CN1719254A - 一种化学发光底物增强剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种化学发光底物增强剂，属于免疫检测技术领域。其组分包括：氯化十六烷三甲基铵CTAC，1，2肉蔻酰－Sn－甘油－3－磷酸二钠盐DGPD，牛血清白蛋白BSA，5’－18烷氨基荧光素；各组分的工作浓度范围为：CTAC为4－10mg/L，DGPD为1－30mg/L，BSA为1－50g/L，5’－18烷氨基荧光素为5－100mg/L。该增强剂可以溶解在底物溶液中起作用，也可以单独配制，在反应时与CSPD底物分别加入。化学发光底物增强剂溶解的缓冲液为碳酸盐缓冲液或二乙醇胺缓冲液，pH值范围为9.0－10.0。本发明的优点在于：使用较低的CSPD底物的工作浓度可以较好的分析效果。并且增强剂溶液的配方所有相关的化学试剂均可以从商业途径采购，价格便宜。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，特别是提供了一种化学发光底物增强剂。
背景技术
化学发光免疫分析在过去十年来，以其高灵敏度和宽检测范围在临床检测中发挥了越来越多的作用(尹东光等，几种主要化学发光物质的发光性能及其化学发光免疫分析体系，标记免疫分析与临床，2002，9：225-230)。在发光免疫分析中，最常用的发光物质包括鲁米诺/异鲁米诺，丫啶酯和环二氧乙烷衍生物(dioxetanes)等。鲁米诺/异鲁米诺及丫啶酯化学发光系统均属于闪光型发光，需要相对复杂的检测仪器。这些系统具有很多优点，但是与放免相比，它们的系统相对复杂。从技术上讲，优化十分困难，许多化学成分的使用都影响信噪比。而环二氧乙烷衍生物如AMPPD、CSPD和CDP-Star等系统的发光属于辉光型，利用酶的催化反应来引发发光，同时发光底物本身的化学结构具有较好的热力学稳定性(Stephan Beck等，Perspective：ananlyticalbiotechnology，Anal.Chem.1990，62：2258-2270.)。因此，其使用受到越来越多的重视。
为了增强发光强度，延迟发光时间，常在底物溶液中使用水溶性大分子如牛血清白蛋白(BSA)和表面活性剂(如CTAB、SDS等)。此外，还发现一些荧光素可以增强发光(1，2-Dioxetanes：novelchemiluminescent enzyme substrate.Applications to immunoassays，Journalof bioluminescence and chemiluminescence，1989，4：99-111.)。
发明内容
本发明的目的提供一种化学发光底物增强剂，一种新的CSPD底物增强剂溶液的配方，该增强剂可以溶解在底物溶液中起作用，也可以单独配制，在反应时与CSPD底物分别加入。在化学发光免疫分析中，CSPD底物增强剂溶液可以与碱性磷酸酶作用而发光，其发光强度与碱性磷酸酶的量成正比。
本发明的组分包括氯化十六烷三甲基铵(CTAC)，1，2肉蔻酰-Sn-甘油-3-磷酸二钠盐(DGPD)，牛血清白蛋白(BSA)，5’-18烷氨基荧光素。
本发明配方中CTAC的工作浓度范围为4-10mg/L，DGPD的工作浓度范围为1-30mg/L，BSA的工作浓度范围为1-50g/L，5’-18烷氨基荧光素的工作浓度范围为5-100mg/L。
本发明配方溶解的缓冲液为碳酸盐缓冲液或二乙醇胺缓冲液，pH值范围为9.0-10.0。
本发明的优点在于提供一种简单的CSPD发光底物增强剂溶液的配方。此外，在使用本发明的增强剂溶液时，使用较低的CSPD底物的工作浓度可以较好的分析效果。
本发明的另一个优点在于增强剂溶液的配方所有相关的化学试剂均可以从商业途径采购，价格便宜。
附图说明
图1为本发明测量发光反应的时间曲线。其中，横坐标为时间，纵坐标为相对光强。
图2为测量发光反应的时间曲线，无增强剂。
图3为本发明PRL剂量反应曲线，其中，横坐标为浓度，纵坐标为相对发光强度。
具体实施方式
实施例1 增强剂溶液的配制：
1.06g二乙醇胺，溶解在80ml的去离子水中调pH至9.5，加入0.02g MgCl2，0.4mg CTAC，0.2mg DGPD，0.5g BSA和1.2mg 5’-18烷氨基荧光素，搅拌使其溶解，定容100ml。使用0.2um过滤器过滤溶液，于4℃贮存。使用时，用增强剂溶液稀释底物至0.10mM。
增强发光反应的时间曲线：
使用2.96×10-15摩尔的碱性磷酸酶，加入200ul的底物增强剂工作液，混匀后，室温反应，使用BPCL发光测定仪(中科院生物物理所研制)测量发光反应的时间曲线(见图1)。
使用二乙醇胺溶液稀释的底物溶液作为对照溶液，该溶液与碱性磷酸酶的发光反应的时间曲线见图2。
实施例2 人催乳素(PRL)化学发光免疫分析
试剂：
磁分离试剂：包被羊抗异硫氰酸荧光素的磁珠，直径1um，工作浓度6mg/ml；
PRL单抗-异硫氰酸荧光素工作液：0.75ug/ml；
PRL单抗-碱性磷酸酶工作液：1.0ug/ml；
PRL标准品：0，40，200，500，2000和5000uIU/ml；
以上试剂由北京倍爱康生物技术股份有限公司提供。
清洗液：氯化钠(NaCl)2g，磷酸二氢钠(NaH2PO4.12H2O)2.9g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.2g，氯化钾(KCl)0.2g，曲拉通X-1000.5ml，吐温200.2ml，布兰尼道克斯(Bronidox-L)5g，用纯化水配成1000ml，用0.2μm过滤器过滤，于室温保存。
发光底物增强剂溶液：配制0.05mmol/l，pH9.8碳酸盐缓冲液100ml。取80ml加入0.02g MgCl2，0.5mg CTAC，1.0mg DGPD，1.0g BSA和1.0mg 5’-18烷氨基荧光素，搅拌使其溶解，定容100ml。使用0.2um过滤器过滤溶液，于4℃贮存。使用时，用增强剂溶液稀释CSPD底物原液至0.06mM。
操作步骤：
1、加样与免疫反应：在平底试管中加入15μl标准品，30μl PRL单抗-异硫氰酸荧光素工作液，PRL单抗-碱性磷酸酶工作液，以及60μl10mg/ml磁分离试剂，混匀后，37℃温育30分钟。
2、洗涤：将平底试管放在磁分离器上分离2分钟，然后用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，拍击分离器以除去挂壁液体。每管中加入清洗液150μl，充分混匀后，将平底试管放在磁分离器上分离2分钟，然后用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管放在滤纸上，拍击分离器以除去挂壁液体。重复两次。
3、加入200μl发光底物增强剂溶液，室温下震荡反应15分钟。
4、在BPCL化学发光测定仪上读取发光值，并进行曲线拟合。
结果：见图3。
Claims (2)
1、一种化学发光底物增强剂，其特征在于：组分包括：氯化十六烷三甲基铵CTAC，1，2肉蔻酰-Sn-甘油-3-磷酸二钠盐DGPD，牛血清白蛋白BSA，5’-18烷氨基荧光素；各组分的工作浓度范围为：CTAC为4-10mg/L，DGPD为1-30mg/L，BSA为1-50g/L，5’-18烷氨基荧光素为5-100mg/L。
2、按照权利要求1所述的化学发光底物增强剂，其特征在于：化学发光底物增强剂溶解的缓冲液为碳酸盐缓冲液或二乙醇胺缓冲液，pH值范围为9.0-10.0。
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