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TECHNISCHER HINTERGRUND DER
ERFINDUNG
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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft dendritische chemilumineszierende Polymersubstrat-Konjugate;
die Synthese von dendritischen chemilumineszierenden Polymersubstrat-Konjugaten;
Zusammensetzungen, die dendritische chemilumineszierende Polymersubstrat-Konjugate
enthalten; und Verfahren zur Verwendung von dendritischen chemilumineszierenden
Polymersubstrat-Konjugaten. Die Erfindung betrifft außerdem die
Verwendung von Verstärkersubstanzen
in Kombination mit den dendritischen chemilumineszierenden Polymersubstrat-Konjugaten.
Die dendritischen chemilumineszierenden Polymersubstrat-Konjugate
und dendritischen chemilumineszierenden Polymersubstrat-Verstärkerkonjugate,
die das nachweisbare Chemilumineszenzsignal durch Kopplung von mehreren
(d. h. von 3 bis 3072) enzymaktivierbaren chemilumineszierenden
Substraten verstärken,
sind verwendbar beim Nachweis der Gegenwart oder der Konzentrationsbestimmung
chemischer oder biologischer Substanzen in Immunoassays, chemischen
Assays und Gensondenassays sowie in chemisch/physikalischen Sondenverfahren
zur Untersuchung der Mikrostrukturen von Makromolekülen, einschließlich synthetischer
Polymere, Proteine, Nucleinsäuren
und dergleichen.
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HINTERGRUND DER TECHNOLOGIE
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Dendritische
Polymere (sonst als "Dendrimere" bekannt) sind einheitliche
Polymere, in der Literatur unterschiedlich als hyperverzweigte Dendrimere,
Arborole, fraktale Polymere und Sterndendrimere bezeichnet, die
einen zentralen Kern, eine innere dendritische (hyperverzweigte)
Struktur und eine äußere Oberfläche mit
Endgruppen aufweisen. Diese Polymere unterscheiden sich in Form
und Funktion von den klassischen linearen Polymeren. Die Chemie
der linearen Polymere ergibt sich aus chaotischen, ungesteuerten
Prozessen, die eine Verteilung von Produktspezies von mikroskopischer
bis zu makroskopischer Größe liefern.
Die molekulare Linearität
der Polymere erzeugt eine stark verwickelte makromolekulare Population,
die makroskopisches Verhalten definiert, wie z. B. mit steigendem
Molekulargewicht steil ansteigende Viskosität, mäßige chemische Reaktivität infolge
verborgener aktiver Stellen in Zufallsknäueln, und veränderliche
oder mäßige Löslichkeit.
Dagegen baut die Dendrimerchemie Makromoleküle mit straffer Steuerung von
Größe, Form,
Topologie, Flexibilität
und Oberflächengruppen
auf. In einem als divergente Synthese bekannten Prozeß beginnen diese
Makromoleküle
durch Reaktion eines Initiatorkerns in einer iterativen Reaktionsfolge
mit hoher Ausbeute, vom Kern ausstrahlende symmetrische Zweige mit
wohldefinierten Oberflächengruppen
aufzubauen. Alternativ werden in einem als konvergente Synthese
bekannten Prozeß dendritische
Keile von der Peripherie nach innen zu einem Brennpunkt hin aufgebaut,
und dann werden mehrere dendritische Keile in den Brennpunkten mit
einem polyfunktionellen Kern gekoppelt. Dendritische Synthesen bilden
konzentrische Schichten, die als Generationen bezeichnet werden,
wobei jede Generation die Molekülmasse
und die Anzahl reaktionsfähiger Gruppen
an den Zweigenden verdoppelt, so daß das Dendrimer der Endgeneration
ein hochreines, einheitliches monodisperses Makromolekül ist, das
sich über
einen Bereich von Bedingungen leicht löst. Aus den nachstehend diskutierten
Gründen
liegen Molekulargewichte von Dendrimeren im Bereich von 300 bis
700000 Dalton, und die Anzahl der Oberflächengruppen (der reaktiven
Stellen für
eine Bindung) liegt im Bereich von 3 bis 3072.
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Da
Dendrimere mit jeder Generation wachsen, erzwingen die von der Überfüllung der
Zweige herrührenden
sterischen Behinderungen eine Änderung
der Polymerform von einem seesternförmigen Molekül zu einem
Kugelmolekül.
Zum Beispiel sind bei Polyamidoamin-("PAMAM"-)Sterndendrimeren die Generationen 0–3 kuppelförmig, die
Generation 4 ist eine Übergangsgeneration
mit abgeplatteter Sphäroidform,
und die Generationen 5 und größer sind
symmetrisch kugelförmig
mit hohlem Inneren und einer Oberflächenhaut. Diese Formänderung
von Kuppeln zu Kugeln mit zunehmender Größe (verursacht durch zunehmende Überfüllung der
Oberfläche
an den Verzweigungsenden) ist ein allgemeines Merkmal dendritischer
Polymere.
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Dendritisches
Wachstum, Form und Topologie werden durch den Kern, die innere Verzweigungsstruktur
und die Oberflächengruppen
gesteuert. Dendrimere expandieren symmetrisch auf eine Weise, die
eine konstante Fläche
endständiger
Oberflächengruppen
aufrechterhält.
Zum Beispiel benötigt
bei Sterndendrimeren die Oberflächengruppe
-CO2Me 93 A2/Gruppe,
während
die Oberflächengruppe
-NH2 150 A2/Gruppe
benötigt.
Endständige
Gruppen mit größerem sterischem
Umfang, wie zum Beispiel NH2, fördern durch
sterische Oberflächenwechselwirkungen
eine größere Hohlheit
des Kerns, wie bei den PAMAMs beobachtet. Dagegen werden Polyether-Sterndendrimere
innerhalb von 3 Generationen bei sehr kleinem innerem Hohlraum überfüllt. Im
allgemeinen wird das dendritische Wachstum selbstbegrenzend, da
sterische Überfüllung der
reaktiven Oberflächenstellen
weitere chemische Modifikationen ausschließt; für PAMAM-Sterndendrimere tritt
dies in den Generationen 9–10
auf.
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Wie
sie hier diskutiert werden, können
dendritische Oberflächen
3 bis 3072 Endgruppen aufweisen, die für die Oberflächenchemie
verfügbar
sind; die Anzahl der Endgruppen ist dabei vom Typ der Dendrimerstruktur
(der die sterische Überfüllung definiert)
und von der Dendrimergeneration abhängig. Dendrimere mit endständigen Aminogruppen
(NH2) reagieren beispielsweise mit Michael-Akzeptoren
(CH2=CHCO2R), α-Halogenestern,
Aziridinen, aktivierten Carbonsäuren,
Säurechloriden,
Benzylhalogeniden, Carbonaten und Aldehyden. Dendrimere mit endständigen Hydroxylgruppen
(OH) reagieren beispielsweise mit Halogensulfonsäureestern, aktivierten Carbonsäuren und
Säurechloriden.
Dendrimere mit endständigen
Estern und Säuren (CO2R, CO2H) reagieren
zum Beispiel mit Aminen, und Dendrimere mit endständigen Halogeniden
reagieren beispielsweise mit Aminen und Alkoxid- und Thioalkoxid-Anionen.
Weitere reaktive Oberflächengruppen
sind unter anderem Carboxyhalogenid-, Imino-, Alkylamino-, Dialkylamino-,
Alkylarylamino-, Cyanogruppen, Sulfonylester, Dithiopyridyl und
Sulfhydryl. Chemische Reaktionen an der Dendrimeroberfläche treten
gewöhnlich ebenso
leicht wie bei einzelnen organischen Molekülen, mit hoher Spezifität und hohen
Ausbeuten auf, solange an der Oberfläche keine sterische Überfüllung herrscht.
Strukturen von im Handel erhältlichen
Dendrimeren, zu denen die PAMAM-Sterndendrimere (mit endständigen NH2-, endständigen
OH- und endständigen CO2R-Gruppen)
und Astramol PEI-Dendrimere (mit endständigen NH2-Gruppen)
gehören,
die in den 1A bis 1D dargestellt
sind, sind von Aldrich Chemical Co., Dendritech Inc. und DSM Fine
Chemicals beziehbar. Außerdem
sind viele andere dendritische Polymere mit reaktiven Oberflächengruppen
synthetisiert und in der Literatur beschrieben worden (eine Übersicht
siehe zum Beispiel "Dendritic
Molecules: Concepts, Syntheses, Perspectives", G.R. Newkome, C.N. Moorefield, F.
Vogtle, VCH Publishers, Inc., New York (1996), und am Ende dieser
Patentanmeldung zitierte Literatur).
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In
den letzten Jahren ist festgestellt worden, daß die Größe, die Form und die Eigenschaften
von dendritischen Polymeren molekular gezielt aufgebaut werden können, um
spezialisierten Endanwendungen gerecht zu werden. Dendritische Polymere
weisen daher bedeutende Vorteile auf, die ein Mittel für die Abgabe hoher
Konzentrationen von transportiertem Material pro Polymereinheit,
gesteuerte Abgabe, gezielte Abgabe und/oder Abgabe oder Verwendung
mehrerer Spezies bieten können.
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Die
US-Patente Nr. 5 338 532 ;
5 527 524 und
5 714 166 offenbaren dichte Sternpolymere
oder Starburst-Polymere, die mit verschiedenen Materialien verbunden
sind, zu denen Medikamente, Toxine, Metallionen, Radionuklide, Signalgeber,
Signalreflektoren, chelatgebundenes Metall, Signalabsorber, Antikörper, Hormone,
biologische Antwortmodifikatoren (= immunstimulierende, -restaurierende
und supprimierende Stoffe), diagnostische Trübungsmittel, fluoreszierende
Komponenten und Radikalfänger
gehören;
Verfahren zur Herstellung der Konjugate, Zusammensetzungen, welche
die Konjugate enthalten; und Verfahren zur Verwendung der Konjugate.
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Das
US-Patent Nr. 5 482 698 offenbart
Verfahren zum Nachweis oder zur Behandlung von Verletzungen, die
ein Polymer, das mehrere Avidin- oder Biotin-Bindungsstellen aufweist;
Zusatz eines Nachweis- oder Heilmittels zu dem Avidin oder Biotin
und Nachweis oder Behandlung der Verletzung einschließen.
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Die
US-Patente Nr. 5 443 953 und
5 635 603 offenbaren ein
lösliches
Immunkonjugat, das ein glykosyliertes Antikörperfragment enthält, und
ein Zwischenkonjugat, das einen Polymerträger mit mindestens einer freien
Amingruppe und einem nachweisbaren Markermolekül aufweist, das kovalent an
den Polymerträger
gebunden ist.
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Keine
der oben zitierten Literaturstellen offenbart die Verbindung von
dendritischen Polymeren mit chemilumineszierenden Substraten.
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1,2-Dioxetan-Enzymsubstrate
haben sich als hochwirksame chemilumineszierende Reportermoleküle zur Verwendung
in Enzymassays vieler verschiedener Typen bewährt. Diese Assays bieten eine
bevorzugte Alternative zu herkömmlichen
Assays, die auf Radioisotope, Fluorophore, komplizierte Farbverschiebung,
Sekundärreaktionen
und dergleichen angewiesen sind. Für diesen Zweck entwickelte
Dioxetane sind unter anderem diejenigen, die in den
US-Patenten Nr. 4 978 614 ;
5 112 960 ;
5 538 847 und
5 582 980 sowie in der
US-Patentanmeldung, Serien-Nr. 09/362 047 (anhängig) offenbart
werden. Die
US-Patent Nr. 4 978
614 offenbart unter anderem 3-(2'-Spiroadamantan)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan,
das im Handel von Applied Biosystems unter der Handelsbezeichnung
AMPPD
® erhältlich ist,
die ein eingetragenes Warenzeichen der PR Corporation (NY) ist.
Die
US-Patente Nr. 5 112 960 ;
5 538 847 und
5 582 980 offenbaren ähnliche
Verbindungen, in denen der Adamantyl-Stabilisierungsring an beiden Brückenkopfpositionen
durch verschiedene Substituenten substituiert ist, zu denen Hydroxy,
Halogen und dergleichen gehören,
welche die sonst statische oder passive Adamantyl-Stabilisierungsgruppe
in eine aktive Gruppe umwandeln, die an der Kinetik der Aufspaltung
des Dioxetanrings beteiligt sind. Verbindungen dieses Typs ergeben
in vielen Anwendungen ein schnelleres und stärkeres Signal als AMPPD
®.
CSPD
®,
ein eingetragenes Warenzeichen der PE Corporation (NY), ist ein
Dioxetan der zweiten Generation mit einem Chlorsubstituenten an
der Adamantylgruppe. Dieses Material ist gleichfalls von Applied
Biosystems beziehbar. CSPD
® liefert verbesserte Lichtintensität und Nachweisempfindlichkeit.
Das
US-Patent 6 355 441 offenbart
enzymatisch spaltbare chemilumineszierende 1,2-Dioxetane, die in
Wellenlängen
nahe dem roten oder grünen
Ende des sichtbaren Spektrums emittieren. Die in diesem Abschnitt
zitierten Patente und Patentanmeldungen werden hier jeweils insgesamt durch
Verweis einbezogen.
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Reaktionen,
die Chemilumineszenz erzeugen, dienen als Beispiel für einen
weiteren Fall, in dem das Medium, wenn auch nicht die Nachricht,
die Intensität
der übertragenen
Nachricht bestimmen kann. Chemilumineszierende Verbindungen, die
bei Zerfall in Substanzen wie z. B. mäßig polare oder polare aprotische
Lösungsmittel,
z. B. n-Butanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid,
Fluorophore erzeugen, die dann wieder Licht von hinreichender Intensität für einen
leichten Nachweis und zur Quantifizierung emittieren, erzeugen Licht
von erheblich geringerer Intensität, wenn sie in einem polaren
erotischen Milieu zerfallen, und besonders in wäßrigen Medien. Da aber alle
biologischen Systeme wäßrig sind – tatsächlich bestehen
Menschen zu etwa 97% aus Wasser – ist die Notwendigkeit zur
Verstärkung
der Intensität
von Licht offensichtlich, das durch chemilumineszierende Marker
oder Substrate in Immunoassays, DNA-Sonden-Assays, chemisch/physikalischen
Sondenverfahren und anderen Bioassays erzeugt wird. Ein Möglichkeit
zur Bereitstellung einer derartigen Verstärkung ist die Verwendung kostspieliger
optischer oder elektronischer Geräte: Einzelphotonenzähler, Luminometer,
Szintillationszähler
usw.
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Obwohl
Dioxetane besonders für
eine verbesserte Empfindlichkeit in Assays zum Nachweis der Gegenwart
von Analyten in Konzentrationen von nur 10
–12 M
entwickelt worden sind, werden Dioxetane in bestimmten Anwendungen
in Verbindung mit Verstärkern
eingesetzt, um Analyten in Konzentrationen von 10
–12 M
oder niedrigeren Konzentrationen nachzuweisen. Diese Verstärkungsmittel,
zu denen natürliche
und synthetische wasserlösliche
Makromoleküle
gehören,
werden in dem
US-Patent Nr. 5
145 772 offenbart. Bevorzugte Verstärkungsmittel sind unter anderem
wasserlösliche
polymere quaternäre
Ammonium-, Phosphonium- oder Sulfoniumsalze und Copolymere oder
Gemische davon, wie zum Beispiel Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid)
(TMQ), Poly(vinylbenzyltributylammoniumchlorid) (TBQ) und Poly(vinylbenzyldimethylbenzylammoniumchlorid)
(BDMQ).
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Diese
Verstärkungsmittel
verbessern das Chemilumineszenzsignal der Dioxetan-Reportermoleküle, offenbar
durch Bilden eines hydrophoben Milieus, in dem das Dioxetan sequestriert
wird. Wasser, wegen der Verwendung von Körperflüssigkeiten in den meisten Assays
unvermeidbar, ist ein natürlicher "Quencher" (Löscher) der
Dioxetan-Chemilumineszenz. Die Verstärkungsmoleküle schließen offensichtlich Wasser aus
dem Mikromilieu aus, in dem sich die Dioxetanmoleküle oder
zumindest die Emitterspezies im angeregten Zustand befinden, wodurch
verstärkte
Chemilumineszenz entsteht. Andere Effekte, die mit der Verstärker-Dioxetan-Wechselwirkung
verbunden sind, könnten
gleichfalls zu der Chemilumineszenzverstärkung beitragen.
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Außer Dioxetan
sind Luminol-Derivate, Acridiniumester, Acridiniumsulfonylamide
und Luciferin als chemilumineszierende Marker in Bioassays verwendet
worden. (Schroeder et al., Anal. Chem., 50, 1114 (1978); Arakawa
et al., Anal. Biochem., 79, 248 (1979); und Arakawa et al., Clin.
Chem., 31, 430 (1985). Übersichten
siehe: Kricka et al., Clinical and Biochemical Luminescence, L.
J. Kricka und T. J. N. Carter (Hrsg.), Kap. 8, Marcel Dekker, Inc.,
New York (1982); Kricka, Ligand-Binder Assays, Kap. 7, Marcel Dekker,
Inc., New York (1985); McCapra et al., Bioluminescence and Chemiluminescence:
Instruments and Applications, Bd. I, K. van Dyke (Hrsg.), CRC Press,
Inc., Boca Raton, Fla. (1985), Kap. 2 (zu beachten ist besonders
der Abschnitt über
Dioxetane, S. 13); und Barnard et al., ebenda, Kap. 7). Die Enzym-Marker
sind durch Farb- oder Fluoreszenzentwicklungsverfahren nachgewiesen
worden. In jüngerer
Zeit beruhten chemilumineszierende Enzymimmunoassays auf Peroxidase-Konjugaten,
die mit Luminol/Wasserstoffperoxid, Pyrogallol/Wasserstoffperoxid, Pholas
dactylus-Luciferin oder Luminol unter alkalischen Bedingungen analysiert
wurden (Kricka et al., Clinical and Biochemical Luminescence, Kap.
8, L.J. Kricka und T. J. N. Carter (Hrsg.), Marcel Dekker, Inc.,
New York (1982)).
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In
Bioorganic and Medical Chemistry Letters, Bd. 8, Nr. 24, 15. Dezember
1998, S. 3595–3598,
werden Signalgeneratoren auf Acridiniumbasis mit Dendrimerkernen
offenbart.
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In
Tetrahedron, Bd. 55, Nr. 47, 19. November 1999, S. 13377–13394,
werden Dendrimere offenbart, die aus chemilumineszierenden Komponenten
bestehen.
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WO95/01341 offenbart Dendrimere
mit Acridinium-Komponenten, die an das Dendrimer gebunden sind.
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In
Angewandte Chemie: International Bd. 33, Nr. 10, 10. Juni 1994,
S. 1044–1072,
werden verschiedene chemilumineszierende Derivate zur Verwendung
als Marker für
den Nachweis von Analyten in einer Probe offenbart.
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Als
Hintergrund kann erwähnt
werden, daß die
enzymatisch aktivierten chemilumineszierenden Substrate als Reportermoleküle verwendet
werden, indem sie als Substrate für Enzyme wirken, die eine daran
gebundene enzymlabile Gruppe abspalten. Auf diese Weise kann das
Enzym (z. B. alkalische Phosphatase) kovalent gebunden oder sonst
entweder mit einem Antigen oder einem Antikörper in herkömmlichen
Antigen/Antkörper-Ligandbindungsassays
oder mit einer DNA-Sonde in DNA-Sonden-Assays komplexiert werden. Das enzymtragende
Antigen oder der enzymtragende Antikörper oder die DNA-Sonde wird
dann dem Analyten, von dem vermutet wird, daß er das Zielantigen oder die
Ziel-Nucleinsäuresequenz
enthält,
unter Bedingungen beigemischt, die eine Komplexbildung oder Hybridisierung
zwischen dem Antigen/Antikörper
oder der Sonde/Nucleinsäuresequenz
zulassen. Nach dem Auswaschen oder Abtrennen alles nicht komplexierten
oder nicht hybridisierten Materials wird das chemilumineszierende
Substrat zugesetzt. Wenn der verdächtigte Analyt anwesend ist,
wird das Enzym das chemilumineszierende Substrat mit der enzymlabilen
Gruppe aufspalten, wodurch ein Zwischenprodukt entsteht, das zerfällt. Das
Zerfallsereignis ist das lichtauslösende Ereignis.
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Zum
Nachweis von Analyten in extrem niedrigen Konzentrationen (beispielsweise
unter etwa 10–12 M) ist
es wünschenswert,
die Intensität
des Signals des Reportermoleküls
des chemilumineszierenden Substrats zu verbessern, und gleichzeitig
ist es wünschenswert,
eine Steigerung des Hintergrundrauschens aufgrund nichtenzymatisch
induzierter Lichtauslösung
zu vermeiden, um die Gesamtempfindlichkeit des Assays zu verbessern.
Daher werden weitere Verbesserungen bei der Anwendung chemilumineszierender
Substrate angestrebt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Leistung von chemilumineszierenden
Substraten zu verbessern, einschließlich einer Verbesserung der
Maschinenlesbarkeit, der Empfindlichkeits- und Leistungsaspekte
der Assays, die ihrerseits von dem durch das chemilumineszierende
Reportermolekül
ausgelösten
Signal abhängen.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verbesserung der Intensität und Auflösung des
Signals der chemilumineszierenden Substrate und die gleichzeitige
Vermeidung einer Erhöhung
des Hintergrundrauschens aufgrund nichtenzymatisch induzierter Lichtauslösung, um
die Gesamtempfindlichkeit des Assays zu verbessern und klinische
Assays zu automatisieren, und um für ein Screening mit hohem Durchsatz
auf Anordnungen bzw. Chips mit hoher Dichte (Mikrochips) zu sorgen.
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Die
obigen Ziele werden durch eine neue Klasse von chemilumineszierenden
dendritischen Polymersubstraten erreicht, in denen das Lichtsignal
durch Binden eines oder mehrerer enzymaktivierbarer chemilumineszierender
Substrate an ein dendritisches Polymer verstärkt wird. Die Signalauflösung kann
sich auch durch den Reibungswiderstand der hochmolekularen dendritischen
Hauptkette, d. h. durch verlangsamte Moleküldiffusion infolge erhöhter Molekülgrößen-, Form-,
Verzweigungs- und/oder kumulativer Ladungseffekte verbessern, welche
die Lichtemission auf den Bereich der Substrataktivierung durch
einen Enzymmarker beschränken.
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Dementsprechend
bietet die vorliegende Erfindung ein Abgabesystem für ein chemilumineszierendes Substrat,
das aufweist:
ein Dendrimer; und
mindestens ein mit dem
Dendrimer konjugiertes, enzymatisch aktivierbares chemilumineszierendes
Substrat, wobei das chemilumineszierende Substrat eine Dioxetan-Komponente
aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung
des Abgabesystems für
ein erfindungsgemäßes chemilumineszierendes
Substrat bereit, das aufweist:
kovalente Bindung eines oder
mehrerer Moleküle,
die eine enzymatisch aktivierbare chemilumineszierende Komponente
aufweisen, an das Dendrimer; oder
kovalente Bindung eines oder
mehrerer Moleküle,
die einen Vorläufer
einer enzymatisch aktivierbaren chemilumineszierenden Komponente
aufweisen, an das Dendrimer und danach Umwandeln des Vorläufers der
chemilumineszierenden Komponente in eine chemilumineszierende Komponente.
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Die
Erfindung stellt ferner eine Ausstattung zur Durchführung eines
Assays bereit, um die Anwesenheit oder Konzentration eines Analyten
in einer Probe zu ermitteln, wobei die Ausstattung aufweist:
ein
Dendrimer, das mindestens eine enzymatisch aktivierbare chemilumineszierende
Substratkomponente aufweist, und ein Enzym, das imstande ist, das
chemilumineszierende Substrat zu aktivieren, um ein peroxygeniertes
Zwischenprodukt zu erzeugen, das sich zersetzt, um Licht zu erzeugen,
wobei die enzymatisch aktivierbare chemilumineszierende Substratkomponente
ein Dioxetan mit einer enzymlabilen Gruppe aufweist, und wobei das
Enzym die enzymlabile Gruppe spalten kann, um das peroxygenierte
Zwischenprodukt zu erzeugen.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit
eines Analyten in einer Probe bereit, wobei das Verfahren aufweist:
Bilden
eines Enzymkomplexes zwischen einem Enzym und einer Substanz, die
an den Analyten bindungsfähig ist;
Zugabe
des Enzymkomplexes zu der Probe;
Zulassen einer Bindung des
Enzymkomplexes mit dem in der Probe anwesenden Analyten;
Zugabe
eines Chemilumineszenz-Abgabesystems zu der Probe; und Messung von
Chemilumineszenzemissionen von der Probe;
wobei das Chemilumineszenzabgabesystem
ein Dendrimer und mindestens ein mit dem Dendrimer konjugiertes,
enzymatisch aktivierbares chemilumineszierendes Substrat aufweist,
und wobei der gemessene Betrag der Chemilumineszenzemissionen die
Anwesenheit und/oder die Konzentration des Analyten in der Probe
anzeigt, wobei das chemilumineszierende Substrat eine Dioxetan-Komponente
aufweist.
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Die
erfindungsgemäßen chemilumineszierenden
Substrate können
durch Binden mehrerer Substrat-Reportermoleküle an einen Verstärkungsbereich
des dendritischen Polymers weiter verstärkt werden. Auf diese Weise
kann eine effizientere Sequestration des Substrats durch wäßrige Abschreckung
realisiert werden. Sobald das Substrat erzeugt ist, kann sich das
entstehende Reportermolekül
für eine
effiziente verstärkte Chemilumineszenz
in den nahen hydrophoben Verstärkungsbereich
des dendritischen Polymers falten. Das verstärkte Chemilumineszenzsignal
führt zu
erhöhter
Nachweisempfindlichkeit.
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Entsprechend
den obigen Aufgaben bietet die Erfindung Verbesserungen der Nachweisbarkeit
elektromagnetischer (z. B. optisch nachweisbarer) Energie, die durch
den Zerfall der chemilumineszierenden Substrate in wäßrigen und
gemischten Medien freigesetzt wird. Insbesondere bietet die Erfindung
Mittel zum verbesserten Nachweis elektromagnetischer (z. B. optisch
nachweisbarer) Energie, die durch den Zerfall chemilumineszierender
Substrate freigesetzt wird, die zum Nachweis der Anwesenheit oder
zur Bestimmung der Konzentration oder Struktur einer Substanz in
einer wäßrigen und
gemischten Probe dienen. Die Erfindung bietet ferner Verbesserungen
der Nachweisbarkeit elektromagnetischer (z. B. optisch nachweisbarer)
Energie, die durch den Zerfall chemilumineszierender Substrate freigesetzt
wird, die zum Nachweis der Anwesenheit oder zur Bestimmung der Konzentration
chemischer oder biologischer Substanzen durch technisch anerkannte
Immunoassay-, chemische Assay- oder
DNA-Sondenassay-Verfahren dienen. Die Erfindung bietet außerdem Verbesserungen
der Nachweisbarkeit elektromagnetischer (z. B. optisch nachweisbarer)
Energie, die durch den Zerfall chemilumineszierender Substrate zur
Untersuchung von Molekülstrukturen
oder Mikrostrukturen freigesetzt wird.
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Die
Erfindung bietet ferner Verfahren zur Herstellung chemilumineszierender
dendritischer Polymersubstrate und von Zwischenprodukten dafür. Zum Beispiel
weist ein erstes Verfahren zur Herstellung eines Konjugats eines
dendritischen Polymers und eines chemilumineszierenden Substrats
die Reaktion des dendritischen Polymers mit dem chemilumineszierenden
Substrat in einem geeigneten Lösungsmittel
bei einer Temperatur auf, welche die Assoziation des chemilumineszierenden
Substrats und des dendritischen Polymers erleichtert. Auf diese
Weise kann die dendritische Oberfläche durch Bindung an Moleküle, wie
z. B. Dioxetane, Luminole, Isoluminole, Acridiniumester, Acridiniumsulfonylamide
und andere Luciferine, die eine geeignete reaktive Stelle an einer
Linkerkomponente aufweisen, modifiziert werden. Eine vollständigere
Diskussion des Verfahrens wird weiter unten gegeben.
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Die
vorliegende Erfindung ist folglich auf dendritische chemilumineszierende
Polymersubstrat-Konjugate,
Verfahren zur Herstellung der Konjugate, Zusammensetzungen, welche
die Konjugate enthalten und Verfahren zur Verwendung der Konjugate
und Zusammensetzungen gerichtet.
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Diese
und weitere Aufgaben sowie die Natur, der Umfang und die Nutzung
der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann leicht aus der
nachstehenden Beschreibung und den Zeichnungen ersichtlich.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die
vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
besser verständlich.
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Die 1A–1D zeigen
die Strukturen einer Anzahl von im Handel erhältlichen Dendrimeren, wobei 1A ein
Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer mit NH2-Oberflächengruppen
zeigt; 1B ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer
mit Carbonsäure-Oberflächengruppen
zeigt; 1C ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer
mit Hydroxyl-Oberflächengruppen
zeigt; und 1D ein Polypropylenimin-(PEI-)Dendrimer mit
NH2-Oberflächengruppen zeigt;
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die 2A–2L zeigen
erfindungsgemäße Dioxetan-Bindungsvorläufer;
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die 3A–3O zeigen
erfindungsgemäße dendritische
Dioxetan-Polymerkonjugate;
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die 4A–4F zeigen
das Syntheseschema für
die in den 3A–3L dargestellten
dendritischen Polymerkonjugate, wobei: 4A 3A und 3G entspricht; 4B 3B und 3H entspricht; 4C 3C und 3I entspricht; 4D 3D und 3J entspricht; 4E 3E und 3K entspricht;
und 4F 3F und 3L entspricht;
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die 5A–5I und die 6A–6R zeigen erfindungsgemäße dendritische Isoluminol-,
Acridiniumester-, Acridiniumsulfonylamid- und Luciferin- Polymerkonjugate;
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die 7A–7C zeigen die Synthese von erfindungsgemäßen dendritischen
Isoluminol-Polymerkonjugaten;
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die 8A–8F zeigen die Synthese von erfindungsgemäßen dendritischen
Acridiniumester- und
Acridiniumsulfonylamid-Polymerkonjugaten;
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die 9A–9C zeigen
erfindungsgemäße dendritische
Dioxetan- und Isoluminol-, Dioxetan- und Acridiniumester- und Dioxetan-
und Acridiniumsulfonylamid-Polymerkonjugate;
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10 zeigt
erfindungsgemäße gebundene
Dioxetane und quaternäre
Amin-Verstärker;
und
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11 zeigt
erfindungsgemäße dendritische
Dioxetan-Verstärkerhybride.
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Die
obigen Figuren dienen lediglich zur Veranschaulichung und sind nicht
als Einschränkung
des Umfangs der Erfindung aufzufassen.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Gestaltung enzymatischer Assays liefert eine erhebliche Signalverstärkung durch
enzymatischen Umsatz von Substrat zur Erzeugung eines Signals mit
erhöhter
Nachweisempfindlichkeit. Die Enzymsubstrate sind gewöhnlich kolorimetrisch,
fluorimetrisch oder chemilumineszierend. Im allgemeinen liefern
chemilumineszierende Enzymsubstrate einen breiteren dynamischen
Nachweisbereich ebenso wie eine erhöhte Empfindlichkeit wegen eines
niedrigeren Eigenrauschens (wie z. B. Lichtstreuung und Autofluorezenz)
und ein Ausgangssignal von höherer
Intensität.
Die Instrumentierung für
den Nachweis eines Chemilumineszenz-Ausgangssignals ist gleichfalls
einfacher als die zum Nachweis von Fluoreszenz erforderliche Instrumentierung, da
keine Anregungsquelle benötigt
wird. Bei der vorliegenden Erfindung enthält das chemilumineszierende Substrat
Dioxetane (die durch hydrolytische Enyzme aktiviert werden, wie
z. B. Esterasen, alkalische Phosphatasen und Glycosidasen wie etwa β-Galactosidase
und β-Glucuronidase). Außerdem verwendbare
chemilumineszierende Substrate sind unter anderem Luminole, Isoluminole,
Acridiniumester, Acridiniumsulfonylamide und Luciferine (aktiviert
durch oxidative Enzyme, wie z. B. Meerrettichperoxidase, Glucose-
oder Galactoseoxidase und Luciferase). Diese Substrate werden enzymaktiviert,
um destabilisierte peroxygenierte Zwischenprodukte zu erzeugen,
die sich unter Lichtemission zersetzen. Die Messung des resultierenden
Chemilumineszenzsignals ermöglicht
den Nachweis von Enzymmarkern in Immunoassay-, Reportergen-Assay-, DNA-Sonden-Assay-
und -Chip-Formaten.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung können
chemilumineszierende dendritische Polymersubstrate synthetisiert
werden, die ein oder mehrere Dioxetane enthalten, die an die Oberfläche von
bekannten Dendrimer-Polymeren gebunden sind. Nicht einschränkende Beispiele
einiger Dendrimer-Ausgangsmaterialien,
die zur Synthese der chemilumineszierenden dendritischen Polymersubstrate
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind in den 1A–1D abgebildet. 1A zeigt ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer
mit NH2-Oberflächengruppen. 1B zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer mit Carbonsäure-Oberflächengruppen. 1C zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM)Dendrimer mit Hydroxyl-Oberflächengruppen. 1D zeigt
ein Polypropylenimin-(PEI)Dendrimer mit NH2-Oberflächengruppen.
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Bindungsvorläufer von
chemilumineszierenden Substraten, die zur Synthese der erfindungsgemäßen chemilumineszierenden
dendritischen Polymersubstrate verwendet werden können, sind
in den 2A–2L dargestellt.
In den 2A–2L sind
die Substituenten wie folgt definiert:
A ist H, Alkyl, Trihalogenalkyl
oder -aryl;
B ist NA, NC(O)A, O, S oder CH2,
wobei A unabhängig
voneinander H, Alkyl, Trihalogenalkyl oder -aryl ist;
Y ist
unabhängig
voneinander H, eine Hydroxylgruppe, eine Halogengruppe, eine nichtsubstituierte
niedere Alkylgruppe, eine niedere Hydroxyalkylgruppe, eine niedere
Halogenalkylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe,
eine Alkoxyphenylgruppe, eine Alkoxyphenoxygruppe, eine Hydroxyalkoxygruppe,
eine Cyanogruppe, eine Amidgruppe, eine Alkoxygruppe oder eine Carboxylgruppe;
R
ist eine Alkylgruppe (z. B. eine C1-C12-Alkylgruppe), eine Halogenalkylgruppe
(z. B. ein Mono-, Di- oder Trihalogenalkyl), eine Arylgruppe oder
eine Aralkylgruppe;
X ist eine enzymlabile Gruppe, die am der
Gruppe ausgewählt
ist, die aus einem Phosphat, Galactosid, Acetat, 1-Phospho-2,3-diacylglycerid,
1-Thio-D-glycosid, Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Adenosinmonophosphat,
Adenosin, α-D-Glucosid, β-D-Glucosid, β-D-Glucuronid, β-D-Mannosid, β-D-Fructofuranosid, β-Glucosiduronat;
5-Acetamido-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosid
und Alkoxy-Derivaten (z. B. 4,7-Di-O-methyl), p-Toluolsulfonyl-L-argininester
und p-Toluolsulfonyl-L-argininamid
besteht;
Z ist eine Halogen-, Alkoxy- oder Alkylgruppe; und
T
ist H, eine elektronenabgebende Gruppe, eine elektronenziehende
Gruppe oder eine organische Linkergruppe, die an einen Hilfsfluorophor
oder an irgendeine biologische Komponente gebunden sein kann.
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Beispiele
allgemeiner Strukturen von dendritischen Polymer-Dioxetan-Konjugaten
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind in den 3A–3O dargestellt.
In den 3A–3L sind
die Substituenten A, B, Y, R, X, Z und T definiert, wie oben in
Bezug auf die 2A–2L dargelegt.
N, das die Anzahl der mit dem Dendrimer konjugierten Dioxetan-Komponenten
darstellt, ist eine positive ganze Zahl. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist N in den 3A–3F gleich
6 bis 768.
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3M zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Starburst-Dendrimer mit Carbonsäure-Oberflächengruppen,
die mit einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Dioxetanen konjugiert sind. 3N zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Starburst-Dendrimer mit endständigen Aminogruppen,
die mit einer Vielzahl von Dioxetanen gemäß einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung konjugiert sind. 3O zeigt
ein Polypropylenimin-(PEI-)Starburst-Dendrimer mit Amino-Oberflächengruppen,
die mit einer Vielzahl von Dioxetanen gemäß einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung konjugiert sind.
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Die 4A–4F zeigen
Syntheseschemata für
die in den 3A–3L dargestellten
dendritischen Polymerkonjugate. In den 4A–4F entsprechen
die Substituenten A, B, Y, R, X und N der oben gegebenen Definition.
Der "Aktivator" kann ein gemischtes
Anhydrid, ein NHS-Ester oder eine andere Standardfunktionalität sein,
die in der Peptidchemie zur Erleichterung der Bildung von Peptidbindungen
eingesetzt wird. Die "austretende
Gruppe" kann ein
Halogen oder Sulfonsäureester
sein, wie z. B. Mesylat, Tosylat oder Triflat.
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In 4A kann
der Substituent "Aryl" eine Phenylgruppe
oder ein Benzothiazol sein, wie in den 3A oder 3G definiert.
In 4B kann der Substituent "Aryl" eine
Phenylgruppe oder eine Benzothiazol sein, wie in den 3B oder 3H definiert.
In 4C kann der Substituent "Aryl" eine
Phenylgruppe oder ein Benzothiazol sein, wie in den 3C oder 3I definiert.
In 4D kann der Substituent "Aryl" eine Phenylgruppe
oder ein Benzothiazol sein, wie in den 3D oder 3J definiert.
In 4E kann der Substituent "Aryl" eine
Phenylgruppe oder ein Benzothiazol sein, wie in den 3E oder 3K definiert.
In 4F kann der Substituent "Aryl" eine
Phenylgruppe oder ein Benzothiazol sein, wie in den 3F oder 3L definiert.
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Es
kann außerdem
wünschenswert
sein, zwei oder mehr verschiedene chemilumineszierende Substrate
an eine Dendrimer-Hauptkette zu binden. Beispiele von derartigen
chemilumineszierenden dendritischen Polymersubstraten mit doppeltem
Enzym-Marker sind in den 9A–9C dargestellt. 9A zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Starburst-Dendrimer gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung, das mit Dioxetan- und Isoluminol-Komponenten konjugiert
ist. 9B zeigt ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Starburst-Dendrimer gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung, das mit Dioxetan- und Acridiniumester-Komponenten konjugiert
ist. 9C zeigt ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Starburst-Dendrimer gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung, das mit Dioxetan- und
Acridiniumsulfonamid-Komponenten konjugiert ist.
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10 zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer mit Amino-Oberflächengruppen
gemäß einer Ausführungsform
der Erfindung, die mit Dioxetan-Komponenten und quaternären Ammonium- Verstärkerkomponenten
konjugiert sind. Wie in 10 dargestellt,
sind die quaternären
Ammonium-Verstärkerkomponenten perbutylierte
Ammonium-Komponenten.
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11 zeigt
ein Polyamidoamin-(PAMAM-)Dendrimer mit Carbonsäure-Oberflächengruppen, die sowohl mit
Dioxetan-Komponenten als auch mit Verstärkerkomponenten gemäß einer
weiteren Ausführungsform der
Erfindung konjugiert sind. Die erfindungsgemäßen Verstärkerkomponenten können sein:
polymeres quaternäres
Ammonium mit endständigen
Aminogruppen, Phosphonium- oder Sulfoniumsalze; quaternäre Jeffamine
mit endständigen
Aminogruppen; quaternisierte Polyethylenimine mit endständigen Aminogruppen
oder Poly(2-, 3- oder 4-vinylpyridinium)-Salze mit endständigen Aminogruppen.
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Ein "dendritisches Polymer" ist ein Polymer,
das eine regelmäßige dendritische
Verzweigung aufweist, die durch das sequentielle oder generationsweise
Hinzufügen
von verzweigten Schichten zu oder von einem Kern gebildet wird.
Der Begriff "dendritisches
Polymer" umfaßt "Dendrimere", die durch einen
Kern, mindestens eine innere verzweigte Schicht und eine verzweigte
Oberflächenschicht
gekennzeichnet sind. (Siehe Petar R. Dvornic und Donald A. Tomalia
in Chem. in Britain, 641–645,
August 1994.) Ein "Dendron" ist eine Dendrimer-Spezies
mit Verzweigungen, die von einem Brennpunkt ausgehen, der entweder
direkt oder über
eine verbindende Komponente mit einem Kern verbunden ist oder verbunden
sein kann, um ein Dendrimer zu bilden. Viele Dendrimere weisen zwei
oder mehrere Dendrone auf, die mit einem gemeinsamen Kern verbunden sind.
Der Begriff "Dendrimer" wird jedoch allgemein
so verwendet, daß er
ein einzelnes Dendron umfaßt.
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Dendritische
Polymere schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Dendrimere mit symmetrischer und unsymmetrischer Verzweigung,
Kaskadenmoleküle,
Arborole und dergleichen, obwohl die besonders bevorzugten dendritischen
Polymere dichte Sternpolymere sind. Die hierin offenbarten dichten
PAMAM-Sterndendrimere sind insofern symmetrisch, als die Verzweigungsarme
von gleicher Länge
sind. Die Verzweigung tritt an den Wasserstoffatomen einer endständigen -NH2-Gruppe an einer Verzweigung der vorhergehenden Generation
auf.
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Hyperverzweigte
Polymere, z. B. hyperverzweigte Polyole, auch wenn sie nicht durch
reguläre
sequentielle Hinzufügung
verzweigter Schichten gebildet werden, können einem dendritischen Polymer äquivalent
sein, falls die Verzweigungsstruktur einen Regularitätsgrad aufweist,
der der eines Dendrimers annähert.
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Topologische
Polymere mit größen- und
formgesteuerten Domänen
sind Dendrimere, die durch ihre reaktiven endständigen Gruppen miteinander
verbunden sind (beispielsweise durch eine kovalente Brückenbindung
oder durch eine andere Verbindung, wie nachstehend definiert) und
als "verbrückte Dendrimere" bezeichnet werden.
Wenn mehr als zwei dichte Sterndendrimere miteinander verbunden
sind, werden sie als "Aggregate" oder "dichte Sternaggregate" bezeichnet.
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Daher
schließen
dendritische Polymere verbrückte
Dendrimere und Dendrimeraggregate ein. Dendritische Polymere umfassen
sowohl generationsweise monodisperse als auch generationsweise polydisperse Lösungen von
Dendrimeren. Die Dendrimere in einer monodispersen Lösung sind
im wesentlichen alle von der gleichen Generation und daher von einheitlicher
Größe und Form.
Die Dendrimere in einer polydispersen Lösung weisen eine Verteilung
von Dendrimeren aus unterschiedlichen Generationen auf.
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Dendritische
Polymere umfassen auch oberflächenmodifizierte
Dendrimere. Zum Beispiel kann die Oberfläche eines PAMAM-Dendrimers
durch Zusatz einer Aminosäure
(z. B. Lysin oder Arginin) modifiziert werden.
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Zur
Bindung von Vorläufern
chemilumineszierender Substrate an dendritische Polymere können verschiedene
allgemeine Bindungsschemata verwendet werden. Ein erstes Verfahren
erfordert die Reaktion von primären
oder sekundären
amino-gebundenen Vorläufern,
wie z. B. Alkenen oder Enolethern (d. h. für die Herstellung von Dioxetanen),
Luminolen, Isoluminolen oder Acridiniumestern oder Acridiniumsulfonylamiden,
mit einem dendritischen Polymer mit endständigen Carboxylat-Gruppen,
das als gemischtes Anhydrid oder als aktivierter Ester oder mit
einem Kopplungsmittel, wie z. B. Carbodiimiden, Phosphonium- oder
Ammoniumsalzen, zur Bildung einer Amidbindung aktiviert wird. Alternativ
kann ein dendritisches Polymer mit endständigen Aminogruppen mit einem
estergebundenen Vorläufer
eines chemilumineszierenden Substrats reagieren, um Amidbindungen
zu bilden. Diese Typen von Amidbindungen bildenden Reaktionen sind
in der Literatur zur Peptidsynthese gut dokumentiert und können leicht
durch einen Fachmann ausgeführt
werden. Ein zweites Verfahren erfordert die Bildung von Ether- oder
Aminbindungen durch nucleophile Substitution einer austretenden
Gruppe, wie z. B. eines Halogenids oder eines Sulfonsäureesters
am Linker des Vorläufers
des chemilumineszierenden Substrats durch Amino- oder Alkoxid-Endgruppen
des dendritischen Polymers. Entsprechend kann der gleiche Bindungstyp
durch nucleophile Substitution von austretenden Gruppen an der Oberfläche des
dendritischen Polymers durch Linker mit endständigen Amin- oder Alkoxidgruppen,
an die Vorläufer eines
chemilumineszierenden Substrats gebunden sind, synthetisiert werden.
Ein drittes, in der Farbstoffchemie bekanntes Verfahren erfordert
die Bindung von 1-2-Oberflächengruppen
eines dendritischen Polymers an Cyanurchlorid, wobei die verbleibenden
reaktiven 1-2-Chloride an Cyanurchlorid durch einen Linker mit endständigen Amino-,
Sulfhydryl-, Hydroxyl- oder Phenoxy-Gruppen an dem Vorläufer des
chemilumineszierenden Substrats ausgetauscht werden. Ein viertes
Verfahren konjugiert avidin- oder streptavidin-gebundene Vorläufer von
chemilumineszierenden Substraten mit biotinylierten Dendrimeren
oder konjugiert umgekehrt biotinylierte Vorläufer von chemilumineszierenden
Substraten mit avidin- oder streptavidin-modifizierten Dendrimeren.
Jeder bekannte Linker, der mit den in der Literatur beschriebenen
Standard-Bindungsverfahren gebunden wird, kann zur Bindung von Vorläufern chemilumineszierender
Substrate an dendritische Polymere verwendet werden; die oben beschriebenen
Linker und Bindungsverfahren dienen nur als Beispiele. Geeignete
Kopplungsmittel und Bedingungen können durch einen Fachmann ohne
weiteres ausgewählt
und leicht hergestellt werden.
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Nach
der Bindung des dendritischen Polymers und der Vorläufer eines
chemilumineszierenden Substrats können die Vorläufer des
chemilumineszierenden Substrats modifiziert werden, um die chemilumineszierenden
dendritischen Polymersubstrate zu bilden. Zum Beispiel werden zum
Abschluß der
Synthese von dendritischem Polymerdioxetan die gebundenen Vorläufer-Enolether
zu den entsprechenden Dioxetanen photooxygeniert, und etwaige Modifikationen
zur vollständigen
Bildung der enzymspaltbaren Gruppen, wie z. B. die Abspaltung der
Schutzgruppen von Triesterphosphaten zu Monoesterphosphaten oder
die Deacylierung zu den β-Galactosidethern,
werden ausgeführt.
Wenn dies für
die Dioxetanstabilität
und/oder Verstärkbarkeit gewünscht wird,
können
die Dendrimer-Enolether-Konjugate mit einem Arylalkyl oder Alkylhalogenid
an irgendwelchen Amino-Stellen peralkyliert werden, bevor die weitere
Oxidation zu dem Dioxetan erfolgt.
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Die
oben beschriebenen chemilumineszierenden dendritischen Polymersubstrat-Konjugate
weisen eine verbesserte Lichtintensität und/oder -empfindlichkeit
sowie eine verbesserte Signalauflösung auf. Diese Substrat-Konjugate
sind speziell für
die Verwendung in enzymatischen Assays vorbereitet, wo die hydrolytische
enzymatische Entfernung eines enzymlabilen Substituenten (z. B.
X) an den dendritischen Polymer-Dioxetan-Konjugaten (z. B. durch
alkalische Phosphatase, β-Galactosidase
oder β-Glucuronidase)
den Zerfall von Dioxetan und Chemilumineszenz auslöst. Alternativ
löst die
Oxidation (z. B. durch Meerrettichperoxidase, Glucose-, Galactoseoxidase
und Luciferase) der Konjugate des dendritischen Polymersubstrats
mit Luminol, Isoluminol, Acridiniumester, Acridiniumsulfonylamid
oder Luciferin den Zerfall von Dioxetanon und Chemilumineszenz aus.
Das Enzym kann der Zielanalyt in der Probe sein oder kann ein an
eine Sonde gebundenes Reportermolekül, ein Antigen oder ein Antikörper oder
irgendein Element eines spezifischen Bindungspaares sein, um die
Anwesenheit des anderen Elements des spezifischen Bindungspaares
nachzuweisen. Allgemein gibt es viele verschiedene existierende
Assays und Assayformate, einschließlich Immunoassay- und Chipformate, die
von den chemilumineszierenden dendritischen Polymersubstrat-Konjugaten
Gebrauch machen können und
sämtlich
ein visuell nachweisbares Chemilumineszenzsignal zur Anzeige der
Anwesenheit und/oder Konzentration einer bestimmten Substanz in
einer Probe verwenden.
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Zum
Beispiel kann zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe die Probe
in Kontakt mit dendritischen Polymer-Dioxetan-Konjugaten gebracht
werden, die eine Gruppe tragen, die durch das nachzuweisende Enzym
abgespalten werden kann. Das Enzym spaltet die enzymspaltbare Gruppe
des Dioxans ab, um einen negativ geladenen Substituenten zu bilden
(z. B. ein Sauerstoffanion), der an das Dioxetan gebunden ist. Dieser negativ
geladene Substituent destabilisiert wiederum das Dioxetan und bewirkt
den Zerfall des Dioxetans, um ein chemilumineszierendes Chromophor
zu bilden, das Licht emittiert. Diese Lichtemission wird als Anzeige für die Anwesenheit
des Enzyms nachgewiesen. Durch Messen der Intensität der Lumineszenz
kann die Konzentration des Enzyms in der Probe bestimmt werden.
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Bekannt
ist, daß Lichtlöschungsreaktionen
auftreten, wenn das peroxygenierte chemilumineszierende Substrat
in einem erotischen Lösungsmittel,
wie z. B. Wasser, zerfällt.
Da Assays im allgemeinen in einem wäßrigen Milieu stattfinden,
können
die Lichtlöschungsreaktionen
die beobachtete Chemilumineszenzintensität beträchtlich vermindern. Außerdem ist
bekannt, daß natürlich auftretende
und synthetische wasserlösliche Substanzen,
die im allgemeinen von makromolekularer Größe sind, die Lichtintensität von lichtemittierenden Fluorophoren
erhöhen
können,
die durch den Zerfall von chemilumineszierenden chemischen Verbindungen in
wäßrigen und
gemischten Medien, d. h. in Medien mit einer wäßrigen und einer nichtwäßrigen Komponente, erzeugt
werden. Diese Verstärkungsmittel
verbessern das Chemilumineszenzsignal von chemilumineszierenden
Substraten, offenbar durch Herstellen eines hydrophoben Milieus.
Wasser, wegen der Verwendung von Körperflüssigkeiten oder biologischen
Mitteln ein unvermeidbarer Aspekt der meisten Assays, ist ein natürlicher "Löscher" der Chemilumineszenz. Die Verstärkungsmoleküle schließen offenbar
Wasser aus dem Mikromilieu aus, in dem sich die Emitterspezies im
angeregten Zustand befindet, wodurch eine verstärkte Chemilumineszenz entsteht.
Weitere mit dem Verstärker/chemilumineszierenden
Substrat verbundene Effekte könnten gleichfalls
zur Verstärkung
der Chemilumineszenz beitragen. Wie sie hier diskutiert werden,
können
Verstärkungsmittel,
zu denen wasserlösliche
polymere quaternäre
Ammonium-, Phosphonium- oder Sulfoniumsalze und Copolymere und/oder
Gemische davon gehören,
wie z. B. Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid), Poly(vinylbenzyltributylammoniumchlorid)
und Poly(vinylbenzyldimethylammoniumchlorid), die ausführlich im
US-Patent Nr. 5 145 772 diskutiert
werden, zur Erhöhung
der Empfindlichkeit des Assays verwendet werden.
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Wie
im
US-Patent Nr. 5 145 772 offenbart,
ermöglichen
bestimmte wasserlösliche,
natürlich
auftretende und synthetische Substanzen, im allgemeinen von makromolekularer
Natur, z. B. wasserlösliche
globuläre Proteine,
die hydrophobe Bereiche enthalten: Säugetierserumalbumine wie z.
B. Rinderserumalbumin (BSA) und Humanserumalbumin (HSA), oder wasserlösliche polymere
quaternäre
Ammonium-, Phosphonium- oder Sulfoniumsalze: Poly(vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid)
(TMQ), Poly[vinylbenzyl(benzyldimethylbenzylammoniumchlorid)] (BDMQ),
die Stabilisierung und damit die Erhöhung der Lichtintensität von lichtemittierenden
Fluorophoren, die durch den Zerfall von chemilumineszierenden chemischen
Verbindungen in wäßrigen und
gemischten Medien erzeugt werden. Derartige chemilumineszierende
Verbindungen sind enzymatisch spaltbare 1,2-Dioxetane; und Gemische
von solchen chemilumineszierenden Verbindungen miteinander und mit
einem oder mehreren Hilfsfluorophoren, z. B. Fluorescein, die Energie
von energieemittierenden Fluorophoren aufnehmen, die durch den Zerfall
von chemilumineszierenden Verbindungen erzeugt werden, und ihrerseits
nachweisbare Energie emittieren. Aufgrund der Anwesenheit wirksamer
Mengen einer oder mehrerer Verstärkersubstanzen
wird die Intensität
des Lichts, das in einem wäßrigen Medium
durch auf diese Weise stabilisierte Fluorophore emittiert wird,
im Vergleich zur Intensität
des Lichts, das durch die gleichen Mengen von Fluorophoren in Abwesenheit
derartiger Verstärker
emittiert wird, beträchtlich
erhöht.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung beinhaltet daher die Bindung von Verstärkermolekülen an das
dendritische Polymer oder die Modifikation von reaktiven Oberflächenrestgruppen
an dem dendritischen Polymer, so daß diese Verstärkerbindungsstellen
enthalten. Sobald das dendritische Polymer an 10–90% der reaktiven Stellen
an den Vorläufer
des chemilumineszierenden Substrats (wie oben beschrieben) gebunden
ist, können
die verbleibenden reaktiven Stellen an ein Verstärkungsmittel gebunden oder
chemisch modifiziert werden, um zu einer verstärkenden Oberflächengruppe
zu werden. Oder die Vorläufer
des chemilumineszierenden Substrats können, wenn dies durch Synthesebeschränkungen
erforderlich ist, an reaktive Stellen des dendritischen Polymers
gebunden werden, nachdem die Verstärker-Makromoleküle gebunden sind
oder nachdem einige von den dendritischen reaktiven Gruppen modifiziert
sind. Gemäß einem
ersten Verfahren können
die Verstärkermoleküle, zu denen
beispielsweise natürlich
auftretende makromolekulare Substanzen wie etwa Säugetier-Serumalbumin,
Rinderserumalbumin, Humanserumalbumin, Protein A oder Säugetier-IgG
gehören,
durch Verfahren, die in der Technik der Peptidchemie und Biokonjugation
bekannt sind (z. B. Bindung von zwei Agenzien über eine Streptavidin-Biotin-Affinität) an Oberflächengruppen
des dendritischen Polymers gebunden werden. Nach einem zweiten Verfahren
enthalten die Verstärkermoleküle synthetische
makromolekulare Substanzen mit einer reaktiven Endgruppe oder einem
reaktiven Linker, die jeweils an Oberflächengruppen des dendritischen
Polymers gebunden werden können.
Mögliche
synthetische Verstärkersubstanzen,
die mit einem reaktiven Linker oder einer reaktiven Endgruppe geeignet modifiziert
werden, sind unter anderem Poly(vinylaryl-quaternärammonium)-Salze,
Poly-N-vinyloxazolidinone,
Polyvinylcarbamate, Polyhydroxyacrylate und Polyhydroxymethacrylate,
quaternisierte aminhaltige Oligomere (z. B. Jeffamine), synthetische
Polypeptide (einschließlich
Polylysin und Nylons), Polyvinylalkylether, Polyacrylamide und Polymethacrylamide,
Polyvinylalkohole, Poly-2-,3- oder 4-vinylpyridinium-Salze, Polyvinylalkylpyrrolidinone,
Polyvinylalkyloxazolidone, quaternisierte Polyethylenimine, Poly-N-vinylamine,
alkyliertes oder aryliertes Polyvinylpiperidin, Polyacryloyl, Polymethacryloyl
oder 4-Vinylbenzoylaminimide und dendritische oder hyperverzweigte
Analoge dieser Verbindungen. Nach einem dritten Verfahren werden
reaktive Oberflächen-
und/oder innere Gruppen an dem dendritischen Polymer chemisch so
modifiziert, daß sie
Verstärkerkomponenten
liefern. Beispiele der Modifikation von dendritischen Polymeren,
um eine Chemilumineszenz-Verstärkung
zu ermöglichen,
sind unter anderem die Peralkylierung von endständigen und/oder inneren Aminen
und die Reaktion von endständigen
aktiven Estern mit amino-gebundenen Ammonium-, Phosphonium- oder
Sulfoniumsalzen. Gemäß einem
vierten Verfahren wird ein chemilumineszierendes dendritisches Polymersubstrat
durch einen Linker an einen dendritischen polymeren Verstärker gebunden,
um eine verbrückte
Dendrimerstruktur zu bilden.
-
Außerdem kann
eine wasserlösliche
Gruppe (eine oder mehrere), d. h. ein Substituent, der die Löslichkeit
des Dioxetans in wäßriger Lösung verbessert
und zu dem Carbonsäuren
oder Carbonsäureester,
Alkyl- oder Aryloxide, Alkyl-, Aryl- oder Aralkylamide, Alkyl- oder
Arylurethane, Alkyl- oder Arylsulfonamide, Alkyl- oder Arylsulfonsäuren und
quaternäre
Aminosalze gehören,
wobei die besonders bevorzugten löslichmachenden Substituenten
Alkyl- oder Aryloxide, Amide und Sulfonamide sind, dem chemilumineszierenden
Substrat oder dem Dendrimer zugesetzt werden, um die Löslichkeit
des Substrats in der Probe, die im allgemeinen von wäßriger Natur
ist, zu verbessern. Je nachdem, ob der ausgewählte Substituent Wasserstoff
oder elektronenaktiv ist, kann die Identität, neben der Löslichkeit,
die Halbwertszeit (T
1/2) der Zerfallsreaktion,
die Chemilumineszenzausbeute und das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N)
beeinflussen. Geeignete Substituenten und ihre Auswirkung auf die
Dioxethan-Chemilumineszenz werden in Verbindung mit phenoxy-substituierten
Dioxetanen in dem
US-Patent Nr.
5 330 900 , dessen gesamter Inhalt hier durch Verweis einbezogen
wird, diskutiert und offenbart und beansprucht.
-
Die
oben beschriebenen chemilumineszierenden dendritischen Polymersubstrate
können
in jedem auf Reportermolekülen
basierenden Assay mit akzeptierbarer Umgebung verwendet werden.
Beispiele derartiger Assays sind unter anderem Imunoassays zum Nachweis
von Antikörpern
und Antigenen, z. B. Enzymassays und DNA-Assays, beispielsweise
zum Nachweis von Viren (z. B. HTLV III oder Zytomegalovirus) oder
Bakterien (z. B. E. Coli) oder bestimmter Zellfunktionen (z. B.
Rezeptorbindungsstellen).
-
Zum
Nachweis einer Substanz, wie z. B. eines Antikörpers, eines Antigens oder
einer Nucleinsäure, wird
das Enzym, das imstande ist, die enzymspaltbare Gruppe des Dioxetans
abzuspalten, vorzugsweise an eine Substanz mit einer spezifischen
Affinität
zu der nachweisbaren Substanz gebunden (d. h. an eine Substanz,
die spezifisch an die nachweisbare Substanz bindet), z. B. das Antigen,
der Antikörper
oder die Nucleinsäuresonde.
Außer
der direkten Bindung an ein Enzym kann ein Ligand an die Substanz
gebunden werden, die eine spezifische Affinität zu der nachweisbaren Substanz
aufweist. Der Ligand wird dann mit einem mit hoher Affinität an den
Liganden bindenden Mittel nachgewiesen, das mit einem Enzym markiert
ist, das die enzymspaltbare Gruppe des Dioxetans abspalten kann,
oder mit oxidierenden Luminol, Isoluminol, Acridiniumester, Acridiniumsulfonamid
oder Luciferin. Um das Enzym an die Substanz mit spezifischer Affinität zu binden, werden
herkömmliche
Verfahren angewandt, z. B. die Carbodiimidbindung; die Bindung erfolgt
vorzugsweise durch eine Amidbindung.
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Im
allgemeinen werden Assays wie folgt durchgeführt. In einem Beispiel wird
eine Probe, von der vermutet wird, das sie eine nachweisbare Substanz
enthält,
in Kontakt mit einer gepufferten Lösung gebracht, die ein Enzym
enthält,
das an eine Substanz mit einer spezifischen Affinität zu der
nachweisbaren Substanz gebunden ist. Die entstehende Lösung wird
inkubiert, um die Bindung der nachweisbaren Substanz an den Abschnitt
mit spezifischer Affinität
des Komplexes aus der Substanz mit spezifischer Affinität und dem
Enzym zu ermöglichen.
Der überschüssige Komplex
aus der Substanz mit spezifischer Affinität und dem Enzym wird ausgewaschen,
und ein dendritisches chemilumineszierendes Substrat mit einer Gruppe,
die durch den Enzym-Marker des Komplexes aus der Substanz mit spezifischer
Affinität
und dem Enzym spaltbar ist, oder mit einer Gruppe, die durch den
Enzym-Marker des Komplexes aus der Substanz mit spezifischer Affinität und dem
Enzym oxidierbar ist, wird zugesetzt. In einem zweiten Beispiel
wird eine Probe, von der vermutet wird, daß sie eine nachweisbare Substanz
enthält,
in Kontakt mit einer gepufferten Lösung gebracht, die einen Liganden
enthält,
der an eine Substanz mit spezifischer Affinität zu der nachweisbaren Substanz
gebunden ist. Die resultierende Lösung wird inkubiert, um die
nachweisbare Substanz an den Komplex aus der Substanz mit spezifischer
Affinität
und dem Liganden binden zu lassen. Der überschüssige Komplex aus der Substanz
mit spezifischer Affinität
und dem Liganden wird ausgewaschen, und ein Mittel, das an den enzymmarkierten
Liganden bindet, wird zugesetzt und inkubiert, um das an den enzymmarkierten
Liganden bindende Mittel an den Liganden zu binden. Der Überschuß des enzymmarkierten,
an den Liganden bindenden Mittels wird dann ausgewaschen, und ein
dendritisches chemilumineszierendes Substrat mit einer Gruppe, die
durch den Enzymabschnitt des enzymmarkierten, an den Liganden bindenden
Mittels spaltbar ist, wird zugesetzt. In beiden Beispielen zerfällt und
luminesziert das enzymaktivierte peroxygenierte Zwischenprodukt.
Die Lumineszenz wird nachgewiesen, z. B. mit Hilfe einer Küvette oder
eines lichtempfindlichen Films in einem Kameraluminometer oder einer
CCD oder einer Photozelle oder eines Photomultipliers, um die Anwesenheit
und Konzentration der nachweisbaren Substanz darin zu messen.
-
In
einem anderen Assaytyp werden Substanzen mit spezifischer Affinität zu nachweisbaren
Substanzen in biologischen Proben auf festen Trägem in räumlich wohldefinierten Strukturen
angeordnet. Feste Träger,
wie z. B. Glas, Kunststoff, Silicium, Polymer in Planaren oder nichtplanaren,
porösen
oder nichtporösen, massiven
oder perlenförmigen
Formaten werden verwendet. Die nachweisbaren Substanzen in biologischen Proben
können
Nucleinsäuren
oder Proteine sein. Die biologische Probe, welche die nachweisbare(n)
Substanz(en) enthält,
wird mit der Festphasen-Anordnung in Kontakt gebracht und unter
Bedingungen inkubiert, die für
die Bindung der nachweisbaren Substanz(en) optimiert werden. In
einem Fall werden die eine oder die mehreren nachweisbaren Substanzen
durch chemische oder enzymatische Mittel mit nachweisbaren Liganden
vormarkiert und anschließend
mit an den enzymmarkierten Liganden bindenden Mitteln nachgewiesen.
In einem anderen Fall wird die gebundene unmarkierte Substanz mit
einer zweiten enzym- oder ligandenmarkierten Substanz nachgewiesen,
die gleichfalls Affinität
zu der gebundenen nachweisbaren Substanz aus der biologischen Probe
aufweist. Diese Bindung der markierten Substanz kann vor dem Anlagern
der nachweisbaren Substanz an die Anordnung oder nach dem Anlagern
erfolgen. Wenn der Nachweis eine ligandenmarkierte Substanz erfordert,
ist eine zusätzliche
Inkubation mit einem an den enzymmarkierten Liganden bindenden Mittel
erforderlich. Zwischen den Inkubationen werden nach Bedarf geeignete
Waschdurchgänge
durchgeführt.
Der letzte Schritt in allen Fällen
ist die Zugabe eines dendritischen chemilumineszierenden Substrats
mit einer Gruppe, die durch den Enzymabschnitt des enzymmarkierten
Nachweismittels spaltbar ist, oder mit einer Gruppe, die durch den
Enzymabschnitt des spezifischen enzymmarkierten Komplexes oxidierbar
ist. Das enzymaktivierte peroxygenierte Zwischenprodukt zerfällt und
luminesziert. Die Lumineszenz wird mit Hilfe einer ladungsgekoppelten
Kamera (CCD), eines Films oder einer anderen lichtempfindlichen
Abbildungsvorrichtung nachgewiesen, und die in spezifischen Bereichen
gemessene Lichtintensität
wird bestimmt.
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Die
folgenden Beispiele geben eine nähere
Erläuterung
der Erfindung, sind aber nicht als Einschränkung für den Umfang der Erfindung
aufzufassen.
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BEISPIELE
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Synthese von aktivierten Ester-Dendrimeren
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Eine
Lösung
von 100 mg Dendrimer mit endständigen
Carboxylatgruppen (z. B. Starburst-PAMAM-Dendrimer, eingestellt auf pH
7) und N-Hydroxysuccinimid (1,0 Val pro Carboxylat-Endgruppe) in
20 ml trockenem 1,2-Dimethoxymethan wird bei 0°C gerührt. Ein Kopplungsmittel, z.
B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 1,0 Val pro Carbonsäure-Endgruppe)
oder 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI,
1,0 Val pro Carbonsäure-Endgruppe)
wird bei 0°C
zugesetzt, und die Lösung
wird über
Nacht im Kühlschrank
gelagert. Das Harnstoff-Nebenprodukt wird durch Filtration oder
Waschen mit Wasser entfernt (EDCI-Nebenprodukt), das organische
Lösungsmittel
wird verdampft, und das Rohprodukt wird durch Chromatographie gereinigt.
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Synthese von dendritischen Polymer-Enolether-Konjugaten
mit der in 4A oder 4E abgebildeten
allgemeinen Struktur
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Einer
gerührten
Lösung
von 100 mg Dendrimer mit aktivierten endständigen Estergruppen in 15 ml CH2Cl2 mit 0,1 ml Triethylamin
wird Enolether mit einem Linker mit endständigem primärem oder sekundärem Amin
zugesetzt (1,01 Val Enolether pro aktivierter Esterendgruppe; z.
B. Aktivator = N-Hydroxysuccinimidester).
Das Reaktionsgemisch wird über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt,
mit CH2Cl2 auf 75
ml verdünnt
und mit Wasser (3 × 30
ml) und gesättigter
Na2CO3-Lösung (3 × 30 ml)
gewaschen. Die organische Schicht wird über Na2SO4 getrocknet, und das Lösungsmittel wird ausgedämpft, um
das in 4A oder 4E abgebildete dendritische
Enolether-Konjugat zu ergeben.
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Synthese von dendritischen Polymer-Enolether-Konjugaten
mit der in 4B oder 4F dargestellten
allgemeinen Struktur
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Einer
gerührten
Lösung
von 100 mg Dendrimer mit endständigen
Aminogruppen (z. B. Starburst-PAMAM-Dendrimer
oder Polypropylenimintetrahexacontaamin-Dendrimer) in 15 ml CH2Cl2 mit 0,1 ml Triethylamin
wird Enolether mit einem Linker mit endständigem aktiviertem Ester zugesetzt
(1,01 Val Enolether pro NH2-Endgruppe; z.
B. Aktivator = N-Hydroxysuccinimidester). Das Reaktionsgemisch wird über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt,
mit CH2Cl2 auf 75
ml verdünnt
und mit Wasser (3 × 30
ml) und gesättigter
Na2CO3-Lösung (3 × 30 ml)
gewaschen. Die organische Schicht wird über Na2SO4 getrocknet, und das Lösungsmittel wird ausgedämpft, um
das in 4B oder 4F abgebildete
dendritische Enolether-Konjugat
zu ergeben.
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Synthese von dendritischen Polymer-Enolether-Konjugaten
mit der in 4C oder 4D dargestellten
allgemeinen Struktur
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Syntheseschema 1:
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Einer
gerührten
Lösung
von 100 mg Dendrimer mit endständigen
Aminogruppen (z. B. Starburst-PAMAM-Dendrimer
oder Polypropylenimintetrahexacontaamin-Dendrimer) in 15 ml CH2Cl2 mit 0,1 ml Triethylamin
wird Enolether mit einem Linker mit endständigem Halogenid (z. B. I oder
Br) oder Sulfonsäureester
(z. B. Mesylat, Tosylat, Brosylat) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch
wird über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt,
mit CH2Cl2 auf 75
ml verdünnt
und mit Wasser (3 × 30
ml) und gesättigter
Na2CO3-Lösung (3 × 30 ml)
gewaschen. Die organische Schicht wird über Na2SO4 getrocknet, und das Lösungsmittel wird ausgedämpft, um
das in 4C oder 4D abgebildete
dendritische Enolether-Konjugat zu ergeben.
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Syntheseschema 2:
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Einer
gerührten
Lösung
von 100 mg Dendrimer mit endständigen
Brom- oder Tosylat oder Brosylatgruppen (z. B. mit einer austretenden
Gruppe modifiziertes Starburst-PAMAM-Dendrimer) in 15 ml CH2Cl2 mit 0,1 ml Triethylamin
wird Enolether mit einem Linker mit einer endständigen Amin- oder Hydroxylgruppe
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt,
mit CH2Cl2 auf 75
ml verdünnt
und mit Wasser (3 × 30
ml) und gesättigter
Na2CO3-Lösung (3 × 30 ml)
gewaschen. Die organische Schicht wird über Na2SO4 getrocknet, und das Lösungsmittel wird ausgedämpft, um
das in 4C oder 4D abgebildete
dendritische Enolether-Konjugat zu ergeben.
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Synthese von Dioxetan-Polyammonium-
und Dioxetan-Polyvinylpiperidinium-Dendrimer
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Eine
Lösung
von 100 mg Dendrimer mit endständigen
Carboxylatgruppen (z. B. Starburst-PAMAM-Dendrimer, eingestellt auf pH
7), einem Enolether mit einem Linker mit endständigen Aminogruppen (0,5 Val
pro Carboxylat-Endgruppe) und Polymer mit Amino-Endgruppen (0,5
Val pro Carboxylat-Endgruppe, z. B. Polyethylenimin, Poly-N-vinylamin
oder Polyvinylpiperidin) in 20 ml trockenem 1,2-Dimethoxymethan
wird bei 0°C
gerührt.
Bin Kopplungsmittel, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 1,0 Val
pro Carbonsäure-Endgruppe) oder
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(EDCI, 1,0 Val pro Carbonsäure-Endgruppe) wird
bei 0°C
zugesetzt, und die Lösung
wird über
Nacht im Kühlschrank
gelagert. Das Harnstoff-Nebenprodukt wird durch Filtration oder
Waschen mit Wasser entfernt (EDCI-Harnstoff-Nebenprodukt), das organische
Lösungsmittel
wird verdampft, und das rohe Enolether-Verstärker-Dendrimer wird durch Chromatographie
gereinigt. Die Amin-Bindungsstellen werden durch Reaktion mit einem
Alkylhalogenid zu Ammoniumgruppen peralkyliert (z. B. mit Iodmethan
zu Permethylat oder mit Butylbromid zu Perbutylat), und der Enolether
wird zu dem Dioxetan oxygeniert, wie weiter unten beschrieben, um
die Synthese eines dendritischen Dioxetan-Polyammonium- oder dendritischen
Dioxetan-Polyvinylpiperidinium-Substrats abzuschließen.
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Synthese von biotinylierten
Starburst-Dendrimeren
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Eine
0,1-molare Lösung
von Dendrimer mit Amino-Endgruppen (z. B. Starburst-PAMAM-Dendrimer oder Starburst-PEI-Dendrimer,
eingestellt auf pH 7) in Tris-, HEPES-, Phosphat-, Carbonat- oder Borat-Puffer wird
mit N-Hydroxysuccinimidobiotin (0,1–10 mol) bei Umgebungstemperatur
12–48
Stunden umgesetzt. Das biotinylierte Dendrimer wird durch Dialyse,
Größenausschlußchromatographie
(SEC) oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
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Synthese von avidin- oder
streptavidin-konjugierten Starburst-Dendrimeren
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Eine
0,1-molare Lösung
von Dendrimer mit Amino-Endgruppen (z. B. Starburst-PAMAM-Dendrimer oder Starburst-PEI-Dendrimer,
eingestellt auf pH 7) in DMF wird mit Succinylavidin (Sigma) oder
Succinylstreptavidin in Gegenwart eines Kopplungsmittels (z. B.
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(EDCI) umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2–24 Stunden bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Das avidin-konjugierte Dendrimer wird durch Ultrafiltration oder
Sephadex-Säulenchromatographie
gereinigt.
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Alternativ
wird einer gerührten
Lösung
von 100 mg PAMAM-Dendrimer mit Carboxylat-Endgruppen in 15 ml entionisiertem Wasser
Avidin oder Streptavidin und das Kopplungsmittel 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(EDCI) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 8–24 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt,
wobei die Lösung
auf oder nahe pH 5 gehalten wird. Die Reaktionslösung wird ultrafiltriert oder
durch eine Sephadex-Säule
eluiert und ergibt das avidin- oder streptavidin-konjugierte Dendrimer.
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Synthese von Isoluminol-Rinderserumalbumin-Dendrimer
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Eine
wäßrige pH
7-Lösung
von 100 mg avidin-konjugiertem Dendrimer wird einer Lösung von
biotinyliertem Aminobutylethylisoluminol (ABEI) und biotinyliertem
Rinderserumalbumin (BSA) (anwesend im Molverhältnis von 1:1) zugesetzt und
1–24 Stunden
bei Umgebungstemperatur gerührt.
Die Lösung
wird ultrafiltriert, um nicht umgesetzte biotinylierte Agenzien
zu entfernen, und ergibt dendritisches Isoluminol-BSA-Substrat.
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Synthese von dendritischen
Polymer-Dioxetan-Konjugaten
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Eine
10%-ige MeOH/CHCl3-Lösung (50 ml) von Dendrimer-Enolether-Konjugat
(250 mg) mit Tetraphenylporphin (TTP, 10 mg in 5 ml CHCl3) wird in einem Eisbad abgekühlt und
dabei 5 Minuten durch eine Pasteur-Pipette mit Sauerstoff durchperlt.
Der Sauerstoffdurchfluß wird
fortgesetzt, während
die Lösung
mit einer 400-Watt-Natriumdampflampe bestrahlt wird, deren Licht
mit einer 3,0 ml dicken DuPont-Kapton-Folie gefiltert wird. Nach
Abschluß der
Photooxidation werden Lösungsmittel
aus dem Reaktionsgemisch ausgedämpft,
das Reaktionsgemisch wird in Wasser gelöst und in einer PLRP-S-Säule (Polymer
Laboratories) unter Anwendung eines Acetonitril/Wasser-Gradienten
präparativ
chromatographiert. Der Produktpeak wird an der Vorder- und Rückseite
abgeschnitten, und erfaßt
wird nur die mittlere Fraktion. Der Eluent wird gefriergetrocknet,
um das dendritische Dioxetanprodukt als weißen Feststoff zu erhalten.
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Bestimmung der Chemilumineszenz-Halbwertszeit
von dephosphoryliertem Dioxetan
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Eine
1 ml-Aliquote von dendritischem Polymer-Dioxetan-Konjugat (0,004
mmol) wird in 0,1 M Diethanolamin, 1 mmol MgCl2,
pH 10, auf 30°C äquilibriert.
Alkalische Phosphatase (mit einer Endkonzentration von 1,05 × 10–9 M)
wird dem Reagenzglas zugesetzt, und die Kinetik des Chemilumineszenz-Signals
wird 10 bis 20 Minuten in einem Turner TD-20E-Luminometer gemessen.
Die Halbwertszeit wird aus dem Diagramm von log RLU als Funktion
der Zeit berechnet. Die Chemilumineszenz-Halbwertszeit wird außerdem in
Anwesenheit des Verstärkers
Sapphire-IITM bestimmt (in 0,1 M Diethanolamin,
1 mmol MgCl2, 10% Polyvinylbenzyltributylammoniumchlorid,
Menge 1 mg/ml).
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Bestimmung der Lichtsignalintensität von dephosphorylierten
Dioxetanen
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Eine
0,5 ml-Aliquote von dendritischem Polymer-Dioxetan-Konjugat (0,004
mmol) wird in 0,1 M Diethanolamin, 1 mmol MgCl2,
pH 10, auf 30°C äquilibriert.
Alkalische Phosphatase (Endkonzentration von 1,05 × 10–9 M)
wird dem Reagenzglas zugesetzt, und das Chemilumineszenz-Signal
wird 10 bis 20 Minuten in einem Turner TD-20E-Luminometer gemessen.
Die Lichtsignalintensität
wird aufgezeichnet. Die Lichtsignalintensität wird außerdem in Anwesenheit des Verstärkers Sapphire-IITM bestimmt (in 0,1 M Diethanolamin, 1 mmol MgCl2, 10% Polyvinylbenzyltributylammoniumchlorid,
Menge 1 mg/ml).
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Ein
erfindungsgemäßes dendritisches
Polymer-Dioxetan-Konjugat kann in einem TSH-Assay wie folgt verwendet
werden:
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MATERIALIEN:
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Monoklonaler
Maus-Anti-TSH-β-Antikörper kann
zum Beschichten von 1/8-Zoll-Perlen zur Anlagerung des Analyten
verwendet werden. Monoklonaler Maus-Anti-TSH-Antikörper kann
mit alkalischer Phosphatase konjugiert und als Nachweisantikörper verwendet
werden. TSH ist von Calbiochem, Katalog-Nr. 609396, beziehbar, und
BSA (Typ V – fettsäurefrei)
ist von Sigma, Katalog-Nr. A6003, beziehbar. Die für den Analyten
verwendete Pufferlösung
und das Konjugat können
0,1 M Tris-HCl,
1 mmol MgCl2, und 2 Gew.-% BSA (pH = 7,5) enthalten.
Die Substrat-Pufferlösung
kann 0,1 M Tris, 0,1 mmol MgCl2, 0,1 Gew.-%
BSA (pH = 9,5) und ein dendritisches Polymer-Dioxetan-Konjugat als
chemilumineszierende Verbindung enthalten (50 μg/ml).
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PROTOKOLL
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15 μl TSH-haltige
Analytlösung
wird mit 135 μl
Konjugat-Antikörperlösung vermischt.
Zwei 1/8-Zoll-Perlen
mit der oben beschriebenen Beschichtung werden der Lösung zugesetzt
und 2 Stunden bei 23°C
inkubiert. Die Perlen werden dann viermal mit 0,1 M Tris (pH = 7,5)
gewaschen und in ein Reagenzglas übertragen. 200 μl der gleichen
chemilumineszierenden Verbindung, wie sie in der oben beschriebenen
Substrat-Pufferlösung
verwendet wird, werden dem Reagenzglas zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit
von 20 Minuten wird die Lichtemission in Form von 10-Sekunden-Zählwerten
unter Verwendung eines Berthold Cliniluminat Lumineszenzanalysators
aufgezeichnet.
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Außerdem kann
ein erfindungsgemäßes dendritisches
Polymer-Dioxetan-Konjugat in einem Assay für Human-IgG, für bCG, für alkalische
Serumphosphatase, für
Alphafetoprotein, für
TSH oder für
irgendeine der Substanzen verwendet werden, die gemäß den im
US-Patent Nr. 4 978 314 offenbarten
Protokollen analysiert werden, dessen gesamter Inhalt hier durch
Verweis einbezogen wird.
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Die
erfindungsgemäßen dendritischen
Polymer-Dioxetan-Konjugate können
in einem Nucleinsäurehybridisierungsassay
wie folgt verwendet werden:
Eine Probe von Zerebrospinalflüssigkeit
(CSF), von der vermutet wird, daß sie Zytomegalovirus enthält, wird entnommen
und auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht. Die Probe wird dann
chemisch mit Harnstoff oder Guanidiniumisothiocyanat behandelt,
um die Zellwände
aufzulösen
und alle Zellbestandteile außer
der viralen DNA zu zersetzen. Die so erzeugten Stränge der
viralen DNA werden abgetrennt und an ein Nitrocellulosefilter gebunden.
Eine für
die virale DNA spezifische und mit alkalischer Phosphatase markierte
DNA-Sonde wird dann auf das Filter aufgebracht; die Sonde hybridisiert
mit den komplementären
viralen DNA-Strängen. Nach
der Hybridisierung wird das Filter mit wäßriger Pufferlösung gewaschen,
die 0,2 M NaCl und 0,1 mmol Tris-HCl (pH = 8,10) enthält, um überschüssige Sondenmoleküle zu entfernen.
Ein phosphathaltiges dendritisches Polymer-Dioxetan-Konjugat wird
zugesetzt, und die aus der enzymatischen Zersetzung des Dioxetans resultierende
Lumineszenz wird in einem Luminometer gemessen oder mit photographischem
Film nachgewiesen.
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Die
erfindungsgemäßen dendritischen
Polymer-Dioxetan-Konjugate können
auch in jedem der im
US-Patent
Nr. 4 978 614 offenbarten Assays verwendet werden, dessen
gesamter Inhalt hier durch Verweis einbezogen wird.
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Die
obige Diskussion der vorliegenden Erfindung richtet sich hauptsächlich auf
bevorzugte Ausführungsformen
und deren praktische Ausführung.
Für den
Fachmann wird leicht ersichtlich sein, daß ohne weiteres weitere Änderungen
und Modifikationen bei der tatsächlichen
Implementierung der hierin beschriebenen Konzepte vorgenommen werden
können,
ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
wobei: n eine positive ganze Zahl ist; A für H, Alkyl, Trihalogenalkyl oder Aryl steht und B unabhängig voneinander für NA, NC(O)A, O, S oder CH2 steht.
