KR20020068260A - β-2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시-5-플루오로사이티딘에 의해 선택된 HIV-1 돌연변이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 β-D-D4FC 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을, 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외의 위치에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 약제와 동시에 또는 순차적으로 이를 필요로 하는 인간에게 투여함을 특징으로 하여 HIV를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다른 항-HIV제에 대해 약물 내성을 나타내는 환자에게 "구제 치료(salvage therapy)"로서 β-D-D4FC를 사용하는 방법에 관한 것이다. β-D-D4FC는 일반적으로 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외에서 돌연변이를 유발하는 약물에 대해 내성을 나타내는 환자에 대해 구제 치료로서 사용될 수 있다.

Description

β-2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시-5-플루오로사이티딘에 의해 선택된 HIV-1 돌연변이{HIV-1 mutations selected for by β-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxy-5-fluorocytidine}
본 발명은 미국립 위생청으로부터 승인번호 1R01-A1-41980-01를 부여받아 부분적으로 재정지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 갖는다.
본 출원은 1999년 1월 22일 출원된 미국 가특허 출원 제 60/116,773호를 우선권으로 주장한다.
1983년에 AIDS의 병인이 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인 것으로 확정되었다. 1985년에, 합성 뉴클레오사이드 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT)이 인간 면역결핍 바이러스의 복제를 억제하는 것으로 보고되었다. 이후, 2',3'-디데옥시이노신 (DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘 (D4T), 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC), (-)-시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(3TC)을 포함한 다수의 다른 합성 뉴클레오사이드가 HIV에 대해 효과적인 것으로 입증되었다. 세포 키나제에 의해 5'-트리포스페이트로 세포 포스포릴화 후, 이들 합성 뉴클레오사이드는 바이러스 DNA의 성장 스트랜드로 도입되어 3'-하이드록실 그룹의 부재로 쇄종결된다. 이들은 또한 바이러스 효소 역전사효소를 억제할 수 있다.
항바이러스제로 장기간 치료후 HIV의 약물-내성 변이체가 나타날 수 있는 것으로 인식되고 있다. 약물 내성은 가장 전형적으로는 바이러스 복제에 사용되는 효소, 및 가장 전형적으로는 HIV의 경우 역전사효소, 프로테아제 또는 DNA 폴리머라제를 코드화하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. 최근, 화합물을 주 약제에 의해 야기되는 것과 상이한 돌연변이를 유발하는 제 2 및, 어쩌면 제 3의 항바이러스성 화합물과 동시에(combination), 또는 순차적으로(alternation) 투여함으로써 HIV 감염에 대한 약물의 효과를 연장하거나, 증가시키거나 또는 복귀시킬 수 있음이 입증되었다. 한편, 약물의 약력학, 생체분포 또는 그밖의 다른 파라미터가 이러한 동시 또는 순차 치료에 의해 변경될 수 있다. 일반적으로, 동시 치료가 바이러스에 대해 동시 다발적으로 압박을 가하기 때문에 순차 치료보다 전형적으로 바람직하다. 그러나, 주어진 약제에 의해 HIV-1 게놈에서 어떤 돌연변이가 유도될 것인지, 돌연변이가 영구적인지 또는 일시적인지, 또는 돌연변이된 HIV-1 서열로 감염된 세포가 다른 제제와 동시 또는 순차 치료시 어떤 방식으로 반응을 나타내는지는 예견할 수 없다. 이것은 최신 항레트로바이러스제로 처리된 장기 세포 배양물에서 약물 내성 동력학에 대한 데이터가 부족하다는 사실로 더욱 심화된다.
3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI) 또는 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC) 내성 HIV-1 변이체가 상기 약물로 장기간 단일치료를 받은 환자로부터 분리되었다(참조: Larder BA, Darby G, Richman DD.Science1989:243:1731-4; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG,et al.Science1991:253:1557-9; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG,et al.Science1991:253:1557-9; 및 Fitgibbon JE, Howell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin DT.Antimicrob Agents Chemother1992;36:153-7). 마운팅 임상 실험(mounting clinical evidence)은 AZT 내성이 어린이 및 성인 모두에게서 좋지 않은 임상 결과의 전조요인임을 나타내었다(참조: Mayers DL. Lecture at the Thirty-second Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy.(Anaheim, CA. 1992); Tudor-Williams G, St Clair MH, McKinney RE,et al. Lancet1992;339:15-9; Ogino MT, Dankner WM, Spector SA.J Pediatr1993;123:1-8; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VAet al. Third Worksharp on Viral Resistance. (Gaithersburg, MD. 1993); 및 Mayers D, and the RV43 Study Group. Third Workshop on Viral Resistance.(Gaithersburg, MD. 1993)). 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(NNRTIs)에 대한 HIV-1 내성의 긴급 발현이 또한 세포 배양물 및 인간 임상 실험 모두에서 보고되었다(참조: Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ,et al. J Virol1991;65(9):4887-92; Richman D, Shih CK, Lowy I,et al. Proc Natl Acad Sci(USA) 1991;88:11241-5; Mellors JW, Dutschman GE, Im GJ, Tramontano E, Winkler SR, Cheng YC.Mol Pharm1992;41:446-51; Richman DD and the ACTG 164/168 Study Team. Second International HIV-1 Drug Resistance Workshop. (Noordwijk, the Netherlands. 1993); 및 Saag MS, Emini EA, Laskin OL,et al. N Engl J Med1993;329:1065-1072). NNRTIL'697,661의 경우, 약물-내성 HIV-1이 치료 시작후 2 내지 6 주만에 나타나는데, 이때 바이러스혈증이 치료전 수준으로 복귀된다(참조: Saag MS, Emini EA, Lsakin OL,et al. N Engl J Med1993;329:1065-1072). 약물-내성 균주 출현과 동시에 나타나는 바이러스혈증 재복귀 현상(breakthrough)은 또한 프로테아제 억제제를 포함한 다른 부류의 HIV-1 억제제로도 보여졌다(참조: Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil K, Mous J. Third Workshop on Viral Resistance. (Gaithersburg, MD. 1993)). 이러한 경험은 HIV-1 약물 내성에 대한 잠재성이 일찍이 HIV-1에 대한 모든 새로운 치료법의 예비임상 평가에서 평가될 수 있도록 실현시켰다.
2',3'-디데옥시-2',3'-디데하이드로-5-플루오로사이티딘(D4FC)은 공지 화합물이다. Ajinomoto Co., Inc.에 의해 출원된 유럽 특허출원 공보 제 0 409 227 A2호에 β-D-D4FC(실시예 2) 및 B형 간염을 치료하기 위한 그의 용도가 개시되었다. Stichting Rega V.Z.W.에 의해 출원된 네덜란드 특허 제 8901258호에 HIV 및 B형 간염("HBV")의 치료용으로서 5-할로게노-2',3'-디데옥시-2',3'-디데하이드로사이티딘 유도체가 일반적으로 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,073,058호에는 유효량의 β-L-D4FC를 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T)과 동시에 또는 순차적으로 투여함을 특징으로 하여 HIV 및 HBV 감염을 치료하는 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,905,070호에는 유효량의 β-D-D4FC를 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T)과 동시에 또는 순차적으로 투여함을 특징으로 하여 HIV 및 HBV 감염을 치료하는 방법이 기술되어 있다.
본 발명의 한가지 목적은 HIV를 치료하기 위해 β-D-D4FC의 최적 투여를 결정하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 β-D-D4FC의 단독 투여시 보다 유리하거나 개선된 약력학, 생체분포, 대사, 내성 또는 그밖의 다른 파라미터를 나타내는, HIV로 감염된 환자를 치료하기 위한 방법 및 β-D-D4FC를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 그밖의 또 다른 목적은 β-D-D4FC와 함께 바이러스에 대해 상승적으로 작용하는 제 2의 화합물과 동시에 또는 순차적으로 β-D-D4FC가 투여되는, HIV로 감염된 환자를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 다른 목적은 HIV의 약물 내성형으로 감염된 환자를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 또 다른 목적은 β-D-D4FC를 최적으로 투여하기 위한 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
β-D-D4FC는 바이러스의 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 및 172 코돈에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견에 기초하여, β-D-D4FC 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을, 이를 필요로 하는 인간에게 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 및 172 코돈 이외의 위치에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 약물과 동시에 또는 순차적으로 투여함을 특징으로 하여 HIV를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명은 공지 항-HIV 약제에 대해 알려진 돌연변이 패턴을 참조하거나, 또는 신규 약제에 대한 돌연변이 패턴을 결정하여 실시될 수 있다.
상기 발견에 기초하여, 다른 항-HIV제에 대해 약물 내성을 나타내는 환자에게 "구제 치료(salvage therapy)"로서 β-D-D4FC를 사용하는 방법이 또한 제공된다. β-D-D4FC는 AZT, DDC, DDI, D4T, 3TC, (-)-FTC 또는 β-L-D4FC에 대해 심각한 교차-내성을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. 이와 대조적으로, β-L-D4FC는 코돈 184(메티오닌에서 발린)에서 돌연변이를 급 유발시켜 3TC 및 FTC에 대한 내성의 수준이 높아지는 결과가 야기된다. β-D-D4FC는 일반적으로 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외에서 돌연변이를 유발하는 약물에 대해 내성을 나타내는 환자에게 구제 치료법으로서 사용될 수 있다.
본 원에 기술된 발명은 더욱 일반적으로 적어도 하기 구체예를 포함한다:
(i) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을, 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외의 위치에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 것으로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 동시에 또는 순차적으로 인간에게 투여함을 특징으로 하여 인간의 HIV 감염을 치료하는 방법.
(ii) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을, HIV-1 역전사효소 영역의 코돈 70에서 K 에서 N(즉, 라이신에서 아스파라긴)으로의 돌연변이, 코돈 90에서 V 에서 I(즉, 발린에서 이소루신)로의 돌연변이 또는 코돈 172에서 R 에서 K(즉, 아르기닌에서 라이신)로의 돌연변이를 유발하는 것으로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘 (AZT), 2',3'-디데옥시이노신 (DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘 (L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 동시에 또는 순차적으로 인간에게 투여함을 특징으로 하여 인간의 HIV 감염을 치료하는 방법.
(iii) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 3TC에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(iv) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 AZT에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(v) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(vi) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(vii) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T)에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(viii) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 2',3'-디데옥시이노신(DDI)에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(ix) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC)에 대해 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
(x) 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 프로드럭 또는 약제학적으로 허용되는 염을 유효량의 (S)-6-클로로-4-사이클로프로필에티닐-4-트리플루오로메틸-1,4-디하이드로-2H-3,1-벤족사진-2-온(SUSTIVA, 미국 특허 제 5,519,021호 참조)과 동시에 또는 순차적으로 투여함을 특징으로 하여 HIV로 감염된 환자를 치료하는 방법.
상기 언급된 동시, 순차 또는 구제 요법은 AIDS-관련 복합증후(ARC), 존속성 전신화 림프절증(PGL), AIDS-관련 신경계 증상, 항-HIV 항체 양성 및 HIV-양성 증상, 카포시육종, 혈소판감소성 자반병 및 기회감염증 감염과 같은 HIV 감염 및 다른 관련 증상을 예방 및 치료하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 제제는 항-HIV 항체 또는 HIV-항원 양성이거나 HIV에 노출된 개체에서 임상적 질병의 진행을 예방적으로 예방 또는 지연시키기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 β-D-D4FC의 도면이다.
도 2는 마이크로몰의 β-D-D4FC 농도에 대한 p24 항원 생성 억제율 %를 나타내는 그래프이다. 이 도면은 β-D-D4FC에 대한 감수성이 감소된 바이러스의 선택성을 나타낸다.
I. 정의
본 원에 사용된 용어 "내성 바이러스"는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 MT2 또는 MT4 세포를 포함하지만 이들로만 한정되지 않는 일정 세포주에서 EC50을 본래 (naive) 바이러스에 비해 3 배, 및 더욱 전형적으로는 5 배이상 증가시키는 바이러스를 의미한다.
용어 D-D4FC는 이후 용어 β-D-D4FC와 혼용하여 사용된다.
본 원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 하나의 광학 이성체 형태"라는 것은 뉴클레오사이드의 단일 에난티오머를 적어도 95 내지 98% 또는 더욱 바람직하게는 99 내지 100%를 포함하는 뉴클레오사이드 조성물을 의미한다. 바람직한 구체예에서, β-D-D4FC는 기술된 어떤 지침에 대해서도 실질적으로 순수한 형태로 투여된다.
본 원에 사용된 용어 "프로드럭(prodrug)"은 D-D4FC의 5' 및 N4아실화, 알킬화 또는 포스포릴화 유도체(안정화된 포스페이트 및 포스포리피드뿐 아니라 모노, 디 및 트리포스페이트 에스테르 포함)를 의미한다. 한 구체예에서, 아실 그룹은 에스테르 그룹의 비-카보닐 부위가 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 알킬, 메톡시메틸을 포함하는 알콕시알킬, 벤질을 포함하는 아르알킬, 페녹시메틸을 포함하는 아릴옥시알킬, 할로겐, 알킬 또는 알콕시에 의해 임의로 치환된 페닐을 포함하는 아릴, 메탄설포닐을 포함하는 알킬 또는 아르알킬 설포닐과 같은 설포네이트 에스테르, 트리틸, 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질, 트리알킬실릴 또는 디페닐메틸실릴중에서 선택되는 카복실산 에스테르이다. 상기 에스테르에서 아릴 그룹은 최적으로 페닐 그룹을 포함한다. 알킬 그룹은 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭이며, 바람직하게는 C1내지 C18이다.
본 원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 수용체에 투여시 직간접적으로 β-D-D4FC를 제공할 수 있거나 그 자체로 활성을 나타내는 약제학적으로 허용되는 염을 나타낸다.
본 원에 사용된 아미노산의 약어를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
II. β-D-D4FC에 의해 선택된 HIV-1 역전사효소에서의 돌연변이
β-2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시-5-플루오로사이티딘(D4FC)의 D- 및 L-에난티오머는 모두 HIV-1의 강력하고 선택적인 억제제로서 D-에난티오머가 더 선택적이다. D-D4FC에 대한 내성의 시험관내 전개는 약제의 농도를 증가시키면서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 MT-2 세포에 HIV-1LAI을 일련적으로 계대배양시켜 평가한다. D-D4FC에 대한 내성 변이체는 약물에 장기간 노출후에만 발생한다. MT-2 세포에서 20회 계대배양후 수득한 바이러스는 D-D4FC에 대해 5.3 배의 내성을 나타낸다. 내성 바이러스는 수회 시도에도 불구하고 PMBC에서 분리할 수 없었다. MT-2 세포에서 선택된 바이러스로부터의 RT의 DNA 서열은 두개의 돌연변이 K65R 및 V179D를 나타내었다. D-D4FC 내성 바이러스의 선택을 MT-2 세포에서 반복하였고, 19.3-배 내성을 나타내는 변이체가 세개의 새로운 RT 돌연변이(K70N, V90I 및 R172K)를 코드화하였다. K65R 재조합 HIV-1LAI바이러스가 D-D4FC에 대해 3.9-배 내성을 나타내었다. 비뉴클레오사이드 RT 억제제에 대해 내성을 제공하는 돌연변이가 K65R에 대한 가장 유망한 보체이다. 단일 및 다중 돌연변이를 갖는 재조합 바이러스를 작제하여 D-D4FC에 대한 내성에 있어서 다른 돌연변이의 역할을 또한 평가하였지만, 시험한 재조합체의 어느 것도 2배 이상의 내성을 나타내지 못하였다.
물질 및 방법
화학약품.
우리 실험실중 한 곳에서 D-D4FC를 이미 알려진 바와 같이(Shi et al, 1999) 합성하였다. 멸균수중 10 mM 원액으로 제조하고, -20 ℃에서 보관하였다. 화합물을 해동시키고, 사용 직전에 원하는 농도로 희석시켰다.
세포.
MT-2 세포(AIDS Research and Reference Reagent Program, National Insitute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, contributed by D. Richman)를 10% 송아지 태자 혈청, 10 mM HEPES 완충액, 페니실린(50 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖)가 보충된 RPMI 1640(Whittaker M.A., Bioproducts, Walkersville, MD)에서 배양하였다.
바이러스.
분자적으로 클로닝한 임상적 분리체, HIV-1LAI을 내성 선택성 및 재조합 돌연변이체 생성에 대한 출발 바이러스로서 사용하였다. 5-10 jig의 프로바이러스 플라스미드 DNA를 1.3×107MT-2 세포에서 일렉트로포레이션하여(electrophorating) HIV-1LAI의 스톡(stock) 제제를 제조하였다. 바이러스 세포변성 효과가 최고조 일 때(일반적으로 트랜스펙션 7 일후), 감염된 배양물로부터 상등액을 수집하여 분취하고, 사용전까지 -80 ℃에서 보관하였다. 바이러스 제제를 MT-2 세포에서 3배 종점 희석에 의해 적정하고, Reed and Muench 식으로부터 TCID50을 산출하였다.
내성 바이러스 선택.
D-D4FC 내성 바이러스를 선택하기 전에, 출발 바이러스(HIV-1LAI)를 세포를 갖지 않는 바이러스로서 약물 부재하에 MT-2 세포에서 10 사이클동안 계대배양하였다. D-D4FC의 농도를 점진적으로 증가시키면서 HIV-1LAI를 MT-2 세포에서 일련적으로 계대배양시켜 D-D4FC 내성 바이러스를 선택하였다. D-D4FC 내성 바이러스에 대한 선택을 2회 수행하였다. 1×106MT-2 세포를 0.01몰의 바이러스로 접종하여 선택을 개시하였다. 바이러스성 세포변성 효과가 최고조일 때(감염후 4 내지 7 일), 감염된 배양물로부터 상등액을 수집하고, 0.1 내지 0.3 ㎖를 다른 감염 사이클을 개시시키기 위해 사용하였다. 상등액을 또한 분취하고, 선택된 바이러스를 특정화하기 위해 -80 ℃에서 보관하였다. 바이러스를 각 농도에서 적어도 3 회 계대배양시켰는데, 주어진 약물 농도에서 사이클 수는 D-D4FC의 특정 농도에서 바이러스를 성장시키는 눙력에 따라 달라진다. 최초 선택 과정동안, 바이러스를 약물의 농도를 증가시키기 전 약물의 부재하에서 1회 계대배양시켰다(표 2 참조). 대조용으로서, 바이러스를 또한 약물의 부재하에서 동시에 계대배양하였다. 최초 선택은 0.75 μM에서 개시하고, 세포가 없는 계대배양의 37 사이클 과정동안 4.0 μM로 서서히 증가시켰다. 제 2 선택은 0.2 μM에서 개시하고, 세포가 없는 계대배양의 27 사이클 과정동안 6.2 μM로 서서히 증가시켰다(표 2 참조).
표 2
항바이러스 감수성 분석
p24 항원 생성 억제%를 측정하여 D-D4FC에 대한 바이러스 감수성을 측정하였다. 간략하면, MT-2 세포(1×105세포/㎖)를 일련의 D-D4FC 희석하에 0.01 moi에서 바이러스로 감염시켰다. 각 희석을 트리플리케이트로 시험하였다. 배양 상등액을 감염 7 일후 수확하고, 시판 어세이(Dupont, NEN Products, Wilmington, Del.)를 사용하여 p24 항원 생성에 대해 분석하였다. 바이러스 감수성을 p24 항원 생성을 50% 까지 억제하는데 필요한 약물의 농도(EC50)로서 나타내었다.
선택된 바이러스 역전사효소의 DNA 서열
선택된 바이러스로부터 바이러스 RNA(vRNA)를 TRIzol 시약(GibcoBRL, Grand Island, NY)을 사용하여 분리하였다. 완전한 길이의 RT 코드 영역을 RT-PCR로 증폭시켰다. 이어서, PCR 생성물을 Wizard PCR preps(Promega, Madison, WI)를 사용하여 정제하고, 서열화하였다.
돌연변이체 재조합 HIV-1 제조
Altered SitesII in vitro Mutagenesis System(Promega, Madison, WI)을 사용하여 돌연변이체 RT를 생성시켰다. 돌연변이유발을 HIV-1LAI상에서 수행하고, RT를 돌연변이유발 벡터(PALTER, Promega)에 클로닝하였다. RT 유전자의 직접 서열로 목적하는 돌연변이체의 존재를 결정하였다. 이어서, 돌연변이체 RT를 pxxHIV-1LAI벡터에 결찰시켰다. 그후, DNA 5-10 ㎍을 상술한 바와 같이 1.3×107MT-2 세포에서 일렉트로포레이션하여 돌연변이체 바이러스의 스톡을 제조하였다.
결과 및 토론
내성 바이러스의 표현형(phenotyping)
MT-2 세포에서 37(선택 #1) 및 20(선택 #2) 감염 사이클후 D-D4FC에 대한 내성 바이러스를 선택하였다. 선택 #1 계대배양 37(p37 D-D4FC #1)로부터의 바이러스에 대한 D-D4FC 감수성 평가는 EC50증가(0.21 μM-4.07 μM)로 입증되는 바와 같이, p37 D-D4FC #1이 야생형보다 D-D4FC에 대해 19.4-배 덜 민감함을 나타낸다(도 2 및 표 3 참조). 선택 #2 계대배양 20(p20 D-D4FC #2)으로부터의 바이러스에 대한 D-D4FC 감수성 평가는 EC50증가(0.21 μM-1.1 μM)로 입증되는 바와 같이, p20 D-D4FC #2가 야생형보다 D-D4FC에 대해 5.3-배 덜 민감함을 나타낸다(도 2 및 표 3참조).
내성 바이러스의 유전자형(genotyping)
p37 D-D4FC #1 및 p20 D-D4FC #2로부터 vRNA를 분리하여 RT-PCR로 증폭시켰다. PCR 생성물의 서열은 p37 D-D4FC #1에 세개의 새로운 돌연변이 (K70N(AAA→4AAT), V901(GTT→ATT) 및 R172K(AGA→AAA))가 존재함을 나타낸다(표 2 참조). 두개의 상이한 돌연변이(K65R(AAA→AGA) 및 V179D(GTT→GAT))가 p20 D-D4FC #2에서 동정되었다(표 3). 이들 바이러스(아미노산 8-330로부터의)로부터의 RT 유전자에서 다른 돌연변이는 확인되지 않았다. 또한, 약물없이 동시에 계대배양된 대조 바이러스에서도 돌연변이는 발견되지 않았다.
상이한 관련 돌연변이를 갖는 D-D4FC 내성 바이러스를 분리함으로써 D-D4FC 내성 바이러스를 분리하기 위해 상이한 선택 기술이 사용될 수 있도록 하였다. 선택 #1에서, 약물의 농도를 증가시키기 전 감염 1 사이클동안 선택 압력을 제거하였다. 이것은 제 2 선택 과정동안에는 행해지지 않았다. 또한, 각 선택 과정을 위해 사용된 D-D4FC의 출발 농도가 약 3-배 달라졌다. 선택 #1에 대해 더 높은 약물 농도(0.75 μM)를 사용하였다. 이들 두 차이는 선택된 바이러스에서 관찰되는 상이한 돌연변이 때문인 것으로 여겨진다.
돌연변이체 재조합 HIV-1
선택된 바이러스에서 동정된 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 재조합 HIV-1을 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. 표 4는 생성된 각 돌연변이체 재조합 바이러스뿐만 아니라 상응하는 EC50을 나타낸다. xxHIV-1LAI, K65R 바이러스가 D-D4FC에 대한 감수성을 3.9-배 감소시킨 반면, 다른 바이러스중에서 3.0 배 이상의 내성을 나타내는 것은 없었다. 그러나, 삼중 돌연변이체(xxHIV-1LAI, K70N/V90I/R172K)가 잘 성장하지 못하고, 이는 시험관내에서 선택된 바이러스로부터 관찰되는 내성을 재현할 수 없는 것의 원인일 수 있음을 주목하여야 한다.
표 3
MT-2 세포에서 D-D4FC 선택된 바이러스의 감수성 및 관련 돌연변이
표 4
MT-2 세포에서 재조합 HIV-1의 D-D4FC 감수성
표 5는 상당히 감염된 인간 PBM 세포에서(6 일) D-D4FC 단독에 대해서, 및AZT 및 D4T와 배합시 평균 유효 농도 및 조합 지수(C.I.)값을 제공한다. 표 6은 클로닝된 바이러스 I 인간 PBM 세포 및 HIV-1에 대한 β-D- 및 β-L-D4FC의 효과를 나타낸다.
표 5
상당히 감염된 인간 PBM 세포에서(6 일) D-D4FC 단독에 대해서, 및 AZT 및
D4T와 배합시 평균 유효 농도 및 조합 지수(C.I.)값
am 은 기울기 ±S.E.이고, EC50은 유효 농도이며, r은 평균 효과 플럿으로부터 결정된 것으로서 상관계수이다.
bC.I.가 1보다 작거나 1과 같거나 1보다 크다는 것은 각각 상승, 상가 및 길항을 나타낸다. Fa는 영향받은 시스템 부분에 대한 평균 효과 방정식의 성분이다(예를 들어 0.50은 50% 감소된 RT 활성에서의 C.I.를 나타낸다). C.I.값은 비배타적 상호작용에 대해 결정되었다(이탤릭 값은 배타적 상호작용에 대한 값이며, 덜 유효하다).
표 6
인간 PBM 세포에서 HIV-1 및 클로닝된 바이러스에 대한 β-D- 및 β-L-D4FC의 효과
FI50= HIV-1LAV또는 xxBRUPITT로부터의 내성 바이러스 EC50데이터로부터 얻은 EC50데이터.
FI90= HIV-1LAV또는 xxBRUPITT로부터의 내성 바이러스 EC90데이터로부터 얻은EC90데이터.
굵은 글씨체 값은 FI>10임을 나타낸다.
aMT-2 세포에서: Dr. J. Mellors(Pittsburgh)의 Cortesy
b추가의 돌연변이: 203D, 207A, 211K, 214F, 245M, 277N, 283I, 284K, 200D, 311R.
III. 동시 또는 교대 HIV-제
일반적으로, 순차 치료동안, 각 제제의 유효 용량은 일련적으로 투여되는 반면, 동시 치료의 경우에는, 유효한 용량의 2 이상의 제제가 함께 투여된다. 예를 들어 순차 치료의 경우, 하나이상의 제 1 제제가 바이러스 감염을 치료하기에 효과적인 시간동안 유효한 양으로 투여된 후, 치료 과정에서 제 1 제제를 대신하는 하나이상의 제 2 제제가 마찬가지로 유효 시간동안 유효한 양으로 투여될 수 있다.
용량은 각 약물의 흡수, 생체분포, 대사 및 배출 비율뿐만 아니라 당업자들에 알려진 다른 요인에 따라 달라질 것이다. 용량값은 또한 경감될 증상 중증도에 따라서도 달라질 것이다. 또한 개체 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 관리하는 사람의 전문적 판단에 의해 특정 목적, 특정 용량 섭생법 및 스케줄이 시간에 따라 조정될 수 있다. 뉴클레오사이드 유도체(예: AZT, D4T, DDI 및 3TC) 또는 프로테아제 억제제, 예를 들어 넬피라비르 및 인디나비르를 포함한 항-HIV 화합물에 대한 적합한 용량 범위의 예는 과학 문헌 및 Physicians Desk Reference에서 확인할 수 있다. 본 원에 기술된 다른 화합물에 대한 적합한 용량 범위의 다양한예가 또한 공공 문헌에 나타나 있거나, 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이들 용량 범위는 목적하는 결과를 얻기 위하여 원하는 바대로 변경될 수 있다.
바람직한 구체예에서, D-D4FC는 프로테아제 억제제와 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, D-D4FC는 인디나비르(Crixivan), 넬피나비르([3S-[2(2S*,3S*),3-알파-4-a-베타,8a-베타-]]-N-(1,1-디메틸에틸)데카하이드로-2-)2-하이드록시-3-[(3-하이드록시-2-메틸벤조일)아미노]-4-(페닐티오)부틸]-3-이소퀴놀린카복스아미드 모노-메탄설포네이트)(Viracept), 사퀴나피르(Invirase) 또는 141W94(암프레나비르; (S)-테트라하이드로푸란-3-일-N-[((1S,2R)-3-[N-[(4-아미노페닐)설포닐]-N-이소부틸아미노]-1-벤질-2-하이드록시프로필]카바메이트; 또는 에파비렌즈 (S)-6-클로로-4-(사이클로프로필에티닐)-1,4-디하이드로-4-(트리플루오로메틸)-2H-3,1-벤족사진-2-온)과 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
다른 바람직한 구체예에서, D-D4FC는 (1S,4R)-4-[2-아미노-6-사이클로프로필아미노)-9H-퓨린-9-일]-2-사이클로펜텐-1-메탄올 숙시네이트인 아바카비르(1592U 89)를 포함한 뉴클레오사이드 유사체와 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
다른 구체예에서, D-D4FC는 DMP-266 ((S)-6-클로로-4-사이클로프로필에티닐-4-트리플루오로메틸-1,4-디하이드로-2H-3,1-벤족사진-2-온(SUSTIVA, 참조: 미국 특허 제 5,519,021호); 델라비르딘, (1-[3-(1-메틸에틸)아미노]-2-피리디닐-4-[[5-[(메틸설포닐)아미노]-1H-인돌-2-일]카보닐]-, 모노에탄설포네이트), 네비라핀 또는 델라르비르딘과 같은 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제와 동시에 투여된다.
또 다른 구체예에서, D-D4FC는 HIV-인테그라제 억제제 또는 케모킨 억제제와동시에 또는 순차적으로 투여된다.
II. HIV 게놈의 D-D4FC 유도된 돌연변이 분석
Larder 등에 의한 미국 특허 제 5,409,801호에 AZT에 대해 기재된 것과 유사하지만 D-D4FC에 대한 돌연변이 특성에 기초한 방법 및 키트를 사용하여 D-D4FC 유도된 돌연변이 존재를 분석하고 이에 따라 본 원에서 제시하는 발명의 대상을 알아볼 수 있다. Larder 특허의 내용을 참고로 인용한 것과 더불어, 이들 기술을 이후 설명한다.
본 발명의 한 측면으로,
(i) 샘플로부터 핵산을 분리하고;
(ii) 올리고뉴클레오타이드를 핵산으로 하이브리드화시킨 후(이때 올리고뉴클레오타이드는 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 돌연변이체 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역에 상보적이다);
(iii) 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단으로부터 핵산을 중합시키고;
(iv) 올리고뉴클레오타이드 프라이머 연장된 생성물이 존재하는지의 여부를 확인함을 특징으로 하여 D-D4FC에 대한 HIV-1 샘플의 감수성을 평가하는 방법이 제공된다.
상기 방법에서 HIV-1 샘플로부터 분리한 게놈 DNA 또는 RNA를 사용하는 것이 가능하다. HIV-1 분리체의 성장을 유지하는데 적합한 세포를 일정시간동안 인큐베이션한다. 새포를 원심분리에 의해 회수한다. 그후, 세포를 EDTA의 존재하에서 프로테이나제 K 및 SDS와 같은 세정제로 분해한 후, 페놀로 추출하여 DNA를 분리할 수 있다.
샘플로부터 DNA를 분리하기 위해 공지된 추출 및 정제 방법이 사용될 수 있다. 하기 방법을 이용하여 RNA를 분리할 수 있다. 적합한 세포를 감염시키고, 일정 시간동안 인큐베이션한다. 세포를 원심분리에 의해 회수한다. 세포를 RNA 추출 완충액에 재현탁시킨 다음, 프로테이나제 분해 완충액으로 분해하고, 프로테이나제 K로 분해한다. 페놀/클로로포름 혼합물의 존재하에서 프로테인을 제거한다. 그후, RNA를 추가의 원심분리 단계에 따라 회수할 수 있다(참조: Maniatis, T., et al, Molecular Coning, A laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).
증폭되지 않은 핵산이 사용가능하더라도, HIV-1 샘플에서 핵산이 상대적으로 부족하기 때문에 증폭시키는 것이 바람직하다. 핵산은 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)의 기술(이는 소량의 템플레이트로부터 정해진 길이 및 서열의 특정 핵산 프래그먼트를 다량 생산하는 시험관내 방법이다)을 이용하여 선택적으로 증폭시킬 수 있다.
PCR은 프라이머를 사용하여 RT 유전자를 증폭시키기 위한 Mg2+농도, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 온도 사이클 조건을 사용한 표준 반응물로 구성된다. 프라이머는 RT 유전자 전체 또는 돌연변이된 코돈을 포함하는 HIV-1의 야생형 DNA 서열 영역에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하고 있는 선택된 서열만을 증폭시키도록 선택된다.
RNA는 PCR에 의해 직접 증폭시킬 수 없다. 그의 상응하는 cDNA를 합성하여야 한다. cDNA의 합성은 일반적으로 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라임된 역전사에 의해 수행된다. 유리하게, 프라이머는 이들이 RT에 대한 핵산 서열, 또는 야생형 DNA 서열에 상응하는 RNA 영역 또는 역전사효소 영역의 70번째(K 에서 N), 90번째 또는 172번째 코돈에 상응하는 돌연변이체 DNA 서열 영역에 상응하는 뉴클레오타이드를 포함하는 선택된 서열을 증폭하도록 선택된다. 이것은 야생형 DNA 서열의 상응하는 서열에 대해 상행인 RNA 스트랜드 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제조함으로써 달성될 수 있다. 그후, 이러한 방법(상기 언급된 Maniatis, T., et al. 참조)으로 제조한 cDNA를 상기에서 이미 언급한 바와 동일한 방식으로 사용할 수 있다.
방법의 다음 단계는 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 돌연변이체 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 핵산으로 하이브리드화하는 것이다.
이후, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3'-말단으로부터 핵산을 중합시킬 수 있는 조건 및 시약이 제공된다. 이러한 중합반응은 당업계에 잘 알려져 있다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머가 그의 3'-말단에 돌연변이체 유전자형, 즉 RT 영역의 70번째(K 에서 N), 90번째 또는 172번째 코돈에 뉴클레오타이드가 변화된 유전자형에 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다면, 핵산 서열의 중합은 샘플의 핵산이 돌연변이체 유전자형과 동일한 경우에만 일어날 것이다. 샘플의 핵산 서열 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 3'-말단에서 뉴클레오타이드가 매치되지 않기 때문에 야생형 핵산 서열의 중합은 일어나지 않거나, 적어도 상당한 정도로는일어나지 않을 것이다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머가 그의 3'-말단에 야생형 유전자형, 즉 RT 영역의 70번째(K 에서 N), 90번째 또는 172번째 코돈에 야생형 뉴클레오타이드를 갖는 유전자형에 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다면, 상기 위치에서 야생형인 핵산 서열이 중합될 것이다. 3'-위치에서 돌연변이체 뉴클레오타이드를 갖는 핵산은 중합되지 않을 것이다.
각 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 길이는 15 내지 20 뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드는 당업자들에 이미 공지된 방법론에 따라 제조될 수 있으며(참조: Koster, H., Drug Research, 30 p548(1980); Koster, H., Tetrahedron Letters p1527(1972); Caruthers, Tetrahedron Letters, p719(1980); Tetrahedron Letters, p1859(1981); Tetrahedron Letters 24, p245(1983); Gate. M. Nucleic Acid Research, 8, p1081(1980)), 일반적으로 Applied Biosystems 381A 합성기와 같은 자동 DNA 합성기를 사용하여 제조된다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머 연장된 생성물의 존재유무를 결정하는 것이 편리하다. 상기 검출을 수행하기 위한 수단은 적합한 표지를 이용하는 것이다.
표지는 편리하게는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프라이머 연장된 중합 생성물과 결합하는 특정의 다른 분자에 부착시킬 수 있다.
표지는 예를 들어 효소, 방사성동위원소 또는 플루오로크롬일 수 있다. 바람직한 표지는 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소에 콘쥬게이트된 스트렙타비딘을 사용하여 검출할 수 있는 바이오틴일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 연장된 중합 생성물의 존재유무는 예를 들어 아가로스 겔상에서 중합반응을 수행하고, 에티듐 브로마이드로 표지된 특정 DNA 프래그먼트를 관찰하여 검출하거나, 중합된 생성물에 상응하는 밴드의 존재 유무를 검출하기 위한 서던블롯 및 방사선사진으로 검출할 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오타이드에만 상응하는 주요 밴드가 존재하는 경우, 이것은 중합이 일어났음을 나타낸다. 정확히 예견된 크기의 밴드가 존재한다면 이는 중합이 일어났음을 의미한다.
예를 들어, 본 원에 기술된 바와 같이, 환자의 림프구로부터 분리된 DNA는 증폭된 서열과 매치되거나 매치되지 않는 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 대한 템플레이트로서 사용된다. 상기 돌연변이 검출시 PCR의 실행가능성은 이미 입증되었다. Amplification Refractory Mutation 시스템("ARMS")을 사용한 PCR(참조: Newton, C.R., et al. Nucleic Acis Research, 17, p2503, (1989)). 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단이 돌연변이체 또는 야생형 서열과 매치되거나 매치되지 않도록 특정 돌연변이를 포함하기 위하여 인접한 영역에 어닐링된 합성 뉴클레오타이드가 제조된다. PCR을 수행하여 매치된 DNA 프래그먼트(겔 전기영동 사용)를 동정하거나. 매치되지 않은 프래그먼트를 동정하지 못했다.
DNA를 본 원에 기술된 바와 같이 HIV-1 감염된 T-세포로부터 추출하고, 이 프라이머를 사용하여 "ARMS"PCR 분석을 수행하였다.
상기 언급된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여, 즉 보상 DNA만이 하이브리드되도록 하는 엄격한 조건하에서 증폭된 DNA 프래그먼트에 표지될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 중합을 시도함으로써 프래그먼트의 존재를 확인하였다(유일한 차이는 "ARMS" 방법에 의해 증폭된 DNA 프래그먼트가 돌연변이체로부터 유도되는지 야생형 DNA로부터 유도되는지에 상관없이 동일할 것이기 때문에 차동(differential) 하이브리드화가 수행될 필요가 없어 일반적인 올리고뉴클레오타이드가 이들 프래그먼트의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 HIV-1 균주중에서 보존되는 DNA 프래그먼트내 DNA 서열로부터 유도된다).
상기 PCR 분석은 바이러스 수득을 위해 배양되지 않은 감염 개체로부터의 PBL 샘플로부터 얻은 DNA중의 D-D4FC 내성과 관련된 돌연변이를 직접 검출할 수 있도록 하기에 적합할 수 있다. 이 물질은 일반적으로 감염된 림프양 배양물의 것보다 HIV-1 DNA를 훨씬 덜 함유하기 때문에 샘플에서 표적 HIV-1 RT DNA 시그널의 양을 증가시키기 위해 "이중 PCR(또는 네스트된 세트(nested set))" 프로토콜이 사용될 수 있다(참조: Simmonds, P., Balfe, P, Peutherer, J.F., Ludlam, C.A., Bishop, J.O. 및 Leigh Brown, A.J., J. Virol., 64, 864-872(1990)). 이중 PCR은 희귀한 템플레이트 서열의 제한된 증폭 문제를 극복하였다. 야생형 및 돌연변이체 잔기가 식별되도록 디자인된 프라이머 쌍을 사용하여 소량의 예비증폭된 물질을 제 2 PCR에 사용할 수 있다.
본 발명의 제 1 측면에 따른 방법을 사용하는 D-D4FC에 대한 HIV-1 샘플의 내성 상태를 알아보기 위한 분석에 사용하기에 적합한 시험 키트는 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 본 원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 DNA서열 영역, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단으로부터 핵산을 중합시키는데 필요한 다른 물질 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 연장된 생성물의 존재유무를 결정하기 위한 수단을 포함한다. 여기에서 다른 물질로는 적합한 효소, 완충액 및 세척 용액, 및 필요에 따라 표지 및 표지용 기질이 포함된다. PCR이 핵산을 증폭시키기 위하여 사용된 경우, 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 본 원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역을 증폭시킬 수 있는 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 dNPT와 같은 추가의 물질이 포함되어야 한다.
본 발명의 제 2 측면으로,
(i) 샘플로부터 핵산을 분리하고;
(ii) RT 영역의 70번째(K 에서 N), 90번째 또는 172번째 코돈 영역에 있는 하나이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 도 1에 도시된 돌연변이체 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드로 핵산을 하이브리드화시킨 후;
(iii) 핵산 및 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드가 이들 위치중 한 곳에서 상보적 뉴클레오타이드를 가지는지의 여부를 확인함을 특징으로 하여 D-D4FC에 대한 HIV-1 샘플의 감수성을 확인하는 방법이 제공된다.
바람직하게, 올리고뉴클레오타이드는 그의 보체와 완전히 매치된 하이브리드를 형성하도록 디자인된다.
본 발명의 제 1 측면에 기술된 방법에 따라 샘플로부터 핵산(DNA 또는 RNA)을 분리한다.
유사하게, RT DNA(또는 그의 상응하는 RNA) 또는 바람직하게는 지정된 위치에 있는 하나이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 DNA(또는 그의 상응하는 RNA)를 포함하는 RT DNA(또는 그의 상응하는 RNA) 영역을 증폭시키기 위해 PCR이 사용될 수 있다.
상기 방법의 제 2 단계에서, 핵산을 사용하여 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 돌연변이체 DNA 서열 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화시킨다.
올리고뉴클레오타이드는 시험되는 관심의 대상인 뉴클레오타이드 위치의 수에 따라 달라지는 길이의 것일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드가 관심의 대상인 오직 하나의 위치에서 뉴클레오타이드를 포함하도록 디자인된 경우, 이 뉴클레오타이드는 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드의 중심 위치에 있거나, 이에 근접해 있다.
올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열이 매치된 하이브리드를 형성하는지의 여부를 확인하기 위해, 역전사효소 영역의 70번째(K 에서 N), 90번째 또는 172번째 코돈의 뉴클레오타이드(들)가 상응하는 뉴클레오타이드 또는 하이브리드화되거나 하이브리드화되지 않은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드에 상보적인 경우에만 하이브리드가 형성되도록 특정 하이브리드화 조건을 설정한다. 특이성을 보장하기에 충분히 엄격한 조건을 밝히기 위해 하이브리드화 단계를 수행하기 전에 예를 들어 반응온도 및 염 용액의 농도를 확정하는 것이 중요하다(참조: Maniatis,T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, (1989)). 올리고뉴클레오타이드 프로브가 역전사효소 영역의 70번째(K 에서 N), 90번째 또는 172번째 코돈에 상응하는 하나이상의 그의 뉴클레오타이드에서 야생형 핵산 서열에 상보적인 DNA 서열을 갖는 다면, 이 올리고뉴클레오타이드는 야생형 핵산과 완전히 하이브리드화할 것이다. 야생형 핵산과 완전히 하이브리드화하지 않는다면. 하이브리드화가 없다면 이는 샘플로부터 분리된 핵산이 하나이상의 돌연변이를 함유하는 것을 암시한다.
올리고뉴클레오타이드 프로브가 돌연변이체 핵산 서열에 상보적인 DNA 서열을 갖는 다면, 이 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이체 핵산과 완전히 하이브리드화할 것이다. 하이브리드화가 없다면 이는 샘플로부터 분리된 핵산이 돌연변이(들)를 함유하지 않는 것을 암시한다. 올리고뉴클레오타이드 프로브를 본 발명의 제 1 측면에 대한 것과 같이 검출 수단으로 표지화할 수 있다.
하이브리드화 및 비하이브리드된 핵산 제거는 상보적 DNA 만을 하이브리드화시키고 매치되지 않은 올리고뉴클레오타이드는 하이브리드화시키지 않는 엄격한 조건하에서 수행된다(즉, β-글로빈 또는 HLA-DQα유전자를 사용하여 시클(sickle) 세포 돌연변이 검출을 위해 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 특이적 하이브리드화(참조: Saikt, R.K., et al., Nature, 324, p163, (1986), 활성화 Ras 유전자(참조: Ver Laan-de, Vries, M., et al., Gene, 50, 313, (1986) 및 β-탈라세미아(thalassaemia)(참조: Wong, C., et al., Nature, 330, p384, (1987)).
하이브리드화는 니트로셀룰로스, 나일론 또는 다른 고체 매트릭스상에 RT 핵산 서열을 고정시켜(예를 들어 도트-블롯) 수행할 수 있다. 표지 수단을 이용하여 하이브리드 존재유무를 결정하는 것이 편리하다. 예를 들어, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 적합하게는 효소, 방사성동위원소 또는 플루오로크롬을 사용하여 표지될 수 있다. 바람직한 표지는 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소에 콘쥬게이트된 스트렙타비딘을 사용하여 검출될 수 있는 바이오틴일 수 있다.
한편, 하이브리드화는 상기 언급된 표지되지 않은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 상기 언급된 고체 지지체상에 고정시키고, 이어서 앞서 언급된 표지된 RT 핵산으로 하이브리드화시켜 수행할 수 있다.
하이브리드화에 대해 언급된 상기 두 경우에 있어서, 효과적인 하이브리드화가 일어났는지를 확인하기 위하여 적합한 조절 반응이 도입될 수 있다(예를 들어, 상보적 올리고뉴클레오타이드에 대한 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화).
분리된 핵산이 야생형 올리고뉴클레오타이드 또는 돌연변이체 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화되기 때문에 결과는 용이하게 해석된다.
본 발명의 제 2 측면에 따른 방법을 사용하는 D-D4FC에 대한 HIV-1 샘플의 감수성을 알아보기 위한 분석에 사용하기에 적합한 시험 키트는 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 돌연변이체 DNA 서열의 영구적인 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 및 하이브리드화에 필요한 다른 물질을 포함한다. 이러한 다른 물질로는 적합한 완충액 및 세척 용액, 및 필요에 따라 표지 및 표지용 기질이 포함된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 표지화된다. 하이브리드화전에 PCR이 핵산을 증폭시키기 위하여 사용되는 경우, 야생형 DNA 서열(또는 그의 상응하는 RNA) 영역 또는 돌연변이체 DNA 서열 영역을 증폭시킬 수 있는 적합한 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 적합한 효소 및 dNTP(데옥시 뉴클레오타이드 트리포스페이트)와 같은 추가의 물질이 포함되어야 한다.
분석의 한 대체 포멧으로, 증폭 dNTP를 방사성동위원소, 바이오틴, 플루오로크롬 또는 효소와 같은 검출 분자와 커플링시키거나 커플링시키지 않을 수 있다.
또한, RNA 증폭 시스템을 사용하여 임상 샘플로부터 분리한 HIV-1 RT RNA에서 지도부딘 내성 돌연변이를 검출할 수 있다. Guatelli 등에 의해 기술된 방법론(참조: Proc. Natl. Acad. Sci, (USA), 8/7, 1874-1878, (March 1990))에 따라, 레트로바이러스 복제에 필수적인 세개의 효소(역전사효소, RNase H 및 DNA-의존 RNA 폴리머라제) 활성을 이용하여 표적 핵산 서열을 시험관내에서 등온 조건하에 지수적으로 복제(증폭)할 수 있다. 이 방법은 앞서 언급된 야생형 뉴클레오타이드로부터 돌연변이체를 식별하기 위한 하이드리드화 단계후 이용될 수 있다.
약제학적 조성물 제제
본 원에 언급되어 있는 질병, 특히 HIV 감염에 의한 영향으로 고통받는 환자에게 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 존재하의 유효량의 D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 본 원에 상세히 기술된 지침 또는 투여 양태로 투여하여 상기 질병, 특히 HIV 감염에 의한 영향으로 고통받는 인간을 치료할 수 있다. 활성 물질은 액체 또는 고체 형태로 하여 적절한 경로, 예를 들어 경구적으로, 비경구적으로, 장내로, 정맥내로, 피내로, 피하적으로, 경피적으로, 비내로 또는 국소적으로 투여된다.
활성 화합물(들)은 치료 환자에게 심각한 독성효과없이 생체내 바이러스 복제, 특히 HIV 복제를 억제하기에 치료적으로 유효한 양의 화합물을 환자에게 전달하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제내에 포함된다. "억제량"은 예를 들어 본 원에 기술된 것과 같은 분석에 의해 특정된 바 억제 효과를 나타내기에 충분한 활성 성분의 양을 의미한다.
상기 언급된 모든 증상에 바람직한 화합물 용량은 1 일 체중 1 ㎏당 약 1 내지 75 ㎎, 바람직하게는 1 내지 20 ㎎, 더욱 일반적으로는 1 일 수용체 체중 1 ㎏당 0.1 내지 약 100 ㎎이다. 약제학적으로 허용되는 유도체의 유효한 용량 범위는 전달되는 모 뉴클레오사이드의 중량을 기준으로 하여 산정될 수 있다. 유도체가 그 자체로 활성을 나타낸다면, 유효 용량은 유도체의 중량을 사용하여 상술된 바와 같이 평가될 수 있거나, 또는 당업자들에 공지된 다른 수단으로 평가될 수 있다.
화합물은 편리하게는 단위 용량 형태당 활성 성분 7 내지 3,000 ㎎, 바람직하게는 70 내지 1,400 ㎎을 함유하지만 이들로 제한되지 않는 적합한 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 50 내지 1,000 ㎎의 경구적 용량이 일반적으로 편리하다.
이상적으로, 활성 성분은 약 0.02 내지 70 마이크로몰, 바람직하게는 약 0.5 내지 10 mM의 활성 화합물의 최대 혈장 농도를 이루도록 투여되어야 한다. 이것은 예를 들어 임의로 염수중 활성 성분의 0.1 내지 25% 용액을 정맥내 주사하거나 활성 성분을 거환제로서 투여함으로써 달성할 수 있다.
약제 조성물중의 활성 화합물의 농도는 약물 흡수, 생체분포, 대사 및 배출 비율뿐만 아니라 당업자들에 알려진 다른 요인에 따라 달라질 것이다. 용량값은 또한 경감될 증상 중증도에 따라서도 달라질 것이다. 또한, 개체 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 관리하는 사람의 전문적 판단에 의해 특정 목적, 특정 용량 섭생법 및 스케줄이 시간에 따라 조정되어야 하며, 본 원에 기술된 농도 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 조성물의 영역 또는 실시를 제한하고자 하기 위한 것은 아니다. 활성 성분은 한번에 투여될 수 있거나, 수회 소 용량으로 나누어 다양한 시간 간격으로 투여될 수 있다.
활성 화합물의 바람직한 투여 형태는 경구투여이다. 경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체중에 포함될 것이다. 이들은 젤라틴 캅셀에 함침될 수 있거나, 정제로 타정될 수 있다. 경구적 치료 투여 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제에 함침되어 정제, 트로키제 또는 캅셀제의 형태로 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 결합제 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다.
정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은 하기 성분, 또는 유사한 특성의 화합물중 어느 것을 함유할 수 있다: 미정질 셀룰로스, 트라가칸드검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, Primogel 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotes와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활주제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제와 같은 향미제. 용량 단위 형태가 캅셀제인경우, 이것은 상기 유형의 물질 이외에도 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 또한, 용량 단위 형태는 복용 단위의 물리적 형태를 변경시키는 각종 다른 물질, 예를 들어 당코팅, 셸락, 또는 다른 장용피제를 함유할 수도 있다.
화합물은 엘릭서르, 현탁제, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 성분으로 투여될 수 있다. 시럽은 활성 화합물 이외에 감미제로서 수크로스 및 특정 방부제, 염료 및 착색제 및 향미제를 함유할 수 있다.
화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 유도체 또는 이들의 염은 또한 목적하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 목적하는 작용을 보충하는 물질, 예를 들어 상기에 상세히 기술된 항생제, 항진균제, 항염증제, 프로테아제 억제제 또는 다른 뉴클레오사이드 또는 비뉴클레오사이드 항바이러스제와 혼합될 수 있다. 비경구, 피내, 피하 또는 국소 적용용으로 사용되는 용액 또는 현탁제는 하기 성분들을 포함할 수 있다: 주사용수, 염용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 폴리프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 무균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로제와 같은 장성 조절제. 비경구적 제제는 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리나 플라스틱으로 만들어진 다중 용량 바이알에 투입될 수 있다.
정맥내로 투여되는 경우, 바람직한 담체는 생리식염수 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)이다.
리포좀성 현탁제(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체로 감염된 세포로 표적되는 리포좀 포함)가 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 바람직하다. 이들은 당업자에 공지된 방법, 예를 들어 미국 특허 제 4,522,811호(그의 내용이 본 원에 참고로 인용된다)에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제제는 적합한 리피드(들)(예를 들어 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤과 같은)를 무기 용매에 용해시킨 후, 증발시켜 용기 표면상에 건조된 리피드의 박막을 형성시킴으로써 제조할 수 있다. 그후, 활성 화합물 또는 그의 모노포스페이트, 디포스페이트 및/또는 트리포스페이트 유도체의 수용액을 용기에 도입한다. 그후, 용기를 손으로 용기의 표면으로부터 리피드 물질이 떨어져 나가 리피드 응집물이 분산될 때까지 와동시켜 리포좀성 현탁제를 수득한다.
서방성 제제
서방성 제제에 대해 본 부분에 인용된 모든 미국 특허는 그의 내용이 참고로 포함된다.
생분해가능한 중합체 분야는 폴리락트산의 합성 및 생분해성이 1966년에 Kulkarni에 의해 보고된 이후로 급속히 발달되었다(참조: "Polylatic acid for surgical implants",Arch. Surg., 93:839). 전달 장치용 매트릭스 물질로서 유용한 것으로 보고된 다른 중합체의 예로 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜라이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드와 같은 폴리에스테르, 폴리라이신과 같은 폴리아미노산, 폴리에틸렌 옥사이드의 중합체 및 공중합체, 아크릴 종결된 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리오르토에스테르, 폴리아크릴로니트릴 및 폴리포스파젠이 포함된다. 참조예: Langer에 의한 미국 특허 제 4,891,225호 및 4,906,474호(폴리언하이드라이드), Hutchinson에 의한 4,767,628호(폴리락타이드, 폴리락타이드-코-글리콜라이드 산) 및 Tice 등에 의한 4,530,840호(폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 및 공중합체). 또한, Hubbell 등에 의한 미국 특허 제 5,626,863호(조직 접착 물질 및 서방성 담체로서 광중합가능한 생분해성 하이드로겔(중합 및 가교결합될 수 있는 말단 종결된 모노머 또는 올리고머인 생분해성 모노머 또는 올리고머 확장기를 갖는 친수성 올리고머를 포함하는 중합 및 가교결합된 마크로머의 하이드로겔)을 기술하고 있다); 및 Focal, Inc.에 의해 출원된 PCT WO 제 97/05185호(조직 처리제 및 약물 전달용 서방성 제제로서 사용하기 위한 멀티블록 생분해성 하이드로겔에 대해 개시하고 있다) 참조.
생물학적 기원의 생분해가능한 물질, 예를 들어 가교결합된 젤라틴이 이미 알려져 있다. 히알우론산은 가교결합되었고, 생체의학 적용용의 분해성 팽윤 중합체로 사용되고 있다(참조: Della Valle 등에 의한 미국 특허 제 4,957,744호; (1991) "Surface modification of polymeric biomaterials for reduced thrombogenicity":,Polym. Mater. Sci. Eng., 62:731-735).
많은 분산 시스템이 현재 물질, 특히 생물학적 활성 화합물의 담체로서 사용되고 있거나 연구되고 있다. 약제학적 및 화장품 제제로서 사용되는 분산 시스템은 현탁액 또는 유제로서 구분되어 있다. 현탁액은 현탁화제를 사용하여 액체 매질중에 분산된 수 나노미터에서 수백 미크론에 이르는 크기의 고체 입자로서 정의된다. 고체 입자로는 마이크로스피어, 마크로캅셀 및 나노스피어가 포함된다. 유제는 계면활성제 및 리피드와 같은 유화제의 계면필름에 의해 안정화된 다른 한 액체중의 분산물로서 정의된다. 유제는 유중수 및 수중유 유제, 다중 유제, 마이크로에멀젼, 마이크로드롭렛 및 리포좀을 포함한다. 마이크로드롭렛은 Haynes에 의한 미국 특허 제 4,622,219호 및 4,725,442호에 정의된 바와 같이 내부에 오일상을 갖는 구상 리피드층으로 구성된 단일박막층(unilamellar) 포스포리피드 비시클(vesicle)이다. 리포좀은 수불용성 극성 리피드를 수용액과 혼합하여 제조된 포스포리피드 비시클이다. 물에서 불용성 리피드와 혼합함으로써 야기되는 바림직하지 않은 엔트로피는 수용액을 포획하고 있는 포스포리피드의 동심 밀폐된 막의 매우 정돈된 어셈블리를 형성한다.
Dunn 등에 의한 미국 특허 제 4,938,763호는 비반응성 수불용성 열가소성 중합체를 생체적합한 수용성 용매에 용해시켜 액체를 수득하고, 액체를 체내에 삽입한 후, 용매를 분산시켜 고체 임플란트를 형성시킴으로써 원위치에서 임플란트를 형성하는 방법을 기술하고 있다. 중합체 용액을 주사기로 체내에 도입할 수도 있다. 임플란트는 그의 주변 공동 형태인 것으로 가정된다. 또 다른 구체예에서, 임플란트는 용매를 함유하지 않으며 일반적으로 경화 촉매 첨가시 적소에서 경화되어 고체를 형성하는 반응성 액체 올리고머 중합체로부터 형성된다.
다수의 특허가 D-D4FC 또는 뉴클레오타이드 또는 그의 정의된 다른 프로드럭을 투여하기 위해 사용될 수 있는 약물 전달 시스템을 개시하고 있다. 미국 특허 제 5,749,847호는 뉴클레오타이드를 일렉트로포레이션에 의해 유기체에 전달하는방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,718,921호는 중합체 및 여기에 분산된 약물을 포함하는 마이크로스피어를 개시하고 있다. 미국 특허 제 5,629,009호는 생체활성 인자를 서방적으로 방출하기 위한 전달 시스템을 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,578,325호는 비선형 친수성 소수성 멀티블록 공중합체의 나노입자 및 마이크로입자를 기재하고 있다. 미국 특허 제 5,545,409호는 생체활성 인자를 서방적으로 방출하기 위한 전달 시스템을 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,494,682호는 이온적으로 가교결합된 중합 마이크로캅셀을 개시하고 있다.
Andrx Pharmaceuticals, Inc.에 의한 미국 특허 제 5,728,402호는 하이드로겔 형성제와 함께 활성 약물, 그의 염 또는 프로드럭을 갖는 내부상 및 위에서 용해되지 않는 코팅을 갖는 외부상을 포함하는 서방성 제제를 기술하고 있다. Andrx Pharmaceuticals, Inc.에 의한 미국 특허 제 5,736,159호 및 5,558,879호는 통로가 원 위치에(in situ) 형성되는 최소한의 수용해도를 갖는 약물용 서방성 제제를 기술하고 있다. Andrx Pharmaceuticals, Inc.에 의한 미국 특허 제 5,567,441호는 1일 1회 서방성 제제를 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,508,040호는 다중입자 박동적(pulsatile) 약물 서방 시스템을 개시하고 있다. 미국 특허 제 5,472,708호는 박동적 입자를 기본으로 한 약물 전달 시스템을 기재하고 있다. 미국 특허 제 5,458,888호는 내부 약물 함유상 및 중량 평균 분자량이 3,000 내지 10,000인 폴리에틸렌 글리콜 중합체로 구성된 외부상을 갖는 블렌드를 사용하여 제조될 수 있는 서방성 정제를 개시하고 있다. 미국 특허 제 5,419,917호는 하이드로겔로부터 약물을 실질적으로 0차 방출 속도로 제공할 수 있는 유효한 양의 약제학적으로 허용되는 이온화가능한 화합물을 사용하는 것을 기본으로 하여 하이드로겔로부터 약물의 방출속도를 변경시키는 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 제 5,458,888호는 서방성 정제를 개시하고 있다.
Elan Corporation, plc에 의한 미국 특허 제 5,641,745호는 생분해가능한 중합체중에 활성 약물을 함유하여 마이크로스피어 또는 나노스피어를 형성하는 서방성 약제학적 제제를 개시하고 있다. 생분해가능한 중합체는 적합하게는 폴리-D,L-락타이드 또는 폴리-D,L-락타이드와 폴리-D,L-락타이드-코-글리콜라이드의 혼합물이다. Elan Corporation, plc에 의한 미국 특허 제 5,616,345호는 유기산과 함께 활성 화합물, 코어를 둘러싼 다층막 및 다량의 약제학적으로 허용되는 필름-형성 수불용성 합성 중합체 및 소량의 약제학적으로 허용되는 필름-형성 수용성 합성 중합체를 함유하는 1 일 1 회 투여용 서방성 흡수 제제를 개시하고 있다. 미국 특허 제 5,641,515호는 생분해가능한 나노입자를 기본으로 한 서방성 제제를 기술하고 있다. 미국 특허 제 5,637,320호는 1 일 1 회 투여용 서방성 흡수 제제에 관한 것이다. 미국 특허 제 5,580,580호 및 5,540,938호는 제제 및 신경계 질환 치료에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 미국 특허 제 5,533,995호는 약물을 서서히 전달하는 수동적 경피 장치에 관한 것이다. 미국 특허 제 5,505,962호는 서방성 약제학적 제제를 기술하고 있다.
프로드럭 제제
D-D4FC 또는 뉴클레오사이드, 또는 D-D4FC 또는 그의 관련 화합물과 동시 또는 순차적 치료용으로 본 원에 기술된 다른 화합물은 이하 상세히 기술되는 바와같이 아실화된 프로프덕 또는 뉴클레오타이드 프로드럭으로서 투여될 수 있다.
본 원에 기술된 뉴클레오사이드, 또는 하이드록실 또는 아민 작용기를 함유하는 다른 화합물은 뉴클레오사이드의 활성, 생체이용성, 안정성을 증가시키기 위해 또는 그밖의 다른 성질을 변경시키기 위해 뉴클레오타이드 프로드럭으로서 투여될 수 있다. 다수의 뉴클레오타이드 프로드럭 리간드가 공지되었다. 일반적으로, 뉴클레오사이드의 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 화합물의 하이드록실 그룹을 알킬화시키거나, 아실화시키거나, 또 달리 친유적으로 변형시키는 것이 뉴클레오타이드의 안정성을 증가시킬 것이다. 포스페이트 부위 또는 하이드록실상의 하나이상의 수소를 수소를 대체할 수 있는 치환체 그룹의 예로 알킬, 아릴, 스테로이드, 당을 포함한 탄수화물, 1,2-디아실글리세롤 및 알콜이 있다. 다수가 문헌 [R. Jones and N. Bischofberger,Antiviral Research, 27 (1995) 1-17]에 기술되어 있다. 이들중 어떤 것도 목적하는 효과를 달성하기 위해 상기 기술되어 있는 뉴클레오사이드 또는 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다.
활성 뉴클레오사이드 또는 다른 하이드록실 함유 화합물은 또한 본 원에 참고로 인용된 하기 문헌에 기술된 바와 같이 리피드(및 특히 뉴클레오사이드에 대한 5'-에테르 리피드)로서 제공될 수 있다: Kucera, L.S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.K., D.L.W., and C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation."AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus,J.R. Surles, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. Iyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi, and E.J. Modest.1991. "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity."J. Med. Chem. 34:1408.1414; Hosteller, K.Y., D.D. Richman, D.A. Carson, L.M. Stuhmiller, G.M. T. van Wijk, and H. van den Bosch. 1992. "Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3'-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxythymidine."Antimicrob. Agents Chemother. 36:2025.2029; Hostetler, K.Y., L.M. Stuhmiller, H.B. Lenting, H. van den Bosch, and D.D. Richman, 1990. "Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides."J. Biol. Chem. 265:61127.
바람직하게는 뉴클레오사이드 또는 친유성 제제의 5'-OH 위치에서 뉴클레오사이드 또는 다른 하이드록실 또는 아민 함유 화합물에 공유적으로 도입될 수 있는 적합한 친유성 치환체를 기술하고 있는 미국 특허의 예를 이후 예시하지만 이들로만 한정되지 않는다: 미국 특허 제 5,149,794호(Sep. 22, 1992, Yatvin et al.); 5,194,654호(Mar. 16, 1993, Hostetler et al.); 5,223,263호(June 29, 1993, Hostetler et al.); 5,256,641호(Oct. 26, 1993, Yatvin et al.); 5,411,947호(May 2, 1995, Hostetler et al.); 5,463,092호(Oct. 31, 1995, Hostetler et al.); 5,543,389호(Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,390호(Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,391호(Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 및 5,554,728호(Sep. 10, 1996;Basava et al.)(이들은 모두 본 원에 참고로 인용된다). 본 발명의 뉴클레오사이드 또는 친유성 제제에 부착될 수 있는 친유성 친화체를 기술하고 있는 다른 외국 특허 출원으로는 WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4 및 WO 91/19721이 포함된다.
뉴클레오사이드 프로드럭의 예가 하기 참고문헌에 기술되어 있지만, 이들로만 한정되지 않는다: Ho, D. H. W.(1973) "Distribution of Kinase and deaminase of 1β-D-arabinofuranosylcytosine in tissues of man and muse."Cancer Res. 33, 2816-2820; Holy, A.(1993) Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues," In: De Clercq (Ed.),Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I, JAI Press, pp. 179-231; Hong, C.I., Nechaev, A., and West, C.R.(1979a) "Synthesis and antitumor activity of lβ-D-arabino-furanosylcytosine conjugates of cortisol and cortisone."Biochem. Biophys. Rs. Commun. 88, 1223-1229; Hong, C.I., Nechaev, A., Kirisits, A.J. Buchheit, D.J. and West, C.R.(1980) "Nucleoside conjugates as potential antitumor agents. 3. Synthesis and antitumor activity of 1-(β-D-arabinofuranosyl)cytosine conjugates of corticosteroids and selected lipophilic alcohols."J. Med. Chem. 28, 171-177; Hosteller, K.Y., Stuhmiller, L.M., Lenting, H.B.M. van den Bosch, H. and RichmanJ. Biol. Chem.265, 6112-6117; Hosteller, K.Y., Carson, D.A. and Richman, D.D.(1991); "Phosphatidylazidothymidine:
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본 발명은 그의 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었다. 본 발명이 상기 언급된 본 발명의 상세한 설명으로부터 변형 및 수정될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형 및 수정은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.

Claims (17)

  1. 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을, 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외의 위치에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 것으로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 동시에(combination) 또는 순차적으로(alternation) 인간에게 투여함을 특징으로 하여 인간의 HIV 감염을 치료하는 방법.
  2. 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을, HIV-1 역전사효소 영역의 코돈 70에서 라이신에서 아스파라긴(K 에서 N)으로의 돌연변이, 코돈 90에서 발린에서 이소루신(V 에서 I)으로의 돌연변이 또는 코돈 172에서 아르기닌에서 라이신(R 에서 K)으로의 돌연변이를 유발하는 것으로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 동시에 또는 순차적으로 인간에게 투여함을 특징으로 하여 인간의 HIV 감염을 치료하는 방법.
  3. 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 환자에게 투여함을 특징으로 하여, (-)-시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(3TC), AZT, 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC), 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 및 (S)-6-클로로-4-사이클로프로필에티닐-4-트리플루오로메틸-1,4-디하이드로-2H-3,1-벤족사진-2-온(SUSTIVATM)으로 구성된 그룹중에서 선택된 항바이러스 약제에 내성을 나타내는 HIV 바이러스 균주로 감염된 환자를 치료하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 (-)-시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(3TC)인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT)인 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란(FTC)인 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르)인 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T)인 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 2',3'-디데옥시이노신(DDI)인 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC)인 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 (S)-6-클로로-4-사이클로프로필에티닐 -4-트리플루오로메틸-1,4-디하이드로-2H-3,1-벤족사진-2-온(SUSTIVATM)인 방법.
  12. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌 (아사이클로비르)인 방법.
  13. 제 3 항에 있어서, 항바이러스 약제가 (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU)인 방법.
  14. 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외의 위치에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 유효량의 약제로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 함께, 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염을 함유하는 인간의 HIV-1 치료용 약제학적 조성물.
  15. HIV-1 역전사효소 영역의 코돈 70에서 라이신에서 아스파라긴(K 에서 N)으로의 돌연변이, 코돈 90에서 발린에서 이소루신(V 에서 I)으로의 돌연변이 또는 코돈172에서 아르기닌에서 라이신(R 에서 K)으로의 돌연변이를 유발하는 유효량의 약제로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신 (DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘 (L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 함께, 약제학적으로 허용되는 담체중의 유효량의 β-D-D4FC 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 인간의 HIV-1 치료용 약제학적 조성물.
  16. 인간의 HIV-1 치료용 약제를 제조하는데 있어서, 역전사효소 영역의 70(K 에서 N), 90 또는 172 코돈 이외의 위치에서 HIV-1의 돌연변이를 유발하는 것으로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 β-D-D4FC, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 프로드럭 또는 염의 용도.
  17. 인간의 HIV-1 치료용 약제를 제조하는데 있어서, HIV-1 역전사효소 영역의 코돈 70에서 라이신에서 아스파라긴(K 에서 N)으로의 돌연변이, 코돈 90에서 발린에서 이소루신(V 에서 I)으로의 돌연변이 또는 코돈 172에서 아르기닌에서 라이신 (R 에서 K)으로의 돌연변이를 유발하는 것으로서 시스-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 시스-2-하이드록시메틸-5-(사이토신-1-일)-1,3-옥사티올란, 9-[4-(하이드록시메틸)-2-사이클로펜텐-1-일]-구아닌(카보비르), 9-[(2-하이드록시에톡시)메틸]구아닌(아사이클로비르), 인터페론, 3'-데옥시-3'-아지도-티미딘(AZT), 2',3'-디데옥시이노신(DDI), 2',3'-디데옥시사이티딘(DDC), (-)-2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라-우리딘(L-FMAU) 또는 2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티미딘(D4T) 이외의 약제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체중의 β-D-D4FC 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 용도.
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