KR101049856B1 - Ｈｉｖ－１ 잠복성 세포주, 이의 제조방법 및 잠복성 ｈｉｖ 감염의 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 잠복성 HIV감염 세포주, 이의 제조방법 및 잠복성 HIV 감염의 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 인간 T-림프구세포인 A3.01 세포주의 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4에 HIV(human immunodeficiency virus) 유전자가 융합된 것을 특징으로 하는 잠복성 HIV-감염 세포주 NCHA-1에 관한 것이다. 이로 인하여, 본 발명의 잠복성 HIV감염 세포주는 HIV 프로바이러스(provirus)를 포함하고, 종래의 잠복성 세포주와 상이한 분자생물학적인 특성을 나타내어 HIV 프로바이러스의 잠복성 및 이의 재활성화에 관한 연구에 유용하며, 나아가 HIV의 잠복기 병리현상을 효과적으로 규명함으로서 궁극적으로 HIV/AIDS환자의 AIDS 치료 및 예방에도 기여할 수 있다.
세포주, HIV-1, 잠복성 감염, 수용체 발현저하, 히스톤 H3 변형

Description

ＨＩＶ－１ 잠복성 세포주, 이의 제조방법 및 잠복성 ＨＩＶ 감염의 진단방법{HIV-1 latent cell line, its manufacturing process, and diagnostic method of HIV-1 latency}
본 발명은 잠복성 HIV감염 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
1980년대 초 AIDS 원인병원체인 HIV바이러스가 분리된 이후 전세계적으로 많은 연구자들이 AIDS극복을 위하여 다방면으로 노력하고 있으나 아직까지 효과적인 예방 및 치료백신은 개발되지 못하고 있는 상황이다. 임상적인 측면에서 HIV감염자 및 AIDS환자에 대한 지속적인 HAART(highly active antiretroviral therapy)치료로 AIDS 발생 및 AIDS관련 사망률이 크게 감소되었지만, HIV감염 환자의 휴지기 CD4+ T 세포, 즉, 잠복성 HIV감염 병원소(HIV reservoir)의 지속적인 존재는 숙주로부터 HIV 바이러스 근절에 주요한 장애물이 되고 있다(Ho et . al ., 1995; Chun et . al., 2000). 이들 잠복성 감염 세포는 HAART 중단 후 HIV바이러스 재활성화의 결정적인 원인으로 작용하고 있다(Chun et . al., 1999). 전세계적으로 HIV 연구분야에서 풀어야 할 가장 큰 숙제는 '어떻게 HIV가 숙주내에서 잠복감염상태를 유지할 수 있으며, 효과적으로 숙주내 존재하는 HIV감염 병원소를 제거할 수 있는 방법 은 무엇인가?' 라는 화두이다. 따라서, HIV 프로바이러스의 잠복성 및 재활성을 조절하는 분자 매커니즘에 대한 구체적인 이해는 세포내 HIV 병원소 제거를 통한 AIDS질병의 완치에 단서를 제공하여 줄 것이다.
최근 연구보고에 따르면, HIV 프로바이러스를 가진 잠복성 세포는 인터로킨-2(interleukin-2) 및 PMA(phorbol myristyl acetate)와 같은 다양한 화학약물을 처리하여 제거할 수 있다(Fraser et . al., 2000; Alexaki et . al., 2007). 그러나, 이들 화학약물은 매우 유독하며 또한, HIV감염자로부터 HIV-1 병원소를 제거하는데 효과적이지 못하다. 또한, 프로테아좀(proteosome), HDAC(histone deacetylase) 및 TRAIL를 포함하는 세포내 단백질들이 HIV의 잠복성과 관련성이 있다고 보고되고 있다(Lum et . al., 2001; Krishnan and Zeichner, 2004; Williams et . al.; 2006). 현재 전세계적으로 이용되고 있는 ACH-2, J1.1 및 U1 세포와 같은 잠복성 감염 세포들은 유전자 발현양상이 정상세포와는 현격한 차이를 나타내고 있음이 보고 되었다(Krishnan and Zeichner (2004)). HDAC 억제제인 발포릭산(valporic acid) 및 트리코스타틴 A(trichostatin A)의 경우 HIV 병원소를 재활성화시켜 HIV 만성감염을 중단할 수 있는 것으로 평가되고 있다(Lehrman et . al., 2005; Vandergeeten et. al ., 2007). 특히, HDAC에 의한 HIV만성감염기전은 CBF-1/HDAC 상호작용과 c-Myc/Sp1/HDAC 복합체에 의해 HIV 잠복성 유도 모델들로 제시되고 있다(Tyagi M and Karn J, 2007; Jiang et . al ., 2007). 최근 에피제네틱(epigenetic) 연구에서는 HAT(histone acetyltransferase), HDAC(histone deacetylase) 및 HMT(histone methyltransferase) 억제제 등의 세포내 히스톤 단백질 억제제가 병원성 감염치료 제로 사용될 수 있음이 밝혀지고 있다(Mai, 2007). 그러나, 아직까지 HIV잠복감염에 관여하는 결정적인 세포인자와 세부적인 메커니즘 대부분 밝혀지지 않은 상태이며, 현재 사용되고 있는 HIV만성감염 세포주도 매우 제한되어 있다는 한계가 있다.
이에 의하여, 본원발명에서는 기존의 감염 세포주에 비하여 만성감염 상태를 보다 안정적으로 유지하면서도 바이러스의 재활성화를 높은 수준으로 유지할 수 있는 세포주를 포함한, 다양한 감염 상태를 대표할 수 있는 3종의 서로 다른 HIV 만성 감염 세포주를 제조하였고, 제조된 만성감염 세포주의 분자생물학적 특징을 밝혀내었으며, 크로마틴 변형단백질에 의한 HIV만성감염 메커니즘을 연구하였다.
본 발명의 목적은 인간 T-림프구 A3.01 세포주의 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4에 HIV(human immunodeficiency virus) 유전자가 융합된 신규한 잠복성 HIV-감염 세포주 NCHA-1(New chronic HIV-infected A3.01-derived cell-1)을 제공하기 위한 것으로, HIV 프로바이러스의 잠복성 및 이의 재활성화에 관한 연구분야에 유용한 세포주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 인간 T-림프구 A3.01 세포주의 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4에 HIV(human immunodeficiency virus) 유전자가 융합된 것을 특징으로 하는 잠복성 HIV-감염 세포주 NCHA-1을 제공한다.
또한, a) 인간 T-림프구 A3.01 세포주에 HIV를 감염시켜, 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4로 HIV의 유전자를 융합시키는 단계;
b) HIV로 감염된 A3.01 세포의 생존능력이 5% 미만일때, 한계희석 클로닝을 통해 잠재적인 잠복성 HIV감염 세포주를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV감염 세포주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간으로부터 채취한 T 림프구 세포주의 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4에 융합된 HIV 유전자를 확인하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법을 제공한다.
바람직하게는, HIV가 pNL4-3 바이러스임을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염 의 진단 방법을 제공한다.
바람직하게는, T 림프구 세포주가 A3.01 세포주인 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법을 제공한다.
바람직하게는, 세포주에 PMA를 처리하여 HIV-프로바이러스를 재활성화시킨 후, HIV-1 p24 항원 생산량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법을 제공한다.
바람직하게는, 세포주에 TNF-a 또는 TSA를 처리하여, 히스톤 H3 단백질의 아세틸화를 측정하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 HIV/AIDS치료용 잠복성 HIV감염 세포주는 HIV 프로바이러스를 포함하고, 종래의 감염 세포주에 비하여 만성감염 상태를 보다 안정적으로 유지하면서도 바이러스의 재활성화를 높은 수준으로 유지할 수 있으며, 다양한 감염 상태를 대표할 수 있는 HIV 만성 감염 세포주이다. 이에 의해, HIV 프로바이러스의 잠복성 및 이의 재활성화에 관한 연구에 유용하며, 나아가 AIDS의 잠복기 병리현상을 규명하는데 효과적이며, 궁극적으로 AIDS의 치료와 예방에도 기여할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 해당기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1: HIV 잠복 세포의 생성
<1-1> 세포주의 수득
대조군 세포주(A3.01, ACH-2)는 미국립보건원 AIDS 연구 및 레퍼런스 시약 프로그램(National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program)을 통해 구입하였다. ACH-2는 HIV-1 LAV 표준주를 포함하는 만성적 HIV-1 감염 세포주이고, A3.01 세포는 동종 표준주에 감염되지 않은 모체 세포주이다. 95% 공기-습도 조절 인큐베이터 하에서 37 ℃에서 10% FBS (fetal bovine serum), 5% 페니실린-스트렙토마이신 및 5% CO2, 2 mM 글루타민이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 세포를 배양하였다. 배양 플라스크의 세포농도는 1 x 106 cells/ml로 유지하였다. HIV-1 pNL4-3 표준주(Genebank Acc. No. AF324493)를 MOI(multiplicity of infection) 0.3으로 감염시킨 인간 T-림프구 A3.01 세포를 37 ℃에서 배양하였다. 바이러스에 1시간 노출시킨 후, 감염세포에 신선한 배지를 첨가하였고, 10% FBS(fetal bovine serum), 5% 페니실린-스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 1 x 106 cells/ml의 농도로 세포를 배양하였다. 바이러스 감염 후 시간경과에 따라 살아있는 세포 및 죽은 세포수를 측정하였으며 또한, 바이러스가 함유된 상층액(supernatants)이 수집되었다.
<1-2> HIV -1 DNA 를 포함하는 세포주의 스크리닝
HIV-1 pNL4-3 바이러스감염 50일 후 HIV감염 A3.01 세포의 생존능력이 5% 미만일 때 한계희석(limiting dilution)클로닝에 의해 570개의 잠재적인 A3.01-유래 HIV잠복성 감염 세포주를 제조하였다.
총 지노믹(genomic) DNA는 각각 제조업자의 프로토콜에 따라 DNeasy Midi 키트 및 혈액 & 세포 배양 DNA 키트(Qiagen, Valencia, California)에 의해 분리되었다. 총 DNA의 농도 및 순도를 분광광도계에 의해 측정하였고, 분리된 지노믹 DNA는 각각 추후 사용할 때까지 -80℃에서 RNase가 제거된 증류수 100㎕ 및 Tris-EDTA 버퍼(pH 8.0) 100㎕에 보관하였다. 잠재적인 HIV감염 세포의 스크리닝은 SK38/SK39 프라이머를 이용한 HIV DNA PCR 및 HIV p24 항원 ELISA를 통해 수행하였다.
GeneAmplimer® HIV-1 Control Reagents(Applied Biosystems, Foster City, California)를 사용한 HIV-1 gag PCR 및 실시간 PCR에 의해 570개의 잠재적인 HIV잠복성 감염 세포주로부터 신규 만성적 HIV감염 A3.01-유도 세포(NCHA: New chronic HIV-infected A3.01-derived cell)를 수득하였다. 이는 융합 프로바이러스(도 1A)를 포함하였고, HIV-1 p24 항원(도 1B)을 미량 발현하였다. 도 1에서 A3.01는 HIV-1 감염되지 않은 세포(음성 대조군 세포주); ACH2는 HIV감염 세포주 (양성대조군 세포주); NCHA(A3.01 세포 유래 HIV-1 만성감염 세포주)는 생성된 세포주이며, 예상된 바와 같은 DNA 크기의 증폭 결과가 나타났다. 데이터는 3회 측정값의 평균(± 표준오차)으로 나타내었다.
실시예 2: HIV -1 융합( integration ) 부위의 인접 서열에 대한 역( Inverse ) PCR
HIV-1 융합 부위의 분석은 Siliciano박사 연구진의 역-PCR 방법을 변형시켜 수행하였다. 제한효소 Pst I (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)를 사용하여 본 발명의 세포주로부터 수득한 지노믹 DNA 50ng의 특정부위를 절단시켰다. Pst I으로 절단된 DNA를 37℃에서 하룻밤동안 배양시킨 후 Pst I 제한효소를 비활성화시켰고, 에탄올-침전 방법에 의해 DNA를 정제하고 난 다음, DNA T4 리가아제 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana)로 접합(ligation)하였다. 접합된 고리형(Circularized) 지노믹 DNA는 에탄올-침전 방법에 의해 정제하였고, HIV-1 인접 서열은 Siliciano박사 연구실의 Han 등에 의해 개발된 프라이머로 증폭되었다.
제 1 프라이머 쌍의 서열은 정방향 프라이머(Outer LTR) 5’-TAA CCA GAG AGA CCC AGT ACA GGC-3’과 역방향 프라이머(Outer gag) 5’-GGT CAG CCA AAA TTA CCC TAT AGT G -3’이고; 제 2 프라이머 서열은 정방향 프라이머(Inner LTR) 5’-TGG TAC TAA CTT GAA GCA CCA TCC A -3’ 및 역방향 프라이머(Inner gag) 5’- TGT TAA AAG AGA CCA TCA AGT AGG AAG-3’이다. PCR 혼합물 50㎕는 고리형 지노믹 DNA 5.0㎕; 10X-EF-Taq 버퍼 5.0㎕; EF-Taq 중합효소 0.4㎕(2.5U); HIV-1 DNA에 대한 각각의 10μM 프라이머 1.5㎕; 각각의 10 mM dNTP 1.5㎕ 및 증류수 35.1㎕로 구성되었다. PCR은 94℃에서 3분, 94℃에서 30초, 65℃에서 1분 및 68℃에서 2분을 30회 반복 수행하였고, 최종 신장(Final extension)은 68℃에서 4분동안 수행하였다. 제 2 역 PCR은 제 1 역 PCR과 같은 조건에서 Han 박사 등에 의해 개발된 네스티드 프라이머 및 제 1 역 PCR 산물 5.0㎕을 사용하여 수행하였다. 네스티드 PCR 밴드는 겔(Gel)로부터 분리하여 ABI PRISM 3730XL DNA 분석기 및 BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing 키트 (Applied Biosystems, Foster City, California)를 사용하여 Inner LTR 프라이머에 의해 염기서열이 결정되었다.
Figure 112008057942829-pat00001
변형된 역 PCR로부터 얻어진 HIV-1 융합 부위를 재확인하기 위하여, 염기서열이 결정된 부위를 사용하여 특정 프라이머를 제작하였으며, 이를 사용하여 직접 지노믹 DNA PCR을 수행하여 결과를 재확인하였다. HIV-1 융합부위는 UCSC 생물정보학 인간 유전체 데이터베이스(UCSC Bioinformatics Human Genome Database)를 이용하여 결정하였다. 표 1에서 a 는 HIV-1 LTR의 5' 말단(TTCCA) 및 숙주 세포 DNA 사이의 접합 부위 서열을 의미하고, b는 융합 부위(Integration site)을 의미하며, UN(Unknown)는 밝혀지지 않음을 의미한다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 NCHA 세포주에서 HIV-1 프로바이러스들은 서로 다른 염색체 위치 및 특정부위 유전자에 삽입되었으며, 삽입된 HIV-1 프로바이러스 수는 1 ~ 2개였다. NCHA-1 세포주는 2개의 HIV 프로바이러스가 숙주염색체로 삽입되었으며; 이 중 하나는 염색체 1에 있는 GDAP2 유전자로 융합되었고, 다른 하나는 염색체 X에 있는 유전자로 융합되었다. NCHA-2 및 NCHA-3 세포주는 각각 1개의 HIV 프로바이러스가 숙주 염색체로 융합되었다. NCHA-2 세포주에서는 염색체 11에 있는 AK096155로, NCHA-3 세포주에서는 염색체 7에 있는 ANL 유전자로 융합되었다.
실시예 3: HIV -1 DNA 를 포함하는 세포주에 대한 PMA 유도 분석
만성적으로 HIV 감염된 세포주(ACH-2 세포) 및 감염되지 않은 모체 세포주(A3.01 세포)는 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용되었다. 모든 세포주는 PMA 처리 전 상청액에 존재하는 p24 항원을 제거하기 위하여 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척하였다. PMA 20 ng/ml은 HIV감염 및 감염되지 않는 세포를 자극하기 위해 사용하였으며, 본 시험을 위하여 사용된 세포수는 1 x 105 cells/ml이었다. HIV만성감염 세포와 모체세포를 PMA를 처리한 그룹과 PMA를 처리하지 않은 그룹으로 나누어 배양하였다. 각각의 세포주로부터 세포 상층액은 PMA 처리 후 0, 24, 48 및 72 시간 경과시마다 p24 항원농도 측정을 위하여 수집되었다. 세포 상층액에 존재하는 p24 항원농도는 HIV-1 p24 항원 포획 분석 키트(Vironostika® Biomeriex, Boxtel, the Netherlands)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 측정되었다. 생물학적 반복시험(biological replicates)을 위해 4회의 독립적인 PMA 유도 실험을 수행하였다.
PMA처리 후 다양한 시점(0, 24, 48 및 72 시간)에서 생성된 HIV-1 p24 항원 생성량을 측정하여 도 2에 나타내었다. 도 2에서 하얀색 및 회색 막대는 각 시점의 PMA 처리 전과 후의 상층액에 존재하는 HIV-1 p24 항원 생성량을 나타낸다. 모든 시험결과는 3회 측정값의 평균(± 표준오차)으로 나타내었다. ACH2 세포 및 NCHA 세포주에 PMA 처리 후 HIV-1 p24 항원 생성량이 현격하게 증가되었다(도 2; 회색 막대). ACH2 세포 및 NCHA 세포주에서 HIV-1 복제 속도는 매우 상이하였으며 특히, NCHA-1 및 NCHA-2 세포주에서 PMA 처리 후 HIV-1 p24 항원 생성량은 PMA 처리전에 비하여 현저하게 증가되었다. PMA를 처리하지 않은 경우, ACH2 세포에서 HIV-1 p24항원 생성량이 시간에 따라 서서히 증가한 반면, NCHA-1 및 NCHA-2 세포주에서의 HIV-1 p24항원 생성량은 ACH2 세포 및 NCHA-3 세포주보다 훨씬 낮았다(도 2; 하얀색 막대).
실시예 4: HIV -1 자손 바이러스의 감염성 측정
A3.01 세포주를 사용하여 본 발명의 세포주에 의해 생성된 HIV-1 후손 바이러스의 표적 T 세포들에 대한 HIV 감염성 시험을 수행하였다. HIV감염성 시험에 사용된 표적 세포 수와 HIV-1 p24 항원 생성량은 각각 2 x 105 개 및 10 ng이었다. 각각의 세포주로부터 HIV-1 p24 항원 생성량 10 ng에 필요한 세포 상층액 부피를 산출한 다음 표적 세포(A3.01 세포)에 산출된 양을 첨가하였다. HIV-1 p24 항원 생성량 10 ng을 첨가한 다음 시간에 따른 HIV-1 p24항원 생성량을 측정하기 위하여 상층액을 0, 24, 48 및 72시간 경과 후 수집하였다. HIV-1 p24 항원농도는 HIV-1 p24 항원 포획 분석 키트 (Vironostika® Biomeriex, Boxtel, the Netherlands)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였으며, 생물학적 반복을 위해 3회 독립적인 실험을 수행하였다. 시험결과는 3회 측정값의 평균(± 표준오차)으로 나타내었다. ACH2 세포와 NCHA 세포주에서 생성된 HIV-1 자손바이러스는 모두 표적세포인 A3.01 세포에 감염성을 나타내었다 (도 3). HIV-1 자손 바이러스가 높은 감염성(virulence)을 보이는 시기는 ACH2 세포 및 NCHA-3 세포주에서 생성된 HIV-1 자손바이러스는 감염 후 24시간이 경과된 때인 반면, NCHA-1 및 NCHA-2 세포주에서 생성된 HIV-1 자손바이러스는 감염 후 48시간이 경과된 때였다(도 3).
실시예 5: TNF -α 및 NF κB 에 의한 HIV 프로바이러스의 재활성화
본 발명에서는 NCHA 만성 HIV 감염 세포주에서 융합된 HIV-1 프로바이러스의 재활성화에 대한 TNF-α(tumor necrosis factor alpha) 및 NFκB p65의 역할을 규명하기 위하여 유세포 분석, HIV-1 p24항원 생성량 측정 및 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)를 포함한 웨스턴 블랏을 수행하였다. 각각의 세포들을 수집한 후 PBS에서 세정하여, 세포들을 용해시켜 핵을 Panomix (AY 2002)의 핵 추출 키트를 사용하여 추출하였다. 단백질 농도는 micro-BCA 단백질 분석 키트(#23235, PIERCE)로 측정하였다. 핵 추출물(단백질 5 ug)은 비오틴-표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 배양하였다. Panomix (AY 1030)로부터 수득한 EMSA 키트 및 활성제 단백질 NFκB (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGC-3')로 프로브를 특정하였다. DNA-단백질 복합체는 6% DNA 지연(retardation) 겔(EC63652; Invitrogen)로 분해시켰다. 겔은 Biodyne B nylon 막(P/N 60201, PALL)에 옮겼고, streptavidin-HRP 및 화학발광 기질(chemiluminescent substrate)를 사용하여 검출하였다. x-ray 필름에 노출시켜 블랏을 이미지화 하였다; NFκB p65 (CST-3034), Phospho-NFκB p65(Ser536) (CST-3031), Phospho-NFκB p65(Ser276) (CST-3037), β-actin (sc-1616), Acetyl-Histone H3(Lys9) (CST-9671), Di-Methyl-Histone H3(Lys9) (CST-9753), Di-Methyl-Histone H3(Lys27) (CST-9755), 및 Acetyl-Histone H3(Lys27) (Upstate, 07-360). 모든 시험결과는 3회 측정값의 평균(± 표준오차)으로 나타내었다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, TNF-α로 48시간 처리 후 세포내 존재하는 HIV-1 p24 항원 생성량은 ACH2 세포에서 3배정도 증가한 반면, NCHA 세포주에서는 유의한 증가를 나타내지 않았다. 반면, 도 4B에 나타낸 TNF-α로 48시간 처리 후 상층액에 존재하는 HIV-1 p24 항원 생성량은 모든 HIV-1 만성감염세포에서 TNF-α 처리전에 비하여 현저하게 증가하였다. 특히, NCHA-1 및 NCHA-2 세포주에서 TNF-α에 의한 HIV-1 p24항원 생성 증가율이 ACH2 세포 및 NCHA-3 세포주보다 현저히 높았다.
또한, 도 4C에 나타낸 바와 같이, NCHA-1 세포주에서는 NFκB p65 및 세린 276 잔기부위의 인산화된 NFκB p65 단백질 발현이 다른 세포에 비하여 현저히 감소되었다. 도 4D에 나타낸 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay) 분석에서 NCHA-1 및 NCHA-2 세포주는 세린 276 잔기부위가 인산화된 NFκB p65 단백질과 NFκB 복합체가 A3.01 세포에 비하여 감소한 반면, ACH2 세포 및 NCHA-3 세포주에서는 현저한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 6: NCHA 세포주에서의 HIV -1 수용체 및 보조수용체의 표면 밀도 측정
HIV-1 수용체(CD4 receptor) 및 보조수용체(CXCR4/CCR5 co-receptor)는 표적 세포로의 HIV 바이러스의 유입에 필수적으로, 이들의 발현양상을 NCHA 세포주에서 측정하였다. CD3 수용체, CD4 수용체 및 CXCR4 보조수용체, CCR5 보조수용체에 대한 세포 표면과 세포내 염색은 다음의 분자들에 대한 단일클론 항체(mAbs)를 사용하여 염색하였다: CD3(UCHT1 [phycoerythrin-Cyanine5]; Beckman Coulter), CD4(13B8.2 [fluorescein isothiocyanate]; Beckman Coulter), CXCR4(12G5 [R-phycoerythrin]; Beckman Coulter), CCR5(2D7/CCR5 [phycoerythrin-Cyanine5]; Beckman Coulter). 각 세포들을 수집하여 염색 버퍼(2% FBS를 함유하는 1XPBS)로 세정하였다. 세포 펠렛을 재현탁시키고, 플루오로크롬 10ul가 결합된 항체(모든 항-마우스 mAb에서 사용된) 또는 마우스 IgG1 동형 대조군을 첨가하였다. 후속하여 20분동안 배양한 뒤 2회 세정하고, FC500 유 세포 측정기(Beckman Coulter, Flullerton, CA)로 샘플을 분석하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, HIV-1에 감염되지 않은 A3.01 세포는 높은 CD3-CD4+ T 서브세트(subsets)(60.7%) 및 낮은 CD3+CD4- T 서브세트(8.1%)를 보였다. CD3-CD4+ T 서브세트는 모든 잠복성 A3.01-유도 세포주인 ACH2 세포 및 NCHA 세포주에서 거의 검출되지 않았다. CD3+CD4- T 서브세트는 HIV-1 감염되지 않은 A3.01 세포와 비교하여 NCHA-2 및 NCHA-3 세포주에서 4배나 더 높은 반면(NCHA-2 세포주: 34.4%, NCHA-3 세포주: 35.7%), ACH2 세포에서는 비슷한 수준(ACH2 세포: 9.7%)이었다. 그러나, NCHA-1 세포주에서는 세포표면에 CD4 수용체 및 CD3 수용체 모두가 검출되지 않았다. 상기 결과와 같이 HIV-1 수용체인 CD4 표면분자는 잠복성 HIV감염 세포주에서 현저히 발현이 저하되었다(receptor down-regulation). 다음으로, HIV 친화성(tropism)에 관여하는 HIV-1 보조수용체 발현을 조사한 결과, NCHA-1 세포주는 CCR5 및/또는 CXCR4 보조수용체를 발현하는 반면, 다른 세포주에서는 세포 표면에서 오직 CXCR4 보조수용체만 발현하였다. NCHA-1 세포주의 경우 3분의 1정도(33.5%)의 서브세트가 CCR5 및 CXCR4 보조수용체를 모두 발현하였다(도 5B).
실시예 7: HIV -1 잠복성 및 히스톤 단백질 변형( Histone H3 modification )과의 연관성
히스톤은 유전자 활성 및 억제(silencing)에서 중요한 역할을 담당한다. 히스톤 H3 아세틸화는 PathScan 아세틸화된 히스톤 샌드위치 ELISA(Cell Signaling)을 사용하여 정량화하였다. 시험결과는 3회 측정값의 평균(± 표준오차)으로 나타내었다. NCHA 세포주에서 TNF-α(tumor necrosis factor alpha) 및 TSA(trichostatin A) 처리에 의한 히스톤 H3 아세틸화를 유도하였다. TNF-a (A) 및 TSA(B)로 24시간 처리한 후 잠복성 세포주에서의 히스톤 H3 아세틸화를 정량적으로 측정하였다. 도 6B 및 6D에서 나타낸 바와 같이, 모든 HIV만성감염 세포주에서는 TSA 처리 후 급격히 히스톤 H3 아세틸화가 증가하는 반면, TNF-α처리 후에는 미미한 변화만 관찰되었다(도 6A 및 6B). 이는 히스톤 H3 아세틸화의 증가에 의한 HIV-1 잠복감염세포의 활성화 정도는 TNF-α 와 TSA(trichostatin A)에 따라 다르게 일어남을 보여주고 있다. 보다 세분화하여 히스톤 H3 단백질의 9번과 27번 라이신 잔기에 대한 아세틸화 및 메틸화 변화를 웨스턴 블랏으로 측정하였는데, HDAC 억제제인 TSA만이 히스톤 H3 단백질의 9번과 27번 라이신 잔기의 아세틸화를 현저히 유도한 반면, TNF-α 와 TSA(trichostatin A)는 모두 27번 라이신 잔기의 메틸화를 감소시켰다 (도 6C 및 6D). 이와 일관되게, TSA는 TNFα처리와 비교하여 ACH2 세포 및 NCHA 세포주로부터 HIV 프로바이러스의 재활성을 보다 현저히 유도하였다(도 6E 및 도 6F).
도 1은 본 발명에 따른 세포주 NCHA-1을 수득하기 위한 한계 희석 스크리닝 결과(A) 및 잠복성 프로바이러스의 HIV-1 p24항원 발현(B)을 ELISA에 의해 측정한 결과이다.
도 2는 시간 변화에 따른 PMA 유도 이전(-) 및 이후(+)에서의 HIV-1 프로바이러스 재활성 유도를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 세포주로부터 생성된 HIV-1 자손바이러스의 표적 세포에 대한 감염성 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 TNF-α 및 NFκB에 의한 본 발명에 따른 세포주의 HIV 프로바이러스 재활성화를 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 세포주에서의 HIV-1 수용체(A) 및 보조 수용체(B)의 표면밀도를 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 세포주에서 HIV-1 잠복성과 히스톤 H3 단백질 변형과의 연관성을 규명한 결과이다.

Claims (9)

  1. 인간 T-림프구 A3.01 세포주의 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4에 HIV(human immunodeficiency virus) 유전자가 융합된 것을 특징으로 하는 잠복성 HIV-감염 세포주 NCHA-1(기탁번호: KCLRF-BP-00183).
  2. 제1항에 있어서, 상기 HIV 유전자가 pNL4-3 바이러스 유전자임을 특징으로 하는, 잠복성 HIV-감염 세포주 NCHA-1.
  3. a) 인간 T-림프구 A3.01 세포주에 HIV를 감염시켜, 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4로 HIV의 유전자를 융합시키는 단계;
    b) HIV로 감염된 A3.01 세포의 생존능력이 5% 미만일때, 한계희석 클로닝을 통해 잠재적인 잠복성 HIV감염 세포주를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 잠복성 HIV감염 세포주의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 HIV 유전자가 pNL4-3 바이러스 유전자임을 특징으로 하는, 잠복성 HIV감염 세포주의 제조방법.
  5. 인간으로부터 채취한 T 림프구 세포주의 염색체 1의 p12 및 염색체 X의 p11.4에 융합된 HIV 유전자를 확인하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진 단 방법.
  6. 제5항에 있어서, T 림프구 세포주가 A3.01 세포주인 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법.
  7. 제5항에 있어서, HIV가 pNL4-3 바이러스임을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주에 포볼 미리스틸 아세테이트(phorbol myristyl acetate)를 처리하여 HIV-프로바이러스를 재활성화시킨 후, HIV-1 p24 항원 생산량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주에 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha) 또는 트리코스타틴 A(trichostatin A)를 처리하여, 히스톤 H3 단백질의 아세틸화를 측정하는 것을 특징으로 하는, 잠복성 HIV 감염의 진단 방법.
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