DE3921609C2

DE3921609C2 - Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Konzentration oder der Struktur eines Analyten

Info

Publication number: DE3921609C2
Application number: DE19893921609
Authority: DE
Inventors: John C Voyta; Edwards Brooks; Irena Y Bronstein
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1989-06-27
Filing date: 1989-06-30
Publication date: 1998-11-26
Anticipated expiration: 2009-07-01
Also published as: GB2233451A; GB8914749D0; GB2233451B; FR2649205B1; DE3921609A1; FR2649205A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Konzentration oder Struktur eines Ana lyten, bei dem in einem wäßrigen Medium elektromagnetische Energie, die durch die Zersetzung eines chemilumineszenten, ein Fluorophor umfassenden enzymatisch spaltbaren 1,2-Di oxetans freigesetzt wird, nachgewiesen wird, wie es aus der WO 88/00695 A1 bekannt ist.

Insbesondere betrifft die Erfindung einen verstärkten Nachweis von elektromagnetischer Energie, die durch die Zersetzung von chemilumineszenten Verbindungen, die zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Konzentration oder Struktur einer Substanz in einer wäßrigen Probe eingesetzt werden, freigesetzt wird, insbesondere wenn solche chemilumineszenten Verbindungen eingesetzt werden, um das Vorhandensein von chemischen oder biologischen Substanzen durch fachbekannte Immunoassaytechniken, chemischen Assays oder Nukleinsäureprobenassays nachzuweisen oder ihre Konzentration zu bestimmen, oder wenn sie als direkte chemische/physikalische Proben zur Untersuchung der molekularen Strukturen oder Mikrostrukturen verschiedener Makromoleküle, wie synthetische Polymere, Proteine, Nukleinsäuren, verwendet werden.

Die Zersetzung von chemilumineszenten chemischen Verbindungen unter Ausstrahlung von elektromagnetischer und insbesondere von optisch nachweisbarer Energie - üb licherweise als Lumineszenz in Form von sichtbarem Licht - ist gut bekannt und verstanden. Die Einfügung solcher lichtemittierender Reaktanten in fachbekannte Immunoassays, chemische Assays, Nukleinsäureprobenassays und chemisch/physikalische Probetechniken als Mittel, durch die der Analyt, eine Substanz, dessen Vorhandensein, Menge oder Struktur bestimmt wird, identifiziert oder quantifiziert wird, hat in den vergangenen Jahren eine steigende Bedeutung erlangt, insbesondere mit dem Auftreten von enzymatisch spaltbaren 1,2-Dioxetanen (vgl. WO 88/00695 A1).

Die GB 2 196 118 A betrifft eine Zusammensetzung bzw. einen Assay, bei dem Wasserstoffperoxid, eine Mikroperoxidase und ein sterisch gehindertes Amin eingesetzt werden, um eine chemilumineszente Reaktion zu bewirken.

Reaktionen, die Chemilumineszenz erzeugen, geben als Beispiel noch einen anderen Fall wieder, in dem das Medium, obwohl es selbst nicht die Nachricht darstellt, die Intensität der übermittelten Nachricht bestimmen kann. Chemilumineszente Verbindungen, die bei der Zersetzung in Substanzen wie schwachpolaren oder polar aprotischen organischen Lösungsmitteln, z. B. n-Butanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid, Fluoropbore erzeugen, die ihrerseits Licht einer geeigneten Intensität für den leichten Nachweis und die Quantifizierung erzeugen, werden Licht mit beträchtlich verminderter Intensität erzeugen, wenn sie in einer polar protischen Umgebung zersetzt werden, insbesondere in wäßrigen Medien. Da jedoch alle biologischen Systeme wäßrig sind - der Mensch selbst besteht aus 97% Wasser - ist das Bedürfnis zur Steigerung der Intensität des Lichtes, das durch chemilumineszente Markierer oder Substrate in Immunoassays, Nucleinsäureprobenassays, chemischen/physikalischen Probetechniken und anderen Bioassays erzeugt wird, naheliegend. Ein Weg, um eine solche Steigerung zu schaffen, besteht natürlich darin, eine teure optische oder elektronische Ausrüstung einzusetzen: Einzelphotonenzähler, Luminometer, Scintillationszähler usw. Die vorliegende Erfindung stellt einen weit weniger teuren, jedoch gleich wirksamen Weg für die Schaffung der geforderten Lichtsteigerung in wäßrigen Medien zur Verfügung, und liefert in vielen Fällen eine derart gesteigerte Lichtintensität, daß sie den Nachweis durch einfache, billige Mittel, wie mit einer Kamera, anstelle von komplexen Nachweisinstrumenten erlaubt.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch den Nachweis von niedrigeren Konzentrationen an Analyten, wobei man die gleichen Mengen an chemilumineszenten chemischen Verbindungen verwendet, die in bislang praktizierten Verfahren verwendet werden, und sie erlaubt damit die Verwendung von geringeren Mengen an chemilumineszenten chemischen Verbindungen, um die gleichen Konzentrationen an Analyten im Vergleich zu denen, die bei bisher praktizierten Verfahren notwendig waren, nachzuweisen. Durch Ausübung der Erfindung kann die Intensität des Lichtes, das durch Fluorophorzersetzungsprodukte von chemilumineszenten chemischen Verbindungen erzeugt wird, um mindestens 10%, gewöhnlich aber um mindestens das Zehnfache und häufig bis um einen Faktor von mindestens 100 bis 1 000 000 mal, gegenüber den Intensitäten, die in wäßrigen Medien unter Verwendung der gleichen chemilumineszenten Verbindungen in bisher praktizierten Verfahren erhältlich sind, gesteigert werden.

Es wird nicht beabsichtigt, an eine bestimmte Theorie oder einen bestimmten Mechanismus zur Erklärung der Wirkungsweise der Erfindung gebunden zu sein, jedoch wird angenommen, daß die Steigerungssubstanzen der vorliegenden Erfindung in einer polar protischen Umgebung, wie einem wäßrigen Medium, unter Bindung von fluorophorhaltigen Fragmenten, die aus der Zersetzung einer chemilumineszenten chemischen Verbindung resultieren, wirken und solche Fragmente in einer stabilisierten Konformation, möglicherweise durch hydrophobe oder ionische Wechselwirkung oder beiden zwischen der Steigerungssubstanz und dem fluorophorhaltigen Fragment, beibehalten. Dies wird seinerseits das Fluorophor daran hindern, die gesamte Menge oder einen beträchtlichen Teil seiner Anregungsenergie durch nicht lichtemittierende Weisen freizugeben: Schwingungsrelaxation, bei der die Energie in Form von Wärme anstelle von Licht ausgestrahlt wird, Übergang zwischen den Systemen zu anderen niedrigeren Energiezuständen oder andere derartige Mechanismen.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte wasserlösliche, natürlich auftretende und synthetische Substanzen, die im allgemeinen in der Natur makromolekular vorliegen, z. B. wasserlösliche Globularproteine, die hydrophobe Stellen einschließen: Säugetierserumalbumine, wie Rinderserumalbumin (RSA) und menschliches Serumalbumin (MSA), oder wasserlösliche, polymere quaternäre Ammoniumsalze: Poly(vinylbenzyl)trimethyl)ammoniumchlorid (TMQ) oder Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl))ammoniumchlorid (BDMQ), die Stabilisierung von lichtemittierenden Fluorophoren, die durch Zersetzung von chemilumineszenten chemischen Verbindungen in wäßrigen Medien erzeugt werden, erlauben und damit die Lichtintensität steigern. Solche chemilumineszente chemische Verbindungen beinhalten thermisch, chemisch, elektrochemisch und enzymatisch spaltbare 1,2-Dioxetane; Acridiniumester; Lucigenin, ein Dimeres von N-substituierten Acridinen; Luciferin, und Mischungen solcher chemilumineszenter Verbindungen untereinander und mit ein oder mehreren Hilfsfluorophoren, z. B. Fluorescin, das Energie aus energieemittierenden Fluorophoren, die durch Zersetzung von chemilumineszenten Verbindungen erzeugt werden, aufnimmt und seinerseits nachweisbare Energie ausstrahlt, jedoch sind diese Verbindungen nicht darauf beschränkt. Durch das Vorhandensein einer wirksamen Menge an Steigerungssubstanz oder -substanzen wird die Intensität des in wäßrigem Medium emittierten Lichtes durch die so stabilisierten Fluorophore beträchtlich gesteigert im Vergleich zu der Intensität des durch die gleichen Mengen an Fluorophoren emittierten Lichtes in Abwesenheit solcher Steigerungssubstanzen.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Mittel bzw. ein Verfahren für den gesteigerten Nachweis von elektro magnetischer, d. h. optisch nachweisbarer Energie bereitzu stellen, die durch die Zersetzung eines chemilumineszenten, ein Fluorophor umfassenden enzymatisch spaltbaren 1,2-Di oxetans freigesetzt wird, um das Vorhandensein, die Konzen tration oder Struktur eines Analyten zu bestimmen.

Fig. 1 zeigt graphische Darstellungen der Lumineszenzintensitätssignale, die in den TSH-Assays des Beispiels 46, die bei Vorhandensein (Kurve "A") und unter Abwesenheit (Kurve "B") von RSA durchgeführt wurden, erhalten wurden;

Fig. 2 zeigt graphische Darstellungen der Lichtemission, die aus der Zersetzung von dem Acridiniumester resultiert, der verwendet wurde, um die Anti-TSH-IgG des Beispiels 47 in Abwesenheit ("Kontrolle") und bei Vorhandensein ("Gesteigert") eines BDMQ/Fluorescindinatriumsalzsteigerungsmittels nachzuweisen;

Fig. 3 bis 5 zeigen die Lumineszenzratenspektren des emittierenden Dioxetanfragments mit und ohne Steigerungsmittel: ausgewertet in Beispiel 4 (0,1% BDMQ/Fig. 3) und Beispiel 7 (1,0% RSA/Fig. 4), zusammen mit dem Lumineszenzratenspektrum der Pufferkontrolle (Fig. 5) des Beispiels 30.

Fig. 6 zeigt eine graphische Darstellung der relativen Dreheinheiten (RDE) gegen die alkalische Phosphatasekonzentration für verschiedene Systeme des Beispiels 48.

Fig. 7 und 8 sind Reproduktionen von Photographien, die in Beispiel 49 beschrieben sind und eine Substratlösung ohne (Fig. 7) und mit (Fig. 8) RSA Steigerungsmittel zeigen.

Die Steigerungssubstanzen, die verwendet werden, sind wasserlösliche, natürlich auftretende oder synthetische Materialien, die eine hydrophobe Mikroumgebung von reduzierter Polarität für fluorophorhaltige Fragmente schaffen können, die aus der Zersetzung einer chemilumineszenten chemischen Verbindung resultieren, die in einem polaren Medium, d. h. einem Medium aus Wasser als Lösungsmittel oder einer Mischung aus Wasser und anderen in beträchtlichem Maße oder vollständigen polaren Substanzen, wie Methanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid enthalten ist.

Wie oben bemerkt, sind unter solchen Steigerungssubstanzen makromolekulare Globularproteine beinhaltet, im allgemeinen solche mit einem Molekulargewicht von ungefähr 1000 bis ungefähr 600 000 Daltons und vorzugsweise von ungefähr 40 000 bis ungefähr 100 000 Daltons, wie es durch SDS Gelelektrophorese bestimmt ist, die hydrophobe Stellen einschließen: Säugetierserumalbumine, wie RSA, MSA, AFP; Globularproteine wie Säugetier IgG, IgE, Protein A, Avidine; Serumlipoproteine, Apolipoproteine.

Synthetische, oligomere oder polymere Steigerungssubstanzen, die verwendet werden, beinhalten insbesondere wasserlösliche Poly(vinylaryl)quaternäre Ammoniumsalze, wie Poly(vinylbenzyl)quaternäre Ammoniumsalze mit der Formel

In dieser Formel können R₁, R₂ und R₃ jeweils eine geradkettige oder verzweigte, unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, einschließlich Methyl, Ethyl, n-Butyl, t-Butyl, Cetyl; eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, substituiert mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, Alkoxygruppen, z. B. Methoxy, Ethoxy, Benzyloxy oder Polyoxyethylethoxy, Aryloxygruppen, z. B. Phenoxy, Amino- oder substituierte Aminogruppen, z. B. Methylamino, Amidogruppen, z. B. Acetamido oder Cholesteryloxycarbonylamido, oder Fluoroalkangruppen oder Fluoroarylgruppen, z. B. Heptafluorobutyl; eine unsubstituierte Monocycloalkylgruppe mit 3 bis 12 Ringkohlenstoffatomen, einschließlich z. B. Cyclohexyl oder Cyclooctyl; eine substituierte Monocycloalkylgruppe mit 3 bis 12 Ringkohlenstoffatomen, substituiert mit ein oder mehreren Alkyl-, Alkoxy- oder fusionierten Benzogruppen, z. B. Methoxycyclohexyl oder 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl; einer Polycycloalkylgruppe mit zwei oder mehr fusionierten Ringen, die jeweils 5 bis 12 Kohlenstoffatome besitzen, unsubstituiert oder substituiert mit ein oder mehreren Alkyl-, Alkoxy- oder Arylgruppen, z. B. 1-Adamantyl oder 3-Phenyl-1-adamantyl; einer Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylgruppe mit mindestens einem Ring und 6 bis 20 Kohlenstoffatomen im Ganzen, unsubstituiert oder substituiert mit ein oder mehreren Alkyl- Aryl-, oder Fluoroalkan- oder Fluoroarylgruppen, z. B. Phenyl, Naphtyl, Pentafluorophenyl, Ethylphenyl, Benzyl, Hydroxybenzyl, Phenylbenzyl oder Dehydroabietyl; mindestens zwei der Substituenten R₁, R₂ und R₃ können zusammen mit dem quaternären Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten, unsubstituierten oder substituierten, stickstoffhaltigen, stickstoff- und sauerstoffhaltigen oder stickstoff- und schwefelhaltigen Ring mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Heteroatomen, der benzoaniliert sein kann, z. B. 1-Pyridyl,1-(3-alkyl oder aralkyl)imidazolium, Morpholino, Piperidino oder Acylpiperidino, Benzoxyzol, Benzdiazol oder Benzamidazol, bilden.

Das Symbol X⁻ stellt ein Gegenion dar, das alleine oder in Kombination Gruppen wie Halogenid, d. h. Fluorid, Chlorid, Bromid oder Jodid, Sulfat, Alkylsulfonat, z. B. Methylsulfonat, Arylsulfonat, z. B. p-Toluolsulfonat, substituiertes Arylsulfonat, z. B. Anilinonaphthylensulfonat (verschiedene Isomere), Lucifergelb CH und Diphenylanthracensulfonat, Perchlorat, Alkanoat, z. B. Acetat, Arylcarboxylat, z. B. Fluorescein oder Fluoresceinderivate, Benzoheterocycloarylcarboxycarbonate, z. B. 7-diethylamino-4-cyanocumarin-3-carboxylat, Phosphat oder substituiertes Monoaryloxyphosphat, z. B. ein 3-(2''-spiroadamantan)-4-methoxy-(3''-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetandianion oder andere Dianionen, die in Formel III, unten, gegeben sind, beinhaltet.

Das Symbol n stellt eine derartige Zahl dar, daß das Molekulargewicht der Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze von ungefähr 800 bis 200 000 reicht, und vorzugsweise von ungefähr 20 000 bis ungefähr 70 000, wie es durch die intrinsische Viskosität oder LALLS Techniken bestimmt wird.

Beispielhaft für solche wasserlöslichen Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze sind TMQ, BDMQ und dergleichen.

Diese vinylbenzylquaternären Ammoniumsalzpolymere können durch freie Radikalpolymerisation von geeigneten Vorläufermonomeren oder durch erschöpfende Alkylierung der entsprechenden tertiären Amine mit Polyvinylbenzylchlorid hergestellt werden. Das gleiche Ziel kann erreicht werden, indem man andere polymere Alkylierungsmittel, wie chloromethyliertes Polyphenylenoxid oder Polyepichlorhydrin verwendet. Die gleichen polymeren Alkylierungsmittel können als Initiatoren der Oxazolinring-Öffnungspolymerisation verwendet werden, die nach der Hydrolyse polyethylenimingepfropfte Copolymere ergibt. Solche Copolymere können dann quaternisiert werden, vorzugsweise mit Aralkylgruppen, wobei man die endgültige polymere Steigerungssubstanz erhält.

Wasserlösliche Acetale von einem Polyvinylalkohol und einem formylbenzylquaternärem Ammoniumsalz mit der Formel

wobei jeweils R₄ der gleiche oder ein unterschiedlicher aliphatischer Substituent ist und X₁ ein Anion darstellt, wie es von Bronstein-Bonte et al in US-Patent 4.124.388 offenbart und beansprucht wird, können auch als Steigerungssubstanzen eingesetzt werden. Und die einzelnen vinylbenzylquaternären Ammoniumsalzmonomere, die verwendet werden, um die Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze der Formel I herzustellen, können auch mit anderen vinylbenzylquaternären Ammoniumsalzmonomeren copolymerisiert werden, deren Polymere durch die Formel 1 dargestellt werden, oder mit anderen ethylenisch ungesättigten Monomeren ohne quaternäre Ammoniumfunktionalität, wobei man Polymere erhält, die von Land et al in US 4,322,489; von Bronstein-Bonte et al in US 4,340,522; von Land et al in US 4,424,326; von Bronstein-Bonte et al in US 4,503,138 und von Bronstein-Bonte in US 4,563,411 offenbart und beansprucht sind, wobei all diese Polymere auch als Steigerungssubstanzen verwendet werden können. Vorzugsweise haben diese quaternisierten Polymere Molekulargewichte innerhalb der oben angegebenen Bereiche für die Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze der Formel I.

Andere wasserlösliche, oligomere, homopolymere und copolymere Materialien können auch als Steigerungssubstanzen zusätzlich zu oder anstelle der zuvor genannten Polymere eingesetzt werden, einschließlich:

- Poly-N-vinyloxazolidinone;
- Polyvinylcarbamate (z. B. Polyvinylpropylencarbamat);
- Polyhydroxyacralate und -methacrylate (z. B. Poly (beta-hydroxyethyl)methacrylat und Polyethylenglycolmonomethacrylate);
- aminhaltige Oligomere (z. B. Jeffamine), die mit Alkylierungs- oder Aralkylierungsmitteln quaternisiert sind;
- synthetische Polypeptide (z. B. Polylysincophenylalanin);
- Polyvinylalkylether (z. B. Polyvinylmethylether);
- Polysäuren und deren Salze (z. B. Polyacrylsäuren, Polymethacrylsäuren, Polyvenylbenzoesäure, Polyethylensulfonsäure, Polyacrylamidomethylpropansulfonsäure, Polymaleinsäure und Poly(N-vinylsuccinamidinsäure);
- Polyacrylamide und Polymethacrylamide, abgeleitet von Ammoniak oder cyklischen und acyclischen primären oder sekundären Aminen;
- Polyvinylalkohol und Polyvinylalkoholcopolymere mit Vincylacetat, Ethylen;
- Poly 2-, 3- oder 4-vinylpyridiniumsalze, bei denen das heterocyclische Stickstoffatom an eine Gruppe gebunden ist, die durch R₁, R₂ und R₃ in der obigen Formel I gegeben ist;
- Polyvinylalkylpyrrolidinone (z. B. Polyvinylmethylpyrrolidinon);
- Polyvinylalkyloxazolidone (z. B. Polyvinylmethyloxazolidone);
- verzweigte Polyethylenimine, acylierte, verzweigte Polyethylenimine oder acylierte, verzweigte Polyethylenimine, die weiter mit Alkyl- oder Aralkylgruppen quaternisiert sind;
- Poly N-vinylamine, abgeleitet von Ammoniak oder cyclischen und acyclischen, primären oder sekundären Aminen und Salzen davon;
- Polyvinylpiperidin;
- Polyacryloyl, Polymethacryloyl oder 4-vinylbenzoylaminimide, bei denen die drei Substituenten an dem positiv geladenen Stickstoffatom die in der obigen Formel I definierten R₁₁ R₂ und R₃ Gruppen sein können.

Auch hier haben diese oligomeren oder polymeren Steigerungssubstanzen vorzugsweise Molekulargewichte innerhalb des Bereichs, der oben für die Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze der Formel I gegeben sind.

Wasserlösliche, monomere, quaternäre Seifen, deren Stickstoffatom mindestens einen Benzylsubstituenten hat, und in denen die verbleibenden Stickstoffsubsituenten den für R₁, R₂, R₃ und X in der obigen Formel I gegebenen Definitionen entsprechen, z. B. Cetyldimethylbenzylammoniumchlorid oder Cetyldibenzylmethylammoniumbromid, können auch als Steigerungssubstanzen eingesetzt werden.

Die Menge der Steigerungssubstanz oder der Mischung der Steigerungssubstanzen, die verwendet werden, können innerhalb weiter Grenzen in Abhängigkeit von der speziellen gewählten Steigerungssubstanz, der Menge und der Art der vorliegenden chemilumineszenten Verbindung variieren. Zum Beispiel weisen bestimmte Steigerungssubstanzen, wie RSA, eine optimale Konzentration auf, die vornehmlich von der vorliegenden chemilumineszenten Verbindung abhängt, jenseits der die Zugabe von weiteren Mengen an Steigerungsmitteln keinen weiteren Anstieg in der Lichtintensität erzeugt. Andere Steigerungsmittel, wie TMQ, liefern eine erhöhte Steigerung mit erhöhter Konzentration. Im allgemeinen werden jedoch Mengen an Steigerungssubstanz, die von ungefähr 0,01% bis ungefähr 25%, und vorzugsweise von ungefähr 0,1% bis ungefähr 5%, in Bezug auf das Gewicht des Steigerungsmittels, geteilt durch das Gewicht des wäßrigen Mediums, reichen, eingesetzt.

Jede chemilumineszente chemische Verbindung, die (1) dazu angeregt werden kann, unter Zersetzung eine Gruppe in einem angeregten Zustand zu ergeben, wobei diese Gruppe einen heteropolaren Charakter besitzt, der sie empfindlich für Umgebungseinflüsse macht, und die insbesondere dazu angeregt werden kann, in einer polar protischen Umgebung die Lumineszenz zu dämpfen oder auszulöschen, und die (2) dazu geeignet ist, das Vorhandensein, die Konzentration oder Struktur einer Substanz in einer polar protischen Umgebung, insbesondere einer Substanz in einer wäßrigen Probe, zu bestimmen, kann) (verwendet werden.

1,2-Dioxetane, wie die enzymatisch spaltbaren Dioxetane und ihre thermisch, chemisch und elektrochemisch spaltbaren Analoge, bilden die Klasse von verwendbaren chemilumineszenten chemischen Verbindungen. Diese 1,2-Dioxetane können durch die allgemeine Formel

dargestellt werden. In dieser Formel ist T eine unsubstituierte oder substituierte Cycloalkyl-, Aryl-, Polyaryl- oder Heteroatomgruppe, z. B. eine unsubstituierte Cycloalkylgruppe mit 6 bis 12 Ringkohlenstoffatomen; eine substituierte Cycloalkylgruppe mit 6 bis 12 Ringkohlenstoffatomen und ein oder mehreren Substituenten, die eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen sein können, oder eine Heteroatomgruppe, die eine Alkoxygruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen sein kann, wie Methoxy oder Ethoxy, eine substituierte oder unsubstituierte Aryloxygruppe, wie Phenoxy oder Carboxyphenoxy, oder eine Alkoxyalkyloxygruppe, wie Methoxyethoxy oder Polyethylenoxy, oder eine Cycloalkylidengruppe, die an das 3-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings durch eine Spirobindung gebunden ist und 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine fusionierte Polycycloalkylidengruppe, die an das 3-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings durch eine Spirobindung gebunden ist und zwei oder mehr fusionierte Ringe aufweist, die jeweils 5 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen, z. B. eine Adamant-2-ylidengruppe.

Das Symbol Y bedeutet eine lichtemittierende, Fluorophor bildende fluoreszente Chromophorgruppe, die in der Lage ist, Energie zu absorbieren, um einen angeregten Energiezustand zu bilden, von dem sie optisch nachweisbare Energie emittiert und dabei in ihren ursprünglichen Energiezustand zurückkehrt.

Das Symbol X₂ bedeutet Wasserstoff oder eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl- oder Cycloheteroalkylgruppe, z. B. eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; eine geradkettige oder verzweigte Hydroxyalkylgrupe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, oder eine -OR Gruppe, in der R eine C₁-C₂₀ unverzweigte oder verzweigte, unsubstituierte oder substituierte, gesättigte oder ungesättigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Aralkenylgruppe, fusionierte Ringcykloalkyl-, Cykloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Aralkenylgruppe ist, oder eine N- oder O- oder S-Heteroatomhaltige Gruppe, oder eine enzymspaltbare Gruppe, die eine Bindung enthält, die durch ein Enzym gespalten werden kann, wobei eine elektronenreiche. Gruppe erhalten wird, die an den Dioxetanring gebunden ist. Vorzugsweise ist X₂ eine Methoxygruppe.

Das Symbol Z bedeutet Wasserstoff (in diesem Fall kann das Dioxetan thermisch durch Aufbrechen der Sauerstoff-Sauerstoffbindung gespalten werden), eine chemisch spaltbare Gruppe, wie eine Hydroxylgruppe, eine Alkanoyl oder Aroylestergruppe oder eine Alkyl oder Arylsilyloxygruppe, oder eine enzymspaltbare Gruppe, die eine durch ein Enzym spaltbare Bindung enthält, wobei man eine elektronenreiche Gruppe, die an den Dioxetanring gebunden ist, erhält, z. B. eine Bindung, die, wenn sie gespalten wird, ein Sauerstoffanion, ein Schwefelanion oder ein Stickstoffanion, und insbesondere ein Amidoanion, wie ein Sulfonamidoanion, ergibt.

Ein oder mehr der Substituenten T, X₂ und Z können auch einen Substituenten einschließen, der die Wasserlöslichkeit des 1,2-Dioxetans erhöht, wie eine Carbonsäure, Sulfonsäure oder eine quaternäre Amoniumsalzgruppe, wobei mindestens einer der Substituenten X₂ und Z, und vorzugsweise Z, eine enzymspaltbare Gruppe ist, und vorzugsweise eine enzymspaltbare Phosphatestergruppe, und X₂ und Y können zusammen eine fusionierte Fluoreszenzchromophorgruppe bilden, die an das 4-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings durch eine Spirobindung gebunden ist, z. B. eine Verbindung mit der allgemeinen Formel:

In dieser Formel ist X₃

-O-, -S- oder -NR₉, wobei jeder der Substituenten R₇, R₈ und R₉ unabhängig voneinander Wasserstoff, eine verzweigte oder geradkettige Alkylkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, n-Butyl oder Decyl-, eine verzweigte oder geradkettige Heteroalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, z. B. Methoxy, Hydroxyethyl oder Hydroxypropyl; eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Phenyl; eine Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Pyrrolyl oder Pyrazolyl; eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen im Ring, z. B. Cyclohexyl; eine Heterocycloalkylgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen im Ring, z. B. Dioxan; eine Aralkylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Benzyl; eine Alkarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Tolyl; oder eine wie oben definierte enzymspaltbare Gruppe ist; und jeder der Substituenten R₆ kann unabhängig voneinander Wasserstoff; eine elektronenziehende Gruppe, wie eine Perfluoroalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, z. B. Trifluormethyl; ein Halogen; CO₂H, Z₁CO₂H, SO₃H, NO₂₁ Z₁NO₂, C=N oder Z₁C=N, wobei Z₁ eine verzweigte oder geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, z. B. Methyl, oder eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Phenyl, ist; eine elektronen spendende Gruppe, z. B. eine verzweigte oder geradkettige C₁-C₇ Alkoxygruppe, z. B. Methoxy oder Ethoxy; eine Aralkoxygruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Phenoxy; eine verzweigte oder geradkettige C₁-C₇ Hydroxyalkylgruppe, z. B. Hydroxymethyl oder Hydroxyethyl; eine Hydroxyarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Hydroxyphenyl; eine verzweigte oder geradkettige C₁-C₇ Alkylestergruppe, z. B. Acetat; oder eine Arylestergruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Benzoat; eine Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Benzoxazol, Benzthiazol, Benzimidazol oder Benztriazol; oder Wasserstoff oder eine enzymspaltbare oder chemisch spaltbare Gruppe Z, wie sie hier definiert ist, sein, wobei mindestens einer der Substituenten R₆ Z darstellt. Des weiteren können alle der R₆-Gruppen zusammen einen Ring bilden, der substituiert oder unsubstituiert sein kann, und einer oder mehrere der Substituenten T, X₂ und Z können auch einen Substituenten beinhalten, der die Wasserlöslichkeit des 1,2-Dioxetans erhöht, wie eine Carbonsäure, Sulfonsäure oder eine quaternäre Amoniumsalzgruppe.

Unter diesen Substanzen, deren Reste in solchen 1,2-Dioxetanen als fluoreszierender Chromophor (Y oder

vorliegen können, sind beinhaltet:

- Anthracene und Anthracenderivate, z. B. 9,10-diphenylanthracen, 9-methylanthracen, 9-anthracencarboxaldehyd, Anthrylalkohol und 9-phenylanthracen;
- Rhodamine und Rhodaminderivate, z. B. Rhodole, Tetramethylrhodamin, Tetraethylrhodamin, Diphenyldimethylrhodamin, Diphenyldiethylrhodamin und Dinaphtylrhodamin;
- Fluorescein und Fluoresceinderivate, z. B. 5-Iodoacetamidofluorescein, 6-Iodoacetamidofluorescin und Fluorescein-5-Maleimid;
- Coumarin und Coumarinderivate, z. B. 7-Dialkylamino-4-methylcoumarin, 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin und 4-bromomethyl-7-hydroxycoumarin;
- Erythrosin und Erythrosinderivate, z. B. Hydroxyerythrosine, Erythrosin-5-iodoacetamid und Erythrosin-5-maleimid;
- Aciridin und Aciridinderivate, z. B. Hydroxyaciridin und 9-methylaciridin;
- Pyren und Pyrenderivate, z. B. N-(1-pyren)iodoacetamid, Hydroxypyrene und 1-pyrenmethyliodoacetet;
- Stilben und Stilbenderivate, z. B. 6,6'-dibromstilben und Hydroxystilbene;
- Naphthalin und Naphtalinderivate, z. B. 5-dimethylaminonaphthalin-1-sulfonsäure und Hydroxynaphthaline;
- Nitrobenzoxadiazole und Nitrobenzoxadiazolderivate, z. B. Hydroxynitrobenzoxadiazole, 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, 2-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol,4-yl) methylaminoacetaldehyd und 6-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-aminohexansäure;
- Chinolin und Chinolinderivate, z. B. 6-hydroxychinolin und 6-aminochinolin;
- Acridin und Acridinderivate, z. B. N-methylacridin und N-phenylacridin;
- Acidoacridin und Acidoacridinderivate, z. B. 9-methylacidoacridin und Hydroxy-9-methylacidoacridin;
- Carbazol und Carbazolderivate, z. B. N-methylcarbazol und Hydroxy-N-methylcarbazol;
- Fluoreszierende Cyanine, z. B. DCM (ein Laserfarbstoff), Hydroxycyanine, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrien, 1-(4-dimethylaminophenyl)-t-phenylhexatrien und die entsprechenden 1,3-butadiene;
- Carbocyanine und Carbocyaninderivat, z. B. Phenylcarbocyanin und Hydroxycarbocyanine;
- Pyridiniumsalze, z. B. 4(4-dialkyldiaminostyryl)N-methylpyridiniumiodat und Hydroxy-substituierte Pyridiniumsalze;
- Oxonole; und
- Resorofine und Hydroxyresorofine.

Wenn man ein enzymatisch spaltbares 1,2-Dioxetan einsetzt, dann kann die Spaltung unter Verwendung eines Enzyms wie einer alkalischen Phosphatase erfolgen, die eine Bindung in z. B. einem Z-Substituenten, wie einer Phosphatestergruppe, spalten wird unter Bildung eines Y-Anions in einem Landungstransferzustand, der seinerseits das Dioxetan destabilisieren wird und seine Sauerstoff-Sauerstoffbindung spaltet. Die Spaltung kann auch dadurch erreicht werden, indem man ein Enzym, wie ein Oxydoreduktaseenzym, verwendet, das die Sauerstoff-Sauerstoffverbindung direkt spaltet.

Neben einer Phosphatase-Ester-Gruppe kann Z in den obigen Formeln III und IV auch eine enzymspaltbare Alkanoyloxygruppe, z. B. eine Acetatestergruppe, oder eine Oxacarboxylatgruppe, 1-phospho-2,3-diacylglyceridgruppe, 1-thio-D-glucosidgruppe, Adenosintriphosphatanaloge Gruppe, Adenosindiphosphatanaloge Gruppe, adenosinmonophosphatanaloge Gruppe, adenosinanaloge Gruppe, alpha-D-galactosidgruppe, beta-D-galactosidgruppe, alpha-D-glucosidgruppe, beta-D-glucosidgruppe, alpha-D-mannosidgruppe, beta-D-mannosidgruppe, beta-D-fructofuranosidgruppe, beta-D-glucosiduronatgruppe, p-toluolsulfonyl-L-argininfarbstoffestergruppe oder p-toluolsulfonyl-L-argininfarbstoffamidgruppe sein.

Bevorzugte enzymatisch spaltbare 1,2-Dioxetane sind die 3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoroyloxy)phe nyl-1,2-dioxetansalze, die durch die Formel

dargestellt sind, wobei M⁺ ein Kation wie ein Alkalimetall, z. B. Natrium oder Kalium, Ammonium oder C₁-C₇ Alkyl, Aralkyl oder aromatisches quaternäres AmmoniumKation, N(R₅)₄⁺, in dem R₅ jeweils Alkyl, z. B. Methyl oder Ethyl, Aralkyl, z. B. Benzyl, darstellt oder einen Teil eines heterocyclischen Ringsystems, z. B. Pyridinium, und insbesondere das Dinatriumsalz, bildet.

Eine andere Klasse von chemilumineszenten Verbindungen beinhaltet Acridiniumester oder die Phenanthradiniumderivate, in denen einen Phenoxycarbonylgruppe in der Position 9 an einem N-substituierten Acridinteil vorliegt, z. B. Verbindungen mit der allgemeinen Formel:

wobei R₁₀ z. B. eine C₁-C₁₀ geradkettige oder verzweigte Alkyl oder Alkoxygruppe ist; eine Arylgruppe, vorzugsweise eine Arylgruppe mit einem einzelnen Arylring, z. B. Phenyl; eine Aminogruppe; eine Hydroxylgruppe; eine carbonylhaltige Gruppe, z. B. eine Acetylgruppe oder eine Carbonsäure- oder Estergruppe; R₁₁ kann die Bedeutung wie R₁₀ besitzen und kann Wasserstoff, einen fusionierten Benzoring oder eine Gruppe, geeignet für die Konjugation mit Proteinen oder Nucleinsäuren, z. B. eine Isothiocyanatgruppe, eine N-hydroxysuccinimidestergruppe, Biothin oder Avidine darstellen, und X₄ ist ein Gegenion, das alleine oder in Kombination ein Halogenid, Sulfat, Alkylsulfonat, Arylsulfonat, substituiertes Arylsulfonat, Perchlorat, Alkanoat, Arylcarboxylat, Heteroarylcarboxylat, Phosphat oder substituiertes Monoaryloxyphosphat, ein anionisches Oligomer oder ein anionisches Homopolymer oder Copolymer beinhalten kann.

Diese Acridiniumester bewirken bei Vorhandensein eines Peroxids, wie Wasserstoffperoxid, und einer alkalischen Substanz, z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, eine Chemilumineszenz von dem angeregten Zustand des N-substituierten Acridons aus, das durch Spaltung des Phenoxyesterteils des Moleküls gebildet wurde.

Ein oder mehrere Hilfsfluorophore, die nicht zu den lichtemittierenden Fluorophoren gehören, die durch Zersetzung der vorhandenen chemilumineszierenden Verbindungen erzeugt werden, die Energie, insbesondere Licht, von energieemittierenden Fluorophoren aufnehmen, die durch Zersetzung der chemilumineszenten Verbindungen erzeugt werden und ihrerseits nachweisbare Energie, wiederum vorzugsweise Licht, aussenden, können auch verwendet werden. Unter diesen Hilfsfluorophoren, die alleine oder in Kombination verwendet werden können, sind die oben aufgeführten Substanzen, deren Reste in 1,2-Dioxetanen als fluoreszente Chromophorgruppen vorhanden sein können. Fluorescein und Fluoresceinderivate, einschließlich Derivate, die in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit der Steigerungssubstanz zu bilden, sind besonders für die Verwendung als Hilfsfluorophore bevorzugt.

Diese Hilfsfluorophore können einfach mit der Steigerungssubstanz und der chemilumineszenten Verbindung vermengt werden, oder werden an eine oder beide dieser Materialien gebunden. Phycobiliproteine bilden eine natürlich auftretende Klasse von Steigerungsmolekülen, in denen ein Fluorophor kovalent an ein Protein gebunden ist. Wenn das Hilfsfluorophor an eine chemilumineszente Verbindung gebunden wird, dann wird es vorzugsweise an den Teil der chemilumineszenten Verbindung gebunden, der bei Zersetzung ein Fragment bildet, das den fluorophoren Teil des Moleküls der chemilumineszenten Verbindung enthält. Auf diese Weise wird der Energietransfer durch die beiden Fluorophore, die in großer Nachbarschaft zueinander vorliegen, gesteigert. Hilfsfluorophore, die unlöslich oder teilweise unlöslich im wäßrigen Medium sind, können löslich gemacht werden, indem man sie zunächst auf löslich machende Moleküle, z. B. wasserlösliche Oligomere oder Polymermoleküle, pfropft.

Beim Vermengen mit der Steigerungssubstanz und der chemilumineszenten Verbindung kann die Menge des vorhandenen Hilfsfluorophors von ungefähr 1 µg/ml bis ungefähr 10 mg/ml der das Steigerungsmittel enthaltenden Lösung, und vorzugsweise 1 µg/ml bis ungefähr 100 µg/ml der das Steigerungsmittel enthaltenden Lösung, betragen.

Wenn die Hilfsfluorophore kovalent an das Protein gebunden verwendet werden, dann kann das molare Verhältnis des Fluorophors zum Protein von 1 bis 60 und vorzugsweise (z. B. bei RSA) von 1 bis 6, pro Proteinmolekül, reichen.

Die beschriebene Vorgehensweise ist insbesondere nutzvoll, wenn man Immunoassays durchführt, und zwar solche, die verwendet werden, um ein Enzym oder ein Teil eines spezifischen Bindungspaares, z. B. ein Antigen-Antikörper-Paar oder eine Nucleinsäure, die mit einer Probe gepaart ist, die in der Lage ist, sich an die gesamte Nucleinsäure oder an einen Teil davon zu binden, nachzuweisen. Solche Assays beinhalten Immunoassays, die dazu verwendet werden, ein Hormon, wie beta-humanchorionisches Gonadotrobin (beta-hCG), thyroidstimulierendes Hormon (TSH), follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), nachzuweisen, Zelloberflächenrezeptorassays und Nukleinsäureassays, die verwendet werden, um Viren, z. B. HIV oder HTLV III und Cytomegalovirus, oder Bakterien, z. B. E. Coli, nachzuweisen, und Histocompatibilitätsassays; typische Assayprotokolle sind in den Arbeitsbeispielen unten aufgeführt. Es kann auch bei Assays für einen chemischen Analyten, wie Kalium und Natriumionen, oder in Assays für Substanzen, wie Cholesterol oder Glucose, in denen der Analyt zersetzt wird, z. B. unter Verwendung eines Enzyms, wie Cholesteroloxydase oder Glucoseoxydase, unter Bildung einer Substanz, z. B. Wasserstoffperozid, das in der Lage ist, die chemilumineszente Verbindung zu zersetzen, eingesetzt werden. Um den Fachmann die vorliegende Erfindung verständlicher zu machen, sind die folgenden Beispiele angegeben.

Beispiele 1 bis 45

Die Steigerungssubstanzen, die in der Tabelle 1 aufgeführt sind, in der alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind, wenn es nicht anderweitig festgehalten ist, wurden hinsichtlich ihrer Lichtintensitätssteigerungseigenschaften bewertet, indem man die geeignete Menge des Steigerungsmittels in 0,05 M Carbonatpufferlösung, die 1 mM Magnesiumchlorid (pH = 9,5) enthielt, gelöst, um die festgelegten Konzentrationen zu erhalten. Zu 1 ml Proben von jeder der erhaltenen Lösungen (einschließlich der Kontrolle, Beispiel 31, die kein Steigerungsmittel enthielt), wurde dann ausreichend 3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl- 1,2-dioxetandinatriumsalz, gelöst in der gleichen Carbonatpufferlösung, die für die Lösung des Stei gerungsmittels verwendet wurde, gegeben, um eine Endkonzentration der chemilumineszierenden Verbindung von 0,125 mM zu erhalten. Die erhaltenen Lösungen wurden dann auf 30°C equilibriert, worauf eine wäßrige alkalische Phosphataselösung hinzugegeben wurde, um eine Endenzymkonzentration von 4.17 × 10^-10 M zu erhalten. Das Lumineszenzsignal jeder Lösung wurde dann bei 30°C in einem Luminometer, das über 20 Minuten integrierte, gemessen. Erfolgreiche Steigerungsmittel oder Mengen an Steigerungsmittel waren solche, die einen Steigerungsfaktor größer als 1, z. B. größer als der der Probe, Beispiel 30, die die chemilumineszierende Verbindung, jedoch nicht das Steigerungsmittel, enthielt ergaben.

TABELLE 1

1 0,01 µg/ml Fluorescein zugegeben.

2 Benzyldimethylcetylammoniumchlorid; TCI.

3 Polymethacrylamidopropylenmethylammoniumchlorid; Polyscience.

4 Polyvinylpyrrolidon; GAF.

5 Polyethyloxazolin; Dow Chemicat Co.

6 Polyvinylpyrrolidinon; CTAF.

7 1,5-Dimethyl-1,5-diaza-undecamethylenpolymethobromid; Aldrich

8 von Staphylococcus abgeleitet; Sigma.

9 Polyethylenimin; Dow Chemical Co.

10 Polyethylenoxid; Union Carbide Corp.

11 Algininsäure (Natriumsalz); Merck.

12 Natriumcellulosesulfat; Merck.

13 Polyethylenpropylenglycol; BASF Wyandotte.

14 Polyoxazolin; Dow Chemical Co.

15 1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadecan; Aldrich.

16 Kat.-Nr. G0378; Sigma.

17 Polyvinylhydrogenphthalat; Eastman Kodak 5527.

18 Polyethylenglycol, Molekulargewicht 8000, zur biologischen Verwendung, P2139; Sigma.

19 Alginate; Kelco Co.

20 Polyethylenoxid; Union Carbide.

Die Lichtemissionsspektren der Proben der Beispiele 4, 7 und 30 sind in den Fig. 3, 4 und 5 gezeigt, wobei die gemessene Lichtintensität auf der Abszisse (X-Achse) und die Zeit auf der Ordinate (Y-Achse) bei jedem Plot aufgetragen ist.

BEISPIEL 46

Ein TSH-Assay wurde wie folgt ausgeführt:

Materialien

Monoklonaler anti-TSH-beta Antikörper von Mäusen wurde verwendet, um 0,3 cm- Perlen für das Einfangen des Analyten zu beschichten. Monoklonaler anti-TSH Antikörper von Mäusen wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiert und als Nachweisantikörper verwendet.

TSH wurde von Calbiochem, Katalog Nr. 609396 erhalten und RSA (Typ V - freie Fettsäure) wurde von Sigma, Katalog Nr. A6003 erhalten.

Die für den Analyten und das Konjugat verwendete Pufferlösung enthielt 0,1 M Tris-HCl, 1 mM MgCl₂ und 2 Gewichtsprozent RSA (pH = 7,5). Die Substratpufferlösung enthielt 0,1 M Tris, 0,1 mM MgCl₂, 0,1 Gewichtsprozent RSA (pH = 9,5) und 3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl- 1,2-dioxetandinatriumsalz als chemilumineszierende Verbindung (50 µg/ml).

Protokoll

15 µl einer TSH-haltigen Analytlösung wurden mit 135 µl der Konjugatantikörperlösung vermengt. Zwei 0,3 cm- Perlen, die wie oben beschrieben beschichtet wurden, wurden zu der Lösung hinzugegeben, und es wurde 2 Stunden lang bei 23°C inkubiert. Die Perlen wurden dann viermal mit 0,1 M Tris (pH = 7,5) gewaschen und zu einer Reaktionsröhre überführt. 200 µl der gleichen chemilumineszenten Verbindung, die in der oben beschriebenen Substratpufferlösung verwendet wurde, wurden zu der Röhre gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten wurde die Lichtemission als 10 Sekunden Zählungen unter Verwendung eines Lumineszenz-Analysegerätes aufgezeichnet.

Ein identischer TSH-Assay wurde auch mit der gleichen Konzentration an Substrat in dem gleichen Puffer ohne RSA für Vergleichszwecke durchgeführt. Wie in Fig. 1, ein Plot der Daten der Tabelle II, gezeigt wird, wies die RSA-haltige Probe (Kurve A) eine größere Lumineszenzintensität für eine gegebene TSH-Konzentration im Vergleich mit der Probe ohne RSA (Kurve B) auf.

Tabelle II

BEISPIEL 47

Die Steigerung der Acridiniumesterliumineszenz aus einem anti-TSH-IgG-acridiniumester ("AE") Konjugat (Ciba-Corning) wurde durch das folgende Verfahren gezeigt.

Zu 50 µl Teilen-von anti-TSH-IgG-AE-Konjugat, die 30 mg IgG/ml mit 2-3 Markierern in Luminometerröhren enthielten, wurden die Mengen einer wäßrigen Lösung, die 0,1% BDMQ und 0,01 mg/ml des Fluoresceindinatriumsalzes, das in Tabelle III angegeben ist, enthielt, gegeben. Jede Röhre wurde in ein Luminometer gestellt, und eine Lumineszenzreaktion wurde initiiert, indem man 200 µl einer 50 mM wäßrigen Natriumhydroxidlösung, die 0,05% Wasserstoffperoxyd enthielt, injizierte.

Die BDMQ/Fluorescein-gesteigerte Lichtemission aus dem Acridiniumester wird bei 10 und 50 µl im Vergleich zur Kontrolle in der Tabelle III gezeigt und durch die Plots der Fig. 2 verdeutlicht.

Tabelle III

BEISPIEL 48

Ein Assay für alkalische Phosphatase wurde in der folgenden Weise durchgeführt:

Komponenten

Puffer:
0,05 M Karbonat, 1 mM MgCl₂

(pH 9,5)
Substrat:
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phospho ryloxy)phenyl-1,2-dioxetandinatriumsalz bei einer Konzentration von 0,4 mM
Alkalische Phosphatase:
Stammlösung mit 1,168 µg/ml in den Puffer
Untersuchte Steigerungssysteme:

1. Puffer alleine, Kontrolle
2. Puffer plus 0,1% RSA
3. Puffer plus 0,1% RSA-Fluorescein (molares Verhältnis von RSA zu Fluorescein von 1 bis 3)
4. Puffer plus 0,1% BDMQ
5. Puffer plus 0,1% BDMQ und Fluorescein (es wurden 0,01 mg an Fluoresceindinatriumsalz pro ml BDMQ zugegeben).

Serienverdünnungen der alkalischen Phosphatasestammlösungen wurden in Röhren mit den Endenzymkonzentrationen durchgeführt:

4,17 × 10^-11M	1,67 × 10^-15M
8,34 × 10^-12M	8,34 × 10^-16M
1,67 × 10^-12M	4,17 × 10^-16M
3,34 × 10^-13M	2,09 × 10^-16M
6,68 × 10^-14M	1,0 × 10^-16M
1,34 × 10^-14M	5,0 × 10^-17M
3,34 × 10^-15M	2,5 × 10^-17M

Verfahren

Duplikatröhren mit jeweils den obigen Konzentrationen an alkalischer Phosphatase, die auch 0,4 mM 3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl- 1,2-dioxetandinatriumsalz in verschiedenen Steigerungssystemen enthielten, wurden bei 30°C inkubiert. Die Systeme 1, 4 und 5 wurden 20 Minuten lang inkubiert, während die Systeme 2 und 3 80 Minuten lang inkubiert wurden.

Nach der Inkubation wurden 30 Sekunden Lichtintegrale in einem Luminometer gemessen und die Wirkung der Steigerungsmittel, die hinsichtlich der Grenzen der Nachweisbarkeit der alkalischen Phosphatase untersucht wurde, ist in Tabelle IV gezeigt.

TABELLE IV

BEISPIEL 49

Die Fähigkeit, Lumineszenz fotografisch mit den Mitteln dieser Erfindung nachzuweisen, wurde auf folgende Weise bewiesen:

Komponenten

Puffer:
0,1 M Tris, 1 mM MgCl₂

bei einem pH Wert von 9,8, hergestellt mit 0,1% RSA und ohne RSA (RSA wurde von Sigma, Katalog Nr. A7906) gekauft
Enzym:
0,05 µg alkalische Phosphatase (3,6 × 10^-13

mol)
Membran:
Nitrocellulose mit einer Porengröße von 0,45 µm
Substrat:
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phos phoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan dinatriumsalz bei einer Konzentration von 0,08 mM.

Protokoll

Die Enzymlösung wurde auf eine trockene Nitrozellulose membran gesprüht. Anschließend wurde die Membran mit 2,5% Trockenmilchfeststoffen und 1% Fischgelatine in phosphatgepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 7,3 geblockt. Die geblockte Membran wurde mit der Substratlösung in Puffern, die kein RSA enthielten, und mit RSA gewaschen.

Die Membran wurde in ein Kameraluminometer gegeben und die 10 Minuten Belichtungen wurden auf einem Film aufgezeichnet. Die Wiedergaben der erhaltenen Fotografien erscheinen in den Fig. 7 und 8.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Kon zentration oder Struktur eines Analyten, bei dem in einem wäßrigen Medium elektromagnetische Energie, die durch die Zersetzung eines chemilumineszenten, ein Fluorophor umfas senden enzymatisch spaltbaren 1,2-Dioxetans freigesetzt wird, nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in Gegenwart einer makromolekularen was serlöslichen Substanz durchgeführt wird, deren Menge aus reichend ist, um die Intensität der freigesetzten, nach weisbaren Energie im Vergleich zu der Intensität der nach weisbaren Energie, die in Abwesenheit der Steigerungssub stanz freigesetzt wird, zu steigern, wobei die Steigerungs substanz die Fähigkeit besitzt, das Fluorophor daran zu hindern, Energie durch strahlungslose Übergänge freizuge ben, und eine hydrophobe Mikroumgebung für das Fluorophor zu schaffen, und wobei die makromolekulare Substanz ein Globularprotein ist, das hydrophobe Stellen beinhaltet, oder die makromolekulare Substanz ein oligomeres oder poly meres quaternäres Ammoniumsalz umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das Globularprotein ein Säugetier serumalbumin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das quaternäre Ammoniumsalz ein Poly(vinylaryl)quaternäres Ammoniumsalz ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre Ammo niumsalz Poly(vinylbenzyltrimethyl)ammoniumchlorid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre Ammo niumsalz/Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl))ammoniumchlorid ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das 1,2-Dioxetan ein 3- (2'-spiroadamantan)-4-methoxy-(3'-phosphoryloxy)phenyl- 1,2-dioxetansalz ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hilfsfluorophor zu gegeben wird, das in der Lage ist, die bei Zersetzung der chemilumineszenten Verbindung erzeugte Energie von dem Fluorophor aufzunehmen, und seinerseits nachweisbare Ener gie auszustrahlen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hilfsfluorophor mit der chemilu mineszenten Verbindung und der Steigerungssub stanz vermengt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hilfsfluorophor an den Teil der chemilumineszenten Verbindung gebunden wird, der bei Zer setzung das energieemittierende Fluorophor erzeugt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Hilfsfluorophor ein Fluorescein ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hilfsfluorophor an die Steige rungssubstanz gebunden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hilfsfluorophor ein derivati siertes Fluorescein ist, das in der Lage ist, eine kova lente Bindung mit der Steigerungssubstanz zu bilden.

13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei einem Immunoassay.

14. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei einem Nucleinsäureprobeassay.

15. Wäßrige Zusammensetzung aus einem chemilumineszenten, ein Fluorophor aufweisenden enzymatisch spaltbaren 1,2-Di oxetan und einer makromolekularen wasserlöslichen Substanz, deren Menge ausreichend ist, um die Intensität der freige setzten nachweisbaren Energie im Vergleich zu der Intensi tät der nachweisbaren Energie, die bei Abwesenheit der Steigerungssubstanz freigesetzt wird, zu steigern, wobei die Steigerungs substanz die Fähigkeit besitzt, das Fluorophor daran zu hindern, Energie durch strahlungslose Übergänge freizuge ben, und eine hydrophobe Mikroumgebung für das Fluorophor zu schaffen, und wobei die makromolekulare Substanz ein Globularprotein ist, das hydrophobe Stellen beinhaltet, oder die makromolekulare Substanz ein oligomeres oder poly meres quaternäres Ammoniumsalz umfaßt.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch ge kennzeichnet, daß das Globularprotein ein Säu getierserumalbumin ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch ge kennzeichnet, daß das quaternäre Ammoniumsalz ein Poly(vinylaryl)quaternäres Ammoniumsalz ist.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch ge kennzeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyltrimethyl)ammoniumchlorid ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch ge kennzeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl))ammonium chlorid ist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch ge kennzeichnet, daß die Steigerungssubstanz ein Phycobiliprotein umfaßt.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Hilfs fluorophor enthält, das in der Lage ist, die bei Zersetzung der chemilumineszenten Verbindung erzeugte Energie aus dem Fluorophor aufzunehmen und seinerseits nachweisbare Energie auszustrahlen.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch ge kennzeichnet, daß das Hilfsfluorophor ein Fluorescein ist.