FR2505845A1 - Procede de dosage de la 2',5'-oligo-adenylate-synthetase, methodes de detection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de l'interferon circulant ou present dans des tissus, apres administration de l'interferon, ou apres administration d'inducteurs de l'interferon et ensemble pret a l'emploi, ou kit, pour la mise en oeuvre desdits procedes de dosage et methodes de detection et de dosage - Google Patents
Procede de dosage de la 2',5'-oligo-adenylate-synthetase, methodes de detection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de l'interferon circulant ou present dans des tissus, apres administration de l'interferon, ou apres administration d'inducteurs de l'interferon et ensemble pret a l'emploi, ou kit, pour la mise en oeuvre desdits procedes de dosage et methodes de detection et de dosage Download PDFInfo
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Abstract
Procédé de dosage de l'activité enzymatique de la 2',5'-oligo-adénylate-synthétase 2,5 AS dans un extrait brut de cellules sanguines. Ce procédé consiste à incuber un système substrat constitué par un accepteur de 2 -adénylation désigné par la formule générale RpA, et par un donneur de nucléoside-monophosphate NMP constitué par un nucléoside-tri-phosphate autre que l'ATP, avec un extrait brut de cellules sanguines, en présence de la 2,5 AS et d'un activateur de cette dernière pour obtenir du RpA-NMP qui est mesuré par séparation du RpA-NMP, du RpA, par chromatographie en couche mince dans un système solvant approprié, la quantité de RPA-NMP formée étant approprié, la quantité de RpA-NMP formée étant proportionnelle à la quantité d'interféron présente dans les tissus ou fluides biologiques après addition d'interféron ou d'inducteurs de l'interféron. Application à la détection d'infections virales et microbiennes et de l'activité antivirale induite par l'interféron.
Description
La présente invention est relative à un nouveau
procédé de dosage de la 2',5'-oligo-adénylate-synthétase
(ou 2,5 AS),à des méthodes de détection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de
l'interféron circulant ou présent dans les tissus après
administration de l'interféron ou après administration d'inducteurs de l'interféron (tels que Poly(A) . Poly(U),
Poly(I). Poly(C) ou dsAZI, et à un kit prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre desdits procédé de dosage et méthodes de détection et de dosage.
procédé de dosage de la 2',5'-oligo-adénylate-synthétase
(ou 2,5 AS),à des méthodes de détection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de
l'interféron circulant ou présent dans les tissus après
administration de l'interféron ou après administration d'inducteurs de l'interféron (tels que Poly(A) . Poly(U),
Poly(I). Poly(C) ou dsAZI, et à un kit prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre desdits procédé de dosage et méthodes de détection et de dosage.
Ii a été monté Zcf. I.M. KERR & R.E. BROWN, Proc NATL ACAD. SCI. USA, vol. 75, n 1, p. 256-260,
Janvier 19787 qu'il se forme un inhibiteur de bas poids moléculaire de la synthèse des protéines acellulaires, par incubation d'extraits cytoplasmiques de cellules de souris traitées à l'interféron, avec de L'ARN à deux brins et de 1'ATP et que cet inhibiteur peut être synthétisé par incubation d'une fraction enzymatique de ces cellules de souris fixée à du Poly (I).Poly(C)Sépharose avec de 1'ATP marqué tel que Z - H]-ATP ou La- ou y 32P?-ATP.
Janvier 19787 qu'il se forme un inhibiteur de bas poids moléculaire de la synthèse des protéines acellulaires, par incubation d'extraits cytoplasmiques de cellules de souris traitées à l'interféron, avec de L'ARN à deux brins et de 1'ATP et que cet inhibiteur peut être synthétisé par incubation d'une fraction enzymatique de ces cellules de souris fixée à du Poly (I).Poly(C)Sépharose avec de 1'ATP marqué tel que Z - H]-ATP ou La- ou y 32P?-ATP.
Cet inhibiteur présente la structure suivante pppA2'p5'A2'p5'A.
I1 a également été montré Lcf. M.A. MINKS, S.
BENVIN, P.A. MARONEY et C. BAGLIONI, J. of Biol. Chemistry, Vol. 254, n 12, 23 Juin 1979, p. 5058-5064? que l'activation de la 2,5 AS peut être obtenue par addition d'ARN à double brin ou de Poly(I).Poly(C), pour polymériser 1'ATP et obtenir la synthèse d'un2t,5'-olio,onucleQtide, à savoir la pprA (2'p5lA)n ou 2,5 A,le taux de synthèse de la 2,5 A étant proportionnel à la concentration de 1'ATP et étant augmenté dans les cellules traitées à l'interféron ; ces Auteurs ont établi que la mesure de la synthèse de 2,5 Apar la technique qu'ils décrivent montre que la quantité de 2,SAformée est proportionnelle à la quantité d'interéron utilisée pour traiter les cellules ; l'augmentation de l'activité 2,5AS qui est à l'origine de l'augmentation du taux de synthèse de la 2,5A serait en relation étroite avec l'établissement de l'état antiviral dans les cellules traitées à l'interféron. J. JUSTESEN, D. FERBUS et M.N. THANE (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, vol. 77, nO 8, p. 4618-4622, AOUT 1980) ont montré que la 2,5AS catalyse la formation "de novo" d'oligonucléotides de formule pppA2'(p5'A)n, par polymérisation de 1'ATP, mais que cette enzyme n'est pas seulement une ATP-polymérase, mais est capable d'incorporer une unité d'autres nucléosides-triphosphates (NTP), à savoir tous les ribo- et désoxyribo-nucléosides-triphosphates usuels, pour former des co-oligonucléotides contenant des résidus AMP, à condition, toutefois, que cette incorporation d'un nucléotide autre que 1'ATP ait lieu en présence d'ATP ou d'une molécule amorçant la polymérisation, telle qu'une 2',51pppA(pA)n. Toutefois, elle ne peut catalyser l'adddition que d'une seule unité en bout de channe lorsqu'il s'agit d'un nucléotide autre que 1'AMP. Dans les conditions physiologiques, l'enzyme est donc spécifique de 1'ATP. Par ailleurs, dans
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 8, nQ 14, 198, p. 3073-3085, les mêmes Auteurs ont décrit une méthode directe de séparation du substrat (ATP) et des produits de synthèse résultant de la polymérisation de 1'ATP par la 2,5 A, 2',5'-pppA(pA) r où n > , 1, ainsi que la séparation de 2',5'oligonucléotides contenant des résidus AMP et d'autres comportant un autre nucléotide à l'extrémité 2'.La séparation directe des 2',5'-pppA(pA)n du substrat ATP est réalisée par chromatographie sur plaque en couche mince de PEI-cellulose spécialement préparée en laboratoire, en utilisant comme système solvant de développement, un mélange de Tris-HCl 2M, pu8,6. La séparation des 2',5' co-oligonucléotides formés par incubation de la 2,5 AS avec de 1' ATP et un NTP ou avec un mélange de 2,5 A et de NTP est réalisée par chromatographie en utilisant comme système solvant de développement, soit le mélange Tris HC1 2M, pH 8,6 ci-dessus, soit de l'acide acétique et du LiCl, soit du LiCl et de l'acide borique.
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 8, nQ 14, 198, p. 3073-3085, les mêmes Auteurs ont décrit une méthode directe de séparation du substrat (ATP) et des produits de synthèse résultant de la polymérisation de 1'ATP par la 2,5 A, 2',5'-pppA(pA) r où n > , 1, ainsi que la séparation de 2',5'oligonucléotides contenant des résidus AMP et d'autres comportant un autre nucléotide à l'extrémité 2'.La séparation directe des 2',5'-pppA(pA)n du substrat ATP est réalisée par chromatographie sur plaque en couche mince de PEI-cellulose spécialement préparée en laboratoire, en utilisant comme système solvant de développement, un mélange de Tris-HCl 2M, pu8,6. La séparation des 2',5' co-oligonucléotides formés par incubation de la 2,5 AS avec de 1' ATP et un NTP ou avec un mélange de 2,5 A et de NTP est réalisée par chromatographie en utilisant comme système solvant de développement, soit le mélange Tris HC1 2M, pH 8,6 ci-dessus, soit de l'acide acétique et du LiCl, soit du LiCl et de l'acide borique.
Toutefois, s'il est clair. que la 2,5 AS incubée avec de 1'ATP forme des 2,5 A en présence d'un activateur physiologique tel que l'ARN viral ou en présence d'un activateur synthétique tel que le Poly(I). Poîy(C), par exemple, et que la méthode de dosage de la 2,5 AS (proportionnelle, comme indiqué plus haut, à la quantité d'interféron produite naturellement par certaines lignées cellulaires ou utilisée pour traiter des cellules), pourrait consister à mettre en présence un ATP marqué introduit dans un milieu d'incubation brut approprié et à mesurer la quantité de 2,5 A produite, néanmoins cette méthode présente certains inconvénients qui rendent sa mise en oeuvre difficile, et qui sont, en particulier, les suivants
a) dans ce milieu brut, il existe des phosphatases qui interfèrent avec la production de 2,5 A en détruisant 1'ATP. En conséquence, pour avoir une mesure précise de la 2,5 AS dans un tel milieu brut, il faudrait mettre un excès d'ATP marqué, ce qui est onéreux, et ne peut donc conduire à une méthode commerciale.
a) dans ce milieu brut, il existe des phosphatases qui interfèrent avec la production de 2,5 A en détruisant 1'ATP. En conséquence, pour avoir une mesure précise de la 2,5 AS dans un tel milieu brut, il faudrait mettre un excès d'ATP marqué, ce qui est onéreux, et ne peut donc conduire à une méthode commerciale.
Il-faut noter en effet, que la vitesse de dégradation de 1'ATP par la phosphatase est plus rapide que la vitesse de synthèse des 2,5 A.
b) Cette méthode oblige, de plus, après incubation, à séparer 1'ATP marqué du 2,5 A marqué. or, il n'existe pas dans le commerce de support de chromatographie en couche mince (CCM) qui soit adapté, la différence de migration de 1'ATP et du 2,5 A formé étant très faible.
Il s'est, par suite, avéré souhaitable de rechercher des substrats, éventuellement non physiologiques, contrairement à 1'ATP, qui ne soient pas susceptibles d'être attaqués par les phosphatases éventuellement présentes dans le milieu d'incubation brut du substrat avec la 2,5 AS. L.A. BALL et C.N. WHITE Z"Regulation of Macromolecular synthesis by low molecular weight mediators" (1979), Ed. KOCH et RICHTER (Academic Press, New York), p. 303-317/ ont mis en évidence que le nicotinamideadénine-nucléotide (NAD ) agit en tant qu'accepteur pour réaliser la 2'-adénylation par l'enzyme isolée de cellules de poulets traitées par de l'interféron.
La présente invention s'est donné pour but de pourvoir à une méthode de dosage de la 2,5 AS qui élimine la nécessité de l'utilisation de 1'ATP comme substrat et, par suite, les inconvénients liés à ce substrat physiologique qui réduisent considérablement la fiabilité du dosage et qui permet, par voie de conséquence, de contrôler avec précision et sans risque de réactions parasitaires, la détection d'une infection virale ou microbienne et le dosage de la concentration de l'interféron circulant ou présent dans les tissus après administration de l'interféron ou après administration d'inducteurs de l'interféron tels que Poly(A). poly(U) ou
Poly(I). Poly(C).
Poly(I). Poly(C).
La présente invention a pour objet un système substrat apte à former en présence de 2,5 AS dans un milieu d'incbation approprié des 2,5 A directement dosables,en quantité prqretiouxffle à l'acti- vité enzymatique de la 2,5 AS,lequel système substrat est caractérisé en ce qu'il est constitué par un accepteur de 2'énylation pris dans le groupe qui comprend le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD+)et les 3',5'-oligonucléotldes ,ainsi que des polynucléotides du type du tXRN et par un donneur de nucléosidetnophosphate (NMP)constitué par un nucléoside-tripbosphate autre que 1 'ATP.
Pour simplifier, l'accepteur de 2'adénylation sera désigné dans ce qui va suivre sous le nom de RpA.
Conformément à l'invention, le nucléoside-triphosphate est pris dans le groupe qui comprend les riboet les désoxyribo-nucléosides-triphosphates.
La présente invention a également pour objet un procédé de dosage de l'activité enzymatique de la 2,5 AS dans un extrait brut de cellules sanguines et notamment de leucocytes, caractérisé par la mesure de la quantité de RpA-NMP formée par incubation de RpA et de NTP dans ledit extrait, en présence de la 2,5 AS et d'un activateur de cette dernière pris, de préférence, dans le groupe qui comprend le Poly(I), Poly(C) et le dsARN, laquelle mesure est effectuée par séparation du
RpA-NMP, du RpA par chromatographie en couche mince (CCM) dans un système solvant approprié, le RpA-NMP et le RpA migrant avec des Rf suffisamment distincts pour faciliter ladite séparation, permettant ainsi de déterminer la quantité de RpA-NMP formée par rapport au RpA initialement mis en oeuvre et la valeur de l'activité de l'enzyme 2,5 AS définie comme équivalant à la quantité de RpA-NMP formée, par minute et par ml d'extrait cellulaire brut.
RpA-NMP, du RpA par chromatographie en couche mince (CCM) dans un système solvant approprié, le RpA-NMP et le RpA migrant avec des Rf suffisamment distincts pour faciliter ladite séparation, permettant ainsi de déterminer la quantité de RpA-NMP formée par rapport au RpA initialement mis en oeuvre et la valeur de l'activité de l'enzyme 2,5 AS définie comme équivalant à la quantité de RpA-NMP formée, par minute et par ml d'extrait cellulaire brut.
Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé de dosage, l'extrait cellulaire brut est constitué par le surnageant recueilli après la lyse de cellules sanguines par un détergent approprié et une centrifugation à 10 000 g environ.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ce procédé de dosage, l'activateur de la 2,5 AS est constitué par du Poly(I). Poly(C) éventuellement fixé sur un support insoluble inerte tel que l'agarose par exemple.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ce procédé de dosage, le RpA mis en oeuvre est un NAD marqué radioactif, la mesure de la quantité de
NAD*-NMP formée par rapport au NAD* initialement mis en oeuvre étant alors déterminée, après migration des taches correspondant respectivement au NAD* - NMP et au
NAD*, par révélation par autoradiographie, séparation et comptage dans un compteur à scintigraphie connu en lui-même.
NAD*-NMP formée par rapport au NAD* initialement mis en oeuvre étant alors déterminée, après migration des taches correspondant respectivement au NAD* - NMP et au
NAD*, par révélation par autoradiographie, séparation et comptage dans un compteur à scintigraphie connu en lui-même.
Selon un autre rtoe de réalisation avantageux de ce procédé de dosage, le RpX mis en oeuvre est un ND non radioactif, la mesure de la quantité de NE formée par rapport au NAD initialement mis en oeuvre étant alors déterminée, après migration des taches correspondant respectivement au NAD-NMP et au NAD, par mesure optique ou fluorescente. La mesure de la quantité de NAD-NMP formez peut être également mesurée par dosage enzymatique après conversion du NADMP en NAuP, sans séparation du produit mis en oeuvre.
Conformément à un autre mode de réalisation avantageux de ce procédé de dosage, la lyse des cellules est réalisée à l'aide d'un milieu de lyse hypotonique contenant, de préférence, un produit apte à faciliter la lyse cellulaire, présent à des concentrations suffisantes pour réaliser la lyse et adéquates pour ne pas inactiver l'enzyme et ne pas lyser les noyaux des cellules, lequel produit peut être choisi parmi les détergents tels que les éthylphénylpolyéthylèneglycols connus sous les noms de
NONIDET P 40 ou NP 40 (détergent commercialisé sous cette dénomination commerciale par les Sociétés SIGMA, FLUKA et BRL)et est avantageusement en solution dans du tampon Tris pH 8, lequel contient en outre du KCl ou du NaCl, de l'acétate de magnésium et du dithiothreitol, ou en solution dans du tampon Hépès pH 7,6 contenant du
KC1, de l'acétate de magnésium, du 6-mercaptoéthanol.
NONIDET P 40 ou NP 40 (détergent commercialisé sous cette dénomination commerciale par les Sociétés SIGMA, FLUKA et BRL)et est avantageusement en solution dans du tampon Tris pH 8, lequel contient en outre du KCl ou du NaCl, de l'acétate de magnésium et du dithiothreitol, ou en solution dans du tampon Hépès pH 7,6 contenant du
KC1, de l'acétate de magnésium, du 6-mercaptoéthanol.
Selon une autre disposition avantageuse de l'invention, l'incubation de l'extrait cellulaire avec le
RpA et le NTP est réalisée dans un milieu d'incubation constitué par du tampon Tris 20mM, contenant du KC1, du MgC12, du dithiothreitol, de la sérum-albumine bovine (BSA), du glycérol et un activateur de l'enzyme tel que Poly(I). Poly(C).
RpA et le NTP est réalisée dans un milieu d'incubation constitué par du tampon Tris 20mM, contenant du KC1, du MgC12, du dithiothreitol, de la sérum-albumine bovine (BSA), du glycérol et un activateur de l'enzyme tel que Poly(I). Poly(C).
Selon encore une autre disposition avantageuse de l'invention, le système solvant est de préférence cons titué par un système acide acétique-chlorure de lithium.
La présente invention a, en outre, pour objet une méthode de dosage de la concentration de l'interféron circulant ou présent dans les tissus après administration de l'interféron ou après administration d'induc brs 1 l'interféron tels que LA) Poly(P).Poly(I).Poly(C) ou dsARN,~notamment, caracterise par le d o s a q e du R P±NMP formé par action de la 2,5 AS activée par du
Poly(I) .Poly(C) éventuellement fixé sur un support insoluble inerte approprié, sur du RpA incubé avec du NTP, en tirant parti du fait que la quantité de RpA-NMP ainsi formée par synthèse est proportionnelle à la quantité d'interféron présente dans lesdits tissus ou fluides biologiques.
Poly(I) .Poly(C) éventuellement fixé sur un support insoluble inerte approprié, sur du RpA incubé avec du NTP, en tirant parti du fait que la quantité de RpA-NMP ainsi formée par synthèse est proportionnelle à la quantité d'interféron présente dans lesdits tissus ou fluides biologiques.
Selon une disposition avantageuse de ce procédé le RpA mis en oeuvre est du NAD marqué ou non marqué.
Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé de dosage de la concentration d'interféron, ledit dosage est effectué sur un lysat contenant un nombre de cellules variant de 2x104 à 2x107 cellules/ml de tampon de lyse, ces nombres n'étant cependant pas limitatifs et pouvant encore être abaissés en fonction de la sensi bilité des cellules.
Conformément à un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit procédé de dosage de la concentration d'interféron est applicable à la détection d'infections virales et microbiennes et à la détection de l'activité antivirale induite par l'interféron.
La présente invention a également pour objet un kit prêt à l'emploi pour le dosage de la 2,5 AS, la détection d'une infection virale ou microbienne ou le dosage de la concentration de l' interféron circulant ou présent dans les tissus après administration de l'interféron ou après administration d'inducteurs de l'interféron, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend - un flacon contenant une quantité appropriée de tampon de lyse hypotonique des cellules ; - une ampoule contenant du détergent NP40 ou analogue ; - un flacon contenant une quantité appropriée de milieu d'incubation à base de tampon Tris ; - une quantité appropriée d'activateur de l'enzyme tel que Poly(I).Poly(C) ou dsARN, fixé sur un support insoluble inerte approprié, destiné à fixer l'enzyme ; - une quantité appropriée de RpA - une quantité appropriée de RpA* marqué radioactif ; - une quantité appropriée de NTP ; - une quantité appropriée de Poly(I) . Poly(C) ou d'un activateur d'enzyme analogue - une ou plusieurs plaques de chromatographie en couche mince (CCM) ; - un flacon contenant une quantité appropriée de solvant acide acétique de développement du
RpA sur une plaque de CCM ; - un flacon contenant une quantité appropriée de solvant chlorure de lithium de développement du RpA-NMP sur une plaque de CCN ; - éventuellement des agents révélateurs tels qu'un révélateur coloré, notamment du bleu de toluidine ou de l'hypo- chlorite de sodium, des films sensibles aux rayons X ou une lampe à rayonnement ultra-violet.
RpA sur une plaque de CCM ; - un flacon contenant une quantité appropriée de solvant chlorure de lithium de développement du RpA-NMP sur une plaque de CCN ; - éventuellement des agents révélateurs tels qu'un révélateur coloré, notamment du bleu de toluidine ou de l'hypo- chlorite de sodium, des films sensibles aux rayons X ou une lampe à rayonnement ultra-violet.
Pour la mise en oeuvre des différentes modalités de la présente invention, l'on procède comme suit
la 2,5 AS catalyse l'addition d'une unité de NMP à un accepteur RpA pour former des dérivés RpA 2'p5'N.
la 2,5 AS catalyse l'addition d'une unité de NMP à un accepteur RpA pour former des dérivés RpA 2'p5'N.
Conformément à l'invention, le nicotinamide-adenine-di- nucléotide (NAD+) constitue un tel accepteur et contribue à la formation de l'oligo nucléotide NAD-NMP, en acceptant divers NMP provenant de NTP autres que l'ATP,qui jouent le rle de donneurs de NMP.
Le Tableau I ci-après compare les vitesses de formation de produits de condensation NAD-NMP, qui sont calculées à partir des vitesses initiales d'incorporation de nucléotides dans les incubations représentées à la figure 1 annexée.
TABLEAU I
Comparaison des vitesses de formation de produits de
condensation NAD-NMP
Comparaison des vitesses de formation de produits de
condensation NAD-NMP
<tb> <SEP> SUBSTRAT <SEP> nanomoles <SEP> incorporées
<tb> 1 <SEP> mM <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> /min/mg <SEP> protéine
<tb> <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> S <SEP> ~ <SEP>
<tb> NAD <SEP> ATP <SEP> 54,1
<tb> NAD+ <SEP> GTP <SEP> 27,7
<tb> NAD+ <SEP> UTP <SEP> 56,1
<tb> NAD <SEP> dATP <SEP> 47,0
<tb> NAD+ <SEP> CTP <SEP> 51,6
<tb> référence <SEP> : <SEP> formation
<tb> d'oligoadênylate <SEP> à <SEP> par- <SEP> 137,5
<tb> tir <SEP> d'ATP <SEP> seul
<tb> A Le déroulement du dosage a lieu comme suit 1.Lyse de cellules
Des cellules sont lysées à l'aide d'un milieu de lyse contenant un détergent tel que NP40, qui présente avantageusement l'une des compositions a) ou b) ci-après
a) Tampon Hépès 10 mMolaire pH 7,6
KC1 10
Acétate de Mg 2
ss-mercaptoéthanol 7 "
auquel est ajouté du
détergent NP40 0,1-0,5 % en volume
ou
B) Tampon Tris 20 mMolaire pH 8
KC1 ou NaCl 20
Acétate de Mg 1
Dithiothreitol 1
auquel est ajouté du
NP40 0,1-0,5 % en volume
Le lysat est centrifugé à 10 000 g.
<tb> 1 <SEP> mM <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> /min/mg <SEP> protéine
<tb> <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> S <SEP> ~ <SEP>
<tb> NAD <SEP> ATP <SEP> 54,1
<tb> NAD+ <SEP> GTP <SEP> 27,7
<tb> NAD+ <SEP> UTP <SEP> 56,1
<tb> NAD <SEP> dATP <SEP> 47,0
<tb> NAD+ <SEP> CTP <SEP> 51,6
<tb> référence <SEP> : <SEP> formation
<tb> d'oligoadênylate <SEP> à <SEP> par- <SEP> 137,5
<tb> tir <SEP> d'ATP <SEP> seul
<tb> A Le déroulement du dosage a lieu comme suit 1.Lyse de cellules
Des cellules sont lysées à l'aide d'un milieu de lyse contenant un détergent tel que NP40, qui présente avantageusement l'une des compositions a) ou b) ci-après
a) Tampon Hépès 10 mMolaire pH 7,6
KC1 10
Acétate de Mg 2
ss-mercaptoéthanol 7 "
auquel est ajouté du
détergent NP40 0,1-0,5 % en volume
ou
B) Tampon Tris 20 mMolaire pH 8
KC1 ou NaCl 20
Acétate de Mg 1
Dithiothreitol 1
auquel est ajouté du
NP40 0,1-0,5 % en volume
Le lysat est centrifugé à 10 000 g.
2. Incubation
Le surnageant est recueilli, additionné de NAD* marqué radioactif (0,6 microcurie) d'une mmole de NTP et d'une mmole de NAD, ainsi que de 15 microlitres de Poly(I).POly(C) fixé sur agarose, et introduit dans le milieu d'incubation suivant
sérum-albumine bovine (BSA) 0,5 mg/ml
( Tampon Tris pH 8 20 mMolaire
(2) ( KCl 20
( MgC12 20
( Dithiothreitol (DTT) 1
Glycérol 10 % en volume
+ Poly(I).Poly(C) 0,025 mg/ml
La 2,5 AS a une affinité par le Poly(I).Poly(C) fixé sur agarose sur lequel elle vient se fixer.
Le surnageant est recueilli, additionné de NAD* marqué radioactif (0,6 microcurie) d'une mmole de NTP et d'une mmole de NAD, ainsi que de 15 microlitres de Poly(I).POly(C) fixé sur agarose, et introduit dans le milieu d'incubation suivant
sérum-albumine bovine (BSA) 0,5 mg/ml
( Tampon Tris pH 8 20 mMolaire
(2) ( KCl 20
( MgC12 20
( Dithiothreitol (DTT) 1
Glycérol 10 % en volume
+ Poly(I).Poly(C) 0,025 mg/ml
La 2,5 AS a une affinité par le Poly(I).Poly(C) fixé sur agarose sur lequel elle vient se fixer.
On incube à 37"C pendant 2 heures.
Puis on centrifuge à 2000 g
On récupère le surnageant qui contient le produit de condensation marqué NAD*-NMP, dans le mélange réactionnel, tandis que le culot contient l'enzyme 2,5 AS qui s'est fixée sur le support Poly(I).Poly(C)/agarose.
On récupère le surnageant qui contient le produit de condensation marqué NAD*-NMP, dans le mélange réactionnel, tandis que le culot contient l'enzyme 2,5 AS qui s'est fixée sur le support Poly(I).Poly(C)/agarose.
On lave le gel qui a fixé l'enzyme à l'aide du tampon Tris (2) ci-dessus et on réunit le tampon de lavage au produit de condensation.
En variante, l'incubation peut être effectuée sans addition de Poly(I).Poly(C) fixé sur un support solide,mais à une concentration de Poly(I).PDly(C) (sans support solide) canprise entre 0,1 et 0,2 mgAfll.
3. Separation du NAD*-NMP du NAD*
Cette séparation est effectuée sur des plaques de chromatographie en couche mince (CCM) dont le support actif est, de préférence, en polyéthylène-imine (PEI). On prélève d u s u r n a g e a n t qu'on dépose sur la plaque et on effectue le développement à l'aide d'un système solvant de développement comprenant de l'acide acétique 1M pour le développement du NAD* et du chlorure de lithium 0,3M pour le développement du NAD*-NMP ; dans ce but, la plaque est placée successivement dans deux cuves contenant chacune l'un des deux solvants ci-dessus ; le NAD* migre avec un Rf de 0,6 tandis que le NAD*-NMP migre avec un Rf compris entre 0,18 et 0,25, selon la nature du NTP utilisé.
Cette séparation est effectuée sur des plaques de chromatographie en couche mince (CCM) dont le support actif est, de préférence, en polyéthylène-imine (PEI). On prélève d u s u r n a g e a n t qu'on dépose sur la plaque et on effectue le développement à l'aide d'un système solvant de développement comprenant de l'acide acétique 1M pour le développement du NAD* et du chlorure de lithium 0,3M pour le développement du NAD*-NMP ; dans ce but, la plaque est placée successivement dans deux cuves contenant chacune l'un des deux solvants ci-dessus ; le NAD* migre avec un Rf de 0,6 tandis que le NAD*-NMP migre avec un Rf compris entre 0,18 et 0,25, selon la nature du NTP utilisé.
4. Comptage
Les taches correspondantes développées sur la plaque, sont révélées par autoradiographie, puis séparées et les comptages sont effectués dans un compteur à scintigraphie classique.
Les taches correspondantes développées sur la plaque, sont révélées par autoradiographie, puis séparées et les comptages sont effectués dans un compteur à scintigraphie classique.
On détermine ainsi la quantité de NAD*-NMP formée par rapport au NAD* initialement mis en oeuvre, l'activité de l'enz: étant déterminée comme étant équivalente à la quantité de NAD*-NMP formée par minute et par ml d'extrait.
L'efficacité du procédé de dosage de l'activité enzymatique de la 2,5 AS a été testée sur de nombreux types de cellules.
La proportionnalité entre la quantité d'interféron présente et la quantité d'enzyme 2,5 AS formée a pu être établie.
Les courbes représentées à la figure 2 annexée établissent la proportionnalité entre la quantité d'enzyme 2,5 AS formée et la quantité d'interféron introduite dans le milieu cellulaire, pour les lignées cellulaires F 7000 et WISH connues pour leur sensibilité à l'interféron et généralement utilisées pour le dosage de l'interféron.
La figure 3 montre des courbes de mesure de la quantité de produits de condensation NAD-NMP obtenus à partir de divers NTP, par synthèse à l'aide de 2,5 AS de réticulocytes de lapins, en procédant comme suit
Pour chaque incubation, on a ajouté 100 p1 d'un extrait de réticulocytes de lapins à 15 l de Poly(I).Poly(C)/agarose. Au bout de 15 minutes d'incubation à la température ambiante, on a lavé l'agarose à deux reprises au tampon (2).On a ajouté au culot d'agarose sur lequel était fixée la 2,5 AS, 5 ul d'un mélange de : 0,5 mg/ml de BSA, 0,025 mg/ml de
Poly(I).Poly(C) et 5 p1 de nucléotides dans du tampon (2) pour obtenir - courbe a : NAD-GTP - courbe b : NAD-ATP - courbe c : NAD-dATP - courbe d : NAD-(ATP)n - courbe e : NAD-CTP - courbe f : NAD-UTP suivant les valeurs ci-après
lmM Activité
spécifigue(1)
NAD + ATP 54,1 39
GTP 57,7 20
UTP 56,1 41
dATP 47,0 34
CTP 5-1,6 38
Témoin ATP+ATP 137,5 100 (1) Activité spécifique : nanomoles/min/mg protéine
L'incubation a été effectuée à 370C et aux temps indiqués, on a prélevé 1 iii et on l'a déposé sur une plaque en PEI-cellulose qui a été développée
al dans un système Tris 2M
et b) dans un système acide acetique/LiCl.
Pour chaque incubation, on a ajouté 100 p1 d'un extrait de réticulocytes de lapins à 15 l de Poly(I).Poly(C)/agarose. Au bout de 15 minutes d'incubation à la température ambiante, on a lavé l'agarose à deux reprises au tampon (2).On a ajouté au culot d'agarose sur lequel était fixée la 2,5 AS, 5 ul d'un mélange de : 0,5 mg/ml de BSA, 0,025 mg/ml de
Poly(I).Poly(C) et 5 p1 de nucléotides dans du tampon (2) pour obtenir - courbe a : NAD-GTP - courbe b : NAD-ATP - courbe c : NAD-dATP - courbe d : NAD-(ATP)n - courbe e : NAD-CTP - courbe f : NAD-UTP suivant les valeurs ci-après
lmM Activité
spécifigue(1)
NAD + ATP 54,1 39
GTP 57,7 20
UTP 56,1 41
dATP 47,0 34
CTP 5-1,6 38
Témoin ATP+ATP 137,5 100 (1) Activité spécifique : nanomoles/min/mg protéine
L'incubation a été effectuée à 370C et aux temps indiqués, on a prélevé 1 iii et on l'a déposé sur une plaque en PEI-cellulose qui a été développée
al dans un système Tris 2M
et b) dans un système acide acetique/LiCl.
La figure 1 annexée à laquelle il a été fait référence plus haut, montre un chromatogramme obtenu par développement par un système acide acétique/LiCI, d'une plaque de PEI-cellulose sur laquelle ont été déposés, à 1 heure et à 3 heures, 5 iii d'un mélange d'incubation résultant de l1incubation d'une 2,5 AS de réticulocytes dans un milieu standard, avec 1 mM de NAD+ et 1 mM de
NTP radioactif (40 l) : ( H)ATP,(14C)GTP,(3H)UTP, (3H)2'dATP et (3H)CTP.
NTP radioactif (40 l) : ( H)ATP,(14C)GTP,(3H)UTP, (3H)2'dATP et (3H)CTP.
On a pu vérifier que toutes les réactions décrites ci-dessus sont catalysées par la 2,5 AS isolée de cellules de souris, de poulets, de lapins, et également de toutes sortes de cellules humaines en culture telles que les cultures de lymphocytes et de fibroblastes.
Le kit prêt à l'emploi conforme à l'invention peut contenir les milieux tampons soit à leurs dilutions prêtes à ltemploi, soit en solutions concentrées qui sont di luées au fur et à mesure des besoins, soit encore à l'état lyophilisé.
De plus, tout milieu tampon ou système solvant équivalent à ceux décrits dans ce qui précède, peut être substitué à ces derniers.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'etre drits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la presente invention.
Claims (2)
1- Système substrat apte à former en présence de
2 - Système substrat selon la Revendication 1, caractérisé en ce que le nucléoside-triphosphate est pris dans le groupe qui comprend les ribo- et les désoxyribo-nucléosides-triphosphates.
(CCM) dans un système solvant approprié, le RpA-NMP et le RpA migrant avec des Rf suffisamment distincts pour faciliter ladite séparation, permettant ainsi de déterminer la quantité de RpA-NMP formée par rapport au RpA initialement mis en oeuvre et la valeur de l'activité de l'enzyme 2,5 AS définie comme équivalant à la quantité de RpA-NMP formée par minute et par ml d'extrait cellulaire brut.
RpA-NMP, du RpA par chromatographie en couche mince
30- Procédé de dosage de l'activité enzymatique de la 2,5 AS dans un extrait brut de cellules sanguines et notamment de leucocytes, caractérisé par la mesure de la quantité de RpA-NMP formée par incubation d'un système substrat selon la Revendication 1 ou la Revendication 2 dans ledit extrait, en présence de la 2,5 AS -et d'un activateur de cette dernière pris, de préférence, dans le groupe qui comprend le Poly(I) .Poly(C) et le dsARN, laquelle mesure est effectuée par séparation du
40- Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que l'extrait cellulaire brut est constitué par le surnageant recueilli après la lyse de cellules sanguines par un détergent approprié et une centrifugation à 10 000 g environ.
5 - Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que l'activateur de la 2,5 AS est constitué par du Poly(I). Poly(C) ou un dsARN,éventuellement fixé sur un support insoluble inerte.
6 - Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que le RpA mis en oeuvre est un NAD marqué radioactif, la mesure de la quantité de NAD*-NMP formée par rapport au NAD* initialement mis en oeuvre étant alors déterminée, après migration des taches correspondant respectivement au NAD*-NMP et au NAD*, par révélation par autoradiographie, séparation et comptage dans un compteur à scintigraphie.
7 - Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que le RpA mis en oeuvre est un NAD non radioactif, la mesure de la quantité de NAD-NMP formée par rapport au NAD initialement mis en oeuvre étant alors déterminée, après migration des taches correspondant respectivement au NAD-NMP et au NAD, par mesure optique ou fluorescente.
8 - Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que le RpA mis en oeuvre est un NAD non radioactif, la mesure de la quantité de NAD-NMP formée par rapport au NAD initialement mis en oeuvre étant alors déter- mince par dosage enzymatique après conversion au iSYD-NMP en NADP sans séparation du produit mis en oeuvre.
9 - Procédé de dosage selon la Revendication 4, caractérisé en ce que la lyse des cellules est réalisée à l'aide d'un milieu de lyse hypotonique contenant un produit apte a faciliter la lyse cellulaire, présent à des concentrations suffisantes pour réaliser la lyse et adéquates pour ne pas inactiver l'enzyme et ne pas lyser les noyaux des cellules lequel produit est avantageusement en solution dans du tampon Tris pH 8, lequel contient en outre du KC1 ou du Nazi, de l'acétate de magnésium et du dithiothreitol.
KC1, du MgC12, du dithiothreitol, de la sérum-albumine bovine (BSA), du glycérol, et un activateur de l'enzyme tel que Poly(I). Poly(C).
11 - Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que l'incubation de l'extrait cellulaire avec le NAD et le NTP est réalisée dans un milieu d'incubation constitué par du tampon Tris 20mM, contenant du
10 - Procédé de dosage selon la Revendication 4, caractérisé en ce que la lyse des cellules est réalisée à l'aide d'un milieu de lyse hypotonique contenant un produit apte à faciliter la lyse cellulaire, présent à des concentrations suffisantes pour réaliser la lyse et adéquates pour ne pas inactiver l'enzyme et ne pas lyser les noyaux deys cellules, lequel produit est avantageusement en solution dans du tampon Hépès pH 7,6 contenant du KC1, de l'acétate de magnésium et du 8-mercaptoéthanol,
120- Procédé de dosage selon la Revendication 3, caractérisé en ce que le système solvant est de préférence constitué par un système acide acétique-chlorure de lithium.
Poly(I) .Poly(C) ou dsARN, notamment,caractérisé par le dosage du RpA-NMP formé par action de la 2,5 AS activée par du Poly(I) .Poly(C) éventuellement fixé sur un support insoluble inerte approprié, sur du RpA incubé avec du NTP, selon la Revendication 3, en tirant parti du fait que la quantité de RpA-NMP ainsi formée par synthèse est proportionnelle à la quantité d'interféron présente dans lesdits tissus ou fluides biologiques.
130- Méthode de dosage de la concentration de l'interféron circulant ou présent dans les tissus après administration de l'interféron ou après administration d'inducteurs de l'interféron tels que Poly(A). Poly(U)
14 - Méthode de dosage selon la Revendication 13, caractérisé en ce que le RpA mis en oeuvre est du NAD marqué ou non marqué.
15 - Méthode de dosage selon la Revendication 13 ou selon la Revendication 14, caractérisé en ce que ledit dosage est effectué sur un lysat contenant un nombre de cellules pouvant varier de 2x104 à 2x107 cellules/ml de tampon de lyse et éventuellement moins en fonction de la sensibilité des cellules.
16 - Application de la méthode de dosage de la concentration de l'interféron, selon l'une quelconque des Revendications 13 à 15 à la détection d'infections virales et microbiennes.
17 - Application de la méthode de dosage de la concentration de l'interféron selon l'une quelconque des Revendications 13 à 15 à la détection de l'activité antivirale induite par l'interféron.
X ou une lampe a rayonnement ultra-violet.
CCM ; - éventuellement des agents révélateurs tels qu'un révélateur coloré, notamment du bleu de toluidine ou de l'hypochlorite de sodium, des films sensibles aux rayons
180- Kit prêt à l'emploi pour le dosage de la 2,5 AS, la détection d'une infection virale ou microbienne ou le dosage de la concentration de l'interféron circulant ou présent dans les tissus après administration de l'interféron ou après administration d'inducteurs de l'interféron, lequel kit est caractérisé en ce qu'il comprend : - un flacon contenant une quantité appropriée d'un tampon de lyse hypotonique des cellules ; - une ampoule contenant du détergent NP40 ou analogue ; - un flacon contenant une quantité appropriée de milieu d'incubation à base de tampon Tris ; - une quantité appropriée d'un activateur d'enzyme tel que Poly(I) .Poly(C) ou dsARN, fixé sur un support insoluble inerte approprié destiné a fixer l'enzyme ; - une quantité appropriée de RpA 2 - une quantité appropriée de RpA* marqué radioactif ; - une quantité appropriée de NTP ; - une quantité appropriée de Poly(I) . Poly(C) ou d'un activateur d'enzyme analogue ; - une ou plusieurs plaques de chromatographie en couche mince (CCM) ; - un flacon contenant une quantité appropriée de solvant acide acétique de déve loppement du RpA sur une plaque de CCM ; - un flacon contenant une quantité appropriée de solvant chlorure de lithium de développement du RpA-NMP sur une plaque de
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8109489A FR2505845A1 (fr) | 1981-05-13 | 1981-05-13 | Procede de dosage de la 2',5'-oligo-adenylate-synthetase, methodes de detection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de l'interferon circulant ou present dans des tissus, apres administration de l'interferon, ou apres administration d'inducteurs de l'interferon et ensemble pret a l'emploi, ou kit, pour la mise en oeuvre desdits procedes de dosage et methodes de detection et de dosage |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8109489A FR2505845A1 (fr) | 1981-05-13 | 1981-05-13 | Procede de dosage de la 2',5'-oligo-adenylate-synthetase, methodes de detection d'une infection virale ou microbienne, de dosage de la concentration de l'interferon circulant ou present dans des tissus, apres administration de l'interferon, ou apres administration d'inducteurs de l'interferon et ensemble pret a l'emploi, ou kit, pour la mise en oeuvre desdits procedes de dosage et methodes de detection et de dosage |
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| FR2505845A1 true FR2505845A1 (fr) | 1982-11-19 |
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| FR (1) | FR2505845A1 (fr) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2552879A1 (fr) * | 1983-10-03 | 1985-04-05 | Pasteur Institut | Procede et reactifs pour la detection d'une anomalie genetique dans une matiere biologique, notamment dans une preparation de leucocytes |
| EP0325018A2 (fr) * | 1987-12-23 | 1989-07-26 | Hem Pharmaceuticals Corp. | RNase L inhibiteur comme marqueur pour des infections virales |
| EP0710839A2 (fr) * | 1994-11-01 | 1996-05-08 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Méthode pour la mesure de l'activité d'interféron |
| WO2019195240A1 (fr) * | 2018-04-02 | 2019-10-10 | The Johns Hopkins University | Procédés et utilisations du marquage enzymatique de molécules contenant de l'adp-ribose |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2048472A (en) * | 1979-04-22 | 1980-12-10 | Yeda Res & Dev | Assay of interferons and kits therefor |
-
1981
- 1981-05-13 FR FR8109489A patent/FR2505845A1/fr not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2048472A (en) * | 1979-04-22 | 1980-12-10 | Yeda Res & Dev | Assay of interferons and kits therefor |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CA1980 * |
| CA1981 * |
| EXBK/79 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2552879A1 (fr) * | 1983-10-03 | 1985-04-05 | Pasteur Institut | Procede et reactifs pour la detection d'une anomalie genetique dans une matiere biologique, notamment dans une preparation de leucocytes |
| EP0140764A1 (fr) * | 1983-10-03 | 1985-05-08 | Institut Pasteur | Procédé et réactifs pour la détection d'un acide nucléique normalement monocaténaire, notamment d'un ARN, dans une matière biologique, notamment dans une préparation de leucocytes |
| EP0325018A2 (fr) * | 1987-12-23 | 1989-07-26 | Hem Pharmaceuticals Corp. | RNase L inhibiteur comme marqueur pour des infections virales |
| EP0325018A3 (fr) * | 1987-12-23 | 1990-01-17 | Hem Pharmaceuticals Corp. | RNase L inhibiteur comme marqueur pour des infections virales |
| EP0710839A2 (fr) * | 1994-11-01 | 1996-05-08 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Méthode pour la mesure de l'activité d'interféron |
| EP0710839A3 (fr) * | 1994-11-01 | 1996-07-17 | Sumitomo Pharma | Méthode pour la mesure de l'activité d'interféron |
| US5766864A (en) * | 1994-11-01 | 1998-06-16 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. | Method of measuring interferon acitivity |
| WO2019195240A1 (fr) * | 2018-04-02 | 2019-10-10 | The Johns Hopkins University | Procédés et utilisations du marquage enzymatique de molécules contenant de l'adp-ribose |
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