CN1043569A - 用作病毒感染标记的RNase L抑制剂 - Google Patents

用作病毒感染标记的RNase L抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN1043569A
CN1043569A CN88101696A CN88101696A CN1043569A CN 1043569 A CN1043569 A CN 1043569A CN 88101696 A CN88101696 A CN 88101696A CN 88101696 A CN88101696 A CN 88101696A CN 1043569 A CN1043569 A CN 1043569A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rnase
inhibitor
hiv
dsrna
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN88101696A
Other languages
English (en)
Inventor
威廉·安·卡特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hem Research Inc
Original Assignee
Hem Research Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hem Research Inc filed Critical Hem Research Inc
Publication of CN1043569A publication Critical patent/CN1043569A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

描述了天然2′-5′A抗病毒防卸途径的HIV相关抑制剂、诊断步骤和材料、以及治疗病毒疾病的方法。在患LAS、ARC和AIDS病人体内的HIV诱发抑制剂被分离出来和识别。功能性2-5A在这些病人的外周血液单核细胞(PBMC)中不能激活RNase L；内源性dsRNA、尤其是失配的dsRNA激活2-5A合成酶，从而通过内源性2-5A使2-5A合成酶的浓度增加。

Description

爱滋病（AIDS）（获得性免疫缺陷综合症）是二十世纪公众健康的主要威胁。由于爱滋病生物学上的可变性质、它在个体之间微妙的传播方式以及它的不能轻易探测到它真正存在的疾病“潜伏期”，使爱滋病迅速陷入规模空前的流行病困境。事实上，即使已投入了庞大的财力和物力来提高其诊断能力，可利用的技术仍然达不到在任何一部分人群中有力地控制这一问题所必需的要求。例如参见题为“使用HTLV-Ⅲ抗体试验的经验，有关筛选的最新资料、实验室与流行病相关性”的专题讨论会会议录，该讨论会由国立卫生研究所，FDA，医药和生物中心及疾病防治中心联合发起，1985年7月31日在马里兰州的Bethesda的国立卫生研究所举行，还可参见Budiansky，S的“Nature”316卷96页，1985年7月11日。
人体免疫缺陷病毒（HIV）存在几个不同的名称，LAV是法国巴黎的Pasteur研究所分离出来的爱滋病病毒的名称;HTLV-Ⅲ是美国马里兰州Bethesda的国家卫生研究所分离出来的该病毒的名称。在本文中，这种HIV病毒经常被称为一般命名的HTLVⅢ或LAV或HIV，而不打算在它们之间进行区分。此外，本说明书中的术语“HIV”包括与产生爱滋病相关的任何一种病毒和所有其它的病毒，而不论它们是否被分离出来。单数形式的HIV指包括任何一种类型的HIV，而不管它们的基因内容是什么。类似地，爱滋病症状一般指的是包括HIV（如上定义的）、ARC或AIDS相关的综合症、淋巴结病综合症（LAS）和其它引起大致类似临床状况的病毒引起的症状。
爱滋病是随受人体免疫缺陷病毒HIV感染引起的免疫系统逐渐恶化而来的。在爱滋病的早期，细胞中免疫性由于损失了表达所谓T4抗原的T细胞（由胸腺来的）受到损伤，T细胞的亚单元主要是T助体和诱导物细胞组成。T4细胞缺陷可能导致几种细胞中介免疫性的缺陷，其中包括NK（天然杀伤细胞）的缺陷、LAK（淋巴因子激活的杀伤细胞）缺陷和溶胞T细胞缺陷。在爱滋病中还存在B细胞（骨髓得到的）缺陷。
虽然爱滋病自一个阶段过渡到另一阶段的速度是能改变的，但它似乎是一种逐渐发展的疾病，这些阶段已经有了被命名的分类。存在一些受HTV感染而无症状（血清阳性）的个体，这些人通过存在抗该病毒的循环抗体被判断的（M、G、Sarngadharan等人“Science”224卷506页，1984年）。如果他们没有任何其它标记，则按Walter    Reed分类法（R、R、Redfield等人“New    England    Journal    of    Medicine”314卷，131页，1956年），他们是WR1期病人。也称他们为ARC前期病人（ARC是爱滋病相关综合症），尽管这些个体中的某些人可能永远不会发展成ARC症状。这些病人中的一些人可能会发展成淋巴结病（WR2）并显示出T4细胞缺陷（WR3）。接着，淋巴细胞经受抗原刺激的增生能力和抗原刺激的r干扰素生成的能力下降了，这些WR4期病人开始失去被延缓了的皮肤过敏性。WR5期病人通常是无（细胞免疫）反应性的，他们出现带状疱疹感染、口腔念珠菌病（鹅口疱）、或者包括持续高烧、夜里盗汗、疲倦、腹泻和/或体重下降在内的ARC症状，这种ARC阶段通常还以进行性免疫力衰变为特征。最后，WR6期病人经受机会致病菌的感染，构成“全爆发”型（full-blown）爱滋病，这种病人有50%在12个月内死亡（H.W.Murray等人“New    England    Journal    of    Medicine”310卷883页，1984年）。
现在说明天然2′-5′A抗病毒防御途径的HIV相关抑制剂（一种或多种）。这些研究结果涉及到对各种病毒性疾病（如疱疹、还原病毒感染等）和/或潜伏癌病症状的一个新的诊断和/或治疗方法。
干扰素诱导的2-5A（2′-5′寡腺苷酸）合成酶/RNase    L系统是宿主对病毒感染防御机制的一部分。这个系统中的一些组成部分包括：（ⅰ）dsRNA（双股核糖核酸）相关的2-5A合成酶，（ⅱ）内源性2-5A和（ⅲ）一种2-5A相关的内源性RNase    L（内源性核糖核酸酶）。在2-5A合成酶/RNase    L途径中这些组成部分中的任何一个有缺陷都会导致全部或部分丧失抗病毒作用。
已经发现，某些病毒感染的人以及经受干扰素治疗的人的血清和外周血液单核细胞（PBMC）中的2-5A合成酶的水平升高。因此，在PBMC中诱导2-5A合成酶似乎具有虽然有限但有潜在的诊断价值。然而，在PBMC中的2-5A合成酶水平的增高表示某些病毒疾病中的病沉重期状态，但是，这种增高相反也是干扰素对其它病毒感染有效治疗的症兆。在爱滋病病人的血清中已经发现了干扰素，但尽管如此，对已从ARC发展到AIDS的个体来说，显示出2-5A合成酶的持续增高。如果发现2-5A合成酶/RNase    L系统中的其它组成部分（如细胞内的2-5A或RNase    L）不起作用，就能解释这些极大的实验室/临床的矛盾。为了探索这种可能性，需要弄清在体内合成的2-5A的特征和RNase    L的作用，下面我将详细说明之。
以下参照附图进一步描述本发明，在这些附图中：
图1是聚丙烯酰胺凝胶电泳板的照片，显示了由LAS、ARC或AIDS人体的PBMC提取物中提取的2-5A的RNase    L的活性，它是由核蛋白体的RNA分裂测定法确定的;
图2是一个显示PBMC提取物中RNase    L活性水平的凝胶电泳板照片，它由核蛋白体的RNA分裂测定法确定，
图3是一个显示PBMC中核蛋白体的RNA分裂活性恢复的凝胶电泳板照片;以及
图4是一个说明2′-5′寡腺苷酸/RNase    L途径的流程图。
已经发现了一种由感染了人体免疫缺陷病毒的细胞释放的或促使其释放的抑制剂物质。这种抑制剂似乎是实际附着在酶RNase    L、2′-5′寡腺苷酸/RNase    L途径的最终产物上，使整个免疫系统功能紊乱，造成HIV不可控地增殖。这里所公开的是直接或间接识别这些抑制剂的技术，是通过RNase    L的缺少或RNase    L的失活，或通过在2′-5′A/RNase    L途径中存在生化中间产物的抑制剂来识别的，这种（些）抑制剂起检测HIV存在或表现基本相似临床状况的有关病毒存在的标记的作用。
还讨论了这种标记对病人的“全爆发型”爱滋病发展阶段的预后意义，特别是对于那些外周血液和“包括血液、血液成分”移植器官的细胞和细胞提取物在内的组织中有HIV抗体的病人。还描述了用于使RNase    L激活和/或将RNase    L抑制物质除去或使之失活的步骤。通过激活RNase    L和/或除去或失活RNase    L抑制物质或病毒相关抑制剂来治疗AIDS和有关病毒以及监测这样一些病毒的发展的医疗方法也是本发明的一部分。本发明还包括利用一种RNase    L的特异抑制剂或在2′-5′A/RNase    L途径中的生化中间产物的病毒相关抑制剂作为抗原、在体内和体外制取这些病毒抗体的步骤。
在患淋巴结病（LAS）、爱滋病相关的综合症（ARC）和获得性免疫缺陷综合症（AIDS）病人的外周血液单核细胞（PBMC）提取物中测量2-5A合成酶/RNase    L抗病毒途径的各个成分。结果表明，在患爱滋病的人体中，2-5A合成酶水平提高很大，而患ARC和LAS的个体中，2-5A合成酶处在基本水平上。然而，与2-5A合成酶（2-5A）的变化无关，在患LAS、ARC和AIDS人体内探测到高的2-5A内源性浓度（最大为35nM）。如由结合测定法，核-纤维素酶测定法及核蛋白体RNA测定法测定的那样，这种被提取的2-5A事实上是功能性的。不管内源的功能性2-5A的浓度提高了多少，在任何一个患LAS、ARC和AIDS人体内都没有显示出任何被激活的RNase    L。但是，在所有健康个体的PBMC中，即使他们的内源性2-5A的浓度低于5nM，RNase    L却被激活。混合实验提供了在5个患LAS、ARC和AIDS病人的5个病人中都存在RNase    L抑制剂的证据。这种抑制剂被转移并能在人929细胞提取物中阻止2-5A诱发的rRNA的RNase    L-特异降解。一种这样的RNase    L抑制剂是TCA和乙醇可沉淀的。通过RNase    A或蛋白酶处理可消除对RNase    L作用的抑制。我的研究表明，在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC中，一种内源性dsRNA（双股核糖核酸）激活了2-5A合成酶，这使得内源性2-5A的浓度增加。在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC中，一种HIV诱发的RNase    L抑制剂阻止了功能性2-5A激活RNase    L的能力。
这里我指出了用特异的和敏感的测定法得到的PBMC提取物中2-5A的浓度和RNase    L功能的测定值，我们证实了：在患LAS、ARC和AIDS病人PBMC中的2-5A合成酶/RNase    L抗病毒系统中的缺陷取决于RNase    L抑制剂的存在，而不取决于非功能的2-5A的合成。这里报导的数据强调指出，现在能够用合理而清晰的生物化学观点来解释发生在病毒-感染细胞中明显自相矛盾的相互作用。
将结合到丙烯酸珠（1mg）上的RNase    A或结合到羧基甲基纤维素（1mg）（Sigma化学公司）上的蛋白酶浸入到30℃的NP40溶胞缓冲剂（16）（10μL）中2小时，然后以15微升的最终容积将其与PBMC提取物（100μg/每次测定）混合，并在30℃下再保温2小时。在这第二次保温期间轻轻地用手指涡动试管几次。在不加任何酶的情况下保温对照试样。通过离心分离作用（10000×g，5分钟，室温）将固定化酶形成沉淀小片。将5微升的上清液加到L929细胞提取物（每个检测试样150微克蛋白）中，并用rRNA分裂测定法测定RNase    L的特异活性。
从PBMC提取物分离出来的内源性2-5A的特性进一步由rRNA分裂测定法来说明。用从PBMC分离出来的2-5A的RNase人产生的分裂图案与从L929细胞提取物中由真正的2-5A得到的图案有明显的差别（图1，将第3、5、7和9径迹与第10径迹比较）。例如，由PBMC分离出来的内源性2-5A激活了来自L929细胞的RNase    L，从而分裂了28S和18S    rRNA，形成三个特异的分裂产物（见图1第10径迹）。对观察到的分裂图案中这些差异的解释可能是在PBMC内被合成的内源性2-5A与真正的2-5A有差别。
放射性结合测定法已被用来估算游离的（不是2-5A激活的）RNase L、一种目前已知是2-5A靶酶的水平。也可以使用与我的发现同样相关的其它靶酶。患LAS、ARC和AIDS人体PBMC提取物的游离RNase L水平比正常人低5-7倍（表1第4列），但是放射性结合测定法在内源性2-5A和P3A4〔32P〕PCP竞争与RNase L结合的检测中只有有限的用途，其结果是放射性结合测定法得到的结果不能准确地反映出RNase L的水平。因此，确定2-5，A激活的RNase L的水平是必不可少的。为了达到这一目的，我使用了一个下面将要描述的新的敏感技术，该技术允许从小到1毫升外周血液中分离出来的PBMC提取物中测量激活的RNase L，这一技术是以2-5A激活的RNase L对γRNA的分裂特异性为基础的。
由于在PBMC中的γRNA是低于探测水平的，所以HL    929细胞（L929细胞系的一种RNase    L缺陷的亚克隆）提取物被代替作为γRNA。HL929细胞根据布达佩斯条约被存放在美国马里兰州Rockville的“美国典型培养物收集中心”（America    type    Culture    Collection），入藏号  。为利用这种测定法，我们能够证实，在患LAS、ARC和AIPS人的PBMC提取物中，如果存在功能性2-5A高的细胞内积累，那么该提取物中的RNase    L是没有活性的（图2，第2-第6径迹）。从所有被试验的健康人得到的PBMC提取物显示出即使2-5A以小于5nM（表1，第2列）存在时，也存在能产生特异的分裂产物（图2，第7径迹）的活性RNase    L。
从我观察到的在受LAS、ARC和AIDS感染病人的PBMC提取物中存在生物活性的2-5A这件事提出了为什么这种RNase    L是失活的这样一个问题。为了确定RNase    L没有活性（由图2的第2-6径迹证实）是由于无功能的RNase    L引起的还是由RNase    L活性的抑制剂引起的，进行了下述混合实验。将包含功能性RNase    L的L929细胞提取物与患LAS、ARC和AIDS病人提取的PBMC提取物相混合、并一起被培养，探测不到任何RNase    L特异分裂产物形成（图1，第3、5和7径迹）。
重要的是要指示，与RNase    L的激活有直接关系的内源性2-5A（图1，第3，5和7径迹）相对于得到这些样品的细胞提取物至少代表4倍的稀释（图1的第2、4和6径迹）。这些资料表明，在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC内存在一种或多种TCA-不能溶解的RNase    L的抑制剂。这样一种抑制剂在健康人体内未被找到，因为他们的PBMC提取物在和L929细胞提取物共同培养后产生出RNase    L特异分裂产物（图1的第8径迹）。类似地，健康人体的PBMC的TCA可溶性组分也产生特异分裂产物（图1的第9径迹）。从功能性2-5A的存在以及这种假定的RNase    L抑制剂是TCA和乙醇可沉淀的这一事实表明：RNase    L抑制剂不是一种最近在培养基中的HSV-1和还原病毒感染细胞中已经被识别出来的2-5A类似物。
我的利用固定在固体载体上的退化酶的实验对于从患LAS、ARC和AIDS人的PBMC提取物中发现的RNase    L（一种或多种）抑制剂的性质提供了重要的新的理解和认识。当将从患AIDS人中得到的PBMC提取物与固相蛋白酶或RNase    A一起培养、并随后再和L929细胞提取物共同培养，RNase    L的活性就得到了恢复，其证据就是出现了特异分裂产物（图3中，将第1和第2径迹与第3径迹作比较）。
我现在的研究方法证实，在患LAS、ARC和AIDS人的PBMC中的2-5A合成酶/RNase    L抗病毒系统的缺陷可以归咎于一种RNase    L抑制剂，而不是由于缺少功能性2-5A。RNase    L抑制剂存在于患LAS、ARC和AIDS人中分离出来的PBMC提取物中，这就表明这种抑制剂可能存在于典型的还原病毒疾病发展的所有阶段，而且这种抑制剂还和其它亚急性/慢性的病毒/病源体感染有关。如果考虑到我以前的报导，即这里试验的所有来自LAS、ARC和AIDS病人的PBMC都有HIV    RNA（由分子杂化作用测定）和HIV感染中心（通过淋巴细胞联合培养测定），则RNase    L抑制剂很可能是病毒诱发的。
这里报导的研究结果表明，病毒的复制修改了2-5A合成酶/RNase    L系统，因而不能充分表达和/或保持天然的抗病毒状态。很可能是由HIV和/或其它共存还原病毒编码的蛋白质（一种或多种）或RNA（一种或多种）能够抑制RNase    L的活性。
实施例
在Ficoll-Hypaque（聚蔗糖和3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸钠的商品名）上分离出外周血液单核细胞（PBMC）;在单层培养基中维持L929和HL929（L929的一种RNase    L缺陷的亚克隆）;在甘油缓冲液中制备L929和HL929的细胞质提取物，并在NP40溶胞缓冲液中制备PBMC提取物，所有这些都按公知步骤进行。这些提取物的蛋白质浓度范围是1-15微克/微升。
利用Poly（rI）-poly（rc）-琼脂糖来确定2-5A合成酶在被分离的PBMC提取物（每个检测试样50微克蛋白）中的活性。在经氟利昂/三辛胺中和化后，2-5A从PBMC提取物的TCA可溶组分中被分离出来。然后将TCA提取的2-5A冻干，并重新溶解在水中，使得所有的样品在一个相当于5微克蛋白/微升的水容积中被标准化。用L929细胞提取物作RNase L源，在放射性结合测定法中测定PBMC提取物中存在的2-5A的浓度。在加到每个检测的P3A4〔32P〕PCP（比活度3000居里/毫摩尔，Amersham）的18900次衰变/分中，在没有附加2-5A情形下，有9400次衰变/分被结合到RNase L上。在加有5微升的被分离的2-5A样品的检测中，大约有9-14%的P3A4〔32P〕pCp被取代。通过与用真正的2-5A的一组校正曲线作比较就确定了PBMC中2-5A的浓度，并且2-5A的浓度还要以25微克/微升的细胞质蛋白浓度的计算为基础。从PBMC分离出来的2-5A的浓度还在用L929细胞提取物作RNase L源的核-纤维素酶测定法中被测定。在这一测定法中，由2-5A产生的RNase L的活性是以poly（U）〔32P〕pCp到酸可溶性碎片的转换为基础的。在有2.5微升被分离的2-5A样品存在的情况下，大约有5-20%总的poly（U）〔32P〕pCp（15，000次衰变/分）被分裂。浓度也是如上一样，通过用真正的2-5A的一组校正曲线来确定。在将20000次衰变/分的P3A4〔32P〕pCp加到PBMC提取物（每次检测50微克蛋白）中后，在放射性结合测定法中测量了游离的RNase L的水平测得的结果如下：
在体外测定法中测量了由患LAS、ARC和AIDS人体获得的PBMC提取物中的干扰素诱发酶（2-5A合成酶）的活性，并如上表1所示，与健康人提取物中的活性进行比较。在患AIDS人体（3号与5号）中的2-5A合成酶水平比从正常人观察到的水平高16和20倍（见表1第1列）。对比之下，在患LAS、ARC和伴有Kaposi氏肉瘤（KS）的爱滋病病人（4号）中，2-5A合成酶水平仅提高1.3至5倍，这一结果支持了由其它人进行的基本观测结果。
为了确定2-5A合成酶的这种体外测量是否是体内功能性酶的一个指示，将2-5A从PBMC中提取出来。从PBMC提取物的TCA可溶组分获得的2-5A的生物活性通过放射性结合测定法和核-纤维素酶测定法被广泛地说明。由这两种测定方法确定的2-5A的浓度相类似（表1第2和3列）。由方法A和方法B获得的结果之间的一致性（表1第2和3列）显示出，从人体PBMC提取物分离出来的2-5A能够像真正的2-5A那样以同样的程度结合到由L929细胞得到的RNase    L上，并激活它。
现在能够首次如下地解释LAS、ARC和AIDS中的2-5A合成酶和内源性2-5A之间明显没有定量相关性的原因（表1，将第1列与第2和3列比较）。在体外测定法中确定2-5A合成酶是以经过poly（rI）-poly（rC）-琼脂糖部分纯化为基础的;因此，这种测定法仅仅测量了在体内被dsRNA激活的游离2-5A合成酶。但是内源性2-5A合成酶的直接测量要加上2-5A降解酶（即2′-磷酸二酯酶和磷酸酯酶）。因此，在患LAS、ARC和AIDS人体PBMC内2-5A的积累表示了这种2-5A降解酶的一个低的活性。在PBMC中存在2-5A也表示存在一个至今尚未在正常人和爱滋病病人内探测到的内源性dsRNA。
失配的双股核糖核酸（RNA）是大分子RNA的一种已知形式（见美国专利4024222和美国专利4130641），其中双螺旋的不稳定阻止了碱基的配对。失配的dsRNA因它的干扰素诱导特征而众所周知，这种诱导特性表明了一个与干扰素诱导本身无关的机理（如欧洲专利申请83305426.5，申请日1983年8月15日，名称为“Antiproferative    Action    dsRNA    on    Tumor    Cells”）。
失配双股RNA的一个典型的治疗实例是由多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸/尿苷酸复合物形成的合成dsRNA，如rInr（Cx，U或G）n，其中x的值从4到29，例如这里被称为AMPLIGEN 的rInr（C12U）n，美国马里兰州Rockville的HEM研究公司登记的一个美国注册商标。已经研究了许多失配dsRNA聚合物，它们的性质都类似于Ampligen。失配dsRNA比其它形式的天然的和/或合成的dsRNA的主要治疗优点是它们在动物和人体内的毒性低。例如，Lampson等人的美国专利3666646描述了一些能够触发各种干扰素相关效应的早期dsRNA复合物，但是这些化合物的毒性排除了它们在癌症或有关疾病治疗中的任何临床应用。
现已知道，失配dsRNA，如Ampligen，对人的某些癌症、尤其是肾癌有治疗作用。虽然当前认为dsRNA仅仅是一种“干扰素诱发物”，但是dsRNA对完全耐受干扰素本身的人的某些癌症是有效的，这在本申请人的欧洲专利申请83305426.5中已作了全面的描述。
在另一份专利申请中（见欧洲专利申请86306582.7，申请日：1986年8月26日，题为“Modulation    of    Virus-Related    Events    by    Double-Stranded    RNAs”），发明人描述了用Ampligen作为原型dsRNA时dsRNA对人体细胞培养物中爱滋病病毒的抑制作用。
用“匹配dsRNA”来指对应两个股之间的氢键（碱基的堆积）相对来说是完整的那些dsRNA，即在每29个依次接续的碱基残基中，中断平均小于1个碱基对。因此，应当相应地理解术语“失配dsRNA”。
这种dsRNA可以是包含一定比例、如5个中1个至30个中1个的尿嘧啶基或胍基的多肌苷酸和多胞苷酸的复合物、polyI·poly（C4-29X＞U或G）。
这种dsRNA可以具有rIn·（C12U）n·的通式，下面将讨论dsRNA的其它合适的例子。
在本发明中使用的失配dsRNA最好是以从poly（Cn，U）和poly（Cn，G）中选出的共聚核苷酸为基础，其中n是数值从4到29的一个整数，并且它是通过修改rIn·rCn以便沿多核糖胞苷酸（rCn）股的方向加入不配对的碱基（尿嘧啶基或胍基）形成的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸复合物的失配类似物。另一方面，可以通过修改多核糖肌苷酸（rIn）的核糖基主链，例如通过加入2′-0甲基核糖基残基，从poly（I）·poly（C）dsRNA得到这种失配dsRNA。这些rIn·rCn失配类似物最好是具有通式rIn·r（C12，U）n的那些，它们在Carter和Ts′o的美国专利4130641和4024222中被描述，它们的公开内容通过引用被结合到本申请中。那里所描述的dsRNA总的来说是适合用于本发明的。
在本发明中使用的失配dsRNA的具体例子包括：
poly（I）·poly（C4，U）
poly（I）·poly（C7，U）
poly（I）·poly（C13，U）
poly（I）·poly（C22，U）
poly（I）·poly（C20G）
poly（I）·poly（C29G）以及
poly（I）·poly（Cp）23G＞p
预期由本发明得出的药物组合物包括那些适合于在适当药物载体中的肠胃道外施用的组合物。例如，非肠道的溶液、悬浮体、分散体都可以根据需要用灭菌的或无热源的、有或没有生理上可接受的盐的水作为溶剂/稀释剂、按照已有的制药技术被制取。
施用失配dsRNA的量最好足以使在运离输注部位的地方，在注入后不久的全身血液循环中得到的最大血浓度从0.01微克/毫升、通过体液直到1000微克/毫升。
另外，可将一个有效的浓度在注入受血者之前加到血液产品中。在这种情况下，操作者可以简单地参照一张将受血者的重量与他或她的体液容积相互联系起来的体液容积标准表，它上面的容积是病人的体液容积和为用必要量的dsRNA平衡面利用的体液容积的总和。一个60至70公斤病人的体液容积约为5至6公斤。

Claims (10)

1、一种用于确定人体免疫缺陷病毒和引起大致类似临床症状其它病毒存在的方法，包括在一种动物的细胞提取物中确定一种RNaseL抑制剂的存在，该抑制剂是指示HIV存在或与HIV有关的基因信息存在的一种标记。
2、一种如权利要求1所述的用于确定隐伏在人体生物液体或细胞中的人体免疫缺陷病毒存在的方法，包括探测人体生物液体或细胞中核糖核酸酶（RNase）L抑制剂的存在。
3、一种如权利要求2所述的方法，其中的生物液体是血液或血液成分。
4、一种用于确定HIV侵入动物体内可能性的诊断试验，包括检查该动物组织的一种提取物并确定存在或不存在至少一种如权利要求1所述的RNase  L抑制剂，存在这种抑制剂肯定地表明存在HIV病毒的侵入。
5、一种监测从HIV或引起类似生物化学的和/或临床症状的病毒中得以逐渐恢复的方法，该方法包括如下步骤：（1）决定在病人细胞的一种提取物中存在或不存在至少一种RNase  L抑制剂，如果探测到一种RNase  L抑制剂，（2）施用一定量的dsRNA，其量要足以减少HIV诱发条件或其它引起类似生化和/或临床状况的这样一些病毒的RNase  L抑制剂的量，以及（3）继续施用dsRNA直到病人的临床症状稳定或改善。
6、一种如权利要求1或5所述的方法，其中的dsRNA是一种失配的dsRNA。
7、一种如权利要求6所述的方法，其中的dsRNA是一种包含从1/5到1/30的尿嘧啶基或胍基的多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸的复合物。
8、一种如权利要求7所述的方法，其中的dsRNA具有通式rIn·（C12，U）n。
9、一种赋予对HIV免疫性的方法，包括给动物施用RNase  L的一种HIV特异抑制剂，或施用在2′-5′A/RNase  L途径中的生化中间物的一种病毒相关抑制剂作为一种抗原。
10、一种治疗HIV的方法，包括对HIV感染的动物施用一种有效剂量的物质，该物质能去除RNase  L的HIV特异抑制剂或在2′-5′A/RNase  L途径中的生化中间产物的病毒相关抑制剂，并继续施用直到该抑制剂有很大改变为止。
CN88101696A 1987-12-23 1988-03-03 用作病毒感染标记的RNase L抑制剂 Pending CN1043569A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13697887A 1987-12-23 1987-12-23
US136,978 1987-12-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1043569A true CN1043569A (zh) 1990-07-04

Family

ID=22475294

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN88101696A Pending CN1043569A (zh) 1987-12-23 1988-03-03 用作病毒感染标记的RNase L抑制剂

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0325018A3 (zh)
JP (1) JP2690493B2 (zh)
KR (1) KR890010562A (zh)
CN (1) CN1043569A (zh)
AU (2) AU1256488A (zh)
CA (1) CA1337277C (zh)
DK (1) DK112988A (zh)
FI (1) FI880960A (zh)
HU (1) HU205460B (zh)
IL (1) IL85577A0 (zh)
NO (1) NO880935L (zh)
OA (1) OA08815A (zh)
PH (1) PH25365A (zh)
PT (1) PT86880B (zh)
RU (1) RU1836101C (zh)
SU (1) SU1687035A3 (zh)
ZA (1) ZA881470B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112088903A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 武汉愔紫生物科技有限公司 一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5278042A (en) * 1989-02-06 1994-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Method for detecting inhibitors of tat protein
FR2725214A1 (fr) * 1994-09-30 1996-04-05 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux composes utilisables pour la preparation d'agents anti-infectieux
US5985565A (en) 1996-10-09 1999-11-16 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Chronic fatigue syndrome diagnosis
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AU743316C (en) 1998-03-20 2005-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Control of gene expression
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6207366B1 (en) 1999-04-14 2001-03-27 Temple University- Of The Commonwealth System Of Higher Education Chronic fatigue syndrome diagnosis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2505845A1 (fr) * 1981-05-13 1982-11-19 Choay Sa Procede de dosage de la 2',5'-oligo-adenylate-synthetase, methodes de detection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de l'interferon circulant ou present dans des tissus, apres administration de l'interferon, ou apres administration d'inducteurs de l'interferon et ensemble pret a l'emploi, ou kit, pour la mise en oeuvre desdits procedes de dosage et methodes de detection et de dosage
EP0113162B1 (en) * 1982-09-16 1989-07-19 Hem Research, Inc. Anti-proliferative action of dsnras on tumor cells
CA1326450C (en) * 1985-08-26 1994-01-25 William A. Carter Modulation of aids virus-related events by double stranded rnas (dsrnas)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112088903A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 武汉愔紫生物科技有限公司 一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
NO880935D0 (no) 1988-03-02
CA1337277C (en) 1995-10-10
JPH01171500A (ja) 1989-07-06
NO880935L (no) 1989-06-26
DK112988A (da) 1989-06-24
PT86880A (pt) 1988-04-01
ZA881470B (en) 1988-11-18
AU1618792A (en) 1992-09-10
HU205460B (en) 1992-04-28
PT86880B (pt) 1993-01-29
SU1687035A3 (ru) 1991-10-23
FI880960A0 (fi) 1988-03-02
HUT47745A (en) 1989-03-28
AU660973B2 (en) 1995-07-13
FI880960A (fi) 1989-06-24
AU1256488A (en) 1989-06-29
KR890010562A (ko) 1989-08-09
RU1836101C (ru) 1993-08-23
JP2690493B2 (ja) 1997-12-10
DK112988D0 (da) 1988-03-02
OA08815A (en) 1989-03-31
PH25365A (en) 1991-05-13
EP0325018A3 (en) 1990-01-17
IL85577A0 (en) 1988-08-31
EP0325018A2 (en) 1989-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Suhadolnik et al. Upregulation of the 2-5A synthetase/RNase L antiviral pathway associated with chronic fatigue syndrome
Nakashima et al. Anti-human immunodeficiency virus activity of a novel synthetic peptide, T22 ([Tyr-5, 12, Lys-7] polyphemusin II): a possible inhibitor of virus-cell fusion
JP2001500471A (ja) プロテアーゼインヒビターの生物学的及び抗ウイルス活性を改善する方法
CN1050995C (zh) 通过系统的dsＲＮＡ治疗使宿主防御介质进入生物液体中
CN86105436A (zh) 利用双链rna调节与爱滋病病毒相关的行为
CN1043569A (zh) 用作病毒感染标记的RNase L抑制剂
Pinto et al. Extracellular vesicles from HTLV-1 infected cells modulate target cells and viral spread
CN1035050A (zh) 双链rna纠正循环免疫复合物及单核细胞功能异常
CN1059659A (zh) 病毒性肝炎的诊断和治疗
WO1995000529A1 (en) INHIBITION OF INTERFERON-η WITH OLIGONUCLEOTIDES
EP0285263B1 (en) Activated RNase L as a marker for virus infections
Taub et al. Alterations in mast cell function and survival following in vitro infection with human immunodeficiency viruses-1 through CXCR4
US5599917A (en) Inhibition of interferon-γ with oligonucleotides
NZ235656A (en) Diagnosis of chronic dementia by comparison of 2-5 a synthetase levels
EP0437346A1 (en) Anti-viral fraction of aqueous Lentinus edodes extract
CN1030140A (zh) 用作病毒感染标记活化核糖核酸酶l
IE922145A1 (en) Modulation and diagnosis of cytokine dysfunctions
RU2021810C1 (ru) Способ воздействия на развитие заболевания, вызванного hiv-вирусом или вирусом, вызывающим сходную биохимическую или клиническую картину
JPH0825884B2 (ja) 二本鎖ｒｎａの欠損状態を治療するための医薬
CA2060489C (en) Diagnosis and treatment of neuro-cognitive disorders associated with systemic immunological malfunction
AU724056B2 (en) Diagnosis and treatment of double stranded deficiency states
KR101049856B1 (ko) Ｈｉｖ－１ 잠복성 세포주, 이의 제조방법 및 잠복성 ｈｉｖ 감염의 진단방법
KR101049858B1 (ko) Ｈｉｖ－１ 잠복성 세포주, 이의 제조방법 및 잠복성 ｈｉｖ 감염의 진단방법
HU209865B (en) Method for determinating the presence of hiv
JPH09278658A (ja) 新規ｉｆｎ インデューサー

Legal Events

Date Code Title Description
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
C06 Publication
C10 Entry into substantive examination
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication