DE3921609C2 - Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Konzentration oder der Struktur eines Analyten - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Konzentration oder der Struktur eines AnalytenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des
Vorhandenseins, der Konzentration oder Struktur eines Ana
lyten, bei dem in einem wäßrigen Medium elektromagnetische
Energie, die durch die Zersetzung eines chemilumineszenten,
ein Fluorophor umfassenden enzymatisch spaltbaren 1,2-Di
oxetans freigesetzt wird, nachgewiesen wird, wie es aus der
WO 88/00695 A1 bekannt ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen verstärkten Nachweis von
elektromagnetischer Energie, die durch die Zersetzung von
chemilumineszenten Verbindungen, die zur Bestimmung des
Vorhandenseins, der Konzentration oder Struktur einer
Substanz in einer wäßrigen Probe eingesetzt werden,
freigesetzt wird, insbesondere wenn solche
chemilumineszenten Verbindungen eingesetzt werden, um das
Vorhandensein von chemischen oder biologischen Substanzen
durch fachbekannte Immunoassaytechniken, chemischen Assays
oder Nukleinsäureprobenassays nachzuweisen oder ihre
Konzentration zu bestimmen, oder wenn sie als direkte
chemische/physikalische Proben zur Untersuchung der
molekularen Strukturen oder Mikrostrukturen verschiedener
Makromoleküle, wie synthetische Polymere, Proteine,
Nukleinsäuren, verwendet werden.
Die Zersetzung von chemilumineszenten chemischen
Verbindungen unter Ausstrahlung von elektromagnetischer
und insbesondere von optisch nachweisbarer Energie - üb
licherweise als Lumineszenz in Form von sichtbarem
Licht - ist gut bekannt und verstanden. Die Einfügung solcher
lichtemittierender Reaktanten in fachbekannte
Immunoassays, chemische Assays, Nukleinsäureprobenassays
und chemisch/physikalische Probetechniken als Mittel,
durch die der Analyt, eine Substanz, dessen Vorhandensein,
Menge oder Struktur bestimmt wird, identifiziert oder
quantifiziert wird, hat in den vergangenen Jahren eine
steigende Bedeutung erlangt, insbesondere mit dem
Auftreten von enzymatisch spaltbaren 1,2-Dioxetanen (vgl.
WO 88/00695 A1).
Die GB 2 196 118 A betrifft eine Zusammensetzung bzw. einen
Assay, bei dem Wasserstoffperoxid, eine Mikroperoxidase und
ein sterisch gehindertes Amin eingesetzt werden, um eine
chemilumineszente Reaktion zu bewirken.
Reaktionen, die Chemilumineszenz erzeugen, geben als
Beispiel noch einen anderen Fall wieder, in dem das
Medium, obwohl es selbst nicht die Nachricht darstellt,
die Intensität der übermittelten Nachricht bestimmen kann.
Chemilumineszente Verbindungen, die bei der Zersetzung in
Substanzen wie schwachpolaren oder polar aprotischen
organischen Lösungsmitteln, z. B. n-Butanol, Acetonitril,
Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid, Fluoropbore
erzeugen, die ihrerseits Licht einer geeigneten Intensität
für den leichten Nachweis und die Quantifizierung
erzeugen, werden Licht mit beträchtlich verminderter
Intensität erzeugen, wenn sie in einer polar protischen
Umgebung zersetzt werden, insbesondere in wäßrigen
Medien. Da jedoch alle biologischen Systeme wäßrig sind -
der Mensch selbst besteht aus 97% Wasser - ist das
Bedürfnis zur Steigerung der Intensität des Lichtes, das
durch chemilumineszente Markierer oder Substrate in
Immunoassays, Nucleinsäureprobenassays,
chemischen/physikalischen Probetechniken und anderen
Bioassays erzeugt wird, naheliegend. Ein Weg, um eine
solche Steigerung zu schaffen, besteht natürlich darin,
eine teure optische oder elektronische Ausrüstung
einzusetzen: Einzelphotonenzähler, Luminometer,
Scintillationszähler usw. Die vorliegende Erfindung
stellt einen weit weniger teuren, jedoch gleich wirksamen
Weg für die Schaffung der geforderten Lichtsteigerung in
wäßrigen Medien zur Verfügung, und liefert in vielen
Fällen eine derart gesteigerte Lichtintensität, daß sie
den Nachweis durch einfache, billige Mittel, wie mit einer
Kamera, anstelle von komplexen Nachweisinstrumenten
erlaubt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch den Nachweis von
niedrigeren Konzentrationen an Analyten, wobei man die
gleichen Mengen an chemilumineszenten chemischen
Verbindungen verwendet, die in bislang praktizierten
Verfahren verwendet werden, und sie erlaubt damit die
Verwendung von geringeren Mengen an chemilumineszenten
chemischen Verbindungen, um die gleichen Konzentrationen
an Analyten im Vergleich zu denen, die bei bisher
praktizierten Verfahren notwendig waren, nachzuweisen.
Durch Ausübung der Erfindung kann die Intensität des
Lichtes, das durch Fluorophorzersetzungsprodukte von
chemilumineszenten chemischen Verbindungen erzeugt wird,
um mindestens 10%, gewöhnlich aber um
mindestens das Zehnfache und häufig bis um einen Faktor
von mindestens 100 bis 1 000 000 mal, gegenüber den
Intensitäten, die in wäßrigen Medien unter Verwendung der
gleichen
chemilumineszenten Verbindungen in bisher praktizierten
Verfahren erhältlich sind, gesteigert werden.
Es wird nicht beabsichtigt, an eine bestimmte Theorie oder
einen bestimmten Mechanismus zur Erklärung der
Wirkungsweise der Erfindung gebunden zu sein, jedoch wird
angenommen, daß die Steigerungssubstanzen der vorliegenden
Erfindung in einer polar protischen Umgebung, wie einem
wäßrigen Medium, unter Bindung von fluorophorhaltigen
Fragmenten, die aus der Zersetzung einer
chemilumineszenten chemischen Verbindung resultieren,
wirken und solche Fragmente in einer stabilisierten
Konformation, möglicherweise durch hydrophobe oder
ionische Wechselwirkung oder beiden zwischen der
Steigerungssubstanz und dem fluorophorhaltigen Fragment,
beibehalten. Dies wird seinerseits das Fluorophor daran
hindern, die gesamte Menge oder einen beträchtlichen Teil
seiner Anregungsenergie durch nicht lichtemittierende
Weisen freizugeben: Schwingungsrelaxation, bei der die
Energie in Form von Wärme anstelle von Licht ausgestrahlt
wird, Übergang zwischen den Systemen zu anderen
niedrigeren Energiezuständen oder andere derartige
Mechanismen.
Es wurde nun gefunden, daß bestimmte wasserlösliche,
natürlich auftretende und synthetische Substanzen, die im
allgemeinen in der Natur makromolekular vorliegen, z. B.
wasserlösliche Globularproteine, die hydrophobe Stellen
einschließen: Säugetierserumalbumine, wie
Rinderserumalbumin (RSA) und menschliches Serumalbumin
(MSA), oder wasserlösliche, polymere quaternäre
Ammoniumsalze: Poly(vinylbenzyl)trimethyl)ammoniumchlorid
(TMQ) oder
Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl))ammoniumchlorid (BDMQ),
die Stabilisierung von lichtemittierenden Fluorophoren,
die durch Zersetzung von chemilumineszenten chemischen
Verbindungen in wäßrigen Medien erzeugt werden, erlauben
und damit die Lichtintensität steigern. Solche
chemilumineszente chemische Verbindungen beinhalten
thermisch, chemisch, elektrochemisch und enzymatisch
spaltbare 1,2-Dioxetane; Acridiniumester; Lucigenin, ein
Dimeres von N-substituierten Acridinen; Luciferin, und
Mischungen solcher chemilumineszenter Verbindungen
untereinander und mit ein oder mehreren Hilfsfluorophoren,
z. B. Fluorescin, das Energie aus energieemittierenden
Fluorophoren, die durch Zersetzung von chemilumineszenten
Verbindungen erzeugt werden, aufnimmt und seinerseits
nachweisbare Energie ausstrahlt, jedoch sind diese
Verbindungen nicht darauf beschränkt. Durch das
Vorhandensein einer wirksamen Menge an Steigerungssubstanz
oder -substanzen wird die Intensität des in wäßrigem
Medium emittierten Lichtes durch die so stabilisierten
Fluorophore beträchtlich gesteigert im Vergleich zu der
Intensität des durch die gleichen Mengen an Fluorophoren
emittierten Lichtes in Abwesenheit solcher
Steigerungssubstanzen.
Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Mittel bzw.
ein Verfahren für den gesteigerten Nachweis von elektro
magnetischer, d. h. optisch nachweisbarer Energie bereitzu
stellen, die durch die Zersetzung eines chemilumineszenten,
ein Fluorophor umfassenden enzymatisch spaltbaren 1,2-Di
oxetans freigesetzt wird, um das Vorhandensein, die Konzen
tration oder Struktur eines Analyten zu bestimmen.
Fig. 1 zeigt graphische Darstellungen der
Lumineszenzintensitätssignale, die in den
TSH-Assays des Beispiels 46, die bei
Vorhandensein (Kurve "A") und unter Abwesenheit
(Kurve "B") von RSA durchgeführt wurden,
erhalten wurden;
Fig. 2 zeigt graphische Darstellungen der
Lichtemission, die aus der Zersetzung von dem
Acridiniumester resultiert, der verwendet wurde,
um die Anti-TSH-IgG des Beispiels 47 in
Abwesenheit ("Kontrolle") und bei Vorhandensein
("Gesteigert") eines
BDMQ/Fluorescindinatriumsalzsteigerungsmittels
nachzuweisen;
Fig. 3 bis 5 zeigen die Lumineszenzratenspektren des
emittierenden Dioxetanfragments mit und ohne
Steigerungsmittel: ausgewertet in Beispiel 4
(0,1% BDMQ/Fig. 3) und Beispiel 7 (1,0% RSA/Fig.
4), zusammen mit dem Lumineszenzratenspektrum
der Pufferkontrolle (Fig. 5) des Beispiels 30.
Fig. 6 zeigt eine graphische Darstellung der relativen
Dreheinheiten (RDE) gegen die alkalische
Phosphatasekonzentration für verschiedene
Systeme des Beispiels 48.
Fig. 7 und 8 sind Reproduktionen von Photographien, die in
Beispiel 49 beschrieben sind und eine
Substratlösung ohne (Fig. 7) und mit (Fig. 8)
RSA Steigerungsmittel zeigen.
Die Steigerungssubstanzen, die verwendet werden, sind
wasserlösliche, natürlich auftretende oder synthetische
Materialien, die eine hydrophobe Mikroumgebung von
reduzierter Polarität für fluorophorhaltige Fragmente
schaffen können, die aus der Zersetzung einer
chemilumineszenten chemischen Verbindung resultieren, die
in einem polaren Medium, d. h. einem Medium aus Wasser als
Lösungsmittel oder einer Mischung aus Wasser und anderen
in beträchtlichem Maße oder vollständigen polaren
Substanzen, wie Methanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid,
Dimethylformamid enthalten ist.
Wie oben bemerkt, sind unter solchen Steigerungssubstanzen
makromolekulare Globularproteine beinhaltet, im
allgemeinen solche mit einem Molekulargewicht von ungefähr
1000 bis ungefähr 600 000 Daltons und vorzugsweise von
ungefähr 40 000 bis ungefähr 100 000 Daltons, wie es durch
SDS Gelelektrophorese bestimmt ist, die hydrophobe Stellen
einschließen: Säugetierserumalbumine, wie RSA, MSA, AFP;
Globularproteine wie Säugetier IgG, IgE, Protein A,
Avidine; Serumlipoproteine, Apolipoproteine.
Synthetische, oligomere oder polymere
Steigerungssubstanzen, die verwendet werden, beinhalten insbesondere
wasserlösliche Poly(vinylaryl)quaternäre Ammoniumsalze,
wie Poly(vinylbenzyl)quaternäre Ammoniumsalze mit der
Formel
In dieser Formel können R1, R2 und R3 jeweils eine
geradkettige oder verzweigte, unsubstituierte Alkylgruppe
mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, einschließlich Methyl,
Ethyl, n-Butyl, t-Butyl, Cetyl; eine geradkettige oder
verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
substituiert mit einer oder mehreren Hydroxygruppen,
Alkoxygruppen, z. B. Methoxy, Ethoxy, Benzyloxy oder
Polyoxyethylethoxy, Aryloxygruppen, z. B. Phenoxy, Amino- oder
substituierte Aminogruppen, z. B. Methylamino,
Amidogruppen, z. B. Acetamido oder
Cholesteryloxycarbonylamido, oder Fluoroalkangruppen oder
Fluoroarylgruppen, z. B. Heptafluorobutyl; eine
unsubstituierte Monocycloalkylgruppe mit 3 bis 12
Ringkohlenstoffatomen, einschließlich z. B. Cyclohexyl oder
Cyclooctyl; eine substituierte Monocycloalkylgruppe mit 3
bis 12 Ringkohlenstoffatomen, substituiert mit ein oder
mehreren Alkyl-, Alkoxy- oder fusionierten Benzogruppen,
z. B. Methoxycyclohexyl oder 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl;
einer Polycycloalkylgruppe mit zwei oder mehr fusionierten
Ringen, die jeweils 5 bis 12 Kohlenstoffatome besitzen,
unsubstituiert oder substituiert mit ein oder mehreren
Alkyl-, Alkoxy- oder Arylgruppen, z. B. 1-Adamantyl oder
3-Phenyl-1-adamantyl; einer Aryl-, Alkaryl- oder
Aralkylgruppe mit mindestens einem Ring und 6 bis 20
Kohlenstoffatomen im Ganzen,
unsubstituiert oder substituiert mit ein oder mehreren
Alkyl- Aryl-, oder Fluoroalkan- oder Fluoroarylgruppen,
z. B. Phenyl, Naphtyl, Pentafluorophenyl, Ethylphenyl,
Benzyl, Hydroxybenzyl, Phenylbenzyl oder Dehydroabietyl;
mindestens zwei der Substituenten R1, R2 und R3
können zusammen mit dem quaternären Stickstoffatom, an das
sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten,
unsubstituierten oder substituierten, stickstoffhaltigen,
stickstoff- und sauerstoffhaltigen oder stickstoff- und
schwefelhaltigen Ring mit 3 bis 5 Kohlenstoffatomen und 1
bis 3 Heteroatomen, der benzoaniliert sein kann, z. B.
1-Pyridyl,1-(3-alkyl oder aralkyl)imidazolium, Morpholino,
Piperidino oder Acylpiperidino, Benzoxyzol, Benzdiazol
oder Benzamidazol, bilden.
Das Symbol X⁻ stellt ein Gegenion dar, das alleine oder
in Kombination Gruppen wie Halogenid, d. h. Fluorid,
Chlorid, Bromid oder Jodid, Sulfat, Alkylsulfonat, z. B.
Methylsulfonat, Arylsulfonat, z. B. p-Toluolsulfonat,
substituiertes Arylsulfonat, z. B.
Anilinonaphthylensulfonat (verschiedene Isomere),
Lucifergelb CH und Diphenylanthracensulfonat, Perchlorat,
Alkanoat, z. B. Acetat, Arylcarboxylat, z. B. Fluorescein
oder Fluoresceinderivate,
Benzoheterocycloarylcarboxycarbonate, z. B.
7-diethylamino-4-cyanocumarin-3-carboxylat, Phosphat oder
substituiertes Monoaryloxyphosphat, z. B. ein
3-(2''-spiroadamantan)-4-methoxy-(3''-phosphoryloxy)
phenyl-1,2-dioxetandianion oder andere Dianionen, die in
Formel III, unten, gegeben sind, beinhaltet.
Das Symbol n stellt eine derartige Zahl dar, daß das
Molekulargewicht der Poly(vinylbenzyl)quaternären
Ammoniumsalze von ungefähr 800 bis 200 000 reicht, und
vorzugsweise von ungefähr 20 000 bis ungefähr 70 000, wie
es durch die intrinsische Viskosität oder LALLS Techniken
bestimmt wird.
Beispielhaft für solche wasserlöslichen
Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze sind TMQ, BDMQ
und dergleichen.
Diese vinylbenzylquaternären Ammoniumsalzpolymere können
durch freie Radikalpolymerisation von geeigneten
Vorläufermonomeren oder durch erschöpfende Alkylierung der
entsprechenden tertiären Amine mit Polyvinylbenzylchlorid
hergestellt werden. Das gleiche Ziel kann erreicht werden,
indem man andere polymere Alkylierungsmittel, wie
chloromethyliertes Polyphenylenoxid oder
Polyepichlorhydrin verwendet. Die gleichen polymeren
Alkylierungsmittel können als Initiatoren der
Oxazolinring-Öffnungspolymerisation verwendet werden, die
nach der Hydrolyse polyethylenimingepfropfte Copolymere
ergibt. Solche Copolymere können dann quaternisiert
werden, vorzugsweise mit Aralkylgruppen, wobei man die
endgültige polymere Steigerungssubstanz erhält.
Wasserlösliche Acetale von einem Polyvinylalkohol und
einem formylbenzylquaternärem Ammoniumsalz mit der Formel
wobei jeweils R4 der gleiche oder ein unterschiedlicher
aliphatischer Substituent ist und X1 ein Anion
darstellt, wie es von Bronstein-Bonte et al in US-Patent
4.124.388 offenbart und beansprucht wird, können auch als
Steigerungssubstanzen eingesetzt werden. Und die einzelnen
vinylbenzylquaternären Ammoniumsalzmonomere, die verwendet
werden, um die Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze
der Formel I herzustellen, können auch mit anderen
vinylbenzylquaternären Ammoniumsalzmonomeren
copolymerisiert werden, deren Polymere durch die Formel 1
dargestellt werden, oder mit anderen ethylenisch
ungesättigten Monomeren ohne quaternäre
Ammoniumfunktionalität, wobei man Polymere erhält, die von
Land et al in US 4,322,489; von Bronstein-Bonte et
al in US 4,340,522; von Land et al in US
4,424,326; von Bronstein-Bonte et al in US
4,503,138 und von Bronstein-Bonte in US 4,563,411
offenbart und beansprucht sind, wobei all diese Polymere
auch als Steigerungssubstanzen verwendet werden können. Vorzugsweise haben
diese quaternisierten Polymere Molekulargewichte innerhalb
der oben angegebenen Bereiche für die
Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze der Formel I.
Andere wasserlösliche, oligomere, homopolymere und
copolymere Materialien können auch als
Steigerungssubstanzen zusätzlich zu oder anstelle der
zuvor genannten Polymere eingesetzt werden, einschließlich:
- - Poly-N-vinyloxazolidinone;
- - Polyvinylcarbamate (z. B. Polyvinylpropylencarbamat);
- - Polyhydroxyacralate und -methacrylate (z. B. Poly (beta-hydroxyethyl)methacrylat und Polyethylenglycolmonomethacrylate);
- - aminhaltige Oligomere (z. B. Jeffamine), die mit Alkylierungs- oder Aralkylierungsmitteln quaternisiert sind;
- - synthetische Polypeptide (z. B. Polylysincophenylalanin);
- - Polyvinylalkylether (z. B. Polyvinylmethylether);
- - Polysäuren und deren Salze (z. B. Polyacrylsäuren, Polymethacrylsäuren, Polyvenylbenzoesäure, Polyethylensulfonsäure, Polyacrylamidomethylpropansulfonsäure, Polymaleinsäure und Poly(N-vinylsuccinamidinsäure);
- - Polyacrylamide und Polymethacrylamide, abgeleitet von Ammoniak oder cyklischen und acyclischen primären oder sekundären Aminen;
- - Polyvinylalkohol und Polyvinylalkoholcopolymere mit Vincylacetat, Ethylen;
- - Poly 2-, 3- oder 4-vinylpyridiniumsalze, bei denen das heterocyclische Stickstoffatom an eine Gruppe gebunden ist, die durch R1, R2 und R3 in der obigen Formel I gegeben ist;
- - Polyvinylalkylpyrrolidinone (z. B. Polyvinylmethylpyrrolidinon);
- - Polyvinylalkyloxazolidone (z. B. Polyvinylmethyloxazolidone);
- - verzweigte Polyethylenimine, acylierte, verzweigte Polyethylenimine oder acylierte, verzweigte Polyethylenimine, die weiter mit Alkyl- oder Aralkylgruppen quaternisiert sind;
- - Poly N-vinylamine, abgeleitet von Ammoniak oder cyclischen und acyclischen, primären oder sekundären Aminen und Salzen davon;
- - Polyvinylpiperidin;
- - Polyacryloyl, Polymethacryloyl oder 4-vinylbenzoylaminimide, bei denen die drei Substituenten an dem positiv geladenen Stickstoffatom die in der obigen Formel I definierten R11 R2 und R3 Gruppen sein können.
Auch hier haben diese oligomeren oder polymeren
Steigerungssubstanzen vorzugsweise Molekulargewichte
innerhalb des Bereichs, der oben für die
Poly(vinylbenzyl)quaternären Ammoniumsalze der Formel I
gegeben sind.
Wasserlösliche, monomere, quaternäre Seifen, deren
Stickstoffatom mindestens einen Benzylsubstituenten hat,
und in denen die verbleibenden Stickstoffsubsituenten den
für R1, R2, R3 und X in der obigen Formel I
gegebenen Definitionen entsprechen, z. B.
Cetyldimethylbenzylammoniumchlorid oder
Cetyldibenzylmethylammoniumbromid, können auch als
Steigerungssubstanzen
eingesetzt werden.
Die Menge der Steigerungssubstanz oder der Mischung der
Steigerungssubstanzen, die
verwendet werden, können innerhalb weiter Grenzen in
Abhängigkeit von der speziellen gewählten
Steigerungssubstanz, der Menge und der Art der
vorliegenden chemilumineszenten Verbindung variieren. Zum
Beispiel weisen bestimmte Steigerungssubstanzen, wie RSA,
eine optimale Konzentration auf, die vornehmlich von der
vorliegenden chemilumineszenten Verbindung abhängt,
jenseits der die Zugabe von weiteren Mengen an
Steigerungsmitteln keinen weiteren Anstieg in der
Lichtintensität erzeugt. Andere Steigerungsmittel, wie
TMQ, liefern eine erhöhte Steigerung mit erhöhter
Konzentration. Im allgemeinen werden jedoch Mengen an
Steigerungssubstanz, die von ungefähr 0,01% bis ungefähr
25%, und vorzugsweise von ungefähr 0,1% bis ungefähr 5%,
in Bezug auf das Gewicht des Steigerungsmittels, geteilt
durch das Gewicht des wäßrigen Mediums, reichen,
eingesetzt.
Jede chemilumineszente chemische Verbindung, die (1) dazu
angeregt werden kann, unter Zersetzung eine Gruppe in
einem angeregten Zustand zu ergeben, wobei diese Gruppe
einen heteropolaren Charakter besitzt, der sie empfindlich
für Umgebungseinflüsse macht, und die insbesondere dazu
angeregt werden kann, in einer polar protischen Umgebung
die Lumineszenz zu dämpfen oder auszulöschen, und die (2)
dazu geeignet ist, das Vorhandensein, die Konzentration
oder Struktur einer Substanz in einer polar protischen
Umgebung, insbesondere einer Substanz in einer wäßrigen
Probe, zu bestimmen, kann)
(verwendet werden.
1,2-Dioxetane, wie die enzymatisch spaltbaren Dioxetane
und ihre thermisch, chemisch und elektrochemisch
spaltbaren Analoge, bilden die Klasse von verwendbaren
chemilumineszenten chemischen Verbindungen. Diese
1,2-Dioxetane können durch die allgemeine Formel
dargestellt werden. In dieser Formel ist T eine
unsubstituierte oder substituierte Cycloalkyl-, Aryl-,
Polyaryl- oder Heteroatomgruppe, z. B. eine unsubstituierte
Cycloalkylgruppe mit 6 bis 12 Ringkohlenstoffatomen; eine
substituierte Cycloalkylgruppe mit 6 bis 12
Ringkohlenstoffatomen und ein oder mehreren Substituenten,
die eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen sein
können, oder eine Heteroatomgruppe, die eine Alkoxygruppe
mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen sein kann, wie Methoxy oder
Ethoxy, eine substituierte oder unsubstituierte
Aryloxygruppe, wie Phenoxy oder Carboxyphenoxy, oder eine
Alkoxyalkyloxygruppe, wie Methoxyethoxy oder
Polyethylenoxy, oder eine Cycloalkylidengruppe, die an das
3-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings durch eine
Spirobindung gebunden ist und 6 bis 12 Kohlenstoffatome
aufweist, oder eine fusionierte Polycycloalkylidengruppe,
die an das 3-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings durch eine
Spirobindung gebunden ist und zwei oder mehr fusionierte
Ringe aufweist, die jeweils 5 bis 12 Kohlenstoffatome
aufweisen, z. B. eine Adamant-2-ylidengruppe.
Das Symbol Y bedeutet eine lichtemittierende, Fluorophor
bildende fluoreszente Chromophorgruppe, die in der Lage
ist, Energie zu absorbieren, um einen angeregten
Energiezustand zu bilden, von dem sie optisch nachweisbare
Energie emittiert und dabei in ihren ursprünglichen
Energiezustand zurückkehrt.
Das Symbol X2 bedeutet Wasserstoff oder eine Alkyl-,
Aryl-, Aralkyl-, Alkaryl-, Heteroaryl-, Cycloalkyl- oder
Cycloheteroalkylgruppe, z. B. eine geradkettige oder
verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; eine
geradkettige oder verzweigte Hydroxyalkylgrupe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen, oder eine -OR Gruppe, in der R eine
C1-C20 unverzweigte oder verzweigte, unsubstituierte
oder substituierte, gesättigte oder ungesättigte Alkyl-,
Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder
Aralkenylgruppe, fusionierte Ringcykloalkyl-,
Cykloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Aralkenylgruppe ist,
oder eine N- oder O- oder S-Heteroatomhaltige Gruppe, oder
eine enzymspaltbare Gruppe, die eine Bindung enthält, die
durch ein Enzym gespalten werden kann, wobei eine
elektronenreiche. Gruppe erhalten wird, die an den
Dioxetanring gebunden ist. Vorzugsweise ist X2 eine
Methoxygruppe.
Das Symbol Z bedeutet Wasserstoff (in diesem Fall kann das
Dioxetan thermisch durch Aufbrechen der
Sauerstoff-Sauerstoffbindung gespalten werden), eine
chemisch spaltbare Gruppe, wie eine Hydroxylgruppe, eine
Alkanoyl oder Aroylestergruppe oder eine Alkyl oder
Arylsilyloxygruppe, oder eine enzymspaltbare Gruppe, die
eine durch ein Enzym spaltbare Bindung enthält, wobei man
eine elektronenreiche Gruppe, die an den Dioxetanring
gebunden ist, erhält, z. B. eine Bindung, die, wenn sie
gespalten wird, ein Sauerstoffanion, ein Schwefelanion
oder ein Stickstoffanion, und insbesondere ein Amidoanion,
wie ein Sulfonamidoanion, ergibt.
Ein oder mehr der Substituenten T, X2 und Z können auch
einen Substituenten einschließen, der die
Wasserlöslichkeit des 1,2-Dioxetans erhöht, wie eine
Carbonsäure, Sulfonsäure oder eine quaternäre
Amoniumsalzgruppe, wobei mindestens einer der
Substituenten X2 und Z, und vorzugsweise Z, eine
enzymspaltbare Gruppe ist, und vorzugsweise eine
enzymspaltbare Phosphatestergruppe, und X2 und Y können
zusammen eine fusionierte Fluoreszenzchromophorgruppe
bilden, die an das 4-Kohlenstoffatom des Dioxetanrings
durch eine
Spirobindung gebunden ist, z. B. eine Verbindung mit der
allgemeinen Formel:
In dieser Formel ist X3
-O-, -S- oder
-NR9, wobei jeder der Substituenten R7, R8 und R9
unabhängig voneinander Wasserstoff, eine verzweigte oder
geradkettige Alkylkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen,
z. B. Methyl, n-Butyl oder Decyl-, eine verzweigte oder
geradkettige Heteroalkylgruppe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen, z. B. Methoxy, Hydroxyethyl oder
Hydroxypropyl; eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B.
Phenyl; eine Heteroarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B.
Pyrrolyl oder Pyrazolyl; eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7
Kohlenstoffatomen im Ring, z. B. Cyclohexyl; eine
Heterocycloalkylgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen im
Ring, z. B. Dioxan; eine Aralkylgruppe mit 1 oder 2 Ringen,
z. B. Benzyl; eine Alkarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B.
Tolyl; oder eine wie oben definierte enzymspaltbare Gruppe
ist; und jeder der Substituenten R6 kann unabhängig
voneinander Wasserstoff; eine elektronenziehende Gruppe,
wie eine Perfluoroalkylgruppe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen, z. B. Trifluormethyl; ein Halogen;
CO2H, Z1CO2H, SO3H, NO21 Z1NO2, C=N oder
Z1C=N, wobei Z1 eine verzweigte oder geradkettige
Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, z. B.
Methyl, oder eine Arylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B.
Phenyl, ist; eine elektronen
spendende Gruppe, z. B. eine verzweigte oder geradkettige
C1-C7 Alkoxygruppe, z. B. Methoxy oder Ethoxy; eine
Aralkoxygruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Phenoxy; eine
verzweigte oder geradkettige C1-C7 Hydroxyalkylgruppe,
z. B. Hydroxymethyl oder Hydroxyethyl; eine
Hydroxyarylgruppe mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Hydroxyphenyl;
eine verzweigte oder geradkettige C1-C7
Alkylestergruppe, z. B. Acetat; oder eine Arylestergruppe
mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Benzoat; eine Heteroarylgruppe
mit 1 oder 2 Ringen, z. B. Benzoxazol, Benzthiazol,
Benzimidazol oder Benztriazol; oder Wasserstoff oder eine
enzymspaltbare oder chemisch spaltbare Gruppe Z, wie sie
hier definiert ist, sein, wobei mindestens einer der
Substituenten R6 Z darstellt. Des weiteren können alle
der R6-Gruppen zusammen einen Ring bilden, der
substituiert oder unsubstituiert sein kann, und einer oder
mehrere der Substituenten T, X2 und Z können auch einen
Substituenten beinhalten, der die Wasserlöslichkeit des
1,2-Dioxetans erhöht, wie eine Carbonsäure, Sulfonsäure
oder eine quaternäre Amoniumsalzgruppe.
Unter diesen Substanzen, deren Reste in solchen
1,2-Dioxetanen als fluoreszierender Chromophor (Y oder
vorliegen können, sind beinhaltet:
- - Anthracene und Anthracenderivate, z. B. 9,10-diphenylanthracen, 9-methylanthracen, 9-anthracencarboxaldehyd, Anthrylalkohol und 9-phenylanthracen;
- - Rhodamine und Rhodaminderivate, z. B. Rhodole, Tetramethylrhodamin, Tetraethylrhodamin, Diphenyldimethylrhodamin, Diphenyldiethylrhodamin und Dinaphtylrhodamin;
- - Fluorescein und Fluoresceinderivate, z. B. 5-Iodoacetamidofluorescein, 6-Iodoacetamidofluorescin und Fluorescein-5-Maleimid;
- - Coumarin und Coumarinderivate, z. B. 7-Dialkylamino-4-methylcoumarin, 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin und 4-bromomethyl-7-hydroxycoumarin;
- - Erythrosin und Erythrosinderivate, z. B. Hydroxyerythrosine, Erythrosin-5-iodoacetamid und Erythrosin-5-maleimid;
- - Aciridin und Aciridinderivate, z. B. Hydroxyaciridin und 9-methylaciridin;
- - Pyren und Pyrenderivate, z. B. N-(1-pyren)iodoacetamid, Hydroxypyrene und 1-pyrenmethyliodoacetet;
- - Stilben und Stilbenderivate, z. B. 6,6'-dibromstilben und Hydroxystilbene;
- - Naphthalin und Naphtalinderivate, z. B. 5-dimethylaminonaphthalin-1-sulfonsäure und Hydroxynaphthaline;
- - Nitrobenzoxadiazole und Nitrobenzoxadiazolderivate, z. B. Hydroxynitrobenzoxadiazole, 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol, 2-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol,4-yl) methylaminoacetaldehyd und 6-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-aminohexansäure;
- - Chinolin und Chinolinderivate, z. B. 6-hydroxychinolin und 6-aminochinolin;
- - Acridin und Acridinderivate, z. B. N-methylacridin und N-phenylacridin;
- - Acidoacridin und Acidoacridinderivate, z. B. 9-methylacidoacridin und Hydroxy-9-methylacidoacridin;
- - Carbazol und Carbazolderivate, z. B. N-methylcarbazol und Hydroxy-N-methylcarbazol;
- - Fluoreszierende Cyanine, z. B. DCM (ein Laserfarbstoff), Hydroxycyanine, 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrien, 1-(4-dimethylaminophenyl)-t-phenylhexatrien und die entsprechenden 1,3-butadiene;
- - Carbocyanine und Carbocyaninderivat, z. B. Phenylcarbocyanin und Hydroxycarbocyanine;
- - Pyridiniumsalze, z. B. 4(4-dialkyldiaminostyryl)N-methylpyridiniumiodat und Hydroxy-substituierte Pyridiniumsalze;
- - Oxonole; und
- - Resorofine und Hydroxyresorofine.
Wenn man ein enzymatisch spaltbares 1,2-Dioxetan einsetzt,
dann kann die Spaltung unter Verwendung eines Enzyms wie
einer alkalischen Phosphatase erfolgen, die eine Bindung
in z. B. einem Z-Substituenten, wie einer
Phosphatestergruppe, spalten wird unter Bildung eines
Y-Anions in einem Landungstransferzustand, der seinerseits
das Dioxetan destabilisieren wird und seine
Sauerstoff-Sauerstoffbindung spaltet. Die Spaltung kann
auch dadurch erreicht werden, indem man ein Enzym, wie ein
Oxydoreduktaseenzym, verwendet, das die
Sauerstoff-Sauerstoffverbindung direkt spaltet.
Neben einer Phosphatase-Ester-Gruppe kann Z in den obigen
Formeln III und IV auch eine enzymspaltbare
Alkanoyloxygruppe, z. B. eine Acetatestergruppe, oder eine
Oxacarboxylatgruppe, 1-phospho-2,3-diacylglyceridgruppe,
1-thio-D-glucosidgruppe, Adenosintriphosphatanaloge
Gruppe, Adenosindiphosphatanaloge Gruppe,
adenosinmonophosphatanaloge Gruppe, adenosinanaloge
Gruppe, alpha-D-galactosidgruppe, beta-D-galactosidgruppe,
alpha-D-glucosidgruppe,
beta-D-glucosidgruppe, alpha-D-mannosidgruppe,
beta-D-mannosidgruppe, beta-D-fructofuranosidgruppe,
beta-D-glucosiduronatgruppe,
p-toluolsulfonyl-L-argininfarbstoffestergruppe oder
p-toluolsulfonyl-L-argininfarbstoffamidgruppe sein.
Bevorzugte enzymatisch spaltbare 1,2-Dioxetane sind die
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoroyloxy)phe
nyl-1,2-dioxetansalze, die durch die Formel
dargestellt sind, wobei M⁺ ein Kation wie ein
Alkalimetall, z. B. Natrium oder Kalium, Ammonium oder
C1-C7 Alkyl, Aralkyl oder aromatisches quaternäres
AmmoniumKation, N(R5)4⁺, in dem R5 jeweils Alkyl,
z. B. Methyl oder Ethyl, Aralkyl, z. B. Benzyl, darstellt
oder einen Teil eines heterocyclischen Ringsystems, z. B.
Pyridinium, und insbesondere das Dinatriumsalz, bildet.
Eine andere Klasse von chemilumineszenten Verbindungen
beinhaltet Acridiniumester oder die
Phenanthradiniumderivate, in denen einen
Phenoxycarbonylgruppe in der Position 9 an einem
N-substituierten Acridinteil vorliegt, z. B. Verbindungen
mit der allgemeinen Formel:
wobei R10 z. B. eine C1-C10 geradkettige oder
verzweigte Alkyl oder Alkoxygruppe ist; eine Arylgruppe,
vorzugsweise eine Arylgruppe mit einem einzelnen Arylring,
z. B. Phenyl; eine Aminogruppe; eine Hydroxylgruppe; eine
carbonylhaltige Gruppe, z. B. eine Acetylgruppe oder eine
Carbonsäure- oder Estergruppe; R11 kann die Bedeutung
wie R10 besitzen und kann Wasserstoff, einen
fusionierten Benzoring oder eine Gruppe, geeignet für die
Konjugation mit Proteinen oder Nucleinsäuren, z. B. eine
Isothiocyanatgruppe, eine N-hydroxysuccinimidestergruppe,
Biothin oder Avidine darstellen, und X4 ist ein
Gegenion, das alleine oder in Kombination ein Halogenid,
Sulfat, Alkylsulfonat, Arylsulfonat, substituiertes
Arylsulfonat, Perchlorat, Alkanoat, Arylcarboxylat,
Heteroarylcarboxylat, Phosphat oder substituiertes
Monoaryloxyphosphat, ein anionisches Oligomer oder ein
anionisches Homopolymer oder Copolymer beinhalten kann.
Diese Acridiniumester bewirken bei Vorhandensein eines
Peroxids, wie Wasserstoffperoxid, und einer alkalischen
Substanz, z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, eine
Chemilumineszenz von dem angeregten Zustand des
N-substituierten Acridons aus, das durch Spaltung des
Phenoxyesterteils des Moleküls gebildet wurde.
Ein oder mehrere Hilfsfluorophore, die nicht zu den
lichtemittierenden Fluorophoren gehören, die durch
Zersetzung der vorhandenen chemilumineszierenden
Verbindungen erzeugt werden, die Energie, insbesondere
Licht, von energieemittierenden Fluorophoren aufnehmen,
die durch Zersetzung der chemilumineszenten Verbindungen
erzeugt werden und ihrerseits nachweisbare Energie,
wiederum vorzugsweise Licht, aussenden, können auch verwendet werden. Unter
diesen Hilfsfluorophoren, die alleine oder in Kombination
verwendet werden können, sind die oben aufgeführten
Substanzen, deren Reste in 1,2-Dioxetanen als fluoreszente
Chromophorgruppen vorhanden sein können. Fluorescein und
Fluoresceinderivate, einschließlich Derivate, die in der
Lage sind, eine kovalente Bindung mit der
Steigerungssubstanz zu bilden, sind besonders für die
Verwendung als Hilfsfluorophore bevorzugt.
Diese Hilfsfluorophore können einfach mit der
Steigerungssubstanz und der chemilumineszenten Verbindung
vermengt werden, oder werden an eine oder beide dieser
Materialien gebunden. Phycobiliproteine bilden eine
natürlich auftretende Klasse von Steigerungsmolekülen, in
denen ein Fluorophor kovalent an ein Protein gebunden ist.
Wenn das Hilfsfluorophor an eine chemilumineszente
Verbindung gebunden wird, dann wird es vorzugsweise an den
Teil der chemilumineszenten Verbindung gebunden, der bei
Zersetzung ein Fragment bildet, das den fluorophoren Teil
des Moleküls der chemilumineszenten Verbindung enthält.
Auf diese Weise wird der Energietransfer durch die beiden
Fluorophore, die in großer Nachbarschaft zueinander
vorliegen, gesteigert. Hilfsfluorophore, die unlöslich
oder teilweise unlöslich im wäßrigen Medium sind, können
löslich gemacht werden, indem man sie zunächst auf löslich
machende Moleküle, z. B. wasserlösliche Oligomere oder
Polymermoleküle, pfropft.
Beim Vermengen mit der Steigerungssubstanz und der
chemilumineszenten Verbindung kann die Menge des
vorhandenen Hilfsfluorophors von ungefähr 1 µg/ml bis
ungefähr 10 mg/ml der das Steigerungsmittel enthaltenden
Lösung, und vorzugsweise 1 µg/ml bis ungefähr 100 µg/ml
der das Steigerungsmittel enthaltenden Lösung, betragen.
Wenn die Hilfsfluorophore kovalent an das Protein gebunden
verwendet werden, dann kann das molare Verhältnis des
Fluorophors zum Protein von 1 bis 60 und vorzugsweise
(z. B. bei RSA) von 1 bis 6, pro Proteinmolekül, reichen.
Die beschriebene Vorgehensweise ist insbesondere nutzvoll, wenn man
Immunoassays durchführt, und zwar solche, die verwendet
werden, um ein Enzym oder ein Teil eines spezifischen
Bindungspaares, z. B. ein Antigen-Antikörper-Paar oder eine
Nucleinsäure, die mit einer Probe gepaart ist, die in der
Lage ist, sich an die gesamte Nucleinsäure oder an einen
Teil davon zu binden, nachzuweisen. Solche Assays
beinhalten Immunoassays, die dazu verwendet werden, ein
Hormon, wie beta-humanchorionisches Gonadotrobin
(beta-hCG), thyroidstimulierendes Hormon (TSH),
follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes
Hormon (LH), nachzuweisen, Zelloberflächenrezeptorassays
und Nukleinsäureassays, die verwendet werden, um Viren,
z. B. HIV oder HTLV III und Cytomegalovirus, oder
Bakterien, z. B. E. Coli, nachzuweisen, und
Histocompatibilitätsassays; typische Assayprotokolle sind
in den Arbeitsbeispielen unten aufgeführt. Es kann auch bei Assays für
einen chemischen Analyten, wie Kalium und Natriumionen,
oder in Assays für Substanzen, wie Cholesterol oder
Glucose, in denen der Analyt zersetzt wird, z. B. unter
Verwendung eines Enzyms, wie Cholesteroloxydase oder
Glucoseoxydase, unter Bildung einer Substanz, z. B.
Wasserstoffperozid, das in der Lage ist, die
chemilumineszente Verbindung zu zersetzen, eingesetzt
werden. Um den Fachmann die vorliegende Erfindung
verständlicher zu machen, sind die folgenden Beispiele
angegeben.
Die Steigerungssubstanzen, die in der Tabelle 1 aufgeführt
sind, in der alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht
bezogen sind, wenn es nicht anderweitig festgehalten ist,
wurden hinsichtlich ihrer
Lichtintensitätssteigerungseigenschaften bewertet, indem
man die geeignete Menge des Steigerungsmittels in 0,05 M
Carbonatpufferlösung, die 1 mM Magnesiumchlorid (pH = 9,5)
enthielt, gelöst, um die festgelegten Konzentrationen zu
erhalten. Zu 1 ml Proben von jeder der erhaltenen Lösungen
(einschließlich der Kontrolle, Beispiel 31, die kein
Steigerungsmittel enthielt), wurde dann ausreichend
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-
1,2-dioxetandinatriumsalz, gelöst in der gleichen
Carbonatpufferlösung, die für die Lösung des Stei
gerungsmittels verwendet wurde, gegeben, um eine
Endkonzentration der chemilumineszierenden Verbindung von
0,125 mM zu erhalten. Die erhaltenen Lösungen wurden dann
auf 30°C equilibriert, worauf eine wäßrige alkalische
Phosphataselösung hinzugegeben wurde, um eine
Endenzymkonzentration von 4.17 × 10-10 M zu erhalten.
Das Lumineszenzsignal jeder Lösung wurde dann bei 30°C in
einem Luminometer, das über 20 Minuten
integrierte, gemessen. Erfolgreiche Steigerungsmittel oder
Mengen an Steigerungsmittel waren solche, die einen
Steigerungsfaktor größer als 1, z. B. größer als der der
Probe, Beispiel 30, die die chemilumineszierende
Verbindung, jedoch nicht das Steigerungsmittel, enthielt
ergaben.
TABELLE 1
1 0,01 µg/ml Fluorescein zugegeben.
2 Benzyldimethylcetylammoniumchlorid; TCI.
3 Polymethacrylamidopropylenmethylammoniumchlorid; Polyscience.
4 Polyvinylpyrrolidon; GAF.
5 Polyethyloxazolin; Dow Chemicat Co.
6 Polyvinylpyrrolidinon; CTAF.
7 1,5-Dimethyl-1,5-diaza-undecamethylenpolymethobromid; Aldrich
8 von Staphylococcus abgeleitet; Sigma.
9 Polyethylenimin; Dow Chemical Co.
10 Polyethylenoxid; Union Carbide Corp.
11 Algininsäure (Natriumsalz); Merck.
12 Natriumcellulosesulfat; Merck.
13 Polyethylenpropylenglycol; BASF Wyandotte.
14 Polyoxazolin; Dow Chemical Co.
15 1,4,7,10,13,16-Hexaoxacyclooctadecan; Aldrich.
16 Kat.-Nr. G0378; Sigma.
17 Polyvinylhydrogenphthalat; Eastman Kodak 5527.
18 Polyethylenglycol, Molekulargewicht 8000, zur biologischen Verwendung,
P2139; Sigma.
19 Alginate; Kelco Co.
20 Polyethylenoxid; Union Carbide.
Die Lichtemissionsspektren der Proben der Beispiele 4, 7
und 30 sind in den Fig. 3, 4 und 5 gezeigt, wobei die
gemessene Lichtintensität auf der Abszisse (X-Achse) und
die Zeit auf der Ordinate (Y-Achse) bei jedem Plot
aufgetragen ist.
Ein TSH-Assay wurde wie folgt ausgeführt:
Monoklonaler anti-TSH-beta Antikörper von Mäusen wurde
verwendet, um 0,3 cm- Perlen für das Einfangen des
Analyten zu beschichten. Monoklonaler anti-TSH Antikörper
von Mäusen wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiert
und als Nachweisantikörper verwendet.
TSH wurde von Calbiochem, Katalog Nr. 609396 erhalten und
RSA (Typ V - freie Fettsäure) wurde von Sigma, Katalog Nr.
A6003 erhalten.
Die für den Analyten und das Konjugat verwendete
Pufferlösung enthielt 0,1 M Tris-HCl, 1 mM MgCl2 und
2 Gewichtsprozent RSA (pH = 7,5). Die Substratpufferlösung
enthielt 0,1 M Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 Gewichtsprozent
RSA (pH = 9,5) und
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-
1,2-dioxetandinatriumsalz als chemilumineszierende
Verbindung (50 µg/ml).
15 µl einer TSH-haltigen Analytlösung wurden mit 135 µl
der Konjugatantikörperlösung vermengt. Zwei 0,3 cm-
Perlen, die wie oben beschrieben beschichtet wurden,
wurden zu der Lösung hinzugegeben, und es wurde 2 Stunden
lang bei 23°C inkubiert. Die Perlen wurden dann viermal
mit 0,1 M Tris (pH = 7,5) gewaschen und zu einer
Reaktionsröhre überführt. 200 µl der gleichen
chemilumineszenten Verbindung, die in der oben
beschriebenen Substratpufferlösung verwendet wurde, wurden
zu der Röhre gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 20
Minuten wurde die Lichtemission als 10 Sekunden Zählungen
unter Verwendung eines Lumineszenz-Analysegerätes aufgezeichnet.
Ein identischer TSH-Assay wurde auch mit der gleichen
Konzentration an Substrat in dem gleichen Puffer ohne RSA
für Vergleichszwecke durchgeführt. Wie in Fig. 1, ein Plot
der Daten der Tabelle II, gezeigt wird, wies die
RSA-haltige Probe (Kurve A) eine größere
Lumineszenzintensität für eine gegebene TSH-Konzentration
im Vergleich mit der Probe ohne RSA (Kurve B) auf.
Tabelle II
Die Steigerung der Acridiniumesterliumineszenz aus einem
anti-TSH-IgG-acridiniumester ("AE") Konjugat
(Ciba-Corning) wurde durch das folgende Verfahren gezeigt.
Zu 50 µl Teilen-von anti-TSH-IgG-AE-Konjugat, die 30 mg
IgG/ml mit 2-3 Markierern in Luminometerröhren enthielten,
wurden die Mengen einer wäßrigen Lösung, die 0,1% BDMQ
und 0,01 mg/ml des Fluoresceindinatriumsalzes, das in
Tabelle III angegeben ist, enthielt, gegeben. Jede Röhre
wurde in ein Luminometer gestellt,
und eine Lumineszenzreaktion wurde initiiert, indem man
200 µl einer 50 mM wäßrigen Natriumhydroxidlösung, die
0,05% Wasserstoffperoxyd enthielt, injizierte.
Die BDMQ/Fluorescein-gesteigerte Lichtemission aus dem
Acridiniumester wird bei 10 und 50 µl im Vergleich zur
Kontrolle in der Tabelle III gezeigt und durch die Plots
der Fig. 2 verdeutlicht.
Tabelle III
Ein Assay für alkalische Phosphatase wurde in der
folgenden Weise durchgeführt:
Puffer:
0,05 M Karbonat, 1 mM MgCl2
0,05 M Karbonat, 1 mM MgCl2
(pH 9,5)
Substrat:
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phospho ryloxy)phenyl-1,2-dioxetandinatriumsalz bei einer Konzentration von 0,4 mM
Alkalische Phosphatase:
Stammlösung mit 1,168 µg/ml in den Puffer
Untersuchte Steigerungssysteme:
Substrat:
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phospho ryloxy)phenyl-1,2-dioxetandinatriumsalz bei einer Konzentration von 0,4 mM
Alkalische Phosphatase:
Stammlösung mit 1,168 µg/ml in den Puffer
Untersuchte Steigerungssysteme:
- 1. Puffer alleine, Kontrolle
- 2. Puffer plus 0,1% RSA
- 3. Puffer plus 0,1% RSA-Fluorescein (molares Verhältnis von RSA zu Fluorescein von 1 bis 3)
- 4. Puffer plus 0,1% BDMQ
- 5. Puffer plus 0,1% BDMQ und Fluorescein (es wurden 0,01 mg an Fluoresceindinatriumsalz pro ml BDMQ zugegeben).
Serienverdünnungen der alkalischen
Phosphatasestammlösungen wurden in Röhren mit den
Endenzymkonzentrationen durchgeführt:
4,17 × 10-11M | 1,67 × 10-15M |
8,34 × 10-12M | 8,34 × 10-16M |
1,67 × 10-12M | 4,17 × 10-16M |
3,34 × 10-13M | 2,09 × 10-16M |
6,68 × 10-14M | 1,0 × 10-16M |
1,34 × 10-14M | 5,0 × 10-17M |
3,34 × 10-15M | 2,5 × 10-17M |
Duplikatröhren mit jeweils den obigen Konzentrationen an
alkalischer Phosphatase, die auch 0,4 mM 3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-
1,2-dioxetandinatriumsalz in verschiedenen
Steigerungssystemen enthielten, wurden bei 30°C inkubiert.
Die Systeme 1, 4 und 5 wurden 20 Minuten lang inkubiert,
während die Systeme 2 und 3 80 Minuten lang inkubiert
wurden.
Nach der Inkubation wurden 30 Sekunden Lichtintegrale in
einem Luminometer gemessen und die Wirkung der
Steigerungsmittel, die hinsichtlich der Grenzen der
Nachweisbarkeit der alkalischen Phosphatase untersucht
wurde, ist in Tabelle IV gezeigt.
TABELLE IV
Die Fähigkeit, Lumineszenz fotografisch mit den Mitteln
dieser Erfindung nachzuweisen, wurde auf folgende Weise
bewiesen:
Puffer:
0,1 M Tris, 1 mM MgCl2
0,1 M Tris, 1 mM MgCl2
bei einem pH Wert
von 9,8, hergestellt mit 0,1% RSA und ohne
RSA (RSA wurde von Sigma, Katalog Nr. A7906)
gekauft
Enzym:
0,05 µg alkalische Phosphatase (3,6 × 10-13
Enzym:
0,05 µg alkalische Phosphatase (3,6 × 10-13
mol)
Membran:
Nitrocellulose mit einer Porengröße von 0,45 µm
Substrat:
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phos phoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan dinatriumsalz bei einer Konzentration von 0,08 mM.
Membran:
Nitrocellulose mit einer Porengröße von 0,45 µm
Substrat:
3-(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phos phoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan dinatriumsalz bei einer Konzentration von 0,08 mM.
Die Enzymlösung wurde auf eine trockene Nitrozellulose
membran gesprüht. Anschließend wurde die Membran mit 2,5%
Trockenmilchfeststoffen und 1% Fischgelatine in
phosphatgepufferter Salzlösung bei einem pH-Wert von 7,3
geblockt. Die geblockte Membran wurde mit der
Substratlösung in Puffern, die kein RSA enthielten, und
mit RSA gewaschen.
Die Membran wurde in ein Kameraluminometer gegeben und die
10 Minuten Belichtungen wurden auf einem Film
aufgezeichnet. Die Wiedergaben der erhaltenen Fotografien
erscheinen in den Fig. 7 und 8.
Claims (22)
1. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Kon
zentration oder Struktur eines Analyten, bei dem in einem
wäßrigen Medium elektromagnetische Energie, die durch die
Zersetzung eines chemilumineszenten, ein Fluorophor umfas
senden enzymatisch spaltbaren 1,2-Dioxetans freigesetzt wird,
nachgewiesen wird, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren in Gegenwart einer makromolekularen was
serlöslichen Substanz durchgeführt wird, deren Menge aus
reichend ist, um die Intensität der freigesetzten, nach
weisbaren Energie im Vergleich zu der Intensität der nach
weisbaren Energie, die in Abwesenheit der Steigerungssub
stanz freigesetzt wird, zu steigern, wobei die Steigerungs
substanz die Fähigkeit besitzt, das Fluorophor daran zu
hindern, Energie durch strahlungslose Übergänge freizuge
ben, und eine hydrophobe Mikroumgebung für das Fluorophor zu
schaffen, und wobei die makromolekulare Substanz ein
Globularprotein ist, das hydrophobe Stellen beinhaltet,
oder die makromolekulare Substanz ein oligomeres oder poly
meres quaternäres Ammoniumsalz umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Globularprotein ein Säugetier
serumalbumin ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn
zeichnet, daß das quaternäre Ammoniumsalz ein
Poly(vinylaryl)quaternäres Ammoniumsalz ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre Ammo
niumsalz Poly(vinylbenzyltrimethyl)ammoniumchlorid ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre Ammo
niumsalz/Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl))ammoniumchlorid
ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das 1,2-Dioxetan ein 3-
(2'-spiroadamantan)-4-methoxy-(3'-phosphoryloxy)phenyl-
1,2-dioxetansalz ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Hilfsfluorophor zu
gegeben wird, das in der Lage ist, die bei Zersetzung der
chemilumineszenten Verbindung erzeugte Energie von dem
Fluorophor aufzunehmen, und seinerseits nachweisbare Ener
gie auszustrahlen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hilfsfluorophor mit der chemilu
mineszenten Verbindung und der Steigerungssub
stanz vermengt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hilfsfluorophor an den Teil der
chemilumineszenten Verbindung gebunden wird, der bei Zer
setzung das energieemittierende Fluorophor erzeugt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß das Hilfsfluorophor ein
Fluorescein ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hilfsfluorophor an die Steige
rungssubstanz gebunden ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hilfsfluorophor ein derivati
siertes Fluorescein ist, das in der Lage ist, eine kova
lente Bindung mit der Steigerungssubstanz zu bilden.
13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1
bis 12 bei einem Immunoassay.
14. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1
bis 12 bei einem Nucleinsäureprobeassay.
15. Wäßrige Zusammensetzung aus einem chemilumineszenten,
ein Fluorophor aufweisenden enzymatisch spaltbaren 1,2-Di
oxetan und einer makromolekularen wasserlöslichen Substanz,
deren Menge ausreichend ist, um die Intensität der freige
setzten nachweisbaren Energie im Vergleich zu der Intensi
tät der nachweisbaren Energie, die bei Abwesenheit der
Steigerungssubstanz freigesetzt wird, zu steigern, wobei die Steigerungs
substanz die Fähigkeit besitzt, das Fluorophor daran zu
hindern, Energie durch strahlungslose Übergänge freizuge
ben, und eine hydrophobe Mikroumgebung für das Fluorophor zu
schaffen, und wobei die makromolekulare Substanz ein
Globularprotein ist, das hydrophobe Stellen beinhaltet,
oder die makromolekulare Substanz ein oligomeres oder poly
meres quaternäres Ammoniumsalz umfaßt.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Globularprotein ein Säu
getierserumalbumin ist.
17. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch ge
kennzeichnet, daß das quaternäre Ammoniumsalz
ein Poly(vinylaryl)quaternäres Ammoniumsalz ist.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre
Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyltrimethyl)ammoniumchlorid
ist.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Poly(vinylaryl)quaternäre
Ammoniumsalz Poly(vinylbenzyl(benzyldimethyl))ammonium
chlorid ist.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Steigerungssubstanz ein
Phycobiliprotein umfaßt.
21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Hilfs
fluorophor enthält, das in der Lage ist, die bei Zersetzung
der chemilumineszenten Verbindung erzeugte Energie aus dem
Fluorophor aufzunehmen und seinerseits nachweisbare Energie
auszustrahlen.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch ge
kennzeichnet, daß das Hilfsfluorophor ein
Fluorescein ist.
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