CN1030140A - 用作病毒感染标记活化核糖核酸酶l - Google Patents

Abstract

抗包括引起爱滋病的病毒在内的许多病毒的细 胞防御第一线是称为2′—5′寡腺苷酸/RNase L 途径的细胞内生化系统的活化作用。现已识别出一 种在HIV感染细胞中释放出来的抑制剂物质、或者 2′—5′A/RNase L途径中生化中间产物的一种 病毒相关抑制剂，它通过明显地实际连接到其末端产 物(RNase L)上，使整个系统发生故障，于是它允许 HIV不可控制地增殖。这种新分离出的抑制剂在细 胞内的相对水平对于“全爆发型”爱滋病的发展情况 和最终死亡有预后意义。

Description

爱滋病（获得性免疫缺陷综合症）是二十世纪公众健康的主要威胁。由于爱滋病生物学上的可变性质、它在个体之间难于捉摸的传播方式以及它的不能轻易探测到其真正存在的疾病“潜伏期”，使爱滋病迅速陷入规模空前的流行病困境。事实上，即使已投入了庞大的财力和物力来提高诊断能力，可利用的技术仍然达不到在任何一部分人群中有力地控制这一问题所必需的要求。例如参见题为“利用HTLV-Ⅲ抗体试验的经验，有关筛选的最新资料、实验室与流行病相关性”的专题讨论会会议录，该讨论会由国立卫生研究所，FDA、医药和生物中心及疾病防治中心联合发起，1985年7月31日在马里兰州Bethesda的国立卫生研究所举行，还可参见Budiansky.S的“Nature”316卷96页1985年7月11日。

人体免疫缺陷病毒（HIV）存在几个不同的名称，LVA是法国巴黎Pasteur研究所分离出来的爱滋病病毒的名称;HTLV-Ⅲ是美国马里兰州Bethesda的国家卫生研究所分离出来的该病毒的名称。在本文中，这种HIV病毒经常被称为一般命名的HTLV-Ⅲ或LAV或HIV，而不打算在它们之间进行区分。此外，本说明书中的术语“HIV”包括与产生爱滋病相关的任何一种病毒和所有其它病毒，不论它们是否被分离出来。单数形式的HIV指包括任何一种类型的HIV，而不管它们的基因内容是什么。类似地，爱滋病症状一般指的是包括HIV（如上定义）、ARC或AIDS相关的综合症、淋巴结病综合症（LAS）和其它引起基本类似临床状况的病毒引起的症状。

当前的治疗考虑采取二个方法中的一种：对病毒本身的免疫性（产生疫苗）进攻或直接的攻击（抗病毒疗法）。虽然，疫苗的产生最初似乎极有希望，但是，至少在理论上说，病毒结构的新知识显著地影响和破坏了这种希望;即病毒显然容易突变或改变它的基本生化结构，以致于关键的病毒抗原“决定子”（它对疫苗有效是必需的）容易经受突变和改变。例如，近来人们发现加里福尼亚、马里兰和英格兰州的HTLV-Ⅲ分离株在严格分析它们的基因组内容时是彼此不同的。这些研究的含意在于：接种抗HIV疫苗将不会具有像历史上大多数其它疫苗、如抗脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒等疫苗所具有的令人确信的有益/耐久效果这样广泛持久的好处。

在第二种方法或直接抗病毒方法中，其它科学家已经试验了包括AET、HPA-23    Suramin（苏拉明）、ribavirin（三氮唑核苷）、干扰素和fascart等的几个化合物。这些化合物至今以其有限或有保留的治疗成功的迹象已被用在实验室或临床研究之中。事实上，几乎每一个病例都报导了高毒性和/或严重副作用的一致迹象（例如M.Clark写的概要，“Newsweek”71页，1985年8月5日;还有C.Wallis“Time”40-47页，1985年8月12日）。这些药没有一个真正是新的或者能够有选择性地针对这种根本的紊乱;即在某些细胞中HIV的增殖。例如，HPA-23是重金属的一种组合物（使人想起在本世纪二十年代或使用青霉素年代之前利用砷来治疗性病）;苏拉明（Suramin）实际上是一种抗寄生虫（刚果锥虫病）化合物，而fascart是一种抗疱疹病毒化合物。这后面提到的两个化合物可以抑制一种被称为“逆转录酶”的HIV相关酶，但是没有多少证据说明这种酶的抑制事实上会导致任何有意义的治疗改进或疾病的预防/转好。AZT可能会稍微延长爱滋病患者的生命，但是，它是高毒性的，也不能消灭HIV（R.Yarchoan等人，“Lancet”，575页1986年3月15日;R.E.Chaisson等人“New    England    Journal    of    Medicine”315卷1611页，1986年）。

爱滋病是随受人体免疫缺陷病毒HIV感染引起的免疫系统逐渐恶化而来的。在爱滋病的早期，细胞中介免疫性由于损失了表达所谓T4抗原的T细胞（由胸腺来的）而受到损伤，T细胞的亚单元主要是T助体和诱导物细胞组成。T4细胞缺陷可能导致几种细胞中介免疫性的缺陷，其中包括NK（天然杀伤细胞）、LAK（淋巴因子激活的杀伤细胞）和溶胞T细胞的缺陷。在爱滋病中还存在B细胞（骨髓得到的）缺陷。

虽然爱滋病从一个阶段过渡到另一阶段的速度是能改变的，但它似乎是一种逐渐发展的疾病。这些阶段已经有了指定的分类。存在一些受HIV感染而无症状的个体，有时称为血清阳性者，可由存在抗该病毒的循环抗体来判断（M.G.Sarngadharan等人，“Science”224卷506页，1984年）。如果他们没有任何标记，按照Welter    Reed分类法（R.R.Redfield等人“New    England    Journal    of    Medicine”314卷131页，1986年），它们是WR1期病人。也称他们为ARC（爱滋病相关综合症）前期病人，尽管这些个体中的某些人可能永远不会发展成ARC症状。这些病人中的一些可能会发展成淋巴结病（WR2）並显示出T4细胞缺陷（WR3）。接着，淋巴细胞经受抗原刺激的增生能力和抗原刺激的γ干扰素生成能力下降，这些WR4期病人开始丧失被延缓的皮肤过敏性。WR5期病人通常是无（细胞免疫）反应性的，他们出现带状疱疹感染、口腔念珠菌病（鹅口疱）、或者包括持续高烧、夜里盗汗、疲倦、腹泻和/或体重下降在内的ARC症状，这种ARC阶段通常还以进行性免疫力衰退为特征。最后，WR6期病人经爱机会致病菌的感染，构成“全爆发”型（full-blown）爱滋病，这种病人有50%在12个月内死亡（H.W.Murray等人“New    England    Journal    of    Medicine”310卷883页，1984年）。

图1是聚丙烯酰胺凝胶电泳板的照片，显示了7条径迹和沿每条径迹的段或区;以及

图2是2′-5′寡腺苷酸/RNaseL途经的一个图解说明。

已经发现了一种由感染人体免疫缺陷病毒的细胞释放的或促使其释放的抑制剂物质。这种抑制剂似乎是实际附着在酶RNaseL、2′-5′寡腺苷酸/RNaseL途经的最终产物上，引起整个免疫系统功能紊乱，使HIV不可控地增殖。这里公开的是通过RNaseL的缺少或RNaseL的失活，或通过在2′-5′A/RNaseL途经中存在生化中间产物的抑制剂来直接或间接识别这些抑制剂的技术，这种（些）抑制剂起着检测HIV存在或者表现基本相似临床条件的有关病毒存在的标记的作用。

还讨论了这种标记对病人的“全爆发型”爱滋病发展阶段的预后意义，特别是对于那些外周血液中和在包括血液、血液成分、移植器官的细胞和细胞提取物在内的组织中有HIV抗体的病人。还描述了用于激活RNaseL和/或除去或失活RNaseL抑制物质的步骤，失活RNaseL抑制物质或失活病毒相关的这种抑制剂的治疗方法是本发明的一部分。本发明还包括利用一种RNaseL的特异抑制剂或在2′-5′A/RNaseL途经中的生化中间产物的病毒相关抑制剂作为抗原，在体内和体外制取这些病毒抗体的步骤。

因此，本发明包括使用一种药物组合物形式的dsRNA和激活RNaseL、除去或失活RNaseL的一种特异抑制剂或动物和人体内2′-5′A/RNaseL途经中的生化中间产物的病毒相关抑制剂的方法，该组合物包括一种dsRNA和一种淋巴细胞活素的组合，这在以下要被说明。dsRNA最好是一种失配的dsRNA，而淋巴细胞活素例如像干扰素或者其作用会由于依赖dsRNA的2′-5′A途经的恢复和还原而被促进的特异的其它抗病毒物质。

该组合物含有dsRNA和干扰素的比例最好是0.01至1000毫克dsRNA比0.1至100，000IRU的干扰素。

本发明还包括一个赋予一种最好是人产生的生物液体或最好是人产生的细胞抵抗病毒感染能力的方法，它增加了对病毒感染的抵抗力或减轻HIV感染的效应，该方法包括将这些生物液体或细胞与抑制HIV、激活RNaseL有效量的dsRNA混合或接触。生物液体可以例如是用于输液或透析的人的血液或血液成分。细胞可以由建议的皮肤移植片或可移植的器官得到。

此外，本发明还包括一个由一处理非肠胃液体的装置去除或失活抑制RNaseL形成的物质或减轻HIV感染效应的方法，该方法包括将该装置与包含抑制HIV、激活RNaseL有效量的一种dsRNA的组合物接触。

本发明还包括用于治疗HIV感染的个体、包括爱滋病状况在内的方法和组合物，它是通过抑制或消除一种HIV特异的RNaseL抑制剂或者抑制、消除在2′-5′A/RNaseL途经中的生化中间产物的病毒相关抑制剂，或激活RNaseL实现治疗的。该组合物包括了一种dsRNA和一种药物学上可接受的载体或稀释剂，以及用于治疗还原病毒或T细胞促淋巴病毒诱发的症状、例如AIDS或通过激活不活动的RNaseL会干扰其增殖的其它人类病毒的治疗说明。

以下通过实例方式来公开有选择性地抑制人类病毒、特别是HIV而对正常细胞无很大毒性的治疗方法;抑制、推迟或防止人感染HIV的方法;在人体中防止或治疗AIDS相关的综合症或AIDS相关的功能紊乱的方法;处理人的生物液体、细胞或组织产物以防止或制止HIV感染或污染的方法;以及制止与HIV有关的特异损害的方法，包括人免疫系统中细胞上失去干扰素受体和免疫系统选择性细胞中细胞内2′-5′A合成酶的削减或减少和RNaseL的失活以及细胞内dsRNA的减少或损失这样的损害。还公开了用于这些方法中的药物组合物。除了人外，对动物的治疗也在本发明的范围之内。

使用dsRNA适合于制止与HIV感染有关的特异损害，包括在免疫系统各种关键细胞上损失RNaseL以及与dsRNA有关的酶（例如蛋白激酶）、免疫/人体防御系统中各种关键细胞中细胞内2′-5′A合成酶的削减/减少以及细胞内的dsRNA的减少或损失和具有在免疫/人体防御系统中各种关键细胞中生物活性的2′-5′A寡聚物的减少或损失。

爱滋病中细胞内的“第一防御线”（2′-5′寡腺苷酸途经）中的紊乱

各种各样的研究表明，2′-5′寡腺苷酸途经（医学文献中也称为干扰素2′-5′途经）在爱滋病中发生故障。该途经是人体抗感染防御系统的一个组成部分。在爱滋病及各种先期状态（例如（ARC）或LAS（淋巴结综合症）中，该途径中最接近的酶/因子被“打开”或激活，但是爱滋病病毒仍然增殖。例如，干扰素水平典型地升高，並且酶2-5A合成酶也升高。然而，这些升高的机理，特别是至少是部分打开的该途经不能甚至在一定程度上抑制HIV的机理直到这里报导的研究成果之前完全是个谜。

作为我研究的结果，我已识别出一种抑制剂、HIV感染的伴生物，它存在而且就是这种抑制剂使得对“全爆发”（full-blown）爱滋病起作用的抗病毒防御系统瘫痪。

图1给出了在dsRNA（AMPLIGEN

，美国马里兰州Rockv Rockville的HEM研究公司的一种注册商标）治疗期间迅速清除外周血液中HIV负荷的ARC/AIDS病人的RNaseL的特性。在病人外周血液单核细胞（PBMC）的细胞质提取物中存在或不存在活化的RNaseL是按照K.Kariko和J.Ludwig，在“Biochem.Biophys.Research Communication”128卷695页，1958;D.H.Wreschner等人“Nucleic Acid Research”9卷1571页，（1981年）的步骤由28S和18SrRNA产生特异分裂产物（SCP）来确定的。核糖体的RNA（包括两个被命名为28S和18S的分子物质）在可以由激活的RNaseL、而不是失活的RNaseL分裂方面具有和病毒（例如HIV）RNA相似的性质。被激活的RNaseL的特征在于它具有使它的分子结构与2-5A寡聚物结合的优势，而很少与抑制剂结合（如果有的话）。这些研究的结果被表示在图1、一张聚丙烯酰胺凝胶电泳板的照片上。表1是从10个接受Ampligen治疗的病人中收集到的数据的总结。

作为核糖体RNA源的HL929细胞（RNaseL不足）提取物在不存在（第一径迹）或存在（第二径迹）Ampligen治疗（第3和4径迹分别是3号和7号病人治疗前的试样）前从健康的对照试验者或ARC和AIDS病人得到的PBMC细胞质提取物的情况下培养1小时。如由凝胶SCP区域的光带所表明的那样，第1、3和4径迹没有显示出任何激活的RNaseL的迹象。根据布达佩斯条约，HL929细胞寄存在美国典型培养物收集中心，寄存号是_。

在治疗之前，所有ARC/AIDS病人的提取物即使加入外源性生物活性的寡腺苷酸〔2′5′-P₃A₃（10^-8M）〕时（凝胶未画出）也没有显示出激活作用（无SCP），这证实了在进行Ampligen治疗之前，病人淋巴细胞中没有任何可供利用的功能性RNaseL分子。对照之下，在Ampligen治疗的同时，在3号ARC病人中（8星期治疗时是第5径迹，而16周治疗时是第6径迹）;在7号AIDS病人（8周时是第7径迹）以及表1的各种病人（凝胶未示出）中，观察到体内逐渐发展的RNaseL活性。箭头指示了RNaseL的特异分裂产物（SCP）的位置。只有5号病人在dsRNA治疗中不能激活RNaseL，而且作为很可能的后果，他死于伴随的机会致病菌感染。

情况1-正常人、包括克服了HIV感染个体的生物途径被表示在图2上。

情况2-爱滋病和一些前期疾病，包括ARC，LAS和逐渐发展成AIDS的无症状的HIV血清阳性者等（参照图2）-因为

RNaseL在抑制剂中被束缚住〔步骤D不起作用〕，所以步骤〔A〕、〔B〕和〔C〕作用过度;因此，由于缺少“反馈控制”该途经不能适当地关闭，尽管干扰素、2-5合成酶和有生物活性的2-5寡聚物（2-5A的三聚物和四聚物特别有活性）的浓度很高，HIV仍然增殖。

实验数据-首先在爱滋病所有临床范围里的未被治疗病人中，观察到2-5A寡聚物以显著的浓度存在。但是与正常人（图1中聚丙烯酰胺凝胶的第2径迹）不同，在未被治疗的ARC和AIDS病人（第3和4径迹）中，RNaseL是失活的。还进一步观察到，如果我从ARC/AIDS病人得到失活的RNaseL制剂，並（在测定之前）彻底地清洗它们，包括使用三氯乙酸（TCA），那么RNaseL制剂就会恢复功能，即它们对特异分裂（在凝胶中称为SCP）或大分子RNA有催化作用，所以被称为具有活性的。通过一系列的重组实验，确定了RNaseL抑制剂已被洗提或断落，它如果再一次被加回去的话，将终止、也就是抑制RNaseL的反应活性。

至今获得的证据表明，细胞内RNaseL的状态（活性的对失活的）构成HIV的一个重要的预后参数，以及用双股RNAs的特异治疗计划能够逆转这些HIV特异损害。以无症状的HIV携带者（例如表1中的8号）到早期疾病（例如ARC或LAS;2、3、9、10、1和4号病人）到全爆发型AIDS的一系列临床病人被用dsRNA来治疗以确定这种抑制剂是否按希望那样会被迫从RNaseL上脱开，使得这样一种分子事件会引起HIV负荷的减少和极大的临床改善。一些个体（体重约60公斤）每周用50-250毫克的称为Ampligen的一种特异dsRNA治疗两次。人们知道，2′-5′寡A合成酶是依赖dsRNA的一种酶，所以有理由推断，有可能通过使用一种人造的（合成的）dsRNA来急剧增加细胞内特异生物活性的2′-5′寡聚物的浓度结果使这种抑制剂从RNaseL中被置换出来。

表1表示如何使用失配dsRNA来真正做到使得治疗病人血清中的HIV水平产生显著的减少。通过将表1的最后一列（“病毒学”）与图1的结果进行比较，可以清楚地看出，RNaseL的活性与HIV负荷减少相关联並导致临床的改善。匹配的dsRNA可能也是合适的，而且剂量会是足够低以避免有害的反应，匹配的dsRNA像PolyI·Polyc，一种由Lampson制备的dsRNA。如果更高的剂量是适当的，那么最好使用失配dsRNA。

dsRNA最好是由于促进的生物有效性、适合于激活2′-5′A寡聚物的生成而不产生副作用的结构，或由于施用后相对短的半衰期向产生细胞内的2′-5′A寡聚物必需的高浓度以置换RNaseL抑制剂，同时不存在缩主毒性。

失配双股RNA是大分子RNA的一种已知的形式（见美国专利4024222和4130641），在大分子RNA中，双螺旋的不稳定阻止了碱基配对。失配dsRNA因为它的干扰素诱导特性而被众所周知，这种特性表明了一个与干扰素诱导本身无关的机理（如欧洲专利申请83305426.5，申请日：1983年8月15日，题目是“Antiproliferative    Action    of    dsRNA    on    Tumor    Cells”）。

失配双股RNA一个典型的治疗实例是由多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸/尿苷酸复合物形成的合成dsRNA，如rI_nr（Cx，U或G）n，其中x的值从4到29，例如在这里被称为Ampligen的rI_nr（C₁₂U）n。已经对特性类似于Ampligen的许多失配dsRNA进行了研究，失配dsRNA超过其它型式天然和/或合成dsRNA的主要治疗优点是它们在动物和人中被减低的毒性。例如，Lampson等人的美国专利3666646描述了一些能够触发各种干扰素相关效应的早期dsRNA复合物，但是，这些化合物的毒性排除了它们在癌症或有关疾病治疗中的任何临床应用。

发明人已在他最近的有关该主题的一些教科书中（例如见纽约Marcell    Dekker公司1984年出版的由R.M.Ottenbrite和G.B.Butler编辑的“Anticancer    and    Interferon    Agents”中发明人写的一章;也见1984年纽约和Heidelberg的Springer-Verlag出版的、由P.E.Come和W.A.Carter编辑的“Handbook    of    Experimental    Pharmacology    on    Interferons”535-555页，详细描述了dsRNA的已知性质）详细地描述了各种干扰素、干扰素诱导物和dsRNA的已知活性。

现已知道，失配dsRNA，如Ampligen，对人的某些癌症、尤其是肾癌有治疗作用。虽然当前认为dsRNA仅仅是一种“干扰素诱发物”，但是dsRNA对完全耐受干扰素本身的人的某些癌症是有效的，这在本申请人是发明人的欧洲专利申请83305426.5中已作了详细的描述。

在另一份专利申请中（见欧洲专利申请86306582.7，申请日：1986年8月26日，题为“Modulation    of    Virus-Related    Events    by    Double-Stranded    RNAs），发明人描述了用Ampligen作为原型dsRNA时dsRNA对人体细胞培养物中爱滋病病毒的抑制作用。

用“匹配dsRNA”来指对应两个股之间的氢键（碱基的堆积）相对来说是完整的那些dsRNA，即在每29个依次接续的碱基残基中，中断平均小于1个碱基对。因此，应当相应地理解术语“失配的dsRNA”。

这种dsRNA可以是包含一定比例、如1/5至1/30的尿嘧啶基或胍嘧啶基的多肌苷酸和多胞苷酸的复合物PolyI·Poly（C_4-29X＞U或G）。该dsRNA可以是PolyI·Polyc，U，其中C与U之比约是13比1，並且PolyI和Polyc，U的沉降系数都小于9，並在彼此的两个单位之内，最好都在0.5至7.5。

该dsRNA可以具有通式rI_n·（C_12-13U）n.，以下将讨论dsRNA的其它合适的例子。

组合物可以包括dsRNA和一种像淋巴细胞活素，如干扰素或像IL-2的白细胞介素这样的HIV抑制促进剂。表2上表示了各种各样的组合物。在AIDS病人的各种细胞中，包括T、NK、LAK、B细胞和单核细胞中将看到RNaseL的缺陷、或其它类似的依赖dsRNA的酶的缺陷（见表2）。

如在本说明书中解释的那样，dsRNA可被认为是用于治疗和制止几种HIV损害的一种“基本生物制品”。在表2中，随着七种特异HIV缺陷或损害一起给出了dsRNA与另外（一种或一些）治疗剂可能的治疗组合。

表2

dsRNA作为制止几种AIDS损害的

“基本生物制品”

AIDS′缺陷    与dsRNA可能的治疗组合

1.急性HIV感染    dsRNA/AZT

2.慢性HIV感染    dsRNA/三氮唑核苷（ribavirin）

dsRNA/γ干扰素

3.T，NK，或LAK缺陷    dsRNA/IL-2

dsRNA/retinoids（视网类体）

dsRNA/胸腺肽

4.B细胞缺陷    dsRNA/γ干扰素

5.单核细胞缺陷    dsRNA/γ干扰素

6.卡波氏肉痛    dsRNA/α干扰素

dsRNA/γ干扰素

dsRNA/IL-2

7.中枢神经（CNS）损害    dsRNA/三氮唑核苷

dsRNA/AZT

在本发明中使用的失配dsRNA最好是以从Poly（Cx，U）和Poly（Cx，G）中选出的共多核苷酸为基础，其中n是数值从4到29的一个整数，並且它是通过修改rI_n·rCn以便沿多核糖胞苷酸（rCn）股的方向加入不配对的碱基（尿嘧啶基或胍基）形成的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸复合物的失配类似物。另一方面，可以通过修改多核糖肌苷酸（rIn）的核糖基主链，例如通过加入2′-O-甲基核糖基残基、从Poly（I）·Poly（C）dsRNA得到这种失配dsRNA。这些rI_n·rCn失配类似物最好是具有通式rI_n·r（C₁₂，U）n的那些，它们在Carter和TS′O的美国专利4130641和4024222中被描述，它们的公开内容通过引用被结合到本申请中。那里所描述的dsRNA总的来说是适合用于本发明的。

在本发明中使用的失配dsRNA的具体例子包括：

Poly（I）·Poly（C₄，U）

Poly（I）·Poly（C₇，U）

Poly（I）·Poly（C₁₃，U）

Poly（I）·Poly（C₂₂，U）

Poly（I）·Poly（C₂₀，G）

Poly（I）·Poly（C₂₉，G）以及

Poly（I）·Poly（Cp）23G＞P

本发明的药物组合物包含失配dsRNA，可选择性地还含有一种干扰素或其它的免疫调节剂（淋巴细胞活素）以及一种药物学上可接受的载体或稀释剂。本发明设想的药物组合物包括在一种合适的药物载体中的适合于不经胃肠道施用的那些组合物。

于是，例如，非肠胃道的溶液、悬浮体、分散体都可以根据需要用灭菌的或无热源的、可选择性地加或不加生理上可接受的盐的水作为溶剂/稀释剂，按照公知的制药技术被制备。

施用失配dsRNA的量最好足以使在远离注输点的地方，在注入后不久，全身血液循环中得到从每毫升0.01微克的dsRNA直至每毫升1000微克。当同时施用干扰素时，最好包含的量使得每毫升体液有0.1至100，000IRU的水平。通常，要施用的量取决于病情的严重性，特别是取决于可利用的细胞内的生物活性dsRNA、2′-5′寡A分子或2′-5′A合成酶的水平以及RNaseL抑制剂的相对水平。作为用在这里的术语“体液”是血清溶液、维生素等，它在生物体内循环並浸润组织。对医生来说，病人预计的体液容积当然是知道的，这些预计的容积已经以通常可得到的图、表形式被出版。

下面通过对使用dsRNA实例的说明来描述本发明。

在水溶液中配制失配dsRNA，例如Ampligen，使得它加到各种人细胞中时能够得到每毫升液体（浸泡细胞）0.01微克至250微克的短暂浓度。使用了各种各样不同的细胞，即所有可能的用HIV感染的目标。

以下描述一个用H-9细胞、一种能够用HIV急性或慢性感染的人淋巴样细胞的典型实验。细胞在标准条件下（例如见Mitsuya等人“Science”226卷172页，1984年）生长並在几个星期里分析HIV酶或HIV特异蛋白的存在。对这样一些模拟的各种临床条件，在该病毒之前、之后或同时加进各种浓度的Ampligen。最重要的是，进行细胞数目、形态等方面的仔细分析，以确定是否像Mitsuya用其它抑制剂已描述过的那样，失配dsRNA对淋巴样细胞的生长有各种各样的非特异效应。在实验期间不同的时刻上分离细胞並用Lee等人描述的方法（“Biochemistry”24卷551页，1985年）通过2′-5′A寡聚物的HPLC分析进行研究。人们知道某一些A寡聚物出现时，就能使细胞具有抗病毒的能力，但是，以下这一点是以前从未描述过的或没有的，即一种试验化合物（人工合成的）能准确地、有选择性地触发这种固有的反应，结果加强了抗病毒（总的来说）、特别是抗HIV的天然防御机制。

表3-Ampligen对HIV感染的作用

实验A

天    %HTLP阳性细胞    逆转录酶

+药    -药    +药    -药

4    0    50    1，412    24，287

9    7    90    144，632    1，243，300

实验B

0    0    353    323

7    0    0    400    1，200

10    0    5    800    2，261

14    2    ＞80    1，100    112，247

17    5    ＞90    1，200    1，560，000

实验A是用比靶细胞多25倍的病毒（用感染单位表示）进行的，而实验B是用比病毒多10倍的靶细胞（称为H-9细胞）进行的。细胞阳性百分比是指由萤光免疫法确定的表示被称为P24和P19的HIV标记的细胞;逆转录酶指用称为PolyrA/dT的模板在该细胞上清液中测定的一种病毒酶。同时，进行细胞计数：在所有的试验Ampligen浓度下（高至每毫升300微克），以正常生长速度增殖的细胞数。在实验A和B中，Ampligen（每毫升50微克）在第1天被加入。HPLT分析显示出（到实验A或B的第3至第7天）2′-5′寡聚物分布的一个特异的转换，使得较高（较低抗病毒的）分子量（MW）的寡聚物转换成对选择性地和有力地抑制HIV有贡献的较低（更强抗病毒的）分子量的寡聚物。对RNaseL同时作出的测量（见图1）表明，RNaseL的生物活性通过一系列dsRNA的处理得到了恢复。

用其它可能是HIV的体内靶的人细胞进行了相似的实验：这些实验包括其它一些从功能上被确定是NK（天然杀伤剂）细胞，T助体细胞，T抑制细胞和单核细胞等的细胞。在所有这些例子中，失配dsRNA的各种浓度都能选择性地制止和/或阻止HIV的增殖，而对正常细胞的生长和成熟没有任何影响（也见表2）。T细胞在培养基中的增殖通过IL-2因子的标准添加剂被维持，这是细胞生物学领域专业人员都知道的。如由HPLC分析确定的那样，由失配dsRNA产生对HIV的选择性抑制作用总是在2′-5′-寡聚物的分布中伴随一个特异的转换或增大。

在有关的生物化学途经中，dsRNA在处于危险（有或没有活性的HIV感染）的个体的生物化学损害下游或远处的地方起作用，这样就恢复正常的抗病毒应答能力。

dsRNA能非常有效地为细胞所吸收，因此不需要一个完整的IFN受体。而且，失配dsRNA还可以以生物活性的片段形式用来促进细胞内的吸收和分布。所以，dsRNA具有容易穿过血-脑屏障的能力，而这可能是某些个体中HIV的一个残余集合地。

典型地，用于本发明中的dsRNA将具有美国专利4024222和4130641上举例说明的分子大小，但是，以亲代分子片段形式获得的更低分子量的dsRNA也是有效的。它们例如可以具有前述典型的dsRNA物质一半至十分之一的大小。

dsRNA活化2′-5′A聚合酶並在活性抗病毒寡核苷酸中比只用干扰素可能达到的增加500倍来促进这种合成。（dsRNA在1.6×10⁸细胞中导致250毫微摩尔的2′-5′寡A，而200单位/毫升的干扰素只导致0.5毫微摩尔的2′-5′寡A）。

处在发生AIDS危险中或具有明显AIDS个体的NK细胞中，申请人观察到类似的现象，AIDS/ARC病人的天然杀伤细胞活性水平方面，存在着相似的情形，但是，关于NK调节机理方面知道得很少。AIDS/ARC病人和处于危险群体中的健康成员往往具有弱的免疫监视能力（功能性NK和T淋巴细胞），而且不能通过干扰素再激活。Ampligen能在病区的远侧起作用，並能激活有细胞毒性的淋巴细胞。

Claims (12)

1、一种用于确定人体免疫缺陷病毒或引起大致类似临床状况病毒存在的方法，包括在一种动物细胞提取物中利用RNase底物确定被活化的RNaseL，一种存在HIV或HIV指示的遗传信息的标记物，的存在。

2、一种按权利要求1所述的确定隐伏在人体生物液体或细胞中的人体免疫缺陷病毒存在的方法，包括探测该生物液体或细胞中的被活化的RNaseL的存在。

3、一种按权利要求2所述的方法，其中该生物液体是血液或它的成分。

4、一种按权利要求2所述的方法，其中该细胞来自皮肤移植片或可移植的人器官。

5、一种确定HIV侵入动物体内可能性的诊断试验，包括检查该动物组织的一种提取物並确定存在或不存在权利要求1的被活化的RNaseL分子，不存在这种被活化的RNaseL分子肯定地表明存在HIV的侵入。

6、一种监测从HIV或引起类似生物化学和/或临床状况的病毒中得以逐渐恢复的方法，该方法包括如下步骤：（1）确定在一个病人的细胞提取物中存在或不存在被活化的RNaseL，如果没有检测到被活化的RNaseL，（2）施用一定量的dsRNA，其量要足以减少HIV诱发条件的RNaseL抑制剂或引起类似生化和/或临床状况的这样一些其它病毒的RNaseL抑制剂的量，以及（3）继续施用dsRNA直到病人的临床症状稳定或改善。

7、一个按权利要求1或6所述的方法，其中通过测量由28SrRNA和18SrRNA产生的预定分裂产物的存在以及在病人细胞提取物中有生物活性的2′-5′A寡聚物的存在来确定RNaseL的存在。

8、一个按权利要求6所述的方法，其中dsRNA是一种失配的dsRNA。

9、一个按权利要求8所述的方法，其中dsRNA是一种包含从1/5到1/30的尿嘧啶基或胍基的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸的复合物，並最好具有通式rI_n·（C₁₂U）n。

10、一种赋予对HIV免疫力的方法，包括给动物施用RNaseL的一种HIV特异抑制剂或施用在2′-5′A/RNaseL途经中的生化中间物的一种病毒相关抑制剂作为一种抗源。

11、一种治疗HIV感染的方法，包括对HIV感染的动物施用一种有效剂量的物质，该物质能去除RNaseL的AIDS特异抑制剂或在2′-5′A/RNase  L途经中的生化中间产物的病毒相关抑制剂，並继续施用直到该抑制剂有明显改变为止。

12、一种按权利要求11所述的方法，其中，施用一种dsRNA，最好是失配dsRNA。

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