nº 2 se aisló y se sometió a amplificación por RT-PCR. La secuenciación del producto de la PCR reveló la presencia de tres mutaciones novedosas en p37 D-D4FC nº 1: K70N (AAA \rightarrow 4AAT), V901 (GTT \rightarrow ATT) y R172K (AGA \rightarrow AAA) (Tabla 2). Se identificaron dos mutaciones diferentes en p20 D-D4FC nº 2: K65R (AAA \rightarrow AGA) y V179D (GTT \rightarrow GAT (tabla 3). No se encontraron otras mutaciones en los genes de la RT de estos virus (a partir de los aminoácidos B-3309. Adicionalmente. no se encontraron mutaciones en los virus de control subcultivados en paralelo en la ausencia del fármaco.

El asilamiento de virus resistentes a D-D4FC con diferentes mutaciones asociadas podría ser el resultado de las técnicas de selección diferentes usados para< aislar virus resistente a D-D4FC. En la selección nº 1, la presión selectiva se retiró durante un ciclo de infección antes de incrementar la concentración del fármaco. esto no se hizo durante el segundo procedimiento de selección. De manera adicional, la concentración de partida se D-D4FC usada para cada uno de los procedimientos de selección variaba aproximadamente 3 veces. Se usó una concentración mucho más alta del fármaco para la selección nº 1 (0,75 \muM). Estas dos diferencias son probablemente la acusa de las diferentes mutaciones en los virus seleccionados.

VIH-1 recombinante mutante. Las mutaciones que contenían el VIH-1 recombinante mutante identificadas en los virus seleccionados se generaron mediante mutaciones dirigidas al lugar. La tabla 4 enumera cada uno de los virus recombinantes mutantes generados a sí como la CE_{50} correspondiente. Aunque el virus xxVIH-1_{LAI}, K65R demostró una disminución de 3,9 veces en la susceptibilidad a D-D4FC, ninguno de los otros virus mostró una resistencia de > de 3,3 veces. Se debe apreciar, sin embargo, que el triple mutante (xxVIH-1_{LAI}, K70N/V90/R172K) no crecían bien, y esto podría ser la causa de la incapacidad de reproducir la resistencia observada en el virus seleccionado in vitro.

TABLA 3 Susceptibilidad y Mutaciones asociadas de virus seleccionados de D-D4FC en células MT-2

Virus	CE_{50} (\muM)	Veces de resistencia	Mutaciones desde el
			estado inicial
VIH-1L_{AIP}0	0,21	- -	- -
VIH-1p37	4,07	19,4	K70N
D-Fd4Cnº1			V90I
			R172K
VIH-1p20	1,11	5,3	K65R
D-Fd4Cnº2			V179D

TABLA 4 Susceptibilidad a D-D4FC de VIH-1 recombinante en células MT-2

Virus	CE_{50}	Veces de resistencia
xxLAI	0,32	- -
xxK65R	1,24	3,9
xxLAI	0,17	- -
xxK70N	0,24	1,4
xxV90I	0,25	1,5
xxLAI	0,28	- -
xxR172K	0,23	0,8
xxV901/R172K	0,36	1,3
xxLAI	0,13	- -
xxK70N/V901/R172K	0,056	0,4

La tabla 5 proporciona los valores de concentración media eficaz e índices de combinaciones (I. C.) para D-D4FC solo y en combinación con AZT y D4T en células de PBM humanas extremadamente infectadas

2

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr
\cr}

3

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III. Combinación de agentes de VIH de alternancia

En general, durante la terapia de alternancia, una dosificación eficaz de cada agente se administró en serie, mientras que en la terapia de combinación, una dosis eficaz de dos o más agentes se administran juntos. En la terapia de alternancia, por ejemplo, se pueden administrar uno o más primeros agentes en una cantidad eficaz durante un período de tiempo eficaz para tratar la infección viral, y después uno o más segundos agentes sustituidos por los primeros agentes
en la rutina de terapia y del mismo modo proporcionados en una cantidad eficaz durante un período de tiempo eficaz.

Las dosificaciones dependerán de factores tales como absorción, distribución biológica, metabolismo y velocidades de excreción para cada fármaco así como otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Se ha de indicar que los valores de dosificación también variarán con la gravedad de la afección aliviar. Se ha de entender adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes y programas de dosificación específicos se deben ajustar durante un tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Los ejemplos de intervalos de dosificación adecuadas para los compuestos anti VIH, que incluyen los derivados de nucleósidos (por ejemplo, AZT, D4T, DDi, y 3TC) o inhibidores de proteasa, por ejemplo, nelfinavir e indinavir, se pueden encontrar en la bibliografía sintética en la referencia de escritorios de los médicos. Muchos ejemplos de intervalos de dosificación adecuados para otros compuestos descritos en esta memoria descriptiva también se encuentran en la bibliografía pública o se puede identificar usando procedimientos conocidos. estos intervalos de dosificación se pueden modificar según se desee para lograr el resultado deseado.

En otra realización preferida, el D-D4FC se administra en combinación con con abacavir (1592U89) que es succinato de (1S, 4R)4-[2-amino-6-ciclopropil-amino)-9H-purin-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol.

En otra realización, el D-D4FC se administra en combinación con un inhibidor de la transcriptasa inversa de no nucleósido tal como DMP-266 ((S)-6-cloro-4-ciclorpopiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona (SUSTIVA, véase por ejemplo la patente de Estados Unidos Nº 5.519.021); delaviridina; (1-[3-(1-metil-etil)amino]-2-piridinil-4-[[5-[(metilsulfonil)amino]-1H-indol-2-il]carbonil]-, monoetanosulfonato), nevirapina, o delaviridina.

En otra realización, el v se administra en combinación o alternancia con un inhibidor de la integrasa de VIH o un inhibidor de quimioquina.

II. Análisis de mutación inducida por D-D4FC del genoma de VIH

Los procedimientos y kits similares a los descritos en las patentes de Estados Unidos Nº 5.409.810 de Larder y col., para AZT, pero basándose en el perfil de mutación para D-D4FC, se pueden usar para analizar la presencia de mutaciones inducidas por D-D4FC y de este modo forman parte de la invención presentada en esta memoria descriptiva. Además para incorporar la patente de Larder por referencia en su totalidad, estas técnicas se establecen más adelante.

Un procedimiento de evaluación de la sensibilidad de una muestra de VIH-1 a T3-D4FC, incluye:

(i)

aislar ácido nucleico de la muestra,

(ii)

hibridizar un oligonucleótido al ácido nucleico, siendo los oligonucleótidos complementarios a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia de ADN mutante (o su ARN correspondiente),

(iii)

intentar la polimerización del ácido nucleico a partir del extremo 3' del oligonucleótido,

(iv)

averiguar si o no un producto extendido del cebador de oligonucleótido está presente.

Es posible usar ADN o ARN aislado a partir de muestras de VIH-1 en esta metodología. Las células adecuadas para reforzar el crecimiento de aislado de MV-1 se incuban durante un período de tiempo. Las células se recubren mediante centrifugación. Después se puede aislar ADN mediante digestión de las células con proteinasa K en presencia de EDTA y un detergente tal como SDS, seguido de extracción con fenol.

Los procedimientos de extracción y purificación bien conocidos están disponibles para el aislamiento de ADN de una muestra. El ARN se puede aislar usando la siguiente metodología. Las células adecuadas se infectan y se incuban durante un período de tiempo. las células se recubren mediante centrifugación. las células se vuelven a suspender en tampón de extracción de ARN seguido de la digestión usando un tampón de digestión de proteinasa y digestión con la proteinasa K. Las proteínas se retiran en presencia de una mezcla de fenol/cloroformo. Después el ARN se pueden recubrir después de unas etapas de centrifugación adicionales (Maniatis, T., y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

Aunque es posible usar ácido nucleico no amplificado, debido a la escasez relativa de ácido nucleico en una muestra de VIH-1 es preferible amplificarlo. el ácido nucleico se puede amplificar selectivamente usando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es un procedimiento in vitro para producir grandes cantidades de fragmento de ácido nucleico específico de longitud definida y secuencia de cantidades pequeñas de un molde.

La PCR está comprendida de reactivos convencionales usando concentración de Mg^{2}, cebadores de oligonucleótido y condiciones de ciclación de temperatura para la amplificación del gen de la RT usando los cebadores. Los cebadores se eligen de tal manera que amplificarán el gen entero de la RT o una secuencia seleccionada que incorpora los nucleótidos correspondientes a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje de VIH-1 que induce el codón que está mutado.

El ARN no se puede amplificar directamente mediante PCR, su ADNc correspondiente se debe sintetizar. la síntesis de ADNc normalmente se lleva a cabo mediante transcripción inversa cebada usando cebadores de oligo-dt. De manera ventajosa, los cebadores se eligen de manera que simplificarán la secuencia de ácido nucleico para la RT o una secuencia seleccionada que incorpora los nucleótidos correspondientes a la región de ARN correspondiente a la secuencia de ADN de tipo salvaje o a la región de la secuencia de ADN mutada correspondiente al codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la transcriptasa inversa. Esto se podría lograr preparando un cebador de oligonucleótido que es complementario a la hebra de ARN que está corriente arriba de al secuencia correspondiente de la secuencia de ADN de tipo salvaje. El ADNc preparado mediante esta metodología (véase Maniatis, T., y col., supra) se puede después usar de al misma forma que para el ADN ya descrito.

La siguiente fase de la metodología es hibridar al ácido nucleico un oligonucleótido que es complementario a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia de ADN mutante (o su ARN correspondiente).

Las condiciones y reactivos se proporcionan después para permitir la polimerización del ácido nucleico a partir del extremo 3' del cebador de oligonucleótido. Tales reacciones de polimerización se conocen bien en la técnica.

Si el cebador de oligonucleótido tiene en su extremo 3' un nucleótido que es complementario a un genotipo mutante, ese genotipo es un genotipo que tiene un cambio de nucleótido en el codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la RT, después la polimerización de la secuencia de ácido nucleico solamente se producirá si el ácido nucleico de la muestra es el mismo que el genotipo mutante. La polimerización de una secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje no se producirá a al menos no en un grado significativo debido a una falta de coincidencia de nucleótidos en el extremo 3' del cebador de oligonucleótido y la secuencia de ácido nucleico de al muestra.

Si el cebador de oligonucleótido tiene en extremo 3' del nucleótido que es complementario al genotipo de tipo salvaje, que es un genotipo que tiene el nucleósido de tipo salvaje en el codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la RT, después existirá la polimerización de una secuencia de ácido nucleico que es de tipo salvaje en esa posición. No existirá polimerización de un ácido nucleico que tiene un nucleótido mutante en la posición 3'.

La longitud preferida de cada oligonucleótido es 15 - 20 nucleótidos. Los oligonucleótidos se pueden preparar de acuerdo con la metodología bien conocida por los expertos en la técnica (Koster, H., Drug Research, 30 p548 (1980); Koster, H., Tetrahedron Letters p 1527 (1972); Caruthers, Tetrahedron Letters, p179, (1980); Tetrahedron Letters, p1859, (1981); Tetrahedron Letters 24, p 245, (1983); Gate. M. Nuceic Acid Research, 8, p1081, (1980)) y en general se prepara usando un sintetizador de ADN automático tal como un sintetizador de Applied Biosystems 381A.

Es conveniente determinar la presencia de un producto extendido de cebador de oligonucleótido. Los medios para llevar a cabo al detección es usando una marca apropiada.

La marca se puede unir de manera conveniente al cebador de oligonucleótido a alguna otra molécula que se unirá al producto de polimerización extendido del cebador.

La marca puede ser por ejemplo una enzima, radioisótopo o fluorocromo. Una marca preferida puede ser biotina que se podría posteriormente detectar usando estreptavidina conjugada a una enzima tal como peroxidasa y fosfatasa alcalina. La presencia de un producto de polimerización extendido del cebador se puede detectar por ejemplo llevando a cabo la reacción de polimerización sobre un gel de azarosa y observando un fragmento de ADN específico marcado con bromuro de etidio, o transferido por Southern y autorradiografiado para detectar la presencia o ausencia de bandas correspondientes a producto polimerizado. Si la banda predominante está presente y corresponde solamente al oligonucleótido marcado entonces esto indica que al polimerización se ha producido. Si las bandas están presentes en el tamaño predicho correcto, esto indicaría que la polimerización se ha producido.

Por ejemplo, el ADN aislado a partir de linfocitos de pacientes como se describe en esta memoria descriptiva se usa como un molde para la amplificación de PCR usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos que o bien coinciden o no coinciden con las secuencias amplificadas. La viabilidad de la PCR en la detección de tales mutaciones ya se ha demostrado. La PCR que usa el sistema de mutación refractario a amplificación ("ARMS") (Newton, C. R., y col., Nucleic Acids Research, 17 p2503, (1989)) Los oligonucleótidos sintéticos se producen para hibridizarse a las regiones adyacentes a una que incluye las mutaciones específicas tales como la 3' ENDE del oligonucleótido o bien coincide o no coincide con una secuencia mutante o de tipo salvaje. La PCr se lleva a cabo y da como resultado la identificación de un fragmento de ADN (usando electroforesis de gel) conde se ha producido una coincidencia o ningún fragmento donde se ha producido una no coincidencia.

El ADN se extrae a partir de células T infectadas con VIH-1 como se describe en esta memoria descriptiva y se somete a análisis de PCR de "ARMS" usando estos cebadores.

La presencia de un fragmento se identifica usando un cebador de oligonucleótido como se ha descrito anteriormente, es decir, mediante el intento de polimerización usando un cebador de oligonucleótido que se puede marcar para el fragmento de ADN amplificado en condiciones rigurosas que solamente permiten la hibridación de ADN complementario (la única diferencia es que la hibridación diferencial no tiene que realizarse como fragmentos de ADN amplificados por el procedimiento de "ARMS" será el mismo si se deriva de un ADN mutante o de tipo salvaje, de este modo se puede usar un oligonucleótido común para detectar la presencia de estos fragmentos. La secuencia de tal oligonucleótido se deriva de una secuencia de ADN dentro de un fragmento de ADN que se conserva entre las cepas de VIH-1).

El ensayo de PCR anterior se puede adaptar para que permitir la detección directa de mutaciones asociadas a la resistencia de A-D4FC en ADN de muestras de PBL de individuos infectados que no se han cultivado para obtener virus. Como este material generalmente contienen considerablemente menos ADN de VIH-1 que la que hay en los cultivos linfoides infectados un protocolo de "PCr doble" (o jerarquizados) se puede usar (Simmonds, P., Balfe, P, Peutherer, J. F., Ludlam, C. A., Bishop, J. O. y Leigh Brown, A. J., J. Virol., 64, 864 - 872, (1990)) para reforzar la cantidad de señal de ADN de la RT de VIH-1 diana en las muestras. La doble PCR supera el problema de la amplificación limitada de una secuencia rara de molde. Una cantidad pequeña del material pre-amplificado se puede usar en la segunda PCR con pares de cebadores que permiten la discriminación de residuos de tipo salvaje y mutante.

Un kit de ensayo adecuado para uso en un conjunto para determinar el estados de resistencia de una muestra de VIH-1 a D-D4FC que hace uso de la metodología precedente comprende un oligonucleótido que es complementario a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia mutante de ADN como se describe en esta memoria descriptiva, otros materiales requeridos para la polimerización del ácido nucleico a partir del extremo 3' del oligonucleótido y medios para determinar la presencia de un producto extendido del cebador de oligonucleótido. Dichos otros materiales incluyen enzimas apropiadas, tampones y soluciones de lavado, y una marca y un sustrato para la marca si es necesario. si la PCR se usa para amplificar ácido nucleico entonces materiales adicionales tales como cebadores de oligonucleótidos apropiados que amplificarán una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje(o su ARN correspondiente) o una región de la secuencia de ADN mutante como se describe en esta memoria descriptiva (o su ARN correspondiente) y dNTP's se debe incluir.

Un procedimiento para determinar la sensibilidad de una muestra de VIH-1 a D-D4FC comprende:

(i)

aislar el ácido nucleico de la muestra,

(ii)

hibridizar el ácido nucleico con un oligonucleótido que es complementario a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su ARN correspondiente) o a una región de la secuencia de ADN mutante expuesta en la FIG. 1 (o su ARN correspondiente) que contienen uno o más de los nucleótidos en al región del codón 70 (K a N), 90 0 172 en la región de la RT; y

(iii)

averiguar si cualquiera de los híbridos resultantes del oligonucleótido y ácido nucleico tiene o no nucleótidos complementarios en una de estas posiciones.

Preferiblemente el oligonucleótido se diseña de esta manera para formar un híbrido perfectamente coincidente con su complemento.

El ácido nucleico (ADN o ARN) se aísla a partir de una muestra mediante los procedimientos anteriormente mencionados como se descrito para el primer aspecto de la invención.

De manera similar, la PCR se puede usar para amplificar el ADN de la RT (o su correspondiente ARN) o preferiblemente para amplificar una región del ADN de la RT (o su correspondiente ARN) que incorpora ADN (o su correspondiente ARN) que contiene uno o más de los nucleótidos en la posición designada.

En la segunda fase de esta metodología el ácido nucleico después se usa para hibridizarse a oligonucleótidos complementarios a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su correspondiente ARN) o a una región de la secuencia de ADN mutante.

El oligonucleótido puede ser de cualquier longitud dependiendo del número de posiciones de nucleótidos de interés que se están examinando. si el oligonucleótido se diseña para que incluya un nucleótido en una posición de interés solamente entonces este nucleótido está preferiblemente en o cerca de una posición central del oligonucleótido.

Con el fin de determinar si o no la secuencia de oligonucleótido y ácido nucleico han formado un híbrido coincidente, las condiciones de hibridación se establecen de manera que un híbrido solamente se forma cuando el nucleótido o nucleótidos en el codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la transcriptasa inversa son complementarios con el nucleótido o nucleótidos correspondientes del oligonucleótido que o bien permite la hibridación o no la hibridación. Es importante establecer por ejemplo la temperatura de reacción y la concentración de al solución de sal antes de llevar a cabo la etapa de hibridación para encontrar condiciones que son los suficientemente rigurosas para garantizar la especificidad (Maniatis, T., y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989). Si la sonda de oligonucleótido tiene una secuencia de ADN que es complementaria con al secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje en uno o más de sus nucleótidos que corresponden al codón 70 (K a N), 90 0 172 de la región de la transcriptasa inversa entonces este oligonucleótido se hibridará perfectamente al ácido nucleico de tipo salvaje. Si no se hibrida perfectamente a un ácido nucleico de tipo salvaje. Si no existe hibridación entonces esto sugerirá que el ácido nucleico aislado de la misma contiene una o más mutaciones.

Si la sonda de oligonucleótido tiene una secuencia de ADN que es complementaria d una secuencia de ácido nucleico mutante entonces este oligonucleótido se hibridizara a un ácido nucleico mutante. Si no existe hibridación esto sugeriría que el ácido nucleico aislado a partir de la muestra contiene ninguna de tal mutación o mutaciones. Las sondas de oligonucleótidos se pueden marcar como un medio de detección como para el primer aspecto de la invención.

La hibridación y posterior retirada de los ácidos nucleicos no hibridizados se realiza en condiciones rigurosas que solamente permiten la hibridación del ADN complementario y no el oligonucleótido que contiene una no coincidencia 8 es decir, hibridación específica de oligonucleótido como se describe para la detección de la mutación de células falciformes usando el gen de la \beta-globina o HLA-DQ\alpha (Saikt, R. K., y col., Nature, 324, 9 163 (1986), el gen Ras activado (Ver Laan-de, Vries, M., y col., Gene, 50, 313, (1986) y la \beta-talasemia Wong, C., y col., Nature, 330, p 384, (1987)).

La hibridación se puede llevar a cabo mediante la inmovilización de la secuencia de ácido nucleico de la RT en nitrocelulosa, nylon u otra matriz sólida (por ejemplo transferencia de puntos). Es conveniente determinar la presencia de de un híbrido usando los medios de una marca. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos sintetizados químicamente se pueden marcar de manera adecuada usando enzima, radioisótopo o fluorocromo. Una marca preferida puede ser biotina que se podría detectar posteriormente usando estreptavidina conjugada a una enzima tal como peroxidasa o fosfatas alcalina.

Como alternativa la hibridación se puede llevar a cabo mediante inmovilización de los oligonucleótidos sintetizados químicamente mencionados anteriormente, que están sin marcar, en un soporte sólido mencionado anteriormente y la hibridación posterior mediante una secuencia de ácido nucleico de la RT marcada como se ha descrito previamente.

En ambas situaciones descritas anteriormente para la hibridación se incorporará, reacciones de control adecuadas para determinar que se ha producido la hibridación eficaz (por ejemplo, la hibridación de oligonucleótidos a un oligonucleótido complementario).

Los resultados se interpretarían fácilmente ya que el ácido nucleico aislado se hibridaría a o bien el oligonucleótido de tipo salvaje o al oligonucleótido mutante.

Un kit de ensayo adecuado para uso en un ensayo para determinar la sensibilidad de una muestra de VIH-1 a D-D4FC que utiliza una metodología de acuerdo con el segundo aspecto de la invención comprende un oligonucleótido que es complementario a una región de la secuencia de ADN de tipo salvaje (o su correspondiente ARN) a la región pertinente de al secuencia de ADN mutante, junto con otros materiales requeridos para permitir la hibridación. Tales materiales incluyen los tampones apropiados y soluciones de lavado y una marca y un sustrato para la marca si es necesario. Normalmente el oligonucleótido estaría marcado. Si se usa la PCR para amplificar el ácido nucleico antes de la hibridación entonces los materiales adicionales tales como cebadores de oligonucleótidos adecuados que amplificarán una región de al secuencia de ADN de tipo salvaje (o su correspondiente ARN) o una región de la secuencia de ADN mutante, enzimas apropiadas y dNTP's (trifosfato de desoxi nucleótidos) se deben incluir.

En un formato alternativo del ensayo, los dNTP's en la amplificación pueden o no pueden estar acoplados a una molécula detectora tal como un radioisótopo, biotina, fluorocromo o enzima.

También es posible detectar mutaciones resistentes a zidovudina en el ARN de VIH-1 aislado de muestras clínicas usando un sistema de amplificación de ARN. Usando al metodología descrita por Guatelli y col., (Proc. Natl. Acad. Sci, (Estados Unidos), 8/7, 1874-1878, (marzo de 1990)) se puede replicar (amplificar) una secuencia de ácido nucleico diana exponencialmente in vitro en condiciones isotérmicas usando estas actividades enzimáticas esenciales para la replicación retroviral: transcriptasa inversa, ARNasa H y una ARN polimerasa dependiente de ADN. Tal metodología se puede emplear seguido de una etapa de hibridación para distinguir los nucleótidos mutantes de los de tipo salvaje como se ha descrito previamente.

Preparación de composiciones farmacéuticas

Los humanos que padecen los efectos provocados por por cualquiera de las enfermedades descritas en esta memoria descriptiva, y en particular, virus por VIH, se pueden tratar mediante la administración al paciente de una cantidad eficaz de D-D4FC o una sal o fármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en presencia de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de las indicaciones o modos de administración como se ha descrito anteriormente en detalle en esta memoria descriptiva. Los materiales activos se pueden administrar mediante cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, entérica, intravenosa, intradérmica, subcutánea, transdérmica, intranasal o tópica, en forma líquida o sólida.

El (los) compuesto(s) activo(s) incluido(s) en el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en cantidades suficientes para distribuir a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto para inhibir la replicación viral in vivo, especialmente la replicación de VIH, sin provocar efectos tóxicos graves en el paciente tratado. Por "cantidad inhibidora" se quiera decir una cantidad de ingrediente activo suficiente para ejercer un efecto inhibidor como se mide, por ejemplo, mediante un ensayo tal como los descritos en esta memoria descriptiva.

Una dosis preferida del compuesto para todas las afecciones anteriormente mencionadas estarán en ele intervalo entre aproximadamente 1 y aproximadamente 75 mg/kg, preferiblemente 1 a 20 mg/kg, de peso corporal al día, más generalmente 0,1 a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal del receptor al día. El intervalo de dosificación eficaz de los derivados farmacéuticamente aceptables se pueden calcular basándose en el peso del nucleósido precursor a distribuir. Si el derivado muestra una actividad por sí mismo, la dosificación eficaz se puede estimar como antes usando el peso del derivado, o mediante otros medios conocidos por los expertos en la técnica.

Los compuestos se administran de manera conveniente en cualquier forma adecuada de dosificación unitaria, incluyendo, pero sin limitación, a una que contienen 7 a 3000 mg, preferiblemente 7 a 1400 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Una dosificación oral de 50 a 1000 mg es usualmente conveniente.

De manera ideal, el ingrediente activo se debe administrar para lograr concentraciones en plasma máximas del compuesto activo de entre aproximadamente 0,02 y 70 micromolar, preferiblemente aproximadamente 0,5 a 10 mM. Se puede lograr, por ejemplo, mediante la inyección intravenosa de una solución al 0,1 a 25% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o administrada en forma de un bolo del ingrediente activo.

La concentración de compuesto activo en la composición de fármaco dependerá de la absorción, distribución, metabolismo y velocidades de excreción de fármaco así como otros factores conocidos por los expertos en la técnica. Se ha de indicar que los valores de dosificación también variarán con la gravedad de la afección a aliviar. Se ha de entender adicionalmente que para cualquier sujeto particular, se deben ajustar regímenes de dosificación específica con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos en esta memoria descriptiva son solamente ejemplares y no se pretende limitar el alcance o práctica de de la composición reivindicada. El ingrediente activo se puede administrar una vez, o se puede dividir en un número de dosis más pequeñas a administrar a intervalos de dosis variables.

Un modo preferido de administración del compuesto activo es oral. Las composiciones orales generalmente incluirán un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden estar contenidos en cápsulas de gelatina o en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en la forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares contienen cualquier de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar; un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato magnésico o Sterotex; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como pipermín, salicilato de metilo o aromatizante de naranja. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula puede contener, además del material del tipo anterior, un vehículo líquido tal como un ácido graso. Además, las formas de dosificación unitaria pueden contener otras sustancias diversas que modifican la forma física de la unidad de dosificación, por ejemplo, revestimientos de azúcar, goma de laca u otros agentes entéricos.

Los compuestos se pueden administrar como un componente de un elixir, suspensión, jarabe, oblea, goma de mascar o similares. Un jarabe puede contener además de los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservantes, tintes y colorantes y aromatizantes.

Los compuestos o sus sales o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos también se pueden mezclar con otros materiales activos que no alteran la acción deseada, o con materiales que suplementan la acción deseada, tal como antibióticos, antifúngicos, antiinflamatorios, inhibidores de proteasa, u otros agentes antivirales nucleósidos o no nucleósidos, como se ha descrito en detalla anteriormente. Las soluciones o suspensiones para la aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea, o tópica puede incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites estables, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Si se administra por vía intravenosa, los vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Las suspensiones de liposomas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) se prefieren también como vehículos farmacéuticamente aceptables, éstas se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en l técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.522.811 (que se incorpora en esta memoria descriptiva en su totalidad por referencia). Por ejemplo, las formulaciones de liposomas se pueden preparar disolviendo un (unos) lípido(s) apropiado(s) (tal como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, y colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora, dejando detrás una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. una solución acuosa del compuesto activo o sus derivados monofosfato, sifosfato, y/o trifosfato se introducen después en el recipiente. el recipiente se agita después a mano para dejar libre el material lipídico en los laterales del recipiente y dispersar los agregados lipídicos, formando por lo tanto la suspensión de liposomas.

Formulaciones de liberación controlada

Todas las patentes de Estados Unidos citadas en esta sección en formulaciones de liberación controlada se incorporan por referencia en su totalidad.

El campo de los polímeros biodegradables se ha desarrollado rápidamente ya que la síntesis y biodegradabilidad de poli (ácido láctico) se reseñó por Kulkami y col., en 1996 ("Polilactic acid for surgical implants", Arch. Surg., 93: 839). Los ejemplos de otros polímeros que se han reseñado como útiles como un material de matriz para los dispositivos de distribución incluyen plianhídridos, poliésteres tales como poliglicolidas y polilactida-co-pglicolidas, poli (aminoácidos) tal como polilisina, polímeros y copolímeros de óxido de polietileno, óxido de polietileno terminado en acrílico, poliamidas, poliuretanos, poliortoésetres, poliacrilonitrilos, y polifosfacenos. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.891.225 y 4.906.474 de Langer (polianhídridos), 4.767.628 de Hutchinson (ácido polilactida-co-glicolida) y 4.530.840 de Tice y col., (polilactida, poliglicolida, y copolímeros). Veáse también la patente de Estados Unidos nº 5.626.863 de Hubbell y col., que describe los hidrogeles biodegradables fotopolimerizables como tejido que se pone en contacto con materiales y vehículos de liberación controlada (hidrogeles de macrómeros polimerizados y reticulados que comprende oligómeros hidrófilos que tienen extensiones monoméricas u oligoméricas biodegradables, que son monómeros con capucha en el extremo u oligómeros capaces de polimerización y reticulación); y el documentó PCT WO 97/05185 presentado por Focal, Inc. se refiere a hidrogeles de bloques múltiples para uso como agentes de liberación controlada para la distribución de fármacos y agentes de tratamiento de tejidos.

Los materiales degradables de origen biológico son bien conocidos, por ejemplo, gelatina reticulada. El ácido hialurónico se ha reticulado y usado como un polímero hinchable degradable para aplicaciones biomédicas (patente de Estados unidos Nº 4.957.744 de Della Valle y col.,(1991). "Surface modification of polymeric biomaterials for reduced thrombogenicity", Polym. Mater. Sci. Eng., 62: 731-735).

Muchos sistemas de dispersión están actualmente en uso, o se están explorando para uso como, vehículos o sustancias, particularmente compuestos biológicamente activos. Los sistemas de dispersión usados para formulaciones farmacéuticas y cosméticas se pueden clasificar en categorías como o bien suspensiones o emulsiones. Las suspensiones se definen como partículas sólidas que varían en tamaño desde unos pocos nanómetros hasta cientos de micrones, dispersados en un medio líquido usando agentes de suspensión. Las partículas sólidas incluyen microesferas, microcápsulas, y nanoesferas. Las emulsiones se definen como dispersiones de un líquido en otro, estabilizados mediante una película interfacial o emulsionantes tales como tensioactivos y lípidos. Las formulaciones de emulsiones incluyen emulsiones de agua en aceite, y aceite en agua, emulsiones múltiples, microemulsiones, microgotitas, y liposomas. Las microgotitas son vesículas de de fosfolípidos unilamelares que constan de una capa lipídica esférica con una fase oleosa en su interior, como se define en las patentes de Estados Unidos números 4.622.219 y 4.725.442 emitida por Haynes. Los liposomas son vesículas de fosfolípidos preparadas mezclando lípidos insolubles en agua con una solución acuosa. la entropía desfavorable provocada por la mezcla del lípido insoluble en el agua produce un conjunto altamente ordenado de membranas cerradas concéntricas de fosfolípido con solución acuosa atrapada.

La patente de Estados unidos Nº 4.938.763 de Dunn y col., describe un procedimiento para formar un implante in situ, disolviendo un polímero termoplástico insoluble en agua en un disolvente soluble en agua biocompatible para formar un líquido, colocando el líquido dentro del cuerpo, y permitiendo que el disolvente se disipe para producir un implante sólido. La solución de polímeros se puede colocar en el cuerpo mediante una jeringa. El implante puede asumir la forma de la cavidad que le rodea. En una realización alternativa, el implante se forma a partir de polímeros oligoméricos líquidos, reactivos que no contienen disolvente y que se curan en el lugar para formar sólidos, usualmente con la adición de un catalizador de curado.

Numerosas patentes describen sistemas de distribución de fármacos que se pueden usar para administrar D-D4FC o un nucleótido u otro profármaco definido del mismo. La patente de Estados Unidos Nº 5.749.847 describe un procedimiento para la distribución de oligonucleótidos en organismos mediante electroporación. La patente de Estados Unidos nº 5.718.921 describe microesferas que comprenden polímero y fármaco dispersados dentro. La patente de Estados Unidos nº 5.629.009 describe un sistema de distribución para la liberación controlada de factores bioactivos. La patente de Estados Unidos nº 5.578.325 describe nanopartículas y micropartículas de copolímeros de bloques múltiples hidrófilos hidrófobos. La patente de Estados Unidos nº 5.545.409 describe un sistema de distribución para la liberación controlada de factores bioactivos. La patente de Estados Unidos nº 5.494.682 describe microcápsulas poliméricas iónicamente reticuladas.

La patente de Estados Unidos nº 5.782.402 de Andrx Pharmaceuticals, Inc. describe una formulación de liberación controlada que incluye una fase interna que comprende el fármaco activo, su sal o profármaco, en mezcla con un hidrogel que forma agente, y una fase interna que comprende un revestimiento que resiste la disolución en el estómago. Las patentes de Estados Unidos números 5.736.159 y 5.558.879 de Andrx Pharmaceuticals, Inc, describe una formulación de liberación controlada para fármacos con poca solubilidad en agua en el que se forma un pasillo in situ. La patente de Estados Unidos nº 5.567.441 de Andrx Pharmaceuticals, Inc. describe una formulación de liberación controlada una vez al día. La patente de Estados Unidos nº 5.508.040 describe un sistema de distribución de fármaco por pulsos de multipartículas. La patente de Estados Unidos nº 5.472.708 describe un sistema de distribución de fármaco basado en partículas por pulsos. La patente de Estados Unidos nº 5.458.888 describe una formulación de comprimidos de liberación controlada que se puede preparar haciendo uso de una mezcla que tiene una fase que contiene fármaco interno y una fase externa que comprende un polímero de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de peso de entre 3.000 y 10.000. La patente de Estados Unidos nº 5.419.917 describe procedimientos para la modificación de de la velocidad de liberación de una forma de fármaco un hidrogel que se basa en el uso de una cantidad eficaz de un compuesto ionizable farmacéuticamente aceptable que es capaz de proporcionar una velocidad de liberación de orden cero sustancialmente de fármaco a partir del hidrogel. La patente de Estados Unidos nº 5.458.888 describe una formulación de comprimidos de liberación controlada.

La patente de Estados Unidos nº 5.641.745 de Elan Corporation, plc describe una formulación farmacéutica de liberación controlada que comprende el fármaco activo en un polímero biodegradable para formar microesferas o nanoesferas. El polímero biodegradable es adecuadamente poli-D,L-lactida o una mezcla de poli-D,L-lactida y poli-D,L-lactida-co-glicolida. La patente de Estados Unidos nº 5.616.345 de Elan Corporation, plc describe una formulación de absorción controlada para la administración una vez al día que incluye el compuesto activo en asociación con un ácido orgánico, y una membrana de capas múltiples que rodea el núcleo y contiene una proporción principal de un polímero sintético insoluble en agua, que forma película farmacéuticamente aceptable y una proporción secundaria de un polímero sintético insoluble en agua, que forma película farmacéuticamente aceptable. La patente de Estados Unidos nº 5.641.515 describe una formulación de liberación controlada basada en nanopartículas biodegradables. La patente de Estados Unidos nº 5.637.320 describe una formulación de absorción controlada para la administración una vez al día. La patente de Estados Unidos números 5.580.580 y 5.540.938 se refieren a formulaciones y su uso en el tratamiento de enfermedades neurológicas. La patente de Estados Unidos nº 5.533.995 se refiere a un dispositivo transdérmico pasivo con distribución de fármaco controlada. La patente de Estados Unidos nº 5.505.962 describe una formulación farmacéutica de liberación controlada.

Formulaciones de profármacos

D-D4FC o cualquiera de los nucleósidos u otros compuestos que se describen en esta memoria descriptiva para uso en terapia de combinación o alternancia con D-D4FC o sus compuestos relacionados se pueden administrar como un profármaco acilado o un profármaco de nucleótido como se describe en detalle más adelante.

Cualesquiera de los nucleósidos descritos en esta memoria descriptiva u otros compuestos de contienen una función hidroxilo o amina se pueden administrar como u profármaco de nucleótido para incrementar la actividad, disponibilidad biológica, estabilidad o de otra manera alterar las propiedades del nucleósido. Se conocen numerosos profármacos de nucleósidos. en general, la alquilación, acilación u otra modificación lipófila del grupo hidroxilo del compuesto o el mono, di o trifosfato del nucleósido incrementará la estabilidad del nucleótido. Los ejemplos de grupos sustituyentes que pueden reemplazar uno o más hidrógenos en el resto fosfato o hidroxilo son alquilo, arilo, esteroides, carbohidratos, incluyendo azúcares, 1,2-diacilglicerol y alcoholes. Muchos se describen en R. Jones y N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17. Cualquiera de éstos se puede usar en combinación con los nucleósidos descritos u otros compuestos para lograr el efecto deseado.

El nucleósido activo u otro compuesto que contiene hidroxilo también se puede proporcionar en forma de un éter lípido (y particularmente como el 5' -éter lípido para un nucleósido), como se describe en las siguientes referencias, que se incorporan por referencia en esta memoria descriptiva:

Kucera, L.S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.K., D.L. W., and C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation". AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. Iyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi, and E.J. Modest. 1991. "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity". J. Med. Chem. 34:1408.1414; Hosteller, K.Y., D.D. Richman, D.A. Carson, L.M. Stuhmiller, G.M. T. van Wijk, and H. van den Bosch. 1992. "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type I replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxythymidine". Antimicrob. Agents Chemother. 36:2025.2029; Hostetler, K.Y., L.M. Stuhmiller, H.B. Lenting, H. van den Bosch, and D.D. Richman, 1990. "Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides". J. Biol. Chem. 265:61127.

Los ejemplos no limitantes de las patentes de Estados Unidos que describen sustituyentes lipófilos adecuados se pueden incorporar de manera covalente en el nucleósido u otro compuesto que contiene hidroxilo o amina, preferiblemente en al posición 5'-Oh de las preparaciones de nucleósidos o lipófilas, incluyen las patentes de Estados Unidos números 5.149.794 (22 de septiembre de 1992, Yatvin y col.); 5.194.654 (16 de marzo de 1993, Hostetler y col., 5.223.263 (29 de junio de 1993), Hostetler y col.) 5.256.641 (26 de octubre de 1993, Yatvin y col.); 5.411.947 (2 de mayo de 1995, Hostetler y col); 5.463.092 (31 de octubre de 1995, Hostetler y col.); 5.543.389 (6 de agosto de 1996, Yatvin y col.); 5.543.390 (6 de agosto de 1996, Yatvin y col.); 5.543.391 (6 de agosto de 1996, Yatvin y col.); y 5.554.728 (10 de septiembre de 1996; Basava y col.) todas las cuales se incorporan en esta memoria descriptiva por referencia. Las solicitudes de patente anteriores que describen sustituyentes lipófilos que se pueden unir a los nucleósidos de la presente invención, o preparaciones lipófilas, incluyen los documentos WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, y WO 91/19721.

Los ejemplos no limitantes de profármacos de nucleósidos se describen en las siguientes referencias:

Ho, D.H.W. (1973) "Distribution of Kinase and deaminase of 1\beta-D-arabinofuranosylcytosine in tissues of man and muse". Cancer Res. 33,2816-2820; Holy, A. (1993) “Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues,” In: De Clercq (Ed.), Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I, JAI Press, pp. 179-231; Hong, C.I., Nechaev, A., and West, C.R. (1979a) "Synthesis and antitumor activity of 1\beta-D-arabino-furanosylcytosine conjugates of cortisol and cortisone". Biochem. Biophys. Rs. Commun. 88, 1223-1229; Hong, C.I., Nechaev, A., Kirisits, A.J. Buchheit, D.J. and West, C.R. (1980) "Nucleoside conjugates as potential antitumor agents. 3. Synthesis and antitumor activity of 1-(\beta-D-arabinofuranosyl) cytosine conjugates of corticosteroids and selected lipophilic alcohols". J. Med. Chem. 28, 171-177; Hosteller, K.Y., Stuhmiller, L.M., Lenting, H.B.M. van den Bosch, H. and Richman. J. Biol. Chem. 265, 6112-6117; Hosteller, K.Y., Carson, D.A. and Richman, D.D. (1991); "Phosphatidylazidothymidine: mechanism of antiretroviral action in CEM cells". J. Biol. Chem. 266, 11714-11717; Hosteller, K.Y., Korba, B. Sridhar, C., Gardener, M. (1994a) "Antiviral activity of phosphatidyl-dideoxycytidine in hepatitis B-infected cells and enhanced hepatic uptake in mice". Antiviral Res. 24, 59-67; Hosteller, K.Y., Richman, D.D., Sridhar, C.N. Felgner, P.L. Felgner, J., Ricci, J., Gardener, M.F. Selleseth, D.W. and Ellis, M.N. (1994b) "Phosphatidylazidothymidine and phosphatidyl-ddC: Assessment of uptake in mouse lymphoid tissues and antiviral activities in human immunodeficiency virus-infected cells and in rauscher leukemia virus-infected mice". Antimicrobial Agents Chemother. 38, 2792-2797; Hunston, R.N., Jones, A.A. McGuigan, C., Walker, R.T., Balzarini, J., and DeClercq; E. (1984) "Synthesis and biological properties of some cyclic phosphotriesters derived from 2'-deoxy-5-fluorouridine". J Med Chem. 27, 440-444; Ji, Y.H., Moog, C., Schmitt, G., Bischoff, P. and Luu, B. (1990); "Monophosphoric acid esters of 7-\beta-hydroxycholesterol and of pyrimidine nucleoside as potential antitumor agents: synthesis and preliminary evaluation of antitumor activity". J Med. Chem. 33, 2264-2270; Jones, A.S., McGuigan, C., Walker, R.T., Balzarini, J. and DeClercq, E. (1984) "Synthesis, properties, and biological activity of some nucleoside cyclic phosphoramidates". J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1471-1474; Juodka, B.A. and Smart, J. (1974) "Synthesis of diribonucleoside phosph (P \rightarrow N) amino acid derivatives". Coll. Czech. Chem. Comm. 39, 363-968; Kataoka, S., Imai, J., Yamaji, N., Kato, M., Saito, M., Kawada, T. and Imai, S. (1989) "Alkylated cAMP derivatives; selective synthesis and biological activities". Nucleic Acids Res. Sym. Ser. 21, 1-2; Kataoka, S., Uchida, "(cAMP) benzyl and methyl triesters". Heterocycles 32, 1351-1356; Kinchington, D., Harvey, J.J., O'Connor, T.J., Jones, B.C.N.M., Devine, K.G., Taylor-Robinson D., Jeffries, D.J. and McGuigan, C. (1992) "Comparison of antiviral effects of zidovudine phosphoramidate and phosphorodiamidate derivatives against HIV and ULV in vitro. Antiviral Chem. Chemother. 3, 107-112; Kodama, K., Morozumi, M., Saithoh, K.I., Kuninaka, H., Yosino, H. and Saneyoshi, M. (1989) "Antitumor activity and pharmacology of 1-\beta-D-arabinofuranosylcytosine-5'-stearylphosphate; an orally active derivative of 1-\beta-D-arabinofuranosylcytosine". Jpn. J. Cancer Res. 80, 679-685; Korty, M. and Engels, J. (1979) "The effects of adenosine-and guanosine 3',5' phosphoric and acid benzyl esters on guineapig ventricular myocardium". Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol 310, 103-111; Kumar, A., Goe, P.L., Jones, A.S. Walker, R.T. Balzarini, J. and DeClercq, E. (1990) "Synthesis and biological evaluation of some cyclic phosphoramidate nucleoside derivatives". J. Med. Chem, 33, 2368-2375; LeBec, C., and Huynh-Dinh, T. (1991) "Synthesis of lipophilic phosphate triester derivatives of 5-fluorouridine an arabinocytidine as anticancer prodrugs". Tetrahedron Lett. 32, 6553-6556; Lichtenstein, J., Barner, H.D. and Cohen, S.S. (1960) The metabolism of exogenously supplied nucleotides by Escherichia col.",J. Biol. Chem. 235, 457-465; Lucthy, J., Von Daeniken, A., Friederich, J. Manthey, B., Zweifel, J., Schlatter, C. and Senn, M.H. (1981) "Synthesis and toxicological properties of three naturally occurring cyanoepithioalkanes". Mitt. Geg. Lebensmitte/ureters. Hyg. 72, 131-133 (Chem. Abstr. 95, 127093); McGigan, C. Tollerfield, S.M. and Riley, P.a. (1989) "Synthesis and biological evaluation of some phosphate triester derivatives of the anti-viral drug Ara". Nucleic Acids Res. 17, 6065-6075; McGuigan, C., Devine, K.G., O'Connor, T.J., Galpin, S.A., Jeffries, D.J. and Kinchington, D. (1990a) "Synthesis and evaluation of some novel phosphoramidate derivatives of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) as anti-HIV compounds". Antiviral Chem. Chemother, 1, 107-113; McGuigan, C., O'Connor, T.J., Nicholls, S.R Nickson, C. and Kinchington, D. (1990b) "Synthesis and anti-HIV activity of some novel substituted dialkyl phosphate derivatives of AZT and ddCyd". Antiviral Chem. Chemother. 1, 355-360; McGuigan, C., Nicholls, S.R., O'Connor, T.J., and Kinchington, D. (1990c) "Synthesis of some novel dialkyl phosphate derivative of 3'-modified nucleosides as potential anti-AIDS drugs". Antiviral Chem. Chemother. 1, 25-33; McGuigan, C., Devin, K.G., O'Connor, T.J., and Kinchington, D. (1991) "Synthesis and anti-HIV activity of some haloalkyl phosphoramidate derivatives of 3'-azido-3' deoxythylmidine (AZT); potent activity of the trichloroethyl methoxyalaninyl compound". Antiviral Res. 15, 255-263; McGuigan, C., Pathirana, R.N., Balzarini, J. and DeClercq, E. (1993b) "Intracellular delivery of bioactive AZT nucleotides by aryl phosphate derivatives of AZT". J. Med. Chem. 36, 1048-1052).

Los derivados de fosfato ácido de alquilo del agente anti VIH AZT, pueden ser menos tóxicos que el análogo del nucleósido precursor.

Antiviral Chem. Chemother. 5, 271-277; Meyer, R. B., Jr., Shuman, D.A. and Robins, R.K. (1973) "Synthesis of purine nucleoside 3',5'-cyclic phosphoramidates". Tetrahedron Lett. 269-272; Nagyvary, J. Gohil, R.N., Kirchner, C.R. and Stevens, J.D. (1973) "Studies on neutral esters of cyclic AMP", Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1072-1077; Namane, A. Gouyette, C., Fillion, M.P., Fillion, G. and Huynh-Dinh, T. (1992) "Improved brain delivery of AZT using a glycosyl phosphotriester prodrug". J. Med Chem. 35, 3039-3044; Nargeot, J. Nerbonne, J.M. Engels, J. and Leser, H.A. (1983) Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 2395-2399; Nelson, K.A., Bentrude, W.G. Stser, W.N. and Hutchinson, J.P. (1987) "The question of chair-twist equilibria for the phosphate rings of nucleoside cyclic 3',5'-monophosphates. ^{1}HNMR and x-ray crystallographic study of the diastereomers of thymidine phenyl cyclic 3',5'-monophosphate". J. Am. Chem. Soc. 109, 4058-4064; Nerbonne, J.M., Richard, S., Nargeot, J. and Lester, H.A. (1984) "New photoactivatable cyclic nucleotides produce intracellular jumps in cyclic AMP and cyclic GMP concentrations". Nature 301, 74-76; Neumann, J.M., Herv_, M., Debouzy, J.C., Guerra, F.I., Gouyette, C., Dupraz, B. and Huyny-Dinh, T. (1989) "Synthesis and transmembrane transport studies by NMR of a glucosyl phospholipid of thymidine". J. Am. Chem. Soc. 111, 4270-4277; Ohno, R., Tatsumi, N., Hirano, M., Imai, K. Mizoguchi, H., Nakamura, T., Kosaka, M., Takatuski, K., Yamaya, T., Toyama K., Yoshida, T., Masaoka, T., Hashimoto, S., Ohshima, T., Kimura, I., Yamada, K. and Kimura, J. (1991) "Treatment of myelodysplastic syndromes with orally administered 1-\beta-D-arabinouranosylcytosine-5' stearylphosphate". Oncology, 48, 451-455. Palomino, E., Kessle, D. and Horwitz, J.P. (1989) "A dihydropyridine carrier system for sustained delivery of 2',3'-dideoxynucleosides to the brain". J Med Chem. 32, 22-625; Perkins, R.M., Barney, S. Wittrock, R., Clark, P.H., Levin, R. Lambert, D.M., Petteway, S.R., Serafinowska, H.T., Bailey, S.M., Jackson, S., Hamden, M.R. Ashton, R., Sutton, D., Harvey, J.J. and Brown, A.G. (1993) "Activity of BRL47923 and its oral prodrug, SB203657A against a rauscher murine leukemia virus infection in mice". Antiviral Res. 20 (Suppl. I). 84; Piantadosi, C., Marasco, C.J., Jr., Norris-Natschke, S.L., Meyer, K.L., Gumus, F., Surles, J.R., Ishaq, K.S., Kucera, L.S. Iyer, N., Wallen, C.A., Piantadosi, S. and Modest, E.J. (1991) "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV-1 activity". J. Med. Chem. 34, 1408-1414; Pompon, A., Lefebvre, I., Imbach, J.L., Kahn, S. and Farquhar, D. (1994). "Decomposition pathways of the mono- and bis(pivaloyloxymethyl) esters of azidothymidine-5'-monophosphate in cell extract and in tissue culture medium; an application of the 'on-line ISRP-cleaning HPLC technique". Antiviral Chem Chemother. 5, 91-98; Postemark, T. (1974) "Cyclic AMP and cyclic GMP". Annu. Rev. Pharmacol. 14, 23-33; Prisbe, E.J., Martin, J.C.M., McGhee, D.P.C., Barker, M.F., Smee, D.F. Duke, A.E.; Matthews, T.R. and Verheyden, J.P.J. (1986) "Synthesis and antiherpes virus activity of phosphate an phosphonate derivatives of 9-[(1,3-dihydroxy-2-propoxy)methyl]guanine". J. Med. Chem. 29, 671-675; Pucch, F., Gosselin, G., Lefebvre, I., Pompon, a., Aubertin, A.M. Dirn, and Imbach, J.L. (1993) "Intracellular delivery of nucleoside monophosphate through a reductase-mediated activation process". Antiviral Res. 22, 155-174; Pugaeva, V.P., Klochkeva, S.I., Mashbits, F.D. and Eizengart, R.S. (1969). "Toxicological assessment and health standard ratings for ethylene sulfide in the industrial atmosphere". Gig. Trf. Prof Zabol. 14, 47-48 (Chem. Abstr. 72, 212); Robins, R.K. (1984) "The potential of nucleotide analogs as inhibitors of Retro viruses and tumors". Pharm. Res. 11-18; Rosowsky, A., Kim, S.H., Ross and J. Wick, M.M. (1982) "Lipophilic 5'-(alkylphosphate) esters of 1-\beta-D-arabinofuranosylcytosine and its N^{4}-acyl and 2.2'-anhydro-3'-O-acyl derivatives as potential prodrugs". J. Med. Chem. 25, 171-178; Ross, W. (1961) "Increased sensitivity of the walker turnout towards aromatic nitrogen mustards carrying basic side chains following glucose pretreatment". Biochem. Pharm. 8, 235-240; Ryu, E.K., Ross, R.J. Matsushita, T., MacCoss, M., Hong, C.I. and West, C.R. (1982). "Phospholipid-nucleoside conjugates. 3. Synthesis and preliminary biological evaluation of 1-\beta-D-arabinofuranosylcytosine 5' diphosphate [-], 2-diacylglycerols". J. Med. Chem. 25, 1322-1329; Saffhill, R. and Hume, W.J. (1986) "The degradation of 5-iododeoxyuridine and 5-bromoethoxyuridine by serum from different sources and its consequences for the use of these compounds for incorporation into DNA". Chem. Biol. Interact. 57,347-355; Saneyoshi, M., Morozumi, M., Kodama, K., Machida, J., Kuninaka, A. and Yoshino, H. (1980) "Synthetic nucleosides and nucleotides. XVI. Synthesis and biological evaluations of a series of 1-\beta-D-arabinofuranosylcytosine 5'-alky or arylphosphates".. Chem Pharm. Bull. 28, 291 S-2923; Sastry, J.K., Nehete, P.N., Khan, S., Nowak, B.J., Plunkett, W., Arlinghaus, R.B. and Farquhar, D. (1992) "Membrane-permeable dideoxyuridine 5'-monophosphate analogue inhibits human immunodeficiency virus infection". Mol. Pharmacol 41, 441-445; Shaw, J.P., Jones, R.J. Arimilli, M.N., Louie, M.S., Lee, W.A. and Cundy, K.C. (1994) "Oral bioavailability of PMEA from PMEA prodrugs in male Sprague-Dawley rats". 9th Annual AAPS Meeting. San Diego, CA (Abstract). Shuto, S., Ueda, S., Imamura, S., Fukukawa, K. Matsuda, A. and Ueda, T. (1987) "A facile one-step synthesis of 5' phosphatidiylnucleosides by an enzymatic two-phase reaction". Tetrahedron Lett. 28, 199-202; Shuto, S. Itoh, H., Ueda, S., Imamura, S., Kukukawa, K., Tsujino, M., Matsuda, A. and Ueda, T. (1988) Pharm. Bull. 36, 209-217. An example of a useful phosphate prodrug group is the S-acyl-2-thioethyl group, also referred to as "SATE".

Esta invención se describe con referencia a sus realizaciones preferidas. Las variaciones y modificaciones de la invención, serán obvias para los expertos en la técnica a partir de la anterior descripción detallada de la invención. Se pretende que todas estas variaciones y modificaciones estén incluidas dentro del ámbito de esta invención.

Claims (9)

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de \beta-D-D4FC o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, con una cantidad eficaz de abacavir opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como una preparación combinada para uso para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un ser humano.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los compuestos eficaces se administran en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración oral, administración intravenosa, administración parenteral, administración intradérmica, administración subcutánea o administración tópica.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los compuestos están en la forma de una unidad de dosificación.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la unidad de dosificación contiene de 10 a 1500 mg de cada compuesto.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la unidad de dosificación es un comprimido o cápsula.

7. Uso de una cantidad eficaz de una composición de acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un ser humano.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que los compuestos activos se administran en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración oral, administración intravenosa, administración parenteral, administración intradérmica, administración subcutánea o administración tópica.