CN112794838B - 发光增强剂、酶促化学发光底物及制备方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域,具体而言,提供了一种发光增强剂、酶促化学发光底物及制备方法与试剂盒。本发明提供的1,2‑二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,或,荧光剂与Tris偶联的化合物中的至少一种。该发光增强剂不仅能提高1,2‑二氧杂丁烷化合物底物液的稳定性,还可以显著改善底物液的发光效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体而言,涉及一种发光增强剂、酶促化学发光底物及制备方法与试剂盒。
背景技术
随着医疗技术的发展和居民医疗保健、未病先治意识不断的提高,体外诊断行业对各类疾病的诊断要求更高,如何更快速、更高效、更灵敏、更便宜地进行疾病检测成为这个行业重要课题。体外诊断行业的检测技术从大方法学的分类方式可分为生化诊断、免疫诊断、分子诊断、微生物诊断、血液诊断、POCT等,其中以免疫诊断占比最高,故免疫诊断领域依然是市场份额相对较高且有前景的诊断方法学。
免疫诊断从最初的放射免疫法和时间分辨荧光法逐渐发展为现在的酶联免疫、胶体金、乳胶比浊、荧光免疫和化学发光等多种技术并存,而化学发光由于其高效灵敏且适合高通量易于自动化普及的优势而发展迅速,并在未来一定的时间范围内保持强劲的市场前景。
化学发光是指在一个反应体系中通过化学反应生产一种激发态的产物,在其回到基态的过程中,释放出的能量转变为光子,从而产生发光现象。化学发光按照标记方式又可分为吖啶酯标记化学发光、辣根过氧化物酶酶促化学发光和碱性磷酸酶酶促化学发光等。常用的发光物质包括鲁米诺、吖啶酯、AMPPD(1,2-二氧环已烷衍生物)等。其中,碱性磷酸酶-AMPPD发光体系是目前最重要、最灵敏的一类发光体系,然而发光强度有待改善。
目前,一类AMPPD底物液优化技术主要是在AMPPD的骨架上的某些位置进行特殊官能团优化,从而改变分子在磷水解后的稳定性来获得想要的发光效率、发光时间及量子产率等。其主要的技术点包括两个方面:一是在原AMPPD骨架上增加一些亲电基团或亲核基团或改变相应的位置,从而改变整个分子结构的电子分布,从而改变其结构稳定性、发光效率、发光时间、量子产率等;另一方面是通过化学技术将发光增强物质连接到骨架分子上,该技术弥补了原有技术中发光增强物质的溶剂作用及胶束延迟效应等,大大减少光子传递过程的损失,从而提高发光效率缩短平台期等。
另一类AMPPD底物液优化技术主要是加入各种特殊支链或特殊官能团组合、亲疏水性结构单元组合的季铵盐季膦盐的表面活性剂,以此来形成可控稳定性或可控光激发的底物胶束环境,该类物质固然能够对发光信号值有所提升,但是相对经济易得的CTAC或CTAB来说,其信号增加幅度还是有限的,且这些物质不易获取,还可能需要专门的定制,不利于规模化。
此外,上述优化技术中,AMPPD底物液的稳定性和发光效率或发光速率或量子产率有一定的此消彼长性质,如何综合两者来达到最佳平衡需要更多的摸索。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂及其制备方法,以缓解现有技术中发光增强剂生产困难,成本高,及稳定性与发光性能不能同时兼顾的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种增强1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的试剂盒。
本发明的第三目的在于提供碱性磷酸酶的酶促化学发光底物以及试剂盒。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂,所述发光增强剂包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,或,荧光剂与Tris偶联的化合物中的至少一种。
进一步地,所述发光增强剂包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,以及,荧光剂与Tris偶联的化合物;
优选地,荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,以及,荧光剂与Tris偶联的化合物,的物质的量比为(6-8):(1-3):1。
进一步地,所述荧光剂包括荧光素类荧光剂、罗丹明类荧光剂、香豆素类荧光剂、萘酰亚胺类荧光剂或苯并咪唑类荧光剂,优选为荧光素类荧光剂。
进一步地,所述改性PEG包括亲水臂为双官能团的PEG或亲水臂为单官能团的PEG。
进一步地,所述发光增强剂的结构式包括如下的式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ):
其中,m选自1-3的整数,n选自1-12的整数;
优选地,所述发光增强剂的结构式包括如下式(Ⅰ-1):
进一步地,所述发光增强剂的浓度为0.0001mmol/L-1mmol/L,优选0.1mmol/L-0.5mmol/L。
进一步地,所述发光增强剂还包括镁离子、缓冲液、防腐剂或表面活性剂中的至少一种;
优选地,所述缓冲液包括AMP缓冲液或Tris缓冲液;
优选地,所述缓冲液的浓度为20mmol/L-1000mmol/L,pH值为8-11.5;优选浓度为50mmol/L-100mmol/L,优选PH为8.5-9.5;
优选地,含有所述镁离子的盐包括氯化镁、硫酸镁或乙酸镁;
优选地,所述镁离子的浓度为0.0001-0.1mol/L;
优选地,所述防腐剂包括叠氮钠或Proclin300;
优选地,所述叠氮钠的含量为质量分数0.01-5%;
优选地,所述Proclin300的含量为0.01g/L-1.0g/L;
优选地,所述表面活性剂包括CTAC、CTAB、Triton X-100、3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱、3-磺丙基十四烷基二甲甜菜碱或吐温-20中的至少一种;
优选地,所述表面活性剂的浓度0.01mmol/L-10mmol/L。
一种1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂的制备方法,将上述发光增强剂的组分溶解在水中。
一种增强1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的试剂盒,所述试剂盒包括上述的发光增强剂。
一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物,包括1,2-二氧杂丁烷化合物和上述的发光增强剂;
优选地,1,2-二氧杂丁烷化合物和发光增强剂的物质的量比例为1:2-2:1。
一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物的试剂盒,包括上述的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明提供的1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,或,荧光剂与Tris偶联的化合物中的至少一种。发明人研究中发现,通过将荧光剂与改性PEG、AMP或Tris偶联得到化合物可以改善1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用,不仅能提高1,2-二氧杂丁烷化合物底物液的稳定性,还可以显著改善底物液的发光效率。一方面,该发光增强剂避免了现有技术中对1,2-二氧杂丁烷化合物底物改进的高昂繁杂研发流程,以及规模化生产需要特殊仪器产生的生产成本;另一方面,相对于结构复杂的季铵盐类或季膦盐类化合物,该发光增强剂组分均简单易得,通过简单的化学反应即可得到,极大地简化了生产工艺,降低了生产成本。将该发光增强剂应用于1,2-二氧杂丁烷化合物发光检测,可以显著提高检测的灵敏度和准确性,同时稳定性好,适合做成产品例如试剂盒的形式进行生产和销售。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中不同化学发光液不同时间的化学发光信号检测曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明,本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂,发光增强剂包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,或,荧光剂与Tris偶联的化合物中的至少一种。
发明人研究中发现,通过将荧光剂与改性PEG、AMP或Tris偶联得到化合物可以改善1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用,不仅能提高1,2-二氧杂丁烷化合物底物液的稳定性,还可以显著改善底物液的发光效率。一方面,该发光增强剂避免了现有技术中对1,2-二氧杂丁烷化合物底物改进的高昂繁杂研发流程,以及规模化生产需要特殊仪器产生的生产成本;另一方面,相对于结构复杂的季铵盐类或季膦盐类化合物,该发光增强剂组分均简单易得,通过简单的化学反应即可得到,极大地简化了生产工艺,降低了生产成本。此外,发明人研究发现,本发明提供的发光增强剂中化合物为组合类时,更能形成特殊非均一态的多能级胶束,能在酶促过程中更易裂解发出光子,并将该光子在不同光程下传递给不同能极差的荧光基团,从而实现无损失的增强发光。
需要说明的是,1,2-二氧杂丁烷化合物(AMPPD)具体是指:3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷。荧光剂可以为本领域常用的荧光剂,例如可以但不限于为荧光素类荧光剂、罗丹明类荧光剂、香豆素类荧光剂、萘酰亚胺类荧光剂或苯并咪唑类剂等等。AMP为2-氨基-2-甲基-1-丙醇。Tris为三羟甲基氨基甲烷。改性PEG是指PEG(聚乙二醇)的一端或两端修饰有官能团或支链型的PEG。发光增强剂例如可以但不限于包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物和荧光剂与AMP偶联的化合物,荧光剂与改性PEG偶联的化合物和荧光剂与Tris偶联的化合物,荧光剂与Tris偶联的化合物和荧光剂与AMP偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物和荧光剂与Tris偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物等等。
在优选地实施方式中,发光增强剂包括荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,以及,荧光剂与Tris偶联的化合物,三者物质的量的比例优选为(6-8):(1-3):1。发明人研究发现荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,以及,荧光剂与Tris偶联的化合物均可实现提高稳定性和改善发光性能的效果,进一步地,三者结合使用效果更优,同时,发明人优化出了三者结合组合物的较优配比为(6-8):(1-3):1。荧光剂与改性PEG偶联的化合物,荧光剂与AMP偶联的化合物,以及,荧光剂与Tris偶联的化合物的物质的量的比例可以但不限于6:3:1、8:1:1或7:2:1。
在优选地实施方式中,荧光剂包括荧光素类荧光剂、罗丹明类荧光剂、香豆素类荧光剂、萘酰亚胺类荧光剂或苯并咪唑类荧光剂,优选为荧光素类荧光剂。
在优选地实施方式中,改性PEG包括亲水臂为双官能团的PEG或亲水臂为单官能团的PEG。需要说明的是,亲水臂为双官能团的PEG是指PEG的两端均被官能团取代;亲水臂为单官能团的PEG是指PEG与荧光剂偶联的亲水臂的一端被官能团取代。官能团,是决定有机化合物的化学性质的原子或原子团。常见官能团有碳碳双键、碳碳三键、羟基、羧基、醚键、醛基、羰基等。有机化学反应主要发生在官能团上,官能团对有机物的性质起决定作用,-X、-OH、-CHO、-COOH、-NO2、-SO3H、-NH2、RCO-,这些官能团就决定了有机物中的卤代烃、醇或酚、醛、羧酸、硝基化合物或亚硝酸酯、磺酸类有机物、胺类、酰胺类的化学性质。优选地,这里主要是指一端含有氨基官能团的PEG。
在优选地实施方式中,发光增强剂的结构式包括如下的式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ):
其中,m选自1-3的整数,n选自1-12的整数;
优选地,发光增强剂的结构式包括如下式(Ⅰ-1):
在优选地实施方式中,发光增强剂的浓度为0.0001mmol/L-1mmol/L,优选为0.1mmol/L-0.5mmol/L。化合物的浓度典型但非限制性的为0.0001mmol/L、0.001mmol/L、0.01mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L或1mmol/L。
在优选地实施方式中,发光增强剂还包括镁离子、缓冲液、防腐剂或表面活性剂中的至少一种。
在优选地实施方式中,缓冲液包括AMP缓冲液或Tris缓冲液,浓度优选为20mmol/L-1000mmol/L,pH值为8-11.5;优选浓度为50mmol/L-100mmol/L,优选PH为8.5-9.5。缓冲液浓度典型但非限制性的为20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L、600mmol/L、700mmol/L、800mmol/L、900mmol/L或1000mmol/L;pH值典型但非限制性的为8、9、10、11或11.5。
在优选地实施方式中,含有镁离子的盐包括氯化镁、硫酸镁或乙酸镁,镁离子的浓度优选为0.0001-0.1mol/L。镁离子浓度典型但非限制性的为0.0001mol/L、0.001mol/L、0.01mol/L或0.1mol/L。
在优选地实施方式中,防腐剂包括叠氮钠或Proclin300,防腐剂为叠氮钠时,含量优选为质量分数0.01-5%;防腐剂为Proclin300时,含量优选为0.01g/L-1.0g/L。叠氮钠的含量典型但非限制性的为0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5%;Proclin300的含量典型但非限制性的为0.01g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L或1g/L。
在优选地实施方式中,表面活性剂包括CTAC、CTAB、Triton X-100、3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱、3-磺丙基十四烷基二甲甜菜碱或吐温-20中的至少一种,表面活性剂的浓度优选为0.01mmol/L-10mmol/L。表面活性剂例如可以但不限为CTAC和CTAB、Triton X-100和3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱、吐温-20,或者,CTAC、CTAB、Triton X-100、3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱、3-磺丙基十四烷基二甲甜菜碱和吐温-20,等等。
一种1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂的制备方法,将本发明提供的发光增强剂的组分溶解在水中。
一种增强1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的试剂盒,包括本发明提供的发光增强剂,其中,发光增强剂中的组分单独包装或任意混合包装。
一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物,包括1,2-二氧杂丁烷化合物和本发明提供的发光增强剂,其中,1,2-二氧杂丁烷化合物和发光增强剂的物质的量比例为1:2-2:1。该酶促化学发光底物稳定性和发光效率都得到显著改善,提高了检测试剂的灵敏度和准确性,同时成本低,适合批量生产和广泛应用。
一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物的试剂盒,包括本发明提供的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物,酶促化学发光底物中的组分单独包装或任意混合包装。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例
用超纯水配制1L,100mol/L PH9.5的AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)缓冲液,然后加入150mg AMPPD、1.6mg光泽精、250mg CTAC、40mg荧光素钠、400mgMgCl2、500mgProclin300、5mgZnCl2,该混合液作为基础发光液;
在上述基础发光液中分别加入0.1mmol如下(a)-(e)的物质:
(a)PEG-Fluorescein[如下式(Ⅰ-1)];
(b)AMP-Fluorescein[如下式(Ⅳ)];
(c)Tris-Fluorescein[如下式(Ⅴ)];
(d)PEG-Fluorescein[如下式(Ⅰ-1)]、AMP-Fluorescein[如下式(Ⅳ)]和Tris-Fluorescein[如下式(Ⅴ)],三者比例为7:2:1;
(e)0.1mmol荧光素钠[如下式(Ⅵ)]。
共得到5种化学发光液。
以20μl 20ng/ml碱性磷酸酶溶液为样品,分别加入100μl上述5种化学发光液,在化学发光检测仪上测量化学发光信号,具体检测结果如下表所示,作出发光反应的时间曲线,结果如图1所示,本发明公开的化学发光液发光信号稳定。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (21)
3.根据权利要求1所述的发光增强剂,其特征在于,所述发光增强剂的浓度为0.0001mmol/L-1mmol/L。
4.根据权利要求3所述的发光增强剂,其特征在于,所述发光增强剂的浓度为0.1mmol/L-0.5mmol/L。
5.根据权利要求1所述的发光增强剂,其特征在于,所述发光增强剂还包括镁离子、缓冲液、防腐剂或表面活性剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的发光增强剂,其特征在于,所述缓冲液包括AMP缓冲液或Tris缓冲液。
7.根据权利要求6所述的发光增强剂,其特征在于,所述缓冲液的浓度为20mmol/L-1000mmol/L,pH值为8-11.5。
8.根据权利要求7所述的发光增强剂,其特征在于,所述缓冲液的浓度为50mmol/L-100mmol/L。
9.根据权利要求7所述的发光增强剂,其特征在于,所述缓冲液的pH为8.5-9.5。
10.根据权利要求5所述的发光增强剂,其特征在于,含有所述镁离子的盐包括氯化镁、硫酸镁或乙酸镁。
11.根据权利要求10所述的发光增强剂,其特征在于,所述镁离子的浓度为0.0001-0.1mol/L。
12.根据权利要求5所述的发光增强剂,其特征在于,所述防腐剂包括叠氮钠或Proclin300。
13.根据权利要求12所述的发光增强剂,其特征在于,所述叠氮钠的含量为质量分数0.01 -5 %。
14.根据权利要求12所述的发光增强剂,其特征在于,所述Proclin300的含量为0.01g/L-1.0g/L。
15.根据权利要求5所述的发光增强剂,其特征在于,所述表面活性剂包括CTAC、CTAB、Triton X-100、3-磺丙基十六烷基二甲甜菜碱、3-磺丙基十四烷基二甲甜菜碱或吐温-20中的至少一种。
16.根据权利要求15所述的发光增强剂,其特征在于,所述表面活性剂的浓度为0.01mmol/L-10mmol/L。
17.一种1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的发光增强剂的制备方法,其特征在于,将权利要求1-16任一项所述的发光增强剂的组分溶解在水中。
18.一种增强1,2-二氧杂丁烷化合物发光作用的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-16任一项所述的发光增强剂。
19.一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物,其特征在于,包括1,2-二氧杂丁烷化合物和权利要求1-16任一项所述的发光增强剂。
20.根据权利要求19所述的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物,其特征在于,1,2-二氧杂丁烷化合物和荧光发光增强剂的物质的量比例为1:2-2:1。
21.一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物的试剂盒,其特征在于,包括权利要求20所述的碱性磷酸酶的酶促化学发光底物。
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