CN100443897C - 多级放大荧光免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光免疫分析技术领域，涉及多级放大荧光免疫分析方法。采用含16碳长链琥珀酰亚胺酯-生物素标记特异及发光蛋白(R-PE)，使R-PE分子与相结合的亲和素(A)之间的空间距离以及R-PE与固相微珠(PSMD)的距离加长，有效的解决了发光基团(R-PE)与多级结合的免疫复合物之间的“空间阻碍”，使R-PE发出的不被相邻的分子及固相材料所熄灭，保证了荧光强度的多级放大。实现了荧光强度103以上的多级放大，使灵敏度达1pg/ml。可方便的应用于各类免疫分析，如RIA、ELISA、FIA等领域。

Description

多级放大荧光免疫分析方法
技术领域
本发明属于荧光免疫分析技术领域。
技术背景
荧光免疫分析技术(FIA)因无放射性，无酶试剂的不稳定性及效期限制，在超微量免疫分析领域引起人们更大的关注；但由于FIA存在两个问题：一是液相中产生的散射光降低了信号/噪声比；二是直接检测的荧光信号远低于放免分析(RIA)的电离放大和酶联免疫分析(ELISA)的酶底物放大，造成该技术分析的灵敏度较低。前者经采用时间分辨、荧光微珠技术及流式细胞仪(Flow Cytometry)得以解决，后者经普遍采用亲和素(Avidin，A)-生物素(Biotin，B)放大体系，虽灵敏度有所提高，但仍低于RIA和ELISA法(免疫荧光及有关的染色技术，编辑W.Knapp.，等，Elsevier/North-Holland.NEW YORK出版，1978年，147-148页。Immunofluorescence and related Staining Techniques.Ed W.Knapp.et.al.，Elsevier/North-Holland NEW YORK.Press.1978，P147-148.).
早在1975年，Green就证明亲和素与生物素能以很强的亲和力非共价相结合(解离常数为10-15M)(免疫学方法杂志，1985，76：73-83。J.ImmunolMethods.1985，76：73-83)，1979年Guesdon首次将亲和素-生物素相互结合的方法应用于免疫组织化学中的酶染色(组织化学，细胞化学.1979，27：113-1145.J.Histochem Cytochem.1979，27；1131-1145.)
1981年，Hsu等证明一个亲和素可同时结合4个生物素，并对两者在免疫酶学中应用的方法及理论作了详细的介绍(美国临床病理学杂志.1981，75：734-745.J.Clin Pathol 1981，75：734-745.)
进入八十年代以后，有关研究多数采用的反应方式(式中
Figure C20051011911900062
代表亲和素标记酶或荧光素等可测量物，Ab为抗体，Ag为抗原).这种方式B-A*放大作用有限，故灵敏度不高，只达到10ng/ml.
Hsu等曾提出用A-B之间“架桥”多级放大的模式，但实验结果并未显示多级放大效果，有人认为是“空间阻碍”(Steric hindrance)所致(酶联免疫分析T，Tngo编辑Plenum出版社纽约，1985年p469-476.Enzymemediated Immunoassay Ed.T，T，Ngo，Plenum Press，NewYork，1985，P469-476)为解决“空间阻碍”，有的著者在一抗(兔抗IgG)基础上，加入一个B标记的二抗(羊抗兔IgG-B)使免疫复合物增加长度，分析灵敏度提高到3-5pg/ml.(免疫学方法杂志，1986，90：151-158.J.Immunol.Methods.1986，90：151-158.)
上述方法对A-B之间的结构并未产生明显改变，改变的只是增加了一抗同B之间的长度，故未能实现A-B之间的多级放大，分析的灵敏度还不够理想。
发明内容
本发明的目的就是采用A-B系统多级放大方式提高FIA灵敏度。
为了实现A-B之间连续多级放大，我们采用两个独特的技术措施：一是用长链琥珀酰亚胺-生物素(Sulfo-LC-NHS-B)标记单克隆抗(McAb)-HBs(乙型肝炎)；用Sulfo-LC-NHS-B标记藻红蛋白(R-phycoerythrin)；用无标记A作架桥。二是预先使亲和素A与3个生物素标记藻红蛋白(B-PE)结合，再与B-McAb(生物素标记单克隆抗体)固相结合，避免A四个结合点被饱和以至于A-B连续反应中断，实现了连续多级放大，使分析灵敏度提高了三个数量级.由1ng/mlHBsAg(乙型肝炎表面抗原)提高到1pg/ml。
对这两个独特的技术措施做如下具体的解释：
当免疫复合物与A-B-PE复合物反应时生成免疫复合物与A-B-PE多级复合物，后者以4n倍数增长，当n＝5时PE的数量即可达1000多倍.因为B标记McAb及标记PE，两端经共价联接，含16碳长链的NHS(琥珀酰亚胺酯)，这种标记方法适当增加了发光基团(R-PE)与相邻的B、A及与固相聚苯乙烯微珠(PSMD)的空间距离，故使B-PE-B-A复合物中PE荧光不致因“空间阻碍”而熄灭。
将B-PE-B与A以3∶1(摩尔比)预先结合，可保证A-B-PE-B与固相-Ag-B1∶1的结合，不产生空间干扰，又可以避免A的四个节点被饱和使链索反应中断.在上述反应中一个被结合的HBsAg(乙型肝炎表面抗原)分子可产生1000多个PE分子，PE被记录的荧光强度与被测HBsAg浓度成正比；而阴性样品不含HBsAg，不能生成固相PcAb(多克隆抗体)-Ag-McAb(单克隆抗体)-B复合物.生成的B-PE-B-A被冲洗掉，理论上荧光强度应为零。
本发明的原理标示
Figure C20051011911900081
多克隆抗HBs连接聚苯乙烯微珠(PSMD)
Figure C20051011911900082
HBsAg(乙型肝炎表面抗原)
Figure C20051011911900083
McAb-B(生物素标记单克隆抗体)
Figure C20051011911900084
(B：生物素PE：荧光素)
Figure C20051011911900085
无标记的链亲和素
Figure C20051011911900086
实现本发明的多级放大荧光免疫分析方法技术方案如下：
1.使用的仪器：
●荧光分析仪Luminex Multi-100型；
●高速离心机2000rpm；
●超声波清洗仪50HZ；
●蛋白、核酸监测仪；
2.使用的试剂：
●羧基化聚苯乙烯(PSMD)中80-100nm Luminex CO产；
●硫代琥珀酰亚胺酯，碳二亚胺，生物素，链亲和素，R-藻红蛋白，皆为免疫纯，购自sigma试剂；
●HBsAg，抗HBs，羊抗人IgG，免疫纯长春生物制品研究所产；
●HCV(丙型肝炎病毒)抗原、HIV(艾滋病毒)抗原、HBe(乙型肝炎-e)抗原，中国医科院病毒所产；
●Sephadex G-25、G-100，磷酸盐(PBS)、硼酸盐、碳酸盐等为分析纯；
3.步骤和条件
本发明的方法由以下4步组成：
①.羧基化微珠(PSMD)偶联PcAb
配制缓冲液：
●活化缓冲液-0.1M(pH6.2)PBS；
●偶联缓冲液-0.05M(pH7.4)PBS；
●冲洗缓冲-0.05M(pH7.4)PBS含吐温-20用量为0.1％(v/v)；
●贮存缓冲液-0.01M(pH7.2)PBS含0.05％硫柳汞(w/v)，0.05％庆大霉素(v/v)；
偶联PcAb方法：
●取PSMD1ml(含微珠1.3×107个)，用去离子水及活化缓冲液各冲洗两次；
●加偶联活化剂-硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-NHS)和1-乙基-(3-二甲基、氨基、丙基)碳二亚胺(EDC)分别溶于活化缓冲液浓度均为50mg/ml，各取10μl加到PSMD中，室温反应20分钟，用偶联缓冲液冲洗两次；
●加入PcAb150μl(蛋白含量15μg)，室温反应3小时，用冲洗缓冲液冲洗三次，之后将偶联抗-HBs的PSMD存放于贮存缓冲液中，4℃保存备用.
②.B标记McAb
●McAb(MW150,000)溶于0.1MPBS(pH7.2)含0.15M NaCl，浓度为10mg/ml(w/v)；
●取水溶性Sul fo-LC-NHS-B((长链硫代琥珀酰亚胺-生物素)溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml(w/v)；取20ml(含8×104mM)加入1mlMcAb溶液中(Sulfo-LC-NHS-B/McAb＝12∶1摩尔比)，室温反应60分钟；
●Sephadex-G-25柱层析(用0.01M pH7.2PBS平衡)，取集第一峰，加入0.05％庆大霉素(v/v)于4℃保存；
③.B标记藻红蛋白(R-PE)
●取0.5mlR-PE(含R-PE1mg)置于透析袋中，透析液为0.05M硼酸盐缓冲液(pH8.5)含0.3M NaCl，三次换液，每次500ml，在4℃放置24小时，取出置于反应管中；
●取0.2mg Sulfo-NHS-LC-B(其对R-PE摩尔比为1∶26)直接溶于R-PE中，室温反应90分钟，然后加入中止液0.5ml，中止液为0.075g甘氨酸溶于1ml 0.1M pH7.5的PBS；
●Sephadex G-100经0.01M pH7.2PBS平衡后，将反应液过柱，收集第一峰，加0.01％NaN3于4℃保存；
④.进行荧光免疫分析HBsAg：
●试剂准备：稀释液0.01M pH7.2PBS
冲洗液：0.01M pH7.2PBS含0.15M NaCl，0.01％吐温-20(v/v)；
PcAb联接微珠  1.3×107个/ml；
HBsAg         10mg/ml；
B-McAb        90mg/ml；
A             1mg/ml；
B-R-PE        4mg/ml.
a)分析方法：
将已配好浓度的PcAb、HBsAb和B-McAb三种溶液混合，加入④中配好的稀释液300μL，室温下温育1-2个小时后，加冲洗液冲洗三次，为悬浮液1；
将已配好浓度的A与B-PE溶液混合，加入④中配好的稀释液100μL，室温下温育30-60分钟后，加冲洗液冲洗三次，为溶液2；
将悬浮液1和溶液2合并，室温下温育30-60分钟后，再加冲洗液冲洗三次，然后离心分离，分出沉淀物PSMD，对其用稀释液稀释至100μL，最后用荧光分析仪或激光荧光光度计进行测量，从而构成多级放大荧光免疫分析方法。
本发明的技术指标：
灵敏度：1pg/ml；
特异性：非特异结合＜10％；
均一性：批内相对误差cv＜10％；
批间相对误差cv＜15％；
稳定性：4℃保存6个月，活性降低＜15％；
效期：一年.
本发明的有益的效果
本发明采用含16碳长链琥珀酰亚胺酯-生物素标记特异及发光蛋白(R-PE)，使R-PE分子与相结合的亲和素(A)之间的空间距离以及R-PE与固相微珠的距离加长，有效的解决了发光基团与多级结合的免疫复合物之间的“空间阻碍”，使R-PE发出的不被相邻的分子及固相材料所熄灭，保证了荧光强度的多级放大。
本发明另一个要点是使B标记R-PE与无标记A以3∶1的比例导光结合，再与B-Ab-PSMD结合，避免因B-R-PE或A数量不足导致多级放大中断，实现了荧光强度103以上的多级放大，使灵敏度达1pg/ml.
本发明检测人血清不同抗体时，B标记二抗及A通用，测量不同抗原时A通用，故可方便的应用于各类免疫分析，如RIA、ELISA、FIA等领域。
本发明应用链亲和素(Avidin，A)-生物素(Biotin，B)连续多级放大模式，可使各种免疫分析，包括FIA，TRFIA，RIA和ELISA等分析的灵敏度提高三个数量级。
具体实施方式
以下实施例中使用的长链琥珀酰亚胺均为含有16个碳原子。
实施例1血清HBsAg测定
按照表1称量试剂和样品的加入量：
表1
Figure C20051011911900131
PcAb-MD，HBsAg，B-McAb三者在37℃温育2小时后，离心8000rpm 30分钟，加冲洗液200μL，冲洗三次。
A与B-R-PE温育40分钟，离心，冲洗三次，将两者合并加活化缓冲液，37℃温育30分钟，冲洗三次，加活化缓冲液100μL，测量荧光强度值。
测定结果：R-PE λex 542nm；λem 572nm，仪器给出数据为发射波(波长572nm)光强度值，每样品测量三个平行样品.结果见表2.
表2各组光强度测定结果
Figure C20051011911900132
常规ELISA实验对照比值≥2.1即可诊断为阳性(即实验对象已被乙型肝炎病毒所感染).本发明灵敏度(最低可测浓度)为1Pg/ml.该比值为108/14＝7.7.
实施例2.检测乙型病毒性肝炎e抗体(抗-HBe)
实施原理标示
Figure C20051011911900141
取HBeAg150ug/10ul，PSMD(1.3×107个/ml)1ml用EDC、Sulfo-NHS双活化制备HBeAg偶联PSMD(抗-HBs偶联PSMD)；方法同上(步骤与条件中偶联PcAb方法)
B标记羊抗人IgG
用150μg羊抗人IgG体，20倍分子比的Sulfo-NHS-LC-B标记方法同前(步骤与条件中②)标记Mc抗HBs法。
●B标记R-PE方法及A与前述(步骤与条件中③)测HBsAg相应试剂共用；
测定方法也一样.结果：标准质控血清稀释10倍，常规ELISA法为阴性.
本方法稀释103倍仍为阳性。
实施例3.检测乙型肝炎病毒核心抗体(抗-HBc)。
原理及基本方法同实施例2相同。
●用乙型病毒性肝炎核心抗原(HBcAg)150mg标记1.3×104PSMD，
●B标记羊抗人IgG，B标记R-PE及A与上述实施例2通用。检测方法同例2，结果显示：标准质控血清稀释10倍，常规ELISA法为阴性；
本方法稀释103倍仍为阳性。
实施例4.检测丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)
原理及基本方法同实施例2相同。
●用150μg丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)标记1.3×104PSMD，方法同例2；
●其它试剂如B标记羊抗人IgG，B标记R-PE-及A与实施例2通用。检测方法同例2，结果显示：标准质控血清稀释10倍，常规ELISA法为阴性；
本方法稀释103倍仍为阳性。
实施例5.检测艾滋病毒抗体(抗-HIV)
原理及基本方法同实施例2相同。
●用150μgHIV合成肽抗原标记PSMD；
●其它试剂如B标记羊抗人IgG，B标记R-PE及A与上述试剂通用.检测方法同实施例2，结果显示：标准质控血清稀释10倍，常规ELISA法为阴性；本方法稀释103倍仍为阳性。

Claims (1)

1.多级放大荧光免疫分析方法，其特征在于，步骤和条件如下：
1、使用的仪器：
·荧光分析仪Luminex Multi-100型；
·高速离心机2000rpm；
·超声波清洗仪50HZ；
·蛋白、核酸监测仪；
2、使用的试剂：
·羧基化聚苯乙烯中80-100nm Luminex公司产；
·硫代琥珀酰亚胺酯，碳二亚胺，生物素，链亲和素，R-藻红蛋白。皆为免疫纯，购自sigma试剂；
·HBsAg，抗HBs，羊抗人IgG，免疫纯长春生物制品研究所产；
·HCV抗原、HIV抗原、HBe抗原，中国医科院病毒所产；
·Sephadex G-25、G-100，磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐等为分析纯；
3、步骤和条件
由以下4步组成：
①.羧基化微珠偶联PcAb
配制缓冲液：
·活化缓冲液-0.1M磷酸盐缓冲液，其pH6.2；
·偶联缓冲液-0.05M磷酸盐缓冲液，其pH7.4；
·冲洗缓冲液-含体积比为0.1％吐温-20的0.05M的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；
·贮存缓冲液-0.01M磷酸盐缓冲液，其pH7.2，含质量体积比为0.05％的硫柳汞，含体积比为0.05％的庆大霉素；
偶联PcAb方法：
·取羧基化聚苯乙烯1ml，其含微珠1.3×107个，用去离子水及活化缓冲液各冲洗两次；
·加偶联活化剂-硫代琥珀酰亚胺酯和1-乙基-(3-二甲基、氨基、丙基)碳二亚胺分别溶于活化缓冲液浓度均为50mg/ml，各取10μl加到羧基化聚苯乙烯中，室温反应20分钟，用偶联缓冲液冲洗两次；
·加入PcAb150μl其中含蛋白含量15μg，室温反应3小时，用冲洗缓冲液冲洗三次，之后将偶联抗-HBs的羧基化聚苯乙烯存放于贮存缓冲液中，4℃保存备用.
②.B标记McAb
·McAb，其MW150,000，溶于0.1M磷酸盐，其pH7.2含0.15M NaCl，质量体积浓度为10mg/ml；
·取水溶性长链硫代琥珀酰亚胺-生物素溶于蒸馏水中，浓度为20mg/ml；取20ml，含8×104mM，加入1mlMcAb溶液中，其中，长链硫代琥珀酰亚胺-生物素与McAb的摩尔比为12∶1，室温反应60分钟；
·用pH7.2的0.01M磷酸盐缓冲液平衡Sephadex-G-25柱层析，取集第一峰，加入体积比为0.05％的庆大霉素于4℃保存；
③.B标记藻红蛋白R-PE
·取0.5mlR-PE，含R-PE1mg置于透析袋中，透析液为0.05M硼酸盐缓冲液，其pH8.5，含0.3M NaCl，三次换液，每次500ml，在4℃放置24小时，取出置于反应管中；
·取0.2mg长链硫代琥珀酰亚胺-生物素，其对R-PE摩尔比为1∶26，直接溶于R-PE中，室温反应90分钟，然后加入中止液0.5ml，中止液为0.075g甘氨酸溶于1ml 0.1M pH7.5的磷酸盐溶液；
·Sephadex G-100经0.01M pH7.2的磷酸盐溶液平衡后，将反应液过柱，收集第一峰，加0.01％NaN3于4℃保存；
④.进行荧光免疫分析HBsAg：
·试剂准备：稀释液为0.01M，pH7.2的磷酸盐溶液，冲洗液：0.01M pH7.2磷酸盐溶液含0.15M NaCl，含体积比为0.01％的吐温-20；
PcAb联接微珠 13×107个/ml；
HBsAg        10mg/ml；
B-McAb       90mg/ml；
A            1mg/ml；
B-R-PE       4mg/ml.
分析方法：
将已配好浓度的PcAb、HBsAb和B-McAb三种溶液混合，加入④中配好的稀释液300μL，室温下温育1-2个小时后，加冲洗液冲洗三次，为悬浮液1；
将已配好浓度的A与B-PE溶液混合，加入④中配好的稀释液100μL，室温下温育30-60分钟后，加冲洗液冲洗三次，为溶液2；
将悬浮液1和溶液2合并，室温下温育30-60分钟后，再加冲洗液冲洗三次，然后离心分离，分出沉淀物PSMD，对其用稀释液稀释至100μL，最后用荧光分析仪或激光荧光光度计进行测量，从而构成多级放大荧光免疫分析方法。
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