JPH11500222A

JPH11500222A - 化学ルミネセンスエネルギー移動アッセイ

Info

Publication number: JPH11500222A
Application number: JP8524903A
Authority: JP
Inventors: ブロンスタイン，イレーナ; エドワーズ，ブルックス; ヴォイタ，ジョン
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Tropix Inc
Priority date: 1995-02-13
Filing date: 1995-02-13
Publication date: 1999-01-06
Also published as: EP0809804A1; WO1996025667A1; EP0809804A4; AU704940B2; AU1911895A

Abstract

(57)【要約】酵素標識した標的やプローブに対する化学発光性基質として、１，２−ジオキセタン類とともにAttoPhos（商標）を用いた結合アッセイにおいて、生体高分子の存在または量を決定するための化学発光アッセイを提供する。更に、ａ）酵素結合体；ｂ）１，２−ジオキセタン類；およびｃ）AttoPhos（商標）を含む、生体高分子の存在または濃度に関するバイオアッセイを行うためのキット類と開示する。

Description

【発明の詳細な説明】化学ルミネセンスエネルギー移動アッセイ技術分野本発明は、１，２−ジオキセタン類と、酵素で標識した蛍光測定用基質の標的またはプローブに対する化学発光性基質としての、AttoPhos（商標）のような疎水性の蛍光測定用基質とを併用して、表面結合アッセイにおける生物学的物質の存在または量を決定するための、エネルギー移動化学ルミネセンスアッセイに関する。ジオキセタン−AttoPhosという受容体−基質対の化学ルミネセンスは、重合体増進剤の添加によって強めることができる。Attophos、次いで１，２−ジオキセタン類を逐次加えることによって、より以上の増強が達成できる。背景技術生物学的物質の存在または濃度の検出のための化学ルミネセンスアッセイは、バイオアッセイを実施する迅速で鋭敏な、容易に読取れる方法として、近年増大する関心を受けている。そのようなアッセイでは、化学発光性化合物をレポーター分子として用い、このレポーター分子が、推測される生体高分子の存否に応じて化学発光する。レポーター分子としての用途に向けて、非常に多様な化学発光性化合物が特定されている。特に関心を受けている化合物の一分類群は、１，２−ジオキセタン類である。１，２−ジオキセタン類は、ジオキセタン環の炭素原子のうち少なくとも１個への安定基の付加によって安定化することができる。例示的な安定基は、スピロ結合アダマンタンである。そのようなジオキセタン類は、他の炭素の位置で、アリール基、好ましくはフェニルまたはナフチルで更に置換することができ、このアリール基は酸素で置換され、それが、酵素に作用されやすい基に結合される。この作用されやすい基を切断できる酵素が接触すると、ジオキセタン類のオキシアニオンが形成されて、ジオキセタン類の分解、および自発的化学ルミネセンスへと導く。非常に多様なそのようなジオキセタン類が、米国特許第5,112,960 号明細書に開示されている。この特許は、アダマンチル安定基に置換基、例えばハロゲン置換基、アルキル基、アルコキシ基などを有するジオキセタン類に焦点を合わせている。そのようなジオキセタン類は、初期に認められたジオキセタン類、例えばＡＭＰＰＤとして一般的に特定される、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン類−３，２’−トリシクロ〕−３．３．１．１^3.7〕デカン〕−４−イル）フェニルホスフェート、特にそのニナトリウム塩にまさる進歩を示している。塩素置換されたその対照物は、安定アダマンチル基を、分解反応を前進させる受動基から、より速やかなジオキセタンアニオンの分解、より大きいシグナル対ノイズ値、およびより優れた感度のために、増強された化学ルミネセンスシグナルを生じる能動基へと転換し、ＣＳＰＤと言われている。その他のジオキセタン類、例えばフェニルオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＡＭＰＧＤ）も周知であり、リポーター分子として用いることができる。これらのジオキセタン類およびその製造は、それ自体は、本明細書による発明の一面を構成しない。これらのジオキセタン類を用いるアッセイは、慣用のアッセイ、例えばサザン、ノーザンおよびウエスタンブロットアッセイ、ＤＮＡ配列決定、ＥＬＩＳＡ、ならびに膜やビーズで実施されるその他の液相および混合相アッセイを包含できる。一般に、検出工程を除き、手順は、標準的な周知のプロトコルに従って実施される。ＤＮＡアッセイでは、標的生物学的物質を、共有結合か間接的にそれに結合した酵素をもつＤＮＡプローブによって結合させ、該プローブを、膜に固定化したサンプルと混合して、ハイブリダイゼーションさせる。その後、過剰な酵素複合体を除去し、ハイブリダイズしたサンプルにジオキセタン類を加える。ハイブリダイゼーションが生じたならば、ジオキセタン類は、結合した酵素によって活性化され、ジオキセタン類の分解、および化学ルミネセンスへと導くことになる。溶液相アッセイでは、酵素を、核酸プローブと結合させるか、または標的生物学的物質に応答する抗体と免疫複合させることが多く、未結合成分を除去し、ジオキセタン類を加え、存在する酵素の量によって活性化されたジオキセタン類の分解によって、化学ルミネセンスを生じる。酵素自体が標的である場合、ジオキセタン類を、サンプルに加えることのみが要される。やはり、米国特許第5,112,960 号明細書はもとより、米国特許第4,978,614 号明細書にも開示されたとおり、非常に多様なアッセイ様式が開発されている。ジオキセタン分解が、プロトン性溶媒、例えば水の中で生じるならば、消光反応が生じることになるのは周知である。問題となっている分析対象物を含むか、または欠くと思われるサンプルは、概して生物学的サンプルであるため、これらのアッセイは、水性の環境で実施するのが一般的である。そのため、消光反応が、ジオキセタンの分解から実際に観測される化学ルミネセンスを、実質的に減少させる可能性がある。特定の分析対象物、例えば核酸、ウイルス抗体その他のタンパク質、特に溶液中か溶液−固相系中で調製されるそれらの低レベルの検出を要するアッセイでは、観測される不可避のバックグラウンドシグナルと結び付いた、減少した化学ルミネセンスが、アッセイの感度を、極めて低レベルの生物学的物質が検出できないように低下させる可能性がある。この問題を指向する一つの方法は、米国特許第5,145,772 号明細書に詳細に開示されたとおり、天然および合成の分子のいずれを包含してもよい水溶性高分子の添加である。この特許の開示は、本明細書中に参考として援用する。同様な効果について、米国特許第4,978,614 号明細書は、サンプルへの様々な水溶性「増強」剤の添加を仕向けたが、該特許は、固体状態のアッセイでの非特異的結合反応を抑制する問題に言及している。米国特許第5,112,960 号明細書では、シグナル対ノイズ比を増大させることによって、化学ルミネセンスを増強し、より高い感度を与える水溶性の重合体第四級アンモニウム塩として、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）（ＴＭＱ）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム）（ＴＢＱ）およびポリ（塩化ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウム）（ＢＤＭＱ）のような、好適な水溶性重合体第四級アンモニウム塩を特定している。類似のホスホニウムおよびスルホニウム重合体塩も、開示されている。この増強は、ジオキセタンオキシアニオンが封鎖される疎水性領域の形成によって、少なくとも部分的には達成される。これらの疎水性領域での分解は、水に基づく消光反応が抑制されるために、化学ルミネセンスを強める。用いられる認識されている水溶性第四級重合体塩のうちでも、ＴＢＱは、この疎水性領域形成の機序によって予想外に優れた増強を与える。アンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウム重合体塩のような水溶性重合物質の添加によって達成される、化学ルミネセンスの増強は、ジオキセタンオキシアニオンと、得られた励起状態の放射体レポーター分子とを疎水性領域に封鎖できる第四級重合体塩の能力を向上させる添加物を、水性サンプルに含めることによって、更に向上させることができる。したがって、重合体第四級塩と添加物との併用は、重合体第四級塩か、または界面活性剤もしくは水溶性重合体自体であるときは、化学ルミネセンスを限られた程度に増強し得る添加物かの添加によって別個に生じるのをはるかに越える増強の増大を生じる。重合体第四級塩と添加物との相乗的併用は、水溶性サンプル中でさえ、１，２−ジオキセタン類の使用によって、低レベルの信頼できる検出を可能にする増強効果を与える。添加物と結合した重合体第四級塩は、０．００５％未満から０．００１％まで下るレベルで、劇的な４〜５倍の増強を示すのに充分なだけ強力な増強剤である。それ以上の量の重合体第四級塩、添加物または両者の、５０％以上までもの多量での添加によって、シグナルの増大、およびシグナル／ノイズ比の向上が達成される。一般に、重合体第四級塩と添加物の双方についてのレベルは、好ましくは０．０１〜２５重量％、より好ましくは０．０２５〜１５重量％の範囲内であることができる。この向上の詳細は、米国特許願第08/031,471号明細書に開示されており、本明細書中に参考として援用する。米国特許第5,208,148 号明細書は、グリコシダーゼという酵素を生成する細胞の検出のための一群の蛍光性基質を記載している。この基質は、細胞内部のグリコシダーゼ酵素によって加水分解されて、約４６０〜５５０nmで励起できる蛍光性検出生成物を生じるまでは非蛍光性の基質である、フルオレセインジグリコシドである。この蛍光性酵素加水分解生成物は、生細胞内で特異的に形成され、適切に保持され、そして細胞に対して無害である。該基質は、生理的条件下で細胞膜を貫通できる。そのため、この発明は、in vitroおよびin vivo での細胞の分析、分類およびクローニング、ならびに細胞発生の追跡を可能にする。しかし、これらの蛍光性生成物は、基質のスペクトル特性が、アルゴンレーザーによってその原則的波長で励起された後でのみ、単一細胞内で、単一細胞の特定の小器官内に検出されるにすぎない。既知の蛍光放射体が、ジオキセタン類とともにバイオアッセイに用いられている。米国特許第4,959,182 号および第5,004,565 明細書は、１，２−ジオキセタン類からの化学ルミネセンスのエネルギー移動増強のための方法および組成物を記載している。これらの特許は、界面活性剤と、用いた緩衝液のバルク相に存在する蛍光性補助界面活性剤とを含む、蛍光性ミセルを利用する。蛍光性補助界面活性剤は、エネルギー移動に基づくルミネセンスがいつでもできる形態で存在する。酵素標識されたリガンド結合対を含む固相に接触すると、蛍光性部分は、バルク相中のミセルに付随して留まろうとする。何らかの蛍光性補助界面活性剤が固相に蓄積されるならば、これが、固定化されたリガンド結合対を含む部域でも、該対を含まない部域でも無差別に生じる。したがって、ある問題が、蛍光放射体は、固定化酵素結合体に付随して存在することがないか、または留まらないということを招く。したがって、ジオキセタン類から蛍光放射体へのエネルギー移動に必要な密接な接近が効率的でない。更に、蛍光放射体は、固相のマトリックスのどこにでも蓄積できるため、この方法は、結合アッセイに用いたときに特異性の余地がない。前記’１８２号および’５６５号特許明細書中の実施例の大多数は、溶液相酵素アッセイか、または酵素を用いない化学的誘発実験である。これらの実施例は、エネルギー受容蛍光性界面活性剤との、ジオキセタンアニオン生成物の接近を促進する手段としてのバルク相共同ミセルに、より良く適合する。固相アッセイの唯一の実施例は、第２９および３０欄に出現する。このＥＬＩＳＡアッセイは、Ｓ抗原が１１２〜１．３ngである範囲にわたるウェル表面で、光が生じることを示す。しかし、同じではあるが、蛍光性補助界面活性剤の不在下でジオキセタン類やＣＴＡＢを用いる、用量応答実験からの光の生成を示す対照実験が皆無である。したがって、固体表面でのエネルギー移動が実際にいかに効率的であるかは、誰も決定できない。しかしながら、確かに、この蛍光性補助界面活性剤は、AttoPhosのような非蛍光性酵素基質ではない。したがって、ジオキセタン類というエネルギー供与体を触媒作用で分解する同じ酵素によって、蛍光性エネルギー受容体を直接に、かつ表面に局所的に生成する本発明は、これらの技術の参照によって示唆されてはいない。表面またはブロッティング実験に用いられる蛍光性基質に関連する、いくつかの基本的な問題がある。一つは、脱リン酸化された発色団の励起は、レーザー、またはフィルターもしくはモノクロメーター付きランプで実施しなければならないことである。これらの光源は、面倒なばかりでなく、アッセイの経費を増加させる。ＵＶ／青色光で達成されるこの必要かつ枢要な励起段階は、第二の問題を生じるが、それは、蛍光性増輝剤その他の励起できる発蛍光団を通常含有する膜または表面その他の固体支持体、ならびに生物学的サンプル（すなわちタンパク質や核酸）に含まれる励起性発色団の自動蛍光である。表面または膜の支持体、および脱リン酸化または活性化された基質以外の発生源のそのような蛍光シグナルは、アッセイの感度や特異性を、これらのような基質を用いることができないように実質的に低下させる、許容され得ないレベルのバックグラウンドに寄与する。既知の蛍光放射体は、非結合性のアッセイではジオキセタン類とともに用いられている。しかし、ある問題が、蛍光放射体は、酵素結合体に付随して留まらないということを招く。そのため、ジオキセタンから蛍光放射体へのエネルギー移動に必要とされる、密接な接近が不可能となる。その上、蛍光放射体が酵素結合体に付随して留まらないため、放射体は、結合性アッセイに用いたときに特異性の余地がなくなる。したがって、上記アッセイが指向する化学ルミネセンス技術の進歩にもかかわらず、全体として、より強いシグナルを与え、こうして、高価で面倒なレーザーまたはランプを用いずに、より高い感度や特異性を有して、サンプル中の生物学的物質の存在、濃度またはその双方を決定する化学ルミネセンスアッセイを提供することは、当業界の目標であり続けている。１，２−ジオキセタン化合物が既に開発されていて、そのような化学ルミネセンスアッセイのためのリポーター分子として優れた将来性を示している。しかし、ジオキセタン類に密接に接触して留まり、それによって、必要なエネルギー移動を許し、更には、標的の鋭敏かつ特異的な決定を許す、効率的な蛍光受容体放射体を提供することによって、１，２−ジオキセタン類分子の化学ルミネセンスの感度および特異性に対して改良することが、依然として必要である。発明の開示上記により、１，２−ジオキセタン類という供与体分子を蛍光受容体放射体と併用する生物学的な表面結合および溶液相アッセイで、生物学的物質の存在または量を決定する方法であって、励起のためにいかなる外部光源も用いることなしに、上昇させた感度またはシグナル対ノイズ比を与える方法を提供することが、本発明の目的である。上記の目的は、生物学的サンプル中の生物学的物質の存在または量を決定する方法であって、（ａ）該サンプルからの生物学的リガンドによって酵素複合結合体（抗体またはＤＮＡプローブ）を形成する工程；（ｂ）AttoPhosのような疎水性の蛍光測定用基質および１，２−ジオキセタン類を、結合した該酵素複合結合体に加える工程；（ｃ）これにより、酵素複合生体高分子の酵素が、AttoPhosやジオキセタン類からのリン酸基のような酵素切断可能基を切断して、励起状態の放射体形態を通じてジオキセタン類を分解させる結果、該励起状態の化学ルミネセンス放射体から脱リン酸化されたAttoPhosへのエネルギー移動が生じて、この部分を発光させ；（ｄ）該生物学的物質の存在または量を、蛍光の量の関数として決定する工程とを含む方法を提供する本発明によって満たされる。この目的は、更に、表面に結合させるか、または溶液アッセイにおいてかのいずれかで検出される生物学的物質の存在または濃度についてのバイオアッセイを実施するためのキットであって、（ａ）表面に結合された生物学的物質に安定的に結合する酵素複合体；（ｂ）該酵素複合体が接触したときに、そのエネルギーを移動できる分解生成物へと分解される１，２−ジオキセタン類；および（Ｃ） AttoPhoSを含むキットを更に提供する本発明によって満たされる。〔図面の簡単な説明〕図１は、ＣＳ−Ｄから脱リン酸化Attoへのエネルギー移動、それによる蛍光形態でのエネルギーの放出を示す本発明の方法の例示である。図２（Ａ）〜（Ｄ）は、ニトロセルロース膜でのウサギＩｇＧのウエスタンブロット解析のＣＣＤ画像である。図２の詳細な説明は実施例１に見出すことができる。図３は、化学ルミネセンスの強度（平均および最大値）を示すニトロセルロース膜でのウサギＩｇＧのウエスタンブロット解析のグラフである。図４（Ａ）〜（Ｄ）は、ＰＶＤＦ膜でのウサギＩｇＧのウエスタンブロット解析のＣＣＤ画像である。図４は、実施例１で具体的に説明する。図５は、化学ルミネセンスの強度（平均および最大値）を示すＰＶＤＦ膜でのウサギＩｇＧのウエスタンブロット解析のグラフである。図６（Ａ）〜（Ｂ）は、ＣＳＰＤ＋AttoPhosに対するＣＳＰＤのＰＳＡ（前立腺特異的抗原）での比較のＲＬＵ、５秒間の化学ルミネセンス検出対ＰＳＡ、ng/mlのグラフである。図７は、実施例３に記載のとおり、０．２５mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスの放出スペクトル（強度対波長）である。図８は、実施例３に記載のとおり、１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図９は、実施例３に記載のとおり、０．１mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図１０は、実施例３に記載のとおり、０．２５mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図１１は、実施例３に記載のとおり、０．５mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図１２は、実施例３に記載のとおり、１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図１３は、実施例３に記載のとおり、１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、１０％ＢＤＭＱ、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図１４は、実施例３に記載のとおり、１．０mMＣＳＰＤ、１０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、およびアルカリ性ホスファターゼで得られた化学ルミネセンスのスペクトル（強度対波長）である。図１５は、実施例３に記載のとおり、１．０mMCＳＰＤ、５０％AttoPhos、２．０mg／mlのポリ塩化ビニルベンジルトリフェニルホスホニウム−co−ポリ塩化ビニルベンジルジメチルアンモニウム（４０モル％ＴＰＰ／６０モル％ＢＤＭＱ）、およびアルカリ性ホスファターゼを用いて得られた化学ルミネセンスの放出スペクトル（強度対波長）である。図１６は、実施例３に記載のとおり、１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２．０mg／mlのポリ塩化ビニルベンジルトリフェニルホスホニウム−co−ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム（４５モル％ＴＰＰ／５５モル％ＴＢＱ）、およびアルカリ性ホスファターゼを用いて得られた化学ルミネセンスの放出スペクトル（強度対波長）である。図１７は、実施例３に記載のとおり、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ中でのアルカリ性ホスファターゼの３０分の前温置後の０時間でのＣＳＰＤの添加（０．２５mMの最終濃度）を用いて得られた化学ルミネセンスの放出スペクトル（強度対波長）である。図１８は、図７〜１４および図１７のデータから得られた５４５nm／４６５nm での放射比を示すグラフである。図１９は、図７〜１４および図１７のデータから得られた４６５nmおよび５４５nmでの放射の和を示すグラフである。図２０は、図１５および１６のデータから得られた５４５nm／４６５nmでの放射比を示すグラフである。図２１は、図１５および１６のデータから得られた４６５nmおよび５４５nmでの放射の和を示すグラフである。図２２は、ビオチニル化ＤＮＡの存在を検出するＣＣＤカメラの画像である。発明を実施するための最良の態様以下、発明の好適実施態様が示された添付の図面を参照して、本発明をより充分に説明することにする。しかし、本発明は、異なる多くの形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施態様に限定されるとして解されてはならず；むしろ、本出願人は、本開示が完璧かつ完全になり、本発明の範囲を当業者に充分に伝えるように、これらの実施態様を与えるものである。蛍光測定用基質は、下記に考察する疎水性以外は具体的に限定されないことに留意しなければならない。例示の基質は、米国特許第5,208,148 号明細書に開示され、本明細書中に参考として援用する。本発明は、疎水性の蛍光測定用基質を利用する。これによって、酵素による活性化の際に、励起状態のジオキセタン分解生成物である供与体からのエネルギー移動に応じて放射するよう誘導できる化合物が意図される。供与体が疎水性であるため、基質は、活性化されたとき、エネルギーおよび移動が生じるように供与体が移動する、同じ疎水性領域に封鎖されるのに充分なだけ疎水性でなければならない。本発明は、物質、または１，２−ジオキセタン類を用いる溶液相アッセイで決定された生物学的物質の存在もしくは量を、疎水性の蛍光測定用基質であるAtto Phosを用いて決定する方法について記載される。やはり物質の存在または量を決定するための本発明のキットも、適切な酵素結合体、１，２−ジオキセタン類およびAttoPhosを用いて記載される。その他の蛍光測定用基質を用いてもよい。本発明者らは、AttoPhosと併用した１，２−ジオキセタン類は、表面結合アッセイの特異性と感度の双方を向上させることを初めて見出した。更に、１，２− ジオキセタン類をAttoPhosと併用するこれらのアッセイは、励起に必要な光源の必要性を軽減する。具体的には、本発明は、高い量子収率の蛍光、脱リン酸化されたAttoPhosのための励起源としての１，２−ジオキセタン類の酵素活性化化学ルミネセンスと結合した、AttoPhosが有する表面の親和性を用いる。したがって、表面に脱リン酸化AttoPhosが生成され、アッセイ全体を通じて酵素環境に密接な接近して留まり、受容体、すなわち脱リン酸化AttoPhosの励起を、いかなる外部機器もなしに、かつ脱リン酸化AttoPhos以外の発色団の励起の可能性もなしに実施することができる。本方法は、生物学的サンプル中の生物学的物質の存在または量を決定するのに用いることができる。本方法は、（ａ）該生物学的サンプルからの生物学的物質との酵素結合結合体（抗体または核酸プローブ）複合体を形成する工程；（ｂ） AttoPhos（商標）および１，２−ジオキセタン類を、結合した該酵素結合体生物学的物質複合体に添加する工程；（ｃ）これにより、該酵素結合体の酵素が、At toPhosやジオキセタン類からのリン酸基を切断し、それによって、励起状態の形態を介してジオキセタン類を分解させる結果、ジオキセタン類という励起状態の供与体から脱リン酸化AttoPhosという受容体へのエネルギー移動が生じて、それを発光させ；（ｄ）該生物学的物質の存在または量を、ルミネセンスの量の関数として決定する工程とを含む。本発明のキットも、生体高分子の存在または濃度を決定するためであり、（ａ）それとの添加混合の際に、生物学的物質に結合することになる酵素複合体；（ｂ）該酵素複合体の酵素が接触したときに、励起状態にある分解生成物へと分解されることになる１，２−ジオキセタン類；および（ｃ）AttoPhosを含む。本発明のアッセイおよびキットは、水溶性の化学発光性１，２−ジオキセタン類を用いる。上記に留意したとおり、これらのジオキセタン類は、当技術に充分に確立されており、それらの化学式および調製は、それ自体は本発明の新規な面を構成しない。一般に、該アッセイを実施するのに充分な水溶性および安定性を水性緩衝液中で示し、酵素との相互作用によって分解かつ化学発光させられ、そして該酵素によって、酵素に作用されやすい基の切断を生じて分解を誘導し得るいかなる化学発光性ジオキセタン類も、本発明と組合せて用いることができる。典型的には、本発明に役立つ１，２−ジオキセタン類は、一般式：［式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、その他のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシ基であり；Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり；Ｙは、非置換であるか、または電子供与基もしくは電子求引基で置換された、フェニルもしくはナフチルであり；Ｒ²は、Ｙ上でジオキセタンに対してメタ置換されているか、または非共役のＯＸ（式中、Ｘは、切断されたときに、ジオキセタン類のフェノキシもしくはナフトキシアニオンを離脱する、酵素切断可能基である）である］を有することになる。適切なジオキセタン類は、米国特許願第08/057,903号明細書に開示され、その開示全体を本明細書中に参考として援用する。好適なジオキセタン類は、Ｘがリン酸基であるジオキセタン類を包含する。特に好適なジオキセタン類は、ＡＭＰＰＤ、特にその二ナトリウム塩、およびＣＳＰＤ、特にその二ナトリウム塩を包含する。これらのジオキセタン類を調製する方法は、上記に引用した、譲渡された特許はもとより、例えばウエイン州立大学に譲渡された米国特許第4,857,652 号明細書に開示されている。これらのジオキセタン類の調製、精製および単離は、それ自体は、本明細書に開示かつ請求された発明の新規な面を構成しない。 AttoPhosは、アルカリ性ホスファターゼの検出のための高感度の蛍光測定用基質である。AttoPhosの化学構造は、現時点では未知である。しかし、AttoPhosの化学的特性は既知である。AttoPhosは、JBL Scientificが開発したもので、JBL- Scientificカタログ（1993）よりカタログ番号第1670A で入手できる。 AttoPhosの化学および物理的特性は、下記のとおりである。AttoPhosは、約５８０ｇ／モルの分子量を有する淡黄色結晶状固体である。AttoPhosに対する代謝回転数は、pH９．０の２．４０M ＤＥＡ（ジエタノールアミン）、０．２３mMのＭｇＣｌ₂および０．００５重量％のＮａＮ中で、アルカリ性ホスファターゼ１分子あたり毎分AttoPhos８５，４００分子である。AttoPhosの溶解度は、pH９．０の２．４M ＤＥＡ水性緩衝液中で≧１０mMである。最適アルカリ性ホスファターゼ代謝回転は、０．５〜１．５mMのAttoPhosという基質濃度で発生する。Atto Phosは、０．０３０mMというKm値、および３１．４１２というモル吸光係数を有する。アルカリ性ホスファターゼと接触したとき、AttoPhosは、蛍光放射体になることが知られている。この蛍光放射体の分子量は、約２９０ｇ／モルである。該蛍光放射体は、励起最大値が４３０〜４５０nmの可視範囲内にあって、ＤＥＡ緩衝液中で５５０〜５７０nmで蛍光が追跡される。５５０nmの放射を有する励起の最良の条件は、４４０nmにある。また、該蛍光放射体は、５６０nmに放射最大値を、１４０nmの大きいストークスシフトを有する。水中ラマン放射は、４７０nmで発生し、４１３nmで励起される。該蛍光放射体は、０．３９２ＭのＮａ₂ＣＯ₃中、１１．０のpHで、係数が２６，４８４である最大値を４１８nmに有し、pH＞１０．０では完全に電離される。ジオキセタン類は、生物学的結合体（抗体または核酸プローブ）に結合する酵素複合体に加える。該酵素複合体は、標的の生物学的物質にも結合する。したがって、ジオキセタン類は、該酵素の基質であって、ジオキセタンの本体からの基質の不安定基の酵素触媒切断は、不安定なオキシアニオンの形成、およびその後のジオキセタン類の分解を招く。該酵素は、通常、結合体部分と、例えば、ハイブリダイゼーション段階ではＤＮＡプローブと、または温置段階では適切な抗体と複合する結果、生物学的物質との結合を助ける。ハイブリダイゼーション段階は、標準的な周知の手順を用い、適切なプローブを用いて実施することができる。ハイブリダイゼーション段階の代替として、温置段階を、適切な抗体を用いて、通常の方式で実施することもできる。該酵素結合体は、生物学的物質に安定的に結合できるいかなる酵素結合体であってもよい。酵素結合体の例は、あらゆるリガンド−結合体対、共有結合で結合した酵素を有するプローブ、またはアルカリ性ホスファターゼで直接的に標識された抗体である。これに代えて、核酸プローブおよび抗体を、ビオチン−〔ストレプト〕アビジンまたは抗原−抗体（例えばジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン、フルオレセイン−抗フルオレセイン）その他の類型の組合せを介して酵素で間接的に標識してもよい。ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼのアルカリ性ホスファターゼで標識した抗体やＤＮＡプローブのような、誘導体化されたアルカリ性ホスファターゼは、本発明に役立つ好適な酵素結合体である。酵素結合体−生物学的物質複合体を形成した後は、結合した、生物学的物質と複合させた酵素結合体に、AttoPhosおよび１，２−ジオキセタン類を同時に加えるか、またはAttoPhosを最初に加え、脱リン酸化させ、次いで１，２−ジオキセタン類を加える。当業者には、それが、エネルギー供与性ジオキセタン放射体フラグメントを、やはり同じ酵素で局所的に生成されたAtto（商標）に密接に接近させる酵素切断の方法であることは明白であると思われる。AttoPhos自体は、他の蛍光測定用酵素基質と同様に、バルク相では非蛍光性である。したがって、ノイズシグナルを生じるはずのジオキセタン類のいかなる非酵素性分解も、バルク相でのエネルギー移動によって増幅されない。すなわち、これは、アッセイを実施するのに用いた表面での固定化を可能にする疎水性の蛍光性形態を生じる酵素反応である。他の疎水性の蛍光定量用酵素基質を、本発明に用いることもできる。上記に参照した米国特許第5,208,148 号明細書は、平面的な発蛍光団自体に付着したある範囲の疎水性部分を含めることによって、特異的に修飾したフルオレセインジグリコシドを記載している。そのような疎水性基質は、利用する酵素標識がβ−ガラクトシダーゼのようなグリコシダーゼであり、ジオキセタン類が、例えばＺ＝Ｃｌ、Ｒ¹＝メチル、Ｙ＝フェニレンおよびＸ＝β−Ｄ−ガラクトピラノシドである上記の一般的構造を有する、本発明のバイオアッセイを実施するのに役立つはずである。言うまでもなく、ジグリコシドへの前駆体としての、本特許に示した疎水性ヒドロキシフルオレセイン類を、公知技術を用いて、代わりにリン酸化して、本発明に役立つ疎水性のフルオレセインモノ−およびジ−リン酸誘導体を与えてもよい。酵素は、１，２−ジオキセタン類とAttoPhosの双方からのリン酸基を切断する。１，２−ジオキセタン類が酵素によって脱リン酸化されるにつれて、形成されたオキシアニオンは励起状態の供与体になり、そのエネルギーが、密接に位置する受容体、すなわち脱リン酸化AttoPhos放射体へと移動して、それを放射させる。図１は、１，２−ジオキセタン類（ＣＳ^-Ｄ）から脱リン酸化AttoPhosへとエネルギーが移動し、次いで後者が、ルミネセンスの形態でエネルギーを放出することを図解している。このエネルギー移動の効率は、AttoPhosの脱リン酸化生成物、すなわち受容体が、疎水性であり、かつ表面／生物学的物質の部位に固定化され、そのため、エネルギー供与体である、化学発光性の脱リン酸化１，２−ジオキセタン類の励起状態のフラグメントに非常に密接な近位にあるために高められる。１，２−ジオキセタン類は、生物学的物質と複合した結合酵素結合体に、０．０１〜２．５mM、好ましくは０．２５〜１mMの量で加える。最も好ましくは、０．２５mMの量で１，２−ジオキセタン類を加える。２．４０M ジエタノールアミン（ＤＥＡ）緩衝水溶液中のAttoPhosを、生物学的物質と複合した該酵素または酵素結合結合体に、１〜１００体積％、好ましくは２５〜７５体積％の量で加える。最も好ましくは、１０〜５０体積％のAttoPh osを加える。上記のとおり、AttoPhosを最初に加えて脱リン酸化させ、次いで１，２−ジオキセタン類を加えるのが好ましい。AttoPhosの添加と１，２−ジオキセタン類の添加との間の時間は、好ましくは１０〜６０分、より好ましくは２０〜４０分、最も好ましくは２５〜３０分である。シグナルは、水溶性高分子を、AttoPhos、または他の疎水性の蛍光測定用酵素基質とともに加えることによって、更に強めることができる。本発明を実施するのに役立つ好適な水溶性重合体は、一般的には、重合体オニウム塩、特にホスホニウム、スルホニウム、および好ましくはアンモニウム部分に基づく第四級の塩に基づく。該重合体は、下記に示した一般式（Ｉ）を有する：この式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖の非置換アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−ブチル、 tert−ブチル、ヘキシルなど；１個以上のヒドロキシル、アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、ベンジルオキシもしくはポリオキシエチルエトキシ、アリールオキシ、例えばフェノキシ、アミノもしくは置換アミノ、例えばメチルアミノ、アミド、例えばアセトアミド、またはウレイド、例えばフェニルウレイドで置換された、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキル基；またはフルオロアルカンもしくはフルオロアリール、例えばヘプタフルオロブチルの基、３〜１２個の炭素環炭素原子を有する非置換モノシクロアルキル基、例えばシクロヘキシルもしくはシクロオクチル、１個以上のアルキル、アルコキシもしくは縮合ベンゾ基で置換された、３〜１２個の環炭素原子を有する置換モノシクロアルキル基、例えばメトキシシクロヘキシルもしくは１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、非置換であるか、あるいは１個以上のアルキル、アルコキシもしくはアリール基で置換された、それぞれ５〜１２個の炭素原子数を有する２個以上の縮合環を有するポリシクロアルキル基、例えば１−アダマンチルもしくは３−フェニル−１−アダマンチル、少なくとも１環、および全部で６〜２０個の炭素原子を有し、非置換であるか、または１個以上のアルキル、アリール、フッ素もしくはヒドロキシル基で置換されたアリール、アルカリールまたはアラルキル基、例えばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジルもしくはデヒドロアビエチルであってもよく；Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³のうち少なくとも２個は、それらが結合している第四級窒素原子とともに、飽和または不飽和の、非置換または置換の、３〜５個の炭素原子、および１〜３個のヘテロ原子を有し、ベンゼン環付加されていてもよい含窒素、含リンまたは含硫黄環、例えば１−ピリジニウム、１−（３−アルキルもしくはアラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、アルキルモルホリニウム、アルキルピペリジニウム、Ｎ−アシルピペリジニウム、ピペリジノもしくはアシルピペリジノ、ベンゾオキサゾリウム、ベンゾチアゾリウムまたはベンズアミダゾリウムを形成してもよい。記号Ｘ^-は、単独または組合せで、ハロゲン化物イオン、すなわちフッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオンまたはヨウ化物イオン、硫酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、例えばメチルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオン、例えばｐ−トルエンスルホン酸イオン、置換アリールスルホン酸イオン、例えばアニリノナフチレンスルホン酸イオン（各種異性体）、ジフェニルアントラセンスルホン酸イオンのような部分を含むことができる対イオンを表す。過塩素酸イオン、アルカン酸イオン、例えば酢酸イオン、アリールカルボン酸イオン、例えばフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、ベンゾ複素環式アリールカルボン酸イオン、例えば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボン酸イオン、ｐ−テレフタル酸イオンのような有機ジアニオンも、Ｘ^-によって表されてよい。記号ｎは、固有粘度またはＬＡＬＬＳの手法によって測定される限りで、そのようなポリ（ビニルベンジル第四級塩）の分子量が約８００〜約２００，０００（重量平均）、好ましくは約２０，０００〜約７０，０００の範囲にわたるような数を表す。Ｍが窒素であるこれらの重合体、関連する共重合体、および関連する出発材料の調製法は、G.D．Jonesら、Journal of Polymer Science、25、201、1958；米国特許第2,780,604 号；第3,178,396 号；第3,770,439 号；第4,308,335 号；第 4,340,522 号；第4,424,326 号明細書、およびドイツ国公開特許第2,447,611 号公報に開示されている。記号Ｍは、リンまたは硫黄を表してもよく、それに対しては、対応するスルホニウムまたはホスホニウム重合体が、従来の技術、すなわち米国特許第3,236,82 0 号および第3,065,272 号明細書に記載されている。本発明の２種類の重合体の調製法は、引用した米国特許明細書に述べられており、それ自体は、本発明のいかなる面も構成しない。異なる２種類以上のペンダントオニウム基を有する共重合体も、本明細書に記載の本発明に用いてよい：記号Ｘ、Ｍ’、Ｒ^1'、Ｒ^2'、Ｒ^3'は、Ｘ、Ｍ、Ｒ¹〜Ｒ³について上記したとおりである。記号ＹおよびＺは、該共重合体を構成する個々の単量体のモル分率を表す。したがって、記号ＹおよびＺは、合計が常に１に等しくて、０．０１〜０．９９で別個に変動してよい。好適な部分としては、Ｍは、ＮまたはＰであり、Ｒ¹〜Ｒ³は、個々に独立に、非置換であるか、またはヒドロキシル、アミノ、アミド、ウレイド基で更に置換された、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル（例えばアダマンタン）、アラルキルもしくはアリールであるか、あるいは結合して、Ｍ原子とのスピロ結合を通じて、複素環式の（場合により他のＮ、ＳもしくはＯのヘテロ原子を有する、芳香族の、脂肪族の、または混合の）オニウム部分を形成する。Ｘは、好ましくは、望みのとおりに、溶解度を上昇させ、またはイオン強度を変化させるように選ばれ、好ましくはハロゲンイオン、硫酸イオン、スルホン酸イオンである。共重合体中では、Ｒ¹〜Ｒ^3'は、それぞれ、対応するＲ¹〜Ｒ³と同じか、または異なっていてもよい。好適な重合体の例は、下記を包含する：ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム−ｃｏ−ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムポリ塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム−ｃｏ−ポリ塩化ビニルベンジルトリフェニルホスホニウムポリ塩化ビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムポリ塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウムポリ塩化ビニルベンジルトリヘキシルアンモニウム−ｃｏ−ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム（ＴＨＱ−ＴＢＱ）これらのビニルベンジル第四級アンモニウム塩の重合体は、適切な前駆単量体のラジカル重合によってか、または対応する第三級アミンもしくはホスフィンと、ポリ塩化ビニルベンジルとの、もしくはペンダント塩化ベンジル基を有する共重合体との徹底的なアルキル化によって調製することができる。この同じ方策を、クロロメチル化ポリフェニレンオキシドまたはポリエピクロロヒドリンのような、他の重合アルキル化剤を用いてとることができる。同じ重合アルキル化剤を、オキサゾリン開環重合の開始剤として用いることができ、これが、加水分解後にポリエチレンイミングラフト共重合体を生じる。次いで、そのような共重合体を、好ましくはアラルキル基で第四級化して、最終重合体を得ることができる。ポリビニルアルコールの水溶性アセタール、および式：〔式中、各Ｒ⁴は、同じか、または異なる脂肪族置換基であり、Ｘ₁は、Bronstei n-Bonte らの米国特許第4,124,388 号明細書に開示かつ請求されたとおりのアニオンである］を有するホルミルベンジル第四級塩を、本発明を実施するのに用いることもできる。そして、上記の式Ｉのポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）を調製するのに用いた個々のビニルベンジル第四級アンモニウム塩単量体を、第四級アンモニウム官能基を有しないその他のエチレン性不飽和単量体と共重合させて、 Landらの米国特許第4,322,489 号；Bronstein-Bonte らの米国特許第4,340,522 号；Landらの米国特許第4,424,326 号；Bronstein-Bonte の米国特許第4,503,13 8 号；Bronstein-Bonte の米国特許第4,563,411 号；Cohen らの米国特許第3,89 8,088 号明細書に開示かつ請求されたそれらのような重合体を得ることもできるが、これらの重合体はすべて、本発明を実施する際に増強物質として用いることもできる。好ましくは、これらの第四級重合体は、式Ｉのポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）について上記した範囲内の分子量を有することになる。当業者には明白であると思われるが、カチオン性ミクロゲルまたは架橋結合ラテックスの使用は、注型膜の直接的形成に一層適しているが、予め形成した膜の上塗りに用いることもできる。そのような材料は、写真用媒染剤として周知であり、２個のエチレン性不飽和基で置換された架橋結合部分を有する単量体混合物を用いて合成してよい。ラテックスを含有する第四級アンモニウムまたはホスホニウム塩は、Campbellらの米国特許第3,958,995 号明細書に記載の方法論を用いて調製することができる。式IVは、そのような水溶性ラテックス共重合体の有効な部分を一般的に表しているが、ここで、記号Ｘ^-、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、上記のとおりである。記号Ｘ、ＹおよびＺは、統一性を与えるために加え合わせなければならないモル分率である。好ましくは、ＢＤＭＱのような重合体増強剤を、０．０１〜２６％（０．１〜２５０mg/ml)、より好ましくは０．０２５〜１５％（２５〜１５０mg/ml)の量で、酵素、または酵素結合生物学的物質源に加える。最も好ましくは、０．１〜０．２％(１〜２mg/ml)の量でＢＤＭＱを加える。脱リン酸化AttoPhosから生じる放射されたシグナルは、励起状態のジオキセタンの高密度フラグメントからのエネルギー移動励起による。この放射シグナルは、緑色の感光薄膜か、またはルミノメーターであるＣＣＤカメラに捕捉することができる。検出された放射の量は、生体高分子の存在と、表面結合した生体高分子の量との双方に応答することになる。生物学的物質の量は、放射の強度の関数である。本発明の方法およびキットは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質およびハプテンを包含するいかなる生物学的物質の存在または濃度を決定するのにも用いることができる。更に、本発明の方法およびキットは、ウエスタン、サザン、ノーザンブロットやＤＮＡ配列決定のような、膜で実施される検知に用いることができ、溶液相アッセイに用いることもできる。溶液に基づくアッセイにおいてか、または増強重合体を用いるときは、AttoPhosと１，２−ジオキセタン基質との双方の脱リン酸化生成物を要することがあり、それによって、供与体と受容体の部分の間の接近を増大させる。実施例（実施例１）ニトロセルロースおよびＰＶＤＦでのウエスタンブロット（PhotometricsのStar １というＣＣＤカメラに像形成させた、タンパク質ＩｇＧの膜での検出）標準的な既知の方法を用い、ウサギＩｇＧの希釈物を１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。ＩｇＧサンプルは、ニトロセルロースに対しては１レーンあたり２００、６６．７、２２．２、７．４および２．４ngであり、ＰＶＤＦに対しては１レーンあたり１００、３３．３、１１．１、３．７および１．２ngであった。次いで、下記のとおり、タンパク質を膜に移動させた：ゲルを、移動緩衝液（５mMＭＯＰＳ、２mM酢酸ナトリウム、２０％メタノール、pH７．５）中で平衡させ、次いで、９０ボルト、４℃で１時間、ニトロセルロース（Schleicher and Schuell、ＢＡＳ８５）またはＰＶＤＦ（Tropix）に電気移動させた。移動後、膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％カゼイン、０．１％Tween 20（ブロッキング緩衝液）でブロッキングし、ブロッキング緩衝液中のアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＧＡＲ−ＡＰ）の１０，０００倍希釈液とともに３０分間温置し、ＰＶＤＦ膜をブロッキング緩衝液で５分間ずつ２回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％Tween 20で２回洗浄し、すべての膜を、０．１Ｍジエタノールアミン、１mMＭｇＣｌ₂、pH１０（基質緩衝液）で５分間ずつ２回洗浄し、基質緩衝液中のNitro-Block（Tropix）の２０倍希釈液中で５分間温置し、基質緩衝液で５分間ずつ２回洗浄し、基質緩衝液への０．２５mMＣＳＰＤ、および様々な条件下でのAttoPhos中で５分間温置し、プラスチック製レポートカバーに密閉し、約１時間温置し、そしてStar IというＣＣＤカメラ（Photometrics）で５分間像形成させた。 Apple Macintosh IIciというコンピューターにIPLab Spectrumというソフトウエアを用いてインターフェースで接続したStar IのＣＣＤカメラで、化学発光シグナルを５分間積算することによって、化学ルミネセンスの画像を得た。ＣＣＤ画像をＮＩＨのImage というソフトウエアパッケージへと伝達し、各バンドについて、平均および最大の画素強度を測定した。図２および４に示したＣＣＤ画像は、ウエスタンブロットの画像を合成したものである。ブロットＡは、基質緩衝液への０．２５mMＣＳＰＤ中で温置した。ブロットＢは、０．２５mMＣＳＰＤおよび５０％AttoPhos（５０％AttoPhos緩衝液）中で同時に温置した。ブロットＣは、初めに５０％AttoPhos（５０％基質緩衝液）中で３０分間温置し、AttoPhos を除去し、基質緩衝液で膜を５分間ずつ２回洗浄し、基質緩衝液中の０．２５mM ＣＳＰＤを加えた。ブロットＤは、希釈していないAttoPhos標準とともに３０分間温置し、次いで、基質緩衝液で膜を５分間ずつ２回洗浄した後、基質緩衝液中の０．２５mMCＳＰＤを加えた。画像は、ＣＳＰＤの最初の添加の約１時間後に得た。図３および５に示したとおり、上記条件のそれぞれに対して、最高希釈についての平均および最大シグナル強度をプロットした。図２〜５に示した結果は、AttoPhosを加え、次いで、設定した時間の後に１，２−ジオキセタン類を加えることによって、最大強度が得られることを立証している。（実施例２）ＰＳＡの免疫検定［Hybritech前立腺特異性抗原（ＰＢＡ）］前記製造者が供給するプロトコルおよび試薬を用い、Hybritech のTandem-E PSA キット（カタログ番号４８２３）からの標準を、検出工程を除いて定量した。アッセイは、下記のとおり実施した。それぞれ１００μｌの量の標準を、１２ ×７５mmのガラス管に一定分量採取した（ゼロ標準を三個ずつおよびその他の標準を三個ずつ、６通り）。１００μｌの量のアルカリ性ホスファターゼ結合マウス抗ＰＳＡを各管に加えた後、添付の捕捉抗ＰＳＡ抗体を有する１個のビーズを加えた。次いで、管を１７０rpm の振盪台上で室温下で２時間温置した。ビーズを、Hybritech 洗浄液２mlで３回、そして０．１M のジエタノールアミン、１mM ＭｇＣｌ₂、pH１０（基質緩衝液）で１回洗浄した。次いで、各管に基質を加えた。下記の３種類の基質組成物（管１本あたり２００μｌ）を試験した：０時間で加えた基質緩衝液への０．２５mMＣＳＰＤ、１mg/mlＢＤＭＱ；０時間で加えた基質緩衝液への０．２５mMＣＳＰＤ、１mg/ml ＢＤＭＱ、５０％AttoPhos；３０分間の基質緩衝液への５０％AttoPhos、１mg/m l ＢＤＭＱの後、ＣＳＰＤの添加（最終濃度：０．２５mM）。ＣＳＰＤ（またはＣＳＰＤ／AttoPhos混合物）の添加の２５分後に、Bertholdの952Tというルミノメーターで化学発光シグナルを測定した。図６（Ａ）および図６（Ｂ）は、シグナルとシグナル／ノイズ比との双方が、ＣＳＰＤ単独でよりもＣＳＰＤおよびAttoPhosでの方が大きいことを立証している。したがって、増大したシグナルは、AttoPhosとのＣＳＰＤの併用の結果である。（実施例３）溶液エネルギー移動（脱リン酸化AttoPhosと脱リン酸化ＣＳＰＤとの間のエネルギー移動）下記は、Spexの放射スペクトルに用いた試料のリストである。全サンプルについて、０．１M のジエタノールアミン、１mMＭｇＣｌ₂、pH１０を用いて、２ml の最終溶液に調整した。１００％のSapphireが、１０．０mg/ml ＢＤＭＱと等価である。１．図７：０．２５mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２．図８：１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、３．図９：０．１mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、４．図１０：０．２５mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、５．図１１：０．５mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、６．図１２：１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、７．図１３：１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、１０％ＢＤＭＱ、８．図１４：１．０mMＣＳＰＤ、１０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ、９．図１５：１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２．０mg/ml ＴＰＰ（０．４）／ＢＤＭＱ（０．６）、１０．図１６：１．０mMＣＳＰＤ、５０％AttoPhos、２．０mg/mlＴＰＰ（０．４５）／ＢＤＭＱ（０．５５）、１１．図１７：５０％AttoPhos、２０％ＢＤＭＱ中のアルカリ性ホスファターゼの３０分の前温置後、０時間でＣＳＰＤを添加（０．２５mMの最終濃度）：時間＝０で、各サンプルにアルカリ性ホスファターゼを加え（最終濃度、１．１２× １０^-11M）、キュベットを蛍光光度計（Spex Fluorolog）に挿入した。モノクロメーターのスリットを１０mmに設定して、放射スペクトルを得、シグナルをnmあたり０．５秒について積算した。ほとんどの場合、２、１０、２０、３０、４０、５０および６０分でスペクトルを記録した。結果を図７〜２１に示す。実験のこの設定は、緩衝液中でのＣＳＰＤからAtto Phosへのエネルギー移動を示す。そのような溶液に基づくアッセイは、緩衝液中で実施する免疫検定で用いられる。図７〜２１は、ＣＳＰＤの脱リン酸化放射体と脱リン酸化AttoPhosとの間にエネルギー移動が存在することを立証している。更に、図９〜１７は、このエネルギー移動が、増強重合体の存在によって大幅に改良されることを示す。図７および８は、供与体である脱リン酸化ＣＳＰＤ放射体の増加は、エネルギー移動、すなわちAtto放射を通じてシグナルを増大させることを立証している。本事例では、青色の放射（ＣＳＰＤの化学ルミネセンス）が増大する。これは、Atto^-受容体からのエネルギー移動距離内にないメチルメタオキシベンゾアートアニオン（ＣＳＰＤ放射体）の集団による可能性がある。図１４は、緑色のシグナルがAtto^-を起源とすることを立証しているが、それは、AttoPhosの濃度が低いときは、エネルギー移動シグナルも非常に低いからである。図１２は、基質を順に加えたとき、すなわち初めに、脱リン酸化されて基底状態の放射体を生成するAttoPhosを加え、次いで、脱リン酸化の際にフラグメント化し、脱リン酸化AttoPhosから蓄積された受容体へとそのエネルギーを移動する励起状態の供与体を生成するＣＳＰＤを加えたときの相対的なエネルギー移動シグナルを示す。（実施例４）ビオチニル化ＤＮＡの検出ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼに結合し、次いで、アルカリ性ホスファターゼのＣＳＰＤ１，２−ジオキセタン基質、またはＣＳＰＤと蛍光性アルカリホスファターゼ基質のAttoPhosとの混合物のいずれかとともに温置することによって、ビオチニル化ＤＮＡを検出した。具体的には、ビオチニル化３５量体を、Pall Biodyne Aというナイロン膜に、トップスポットに２１０pgとして配置し、次いで、１：３に逐次希釈した。基質温置工程まで、Tropix Southern- Light （商標）の手順を実施することによって、ＤＮＡを検出した。次いで、各膜を、下記のとおりの異なる基質溶液とともに個別に温置した：（１）アッセイ緩衝液(０．１M ＤＥＡ、pH１０、１mMＭｇＣｌ₂)中の０．２５m MＣＳＰＤ、（２）アッセイ緩衝液中にAttoPhos溶液５０％；１mMＣＳＰＤ５０％、（３）アッセイ緩衝液中にAttoPhos溶液５０％；０．２５mMＣＳＰＤ５０％、（４）AttoPhos溶液中の１mMＣＳＰＤ、（５）膜を脱リン酸化AttoPhosで被覆し、次いでアッセイ緩衝液中の０．２５mM CＳＰＤとともに温置、（６）AttoPhos溶液画像は、いかなる外部光源もなしに、PhotometricsのStar １というＣＣＤカメラを光の洩れない箱の中で用いて得た。図２２は、AttoPhosをＣＳＰＤと併用したサンプルからの増大した光シグナルを示す。出願人らは、可能な組合せの広汎な実施態様によって、その発明を例示しようと努力した。にもかかわらず、可能な組合せは無限であり、具体化し尽くすことはできない。上記の教示を与えられて、当業者は、これまでの出願書類中には具体的に例示されていない増強剤および添加物に到達するものと思われる。実施例は、限定することを意図するものではなく、これまでの開示に与えた、その他の組合せの特定は、充分に、不当な実験なしに本技術を実施する者の技量の範囲内にある。そのような組合せは、明示的に限定されるか、または下記に述べる請求項によって排除されるかしない限り、本発明の範囲内にあるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヴォイタ，ジョンアメリカ合衆国、マサチューセッツ 01776、サッドマリー、メイナード・ファーム・ロード 99

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的サンプル中の物質の存在または量を決定する方法であって、（ａ）酵素または酵素結合体を、該サンプルからの該物質と複合させる工程；（ｂ）疎水性の蛍光測定用基質、および下記の式（Ｉ）：［式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、その他のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシ基であり；Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり；Ｙは、非置換であるか、あるいは電子供与基もしくは電子求引基で置換された、フェニルまたはナフチルであり；Ｒ²は、Ｙ上でジオキセタンに対してメタ置換されているか、または非共役の（unconjugated）ＯＸ（式中、Ｘは、Ｘが切断されたとき、ジオキセタンが疎水性となる酵素切断可能基である）］であるで示される１，２−ジオキセタン類を、該結合した酵素複合体に加える工程；（ｃ）これにより、該酵素複合物質の酵素が、該疎水性の蛍光測定用基質と該ジオキセタン類のそれぞれから酵素切断可能基を切断し、それによって、該ジオキセタン類を分解させて、励起状態の供与体を形成する結果、該励起状態の放射体から、受容体としての該蛍光定量用基質へとエネルギー移動が生じて、該受容体をして放射させ；（ｄ）該基質の存在または量を放射の量の関数として決定する工程を含む方法。２．該物質と複合させた該酵素または酵素結合体に、アンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウムの重合体塩よりなる群から選ばれる１以上の増強重合体塩を加える工程を更に含む、請求項１記載の方法。３．重合体塩が、ポリ（塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム）（ＴＭＱ）、ポリ（塩化ビニルベンジルトリブチルアンモニウム）（ＴＢＱ）およびポリ（塩化ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウム）（ＢＤＭＱ）よりなる群から選ばれる、請求項２記載の方法。４．該物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質およびハプテンよりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。５．疎水性の蛍光測定用基質を、該物質と複合した酵素または酵素結合体に加え、次いで、酵素が該蛍光測定用基質から酵素切断可能基を切断するのに充分な時間後に、該１，２−ジオキセタン類を加える、請求項１記載の方法。６．時間が、２５〜３０分である、請求項５記載の方法。７．該１，２−ジオキセタン類が、０．２５〜１．０mMの濃度で存在する、請求項１記載の方法。８．該蛍光測定用基質が、AttoPhos（商標）であり、２．４０Ｍジエタノールアミン（ＤＥＡ）緩衝水溶液の形態で、１０〜１００体積％の濃度で存在する、請求項１記載の方法。９．工程（ｂ）で、AttoPhosおよび１，２−ジオキセタン類に加えて、ポリ（塩化ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウム）（ＢＤＭＱ）を１〜２mg／ml の量で加える、請求項８記載の方法。１０．工程（ｂ）の前に、ハイブリダイゼーションまたは免疫複合体形成の工程を実施する、請求項１記載の方法。１１．該複合させた酵素を膜またはビーズに結合させる、請求項１記載の方法。１２．該疎水性の蛍光測定用基質がAttoPhosである、請求項１記載の方法。１３．生物学的サンプル中の物質の存在または濃度についてのバイオアッセイを実施するためのキットであって、（ａ）添加混合の際、生物学的物質と複合することになる酵素または酵素結合体；（ｂ）酵素または該酵素複合体が接触したとき、分解生成物へと分解されて、疎水性の励起状態の供与体を形成する１，２−ジオキセタン類；および（ｃ）疎水性の蛍光測定用基質を含むキット。１４．生物学的サンプル中の酵素の存在または量を決定する方法であって、（ａ）該サンプルに、疎水性の蛍光測定用基質、および式Ｉ：〔式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、その他のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシ基であり；Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり；Ｙは、非置換であるか、あるいは電子供与基もしくは電子求引基で置換された、フェニルまたはナフチルであり；Ｒ²は、Ｙ上でジオキセタンに対してメタ置換されているか、または非共役であるＯＸ（式中、Ｘは、Ｘが切断されたとき、ジオキセタンが疎水性となる酵素切断可能基である）である］で示されるジオキセタン類を加える工程；（ｂ）該酵素が、該疎水性の蛍光性基質および該ジオキセタン類から酵素切断可能基を切断する結果、該ジオキセタン類の励起状態の分解生成物から該疎水性の蛍光性基質へとエネルギー移動が生じる添加混合の後に、該疎水性の蛍光性基質からの放射の存在または量を検出する工程を含む方法。１５．生物学的サンプル中の物質の存在または量を決定する方法であって、（ａ）酵素または酵素結合体を、該サンプルからの該物質と複合させる工程；（ｂ）疎水性の発蛍光団を該複合体に加える工程、（ｃ）下記の式：［式中、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、Ｃ１以外のハロゲン、アルキル、カルボキシルまたはアルコキシ基であり；Ｒ¹は、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキルまたはＣ₁〜Ｃ₁₂アリールもしくはアラルキルであり；Ｙは、非置換であるか、あるいは電子供与基もしくは電子求引基で置換された、フェニルまたはナフチルであり；Ｒ²は、Ｙ上でジオキセタンに対してメタ置換されているか、または非共役のＯＸ（式中、Ｘは、Ｘが切断されたとき、ジオキセタンが疎水性となる酵素切断可能基である）である］で示される１，２−ジオキセタン類を、該複合体および発蛍光団に加えるが、ここで、該複合体の酵素が、該ジオキセタン類から酵素切断可能基を切断し、それによって、該ジオキセタン類を分解させて、励起状態の供与体を形成する結果、該励起状態の供与体から、受容体としての該発蛍光団へとエネルギー移動が生じて、該受容体を放射させ、そして、該基質の存在または量を放射の量の関数として決定する工程を含む方法。