CN1293884C - 6－甲氧基双脱氧鸟苷在制备抗乙肝药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及6-甲氧基双脱氧鸟苷在制备抗乙肝药物中的应用。实验表明，6-甲氧基双脱氧鸟苷单用或者联合用药都可以抗乙肝病毒，且可以防止耐药株的产生，防止肝癌的产生，是一种既能抗乙肝病毒又能抗耐受拉米呋丁的乙肝病毒突变株的化合物。
Description
技术领域
本发明涉及6-甲氧基双脱氧鸟苷的一种新用途，具体说是其用于抗乙肝病毒的用途。
背景技术
乙型肝炎作为一种传染病已被认识了上千年，在引入现代抗病毒疗法之前，我国传统中医就采用了黄芪、五味子和柴胡等中药合剂治疗肝炎取得了一定的抗乙肝病毒治疗效果。直到今天这些药物仍在我国广泛使用。
干扰素作为第一个被广泛用于治疗乙型肝炎的现代西药，其作用机理为刺激寡聚乙酰合成酶从而抑制病毒蛋白的合成，其它抗乙肝病毒机理主要为增强机体的细胞免疫功能杀伤感染乙肝病毒的肝细胞达到抑制乙肝病毒在肝细胞内的复制的目的。在临床上申请人观察到约30-40％长期使用α-干扰素的慢性乙肝患者其乙肝病毒的e抗原转阴，病毒复制受到控制，但对乙肝患者主要由母婴垂直传播感染的我国使用α-干扰素治疗效果不太理想。再者干扰素不能经口服，需肌肉或皮下注射以及高昂的价格(一个疗程需数万人民币)，并常常引发流感样症状以及骨髓毒性，精神系统紊乱等严重副作用，妨碍了干扰素的广泛应用。
1998年底，美国国家药品监督管理局(FDA)批准了拉米呋丁(葛兰素制药厂)用于治疗乙型肝炎。这是世界上第一个用于抗乙肝病毒治疗的核苷类药物。该药的抗病毒机理为渗入到乙肝病毒的正负链从而阻断了病毒的DNA合成，它是抑制病毒复制的链阻滞剂。临床应用上，服用拉米呋丁的乙肝患者其乙肝病毒复制可得到迅速而明显的控制，约30％患者的HbeAg转阴，肝功能有明显好转，但在经过约1年左右长期治疗后，15-40％的患者体内产生了针对拉米呋丁的耐药突变病毒株。经分析发现，这种突变发生在病毒DNA多聚酶的552氨基酸残基上由甘氨酸替换了原来的蛋氨酸，并且这种病毒突变株不在对拉米呋丁敏感(IC50升高了约1万倍)，使其失去了原有的抗乙肝病毒作用，也表明单一使用拉米呋丁治疗乙肝患者不能达到彻底清除乙肝病毒的效果。为此，一种能更有效地抑制乙肝病毒复制且还能抗拉米呋丁耐受突变株的药物已被人们所期待。
1988年加拿大阿尔伯塔大学首次报道了2.6二氨嘌呤脱氧核酸(ddDAPR)化合物在乙肝病毒感染的北京鸭的肝细胞实验中有明显的抗乙肝病毒作用，其IC500.5um，还发现在细胞培养18天后，用斑点分子杂交实验检查从细胞提取的乙肝病毒DNA已完全消失。
该化合物还被用于肌肉注射10mg/kg每天2次治疗感染乙肝病毒的北京鸭，治疗2周后，病毒DNA已不能用杂交实验测到，但停药后乙肝病毒又回到治疗前水平。
该化合物属于双脱氧鸟苷(ddG)的前体药，在人体内能迅速脱氨转化成ddG，后者再被细胞内的磷酸激酶活化成ddGTP，并推测可能是ddGTP渗入到病毒DNA链中从而阻断病毒复制，但这个化合物较不稳定，且难溶水，口服后生物利用度低。
1996年阿尔伯塔大学再次报道了ddDAPR抗乙肝病毒复制是由于其在细胞内转化成ddGTP，后者能结合在病毒多末端蛋白物的道转录复制的起始端，从而阻断了DNA的合成，因为在人乙肝病毒和鸭乙肝病毒负链DNA第一个被合成的核苷酸便是dGTP，由于ddGTP取代了其位置，从而终止了负链DNA的合成。但同时ddGTP也可以象拉米呋丁一样渗入到正负链中，从而阻滞病毒的复制。
所以找到一个象ddDAPR化合物，但比其更稳定，生物利用度更高的双脱氧鸟嘌呤前体药物就成为了人们孜孜以求的目标。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是寻找一种既能抗乙肝病毒又能抗耐受拉米呋丁的乙肝病毒突变株的化合物。
为解决上述问题，本发明通过大量的实验，发现有着和ddDAPR类似的化学结构的6-甲氧基双脱氧鸟苷有明显的抗乙肝病毒的作用。其抗乙肝病毒的机理也是通过在机体内脱氨转化成ddG，后者在细胞内激活成ddGTP，分享与ddDAPR一样的抗乙肝病毒的机理。但比ddDAPR更稳定，口服后生物利用度更高的双脱氧鸟嘌呤前体化合物。
实验表明，6-甲氧基双脱氧鸟苷单用或者联合用药都可以抗乙肝病毒，且可以防止耐药株的产生，防止肝癌的产生，是一种即能抗乙肝病毒又能抗耐受拉米呋丁的乙肝病毒突变株的化合物。6-甲氧基双脱氧鸟苷合成方法已有报道(Robins M.J..等人，J.Org.Chem.1995，60(24)，7902-7908)。以下是该化合物的结构式：
具体实施方式
下面是申请人用6-甲氧基双脱氧鸟苷在原代鸭肝细胞和北京鸭、土拨鼠乙肝病毒动物模型中的抗病毒作用和细胞毒性所作的部分实验：
1、在原代鸭肝细胞中的抗乙肝病毒活性测定
选用刚出生10天的先天感染乙肝病毒的北京鸭，取其肝脏并制备出肝细胞，在直径60mm的培养皿中加入2×106个肝细胞，，培养液为L-15营养液并含有5％的牛血清，培养在5％CO237℃的孵箱中，培养第二天后在加入不同浓度的试验化合物于培养皿中，使其最后浓度为0，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml。每两天换培养液和试验药物直到16天。然后加入细胞裂解液于培养皿中裂解细胞，并加入200ug/mlprotenase K继续孵育1个半小时，加入同体积的饱和酚和氯仿提取DNA，最后溶解于TE缓冲液中DNA样本被点在尼龙膜上(Hybond-N，Amersham)，经变性、中和以及紫外线照射后与32P标记的鸭乙肝病毒DNA探针杂交，洗涤凉干、压片冲洗后即可读出结果，分析出所试化合物的抗乙肝病毒的IC50。
该化合物鸭乙肝原代细胞的抗乙肝病毒IC50为0.3um稍好于ddDAPR，后者为IC500.5um。
2、在原代鸭乙肝细胞和人体髓样白血病细胞(HL-60)的细胞毒性测定
申请人用MTT当今最常用的测定细胞毒性的实验来测定该化合物在原代鸭乙肝细胞和人体髓样白血病(HL-60)的细胞毒性。
简言之，申请人选用10天大小的北京鸭，取其肝脏、分离出单个肝细胞悬浮于L-15培养液中，经计数后，置于96孔板的细胞培养板中，每孔含有8×103细胞，培养在有5％CO2的37℃孵箱中，培养第二天后，开始加入不同稀释度的试验化合物，培养48小时后，加入MTT试剂后再继续培养2小时，离心培养板取出上清液再加入，每小时96孔培养板在540nm用分光光度计读出其光密度值(OD)。
细胞的存活度可由不同浓度的化合物OD值/540nm/对照的OD值540nm来计算，最后再算出TC50，实验结果表明该化合物的TC50在鸭乙肝原代细胞中为500um但在人体髓样白血病(HL-60)的TC50为3000um，该化合物的药物选择指数为TC50/IC50＝500/0.3＝1667，再次表明这是一个有效且非常安全的抗乙肝病毒的化合物。
3、为了比较该化合物和拉米呋丁这两种作用机理不同的化合物在抗乙肝病毒中的作用以及探讨联合用药的效果，申请人分别在土拨鼠和北京鸭动物模型进行了分组治疗。
本实验共用了年龄为一周年的已感染乙肝病毒的土拨鼠12只。每组3只，分别为拉米呋丁治疗组(30mg/kg)、该化合物治疗组(20mg/kg)及联合用药组(20mg/kg拉米呋丁加20mg/kg该化合物)以及磷酸缓冲液对照组，每天肌肉注射两次共60周。
血清采样分别为治疗前一周、开始治疗当日、治疗后一周、第4周，以后为每4周一次直到60周。
北京鸭为出生1月大小的已感染鸭乙肝病毒的北京鸭12只，区组治疗同土拨鼠一样，每天肌肉注射2次共治疗60周。血液采样分别为治疗前一周，开始治疗当时、治疗后一周第2周，以后为每2周一次，直到60周。
此外，申请人还对北京鸭进行了肝活检、分别在治疗前，治疗后4周、12周、36周、60周。
血清标本分别用来作斑点分子杂交试验，PCR、AST、ALT、α-AFP，白蛋白和胆红素的分析。肝穿组织分别用来做CCC-DNA以及乙肝病毒中间复合体检查和免疫组化查乙肝病毒核心抗原。
在土拨鼠动物模型治疗中，经过4-8周的治疗后。在拉米呋丁组，该化合物组以及联合用药组用斑点杂交试验已不能测到病毒，而联合用药组到2周后病毒已几乎消失，但用PCR检查，除一只联合用药组的土拨鼠没能测到病毒外，均还能查到病毒DNA。治疗20周后在一只拉米呋丁治疗组的土拨鼠中查到了曾经一度消失的病毒DNA，与此同时在该土拨鼠中查到了混合的野毒株和拉米呋丁耐药突变株。
相较于对照组，肝内WHVCCC-DNA大致出现了3-5倍的下降，但直到治疗60周后仍不能彻底的消除。
另一个有趣的发现是联合用药组所有3只土拨鼠均没有发生肝癌，而安慰对照组以及拉米呋丁组该化合物组则分别有2只和1只土拨鼠出现肝癌迹象，如食欲下降、消瘦和活动减少、血液检查L-AFP升高。在对照组60周治疗结束后有两只土拨鼠死于肝癌，总之，在对土拨鼠各组治疗当中，尽管病毒受到明显的抑制，但都没能彻底消除，然而，在联合用药组或该化合物组还没有发现耐药突变株的产生，并且因能长期控制病毒的复制而能防止或延缓肝癌的发生。
在整个60周的治疗期间，除了土拨鼠冬眠所造成的体重减轻和治疗后期个别土拨鼠发生肝癌所出现的食欲下降、消瘦外，均没有发现别的异常表现，如：跋腿、脱毛、体重减轻、食欲下降等严重副作用。在北京鸭的治疗组中，仅一周的治疗，该化合物和联合用药组，乙肝病毒DNA用杂交试验已不能测到，但拉米呋丁组却治疗2周后才达到同样的结果，治疗8周后，大多数治疗组的鸭子病毒DNA已不能用第一轮PCR测到，但却仍能在第二轮PCR查到，但只有一只在联合用药组中的鸭子病毒DNA已彻底消失，无论用何种方法检测均不能查到。在肝穿组织的免疫组织分析中，发现各治疗组乙肝病毒核心抗原明显下降，在长期的联合治疗组的个别鸭子其它已测不到病毒抗原在肝组织的存在。与土拨鼠治疗组不同，所有北京鸭治疗组均没有发现耐受突变株的产生，这主要和北京鸭本身缺乏免疫反应功能，不能对鸭子乙肝病毒产生压力所致。
在对鸭肝组织病毒CCC-DNA的检查中发现，持续免疫的CCC-DNA下降几乎出现在所有治疗组中，尤其在联合治疗组中下降更为明显，但却长期存在。
尽管该化合物还不能从根本上彻底清除乙肝病毒，但申请人发现与拉米呋丁联合用药已有彻底清除乙肝病毒的可能性。整个60周的治疗期和对照组相比，均没有发现明显的副作用如：体重下降、跋脚、脱毛、食欲下降等。
4、对拉米呋丁耐药突变株的抗病毒试验。
自从拉米呋丁进入抗乙肝病毒的临床试验后，发现经治疗一年后大约30％的试验病人产生耐药突变病毒株主要为M512V突变株，使拉米呋丁失去了继续抗病毒的能力。
1996年加拿大阿尔伯塔大学首先用体外定点突变的办法，构建了鸭乙肝病毒M512V拉米呋丁耐受突变株，并成功的感染了LMH细胞(鸡颈淋巴瘤细胞)。此外，申请人又用这种在LMH细胞中产生的M512V突变株成功感染了北京鸭并建立了拉米呋丁耐受突变株北京鸭动物模型并在此动物模型上试验了该新型抗病毒化合物。
本实验申请人选用了四只成功感染了拉米呋丁耐突变株的北京鸭。2只为拉米呋丁治疗组，2只为拉米呋丁和该化合物的联合用药组。
血清标本采集为治疗前一周，治疗开始当日，第一周、第二周、第四周、第8周，用于斑点杂交试验和Saunthecn DNA的杂交斑点，申请人也在治疗前后测定了血中病毒DNA序列，确定其是M512V突变株。申请人发现在拉米呋丁组，病毒DNA在8周治疗后维持不变，但联合用药组仅在治疗第一周用斑点杂交试验已不能测到病毒DNA，这表明对拉米呋丁耐突变株对该化合物仍象野毒株一样敏感，但仍然维持对拉米呋丁的耐受。也象申请人提示如与拉米呋丁抗病毒机理不同的化合物联合用药可能会达到抑制病毒甚至彻底清除病毒的作用，并且能防止耐药突变株的产生。
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1、6-甲氧基双脱氧鸟苷在制备治疗乙肝的药中的应用。
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