FR2649205A1 - Procede et composition pour detecter l'energie electromagnetique liberee par decomposition de composes chimioluminescents - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé perfectionné en milieu aqueux dans lequel de l'énergie électromagnétique libérée par décomposition d'un composé chimique chimioluminescent est détectée en vue de déterminer la présence, la concentration ou la structure d'un analyte. Le perfectionnement consiste à mettre le procédé en oeuvre en présence d'une quantité d'une substance hydrosoluble suffisante pour activer l'intensité de l'énergie détectable libérée comparativement à l'intensité de l'énergie détectable libérée en l'absence de la substance activatrice. L'invention concerne également une composition aqueuse contenant un composé chimique chimioluminescent pouvant être utilisée dans ce procédé. Applications : analyse qualitative ou quantitative de substances chimiques ou biologiques dans des immuno-essais, des épreuves par sondes d'acides nucléiques et des méthodes utilisant des sondes chimiques/physiques pour l'étude des microstructures de macromolécules.

Description

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La présente invention concerne des perfection-

nements apportés aux possibilités de détection de l'énergie électromagnétique, y compris celle qui peut être détectée par des moyens optiques, libérée par la décomposition de composés chimiques chimioluminescents dans des milieux aqueux. L'invention a plus particulièrement pour objectif de favoriser la détection de l'énergie électromagnétique libérée par la décomposition de composés chimioluminescents utilisés pour déterminer la présence, la concentration ou la structure d'une substance dans un échantillon aqueux, en particulier lorsque ces composés chimioluminescents sont

utilisés pour détecter la présence ou détecter la con-

centration de substances chimiques ou biologiques par des techniques d'imm no-essais, des épreuves chimiques ou des épreuves utilisant des sondes d'acide nucléique, ou lorsqu'on les utilise comme sondes chimiques/physiques directes pour l'étude des structures moléculaires ou de microstructures de diverses macromolécules: polymères synthétiques, protéines, acides nucléiques, etc. La décomposition de composées chimiques

chimioluminescents afin de libérer de l'énergie électro-

magnétique, pouvant être détectés notamment par des moyens optiques habituellement une luminescence sous forme de

lumière visible - est un procédé bien connu et expliqué.

L'incorporation de tels corps réactionnels émettant de la lumière dans des immuno-essais, des épreuves chimiques, des épreuves utilisant des sondes d'acide nucléique et des techniques utilisant des sondes chimiques/physiques, admises dans la pratique en tant que moyens par lesquels l'analyte, substance dont la présence, la quantité ou la structure est en cours de détermination, est réellement identifiée ou est dosée quantitativement, a pris une importance croissante au cours des dernières années, en particulier avec l'avènement des 1,2-dioxétanes clivables par voie enzymatique; voir, par. exemple, la demande de

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brevet des Etats-Unis d'Amérique simultanément pendante NO 889 523 au nom de Bronstein, intitulée "Method of

Detecting a Substance Using Enzymatically-Induced Decom-

position of Dioxetanes", déposée le 24 Juillet 1986; la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 140 035 au nom de Bronstein et collaborateurs, intitulée "Dioxetanes for Use in Assays", déposée le 31 Décembre 1987, et la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique NI 140 197 au nom de Edwards, intitulée "Synthesis of 1,2-Dioxetanes and

Intermediates Therefor" déposée le 31 Décembre 1987.

Des réactions qui produisent une chimio-

luminescence illustrent encore un autre cas dans lequel le milieu, quoique non le message, peut déterminer l'intensité du message transmis. Des composés chimioluminescents qui, par décomposition dans des substances telles que des solvants organiques aprotiques polaires ou modérément polaires, par exemple le n-butanol, l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde ou le diméthylformamide, produisent des fluorophores qui, quant à eux, émettent de la lumière d'intensité convenable pour faciliter la détection et le dosage quantitatifs, produisent de la lumière d'intensité considérablement réduite lorsqu'ils sont décomposés dans un environnement protique polaire, et notamment dans des milieux aqueux. Mais attendu que tous les systèmes biologiques sont aqueux - en effet, l'homme lui-même est constitué de 97 % d'eau -, la nécessité de l'exaltation de l'intensité de la lumière produite par des marqueurs ou des substrats chimioluminescents dans des immuno-essais, des épreuves utilisant des sondes d'acide nucléique, des techniques utilisant des sondes chimiques/physiques et d'autres épreuves biologiques, est évidente. Naturellement, un moyen de produire une telle exaltatation consiste à utiliser un appareillage optique ou électronique coûteux: simples compteurs de photons, luminomètres, compteurs à scintillations. La présente invention propose un moyen bien

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moins coûteux et cependant tout aussi efficace pour produire l'activation lumineuse désirée dans des milieux aqueux, et elle offre dans de nombreux cas une intensité lumineuse exaltée à un degré qui permet la détection par des moyens simples et peu coûteux, par exemple avec un appareil photographique, au lieu d'instruments de détection compliqués. La présente invention permet également la détection de plus faibles concentrations d'analytes en utilisant les mêmes quantités de composés chimiques chimioluminescents que dans les méthodes pratiquées jusqu'à présent, et elle permet en même temps l'utilisation de plus faibles quantités de composés chimiques chimioluminescents

pour détecter les mêmes concentrations d'analytes compara-

tivement aux quantités qui étaient nécessaires dans les méthodes pratiquées jusqu'à présent. Par la mise en pratique de l'invention, on peut accentuer l'intensité de

la lumière émise par des produits fluorophores de décom-

position de composés chimiques chimioluminescents d'un facteur d'au moins 10 %, mais habituellement de facteurs d'au moins dix fois et souvent d'au moins 100 à 1 000 000 de fois les intensités pouvant être obtenues dans des milieux aqueux en utilisant les mêmes composés

chimioluminescents dans les méthodes pratiquées jusqu'ici.

Bien qu'on ne désire s'attacher à aucune théorie ni à aucun mécanisme pour expliquer le mode d'action de la présente invention, on considère que les substances activatrices agissent dans un environnement protique polaire tel qu'un milieu aqueux en fixant des fragments contenant des fluorophores- résultant de la décomposition d'un composé chimique chimioluminescent et en maintenant ces fragments selon une conformation stabilisée, peut-être par interaction hydrophobe ou par interaction ionique ou les deux, entre la substance activatrice et le fragment contenant le fluorophore. On pense que cette action empêche, quant à elle, le fluorophore de libérer la

totalité ou une partie importante de son énergie d'excita-

tion par des processus non émetteurs de lumière: relaxa-

tion vibratoire dans laquelle de l'énergie est émise comme chaleur plutôt que comme lumière, croisement entre systèmes vers d'autres états inférieurs d'énergie, ou d'autres

mécanismes de ce genre.

La Demanderesse vient de trouver que certaines substances naturelles et synthétiques hydrosolubles, généralement de nature macromoléculaire, par exemple des protéines globulaires solubles dans l'eau qui renferment des régions hydrophobes: sérum-albumines de mammifères telles que sérumalbumine de boeuf (SAB) et sérum-albumine

humaine (SAH), ou des sels d'ammonium quaternaire polyméri-

ques hydrosolubles: poly(chlorure de vinylbenzyltri-

méthyl)ammonium (TMQ) ou poly[chlorure de vinylbenzyl-

benzyl-diméthylammonium] (BDMQ) permettent la stabilisa-

tion, et, par conséquent, l'augmentation de l'intensité lumineuse, de fluorophores émettant de la lumière produits

par la décomposition de composés chimiques chimio-

luminescents dans des milieux aqueux. Ces composés chimioluminescents comprennent, à titre non limitatif, des 1,2-dioxétanes clivables par voie thermique, chimique, électrochimique et enzymatique; des esters d'acridinium; la lucigénine, dimère d'acridines N-substituées; la

luciférine, etc., et des mélanges de ces composés chimio-

luminescents les uns avec les autres et avec un ou plusieurs fluorophores auxiliaires, par exemple la fluorescéine, qui reçoivent de l'énergie de fluorophores qui en émettent et qui sont produits par la décomposition de composés chimioluminescents et qui émettent quant à eux de l'énergie détectable. Du fait de la. présence de

quantités efficaces d'une ou plusieurs substances acti-

vatrices, l'intensité de la lumière émise dans le milieu

aqueux par les fluorophores ainsi stabilisés est notable-

ment accentuée, comparativement & l'intensité de la lumière émise par les mêmes quantités de fluorophores en l'absence

de ces activateurs.

La présente invention a, par conséquent, pour objet d'apporter des perfectionnements aux possibilités de détection d'énergie électromagnétique, détectable par

exemple par des moyens optiques, libérée par la décomposi-

tion de composés chimiques chimioluminescents dans des

milieux aqueux.

Un autre objectif de la-présente invention est de proposer des moyens permettant d'améliorer la détection d'énergie électromagnétique, par exemple détectable par des moyens optiques, libérée par la décomposition de composés chimiques chimioluminescents utilisés pour détecter la présence ou pour déterminer la concentration ou- la

structure d'une substance dans un échantillon aqueux.

Un autre objectif de la présente invention est d'apporter des perfectionnements aux possibilités de détection d'énergie électromagnétique, par exemple détectable par des moyens optiques, libérée par la décomposition de composés chimiques chimioluminescents utilisés pour détecter la présence ou pour déterminer la concentration de substances chimiques ou biologiques par des techniques d'immuno-essai, d'épreuve chimique ou d'épreuve par sondes d'aCide nucléique admises dans la pratique. La présente invention a en outre pour objectif d'apporter des perfectionnements aux possibilités de détection d'énergie électromagnétique, par exemple détectable par des moyens optiques, libérée par la décomposition de composés chimiques chimioluminescents en vue de l'étude de structures ou de microstructures moléculaires. La présente invention a en outre pour objectif de trouver des compositions aqueuses comprenant des substances activatrices naturelles et synthétiques hydrosolubles qui permettent la stabilisation, et par conséquent l'augmentation de l'intensité lumineuse, de fluorophores photo- émetteurs produits par la décomposition de composés chimiques chimioluminescents dans des milieux aqueux. D'autres caractéristiques et avantages de la

présente invention ressortiront de la description détaillée

qui va suivre, faite en regard des dessins sur lesquels: la figure 1 est un graphique illustrant des signaux d'intensité de luminescence obtenus dans les épreuves de dosage de TSH de l'exemple 46 effectuées en présence (courbe "A") et en l'absence (courbe "B") de SAB; la figure 2 est un graphique illustrant l'émission de lumière qui résulte de la décomposition de l'ester d'acridinium utilisé pour détecter l'IgG anti- TSH de l'exemple 47 en l'absence ("témoin") et en présence ("activateur") d'un activateur consistant en un sel disodique de BDMQ/fluorescéine; les figures 3 & 5 représentent les spectres de taux de luminescence du fragment de dioxétane émetteur avec et sans activateur: évaluation effectuée dans l'exemple 4 (0,1 % de BDMQ; figure 3) et dans l'exemple 7 (1,0 % de SAB; figure 4), conjointement avec le spectre de taux de luminescence du témoin formé d'un tampon de l'exemple 30 (figure 5); la figure 6 est une représentation graphique de la variation des Unités TUrner Relatives (UTR) en fonction de la concentration en phosphatase alcaline pour les divers systèmes de l'exemple 48; et les figures 7 et 8 sont des reproductions des photographies décrites dans l'exemple 49 d'une solution de substrat en l'absence (figure 7) et en présence (figure 8)

de SAB activateur.

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Les substances activatrices utilisées dans la mise en pratique de la présente invention sont des matières naturelles ou synthétiques hydrosolubles qui peuvent créer un micro-environnement hydrophobe de polarité réduite pour des fragments contenant des fluorophores résultant de la décomposition d'un composé chimique chimioluminescent contenu dans un milieu polaire, c'est-à-dire un milieu constitué d'eau comme solvant ou d'un mélange d'eau et d'autres substances grandement ou entièrement polaires

telles que le méthanol, l'acétonitrile, le diméthyl-

sulfoxyde, le diméthylformamide, etc. Comme indiqué ci-dessus, on compte parmi ces

substances activatrices des protéines globulaires macro-

moléculaires, généralement des protéines ayant des poids moléculaires d'environ 1000 a environ 600 000 daltons et de préférence d'environ 40 000 à environ 100 000 daltons, comme déterminé par électrophorèse sur gel SDS, qui comprennent des régions hydrophobes: sérum-albumines de mammifères telles que SAB, SAH, AFP, etc.; des protéines globulaires telles que IgG, IgE de mammifères, protéine A, avidines, etc.; lipoprotéines sériques, apolipoprotéines, etc. Des substances activatrices oligomériques ou polymériques synthétiques qui peuvent être utilisées dans la mise en pratique de la présente invention comprennent, en premier lieu, des polymères hydrosolubles de sels vinylaryliques d'ammonium quaternaire tels que des polymères de sels de vinylbenzylammonium quaternaire répondant à la formule: X. ton,

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Dans cette formule, chacun des groupes R1, R2 et R3 peut représenter un groupe alkyle non substitué à chaine droite ou ramifiée ayant 1 à 20 atomes de carbone

inclus, par exemple méthyle, éthyle, n-butyle, tertio-

butyle, cétyle, etc.; un groupe alkyle à chaîne droite ou à chaîne ramifiée ayant i à 20 atomes de carbone inclus, substitué avec un ou plusieurs groupes hydroxy, alkoxy, par exemple méthoxy, éthoxy, benzyloxy ou polyoxyéthyléthoxy, aryloxy, par exemple phénoxy, amino ou amino substitué,.par exemple méthylamino, amido, par exemple acétamido ou cholestéryloxycarbonylamido, ou fluoralcane ou fluoraryle, par exemple heptafluorobutyle, un groupe monocyclo-alkyle non substitué ayant un nombre d'atomes cycliques de carbone de 3 à 12 inclus, par exemple cycloalkyle ou cyclo-octyle, un groupe monocyclo-alkyle substitué ayant un nombre d'atomes cycliques de carbone de 3 à 12 inclus, substitué avec un ou plusieurs groupes alkyle, alkoxy ou benzo

condensés, par exemple méthoxycyclohexyle ou 1,2,3,4-

tétrahydronaphtyle, un groupe polycyclo-alkyle ayant 2 ou plus de deux noyaux condensés, chacun d'eux ayant 5 à 12 atomes de carbone inclus, non substitué ou substitué avec un ou plusieurs groupes alkyle, alkoxy ou aryle, par exemple 1-adamantyle ou 3-phényl-1-adamantyle, un groupe aryle, alkaryle ou aralkyle ayant au moins un noyau et 6 à 20 atomes de carbone au total, non substitué ou substitué avec un ou plusieurs groupes alkyle, aryle ou fluoralcane

ou fluoraryle, par exemple phényle, naphtyle, pentafluoro-

phényle, éthylphényle, benzyle, hydroxybenzyle, phényl-

benzyle ou déhydro-abiéthyle; au moins deux des groupes R1, R2 et R3, conjointement avec l'atome quaternaire d'azote auquel ils sont liés, pouvant former un noyau saturé ou non saturé, substitué ou non substitué, contenant de l'azote ou contenant de l'azote et de l'oxygène ou contenant de l'azote et du soufre, ayant 3 à 5 atomes. de carbone inclus, et 1 à 3 hétéro-atomes inclus, et qui peut

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être condensé à du benzène, par exemple i-pyridyle, 1-(3-

alkyl- ou aralkyl)imidazolium, morpholino, pipéridino ou

acylpipéridino, benzoxazole, benzothiazole ou benzimida-

zole. Le symbole "X-" représente un ion complémen- taire qui peut contenir, seul ou en association, des groupements tels qu'halogénure, c'est-à-dire fluorure, chlorure, bromure ou iodure, sulfate, alkylsulfonate, par

exemple méthylsulfonate, arylsulfonate, par exemple p-

toluènesulfonate, arylsulfonate substitué, par exemple anilinonaphtylènesulfonate (divers isomères), le jaune lucifer CH et un groupement diphénylanthracènesulfonate,

perchlorate, alcanoate, par exemple acétate, arylcarboxy-

late, par exemple la fluorescéine ou ses dérivés, benzo-

hétérocyclo-arylcarboxylate, par exemple le 7-diéthylamino-

4-cyanocoumarine-3-carboxylate, phosphate ou mono-aryloxy-

phosphate substitué, par exemple un dianion 3-(2'-spiro-

adamantane)-4-méthoxy-(3"-phosphoryloxy)phényl-1,2-

dioxétane ou d'autres dianions indiqués dans la formule III

ci-dessous.

Le symbole n représente un nombre tel que le poids moléculaire de ces polymères de sels vinylbenzyliques d'ammonium quaternaire se situe dans un intervalle d'environ 800 à environ 200 000 et de préférence d'environ 20 000 a environ 70 000, comme déterminé par des techniques faisant intervenir la viscosité intrinsèque ou techniques

LALLS.

Des exemples de ces polymères de sels vinyl-

benzyliques d'ammonium quaternaire hydrosolubles sont les sels TMQ, BDMQ, etc. Ces polymères de sels vinylbenzyliques

d'ammonium quaternaire peuvent être préparés par polyméri-

sation par radicaux libres des monomères précurseurs appropriés ou par alkylation complète des amines tertiaires correspondantes avec un polychlorure de vinylbenzyle. Cette même approche peut être adoptée en utilisant d'autres

agents alkylants polymériques tels qu'un polyphénylène-

oxyde chlorométhylé ou une polyépichlorhydrine. Les mêmes agents alkylants polymériques peuvent être utilisés comme initiateurs de polymérisation par décyclisation d'oxazo- line, ce qui donne après hydrolyse des copolymères de type polyéthylènë-imine greffés. Ces copolymères peuvent ensuite être quaternisés, de préférence avec des groupes aralkyle,

pour produire la substance polymérique activatrice finale.

Des acétals hydrosolubles d'un polyalcool

vinylique et d'un sel formylbenzylique d'ammonium quater-

naire, répondant à la formule: -- A/,4t (II) dans laquelle chaque R4 représente des substituants aliphatiques identiques ou différents et X1 est un anion, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 124 388 au nom de Bronstein-Bonte et collaborateurs, peuvent aussi être utilisés comme substances activatrices dans la mise en pratique de la présente invention. Les sels vinylbenzyliques d'ammonium quaternaire monomériques

individuels utilisés pour préparer les poly(sels vinyl-

benzyliques d'ammonium quaternaire) de formule I ci-dessus peuvent aussi être copolymérisés avec d'autres sels vinylbenzyliques d'ammonium quaternaire monomériques dont les polymères sont représentés par. la formule I, ou avec d'autres monomères à non-saturation éthylénique n'ayant pas de fonction ammonium quaternaire, pour former des polymères

tels que ceux qui sont décrits dans les brevets des Etats-

Unis d'Amérique N 4 322 489, N 4 340 522, N 4 424 326, NO 4 503 138 et NO 4 563 411, tous ces polymères pouvant aussi tre utilisés comme substances activatrices dans la mise en pratique de la présente invention. Ces polymères quaternisés ont avantageusement des poids. moléculaires compris dans les plages indiquées ci-dessus pour les poly(sels vinylbenzyliques d'ammonium quaternaire) de formule I.

D'autres matières oligomériques, homopolyméri-

ques et copolymériques hydrosolubles peuvent être utilisées comme substances activatrices en plus ou à la place des polymères ci-dessus, comprenant: - des poly-N-vinyl-oxazolidinones; - des polycarbamates de vinyle (par exemple polycarbamate de vinylpropylène); - des polyhydroxyacrylates et méthacrylates

[par exemple polyméthacrylate de 6-hydroxyéthyle et poly-

monométhacrylates d'éthylène-glycol]; - oligomères contenant des groupes amine (par exemple Jeffamines) quaternisés avec des agents alkylants ou aralkylants; - polypeptides synthétiques (par exemple polylysine co phénylalanine); - polyvinylalkyléthers (par exemple polymère d'éther de vinyle et de méthyle); - polyacides et leurs sels [par exemple acides

polyacryliques, acides polyméthacryliques, acide polyvinyl-

benzoïque, acide polyéthylènesulfonique, acide polyacryl-

amidométhylpropanesulfonique, acide polymaléique et poly(acide Nvinylsuccinamidique)]; - polyacrylamides et polyméthacrylamides dérivés de l'ammoniac ou d'amines primaires ou secondaires cycliques et acycliques; alcool polyvinylique et copolymères d'alcool polyvinylique avec l'acétate d'éthyle, l'éthylène, etc.;

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- polymères de sels de 2-, 3- ou 4-vinyl-

pyridinium dont l'atome d'azote hétérocyclique est lié à un groupe tel que défini pour R1, R2 et R3 dans la formule I ci-dessus; polyvinylalkylpyrrolidinones (par exemple polyvinylméthylpyrrolidinones); - polyvinylalkyloxazolidones (par exemple polyvinylméthyloxazolidones);

- polyéthylène-imines ramifiées, polyéthylène-

imines ramifiées acylées ou polyéthylène-imines ramifiées acylées quaternisées en outre avec des groupes alkyle ou aralkyle; - poly-Nvinylamines dérivées de l'ammoniac ou d'amines primaires ou secondaires cycliques et acycliques, et leurs sels; - polyvinylpipéridine;

- polyacryloyl-, polyméthacryloyl- ou 4-

vinylbenzoyl-aminimides dont les trois substituants portés par l'atome d'azote chargé positivement peuvent être l'un quelconque des groupes R1, R2 et R3 définis dans la formule

I ci-dessus.

Là aussi, ces substances activatrices oligomé-

riques ou polymériques ont de préférence des poids moléculaires compris dans les plages indiquées ci-dessus pour les polymères de sels vinylbenzyliques d'ammonium quaternaire de formule I.

Des savons quaternaires monomériques hydro-

solubles dont l'atome d'azote porte au moins un substituant benzyle et dont les autres substituants de l'azote correspondent aux définitionsdonnées pour R1, R2, R3 et X dans la formule I ci-dessus, par exemple chlorure de

cétyldiméthylbenzylammonium ou bromure de cétyldibenzyl-

méthylammonium peuvent aussi être utilisés comme substances activatrices dans la mise en pratique de la présente

invention.

La quantité de substance activatrice ou de mélange de substances activatrices que l'on utilise dans la mise en pratique de la présente invention peut varier entre de larges limites selon la ou les substances activatrices particulières que l'on choisit, la quantité et le type du ou des composés chimioluminescents présents, etc. Par exemple, certains activateurs tels que la SAB montrent une concentration optimale, dépendant principalement du composé chimioluminescent présent, au-delà de laquelle l'addition de quantités supplémentaires d'activateur ne produit pas d'autres élévations de l'intensité lumineuse. D'autres activateurs tels que TMQ permettent une plus grande activation lorsque la concentration croit. Toutefois, en général, on utilise des quantités de substance activatrice allant d'environ 0,01 % à environ 25 % et de préférence d'environ 0,1 à environ 5 %, sur la base du poids de

substance activatrice divisé par le poids de milieu aqueux.

On peut utiliser dans la mise en pratique de la présente invention tout composé chimique chimioluminescent qui (1) peut être amené à se décomposer en fournissant un groupement dans un état excité, ce groupement ayant un caractère hétéropolaire qui le rend susceptible de produire des effets sur l'environnement, et en particulier d'amortir ou de réduire la luminescence dans un milieu protique polaire, et qui (2) est utilisable pour détecter la présence, déterminer la concentration ou la structure d'une substance dans un environnement protique polaire, en

particulier d'une substance dans un échantillon aqueux.

Des 1,2-dioxétanes tels que les dioxétanes clivables par voie enzymatique décrits dans les demandes de brevets simultanément pendantes précitées aux noms de Bronstein, Bronstein et collaborateurs et Edwards, et leurs analogues clivables par voie thermique, chimique et électrochimique, forment une classe de composés chimiques

chimioluminescents que l'on peut utiliser. Ces 1,2-

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dioxétanes peuvent être représentés par la formule générale: O-O

7(III)

Dans cette formule, T est un groupe cyclo-alkyle, arylé, polyaryle ou un groupe hétéro-atomique, non substitué ou substitué, par exemple un groupe cyclo-alkyle non substitué ayant un nombre d'atomes cycliques de carbone de 6 à 12 inclus; un groupe cyclo-alkyle substitué ayant un nombre d'atomes cycliques de carbone de 6 à 12 inclus et portant un ou plusieurs substituants qui peuvent être un groupe alkyle ayant 1 à 7 atomes de carbone inclus, ou un groupe hétéro-atomique qui peut être un groupe alkoxy de 1 à 12 atomes de carbone inclus, tel que méthoxy ou éthoxy, un groupe aryloxy substitué ou non substitué tel que phénoxy ou carboxyphénoxy ou un groupe alkoxyalkyloxy tel que

méthoxyéthoxy ou polyéthylene-oxy ou un groupe cyclo-

alkylidène lié à l'atome de carbone en position 3 du noyau de dioxétane par l'intermédiaire d'une liaison spiro et ayant 6 à 12 atomes de carbone inclus, ou un groupe polycyclo-alkylidène condensé lié à l'atome de carbone en position 3 du noyau de dioxétane par une liaison spiro et ayant deux ou plus de deux noyaux condensés, chacun d'eux ayant 5 à 12 atomes de carbone inclus, par exemple un

groupe adamant-2-ylidène.

Le symbole Y représente un.groupe chromophore fluorescent engendrant un fluorophore photo-émetteur, capable d'absorber de l'énergie 'pour créer un état énergétique excité dans lequel il émet de l'énergie détectable par des moyens optiques en revenant à son état

énergétique initial.

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Le symbole X2 représente l'hydrogène ou un groupe alkyle, aryle, aralkyle, alkaryle, hétéro-alkyle, hétéro-aryle, cyclo-alkyle ou cyclohétéroalkyle, par exemple un groupe alkyle à chaîne droite ou & chaîne ramifiée ayant i & 7 atomes de carbone inclus; un groupe hydroxyalkyle & chaîne droite ou ramifiée ayant 1 à 7 atomes de carbone inclus, ou un groupe -OR dans lequel R est un groupe alkyle saturé ou non saturé, substitué ou non

substitué, ramifié ou non ramifié, cyclo-alkyle, cyclo-

alcényle, aryle, aralkyle ou aralcényle en C1 & C20, un groupe cycloalkyle, cyclo-alcényle, aryle, aralkyle ou aralcényle & noyaux condensés ou un groupe contenant un hétéro-atome de N, O ou S ou un groupe clivable par un enzyme contenant une liaison pouvant être clivée par un enzyme en donnant un groupement riche en électrons lié au noyau de dioxétane. De préférence, X2 est un groupe méthoxy. Le symbole Z représente l'hydrogène (auquel cas le dioxétane peut être clivé thermiquement par rupture de la liaison oxygène-oxygène), un groupe chimiquement clivable tel qu'un groupe hydroxyle, un groupe ester

d'alcanoyle ou d'aroyle ou un groupe alkyl- ou aryl-

silyloxy, ou d'un groupe. susceptible de clivage enzymatique contenant une liaison pouvant être clivée par un enzyme en donnant un groupement riche en électrons lié au noyau de dioxétane, par exemple une liaison qui, lorsqu'elle est clivée, donne un anion contenant de l'oxygène, un anion contenant du soufre ou un anion contenant de l'azote, et en

particulier un anion amido tel qu'un anion sulfonamido.

Un ou plusieurs des substituants T, X2 et Z peuvent aussi renfermer un substituant qui accentue la solubilité dans l'eau du 1,2-dioxétane, tel qu'un groupe acide carboxylique, acide sulfonique ou sel d'amine quaternaire, l'un au moins de X2 et Z et de préférence Z étant un groupe susceptible de clivage enzymatique et de

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préférence un groupe ester phosphorique pouvant être clivé par un enzyme, et X2 et Y représentent conjointement un groupe chromophore fluorescent condensé lié à l'atome de

carbone en position 4 du noyau de dioxétane par l'inter-

médiaire d'une liaison spiro, par exemple un groupe répondant à la formule générale: <p (IV) Dans cette formule, X3 est un groupe R7 Ra c C -O-, -S- ou -NR9, chacun des groupes R7, R8 et R9 représen-

tant, indépendamment, l'hydrogène ou un groupe alkyle à chaine ramifiée ou à chaîne droite ayant 1 à 20 atomes de carbone inclus, par exemple méthyle, n-butyle ou décyle, un groupe hétéro-alkyle à chaine ramifiée ou à chaine droite ayant 1 à 7 atomes de carbone inclus, par exemple méthoxy, hydroxyéthyle ou hydroxyprDpyle; un groupe aryle ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple phényle; un groupe hétéro-aryle ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple pyrrolyle ou pyrazolyle; un groupe cyclo-alkyle ayant, dans le noyau, 3 à 7 atomes de carbone inclus, par exemple cyclohexyle; un groupe hétérocyclo-alkyle ayant, dans le noyau, 3 à 6 atomes de carbone inclus, par exemple dioxanng; un groupe aralkyle ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple benzyle.; un groupe alkaryle ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple tolyle; ou un groupe susceptible de clivage enzymatique tel que défini ci-dessus; et chaque R6 peut représenter, indépendamment,

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l'hydrogène; un groupe attirant les électrons, tel qu'un groupe perfluoralkyle ayant entre 1 et 7 atomes de carbone inclus, par exemple trifluorométhyle; un halogène; un groupe C02H, ZiCO2H, S03H, NO2, ZlN02, C=N ou Z1C=N, o Z1 est un groupe alkyle & chaîne droite ou à chaîne ramifiée ayant 1 & 7 atomes de carbone inclus, par exemple méthyle, ou un groupe aryle ayant i ou 2 noyaux, par exemple phényle; un groupe cédant des électrons, par exemple un groupe alkoxy en C1 à C7 à chaîne ramifiée ou droite, par exemple méthoxy ou éthoxy; un groupe aralkoxy ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple phénoxy; un groupe hydroxyalkyle en C.1

à C7 à chaîne ramifiée ou droite, par exemple hydroxy-

méthyle ou hydroxyéthyle; un groupe hydroxyaryle ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple hydroxyphényle; un groupe ester d'alkyle en C1 a C7 à chaîne ramifiée ou à chaîne droite, par exemple acétate; ou un groupe ester d'aryle ayant 1 ou 2 noyaux, par exemple benzoate; un groupe hétéro-aryle ayant i ou 2 noyaux, par exemple benzoxazole, benzthiazole, benzimidazole ou benztriazole; ou l'hydrogène ou un groupe Z pouvant être clivé par un enzyme ou clivé chimiquement tel que défini dans le présent mémoire, au moins l'un des groupes R6 étant égal à Z. En outre, tous les groupes R6 peuvent former ensemble un noyau qui peut ou non être substitué, et un ou plusieurs des substituants T, X2 et Z peuvent aussi contenir un substituant qui améliore l'hydrosolubilité du 1,2-dioxétane, tel qu'un groupe acide

carboxylique, acide sulfonique ou sel d'amine quaternaire.

Parmi les substances dont les résidus peuvent

être présents dans ces 1,2-dioxétanes comme groupe chromo-

phore fluorescent (Y ou <X2) y INZ

2649205.

on mentionne les suivants: - anthracène et dérivés anthracéniques, par

exemple 9,10-diphénylanthracène, 9-méthylanthracène, 9-

anthracène-carboxaldéhyde, alcools anthryliques et 9-

phénylanthracène; - -rhodamine et dérivés de rhodamine, par

exemple rhodols, tétraméthyl-rhodamine, têtraéthyl-

rhodamine, diphényldiméthyl-rhodamine, diphényldiéthyl-

rhodamine et dinaphtyl-rhodamine; - fluorescéine et dérivés de fluorescéine, par

exemple 5-iodacétamido-fluorescéine, 6-iodacétamido-

fluorescéine et fluorescéine-5-maléimide; - coumarine et dérivés de coumarine, par

exemple 7-dialkylamino-4-méthylcoumarine, 4-bromométhyl-7-

méthoxycoumarine et 4-bromométhyl-7-hydroxy-coumarine; - érythrosine et dérivés d'érythrosine, par exemple hydroxy-érythrosines, érythrosine-5iodacétamide et érythrosine-5-maléimide; - aciridine et dérivés d'aciridine, par exemple hydroxy-aciridines et 9-méthyl-aciridine;

- pyrène et dérivés de pyrène, par exemple N-

(1-pyrène)-iodacétamide, hydroxy-pyrènes et iodacétate de 1-pyrèneméthyle; - stilbène et dérivés de stilbène, par exemple 6,6'dibromostilbène et hydroxy-stilbènes; - naphtalène et dérivés de naphtalène, par exemple acide 5-diméthylamino-naphtalène-1-sulfonique-.et hydroxy-naphtalènes;

- nitrobenzoxadiazoles et dérivés de nitro-

benzoxadiazole, par exemple hydroxynitrobenzoxadiazoles, 4-

chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole, 2-(7-(nitrobenz-2-

oxa-l,3-diazole-4-yl)-méthylamino-acétaldéhyde et acide 6-

(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-4-yl)-aminohexanoique; - quinoléine et dérivés de quinoléine, par exemple 6-hydroxyquinoléine et 6aminoquinoléine;

2649205.

- acridine et dérivés d'acridine, par exemple N-méthylacridine et Nphénylacridine; - acido-acridine et dérivés d'acido-acridine,

par' exemple 9-méthylacido-acridine et hydroxy-9-méthyl-

acido-acridine; - carbazole et dérivés de carbazole, par exemple Nméthylcarbazole et hydroxy-N-méthylcarbazole; - cyanines fluorescentes, par exemple DMC

(colorant pour laser), hydroxycyanines, 1,6-diphényl-l,3,5-

hexatriène, 1-(4-diméthylaminophényl)-6-phénylhexatriène et les 1,3butadiènes correspondants: - carbocyanines et dérivés de carbocyanine, par exemple phénylcarbocyanine et hydroxycarbocyanines;

- sels de pyridinium, par exemple iodate de 4-

(4-dialkyldiaminostyryl)-N-méthylpyridinium et sels de pyridinium à substituants hydroxy - oxonols; et

- résorofines et hydroxyrésorofines.

Lorsqu'on utilise un 1,2-dioxétane susceptible de clivage enzymatique, le clivage peut être accompli au moyen d'un enzyme tel qu'une phosphatase alcaline qui clive une liaison présente par exemple dans un substituant Z tel qu'un groupe ester phosphorique pour produire un anion Y dans un état de transfert de charge, qui déstabilise quant à lui le dioxétane et clive sa liaison oxygène-oxygène. Le clivage peut aussi être effectué en utilisant un enzyme tel qu'une oxydoréductase qui clive directement la liaison

oxygène-oxygène; voir les demandes de brevet des Etats-

Unis d'Amérique simultanément pendantes précitées au nom de

Bronstein et de Bronstein et collaborateurs.

Outre un groupe ester phosphorique, Z dans les formules III et IV cidessus peut aussi être un groupe alcanoyloxy susceptible de clivage enzymatique, par exemple un groupe ester acétique ou un groupe oxacarboxylate, un

groupe 1-phospho-2,3-diacylglycéride, un groupe 1-thio-D-

2649205.

glucoside, un groupe analogue d'adénosine-triphosphate, un groupe analogue d'adénosine-diphosphate, un groupe analogue d'adénosine- monophosphate, un groupe analogue d'adénosine, un groupe a-D-galactoside, un groupe j-D-galactoside, un groupe a-D-glucoside, un groupe O-D- glucoside, un groupe a-

D-mannoside, un groupe P-D-mannoside, un groupe S-D-

fructofurannoside, un groupe P-D-glucosiduronate, un groupe ester coloré de p-toluènesulfonyl-L-arginine ou un groupe

amide coloré de p-toluènesulfonyl-L-arginine.

Des 1,2-dioxétanes susceptibles de clivage enzymatique dont on apprécie l'utilisation dans la mise en

pratique de la présente invention sont les sels de 3-(2'-

spiro-adamantane)-4-méthoxy-4-(3"-phosphoroyloxy}phényl-

1,2-dioxétane représentés par la formule: O-------- o o-oo O (e' (V) dans laquelle M représente un cation tel qu'un métal alcalin, par exemple sodium ou potassium, un cation ammonium ou uni cation aromatique aralkylique ou alkylique en C1 à C7 d'ammonium quaternaire, N(R5)4+ dans lequel chaque R5 peut être un groupe alkyle, par exemple méthyle ou éthyle, un groupe aralkyle, par exemple benzyle, ou faire partie d'un système hétérocyclique de noyau, par

exemple pyridinium, notamment le sel disodique.

Une autre classe de composés chimioluminescents que l'on peut utiliser dans la mise en pratique de la présente invention comprend des esters d'acridinium ou les dérivés de phénanthradinium dans lesquels un groupe phénoxycarbonyle est présent dans la position 9 du groupement acridine substitué sur l'azote, par exemple ceux

2649205.

qui répondent & la formule générale:

4,\ X7

4% c- o

I (VI)

dans laquelle R10 est, par exemple, un groupe alkyle ou alkoxy à chaîne droite ou à chaîne ramifiée en C1 à C10; un groupe aryle, ayant de préférence un seul noyau aryle,

par exemple phényle; un groupe amino; un groupe hydro-

xyle, un groupe contenant une fonction carbonyle; par exemple un groupe acétyle ou un groupe acide carboxylique

ou ester d'acide carboxylique; Rll peut représenter R10 ou.

l'hydrogène; un noyau benzénique condensé ou un groupe convenant pour la conjugaison à des protéines ou à des acides nucléiques, par exemple un groupe isothiocyanate, un groupe ester de N-hydroxysuccinimide, la biotine ou des avidines, et X4 est un ion complémentaire qui peut contenir, individuellement ou en association, un groupement halogénure, sulfate, alkylsulfonate, arylsulfonate,

arylsulfonate substitué, perchlorate, alcanoate, aryl-

carboxylate, hétéro-arylcarboxylate, phosphate ou mono-

aryloxyphosphate substitue, un oligomère anionique ou un

homopolymère ou copolymère anionique.

Ces esters d'acridinium, en présence d'un peroxyde tel que le peroxyde d'hydrogène et d'une substance alcaline, par exemple l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, émettent de la lumière par chimioluminescence à partir de l'état excité de l'acridone substituée sur

l'atome d'azote formée par clivage de la portion phénoxy-

ester de la molécule.

2649205,

Un ou plusieurs fluorophores auxiliaires étrangers aux fluorophores photoémetteurs produits par la décomposition du ou des composés chimioluminescents également présents qui reçoivent de l'énergie, notamment de la lumière, de fluorophores émettant de l'énergie produits par la décomposition du ou des composés chimioluminescents et qui émettent à leur tour de l'énergie pouvant être détectée, là encore de préférence de la lumière, peuvent être utilisés dans la mise en pratique de la présente invention. Parmi les fluorophores auxiliaires que l'on peut utiliser, seuls ou en associations, on mentionne les substances énumérées ci-dessus dont les résidus peuvent être présents dans des 1,2- dioxétanes en tant que groupes chromophores fluorescents. La fluorescéine et les dérivés de fluorescéine, y compris des dérivés capables d'établir une liaison de covalence avec la substance activatrice,

sont particulièrement avantageux à utiliser comme fluoro-

phore(s) auxiliaire(s).

Ces fluorophores auxiliaires peuvent être simplement mélangés avec la substance ou les substances activatrices et le ou les composés chimioluminescents ou

liés à l'une de ces matières ou aux deux. Les phycobili-

protéines représentent une classe naturelle de molécules activatrices dans lesquelles un fluorophore est lié par covalence à une protéine. Lorsque le fluorophore auxiliaire

est lié à un composé chimioluminescent, il est de préfé-

rence en liaison avec la portion du composé chimiolumines-

cent qui, par décomposition, forme un fragment contenant la

portion fluorophore de la molécule du composé chimio-

luminescent. Le transfert d'énergie est, de ce fait, activé parce que les deux fluorophores sont étroitement rapprochés l'un de l'autre. Des fluorophores auxiliaires qui sont insolubles ou partiellement insolubles dans un milieu aqueux-peuvent être solubilisés par leur greffage préalable sur des molécules solubilisantes, par exemple des molécules

d'oligomères ou de polymères hydrosolubles.

En mélange avec la ou les substances acti-

vatrices et le ou les composés chimioluminescents, la quantité présente du fluorophore auxiliaire utilisé peut aller d'environ 1 ng (nanogramme) /ml à environ 10 mg/ml de solution contenant l'activateur, et de préférence d'environ

i Mg/ml à environ 100 pg/ml de solution contenant l'acti-

vateur. Lorsqu'on utilise des fluorophores auxiliaires attachés par covalence à des protéines, le rapport molaire fluorophore:protéine peut aller de 1 à 60 et de préférence (par exemple pour la SAB) de 1 à 6, par molécule de protéine. La présente invention est particulièrement utile pour la conduite d'immuno-essais tels que ceux que l'on utilise pour détecter un enzyme ou un membre d'une paire en liaison spécifique, par exemple une paire antigène-anticorps ou un acide nucléique apparié avec une sonde capable de s'attacher à la totalité ou à une portion

de l'acide nucléique. Ces épreuves comprennent des immuno-

essais utilisés pour détecter une hormone telle que la forme 6 de la gonadotrophine chorionique humaine (6-hCG), la thyréostimuline hypophysaire (TSH), la follicostimuline (FSH), l'hormone lutéinisante (LH) , etc., des épreuves concernant des récepteurs à la surface des cellules et des épreuves portant sur des acides nucléiques, utilisées pour détecter des virus, par exemple HIV ou- HTLV III et le cytomégalovirus, ou des bactéries, par exemple E. coli, et des épreuves d'histocompatibilité; pour des exemples de protocoles d'essai, voir les exemples pratiques donnés plus loin, de même que les demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique précitées aux noms de Bronstein et de Bronstein et collaborateurs. L'invention peut aussi être utilisée dans des épreuves portant sur un analyte chimique, tel que des ions potassium ou sodium, ou dans des épreuves portant

2649205.

* sur des substances telles-que le cholestérol ou le glucose, dans lesquelles l'analyte est décomposé par exemple par l'utilisation d'un enzyme tel qu'une cholestérol-oxydase ou une glucose-oxydase, pour former une substance, par exemple du peroxyde d'hydrogène, capable de provoquer la

décomposition du composé chimioluminescent.

Les exemples suivants sont donnés afin de permettre à l'homme de l'art une meilleure compréhension de la présente invention. Ces exemples ne sont donnés qu'à des fins d'illustration et ne doivent nullement être considérés

comme exprimant des limitations.

EXEMPLES 1 - 45

Les substances activatrices énumérées dans le tableau I ci-dessous, dans lequel toutes les parties et tous les pourcentages sont exprimés en poids, sauf spécification contraire, ont été évaluées, en ce qui concerne leurs propriétés d'activation de l'intensité lumineuse, par dissolution de la quantité appropriée d'activateur dans une solution tampon au carbonate 0, 05 M contenant 1 mM de chlorure de magnésium (pH = 9,5), en quantité appropriée pour donner les concentrations mentionnées. On a ensuite ajouté à des échantillons de 1 ml de chacune des solutions résultantes (y compris le témoin, exemple 31, ne contenant pas d'activateur), une quantité

suffisante de sel disodique de 3-(2'-spiro-adamantane)-4-

méthoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phényl-l,2-dioxétane, dissoute dans la même solution de tampon au carbonate que celle qui est utilisée pour dissoudre l'activateur, de manière qu'il

y ait une concentration finale de ce composé. chimio-

luminescent de 0,125 mM. Les solutions résultantes ont été équilibrées à 30'C, après quoi une solution aqueuse de phosphatase alcaline a été ajoutée de manière qu'il y ait une concentration finale en enzyme de 4,17 x 10-10 M. Le signal de luminescence de chaque solution a ensuite été mesuré à 30 C dans un luminomètre Turner 20 E intégrant sur

2649205.

une durée de 20 minutes. Les activateurs -ou les quantités d'activateurs dont l'utilisation a été couronnée de succès ont été ceux qui ont donné un facteur d'activation supérieur à 1 (c'est-à-dire supérieur à celui de l'échan-' tillon de l'exemple 30 contenant le composé chimio-

luminescent, mais non 1'activateur).

TABLEAU I

Exemple Concentration Facteur d'acti-

d'activateur vation 1 0,1 % de DBMQ + fluorescéine1 298,891832 2 0,1 % de BDMCAC2 + fluorescéinel 135,643835 3 1,0 % de BDMQ 19,026097 4 0,1 % de BDMQ 18,422605 5 0,25 % de TMQ 7,194016 6 0,1 % de SAB 5,172073 7 1,0 % de SAB 4,790837 8 0,1 % de TMQ 4,475993 9 0,1 % de BDMCAC 2,874500 10 1,0 % de PolyMAPTAC3 2,384163 11 1,0 % de PVP K-904 2,034744 12 0,01 pg/ml de fluorescéine seule 2,004920 13 1,0 % de PEOX5 1,454102 14 1,0 % de PVP K306 1,419595 15 1,0 % de Polybrene7 1,391839 1 Addition de 0,01 gg/ml de fluorescéine

2 Chlorure de benzyldiméthylcétylammonium; TCI.

3 Chlorure de polyméthacrylamidopropylèneméthyl-ammonium;

Polyscience.

4 Polyvinylpyrrolidone; GAF.

Polyéthyloxazoline; Dow Chemical Co.

6 Polyvinylpyrrolidone; CTAF.

7 Polyméthobromure de 1,5-diméthylr1,5-diaza-undéca-

méthylène; Aldrich.

2649205.

TABEAU I (Suite)

Exemple Concentration Facteur d'acti-

d'activateur vation 16 0,1% de protéine A8 + fluorescéine 1,391196 17 1,0 % de PEI 10009 1,262907 18 1,0 % de Polyox N-8010 1,167327 19 0,1 % de PolyMAPTAC 1,140866 0,1 % de Polybrene 1,139414 21 0,1 % de PVP K-30 1, 112314 22 0,1 % de PVP K-90 1,091996 23 0,1 % de Kelcosol Algin11 1, 084700 24 0,1 % de Kelco SCS XL12 1,077093 0,1 %.de Pluronic F12713 1, 076141 26 1,0 % de Polyox N-1014 1,045022 27 1,0 % de Kelco SCS XL 1, 043893 28 0,1 % de PEOX 1,025682 29 0,1 % de PEI 1000 1,023954

8 Dérivés de Staphylococcus; Sigma.

9 Polyéthylene-imine; Dow Chemical Co. Polyéthylène-oxyde, Union Carbide Corp.

il Acide alginique (sel de sodium) i Merck.

12 Sulfate de cellulose sodique; Merck.

13 Polyéthylènepropylène-glycol; BASF Wyandotte.

14 Polyoxazoline; Dow Chemical Co.

2649205.

TABLEAU I (Suitel

Exemple Concentration Facteur d'acti-

d'activateur vation 30 Solution tampon seule (sans activateur) 1,00000 31 1,0 % de Pluronic F127 0,959475 32 0,1 % d'éther 18-corona-615 0,953054 33 0,1 % de gomme Ghatti16 0,946162 34 0,1 % de protéine A 0,940106 0,1 % de PVHP17 0,933433 36 0,1 % de Polyox N-80 0,930873 37 0,1 % de Polyox N0,907289 38 1,0 % de PEG18 0,893920 39 1,0 % d'ether 18-corona-6 0, 871326 1,0 % de Kelcosol Algin19 0,786052 41 0,1 % de Polyox N-30120 0, 765806 42 0,1 % de PEG 0,751353 43 1,0 % de Gomme Ghatti 0,558062 44 1,0 % de Polyox N-301 0,523886 1,0 % de PVHP 0,029226

1,4,7,10,13,16-hexa-oxacyclo-octadécane; Aldrich.

16 Numéro de catalogue G0378; Sigma.

17 Polyvinylhydrogénophtalate; Eastman Kodak 5527.

18 Polyéthylène-glycol, poids moléculaire 8000, à usage

biologique, P2139; Sigma.

19 Alginate; Kelco Co.

20 Polyéthylène-oxyde; Union Carbide.

2649205.

Les spectres d'émission lumineuse des échantil-

lons des exemples 4, 7 et 30 sont représentés, respective-

ment, sur les figures 3, 4 et 5, l'intensité lumineuse étant indiquée en abscisses (axes des X) et temps en ordonnées (axe des Y) sur chaque graphique.

EXEMPLE 46

Une épreuve TSH a été effectuée de la façon suivante:

MATERIEL:

L'anticorps anti-TSH-6 monoclonal de souris a été utilisé pour revêtir des perles de 3,175 mm en vue de la capture de l'analyte. L'anticorps anti-TSH monoclonal de souris a été conjugué avec de la phosphatase alcaline et

utilisé comme anticorps de détection.

L'hormone TSH provenait de la firme Calbiochem, N' de catalogue 609396, et la sérum-albumine de boeuf (type V - sans acide gras) provenait de la firme Sigma, N de

catalogue A6003.

La solution tampon utilisée pour l'analyte et pour le conjugué contenait du chlorhydrate de tris 0,1 M, 1 mM de MgC12 et 2 % en poids de SAB (pH = 7,5). La solution tampon du substrat contenait 0,1 M de tris, 0,1 mM de MgC12, 0,1 % en poids *de SAB (pH = 9,5) et du sel

disodique de 3-(2'-spiro-adamantane)-4-méthoxy-4-(3"-

phosphoryloxy)phényl-l,2-dioxétane comme composé chimio-

luminescent (50 gg/ml).

PROTOCOLE:

p1 d'une solution d'analyte contenant l'hormone TSH ont été mélangés avec 135 pl de solution d'anticorps conjugué. Deux perles de 3,1.75 mm revêtues de la manière décrite ci-dessus ont été ajoutées à la solution et maintenues en incubation à 23C pendant-2 heures. Les perles ont ensuite été lavées quatre fois avec une solution de tris 0,1 M (pH = 7,5) et transférées dans un tube de réaction. 200 1 du même composé chimioluminescent que

2649205.

celui qui a été utilisé dans la solution tampon de substrat décrite cidessus ont été ajoutés au tube. Apres une période d'incubation de 20 minutes, on a noté l'émission de lumière en effectuant des comptages de 10 secondes au moyen d'un analyseur de luminescence Berthold Clinilumat. On a aussi effectué un dosage identique de TSH avec la même concentration de substrat dans le même tampon sans SAB, à des fins de comparaison. Comme le montre la figure 1, qui représente graphiquement les résultats indiqués dans le tableau II ci-dessous, l'échantillon contenant de la SAB (courbe A) a montré une plus grande intensité de luminescence pour une concentration donnée en

TSH que l'échantillon sans SAB (courbe B).

TABLEAU II

Concentration Signal luminescent (Coups/10sxl10-4) en TSH (pU/ml) avec 0, 10 % de SAB sans SAB

1 0,48 0,25

2 1,1 0,49

4 1,7 1,1

EXEMPLE 47

L'activation de la luminescence par un conjugué IgG-ester d'acridinium ("AE") anti-TSH (Ciba-Corning) a eté

illustrée au moyen de la méthode suivante.

On a ajouté à des portions de 50 1 du conjugué IgG-AE anti-TSH contenant 30 mg de IgG/ml avec 2-3 marqueurs dans des tubes luminométriques les quantités d'une solution aqueuse contenant 0,1 % de BDMQ et 0,01 mg/ml de sel disodique de fluorescéine indiquées dans le tableau III ci-dessous. Chaque tube a été placé dans un

luminomètre Berthold Clinilumat et une réaction lumines-

cente a été déclenchée par injection de 200 pl de solution aqueuse d'hydroxyde de sodium 50 mM contenant 0,05 % de

peroxyde d'hydrogène.

2649205.

L'émission de lumière, activée par le système BDMQ/fluorescéine, d'un ester d'acridinium, & des niveaux de 10 ml et de 50 pi, comparativement au témoin, est représentée dans le tableau III et illustrée par les graphiques de la figure 2.

TABLEAU III

Concentration Intensité lumineuse d'activateur, pl (intégrale de 10 s) Néant (témoin) 127 479

*169 753

188 885

- 100 82 437

EXEMPLE 48

Un dosage de phosphatase alcaline a été

effectué de la manière suivante.

COMPOSANTS

Tampon: 0,05 M de carbonate, 1 mM de MgC12 à pH 9,5

Substrat: sel disodique du 3-(2'-spiro-adamantane)-4-

méthoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phényl-1,2-dioxétane à la concentration de 0, 4 mM Phosphatase alcaline: solution-mère à 1,168 gg/ml dans le tampon Systèmes. activateurs éprouvés: 1. Tampon seul, témoin 2. Tampon plus 0,1 % de SAB 3. Tampon plus 0,1 % de SAB-fluorescéine (rapport molaire de la SAB à la fluorescéine de 1 à 3) 4. Tampon plus 0,1 % de BDMQ 5. Tampon plus 0,1 % de BDMQ et fluorescéine (0,01 mg de sel disodique de fluorescéine

ajouté par ml de BDMQ).

2649205.

Des dilutions en série de solutions-mères de phosphatase alcaline ont été effectuées dans des tubes avec des concentrations finales d'enzyme de: 4, 17 x 10-11 M 1,67 x 10-15 M 8,34 x 10-12 M 8,34 x 10-16 M 1,67 x 10-12 M 4,17 x 10-16 M 3,34 x 10-13 M 2,09 x 10-16 M 6,68 x 10-14 M 1,0 x 10-16 M 1,34 x 10-14 M 5,0 x 10-17 M 3,34 x 10-15 M 2,5 x 10-17 M

MODE OPERATOIRE:

On a fait incuber à 30'C deux tubes de chacune

des concentrations de phosphatase alcaline indiquées ci-

dessus contenant 0,4 mM de sel disodique de 3-(2'-spiro-

adamantane)-4-méthoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phényl-1,2-

dioxétane dans divers systèmes activateurs. On a fait incuber les systèmes 1, 4 et 5 pendant 20 minutes, tandis

qu'on a fait incuber les systèmes 2 et 3 pendant 80 minu-

tes. Après l'incubation, on a mesuré des intégrales de lumière de 30 secondes dans un luminomètre Turner 20E; l'effet produit par les activateurs d'essai sur les limites de détection de la phosphatase alcaline est représenté dans

le tableau IV.

2649205.

TABLEAU IV

Addition Concentration en Concentration minimale

phosphatase alcaline détectable de phospha-

pour un fond 2X tase alcaline Néant 1,0 x 10-14 M 1,67 x 10-15 M (1,12)

0,1% SAB 9,5 x 10-15 M 8,34 x 10-16 M (1,06).

0,1 % SAB:

fluorescéine 1,3 x 10-15 M 4,17 x 10-16 M (1,04) 0,1% BDMQ 4,0 x 10-15 M 1,00 x 10-16 M (1,07)

0,1% BDMQ:

fluorescéine 3,4 x 10-15 M 2,09 x 10-16 M (1,06)

1 Tampon: carbonate 0,05 M, MgCl2 1 mM, pH = 9,5.

Température: 30 C. La concentration du composé chimio-

luminescent est de 0,4 mM.

2 Le nombre entre parenthèses est le multiple du fond à la

concentration indiquée.

EXEMPLE 49

La capacité de détection photographique de la luminescence au moyen de la présente invention a été

démontrée de la manière suivante.

COMPOSANTS:

TamDon: tris 0,1 M, MgCl2 1 mM à pH 9,8, préparé avec 0,1 % de SAB et sans SAB (SAB provenant de la

firme Sigma, numéro de catalogue A7906).

Enzyme: 0,05 mg de phosphatase alcaline (3,6 x 10-13 mole), produit de la firme

Biozyme Corporation.

Membrane: nitrocellulose à pores-de 0,45 Mm.

Substrat: sel disodique de 3-(2'-spiro-adamantane)-4-

méthoxy-4-(3 "-phosphoryloxy)phényl-l,2-

dioxétane à la concentration de 0,08 mM.

PROTOCOLE3:

La solution d'enzyme a été répartie en gouttes sur une membrane nitrocellulosique sèche. Ensuite, la membrane a été obstruée avec 2,5 % de lait en poudre à l'état sec et 1 % de gélatine de poisson dans une solution de sel tamponné au phosphate à pH 7,3. La membrane obstruée a été lavée avec la solution de substrat dans des tampons

ne contenant pas de SAB et contenant de la SAB.

La membrane a été disposée dans un luminomètre à chambre et des expositions de 10 minutes ont été effectuées à l'aide d'un film instantané noir et blanc Polaroid Type 612. Des reproductions des photographies

obtenues sont données sur les figures 7 et 8.

Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées

sans sortir de son cadre.

Claims (41)

REVENDICATIONS

1. Procédé perfectionné mis en oeuvre en milieu liquide, dans lequel de l'énergie électromagnétique libérée par la décomposition d'un composé chimique chimioluminescent est détectée en vue de déterminer la présence, la concentration ou la structure d'un analyte, caractérisé'en ce que le perfectionnement consiste à mettre le procédé en oeuvre en présence d'une quantité d'une substance hydrosoluble suffisante pour activer l'intensité

de l'énergie détectable libérée comparativement à l'inten-

sité de l'énergie détectable libérée en l'absence de la

substance activatrice.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la décomposition du composé chimique chimioluminescent entraine la formation d'un fluorophore

émettant de la lumière.

3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la substance activatrice est capable d'empêcher le fluorophore de libérer de l'énergie par des

processus sans émission de lumière.

4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé en ce que la substance activatrice comprend une substance macromoléculaire naturelle ou synthétique qui peut créer un micro-environnement hydrophobe pour le

fluorophore.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la substance activatrice comprend une

substance macromoléculaire naturelle.

6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la substance macromoléculaire est une

protéine globulaire qui renferme des'régions hydrophobes.

7. Procédé suivant la revendication 6,

caractérisé en ce que la protéine globulaire est une sérum-

albumine de mammifère.

8. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la substance activatrice comprend une

substance macromoléculaire synthétique.

9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que la substance macromoléculaire comprend un sel d'animmonium quaternaire oligomérique ou polymérique.

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le sel d'ammonium quaternaire est un

poly(sel vinylarylique d'ammonium quaternaire).

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le poly(sel vinylarylique d'ammonium

quaternaire) est un poly(chlorure de vinylbenzyltriméthyl-

ammonium).

12. Procédé suivant la revendication -10, caractérisé en ce que le poly(sel vinylarylique d'ammonium

quaternaire) est un poly[chlorure de vinylbenzyl-benzyl-

diméthylammonium].

13. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le composé chimique chimioluminescent est un 1,2-dioxétane susceptible de clivage thermique, chimique, électrochimique ou enzymatique, un ester

d'acridinium, la lucigénine ou la luciférine.

14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le composé chimique chimioluminescent

comprend un 1,2-dioxétane.

15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le dioxétane est clivable par voie enzymatique.

16. Procédé suivant la revendication 15,

caractérisé en ce que le 1,2-dioxétane est un sel de 3-(2'-

spiro-adamantane)-4-méthoxy-(3"-phosphoryloxy)phényl-l,2-

dioxétane.

17. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en présence d'un

2649205.

fluorophore auxiliaire étranger au fluorophore émetteur d'énergie produit par la décomposition du composé chimique chimioluminescent et capable de recevoir de l'énergie dudit

fluorophore pour émettre à son tour une énergie détectable.

À

18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le fluorophore auxiliaire est mélangé avec le composé chimique chimioluminescent et la substance activatrice.

19. Procédé suivant la revendication 18, caractérisé en ce que le fluorophore auxiliaire est une fluorescéine.,

20. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le fluorophore auxiliaire est lié à

-la portion du composé chimioluminescent qui, par décomposi-

tion, produit le fluorophore émetteur d'énergie.

21. Procédé -suivant la revendication 20, caractérisé en ce que le fluorophore auxiliaire est une fluorescéine.

22. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que le fluorophore auxiliaire est lié à

la substance activatrice.

23. Procédé suivant la revendication 22, caractérisé en ce que le fluorophore auxiliaire est un dérivé de fluorescéine capable d'établir une liaison de

covalence avec la substance activatrice.

24. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre en tant qu'étape

dans un immuno-essai.

25. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre comme épreuve

utilisant des sondes d'acide nucléique.

26. Composition aqueuse, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé chimique chimioluminescent

capable de se décomposer en libérant de l'énergie électro-

magnétique détectable pour déterminer la présence, la

2649205,

concentration ou la structure d'un analyte et une quantité d'une substance soluble dans l'eau suffisante pour accentuer l'intensité de l'énergie détectable libérée comparativement à l'intensité de l'énergie détectable libérée en l'absence de la substance activatrice.

27. Composition suivant la revendication 26,

caractérisée en ce que le composé chimique chimio-

luminescent est un composé dont la décomposition entraîne

la formation d'un fluorophore émettant de la lumière.

28. Composition suivant la revendication 27, caractérisée en ce que la substance activatrice est capable d'empêcher le fluorophore de libérer de l'énergie par des

processus sans émission de lumière.

29. Composition suivant la revendication 28, caractérisée en ce que la substance activatrice comprend une substance macromoléculaire naturelle ou synthétique qui peut créer un micro-environnement hydrophobe pour le fluorophore.

30. Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que la substance activatrice comprend

une substance macromoléculaire naturelle.

31. Composition suivant la revendication 30, caractérisée en ce que la substance macromoléculaire est

une protéine globulaire qui renferme des régions hydro-

phobes.

32. Composition suivant la revendication 31, caractérisée en ce que la protéine globulaire est une

sérum-albumine de mammifère.

33. Composition suivant la revendication 29, caractérisée en ce que la substance activatrice comprend

une substance macromoléculaire synthétique.

34. Composition suivant la revendication 33, caractérisée en ce que la substance macromoléculaire comprend un sel d'ammonium quaternaire oligomérique ou

polymérique.

35. Composition suivant la revendication 34, caractérisée en ce que le sel d'ammonium quaternaire est un

poly(sel vinylarylique d'ammonium quaternaire).

36. Composition suivant la revendication 35, caractérisée en ce que le poly(sel vinylarylique d'ammonium

quaternaire) est un poly(chlorure de vinylbenzyltriméthyl-

ammonium).

37. Composition suivant la revendication 35, caractérisée en ce que le poly(sel vinylarylique d'ammonium

quaternaire est un poly[chlorure de vinylbenzyl-benzyl-

diméthylammonium].

38. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance activatrice comprend

une phycobiliprotéine.

39. Composition suivant la revendication 26,

caractérisée en ce que le composé chimique chimio-

luminescent est un 1,2-dioxétane susceptible de clivage thermique, chimique, électrochimique ou enzymatique, un

ester d'acridinium, la lucigénine ou la luciférine.

40. Composition suivant la revendication 26,

caractérisée en ce qu'elle contient également un fluoro-

phore auxiliaire étranger au fluorophore émetteur d'énergie

produit par la décomposition du composé chimique chimio-

luminescent et capable de recevoir de l'énergie dudit

fluorophore pour émettre à-son tour une énergie détectable.

41. Composition suivant la revendication 40, caractérisée en ce que le fluorophore auxiliaire est une fluorescéine-.