JP4413996B2 - 抗ｂ型肝炎ウィルス活性を有するヌクレオシド - Google Patents

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Description

発明の背景
本発明は、抗Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶとも称される）の治療法の分野にあり、１又はそれ以上の本明細書中に開示された活性化合物又は薬学的に許容しうるその誘導体、あるいはそれらの化合物の１つのプロドラッグの有効量を投与することを含む。
ＨＢＶはヒトの癌の原因としてたばこに劣らない。ＨＢＶが癌を誘導する機作は不明であるが、ＨＢＶが腫瘍の成長を直接的に誘発するか、又は感染に関連した慢性の炎症、硬変、及び細胞再生によって間接的に腫瘍成長を誘発する可能性があることが考えられる。
Ｂ型肝炎ウィルスは世界中に伝染するレベルに達した。宿主が感染に気づかない２〜６か月の潜伏期間の後、ＨＢＶ感染は急性肝炎及び肝障害を引き起こし、それにより腹痛、黄疸及びある種の酵素の血中レベルを高める原因となる。ＨＢＶは、肝臓の対部分が破壊され、非常に進行性で往々にして致死的である激症肝炎の原因となりうる。患者は、一般に急性ウィルス性肝炎からは回復する。しかし、ある患者においては、長期的に又は一生高いレベルのウィルス性抗原が血液中に存続し続け、慢性的感染を起こす。慢性的感染は、慢性持続性肝炎を引き起こすことになる。慢性持続性ＨＢＶに感染した患者は、発展途上国で最も一般的である。１９９１年の半ばまでに、アジアだけで約２億２，５００万人の慢性のＨＢＶキャリアがおり、世界にはほぼ３億人のキャリアが存在した。慢性持続性肝炎は、疲労、肝硬変及び第一期の肝臓癌である肝細胞性癌腫の原因となりうる。西側産業高度発展諸国において、ＨＢＶに感染するリスクの高いグループは、ＨＢＶキャリア又はかれらの血液検体と接触するグループである。ＨＢＶの疫学は、後天性免疫不全症候群のそれに非常に似ており、このことはＨＢＶ感染が、ＡＩＤＳ又はＡＩＤＳ関連感染症の患者の間に普遍的である理由を説明している。しかしながら、ＨＢＶはＨＩＶよりも感染性が高い。
遺伝子工学で製造された蛋白であるα−インターフェロンによる日常の治療は、有望であることが判明している。ヒト血清に由来するワクチンもＨＢＶに対して患者を免疫化するために開発されている。ワクチンは遺伝子工学により製造されている。ワクチンが効果的であることは判明しているが、その製造は慢性のキャリアからのヒト血清の供給が限られているので困難であり、その精製工程は長時間を有し、費用がかかる。更に別々の血清から作られたバッチごとにそのワクチンをチンパンジーで試験して安全性を試験しなければならない。加えて、ワクチンはすでにウィルスに感染した患者には効果がない。
ヨーロッパ特許出願第９２３０４５３０．６号は、１，２−オキサチオランヌクレオシドがＢ型肝炎の治療に有用であることを開示している。２−ヒドロキシメチル−５−（シトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランが抗Ｂ型肝炎活性を有していると報告されている（Doong,et al.,Proc.of Natl.Acad.Sci.ISA,88,8495-8499（1991）;Chang,et al.,J.of Biological Chem.,Vol.267（20）,13938-13942）。２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオランの（−）及び（＋）−エナンチオマーの抗Ｂ型肝炎活性は、Furman,et al.により、Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Dec.1992,pp.2686-2692に発表されている。
エール大学が出願したPCT/US92/03114（国際公開パンフレットWO92/18517）においては、ＨＢＶ及びＨＩＶの治療のためのいくつかのβ−Ｌ−ヌクレオシドが開示されている。ＨＢＶの治療のために開発された他の薬剤としては、アデノシンアラビノシド、チモシン、アシクロビル、ホスホノホルメート、ジドブジン、（＋）−シアニダノール、キナクリン及び２′−フルオロアラビノシル−５−ヨードウラシルがある。
ウィルス性疾患、特にＨＢＶ及びＨＩＶに対するプリン及びピリミジンヌクレオシドの作用機作の基本的段階は、細胞性及びウィルス性キナーゼによる代謝的な活性化によりモノ−、ジ−及びトリホスフェート誘導体を得ることにある。多くのヌクレオシドのなかで生物学的に活性なのは、トリホスフェート型のものであって、これがＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を阻害するか、あるいは鎖の終止を起こさせる。ＨＢＶ及びＨＩＶの治療のために今日まで開発されてきたヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシドがその抗ウィルス効果を表すのに先立って細胞内でホスホリル化されなければならないのにもかかわらず、宿主に投与するためにはホスホリル化されていない形で提供されてきている。というのは、トリホスフェート型は、一般に細胞に到達する以前に脱ホスホリル化されるか、又は、細胞にほとんど吸収されないからである。一般にヌクレオチドは、細胞膜を通過するのが非常に困難であり、一般にin vitroでは強力であるとは言いがたい。ヌクレオチドの吸収及びこの効力を増加させるためにヌクレオチドを改変する試みは、R.Jones and N.Bischofberger,Antiviral Research,27,（1995）1-17に記載されており、その内容は、参考として本明細書中に包含した。
Ｂ型肝炎ウィルスが世界中に伝染するレベルに達し、感染した患者に、重篤でかつしばしば悲劇的な影響を与えることからして、このウイルスに感染した人々を治療するための、宿主に毒性の少ない、新しく効果的な薬剤に対する強い要望が存在する。
したがって、ＨＢＶに感染したヒト患者及び他の宿主の治療のための方法及び組成物を提供することが本発明のもうひとつの目的である。
発明の概要
ＨＢＶに感染した宿主、特にヒトの治療のための方法を提供するものであり、その方法は、次式：
Figure 0004413996
（式中、Ｒ1は、水素、フルオロ、ブロモ、クロロ、ヨード、メチル又はエチルであり；Ｒ2は、ＯＨ、Ｃｌ、ＮＨ2又はＨである）で示されるヌクレオシド又は薬学的に許容しうるその塩のＨＢＶ治療量を、場合によっては薬学的に許容しうる担体又は希釈剤に加えて投与することを含む。
他の態様においては、次式：
Figure 0004413996
（式中、Ｒ5は、アデニン、キサンチン、ヒポキサンチン、あるいはアルキル化又はハロゲン化したプリンを含む他のプリンである）で示される化合物のβ−Ｌ−エナンチオマーの、本明細書中により詳しく記載されているＨＢＶ治療量を宿主に投与する。
他の代替的態様においては、ヌクレオシドは、次式：
Figure 0004413996
〔式中、「塩基」はプリン又はピリミジン塩基であり；
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4は、独立してＨ、ＯＨ、Ｎ3、ＮＲ1Ｒ2、ＮＯ2、ＮＯＲ3、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリール、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを含む）、−ＣＮ−、Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、ＳＨ、−Ｓ−アルキル又は−Ｓ−アリールであり、一般に、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4のうちの３つがＨ又はＯＨである。この−ＯＨ置換基は、存在する時は、一般にＹ1又はＹ3基である。構造式に示されるように、Ｙ2及びＹ4はアラビノ（エリトロ）配置にあり、Ｙ1及びＹ3は、トレオ（リボース）配置にある。Ｒは、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキル、アシル又は以下により詳細に記載するホスフェート誘導体である。Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立してアルキル（特に低級アルキル）、アリール、アラルキル、アルキルアリール、アシル又は水素である〕で示されるものである。
好ましい態様においては、ヌクレオシドは示したエナンチオマーとして提供され、実質的に、その対応のエナンチオマーを含まない（すなわち、エナンチオマー過剰の状態）で提供される。
他の実施態様においては、本発明はＨＢＶに感染したヒトの治療方法を含み、これは、特定の開示されたヌクレオシドのプロドラッグのＨＢＶ治療量を投与することを含む。ここで用いる「プロドラッグ」とは、特に開示されたヌクレオシドの薬学的に許容しうる誘導体を意味し、これは、投与されると生体内で該ヌクレオシドに変換されるか、又は、それ自身が活性を有している。限定の意味ではなく例としてあげられるのは、活性化合物の５′、及びＮ4−ピリミジン、あるいはＮ6−プリンをアシル化又はアルキル化した誘導体である。
本発明の好ましい態様においては、ヌクレオシドは、脱ホスホリル化から化合物を保護するための処方のモノホスフェート、ジホスフェート又はトリホスフフェートの形で提供される。処方としては、リポソーム、リポスフェア、ミクロスフェア又はナノスフェア（そのなかでも後の三者が感染細胞を標的とすることができる）を含む。代替的な好ましい態様としては、ヌクレオシドは、モノホスフェート、ジホスフェート又はトリホスフェート誘導体（すなわち、ヌクレオチドプロドラッグ）、例えばエステルとして提供され、この形はインビボでホスフェートを安定化する。本発明の他の代替的態様としては、ＦＴＣ、ＢＣＨ−１８９又は３ＴＣの安定化したホスフェート誘導体（以下に更に記載する）を肝炎の治療のために提供する。
開示されたヌクレオシド、又はその薬学的に許容しうるプロドラッグ又は塩、あるいはそれらの化合物を含有する薬学的に許容しうる処方は、ＨＢＶ感染及び他の関連症状、例えば抗ＨＢＶ抗体陽性及びＨＢＶ陽性症状、ＨＢＶにより引き起こされる慢性的肝炎症、硬変、急性肝炎、激症肝炎、慢性持続性肝炎及び疲労の予防及び治療に有用である。これらの化合物又は処方はまた、抗ＨＢＶ抗体又はＨＢＶ−抗原陽性であるか、あるいは、ＨＢＶに暴露され続けてきた人々における臨床疾患を防ぐために予防的に又はその進行を遅らせるために用いられる。
本発明のひとつの態様として、活性化合物の１又はそれ以上を、他の抗ＨＢＶ剤の１又はそれ以上と交互に、又は組み合わせて投与して、効果的に抗ＨＢＶ治療を提供する。交互治療又は組み合わせ治療に用いられる抗ＨＢＶ剤の例としては、限定の意味なく、２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ＦＴＣ、WO92/14743参照）、その生理学的に許容しうる誘導体、又は生理学的に許容しうる塩；２−ヒドロキシメチル−５−（シトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ラセミＢＣＨ−１８９型を含むか、又は３ＴＣ（（−）−エナンチオマー富化されたＢＣＨ−１８９）、その生理学的に許容しうる誘導体又は生理学的に許容しうる塩；２′−フルオロ−５−エチル−アラビノシルウラシル（ＦＥＡＵ）；カルボビル又はインターフェロンがある。
患者に対して処理をするいかなる交互治療法も用いることができる。限定の意味なく、その変法の例としては、１種の薬剤の有効量を１〜６週投与し、それに続いて第二の抗ＨＢＶ剤の有効量を１〜６週投与するという方法がある。交互法のスケジュールは、治療を行わない期間を含んでもよい。組み合わせ治療は、一般に、２又はそれ以上の抗ＨＢＶ剤を有効な用量比で同時に投与することを含む。
ＨＢＶがしばしば抗ＨＩＶ抗体又はＨＩＶ−抗原陽性でもある患者、あるいはＨＩＶに暴露されてきた人々において見い出される事実にかんがみ、本明細書中に開示されている活性な抗ＨＢＶ化合物又はその誘導体もしくはプロドラッグは、適切な状況において、限定の意味なしに３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２′，３′−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、２′、３′−ジデオキシシチジン（ＤＤＣ）、２′、３′−ジデオキシ−２′、３′−ジデヒドロチミジン（Ｄ４Ｔ）、２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ＦＴＣ）又は２−ヒドロキシメチル−５−（シトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（ＢＣＨ−１８９のラセミ体もしくは（−）エナンチオマ−過剰のＢＣＨ−１８９、３ＴＣ）をはじめとする抗ＨＩＶ剤と組み合わせるかあるいはそれと交互に投与することができる。非ヌクレオシドＲＴ阻害剤、例えばTiboクラスの化合物、ネビラピン（nevirapine）又はピリミジノンもまた、本発明の化合物と組み合わせて投与しうる。
活性な抗ＨＢＶ剤はまた、第二の感染症の治療のために投与される抗生物質、他の抗ウィルス化合物、抗真菌剤又は他の薬剤と組み合わせて投与される。
ひとつの態様として、ヌクレオシドは、感染細胞に取り込まれるのに先立って、脱ホスホリル化を減少させたり阻止するため安定化された、ホスフェート誘導体として提供される。ヌクレオシドの５′−位で安定化されたホスフェート誘導体のいくつかが既知であって、文献に発表されている。ひとつの態様として、ヌクレオシドは以下により詳細に開示するＳＡＴＥ誘導体として投与される。該化合物の活性を実質的に損なうことがなければ、いかなる代替的安定化ホスフェート誘導体もヌクレオシド５′−位に置き換えることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、β−Ｌ−２′，３′−ジデオキシシチジン（β−Ｌ−ＦｄｄＣ）、β−Ｄ−２′，３′−ジデオキシシチジン（β−Ｄ−ｄｄＣ）、β−Ｌ−２′，３′−ジデオキシ−５−フルオロシチジン（β−Ｌ−ｄｄＣ）、（−）−β−Ｌ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（（−）−β−Ｌ−ＦＴＣ）、（＋）−β−Ｄ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−ジオキソラン（（＋）−β−Ｄ−ＦＤＯＣ）及びβ−Ｌ−２−アミノ−６−（Ｒ4）−９−〔（４−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−１−イル〕プリンの化学的構造を示すものである。
図２は、本文中のヌクレオシドの化学命名法による番号付けを説明したものである。
発明の詳細な説明
ここで用いられている「エナンチオマ−的に純粋な」という用語は、ヌクレオシドの１つのエナンチオマーを少なくとも約９５％、好ましくは約９７％、９８％、９９％又は１００％含むヌクレオシド組成物を意味する。
ここで用いられている用語「アルキル」は、特に言及しない限り、Ｃ1〜Ｃ10の、飽和の直鎖、分岐鎖又は環状の、一級、二級又は三級炭化水素であって、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル及び２，３−ジメチルブチルを含む。このアルキル基は、場合によっては、１以上の部分（保護されていなくてもよく、必要であれば当業者に既知の方法、例えば、Greene,et al.,“Protective Groups in Organic Synthesis,”John Wiley and sons,Second Edition,1991に教示のように保護されていてもよい、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェート又はホスホネートからなる群から選択される）により置換されていてもよい。ここで用いられる用語「低級アルキル」とは、特に言及しない限りは、Ｃ1〜Ｃ4エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、sec−ブチル又はｔ−ブチル基を意味する。
ここで用いられる用語「アシル」は、限定の意味なしに、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、３−メチルブチリル、コハク酸水素エステル基、３−クロロベンゾエート基、ベンゾイル、アセチル、ピバロイル、メシレート基、プロピオニル、バレリル、カプロイック、カプリリック、カプリック、ラウリック、ミリスチック、パルミチック、ステアリック及びオレイックを含む。
ここで用いられている「アリール」とは、特に言及しないかぎり、フェニル、ビフェニル又はナフチルであり、好ましくはフェニルである。このアリール基は場合により、１以上の部分（保護されていなくてもよく、又は必要であれば、当業者に既知の方法、例えば、Greene,et al.,“Protective Groups in Organic Synthesis,”John Wiley and Sons,Second Edition,1991に教示されているように保護されていてもよい、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェート又はホスホネートからなる群から選択される）により置換されていてもよい。
「プリン又はピリミジン塩基」という用語には、限定の意味なしに、アデニン、Ｎ6−アルキルプリン、Ｎ6−アシルプリン（ここで、「アシル」とはＣ（Ｏ）（アルキル、アリール、アルキルアリール又はアリールアルキル）である）、Ｎ6−ベンジルプリン、Ｎ6−ハロプリン、Ｎ6−ビニルプリン、Ｎ6−アセチレン（acetylenic）プリン、Ｎ6−アシルプリン、Ｎ6−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ6−チオアルキルプリン、Ｎ2−アルキルプリン、Ｎ2−アルキル−６−チオプリン、チミン、シトシン、６−アザピリミジン、２−及び／又は４−メルカプトピリジミジン、ウラシル、Ｃ5−アルキルピリミジン、Ｃ5−ベンジルピリミジン、Ｃ5−ハロピリミジン、Ｃ5−ビニルピリミジン、Ｃ5−アセチレンピリミジン、Ｃ5−アシルピリミジン、Ｃ5−ヒドロキシアルキルプリン、Ｃ5−アミドピリミジン、Ｃ5−シアノピリミジン、Ｃ5−ニトロピリミジン、Ｃ5−アミノピリミジン、Ｎ2−アルキルプリン、Ｎ2−アルキル−６−チオプリン、５−アザシチジニル、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニルを含む。塩基上の官能基としての酸素及び窒素基は、必要に応じて又は所望であれば、保護されていてよい。適切な保護基は、当業者に既知のものであって、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル及びｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、アルキル基、アセチル及びプロピオニルのようなアシル基、メチルスルホニルならびにｐ−トルイルスルホニルを含む。
ここで用いられる用語「天然アミノ酸」には、限定の意味なしに、アラニル、バリニル、ロイシニル、イソロイシニル、プロリニル、フェニルアラニニル、トリプトファニル、メチオニニル、グリシニル、セリニル、トレオニニル、システイニル、チロシニル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタオイル、リシニル、アルギニニル及びヒスチジニルを含む。
本明細書に開示されている発明は、ＨＢＶ、及び同様の方法で複製する他のウィルスのヒト又は他の宿主動物における感染の治療方法及び治療用組成物を開示するものであって、場合により薬学的に許容しうる担体中の、１以上の上記の化合物又は生理学的に許容しうるその誘導体、あるいは生理学的に許容しうるその塩の有効量を投与することを含む。本発明の化合物は、抗ＨＢＶ活性を有するか、あるいは、代謝されて抗ＨＢＶ活性を示す複数であってもよい化合物となるものである。
Ｉ．活性ヌクレオシドの構造及びその製造
立体化学
本明細書中に開示される方法に用いられている化合物は、２′，３′−ジデオキシシチジン、２′，３′−ジデオキシ−５−（ハロ又はメチル）シチジン、２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−ジオキソラン又は２−アミノ−６−（ＯＨ、Ｃｌ、ＮＨ2又はＨ）−９−〔（４−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロフラン−１−イル〕プリンである。
ヌクレオシドの糖又はジオキソラニル部の１′及び４′位の炭素（一般的に糖部と以下に記載する）は、キラルであるので、水素以外のその置換基（それぞれ、ＣＨ2ＯＲと、ピリミジン又はプリン塩基）は、糖環系に関してシス（同じ側に存在）又はトランス（反対側に存在）のいずれかである。それゆえ、４つの光学的異性体が、以下の配置のように存在する（糖部を、「第一の」酸素（Ｃ１′とＣ４′原子の間、図２参照）が後ろにくるような、水平方向の平面に配置する場合）：シス（両方の基が上方向、これは、天然に存在するヌクレオシドの配置に相当する）、シス（両方の基が下方向、これは天然には存在しない配置である）、トランス（Ｃ２置換基が上方向でＣ５置換基が下方向）及びトランス（Ｃ２置換基が下方向でＣ５置換基が上方向）。図１に図式的に示したように、「Ｄ−ヌクレオシド」は、天然配置のシスヌクレオシドであり、「Ｌ−ヌクレオシド」は、天然には存在しない配置のシスヌクレオシドである。
ＨＢＶ感染症を治療するための開示された方法において有用なヌクレオシドは、β−Ｌ−エナンチオマーであり、β−Ｄ−エナンチオマー型を使用するＦＤＯＣは例外である。というのは、ＦＤＯＣのβ−Ｄ−エナンチオマーはＦＤＯＣのβ−Ｌ−エナンチオマーよりも驚くほど毒性が少ないからである。
プロドラッグ処方
本発明中に開示されているヌクレオシドは、それを患者に投与した場合に直接的又は間接的に、親の活性化合物か、又はそれ自身活性を示す化合物を提供することができるいかなる誘導体で投与されてもよい。１つの態様として、５′−ＯＨ基の水素は、Ｃ1−Ｃ5アルキルを含むＣ1−Ｃ20アルキル；エステル基のカルボニルでない部分が、直鎖、分岐鎖又は環状の、Ｃ1−Ｃ5アルキルを含むＣ1−Ｃ20アルキル、フェニル又はベンジルから選択される、アシル基；天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸；メトキシメチルをはじめとするアルコキシアルキル；ベンジルをはじめとするアラルキル；フェノキシメチルのようなアリールオキシアルキル；場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ4アルコキシにより置換されているフェニルをはじめとするアリール；コハク酸のようなジカルボン酸；メタンスルホニルを含むアルキル又はアラルキルスルホニルのようなスルホン酸エステル基；あるいは、モノ、ジ又はトリホスフェートエステル基により置き換えられていてもよい。
プリン又はピリミジン塩基のアミノ酸の１又は２個の水素は、Ｃ1〜Ｃ5アルキルをはじめとするＣ1〜Ｃ20アルキル；エステル基の非カルボニル部分が、直鎖、分岐鎖もしくは環状の、Ｃ1〜Ｃ5アルキルを含むＣ1〜Ｃ20アルキル、フェニル又はベンジルから選択されるアシル；メトキシメチルをはじめとするアルコキシアルキル；ベンジルをはじめとするアラルキル；フェノキシメチルのようなアリールオキシアルキル；場合によりハロゲン、Ｃ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ4アルコキシにより置換されている、フェニルをはじめとするアリールによって置換されていてもよい。
活性なヌクレオシドはまた、５′−エーテル脂質物として提供されてよく、それは、以下の文献；Kucera,L.S.,N.Iyer,E.Leake,A.Raben,Modest E.J.,D.L.W.,and C.Piantadosi.1990に開示されており、参考として本明細書に含めた。新規な膜−相互作用性エーテル脂質アナログは、感染性のＨＩＶ−１の産生を阻害して欠陥のあるウィルスを生成させる。AIDS Res Hum Retroviruses.6:491-501;Piantadosi,C.,J.Marasco C.J.,S.L.Morris-Natschke,K.L.Meyer,F.Gumus,J.R.Surles,K.S.Ishaq,L.S.Kucera,N.Iyer,C.A.Wallen,S.Piantadosi,and E.J.Modest.1991,新規なエーテル脂質ヌクレオシド複合体の合成及び抗ＨＩＶ活性の評価。J.Med.Chem.,34:1408.1414;Hostetler,K.Y.,D.D.Richman,D.A.Carson,L.M.Stuhmiller,G.M.T.van Wijk,and H.van den Bosch.1992,３′−デオキシチミジンの脂質プロドラッグである３′−デオキシチミジンジホスフェートジミリストイルグリセロールによる、ＣＥＭ細胞及びＨＴ４−６Ｃ細胞におけるヒト免疫不全Ｉ型ウィルス複製の強力な阻害。Antimicrob,Agents Chemother.36:2025.2029;Hostetler,K.Y.,L.M.Stuhmiller,H.B.Lenting,H.van den Bosch,and D.D.Richman,1990,アジドチミジン及び他の抗ウィルス性ヌクレオシドのホスホリピドアナログの合成及び抗レトロウィルス活性。J.Biol.Chem.265:6112.7.
ヌクレオチドプロドラッグ
ここに記載したいずれのヌクレオシド、又は抗Ｂ型肝炎活性を有するいかなる他のヌクレオシドも、ヌクレオシドの活性、バイオアベイラビリティ、安定性を増強するかそうでなければヌクレオシドの性質を変化させるためのヌクレオチドプロドラッグとして投与されてよい。多くのヌクレオチドプロドラッグリガンドが知られている。ここで記載するヌクレオチドプロドラッグとは、親のホスフェートよりもインビトロでより安定なホスフェート誘導体を５′−位に有し、ヌクレオシドの抗Ｂ型肝炎活性に実際に悪影響を及ぼさないヌクレオシドを意味する。ホスホネートはホスフェート誘導体として含まれる。一般に、ヌクレオシドのモノ、ジ又はトリホスフェートのアルキル化、アシル化又は他の親脂質性の改変は、ヌクレオシドの安定性を増強する。ホスフェート部分の１以上の水素に置き換わる置換基の例としては、アルキル、アリール、ステロイド、糖、１，２−ジアシルグリセロール及びアルコールをはじめとする炭水化物である。多くのものが、R.Jones and N.Bischofberger,Antiviral Research,27（1995）1-17に記載されている。これらのいずれもが開示されたヌクレオシドと組み合わせて用いられて、所望の効果を達成する。以下の文献には、ヌクレオチドプロドラッグの例が、限定の意味なく記載されている。
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活性化合物の調製
本開示方法において、宿主生体におけるＨＢＶ感染症を治療するために使用されているヌクレオシドは、公表されている方法により調製することができる。β−Ｌ−ヌクレオシドは、例えば以下の刊行物に開示されている方法、又は開示されている方法を標準的に変更した方法により調製することができる：Jeong,et al.,J.of Med.Chem.,36,182-195,1993;ヨーロッパ特許出願公開第0 285 884号;
Figure 0004413996
C.,G.Gosselin,A.-M.Aubertin,G.Obert,A.Kirn,and J.-L.Imbach,強力な抗ウィルス剤としての３−置換チミンα−Ｌ−ヌクレオシド誘導体；合成及び生物学的評価，Antiviral Chem.Chemother.2:83-92（1991）;Johansson,K.N.G.,B.G.Lindborg,and R.Noreen,ヨーロッパ特許出願第352 248号;Mansuri,M.M.,V.Farina,J.E.Starrett,D.A.Benigni,V.Brankovan,and J.C.Martin,潜在的な抗ＨＩＶ剤としてのＤＤＣ、ＤＤＡ、Ｄ４Ｃ及びＤ４Ｔの幾何異性体の調製，Bioorg.Med.Chem.Lett.1:65-68（1991）;Fujimori,S.,N.Iwanami,Y.Hashimoto,and K.Shudo,２′−デオキシ−β−Ｌ−リボヌクレオシドの簡便かつ立体選択的合成，Nucleosides & Nucleotides 11:341-349（1992）;
Figure 0004413996
C.,G.Gosselin,A.-M.Aubertin,G.Obert,A.Kirn,and J.-L.Imbach,潜在的な抗ウィルス剤としての３−置換チミンα−Ｌ−ヌクレオシド誘導体；合成及び生物学的評価、Antiviral Chem.Chemother.2:83-92（1991）;Holy,A.,２′−デオキシ−Ｌ−ウリジンの合成，Tetrahedron Lett.2:189-192（1992）;Holy,A.,核酸成分とそのアナログ。ＣＬIII。ピリミジン系列の２′−デオキシ−Ｌ−リボヌクレオシドの調製。Collect Czech Chem Commun.37:4072-4087（1992）;Holy,A.,２′−デオキシ−Ｌ−ウリジン：糖２−アミノオキサゾリンから２，２′−アンヒドロヌクレオシド中間体を介してのウラシル２′−デオキシヌクレオシドの全合成。In:Townsend LB,Tipson RS,ed.Nucleic Acid Chem.New York:Wiley,1992:347-353,vol 1）（1992）;Okabe,M.,R.-C.Sun,S.Tan,L.Todaro,and D.L.Coffen,グルタミン酸、リボノラクトン及びピリミジン塩基からのジデオキシヌクレオシドｄｄＣ及びＣＮＴの合成。J.Org.Chem.53:4780-4786（1988）;Robins,M.J.,T.A.Khwja,and R.K.Robins.プリンヌクレオシド。ＸＸIX。２１−デオキシ−Ｌ−アデノシン及び２１−デオキシ−Ｌ−グアノシン、並びにそれらのアルファ−アノマーの合成。J.Org.Chem.35:363-639（1992）;
Figure 0004413996
C.,Gosselin G.,Aubertin A-M,Obert G.,Kirn A.,and Imbach J-L,強力な抗ウィルス剤としての３′−置換チミンα−Ｌ−ヌクレオシド誘導体；合成及び生物学的評価。Antiviral Chem.Chemother.2（2）:83-92（1991）;
Figure 0004413996
C.,Gosselin G.,Imbach J-L;強力な抗ウィルス剤としての新規なチミンの２′−デオキシ−３′−置換−α−Ｌ−トレオ−ペントフラノヌクレオシドの合成。Tet.Lett.32（1）:79-82（1991）;
Figure 0004413996
C.,Gosselin G.,Imbach J-L.１−ペントフラノシルヌクレオシド合成の前駆体としてのＬ−アラビノ−フラノース及び２−デオキシ−１−エリトロ−ペントフラノースの新規アシル化誘導体の調製。216:240-255（1991）;及び
Figure 0004413996
C.,Gosselin G.,Puech F.et al.５種類の天然に存在する核酸塩基のα−Ｌ−アラビノフラノシル及び２′−デオキシ−α−Ｌ−エリトロ−ペントフラノシルヌクレオシドの系統的合成及び抗ウィルス評価。10（b）:1345-1376（1991）.
２′，３′−ジデオキシシチジン（ＤＤＣ）は、既知の化合物である。ＤＤＣのＤ−エナンチオマーは、現在、ＨＩＶ感染患者の治療における使用のために、ザルシタビン（Zalcitabine）の名称で、ホフマン−ラロシュ（Hoffmann-LaRoche）社によって販売されている。米国特許第4,879,277号及び第4,900,828号を参照。
β−Ｄ−ＦＤＯＣなどのエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドは、詳細にはPCT/US91/09124に詳細に開示されているように調製することができる。本方法は、糖の１位（後に形成されるヌクレオシドにおいて４′−位となる）に関する正しいジアステレオマー立体配置を含む、エナンチオマー的に純粋な最終生成物に必要な立体配置のすべてを含む糖である１，６−アンヒドロマンノースから、（２Ｒ，４Ｒ）−及び（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（保護されたオキシメチル）−ジオキソランをまず調製することからなる。（２Ｒ，４Ｒ）−及び（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（保護されたオキシメチル）−ジオキソランを、ＳｎＣｌ4、その他のルイス酸、又はトリメチルシリルトリフレートの存在下、ジクロロエタン、アセトニトリル、又は塩化メチレンなどの有機溶媒中、所望の複素環式塩基と縮合して、立体化学的に純粋なジオキソラン−ヌクレオシドを得る。
ｃｉｓ−ヌクレオシドのＤ及びＬエナンチオマーの分離のための酵素による方法は、例えばNucleosides and Nucleotides,12（2）,225-236（1993）;ヨーロッパ特許出願Nos.92304551.2及び92304552.0（Biochem Pharma,Inc.出願）;及びＰＣＴ公開パンフレットWO 91/11186、WO 92/14729及びWO 92/14743（Emory University出願）に開示されている。
ｃｉｓ−ヌクレオシドのＤ及びＬエナンチオマーのアシル化又はアルキル化ラセミ混合物の分離は、ＰＣＴ公開パンフレットNo.WO 92/14729に開示されているように、キラル固定相を用いた高速液体クロマトグラフィーによって行うことができる。
活性ヌクレオシドのモノ、ジ及びトリホスフェート誘導体は、発表された方法により記載されているように調製することができる。モノホスフェートは、Imai et al.,J.Org.Chem.,34（6）,1547-1550（June 1969）の方法により調製することができる。ジホスフェートは、Davisson et al.,J.Org.Chem.,52（9）,1794-1808（1987）の方法により調製することができる。トリホスフェートは、Hoard et al.,J.Am.Chem.Soc.,87（8）,1785-1788（1965）の方法により調製することができる。
β−Ｌ−ジデオキシヌクレオシドのビス（Ｓ−アシル−２−チオエチル）ホスホエステル〔ビス（ＳＡＴＥ）β−Ｌ ｄｄｘＭＰ〕の調製のための一般的操作
Figure 0004413996
ビス（ＳＡＴＥ）β−Ｌ−ｄｄｘＭＰ
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、及びＹ4は、独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｎ3、ＮＲ1Ｒ2、ＮＯ2、ＮＯＲ3、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリール、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを含む）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、ＳＨ、−Ｓ−アルキル、又は−Ｓ−アリールであり、一般的に、Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、及びＹ4のうち３つが、Ｈ又はＯＨのいずれかである。この−ＯＨ置換基は、存在する時は、一般には、Ｙ1又はＹ3基である。構造式中に図示したように、Ｙ2及びＹ4は、アラビノ（エリトロ）配置であり、Ｙ1及びＹ3は、トレオ（リボース）配置である。塩基は、プリン又はピリミジンである。代替的に、擬似糖（pseudo-sugar）残基は、１，３−オキサチオランである（ＦＴＣ及びＢＣＨ−１８９又は３ＴＣにおけるように。あるいは１，３−ジオキソラン誘導体である）。テトラヒドロフラン（２ml）中のβ−Ｌ−ジデオキシヌクレオシド（１．０mmol）及び適切なホスホルアミダイト（phosphoramidite）Ｃ（１．２mmol）の撹拌溶液に、室温で、（ｉ）ＩＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、ＤＢＵ／Ｃ6Ｈ5ＣＨ3；（ii）Ｃｌ2ＰＮ（ｉＰｒ）2、ＮＥｔ3／ＴＨＦ；（iii）β−Ｌ−ジデオキシヌクレオシド、１Ｈ−テトラゾール／ＴＨＦ、次にＣｌＣ6Ｈ4ＣＯ3Ｈ／ＣＨ2Ｃｌ2１Ｈ−テトラゾール（０．２１ｇ、３．０mmol）を加えた。３０分後、反応混合物を−４０℃に冷却し、３−クロロペルオキシ安息香酸（０．２３ｇ、１．３mmol）をジクロロメタン（２．５ml）に含む溶液を加えた；次に混合物を１時間放置して、室温まで戻した。亜硫酸ナトリウム（１０％溶液、１．３ml）を混合物に加えて、過剰の３−クロロペルオキシ安息香酸を分解し、その後、有機層を分離し、水層をジクロロメタン（２×１０ml）で洗浄した。合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ml）、次に水（３×５ml）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して、標題のビス（ＳＡＴＥ）β−Ｌ−ｄｄｘｍＰを得た。
実施例＝β−Ｌ−２′，３′−ジデオキシアデノシン−５′−イルビス（２−ピバロイルチオエチル）ホスフェート〔ビス（ＳＡＴＥ）β−Ｌ−ｄｄＡＭＰ〕
Figure 0004413996
上記の一般的操作の後、純粋なビス（ＳＡＴＥ）β−Ｌ−ｄｄＡＭＰが、シリカゲルカラムクロマトグラフィー後に、７２％の収率で、無色の油状物として得られた〔溶離剤：ジクロロメタン中のメタノール（０−３％）の段階的勾配〕；1NMR（DMSO-d6）δppm:8.26及び8.13（2s,2H、それぞれH-2及びH-8）,7.20（br s,2H,NH2）,6.24（t,1H,H-1’;J=6.0Hz）,4.35-4.25（m,1H,H-4’）,4.25-4.00（m,2H,H-5’,5”）,3.96（m,4H,2SCH2CH2O）,3.04（t,4H,2 SCH2CH2O;J=6.3Hz）,2.5-2.4（m,2H,H-2’,2”）2.2-2.0（m,2H,H-3’,3”）,1.15［s,18H,2（CH3）3C］;31P・NMR（DMSO-d6）δppm=-0.76（s）;UV（EtOH）,λmax=259nm（ε 15400）;質量スペクトル（グリセロール、チオグリセロール、１：１、υ／υで実施）、FAB>O 604（M+H）+,136（BH2）+.
３′−置換β−Ｌ−ジデオキシヌクレオシドの立体特異的合成の一般的反応式
Figure 0004413996
実施例＝１−（３−アジド−２，３−ジデオキシ−β−Ｌ−エリトロ−ペントフラノシル）チミン〔β−Ｌ−ＡＺＴ〕
Figure 0004413996
ジエチルアゾジカルボキシレート（０．４６ml;２．９mmol）及びジフェニルホスホルアジデート（０．６２ml;２．９mmol）をＴＨＦ（２．９ml）に含む混合物を、１−（２−デオキシ−５−Ｏ−モノメトキシトリチル−β−Ｌ−トレオ−ペントフラノシル）チミン ８〔０．５ｇ、０．９７mmol〕及びトリフェニルホスフィン（０．７６ｇ、２．９mmol）をＴＨＦ（１１．６ml）に含む溶液に、０℃で、３０分間かけて滴下した。混合物を室温で３．５時間撹拌し、エタノールを加えた。真空中で濃縮乾固した後、残渣を、酢酸（２４０ml）及び水（６０ml）の混合物に溶解して、ｍＭＴｒ保護基を除去した。混合物を室温で５時間攪拌し、トルエンで希釈した。分離した水相を真空中で濃縮乾固した。残渣を、酢酸エチルで溶離するシリカゲルカラムで精製して、β−Ｌ−ＡＺＴ（１０５mg、４０％、酢酸エチルから結晶化）を得た。β−Ｌ−ＡＺＴの物理化学的データは、文献記載のデータどおりであった［J.Wengel,J-Lau,E.B.Ledersen,C.N.Nielsen,J.Org.Chem.56（11）,3591-3594（1991）］.
２′−置換β−Ｌ−ジデオキシヌクレオシドの立体特異的合成の一般的スキーム
Figure 0004413996
実施例＝１−（２−フルオロ−２，３−ジデオキシ−β−Ｌ−トレオ−ペントフラノシル）−５−フルオロシトシン〔２′−Ｆ−β−Ｌ β−Ｌ−ＦｄｄＣ〕
Figure 0004413996
これまで知られていなかった２′−Ｆ−β−Ｌ−ＦｄｄＣを、１−（５−０−ベンゾイル−３−デオキシ−β−Ｌ−エリトロ−ペントフラノシル）−５−フルオロウラシル １７から、５段階で合成し、全体的収率は２８％であった。融点：２０９−２１０℃（無水エタノールから結晶化）；UV（Et OH）λmax276nm（ε,9000）,λmin226nm（ε,4000）;19F-NMR（DMSO-d6）δppm:-179.7（m,F2’）,-167.2（dd,F5;JF,6=7.3Hz,JF,1’=1.5Hz）;1H-NMR（DMSO-d6）δppm:8.30（d,1H,H-6;J6,F=7.3Hz）,7.8-7.5（br s,2H,NH2）,5.80（d,1H,H-1’J1’,F=17.4Hz）,5.34（t,1H,OH-5’;J=4.8Hz）,5.10（dd,1H,H-2’;J2’,F=51.2Hz;J2’,3’=3.4Hz）,4.3（m,1H,H-4’）,3.8-3.6（m,2H,H-5’，5”）,2.2-2.0（m,2H,H-3’,H-3”）;質量スペクトル（実施：グリセロール−チオグリセロール、１：１υ／υ）、FAB>0:248（M+H）+,130（BH2）+;FAB<0:246（M-H）-;
Figure 0004413996
=-16.5（-c 0.85,DMSO）.Ｃ9Ｈ11Ｎ3Ｏ3Ｆ2の計算値：Ｃ、４３．７３；Ｈ、９．４９；Ｎ、１７．００；Ｆ、１５．３７．実測値：Ｃ、４３．５６；Ｈ、４．７８；Ｎ、１６．７５；Ｆ、１４．９６．
Figure 0004413996
II．ヌクレオシドの抗ＨＢＶ活性
活性化合物の、ＨＢＶ阻害能は、各種実験技術により測定することができる。開示化合物のＨＢＶの複製に対する阻害能を評価するためにここで用いたアッセイは、Korba and Gerin,Antiviral Res.19:55-70（1992）に詳細に記載されている。β−Ｌ−２′，３′−ジデオキシシチジン（β−Ｌ−ＦｄｄＣ）、β−Ｌ−２′，３′−ジデオキシ−５−フルオロシチジン（β−Ｌ−ｄｄＣ）、及び（＋）−β−Ｄ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−ジオキソラン（（＋）−β−Ｄ−ＦＤＯＣ）については、説明のためだけに、その毒性及び抗ＨＢＶ−活性の評価結果を以下に示すが、本発明を限定するものではない。（−）−β−Ｌ−２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン（（−）−β−Ｌ−ＦＴＣ）及びβ−Ｄ−２′，３′−ジデオキシシチジン（β−Ｄ−ｄｄＣ）の毒性及び抗ＨＢＶ活性は、コントロールとした。ここに開示するそのほかの化合物は、同様に評価することができる。
抗ＨＢＶアッセイに使用したβ−Ｌ−ｄｄＣ及びβ−Ｌ−５−ＦｄｄＣの試料は、以下の特徴を有していた：
２′，３′−ジオキシ−β−Ｌ−シチジン（β−Ｌ−ＤＤＣ）
融点＝２２０−２２０℃；UV（EtOH 95）max273nm,λmin 252nm;NMR-1H（DMSO-d6）δppm= 7.89（d.1H.H-6;J=7.4Hz）.7.15-6.95（d large,2H,NH2）,5.91（dd.1H,H-1’;J=3.0及び6.5Hz）,5.66（d,1H,H-5;J=7.4Hz）,4.99［t.1H,OH-5’;J-5.2Hz］.4.05-3.95（m,1H,H-4’）,3.60-3.70（m,1H,H-5’;D2O交換後:dd,3.64ppm,J=3.6及び12.0Hz）.3.60-3.50（m.1H,H-5”;D2O交換後:dd,3.50ppm,J=4.1及び12.0Hz）,2.30-2.15（m.1H,H-2’）,1.9-1.65（m,3H,H-2”,3’及び3”）;
Figure 0004413996
-103.6（c 0.8MeOH）;質量スペクトル（実施：グリセロール−チオグリセロール、50:50.v/v）;FAB>0 423［2M+H］+,304［M+グリセロール+H］+.212［M+H］+,112［BH2］+,101［s］+;FAB<0 210［M-H］-.Ｃ9Ｈ13Ｎ3Ｏ3（M=211.21）の計算値；Ｃ ５１．１８；Ｈ ６．２０；Ｎ １９．８９、実測値；Ｃ ５１．３４；Ｈ ６．２５；Ｎ ２０．１２．
２′，３′−ジデオキシ−β−Ｌ−５−フルオロシチジン（β−Ｌ−５−ＦＤＤＣ）
融点＝１５８−１６０℃；UV（EtOH 95）λmax 281nm（ε,8100）及び237nm（ε,8500）;min 260nm（ε,5700）及び225nm（ε,7800）;NMR-1H（DMSO-d6）δppm 8.28（d.1H,H-6;J-7.4Hz）,7.7-7.4（d large,2H,NH2）,5.83（ddほとんど解像されず，1H,H-1’）,5.16（t.1H,OH-5’;J=5.1Hz）,4.05-3.95（m,1H,H-4’）,3.8-3.70［m,1H,H5’;D2O交換後:dd,3.71ppm.J=2.7及び12.3Hz］,3.60-3.50［m,1H,H-5”;D2O交換後:dd,3.52ppm;J=3.3及び12.3Hz］,2.35-2.15（m,1H,H-2’）.1.95-1.75（m,3H,H-2”,3’及び3”）:
Figure 0004413996
-80.0（-c 1.0,DMSO）;質量スペクトル〔実施：３−ニトロベンジルアルコール〕FAB>0 230［M+H］+及び101［s］+;FAB<0 228［M-II］-.Ｃ9Ｈ12Ｎ3ＦＯ3（M=229.21）の計算値；Ｃ ４７．１６；Ｈ ５．２８；Ｎ １８．３３，Ｆ ８．２９、実測直；Ｃ １６．９０；Ｈ ５．２８；Ｎ １８．０７；Ｆ ８．１７
細胞の異なる２種類の継代で、抗ウィルス活性の評価を行った（１継代当たり２培養、合計４培養）。全プレートの全ウエルに、同一濃度、同一時間で接種を行った。
細胞内及び細胞外ＨＢＶ ＤＮＡの両方の濃度の固有の変動のため、非処理細胞中のこれらのＨＢＶ ＤＮＡ形態の平均濃度から３．０倍（ＨＢＶビリオンＤＮＡについて）を超える、又は２．５倍（ＨＢＶ ＤＮＡ複製中間体について）を超える抑制のみを、統計学的に有意〔Ｐ＜０．０５〕（Korba and Gerin,Antiviral Res.19:55-70,1992）であると一般にみた。それぞれの細胞ＤＮＡ調製物における組込まれたＨＢＶ ＤＮＡの濃度（これらの実験においては、細胞当たりのベースでは、一定のままである）を、細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ形態の濃度を算出するために使用して、ブロットハイブリダイゼーションアッセイに固有の技術的変動を排除した。
非処理細胞における細胞外ＨＢＶビリオンＤＮＡの代表的値は、培地１ml当たり５０〜１５０pg（平均約７６pg/ml）の範囲であった。非処理細胞における細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ複製中間体は、細胞ＤＮＡ１μg当たり５０〜１００pgであった（細胞ＤＮＡ１μg当たり平均約７４pg）。一般的に、抗ウィルス性化合物処理による細胞内ＨＢＶ ＤＮＡ濃度の抑制は、それほど顕著ではなく、ＨＢＶビリオンＤＮＡ濃度の抑制よりも、緩徐に起きた。
参考のため、これらの実験のためにハイブリダイゼーション分析を行った方法では、細胞ＤＮＡ１μg当たり約１．０pgの細胞内ＨＢＶ ＤＮＡが、細胞当たり２〜３ゲノムコピーに等しく、培地１ml当たり１．０pgの細胞外ＨＢＶ ＤＮＡは、１ml当たり３×１０5個のウィルス粒子に等しかった。
観察されたなんらかの抗ウィルス性効果が、細胞生存度に対する一般的効果によるものであるかどうかを評価するために、毒性の分析を行った。用いた方法は、ＨＳＶ（単純ヘルペスウィルス）及びＨＩＶを含む各種ウィルス−宿主系において標準的かつ広く使用されている細胞生存度のアッセイである、ニュートラルレッド染料取り込みに基づく方法である。
試験化合物は、４０mM保存用ＤＭＳＯ溶液（ドライアイスで凍結）の形で使用した。試験試料は、毎日の使用量づつ作成し、−２０℃で凍結して、それぞれ個々の量が、一回の凍結−解凍周期に付されるようにした。毎日の試験量を解凍し、室温で培地に懸濁し、すぐに細胞培養物に加えた。化合物は、その抗ウィルス活性について、０．０１〜１０μMで試験した。毒性については、１〜３００μMの濃度で試験した。結果を、表１に示す。
Figure 0004413996
実施例２ 化合物の毒性
活性化合物が２，２，１５セルカルチャ−（肝炎ビリオンにより形質転換されたHepG2細胞）中のウィルス増殖を阻害する能力を評価した。表１に示したように、顕著な毒性（非処理細胞において染料取り込みレベルの５０％以上の抑制が観察される）は、１００μM濃度においてどの試験化合物においても観察されなかった。これらの化合物は３００μMにおいて中程度に毒性であるが、しかし、３種の化合物すべてが、この濃度においてβ−Ｄ−ｄｄＣよりも低い毒性を示した。β−Ｌ−ｄｄＣ及びβ−Ｌ−ＦｄｄＣのＩＣ50は、β−Ｄ−ｄｄＣのそれの約２倍であると思われる。
毒性分析は、９６ウェルの平底組織培養プレートで行った。毒性分析用の細胞を培養し、抗ウィルス評価に用いられるのと同様な方法により、試験化合物で処理した。各々の化合物を４濃度で、それぞれ３培養物において試験した。相対的毒性レベルを決定するために、ニュートラルレッド染料の取り込みを用いた。定量的分析のために、５１０nMにおける取り込まれた染料の吸光度（Ａ510）を用いた。数値は、同じ９６ウェルプレート上で保持した９個の別々の非処理細胞培養物の試験化合物処理細胞に対する平均Ａ510値のパーセント（±標準偏差）を表す。プレート４０上の９個の対照群培養物における染料の取り込み％は、１００±３であった。これらの分析において、一般に、β−Ｄ−ｄｄＣの１５０〜１９０μMにおいては、染料取り込みが（非処理培養物において観察されたレベルに対し）半減することが観察された（Korba and Gerin,Antiviral Res.19:55-70,1992;）。
実施例３ 抗Ｂ型肝炎ウィルス活性
陽性の治療対照物β−Ｄ−２′，３′−ジデオキシシトシン〔β−Ｄ−ｄｄＣ〕は、用いた濃度においてＨＢＶのＤＮＡの複製の顕著な抑制を誘導した。これまでの研究によれば、この分析方法においては、β−Ｄ−ｄｄＣの９〜１２μMは、ＨＢＶ ＲＩを９０％抑制する（非処理細胞における平均的レベルに対して）ことが一般に観察されるということが示されてきた。これは、表１に示したデータと一致する。
表１に示したデータは、３種の試験化合物（β−Ｌ−ＦｄｄＣ、β−Ｌ−ｄｄＣ及びβ−Ｄ−ＦＤＯＣ）が、ＨＢＶ複製の強力な阻害剤であって、ＨＢＶビリオンＤＮＡ及びＨＢＶ ＲＩに対し、β−Ｄ−ｄｄＣによる処理後に観察されるのに匹敵するほどの、又はそれ以上の抑制を引き起こすことを示している。
実施例４
トランスフェクトされたHep G細胞におけるＢ型肝炎ウィルス複製に対する、選択されたβ−Ｌ−誘導体の効果を表２に示した。
Figure 0004413996
実施例５
マーモット肝炎ウィルスＤＮＡポリメラーゼに対する、選択されたトリホスフェート類の相対的阻害効果を表３に示した。
Figure 0004413996
III．医薬組成物の製造
本明細書に開示した化合物及びその薬学的に許容しうる塩、プロドラッグ及び誘導体は、ＨＢＶ感染及び他の関連症状、例えば抗ＨＢＶ抗体陽性及びＨＢＶ−陽性症状、ＨＢＶに起因する慢性的肝炎症、肝硬変、急性肝炎、激症肝炎、慢性持続性肝炎及び疲労などの予防及び治療に有用である。これらの化合物又は配合物は、抗−ＨＢＶ抗体又はＨＢＶ−抗原陽性であるかもしくはＨＢＶに暴露されてきた人々において臨床疾患を予防したり、これの進行を遅らせたりするのに用いることもできる。
これらの症状のどれかに罹患している人間は、この患者に本明細書中に記載された活性な化合物又はその薬学的に許容しうる誘導体もしくは塩の１つ又は混合物の、ＨＢＮ治療に有効な量を、場合によっては薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤に含めて、投与することにより治療される。この活性な物質は、いかなる適切な経路によって投与してもよく、例えば、経口、非経口、静脈内、皮膚内、皮下又は局所的に、液体又は固形の形態で投与される、
この活性な化合物は、治療される患者に重篤な毒作用を引き起こさずに治療上有効な量をその患者に送達するのに十分な量において、薬学的に許容しうる担体又は希釈剤に包含されている。
この活性な化合物の好ましい用量は、上記したすべての条件において、一日あたり体重１kgあたり約１〜６０mgであり、好ましくは１〜２０mgであり、より一般的には、一日あたり、患者の体重１kgあたり０．１〜１００mgである。この薬学的に許容しうる誘導体の有効な用量範囲は、送達すべき親ヌクレオシドの重量を基礎に計算することができる。もし、誘導体がそれ自身で活性を示すのであれば、上記に記載したように誘導体の重量を用いるか、又は当業者に既知の他の方法により見積もることができる。１つの実施態様として、活性化合物は製品の添付文書（productinsert）、又はＨＩＶ処方のための３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２′，３′−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、２′，３′−ジデオキシシチジン（ＤＤＣ）又は２′，３′−ジデオキシ−２′，３′−ジデヒドロチミジン（Ｄ４Ｔ）に関する医師の卓上参考書（Physician’s Desk Reference）に記載されているように投与する。
この化合物は、便利には、いかなる適切な投与形態の単位で投与してもよく、この形態は、７−３０００mg、好ましくは７０〜１４００mgの活性成分を単位投与形態あたり含有するものが含むが、これに限定されるわけではない。経口用量としては、通常、５０〜１０００mgが便利である。
理想としては、活性成分は、活性化合物の約０．２〜７０μM、好ましくは１．０〜１０μMの血漿濃度のピークを達成するように投与されるべきである。このことは、例えば、活性成分の０．１〜５％溶液、場合によっては生理食塩水溶液を静脈注射することにより、あるいは、活性成分のボーラス投与により達成される。
活性化合物は薬学的に許容しうる塩の形で提供される。ここで用いられる「薬学的に許容しうる塩又は複合体」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、もしあるとすれば最小の望ましくない毒性学的効果を示すヌクレオシドの塩又はその複合体を意味する。そのような塩の例としては、（ａ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）により形成される酸付加塩、ならびに酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸及びポリガラクツロン酸のような有機酸により形成される付加塩；（ｂ）ナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、などのカチオンによる塩基付加塩、又はＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、アンモニウム又はエチレンジアミンから形成された有機カチオンにより形成された塩基付加塩；あるいは、（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせ、例えばタンニン酸亜鉛塩など、を意味する。
活性化合物の修飾、特にＮ6又はＮ4、及び５′−Ｏ位における修飾は、活性種のバイオアベイラビリティ及び代謝速度に影響を与えて、活性種の送達を調節する。
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、この薬物の吸収、不活性化及び排泄速度ならびに当業者に既知の他の要素に依存する。用量は治癒すべき症状の程度によっても変化することに注意すべきである。更に、いかなる特定の患者に対しても、その個人の必要性及びこの組成物を患者に投与しそれを監督する人間の専門的判断にしたがって特定の投与方式を経時的に適用すべきであって、ここに示す濃度範囲は単に例として挙げたに過ぎず、本発明の組成物の実施の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。活性成分は、一度に投与されてもよく、又は時間間隔を変化させてより少ない用量を数回投与してもよい。
この活性化合物の好ましい投与方法は、経口投与である。経口投与用組成物は、一般に、不活性な希釈剤又は食用の担体を含む。これらはゼラチンカプセルに封入されても、又は錠剤に打錠されてもよい。治療用経口投与の目的のためには、活性化合物は賦形剤に包含されて錠剤、トローチ又はカプセルの形で用いられる。薬学的に調和しうる結合剤及び／又はアジュバント物質も組成物の一部として含有されていてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のどれか、又はそれと同様な性質の化合物を含有してよい；微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンのような結合剤；澱粉又は乳糖のような賦形剤、アルギニン酸、プリモデル（Primogel）又はコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はSterotesのような滑沢剤（glident）；コロイド状シリコンジオキシドのような滑剤；ショ糖又はサッカリンのような甘味料；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料のような賦香剤。単位投与形態がカプセルである場合、これは、上記の物質に加えて、脂肪油（fatty oil）のような液状担体を含有できる。これに加えて、単位投与形態は、この投与形態の物理的形態を変化させる種々の他の物質、例えば砂糖、シェラック又は他の腸溶成分による被覆を含んでいてもよい。
この活性化合物又はその薬学的に許容しうる塩もしくは誘導体は、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェファー、チューインガムなどの成分として投与されてもよい。シロップは、活性化合物に加えて、甘味剤としてのショ糖及びある種の防腐剤、染料ならびに着色料及び香料を含んでよい。
活性化合物、又は薬学的に許容しうるその誘導体もしくは塩はまた、所望の作用を損なわない他の活性な物質、又は所望の作用を補足する他の物質、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤あるいは、抗−ＨＢＶ剤、抗サイトメガロウィルス剤又は抗ＨＩＶ剤をはじめとする他の抗ウィルス剤と混合してもよい。
非経口、皮内、皮下又は局所適用の溶液又は懸濁液は、以下の成分を含有していてもよい；
滅菌した希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような浸透圧を調節する物質。非経口投与用の製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、又はガラスもしくはプラスチック製の多回投与用バイアル中に封入されていてよい。
静脈内投与される場合は、好ましい担体は生理的食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。好ましい態様においては、活性化合物は、この化合物が体から急速に排出されることを防ぐ担体、例えば、インプラント（implants）及びマイクロカプセルに封入された送達系をはじめとする、調節放出配合物のような担体とともに製造される。生分解性で生体適合性（biocompatible）ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類及びポリ乳酸が使用しうる。そのような配合物の製造は、当業者には明らかである。これらの材料は、市販の、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals,Inc.から得てもよい。
リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた薬学的に許容しうる担体として好ましい。これらは、当業者に既知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号（本明細書中に参考としてその全文を包含する）に記載された方法により製造される。例えば、リポソーム配合物は、適切な脂質（例えばステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラキドイル（arachadoyl）ホスファチジルコリン及びコレステロール）を無機溶媒に溶解し、次いでこれを蒸留し、乾燥した脂質の薄いフィルムを容器の表面に残すことにより製造される。活性化合物又はそのモノホスフェート、ジホスフェート及び／又はトリホスフェート誘導体の水溶液を、次いでこの容器内に導入する。この容器を、次いで、用手的に攪拌して容器の側面から脂質物質を遊離させて脂質の凝集体を拡散させ、これによりリポソーム懸濁液を形成する。
本発明をその好ましい態様に関して記載した。当業者にとっては、上記した本発明の詳細な説明から、本発明の変形及び修飾は当然のことである。このような変形及び修飾は、別紙の請求項の範囲内に包含されることを意図している。

Claims (19)

  1. Ｂ型肝炎ウイルスに感染した患者を治療するための医薬組成物であって、有効量のβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグを含み、
    ａ）ヌクレオチドが５’−炭素において、５’−モノ−、ジ−又はトリ−ホスホリル化されており、
    ｂ）ホスフェート部分上の１以上の水素が、アルキル、アリール、１，２−ジアシルグリセロール及びＳ−アシル−２−チオエチルから独立して選択される部分により置換されており、並びに
    ｃ）ヌクレオチドが、その反対のβ−Ｄ−エナンチオマーを少なくとも９５％含まないものである
    医薬組成物。
  2. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグがβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンモノホスフェートである請求項１に記載の組成物。
  3. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグがβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンジホスフェートである請求項１に記載の組成物。
  4. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグがβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシントリホスフェートである請求項１に記載の組成物。
  5. ヌクレオチドのホスフェート部分中にある１以上の水素がアルキルで置換されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. ヌクレオチドのホスフェート部分中にある１以上の水素がＳ−アシル−２−チオエチルで置換されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
  7. ヌクレオチドのホスフェート部分中にある１以上の水素が１，２−ジアシルグリセロールで置換されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
  8. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグであって、
    ａ）ヌクレオチドが５’−炭素において、５’−モノ−、ジ−又はトリ−ホスホリル化されており、
    ｂ）ホスフェート部分上の１以上の水素が、アルキル、アリール、１，２−ジアシルグリセロール及びＳ−アシル−２−チオエチルから独立して選択される部分により置換されており、並びに
    ｃ）ヌクレオチドが、その反対のβ−Ｄ−エナンチオマーを少なくとも９５％含まないものである
    ヌクレオチドプロドラッグ。
  9. ヌクレオチドのホスフェート部分中にある１以上の水素がアリールで置換されている請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
  10. ヌクレオチドがホスホリル化されており、且つホスフェート部分上の１以上の水素が、式：−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（ＣＨ3）3のＳ−アシル−２−チオエチル基で置換されているものである請求項１に記載の組成物。
  11. 第二の化合物であって、２−ヒドロキシメチル−５−（５−フルオロシトシン−１−イル）−１，３−オキサチオラン又はその生理学的に許容される塩の（−）−エナンチオマー又はラセミ混合物；２’−フルオロ−５−エチル−アラビノシルウラシル（ＦＥＡＵ）又はその生理学的に許容される塩のエナンチオマー又はラセミ混合物;カルボビル;及びインターフェロンからなる群から選択されるものを有効量さらに含有する請求項１に記載の組成物。
  12. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグがβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンモノホスフェートである請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  13. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグがβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンジホスフェートである請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  14. β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシンのヌクレオチドプロドラッグがβ−Ｌ−２’，３’−ジデオキシアデノシントリホスフェートである請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  15. ホスフェート部分上の１以上の水素がアルキルで置換されている請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  16. ホスフェート部分上の１以上の水素がアリールで置換されている請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  17. ホスフェート部分上の１以上の水素がＳ−アシル−２−チオエチルで置換されている請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  18. ホスフェート部分上の１以上の水素が１，２−ジアシルグリセロールで置換されている請求項８に記載のヌクレオチドプロドラッグ。
  19. 請求項８のヌクレオチドプロドラッグを、医薬的に許容される担体中に含有する医薬組成物。
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