CN1059659A - 病毒性肝炎的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

单独使用失配的dsRNA，特别是γI·γ (C_11-14U)_n，或者与一种或几种ganciclovir，香豆霉 素AI，双脱氧次黄苷或其核苷酸类似物联合使用，可 以有效地治肝炎病毒感染。

Description

近来发现病毒性肝炎的特征表现为细胞内某一特定分子构型的dsRNA缺乏。这种dsRNA对于“驱动”特定的宿主防御系统是必需的。这种生化缺陷在肝细胞及淋巴系统的某些外周血细胞中被放大。并且这种缺陷与不同病毒（肝炎病毒，反转录病毒和疱疹病毒经常是在同一个体内的同时增殖有关。外源性提供特定构型的dsRNA带来的理想的临床改善可以确诊这种缺陷。本发明涉及到与肝损伤有关的各种类型病毒如甲型、乙型和非甲非乙型肝炎病毒的治疗方法。

慢性乙型肝炎病毒感染（HBV）是一个全球性的健康问题。在世界范围内大约有2亿人可能有HBV慢性感染。这些感染人群对于个体来说意味着有严重患病的危险，并且它还具全球性流行和感染的巨大威胁。在美国所有正常健康献血者有0.1到0.5%是乙型肝炎表面抗原（HBsAG）阳性¹。在一个有高度感染危险性的选择人群中（医疗保健人员，血友病患者，透析病人，和使用注射器的吸毒者），HBsAg阳性的百分比可以高达30%。慢性乙型肝炎病毒（HBr）携带者可以通过输血或性接触进行传播。有些HBV携带者尤为引起注意，尤其是牙科医生，内科医生，或其他医务工作者，已经有报道这些人员在与病人的多次接触中可以进行传播。

乙肝病毒感染，一般是自我限制，可以导致一种慢性感染状态。10%的HBV感染者可以成为慢性病毒感染，包括：（1）慢性迁延性感染和，（2）慢性活动感染。前者（慢性迁延性感染）经常使病人无症状或者有轻微症状但仍在感染。后者（慢性活动性感染）很有可能会引起严重的衰弱以及危及生命的表现如肝硬变，门静脉高压，和死亡。肝细胞癌与慢性HBV感染也有密切的相关性^2-4。慢性HBV感染病人的病状表现各不相同，从没有症状到表现为中等程度的疲劳，不适，肌肉疼痛，关节痛，瘙痒，甚至表现为更为严重的肝功能不良（如出血性疾病，腹水，和脑病）。与慢性HBV有关的生化异常包括血清肝转氨酶的升高，血清白蛋白降低，血清胆红素升高和凝血酶原时间延长（在迁延性后期肝病当中）。肝炎病毒可以通过人体体液、粪便、性接触等传染。

有HBsAg持续性升高病史连同其他的相关血清学标志一起一直作为慢性HBV感染的一种标志。传统的血清学试验是定性的，HBsAg滴度与感染的严重程度无相关性，并且不一定表示有传染性。近些年来，发明了一种用HBsAg-DNA（HBV-DNA）与放射性标记cDNA进行杂化试验的检查方法。直接检查HBV-DNA能增加检查HBV感染的特异性（有时也出现假阳性HBsAg），并且大大增加了检查HBV感染的敏感性。传统的HBV-DNA检查方法是半定量的;将一种来自感染宿主的血清样本与放射性标记探针cDNA进行轨迹印迹杂化反应，可以得到一种放射自显影照片，用光密度计对该照片进行扫描可以计算出样本信号的密度，这一密度与HBV-DNA的近似量相关。另外，Abbott Labs，Chicago，IL.⁵设计了一种运用消化样本的I¹²⁵标记cDNA探针溶液进行杂化检查的试验。这种检查方法利用液相杂化，一步柱色谱分析和通过γ-释放进行HBV-DNA直接定量。据称该检查方法的限度是1.5微微克HBV-DNA/ml血清。

至少有三方面原因可以说明对HBV感染的有效治疗是重要的。

1、患有慢性活动性肝炎的病人肝脏疾病的改善：已经发现通过抗病毒治疗，乙肝病毒颗粒（HBeAg和HBV-DNA）的丧失与肝脏疾病的组织学改善和肝炎血清标志物的水平降低⁶有关。

2、患有慢性迁延性和慢性活动性肝炎的病人传染性的丧失：已经发现血清中DNA聚合酶和HBeAg的丧失的同时病人血清丧失了对易感黑猩猩的传染力。⁷

3、肝细胞癌发生可能性的降低：发明人所进行的实验首次有力地支持这一观点。

在本发明之前，对于慢性HBV感染及其相关疾病没有已知的治疗方法。近期报道指出干扰素对于某些病人的治疗有暂时的效果。而且，75%以上的慢性HBV感染患者对于干扰素不反应，并且干扰素治疗停止以后的持久效果仍然不稳定。其他的治疗方法效果不佳并且常常伴随有不利的毒付作用（即：阿糖腺苷（adenosine  arabinoside）

图1是对通过病毒探针杂交反应得到的鸭血清乙肝病毒（DHBV）DNA的印迹分析;

图2是分别在两个剂量的ganciclovir和一个剂量安慰剂的作用下进行的血清DHBV  DNA印迹杂交反应;

图3是表示8周内各种产物及对照物的血清DHBV  DNA聚合酶活性的坐标图。

图4的1-8排表示各种治疗或对照的两倍稀释液进行杂化反应分析，而得到的肝DHBV  DNA水平的印迹图。

肝炎病毒本身或者与其他病毒如反转录病毒和疮疹病毒一起可以通过生物样品如肝细胞和淋巴系统的某些外周血细胞中细胞内特定分子构型的dsRNA缺失而确定。病毒性肝炎感染通过给以外源性dsRNA或者与一种或几种抗病毒药结合在一起的dsRNA来治疗。

本发明公开了病人体内肝炎病毒，尤其是乙肝病毒，感染的诊断方法，首先测定健康人体细胞内2′-5′A寡聚腺嘌呤核苷酸合成酶的水平，与健康人的2′-5′A合成酶水平进行比较，异常表明有肝炎病毒感染，之后，如果需要的话，给以一定剂量的dsRNA以足以将2′-5′-寡聚腺嘌呤核苷酸的浓度调整到健康人的水平。

本发明还公开了病人体内乙肝病毒感炎的治疗方法，包括给以有效剂量的由一种失配的dsRNA与ganciclovir，foscarnet，香豆霉素A1（coumeracycinAI），或一种核苷类似物中的至少一种组成的药物组合物。病人体内也可能有某种反转录病毒，某种疱疹病毒或者二者皆有。

这种失配的dsRNA最好是一种含有1/5到1/30尿嘧啶胍碱基的聚次黄苷酸盐和聚胞苷酸盐的复合物。尤其是，dsRNA是γIn·γ（C_11-14′U）_n或者是一种含有结合键断裂区并且表现出γI·γ（C_11-14′U）_n的理想治疗比例特性的失配dsRNA。

失配dsRNA的给药剂量为使每毫升病人的系统血流量含2到1.000微克，如果使用其他抗病毒剂或药物，其给药剂量根据厂家说明使用其正常使用量。

Ampligen^R的生物学活性-Ampligen^R（聚I-聚C₁₂U，HEM Research，Inc.，Rockville，MD）属于一类双股（ds）RNA分子，并且在本发明中是指多种dsRNA中的原型dsRNA。下面对此进行了更为详细地解释和说明。双股RNAS起淋巴因子的作用，也就是说，是一种调节细胞免疫和抗病毒活性的分子。Ampligen^R活性包括自然杀伤细胞调节，巨噬细胞调节，B-淋巴细胞调节，肿癌坏死因子调节，干扰素调节（包括α，β，和γ型），和对干扰诱导的细胞内酶（2-5A合成酶和一种蛋白酶）的调节。在临床上，Ampligen^R可以稳定T₄细胞计数，以及可以增加病人体内与艾滋病相关复合物的延缓型高敏感反应。在体外和临床研究中都已发现其抗肿瘤作用。

以往曾认为Ampligen^R做为抗生长、抗病毒和免疫调节剂所产生的作用来自于它对干扰素级联的影响。也就是说，Ampligen^R一方面刺激干扰素的产生，另一方面，对于表达抗病毒和抗生长状态所必需的干扰素诱导的细胞内环境来说是一个必需的因素。但是，发明人认为归因于Ampligen^R的生物学抗病毒活性不能归因于干扰素的诱导。实际上，在Ampligen^R治疗之后的某些系统中可以发现抗病毒活性。

在1970年后期临床上使用一种双股RNA（即，聚I：聚C）做为一种抗肿瘤药物，但是由于严重的不可忍受的毒付作用而被淘汰了。Ampligen^R是一种特定形式的失配dsRNA，在该分子中尿苷酸（U）替代了被退火成多胞苷酸键的多胞苷酸链中每一个第12位的胞苷酸。这种“失配”的核苷酸碱基对在Ampligen^R的整个分子构型中产生一个特异的凸起。这种分子凸起可以保留了其生物学活性而使得Ampligen^R无毒付作用。尤其是，这种凸起使得该分子可以直接作为一起替代物，来治疗由肝炎病毒感染引起的且可以直接引起发病的细胞内dsRNA缺乏。

几个病人感染了疱疹病毒-6，一种仅在近期才发现的相对新型疱疹病毒。这种病毒已被分别称之为两种不同的名称HBLV（人B淋巴细胞病毒）或者是HHV-6（人疱疹病毒-6）。这种病毒的主要特征是它是大约162个壳粒和一种脂膜组成的二十面对称体。感染细胞发育成大的屈光细胞，并且某些病人可能有20-30%或者更多的循环淋巴细胞（一种特定类型的骨髓或胸腺系淋巴细胞）被感染。用特异性dsRNA治疗几个月后，感染细胞的百分比显著地下降。

dsRNA可以是由含有一定比例的尿嘧啶碱基或胍碱基，如含从1/5到1/30这种碱基（聚I·聚（C_4-29x＞UorG）），的聚次黄苷酸盐和聚胞苷酸盐组成的复合物。

用于本发明的dsRNA可以具有通式γIn·r（C_11-14′U）_n或γIn·γ（C₁₂′U）_n。下面描述了dsRNA的其他合适的范例。

“失配的dsRNA”是指那些配对股之间的氢键合（碱基堆积）是相对完整的，也即，在每29连续碱基对残基中，碱基对断裂平均不超过1个的dsRNA。应当据此来理解术语“失配的dsRNA”。

用于本发明的优选失配dsRNA以选自聚（Cn，U）和聚（Cn′G）的共聚核苷酸为基础，其中n是从4到29的整数。并且可以是通过修饰的γIn·γCn沿多核糖胞苷酸盐（γCn）链来结合未配对碱基（尿嘧啶或胍）而形成的多核糖次黄苷酸和多核糖胞苷酸组成的复合物的失配类似物。也可以通过修饰多核糖次黄苷酸（γIn）的核糖基主框架包括例如2′-0-甲基核糖基，从聚（I）·聚（C）dsRNA中产生该dsRNA。这种失配的复合物可以与一种RNA稳定聚合物如赖氨酸纤维素混合。所推荐的这些γIn·γCn的失配类似物是那些通式为γIn·（C_11-14′U）_n或γInl·γ（C₂₉，G）_n的，由Carter和Is′O的美国专利4，130，641和4，024，222所描述的那些，本发明参考并结合了该专利的公开内容。该专利所描述的dsRNA普遍适用于本发明的用途。

适用于本发明的失配dsRNA的其他范例包括：一

聚（I）·聚（C₄，U）

聚（I）·聚（C₇，U）

聚（I）·聚（C₁₃，U）

聚（I）·聚（C₂₂，U）

聚（I）·聚（C₂₀，G）

聚（I）·聚（C₂₉，G）和

聚（I）·聚C_p23G＞P

适用于实施本发明的另一类dsRNAs是所定义的结构的短dsRNAs，例如，具有下面通式的寡聚核苷酸：

5′锁-（I）n-锁3′

3′锁-（C）m-锁3′

其中m和n分别是大于5而小于100，I是单磷酸次黄苷，C是单磷酸胞苷，其中一条链中的锁互补于相链中的锁，或者是下列结构的寡聚核苷酸：

5′锁-[（I）xA]j-锁3′

3锁-[（C）yU]k-锁3′

其中X和Y分别是大于5并且小于25，j和k各自至少为1并且小于10，I和C同上所述，A是一种非I的核苷酸，而U是一种与A进行碱基配对的核苷酸。

另外，短的寡聚核苷酸也可以具有下面结构：

5′（I）n-铰合-（C）m3′

其中n，m，I和C的定义同上。

这些寡聚核苷酸可以在其中一条链中具有不互补于相对链中的核苷酸的取代。这些寡聚核苷酸最好通过内部对齐互补杂聚体而被稳定，并且最好锁定或/和铰合含有互补杂聚体的区域。这些寡聚核苷酸最好具有单链末端。对这些寡聚核苷酸更为详细的描述见由Gillespie和Carter于1988年4月14日申请的美国申请系列号07/181，385以及相应的PCT/US89/02172，本发明参考和结合了该专利的公开内容。这些寡聚核苷酸可以通过各种途径，包括口服，与合适的载体一起给药。

鸭乙型肝炎病毒与人乙型肝炎病毒（hepadnaviruses）具有共同的独特的复制途径，并且被认为是一种用来评价抗病毒药物抗人HBV效力的理想模型。乙肝病毒具有独特的复制途径和非常独特的基因组构成;即一种杂交到ds/ssDNA分子中的单链基因组。它可以整合到人基因组当中，并且使乙肝病毒阳性病人的肝癌患病率增加几百倍。在适合于慢性HBV研究的两种幼物系统，鸭子和土拔鼠当中，首先选择鸭子，因为鸭子不咬人。因此，鸭子代表一种药物试验的合理体内系统。

用于这些动物研究的一般技术方案如下：用单独的Ampligen^R，Ampligen^R+ganciclovir（抗病毒药），和Ampligen^R+ganciclovir+香豆霉素AI（DNA促旋酶抑制因子）治疗已经成为DHBV携带者的先天感染的鸭子，也可以使用萘啶酮酸（毒性小并且口服给药）。通过DNA杂交反应确定肝内的病毒负荷。

发明人用失配的dsRNA来治疗先天感染的已经成为DHBV载体的鸭子。单独用Ampligen^R或与ganciclovir或者与ganciclovir和香豆霉素A1联合使用对具有稳定和血清DHBV DNA相同水平的Pekin-Aylesbury杂交培育的小鸭进行治疗。通过腹膜内（i.P.）注射，每天单独给予Ampligen^R（7.5mg/kg）并连续给药28天。为了确定与Ampligen^R联合使用的其他抗病毒药是否能够获得一个意想不到的协同作用，也通过i.p.注射或口服（P.O.）在Ampligen^R治疗的后14天中每天以分配剂量给以ganciclovir（10mg/kg/天）和香豆霉素A1（10mg/kg/天）或者foscarnet或核苷酸类似物，如双脱氧次黄嘌呤核苷（DDI）。所有治疗的鸭子都完成了这种治疗方案。没有体重的减少或者明显的血液学，肝功能，或肾功能的不利变化，表明了dsRNA替代疗法的特异性。

下面的数据说明了几个显著的事实。用Ampligen^R治疗的小鸭子在治疗过程的前两周表现出血清DHBV DNA水平的明显降低，继续治疗两周，在停业治疗四周之后，血清病毒DNA水平开始缓慢回升。但是，如果Ampligen^R与其他药物如gancidovir联合使用，在治疗过程中对血清DHBV的抑制是完全的。Ampligen^R的其他联合用药中，如在Ampligen^R/ganciclovir/香豆霉素A1治疗的小鸭子中，出发现类似的情况。在全部联合用药治疗组中病毒DNA聚合酶水平也表现出抑制现象。肝组织样本的定量印迹分析表明在未治疗的对照组小鸭子中每个肝细胞有360个病毒基因组当量（vge）。单独使用Ampligen^R治疗之后，DHBV可降低83%，达到每个肝细胞60vge。治疗后四周，DHBV又回到每个细胞360vge的治疗前水平。在用Ampligen^R加ganciclovir治疗的小鸭子中，发现＜20vge/每个细胞（抑制＞94%）。在Ampligen^R/ganciclovir/香豆霉素AI治疗的小鸭子中所得结果与Ampligen^Rganciclovir治疗组基本相同。

不论从感染小鸭子的血清中间接得到还是直接从肝脏中所得的这些结果表明，单独或与其他抗病毒药物联合使用Ampligen^R可以引起对DHBV DNA复制的显著抑制。

图1表示一种病毒探针与Ampligen^R治疗鸭子的血清DHBV DNA进行杂化印迹反应。横排表示不同的鸭子，纵行表示连续周数。第1行是代表治疗前，2-5行表示4周的Arpligen^R治疗，而6-9行代表治疗后的4周。在一定时间内不同动物中所观察到的病毒水平应当是恒定的。

A和B排是Ampligen^R治疗组，C和D排是Ampligen^R治疗前两周和Ampligen^R+ganciclovir治疗第3周与第4周（4行和5行）的，E和F排是Ampligen前两周组和第3周和第5周的Ampligen^R+ganciclovir+香豆霉素A1治疗组，以及G排和H排代表病毒阴性对照组。

使用各种实验方法和单一或多种治疗药物，以字母代表，经过几周时间，以数字代表，所进行的研究情况见图2和3。

一种Ampligen^R（10mg/kg/天的两次分配量）治疗的慢性感染鸭子的类似印迹分析。

图4表示了做为肝DHBV DNA的肝病毒基因组水平。1-8排是1.5μg/鸭DNA的逐次两倍稀释液，总共稀释128倍。A-C分别代表从没有治疗的感染鸭子中所得到的5周、9周和13周肝样本。D和E排代表用Ampligen^R单独治疗结束时（D＝60病毒基因组/细胞）和治疗后四周（E＝360病毒基因组/细胞）的治疗情况。F和G排代表Ampligen^R+ganciclovir在治疗末（F＝20病毒基因组/细胞）和治疗后四周（G＝490病毒基因组/细胞）的治疗情况。H和I排代表用Ampligen+ganciclovir+香豆霉素AI）在治疗结束（H＝20病毒基因组/细胞）和之后四周末（I＝490基因组/细胞）的治疗情况。J.K和L排是病毒阴性对照组，M排是用于计算病毒DNA的病毒标准液。

用于人体的临床研究对4个具有免疫缺陷的HIV阳性病人用Ampligen^R（200mg）每周两次，静脉内给药）进行治疗的开放标记研究中，通过测定出其血清中HBV DNA的含量升高发现这些病人同时患有乙型肝炎病毒感染和疱疹病毒感染（HHV6）。在Ampligen^R治疗过程中4个病人中有3个表现出血清HBV DNA水平的降低。例如，一个病人在起初三个月的治疗中其水平从2⁺滴度降至1/2⁺滴度。同样，第二个病人在开始的4个半月Ampligen治疗中其血清HBV水平从3⁺降到2⁺。这些结果表明甚至在具有多种免疫功能缺陷的HIV患者中也表现出抗HBV的治疗反应。

通过监控由肝炎病毒病原体引起的细胞内dsRNA特异性缺陷的所产生的2′-5′A通道表现，发明人能够设计出一种特定结构的外源性dsRNA，目前用它可以治疗（同时）两种以上的病毒病原体。

实验室研究-在实验平行研究中，发明人发现在肝细胞和外周淋巴细胞中都末发现有激发合适的抗病毒/免疫防卫所必需的自然dsRNA。这种细胞内dsRNA缺陷表现为应当由慢性病毒感染适当向上调节而没有调节所引起的2′-5′A寡聚腺苷酸A（oligoA）通道的异常。在给以适当构型的失配dsRNA后，发明人发现宿主防卫通道正常化且同时伴随有上述各种人体和动物系统血中质粒病毒的下降（肝炎病毒，HIV和疱疹病毒）。

对外周血淋巴细胞中2′-5′寡聚腺苷酸合成酶/核糖核酸酶L通道也进行了研究。使用Carter等人所述的方法，见The  Lancet，6月6日，1987，1286-1292，可以通过分析外周血细胞是否有2′-5′寡聚腺苷酸的酶系缺乏来对病人血样本进行简易诊断。与相同性别和年龄的健康者所测结果相比，一旦出现异常，则可通过给以外源性dsRNA，最好是一种失配的dsRNA使其矫正，以改善病人的临床状况。在治疗过程和结束时，从细胞水平上检查病人的改善情况，这种改善通常要早于临床改善几周，如果需要并且要确定维持正常2-5′A合成酶/核糖核酸酶L通道以及维持或减少病人乙肝病毒水平所需要的dsRNA用量。

按照下列方法确定正常个体和乙型肝炎病毒患者体内2′-5′A分子的浓度：用聚U-[³²P]-PCP在2′-5′A核心-纤维素检查中（亲和色谱分析）分析病人样本（Ficoll-Hypaqwe纯化的外周血淋巴细胞）的乙醇溶解部分中2′-5′A的含量。在这种测试中，运用2′-5′A激活的核糖核酸酶L水解聚（U）的能力来确定功能性2′-5′A的浓度。

对通过确认没有肝损伤，发烧、无全症状、皮疹等没有近期病毒感染史的15个正常人进行检测获得参考值。运用标准2′-5′A分子所得到的标准曲线来确定淋巴细胞2′-5′A含量的浓度。

另外，通过高压液相色谱分析（HPLC）来定量测定2′-5′A浓度和分子大小。也可以应用核糖体RNA切割试验方法来确定病人体内合成的2′-5′A的生物学功能特性或者确定病人样本中激活的核糖核酸酶L的含量。用于分析的优选细胞是外周单核血细胞。

Claims (11)

1、一种诊断病人体内肝炎病毒感染的方法包括：(a)确定健康者体内细胞内2′-5′A寡聚腺苷酸合成酶的含量，与健康者相比，2′-5′A合成酶含量的异常表明有肝炎病毒感染的存在，和(b)给以足够量的某种dsRNA将其2′-5′寡聚腺苷酸浓度调节至健康者的水平。

2、一种病人体内肝炎病毒感染的治疗方法，包括给所说病人联合施用有效量的失配dsRNA与ganciclovir，香豆霉素A1，foscarnet，或某种核苷酸类似物中至少一种的复合物。

3、如权利要求1或2所说的方法，其中病人感染有甲型、乙型或非甲非乙型肝炎病毒。

4、如权利要求1或2的方法，其中病人体内也存在有某种反转录病毒，疱疹病毒或者二者皆有。

5、如权利要求1的方法，其中dsRNA是失配的。

6、如权利要2或5的方法，其中失配的dsRNA是一种多腺苷酸与多尿苷酸的复合物。

7、如权利要求6的方法，其中的失配dsRNA是一种含有从1/5到1/30个尿嘧啶胍（gaianaidine）碱基的聚次黄苷酸盐与聚胞苷酸盐的复合物。

8、如权利要求7的方法，其中失配的dsRNA是γIn·γ（C_11-14′U）_n或一种含有γIn·γ（C_11-14′U）_n的键断裂区并且具有其良好治疗比例特性的失配dsRNA。

9、如权利要求6的方法，其中失配dsRNA的给药量要使得每毫升病人系统血循环中的失配dsRNA水平达到2-1，000微克。

10、如权利要求1或2的方法，其中dsRNA是一种具有下面分子式所定义的结构的短寡聚核苷酸：

5′锁-（I）_n-锁3′

3′锁-（C）_n-锁5′

其中m和n各大于5和小于100，I是单磷次黄苷，C是单磷酸胞苷，或

5′锁-[（I）_xA];-锁3′

3′锁-[（C）_yU]_k-锁3′

其中X和Y各自大于5和小于25，j和K各自至少为1并且小于10，I和C定义如上，A是一种非I的核苷酸，而U是一种与A进行碱基配对的核苷酸，或者

5′（I）_n-铰合-（C）m3′

只要一条链中的锁互补于相对链中的锁，其中的n，m，I和C定义如上。

11、根据权利要求10的方法，其中寡聚核苷酸可以通过内部对齐互补杂合多聚体和锁定或/和铰合含互补杂合多聚体的区域而被稳定。

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