CN1402834A - 高灵敏度的免疫检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供高灵敏度检测体液样品中细胞因子的方法。该方法是时间分辨荧光免疫检测(TR－FIA)方法，包括捕捉细胞因子，在固相上形成含有与镧系金属离子络合的荧光结构部分的复合物的步骤，以及测定荧光结构部分的荧光的步骤。该复合物由依次结合(a)具有固相结合部分和能与细胞因子结合的区域的第一抗体，(b)细胞因子，(c)具有能与细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体，(d)具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物，以及(e)镧系金属离子而形成。荧光结构部分可用通式(I)表示。

Description

高灵敏度的免疫检测方法
                       技术领域
本发明涉及用于检测体液样品中细胞因子的时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法，特别是涉及利用荧光铕络合物高灵敏度检测体液样品中细胞因子的检测方法。
                        技术背景
正常人血浆等体液中存在的游离细胞因子或趋化因子的浓度接近或低于常规ELISA测定的检测界限。例如，据报道通过应用检测界限为6皮摩尔(pM)的传统ELISA测定，从正常人血浆中检测不到IL-8(Leonard等(文献1))。为了正确测定体液样品中趋化因子的浓度，增大测定灵敏度以及减低来源于体液样品的非特异性背景就成为主要课题。
近年来，开发了利用铕络合物的时间分辨荧光免疫检测方法，并正用于临床上(Kropf等(文献2))。游离的、形成了络合物的铕离子(Eu3+)的放射波长为615nm，不会受到激发波长(340nm)或某种蛋白质造成的短寿命背景荧光(350nm～600nm)的影响，所以很合适。基于该原理的1种分析方法是商业化的DELFIA(解离-增强型镧系荧光免疫检测；Pharmacia)，例如可用于TNFα和IL-6的测定。但是，应用DELFIA时不能成功地正确测定这些细胞因子在血浆中的浓度(Ogata等(文献3))。
最近，松本等研究小组开发了4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-邻-三苯基(BHHCT)-Eu3+络合物作为标记化合物。该络合物可与蛋白质直接结合，通过时间分辨型荧光测定可以进行高灵敏度分析(Yuan等(′97)(文献4)和Yuan等(′98)(文献5))。BHHCT具有β-二酮结构，与Eu3+结合的稳定系数高达1010M-1。所生成的Eu3+络合物的寿命超过400微秒(μs)，吸收和发射波长的最大值为330nm和615nm，显示了极良好的性质。说明该络合物可用于检测人血浆中肿瘤标志物甲胎蛋白(Yuan等(′98)(文献5))和免疫球蛋白E(IgE)(Yuan等(′97)(文献4))的检测。但是，还不知道应用上述Eu3+络合物检测体液样品中细胞因子的例子。
基质细胞来源的因子-1(SDF-1)是属于趋化因子家族的细胞因子，它是1993年从骨髓基质细胞系初次克隆出来(Tashiro等(文献6))。SDF-1是CXCR4受体的主要配体(Bleul等(文献7)和Oberlin等(文献8))。已知该受体作为I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)亚群的CD4共受体(coreceptor)起作用。最近的研究表明，SDF-1基团的多态性与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)进展的延迟相关。(例如，Winkler等(文献9)和Martin等(文献10))。但是，其作用机制有多种阐释，尚未确立。
还有文献指出SDF-1在造血、心血管和神经系统的胚胎形成中起着重要作用(例如，Zou等(文献11)和Tachibana等(文献12))。另一方面，现状是SDF-1在成人组织中的生物学功能还有许多尚未阐明。
如上所述，开发一种正确定量、监测体液样品中SDF-1的技术，将对加深理解SDF-1起到极为重要的作用。不言而喻，对其它趋化因子和细胞因子也一样，体液样品的正确测定方法将会为学术和临床作出贡献。基于这样的观点，期望有以更高灵敏度检测细胞因子的测定方法。
                         发明公开
本发明的目的是解决上述课题，并提供高灵敏度且能简便检测体液样品中细胞因子的方法。
根据本发明，它提供用于检测体液样品中细胞因子的时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法，该方法包括：
在固相上形成依次结合了(a)具有固相结合部分和能与细胞因子结合的区域的第一抗体，(b)该细胞因子，(c)具有能与该细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体，(d)具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物，(e)镧系金属离子的复合物的步骤；以及
测定与镧系金属离子络合的荧光结构部分的荧光的步骤；
这里，该荧光结构部分可用通式(I)表示：
      -R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n-1-X      (I)(式中，R为能与蛋白质形成共价键的官能团残基，Ar为具有共轭双键体系的烃基，n为1以上的整数，X为氟原子或通式(II)表示的基团)
         -C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R-       (II)
本发明的一实施方案中，上述镧系金属离子为铕。
本发明的一实施方案中，上述荧光结构部分可用通式(III)表示。
      -R-Ar-(C(C＝O)-CH2-C-(＝O)-CnF2n+1)2   (III)
           (式中，R、Ar及n与上面相同)
本发明的一实施方案中，上述荧光结构部分为4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-邻-三苯基。
本发明的一实施方案中，上述结合物中，相对于每1分子链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，存在10～60单位上述荧光结构部分。
本发明的一实施方案中，上述测定荧光的步骤在不解离在固相上形成的复合物的情况下进行。
本发明的另一实施方案中，上述测定荧光的步骤是在解离在固相上形成的复合物后进行。
本发明的一实施方案中，上述细胞因子为趋化因子家族的细胞因子。
本发明的一实施方案中，上述细胞因子可以是CXC趋化因子。
本发明的一实施方案中，上述细胞因子为基质细胞来源的因子-1(SDF-1)。
或者，本发明的一实施方案中，上述细胞因子可以作为血循环中的可溶性因子存在，并且是微量即具有生物活性的细胞因子。
或者，本发明的一实施方案中，上述细胞因子可以是粒细胞-巨噬细胞-单集落刺激因子(GM-CSF)或白细胞介素2(IL-2)。
本发明的一实施方案中，上述体液样品为血浆或全血。
本发明的一实施方案中，还包括在上述形成复合物的步骤之前，用样品稀释缓冲液稀释上述体液样品的步骤；该样品稀释缓冲液是pH7.3～8.3的0.01～0.1M Tris-HCl，并含有0.1～0.3％牛血清白蛋白，0.05～0.2％叠氮钠，以及0.5～1.5％的氯化钠。
本发明的一实施方案中，还包括在上述形成复合物的步骤之前，在上述细胞因子的非变性温度条件下，对上述体液样品进行加热处理的步骤。
本发明的一实施方案中，还包括在测定荧光的步骤之前，用洗涤缓冲液洗涤在上述固相上形成的复合物的步骤；该复合物洗涤缓冲液是pH8.5～9.5的0.01～0.1M Tris-HCl，并含有0.01～0.1％的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯。
本发明的一实施方案中，上述固相是有50～200ng/cm2 IgG吸附能力的微量滴度板。
另外，根据本发明，还提供用于检测体液样品中细胞因子的时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法的试剂盒，该试剂盒包括具有固相结合部分和能与细胞因子结合的区域的第一抗体，具有能与该细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体，具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物，以及镧系金属离子；这里，该荧光结构部分可用通式(I)表示：
          -R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X    (I)(式中，R为能与蛋白质形成共价键的官能团残基，Ar为具有共轭双键体系的烃基，n为1以上的整数，X为氟原子或通式(II)表示的基团)
          -C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R-      (II)
                  附图的简单说明
图1a是表示SDF-1校正曲线的图。应用实施例2所述的TR-FIA法测定标准SDF-1。数据是3次测定的平均值。
图1b是与图1a相同的校正曲线，是特别在低浓度范围内测定的。图中的直线，Y＝1.3X+1.2(×10000a.u.)，r＝0.995。数据是3次测定的平均值。
图1c是为了监测SDF-1的生物学活性，按照实施例3所述的方案测定EL-4细胞表面的CXCR4表达的结果图。通过与没有人SDF-1β时进行培养的对照相比较，计算出平均荧光强度(MFI)的减少％。数据是1轮实验进行3次后选择的中间值。
图1d表示为了评价TR-FIA对SDF-1的特异性，测定各种趋化因子的结果图。数据是测定3次的平均值。
图2是针对SDF-1的，TR-FIA与DELFIA进行比较的图。图2的左侧是以人SDF-1β为标准溶液，用与实施例2中使用的相同组合的捕捉抗体和检测抗体，用DELFIA和TR-FIA体系进行测定的结果。图2的右侧表示用两种体系检测血浆样品中内源性SDF-1浓度的结果。图2右侧所示的样品中未添加标准SDF-1。图2右侧的数据和表1的数据是对不同样品进行测定的结果。数据是3次测定的平均值。
图3a是表示抗凝剂和蛋白酶抑制剂对用TR-FIA测定SDF-1的影响。用EDTA(1mg/ml)，肝素(30IU/ml)，柠檬酸盐(0.38％柠檬酸钠)及具有抑肽酶(1μg/ml)的EDTA(1mg/ml)中的任一种处理血浆样品。黑柱和斜线柱是对两个不同样品进行测定的结果。数据是3次测定的平均值。
图3b表示血浆样品的预加热对用TR-FIA测定SDF-1的影响。测定前55℃预先温育血浆样品30分钟，或不加热直接进行测定。24份体液样品来自健康的日本志愿者。数据是2次测定的平均值。
图3c表示血浆样品的稀释对用TR-FIA测定SDF-1的影响。用缓冲液4稀释各样品。5份体液样品来自健康的日本志愿者。数据是3次测的平均值。
图4a表示作为SDF-1的对照的，用ELISA定量IL-8时血细胞的影响。将IL-8添加到血浆样品后，混合细胞沉积物或血浆。37℃温育15分钟后，对血浆中的可溶性IL-8进行定量。白方块是未与细胞沉积物或血浆混合的标准样品，黑圆图表示与血浆混合的样品，白圆圈表示与细胞沉积物混合的样品。数据是4次测定的平均值。
图4b是作为SDF-1的对照的，用ELISA对MCP-1进行定量时血细胞的影响。向血浆样品中添加MCP-1后，与细胞沉积物或血浆混合。37℃温育15分钟后对血浆中的可溶性MCP-1进行定量。符号与图4a相同。数据是测定4个复本的均值。
图4c表示在SDF-1的TR-FIA定量中血细胞的影响。向血浆样品中添加SDF-1后，与细胞沉积物或血浆混合。37℃温育15分钟后，对血浆中的可溶性SDF-1进行定量。符号与图4a相同。数据是测定4个复本的均值。
图5表示36个健康日本志愿者的人血浆中SDF-1的水平。测定前，于55℃对所有的血浆样品进行30分钟热处理。数据是2轮不同测定的各3次测定的平均值。
图6表示人血浆样品中Protein G-Sepharose引起的IgG耗竭的影响。将从7个健康日本志愿者获取的血浆样品与Protein G-Sepharose在冰上一起温育30分钟，离心分离，测定上清中的SDF-1量。斜线柱和黑柱分别表示非加热样品和加热(55℃30分钟)样品。
图7表示GM-CSF的校正曲线。用TR-FIA方法测定标准GM-CSF。数据是3次测定的平均值。
图8是IL-2的校正曲线。用TR-FIA法测定标准IL-2。数据是3次测定的平均值。
                   实施本发明的最佳方式
以下，对本发明进行更详细的说明。
本发明的方法基于时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法。
“时间分辨荧光免疫检测”是应用如本发明中镧系金属离子络合物的能放射长寿命荧光的荧光化合物，通过免疫学反应标记测定对象物，在较短寿命的背景荧光消失后，对来自标记物的荧光信号进行时间分辨型测定的测定方法。
本发明的方法尤其适于高灵敏度检测体液样品中的细胞因子。“体液样品”是指从动物，优选从哺乳动物，尤其是从人体采集的液态物质。代表例有血液(即全血)及其分级物血浆和血清，以及脑脊髓液、胆汁、羊水、胸水、腹水、呼吸道内分泌液、骨髓液、乳汁、泪液、鼻腔分泌物、心内膜液、关节内包液、唾液、精液、尿等。动物来源的培养细胞的上清液等也包括在体液样品中。本发明的方法在应用全血、血浆、血清或脑脊髓液时，尤其是应用全血或血浆时效果显著。称为体液样品时，通常包括生物体液自身和用生物体液适宜的载体进行稀释等处理后的液态样品两者。
“细胞因子”是指在生物体细胞间负责信息传递的蛋白质性化学物质。对于每种细胞因子来讲，靶细胞表面上表达其特征的受体，通过与受体结合而显示细胞增殖、分化等生理活性。统称为“造血因子”的一组诱导血细胞分化和增殖的细胞因子包括包含粒细胞-巨噬细胞-单集落刺激因子(GM-CSF)的集落刺激因子(CSF)、干细胞因子、促红细胞生成素、促血小板生成素等。调控淋巴细胞的白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18等。统称为“生长因子”的一组细胞因子包括TGF-β家族、EGF家族、FGF家族、IGF家族、NGF家族、血小板来源的生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等。统称为“肿瘤坏死因子”的一组细胞因子包括TNF-α、TNF-β等。统称为“干扰素”的一组细胞因子包括INF-α、INF-β、INF-γ等。其它已知的细胞因子有内皮素、胶质细胞株来源的神经营养因子(GDNF)等。细胞因子中，使任一种功能上成熟的血细胞具有化学趋避性的一组细胞因子称作趋化因子。按照其N末端所保存的半胱氨酸的位置，将趋化因子分为CC、CXC、C、CXXXC4类。
本发明的方法中的检测对象可以是上述趋化因子中的任一种。再者，属于上述细胞因子一组的新发现的成员，或者不属于上述细胞因子一组的新发现的细胞因子也是本发明方法中的检测对象。尤其是，本发明的方法适用于在血循环中以可溶性性因子存在、微量即具有生物学活性、与多种疾病相关的细胞因子。
本发明方法中检测对象的例子有属于上述趋化因子家族的细胞因子，尤其是CXC趋化因子，但不一定限于这些分类。本发明中最优选的检测对象的例子为SDF-1。
本发明的方法中，为了选择性捕捉、标记体液样品中所期望的细胞因子，在固相上形成包含该细胞因子的复合物。具体而言，含有细胞因子的复合物是由以下成分在适宜的固相上形成的：
(a)具有固相结合部分和能与细胞因子结合区域的第一抗体；
(b)细胞因子；
(c)具有能与细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体；
(d)具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物；以及
(e)镧系金属离子。
以下，对各成分进行说明。
首先，作为“固相”可应用任意形状和材质的固体物质，只要是能进行抗体的结合且不妨碍上述复合物的形成以及后述的荧光测定即可。为了便于测定方法的实施，代表性的可应用多孔型微量滴度板，也可应用填充了珠子的柱子(珠子的材质为葡聚糖、琼脂糖等，但并不限于此)等其它形状的物质。本发明中尤适宜应用具有中等程度的蛋白质吸附能力的微量滴度板。这里的“中等程度”的吸附能力是指当免疫球蛋白G(IgG)作为标准蛋白质被吸附时，代表性的吸附约50～约200ng/cm2，优选约15～约150ng/cm2，更优选约90～约120ng/cm2的吸附能力。微量滴度板的材质优选聚苯乙烯，但不限定于此。
成分(a)“第一抗体”是以与上述固相结合的状态存在，且通过抗原-抗体反应能与所期望的细胞因子结合的抗体。根据这种概念，将第一抗体称做“捕捉抗体”。本说明书中的“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体、Fab、(Fab)2、嵌合抗体等任意类型的免疫球蛋白(Ig)和免疫球蛋白来源的分子。术语“抗体”用意广泛，只要与免疫球蛋白同样能与细胞因子结合，以该细胞因子作配体的受体也包含在内。优选的抗体例子是多克隆抗体或单克隆抗体。针对各种细胞因子的抗体均有市售，例如可购自R&D System Inc.(Minnesota，US)、Dako Immunoglobulinsals(丹麦)、PharMingen(California，US)、Southern Biotechnology Associates(Alabama，US)等公司。或者可以利用免疫动物、杂交瘤技术等常规方法制备针对所期望的细胞因子的抗体。
结合到固相的方法可按照常规的方法进行，例如将第一抗体直接涂布到微量滴度板上。第一抗体中的“固相结合部分”代表性的指其一部分吸附到固相上的、抗体的Fc区域，但并不限于此。例如也可应用能分别与固相和抗体的一部分结合的双功能性的连接分子。
成分(b)，即存在于体液样品中的所期望的细胞因子，代表性的是通过与第一抗体结合而固定到固相上。细胞因子不必以游离状态与第一抗体接触，例如可与后述的第二抗体结合后与第一抗体结合。这样品发明中复合物的形成不限于各成分结合的次序。
本发明者们发现当把含有所期望细胞因子的体液样品暴露给能与该细胞因子结合的抗体时，用适当的缓冲液将之稀释成适宜的浓度对于高灵敏度检测细胞因子是很重要的。用缓冲液稀释体液样品的稀释倍数，当用(体液样品∶缓冲液)的体积表示时，代表性的约1∶1～约1∶30，优选约1∶2.5～约1∶20，更优选约1∶5～约1∶15的范围。稀释倍数的最适值要根据体液样品的种类和细胞因子的种类而变动，还要依赖于样品稀释缓冲液的组成。
适宜的样品稀释缓冲液为由三(羟甲基)氨基甲烷(略作“Tris”)和无机酸构成的弱碱性缓冲液，代表性的为Tris-HCl。其pH，代表性的为约7.0～约8.0，优选约7.3～约8.3，更优选约7.5～约8.1。代表性的浓度为约0.005～约0.2摩尔(M)，优选约0.01～约0.1M，更优选约0.025～约0.075M。
样品稀释缓冲液还包含适量的血浆蛋白质成分和盐类。血浆蛋白质成分代表性的为血清白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)。其浓度代表性的为约0.05～约0.5％左右，优选约0.1～约0.3％，更优选约0.15～约0.25％。盐类代表性的为叠氮钠(NaN3)和氯化钠(NaCl)。NaN3的浓度代表性的为约0.02～约0.4％，优选约0.05～约0.2％，更优选约0.05％～约0.15％。NaCl的浓度代表性的为约0.2～约3％，优选约0.5～约1.5％，更优选约0.6～约0.12％。
不用说样品稀释缓冲液的组成不限定于上述条件，也允许该领域的技术人员进行便宜的各种改变。例如，可用其它碱金属或碱土金属对应的盐置换上述钠盐的一部分或全部。样品稀释缓冲液的pH和各成分的浓度等的最佳值可根据检测对象细胞因子的种类而不同，还依赖于体液样品的稀释倍率。该领域的技术人员可在通常条件设定方法的范围内使之最优化。
成分(c)“第二抗体”具有能与细胞因子结合的区域，并与第一抗体一起以夹心形式捕捉所期望的细胞因子。第一抗体与第二抗体最好是互不干涉，识别同一细胞因子不同部位(即不同表位)的抗肽抗体。因此，与所期望的细胞因子的结合能力相关，第一抗体和第二抗体的适当组合是很重要的。例如，可用全长细胞因子，或用已知或预测包含多个表位的细胞因子的片段免疫适当的动物，从获得的多种多克隆抗体中选择适当的组合。或者从识别表位不同的多个单克隆抗体中选择适当的组合。这样的选择不是特别难进行，例如可通过制备细胞因子的标准溶液，对需检测的抗体组合用常规ELISA进行预实验。
第二抗体还具有生物素结合部分，并可通过荧光测定检测细胞因子。根据这这种概念，又把第二抗体叫做“检测抗体”。生物素是一种维生素，又叫做维生素H或辅酶R，并可与肽等的氨基形成酰胺键。第二抗体可通过应用常规方法，对检测对象细胞因子的抗体进行生物素化和纯化来进行制备。第二抗体中的“生物素结合部分”是指生物素自身和结合了生物素的抗体的一部分(代表性的为Fc区域)。必要时可应用能与生物素和抗体的一部分结合的双功能性连接分子连接这两部分。
这里，“第二抗体”不必为单一分子，可表示任意结构单位，只要能履行必要的功能(即，通过抗原-抗体反应或配体-受体结合反应可结合细胞因子的功能，以及携持生物素的功能)即可。上述“第一抗体”也同样。例如，本发明中可应用抗所期望细胞因子的抗体和能与该抗细胞因子抗体结合的生物素化抗IgG抗体的组合。此时，抗细胞因子抗体与生物素化抗IgG抗体的组合统称为“第二抗体”。生物素化抗IgG抗体具有普遍适用性，所以很方便。另外，当针对所期望细胞因子的抗体因某种原因对生物素化反应有抵触性时，组合应用生物素化抗IgG抗体则可以奏效。另一方面，从简化测定程序、且使细胞因子的检测灵敏度最大化的观点出发，优选应用单一分子作为第二抗体。
成分(d)的“结合物”是具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的任意结构单位，代表性的是链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白与荧光结构部分直接或间接通过共价键连接起来的分子。众所周知，链霉抗生物素蛋白通常是由放线菌产生的分子量约6万的蛋白质，具有很强地与生物素结合的性质。但是，本发明中的“链霉抗生物素蛋白”对微生物来源不作限定，只要它基本上维持与生物素结合的能力，可包含其它微生物来源的相应蛋白质及其修饰物。众所周知，通常抗生物素蛋白是卵白中包含的分子量约7万的蛋白质，也具有很强地与生物素结合的性质。本发明中的“抗生物素蛋白”不限于天然的卵白蛋白质，只要能基本上维持与生物素结合的能力，也包含其修饰物。
由上述原则可知，本发明的方法也可通过应用具有能与细胞因子结合的区域和链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白结合部分的抗体替代成分(c)，以及通过应用具有生物素和能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物替代成分(d)来完成。
成分(d)的结合物中能与镧系金属离子络合的荧光结构部分是指相应的荧光化合物与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白间直接或间接形成共价键，通过这样的反应而得到的部分结构。荧光结构部分可用下面的通式(I)表示。
      -R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X    (I)(式中，R为能与蛋白质形成共价键的官能团残基，Ar是具有共轭双键体系的烃基，n为1以上的整数，X为氟原子或通式(II)表示的基团)
            -C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R    (II)
上述通式中，规定残基R的“能与蛋白质形成共价键的官能团”是指能与蛋白质中氨基酸残基具有的任意反应性基团(代表性的如氨基、羧基和羟基)反应并能形成共价键的任何有机官能团。这样的官能团的例子包括下面所示的基团：-N＝C＝S，-N＝C＝O，
Figure A0081640500151
-N2X，-N3，
Figure A0081640500152
-SO3CF3，-NH2，
Figure A0081640500153
-SO2X，-SO3H，-SH，-X，-CX3，(其中，X选自卤素原子、-OSO2CH3、-OSO2F、-OSO2CF3、-OSO2C4F9或-OSO2PhCH3-p(Ph为苯基)，RA选自烷基、链烯基、芳香基、或芳烷基，RB选自亚烷基、亚烯基、亚芳基或亚芳烷基，p为0～5，q为2～10)
上述通式中，规定Ar的“具有共轭双键体系的烃基”是指至少有3个共轭的双键的烃基，代表性的是至少有1个苯环的2价或3价芳香族烃基。对烃基的碳原子数上限没有特殊限制，代表性的在约50个以内，优选在约30个以内。这里，1个以上的碳可被杂原子(例如氧或硫原子)所取代。烃基Ar的例子包括下列基团。 (m为1～6的整数)
Figure A0081640500163
Figure A0081640500164
优选烃基Ar为3价，荧光结构部分可用通式(III)表示。
        -R-Ar-(C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1)2    (III)
这里，较优选的Ar例子是在4，4′位与2个β-二酮基结合的O-三苯基。同样优选的Ar的其它例子是将2个β-二酮放置在与O-三苯基中的β-二酮位置近似或基本上同一空间距离的3价芳香族烃基。
上述通式中，n为1以上的整数，代表性的为1～6，优选2～4。
本发明中特别优选的荧光结构部分是4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-邻-三苯基。它是从相应的荧光化合物4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-氯磺酰基-邻-三苯基(略作“BHHCT”)获得的。BHHCT的结构式如下所示：
Figure A0081640500171
提供上述荧光结构部分的所期望的荧光化合物，可利用常规的有机合成反应而合成。代表性的是按照包括以下2个步骤的工序合成：
(第一步)在适当的溶剂中以及碱性催化剂(例如甲基钠盐)存在的条件下，使乙酰基化的芳香族化合物与过氟羧酸酯进行Claisen缩合反应，生成乙酰基的CH3被过氟羧酸酯化了的β-二酮化合物。
(第二步)将能与蛋白质形成共价键的官能团导入β-二酮化合物中。例如，通过应用氯磺酸进行氯磺化反应而使芳香环的氢被置换为氯磺酰基(ClSO3-)。必要时在各步后进行重结晶、沉淀等纯化。
所得荧光性化合物依赖于在上述第二步中导入的官能团种类，在适当的条件下可与蛋白质进行反应，从而提供目的荧光结构部分。例如，氯磺酰基与蛋白质中的氨基在碱性反应条件下很容易地形成酰胺。
本发明中，成分(d)的结合物可通过用荧光化合物直接标记链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而制备。或者通过首先结合链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白与其它蛋白质(例如牛血清白蛋白)后，再对之进行标记而制备。链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白与其它蛋白的结合可按常规方法进行，如应用戊二醛进行交联反应。
用荧光化合物标记蛋白质的反应，代表性的是将蛋白质溶解到已调节至适于反应的pH(例如，进行氯磺化时，pH约为9左右)的缓冲液中后，在该缓冲液中以期望的摩尔比量添加溶解到适宜溶剂(例如乙醇或二甲基甲酰胺)的荧光化合物来进行。可通过调节相对于蛋白质的荧光化合物的摩尔比以及通过调节含有荧光化合物的溶液的浓度，控制每1个蛋白质分子结合的荧光化合物的比率(亦称为“结合比”)。该结合比相当于本发明的结合物中每1分子链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的荧光结构部分的单位数。结合比代表性的为5-100单位，优选10～60单位。结合比过低的话，得不到足够高的细胞因子检测的灵敏度。另一方面，结合比过高也不会提高检测灵敏度。
本发明方法中，通过成分(e)镧系金属离子与上述荧光结构部分络合，在固相上形成复合物。镧系金属离子的例子包括铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)和镝(Dy)。其中，优选铕。通常镧系金属离子预先与成分(d)的结合物络合，在此状态下用于复合物的形成。也就是说，通常在上述链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素形成结合的时间点，荧光结构部分已形成了挟持Eu3+的络合物。但并不妨碍与此相反的程序。
本发明人等发现将上述在固相上形成的复合物进行荧光测定之前，用适宜的缓冲液进行充分洗涤，对于高灵敏度的细胞因子的检测是重要的。这里所讲的适当的复合物洗涤缓冲液是由Tris和无机酸构成的碱性缓冲液，代表性的是Tris-HCl。其pH，代表性的为约8.2～约9.8，优选约8.5～约9.5，更优选约8.7～约9.4。其浓度，代表性的是约0.005～约0.2M，优选约0.01～约0.1M，更优选约0.025～约0.075M。
复合物洗涤缓冲液还含有适量的、具有蛋白质促溶能力的非离子表面活性剂。该非离子表面活性剂，代表性的为聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，优选商品名为“Tween(注册商标)20”的市售聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(分子量约1200)。也可优选应用与Tween(注册商标)20基本上具有同一性质(例如羟基值为约95～约115，皂化值为约35～约55，HLB为约15～约18(亲水性-疏水性平衡))的其它非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的浓度代表性的为约0.005～约0.2％，优选约0.01～约0.1％，更优选约0.025～约0.075％。
不言而喻，复合物洗涤缓冲液的组成并不限定于上述条件，允许该领域的技术人员进行便宜的各种改变。PH和各成分的浓度等的最佳值可根据作为检测对象的细胞因子的种类而不同。这种最优化可由该领域的技术人员在通常条件设定方法的范围内进行。
以下，概括说明本发明方法中在固相上形成复合物的代表性程序的例子。
1)将用适宜的涂布用缓冲液稀释的第一抗体的溶液施用到固相上(例如96孔微量滴度板的孔)，通过孵育，将一抗固定到固相。作为涂布缓冲液，例如可应用含有适量NaCl的磷酸缓冲液。孵育的条件，代表性的是约2～6℃左右20小时以上。
2)接着用洗涤缓冲液洗涤数次涂布了第一抗体的固相表面。作为洗涤缓冲液，例如可应用弱碱性的Tris-HCl，必要时可添加适量的具有蛋白质促溶能力的非离子表面活性剂。洗涤后将涂布了的固相保存于-20℃，直到需要进行测定之前。
3)如上所述，优选预先用稀释缓冲液对含有检测对象细胞因子的体液样品进行适当稀释。将该体液样品以及根据需要将该细胞因子的标准溶液施用到已涂布了的固相上进行孵育。孵育的条件，代表性的是约35～39℃左右约40分钟～约2小时左右。孵育后与上述同样，用洗涤缓冲液数次洗涤固相表面。
4)其后，将用适当的缓冲液稀释的第二抗体溶液施用到固相上。这里，优选应用与上述样品稀释缓冲液相同的溶液。孵育条件与体液样品的上述孵育条件相同。孵育后与上面同样，用洗涤缓冲液数次洗涤固相表面。
5)将结合物与镧系金属离子的盐溶液混合，形成荧光性络合部分。用适当的溶剂稀释络合的结合物后，施用到固相上进行孵育。孵育条件与体液样品和二抗的上述各孵育条件相同。孵育后，如上所述，用适当的复合物洗涤缓冲液洗涤在固相上形成的复合物。
将由上述步骤得到的含有镧系络合物的复合物供给到固相或液相的时间分辨型荧光测定。该荧光测定的装置可从市场上购买。测定条件是，代表性的是延迟时间为约0.2～约0.3毫秒(ms)，窗口时间为约0.2～约0.6ms，闪烁速度(flash rate)为约0.5～约1.5ms，激发波长为337.1nm(氮激光的波长)，测定波长为615nm。
进行固相荧光测定时，可将具有上述复合物的固相直接供给到荧光测定条件。进行液相荧光测定时，要通过用适当的解离溶液处理复合物，使含有荧光性络合部分的结构单位游离到溶液中，再将该溶液提供给荧光测定条件。代表性的解离溶液是含有三烷基膦氧化物和阴离子表面活性剂的弱碱性水溶液。作为解离溶液的例子，可应用含有三(正辛基)膦氧化物(TOPO)和十二烷基硫酸钠(SDS)的碳酸氢钠(NaHCO3)水溶液。应用这样的解离溶液，通过与具有上述复合物的固相例如在约45～55℃左右孵育约40分～约2小时，切断上述链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素的结合，使含有荧光络合物部分的结合物游离到溶液中。
根据上述液相荧光测定，因为固相与荧光测定无关，所以其优点是固相种类及材质的选择范围更广。另一方面，与固相荧光测定相比，液相荧光测定需要额外的步骤，所以程序复杂。再者，与固相荧光测定相比，因在用解离溶液处理的过程中容易受杂质的影响，液相荧光测定的灵敏度有一些降低。但是，可以认为固相和液相荧光测定各自所能达到的最大灵敏度，可以通过与测定相关的各种条件的组合来进行变动。
根据本发明，它还提供用于实施上述时间分辨荧光测定(TR-FIA)的试剂盒。通常，该试剂盒至少包括上述成分(a)、(c)、(d)和(e)作为构成物件。也就是说，将具有固相结合部分和能与细胞因子结合的区域的第一抗体，具有能与细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体，具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物，和镧系金属一起提供给测定者，使检测体液样品中的细胞因子的测定可以实施。必要时试剂盒还可包括测定对象细胞因子的标准品，上述各种缓冲液(特别是样品稀释缓冲液和复合物洗涤缓冲液)等。通常试剂盒的构成物件各自以适宜的方式贮存在容器内，与使用说明书或指示书一起作为一整体进行包装。
根据本发明，使得正确且高灵敏度检测体液样品中的细胞因子，尤其是包含SDF-1的趋化因子的新方法可以应用。当用与下述实施例2基本上相同的条件进行检测时，本发明方法中细胞因子的检测界限代表性的为约100pg/ml以下，优选为约50pg/ml以下，更优选为约30pg/ml以下。同样在与实施例2基本上相同的条件下进行检测时，细胞因子测定的变动系数(CV)代表性的为约低于10％，优选约低于8％，更优选约低于7％。另外，当在与实施例6基本上相同的条件下进行检测时，该细胞因子由血浆样品的回收率代表性的为约70％以上，优选约80％以上，更优选90％以上。此外，于不同日期内在同一条件下重复测定4次同一个体来源的血浆样品中细胞因子时，其测定值的变动优选在约10～约20％的范围内。
如下述实施例所示，尤其对于SDF-1，与ELISA和DELFIA等传统方法相比，本发明中通过利用荧光化合物BHHCT来源的Eu3+络合物，可使血浆样品中的检测灵敏度改善2～3个数量级。正确把握SDF-1在体内的行为并阐明其生理功能，对深入理解HIV-1感染、开拓AIDS治疗的新展望是极其重要的。很明显本发明能对细胞因子的分子生物学的发展及应用作出极为有意义的贡献。
此外，如下述实施例所示，根据本发明，通过应用荧光化合物BHHCT来源的Eu3+络合物，可以与SDF-1同样的高灵敏度测定趋化因子家族以外的细胞因子，例如在血循环中以可溶性因子存在、微量即保持生物活性、不仅与多种病理相关且已用于治疗的细胞因子，且再现性良好。
                         实施例
以下，结合实施例更具体地说明本发明。但这些实施例并不限定本发明。
实施例中使用的材料、装置及测定条件如下：
抗体：用包含人SDF-1β的残基33～45(RFFESHIARANVK)的多克隆抗体原肽(Research Genetics，Alabama，U.S.)免疫兔子，以诱导抗SDF-1的抗血清。用亲合柱纯化抗血精，然后应用。针对人SDF-1β的山羊多克隆抗体购自R&D System Inc.(Minnesota，U.S.)。针对人粒细胞-巨噬细胞-单集落刺激因子(GM-CSF)的人单克隆抗体购自PharMingen(California，U.S.)。针对人白细胞介素2(IL-2)的单克隆抗体购自PharMingen(California，U.S.)。
趋化因子：人RANTES、人MIP-1α和β、人MDC和人fractalkine购自DIACLONE Research(法国)。人IL-8购自ENDOGEN(Massachusetts，U.S.)。用市售的ELISA试剂盒来测定加入到血浆中的小鼠IL-8和小鼠MCP-1。小鼠IL-8购自Amersham Pharmacia Biotech(瑞典)，小鼠MCP-1购自PharMingen(California，U.S.)。小鼠SDF-1α、小鼠SDF-1β、人SDF-1α和人SDF-1β均由Genetics Institute(Massachusetts，U.S.)赠送。人GM-CSF购自PharMingen(Califomia，U.S.)。人IL-2购自PharMingen(California，U.S.)。
装置及测定条件：应用Wallac(法国)和Amersham PharmaciaBiotech的1420型ARVO多标记计数仪进行时间分辨型荧光测定。测定条件如下：延迟时间：0.20毫秒(ms)，窗口时间0.40ms，闪烁速度1.00ms。为了得到最灵敏的TR-FIA测定体系，测定了5种购自Nunc(丹麦)的微量滴度板。其中，polysorp板在标准人SDF-1β的测定中产生最敏锐的荧光信号。灵敏度的次序如下：White C96 polysorp＞White C96 maxisorp＞White C8maxisorp＞Black F16maxisorp。以下实验常用White C96maxisorp微量滴度板。(实施例1：TR-FIA的预研究)
最初试图找出测定SDF-1的、基于ELISA的免疫检测体系适用的固相结合捕捉抗体与检测抗体的良好组合。为了这一目的，对多克隆兔抗SDF-一抗体和多克隆山羊抗SDF-一抗体共5种进行了各种组合。有3种组合可进行标准SDF-1的特异性检测。但是ELISA测定时，SDF-1的检测界限没有超越约10～20ng/ml的范围。通常，血浆中存在的SDF-1的水平远远低于该检测界限。因此可以确定用ELISA测定事实上不能进行血浆样品中SDF-1的检测。
应用在上面找到的最佳多克隆抗体的组合，对通常的TR-FIA条件进行了如下改变后，进行SDF-1的检测。(实施例2：标准SDF-1的TR-FIA)
为TR-FIA制备4种测定缓冲液。涂布96孔微量滴度板的缓冲液1(含有0.14M NaCl的0.15M磷酸缓冲液(PBS))；洗涤板的缓冲液2(含0.05％Tween 20的0.05M Tris-HCl，pH7.8)；洗涤缓冲液3(0.05MTris-HCl，pH7.8)；稀释蛋白质溶液的缓冲液4(含有0.2％BSA，0.1％NaN3和0.9％NaCl的0.05M Tris-HCl，pH7.8)。
BHHCT的合成按照Yuan等(′98)(文献5)所述的方法实施。链霉抗生物素蛋白-牛血清白蛋白(SA-BSA)结合物的制备，及用BHHCT对结合物的标记按照Yuan等(′97)(文献4)所述的方法进行。将标记的结合物溶液于-20℃保存，使用前即刻用下述的缓冲液(缓冲液4)稀释100倍。
应用兔抗人SDF-1β多克隆抗体或山羊抗人SDF-1β多克隆抗体作为捕捉抗体。它们各产生相似的结果。将用缓冲液1稀释到10μg/ml的捕捉抗体溶液(各60μl)加到96孔微量滴度板的孔中，4℃保温24小时。然后用缓冲液2将孔洗2次，用缓冲液3洗1次。这样的用抗SDF-一抗体涂布的板子在-20℃至少可保存1个月。
将SDF-1标准溶液(50μl)吸到涂布的上述板中，37℃孵育1小时。用缓冲液2和3洗涤板子后，将50μl用缓冲液4稀释1000倍的生物素化的山羊抗人SDF-1β多克隆抗体(用常规方法使上述R&D System的山羊抗体生物素化)加到孔中，37℃孵育1小时。孵育后，用缓冲液2洗2次板，然后用缓冲液3洗1次，然后加入50μl用BHHCT-Eu3+标记的BSA-SA溶液(50μl)，37℃孵育1小时。用含有0.05％Tween 20的0.05MTris-HCl(pH9.1)将板洗4次。应用1420型ARVO多标记计数仪对该培养板进行固相荧光测定。
通过上述TR-FIA得到的水性溶液中的SDF-1的校正曲线如图1a和图1b所示。应用TR-FIA时，SDF-1的检测界限可通过以下计算式(Kropf等(文献2))计算。
                      3×[S0]×SB/(S0-B)这里，[S0]为标准溶液的最低浓度SB  为空白的标准偏差S0  为最低浓度标准溶液的荧光信号强度B   为空白的荧光信号强度
通过上式计算出TR-FIA的检测界限为30pg/ml。这比上述参考例中的ELISA的检测界限(约10-20ng/ml)低3个数量级。由于每孔应用50μl溶液，所以用TR-FIA检测出的SDF-1蛋白质的最小量为1.5pg/孔。
在测定的重现性这一点上TR-FIA也有所改善。标准样品在0.1ng/ml～1204ng/ml的浓度范围内时，应用TR-FIA检测SDF-1的变动系数(CV)＜7％。与此相对，上述参考例中，在10ng/ml～1000ng/ml的浓度范围内，应用ELISA时的CV值超过10％；在0.1ng/ml～1024ng/ml的浓度范围内，应用DELFIA(参照下述比较例)时的CV值也超过10％。
除了上述固相荧光测定外，对液相荧光测定也进行了研究。即，通过用酸性螯合的表示活性剂溶液(含有10μM TOPO和0.05％SDS的0.1MNaHCO3水溶液)处理按上述程序在固相上形成的荧光性复合物(抗SDF-1多克隆抗体-SDF-1-生物素化抗SDF-1多克隆抗体-BHHCT-Eu3+标记的BSA-SA)，使标记的BSA-SA结合物从固相上游离出来。用1420型ARVO多标记记数仪测定溶液中的结合物的荧光强度。此时的SDF-1检测灵敏度约为100pg/ml，不如上述固相测定那么高。(实施例3：人SDF-1β对CXCR4的下调)
为了确认用实施例2中的TR-FIA测定SDF-1的测定值与标准SDF-1蛋白质生物活性的相关性，用EL-4细胞体外测定通过与SDF-1结合而诱导的SDF-1受体(CXCR4)的下调。
在人SDF-1β(1，10，20，40，100和1000ng/ml)存在或不存在的条件下，在补充了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改进Eagle′s培养基(D′MEM)中培养EL-4细胞。37℃培养6小时后，用Fc-人SDF-1α嵌合蛋白和FITC结合山羊F(ab′)2抗人IgG(Southern BiotechnologyAssociates，Alabama，U.S.)对细胞表面上的CXCR4进行染色。用荧光细胞计数仪(FACSCalibur，BECTON DICKINSON，California，U.S.)进行荧光强度测定。通过计算CXCR4染色的平均荧光强度(MFI)减少％来评价CXCR4的下调。结果如图1c所示。
图1c显示，与人SDF-1β一起培养的EL-4细胞中CXCR4的表达以用量依赖性方式下调。所得结果与以前的报道(HesseIgesser等(文献13)和Amara等(文献14))一致性良好，即SDF-1α和β分别以5～10nM和2.3～3.6nM的Kd值与CXCR4结合。(实施例4：TR-FIA对SDF-1测定的特异性)
为了确认TR-FIA对SDF-1的特异性，对以下各种趋化因子进行与实施例2同样的TR-FIA测定：CC趋化因子(小鼠MCP-1、人MIP-1α和β、人RANTES，人MDC)、CXC趋化因子(人IL-8、小鼠SDF-1α和小鼠SDF-1β、人SDF-1α和人SDF-1β)以及CXXXC趋化因子(人Fractalkine)。结果如图1d所示。除SDF-1之外其它任何趋化因子均未看到荧光强度的显著性升高。因此可以确定上述TR-FIA可高特异性检测SDF-1。人和小鼠的SDF-1α和SDF-1β间存在交差反应性。(实施例5：血浆样品的制备)
以下各实施例中使用的血浆样品是用EDTA(1mg/ml血液)作抗凝剂，从36名18～30岁健康的志愿者(日本人)血液制备的。具体而言，在用0.1M EDTA涂层了的注射器中按每1ml采取血液为7μl填充含0.5MEDTA的PBS。将血采集到这样的注射器中，室温保存5分钟，然后3000rpm离心10分钟，得到血浆。-80℃保存血浆样品，分析前立即用缓冲液4稀释10倍，除非有其它指示。测定前不要反复冻融。(实施例6：用血浆样品进行的TR-FIA)
应用SDF-1标准溶液和上述血浆样品(来自5个个体)进行实施例2中所述的TR-FIA。与由标准溶液的测定求出的校正曲线(图2左侧所示黑圆线图)进行对比，计算出血浆样品中的SDF-1浓度。为了确认测定的准确性，再向各血浆样品中加入0.4或0.8ng/ml的标准SDF-1进行测定，算出回收率。
添加标准SDF-1后所测定的血浆样品的荧光强度如图2右侧(“TR-FIA”栏)所示。添加标准SDF-1前后血浆样品的SDF-1浓度及回收率示于下述的表1中。结果表明与对标准溶液进行测定时相同，应用TR-FIA，从血浆样品中也可检测出SDF-1并且回收率极高。(比较例：DELFIA对SDF-1的检测)
如无其它特殊情况，以下DELFTA的测定操作按制造者(AmershamPharinacia Biotech，以下称作“APB公司”)的指示进行。洗涤时全部应用PBS/0.05％Tween 20。
将用PBS稀释到10μg/ml的兔抗人SDF-1β抗体或山羊抗人SDF-1β抗体溶液(各60μl)吸附到透明的maxisorp板(Nunc，丹麦)中，4℃孵育24小时后，洗涤1次。接着用180μl DELFIA测定缓冲液(APB公司)于室温至少处理30分钟，以封闭非特异性结合。
洗板3次后，每孔加入50μl用DELFIA测定缓冲液稀释的标准SDF-1或10倍稀释的血浆，然后于4℃至少孵育6小时。将板洗3次后，添加100μl在测定缓冲液中稀释到20ng/ml的Eu标记链霉抗生物素蛋白(APB公司)，然后室温孵育30分钟。洗板6次后，添加DELFIA增感溶液(APB公司)，从与固相结合的Eu标记抗体解离出Eu3+。将微量板缓慢振荡5分钟后，用时间分离型荧光仪(ARVO 1420)进行荧光测定。
由标准溶液测定所得校正曲线如图2左侧所示(黑方块线图)。按实施例2所述的计算公式算出的检测界限为130pg/ml。应用DELFIA能检测出标准溶液中的SDF-1，但灵敏度比TR-FIA低。但是，对血浆样品(来自4个个体)进行测定时，均检测不到内源性SDF-1。而且，向各血浆样品中添加1.0ng/ml的标准SDF-1并进行测定时，其回收率约为20％以下，远低于TR-FIA。
对添加标准SDF-1后的血浆样品进行测定的荧光强度示于图2的右侧(“DELFIA”栏)。添加标准SDF-1前后的血浆样品的SDF-1浓度和回收率示于表1中(图2和图1的数据中显示的血浆样品均进行了55℃、30分钟的预热)。
                         表1
             添加到人血浆中的SDF-1的回收率
         添加的标准      SDF-1的测定值    预测的总SDF-1        回收率
         SDF-1(ng/ml)    (ng/ml)          (ng/ml)              (％)(a)TR-FIA        0               1.08            -
             1.0             2.10            2.08              102
             0               1.53            -
             1.0             2.48            2.53              95
             0               1.68            -
             1.0             2.69            2.68              101
             0               1.87            -
             1.0             2.83            2.87              96
             0               2.14            -
             1.0             3.11            3.14              97(b)DELFIA        0               ＜D.L.
             1.0             0.20            ＞1.0             ＜20
             0               ＜D.L.
             1.0             0.16            ＞1.0             ＜16
             0               ＜D.L.
             1.0             0.17            ＞1.0             ＜17
             0               ＜D.L.
             1.0             0.20            ＞1.0             ＜20<D.L：低于检测界限(130pg/ml)>(实施例7：抗凝剂和蛋白酶抑制剂的影响)
据报道，抗凝剂和蛋白酶抑制剂影响人血浆样品中细胞因子的检测(Thavasu等(文献15))。为了研究TR-FIA对SDF-1的测定是否也受这些因素的影响进行了以下实验。
向血浆样品中添加乙二胺四乙酸(EDTA)(1.0mg/ml)、肝素(30IU/ml)、柠檬酸钠(0.38％)或乙二胺四乙酸(EDTA)(1.0mg/ml)和蛋白酶抑制剂抑肽酶(1μg/ml)。应用与实施例2同样的TR-FIA测定各添加样品中的SDF-1。结果如图3a所示。可以确实抗凝剂和蛋白酶抑制剂对用TR-FIA进行的血浆SDF-1的测定有显著性影响。(实施例8：血浆样品预热的影响)
为了确保应用TR-FIA进行SDF-1测定在临床应用中的安全性，有必要将存在于血液样品中的HIV病毒灭活。于是研究了血浆样品的预加热对TR-FIA的影响。
首先，为了试验SDF-1蛋白的热稳定性，将SDF-1标准溶液分别置于0℃30分钟，37℃30分钟，55℃30分钟，70℃30分钟，100℃1分钟，然后进行测定。观察到在70℃30分钟和100℃1分钟的条件下检测量降低，考虑是由于SDF-1的热变性造成。另一方面，37℃或55℃加热30分钟时，可得到与不加热样品几乎相同的校正曲线，不影响SDF-1的检测量。
在以上结果的基础上，测定前对24份血浆样品(参照实施例5)于55℃进行30分钟的预孵育或者不加热，应用与实施例2同样的TR-FIA对SDF-1进行测定。(预加热在用缓冲液4稀释血浆样品前进行)。结果如图3b所示。55℃30分钟的预加热可增大平均约20％的荧光强度。
该结果提示血浆样品的SDF-1中至少有一部分以多聚体形式存在，和/或以与可热解离或分解等的结合因子结合的形式存在。也许在这样的多聚体和/或结合状态下，SDF-1表位与抗体的结合受到抑制。(实施例9：血浆样品稀释的影响)
有关测定血浆样品中IL-8和MCP-1的以往的研究(Thavasu等(文献15)和Kajikawa等(文献16))表明过低评价了非稀释样品的测定中趋化因子的存在量。所以，研究了血浆样品的稀释对应用TR-FIA测定SDF-1的影响。
用缓冲液4将5份不同个体的血浆样品稀释到1∶1～1∶20的各种比例，应用与实施例2同样的TR-FIA测定SDF-1。结果如图3c所示。当稀释倍数由1倍增加到10倍时，可以看到几乎一致性的检测灵敏度的提高。另一方面，当稀释倍率在10～20倍时，检测灵敏度未增加。因此10倍稀释(即1份血浆样品用10份缓冲液4稀释)可被评价为最有效的条件。(实施例10：血浆样品中添加血细胞时的影响)
据报道，向全血中添加IL-8和MCP-1，这些趋化因子可被血细胞吸附(Amara等(文献14)，Darbonne等(文献17)和Neote等(文献18))。于是，研究了是否能观察到血细胞对SDF-1有同样的吸收。
将250μl全血在微量离心机上离心，使细胞沉淀，取125μl上清组分的血浆。按预先设定的终浓度向125μl血浆中添加IL-8、MCP-1或SDF-1。然后将添加了这些趋化因子的血浆与125μl体积的细胞沉积物或125μl血浆混合，然后37℃孵育15分钟。接着，将混合了细胞沉积物的样品离心使细胞沉淀并分离。用ELISA对样品中的可溶性IL-8和MCP-1进行定量，用TR-FIA对其中的SDF-1进行定量。结果如图4a～图4c所示。
IL-8和MCP-1添加量的大部分被血细胞吸收(图4a和4b)。而与血细胞孵育后SDF-1的减少量低于10％(图4c)。此外，在其它实验中，将SDF-1直接添加到全血，孵育后分离血细胞，用TR-FIA进行定量时，与将SDF-1添加到血浆中的对照间没有显著性差异(数据未给出)。由以上可以确定SDF-1几乎不被血细胞吸收。(实施例11：血浆样品的TR-FIA多次测定)
对36份不同个体的血浆样品进行55℃30分钟的预加热(参照实施例7)后，用与实施例2相同的TR-FIA测定SDF-1。结果如图5c所示。人血浆中的SDF-1水平的平均值和标准偏差为0.85±0.26ng/ml。
在相同条件下，在不同日子对同一个体(3名)来源的血浆样品重复测定4次，测定值的变动为10～20％的范围。这表明TR-FIA对血浆SDF-1测定的可信度十分高。(实施例12：血浆样品中SDF-1和IgG的会合)
据报道，与IL-8和MCP-1相关的，妨碍血浆样品的免疫检测的其它主要原因是与循环系统中的自身抗体结合或会合的可能性(Leonard等(文献1)和Thavasu等(文献15))。如下所述对SDF-1与血浆中IgG的会合进行评价。
将7个个体来源的血浆样品不加热或加热处理(55℃30分钟)后，与Protein G-Sepharose一起在冰上放置30分钟，耗竭IgG。将样品离心，取其上清组分。应用TR-FIA测定该上清中的SDF-1。与Protein G-Sepharose处理前的血浆样品的测定值进行对比，求出荧光强度的减少度。结果如图6所示。
图6中斜线柱和黑柱分别表示非加热样品和加热处理的样品。可以看出，与加热样品相比，未加热样品易受Protein G-Sepharose处理的影响。通过耗竭非加热样品的IgG，TR-FIA可测定的SDF-1水平减少23～37％(平均30％)。而加热处理的样品相对应的减少度为6～22％(平均15％)。因此实施例8中显示的预加热的效果(图3b)可以用以下的假说进行解释。即，血浆样品中一部分SDF-1与IgG会合存在，通过加热解离，转变成TR-FIA可以测定的可溶性形式。
其它实验中，Protein G-Sepharose处理后，未观察到加到血浆样品中的标准SDF-1的显著性减少(未列出数据)。因此，否定了SDF-1自身被Protein G-Sepharose吸附的可能性，及血浆样品中的抗SDF-1 IgG以外的抗体或蛋白质被Protein G-Sepharose吸附，而SDF-1被它们吸附的可能性。
由以上结果可以理解用TR-FIA测定出的人血浆中SDF-1水平与血液中实际存在的生理性SDF-1的水平极其接近。(实施例13：GM-CSF的TR-FIA)
除应用抗人GM-CSF单克隆抗体作捕捉抗体和应用生物素化抗人GM-CSF单克隆抗体(按常规方法对上述PharMingen人抗体进行生物素化)外，与实施例2同样将GM-CSF标准溶液(50μl)供给固相荧光测定，制作标准GM-CSF的校正曲线。结果如图7所示。再用与实施例5同样的方法由健康日本人志愿者的血液制备血浆样品，按实施例9所述，用缓冲液4稀释，并与标准溶液同样用TR-FIA测定GM-CSF。结果表明，对GM-CSF也可进行高灵敏度的测定，并且得到了重现性良好的结果。(实施例14：对IL-2的TR-FIA)
除应用抗人IL-2单克隆抗体作捕捉抗体和应用生物素化抗人IL-2单克隆抗体(按常规方法使上述PharMingen人抗体生物素化)之外，与实施例2同样，将IL-2的标准溶液(50μl)供给固相荧光测定，制作标准IL-2的校正曲线。结果如图8所示。再用与实施例5同样的方法由健康日本志愿者制备血浆样品，按实施例9所述，用缓冲液4稀释，并与标准溶液同样通过TR-FIA测定IL-2。结果表明，对IL-2也可以进行高灵敏度的测定，并且可以得到重现性良好的结果。
                     产业上的实用性
本发明提供能极其灵敏且简便地检测体液样品中细胞因子，尤其是包括SDF-1的趋化因子的时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法，以及用于该方法的试剂盒。该方法及试剂盒适用于作为可溶性因子存在于血液循环中的，微量即具有生物学活性并与多种病理相关的细胞因子。
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Claims (16)

1.检测体液样品中细胞因子的时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法，该方法包括：
在固相上形成依次结合了(a)具有固相结合部分和能与细胞因子结合的区域的第一抗体，(b)该细胞因子，(c)具有能与该细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体，(d)具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物，以及(e)镧系金属离子的复合物的步骤；以及
测定与镧系金属离子络合的荧光结构部分的荧光的步骤；
这里，该荧光结构部分可用通式(I)表示：
      -R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X       (I)
            -C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R-          (II)
式中，R为能与蛋白质形成共价键的官能团残基，Ar为具有共轭双键体系的烃基，n为1以上的整数，X为氟原子或通式(II)表示的基团。
2.权利要求1所述的方法，其中，上述镧系金属离子为铕。
3.权利要求1所述的方法，其中，上述荧光结构部分可用通式(III)表示；
         -R-Ar-(C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1)2    (III)
式中，R、Ar及n与权利要求1中的定义相同。
4.权利要求1所述的方法，其中，上述荧光结构部分为4，4′-二(1″，1″，1″，2″2″3″3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-邻-三苯基。
5.权利要求1所述的方法，其中，上述结合物中，相对于每1分子的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，存在10～60单位上述荧光结构部分。
6.权利要求1所述的方法，其中，上述测定荧光的步骤在不解离在上述固相上形成的复合物情况下进行。
7.权利要求1所述的方法，其中，上述测定荧光的步骤在解离上述固相上形成的复合物后进行。
8.权利要求1所述的方法，其中，上述细胞因子为属于趋化因子家族的细胞因子。
9.权利要求8所述的方法，其中，上述细胞因子为CXC趋化因子。
10.权利要求9所述的方法，其中，上述细胞因子为基质细胞来源的因子-1(SDF-1)。
11.权利要求1所述的方法，其中，上述体液样品为血浆或全血。
12.权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在上述形成复合物的步骤之前，用样品稀释缓冲液稀释上述体液样品的步骤；该样品稀释缓冲液是含有0.1～0.3％牛血清白蛋白，0.05～0.2％叠氮钠，以及0.5～1.5％的氯化钠的pH7.3～8.3的0.01～0.1M Tris-HCl。
13.权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在上述形成复合物的步骤之前，在上述细胞因子的非变性温度条件下加热处理上述体液样品的步骤。
14.权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在上述测定荧光的步骤之前，用洗涤缓冲液洗涤在上述固相上形成的复合物的步骤；该复合物洗涤缓冲液是含有0.01～0.1％的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯的pH 8.5～9.5的0.01～0.1M Tris-HCl。
15.权利要求1所述的方法，其中，上述固相为具有50～200ng/cm2IgG吸附能力的微量滴度板。
16.用于检测体液样品中细胞因子的时间分辨荧光免疫检测(TR-FIA)方法的试剂盒，该试剂盒包括：
具有固相结合部分和能与细胞因子结合的区域的第一抗体，具有能与该细胞因子结合的区域和生物素结合部分的第二抗体，具有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能与镧系金属离子络合的荧光结构部分的结合物，以及镧系金属离子；
这里，该荧光结构部分可用通式(I)表示：
          -R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X    (I)
              -C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R-    (II)
式中，R为能与蛋白质形成共价键的官能团残基，Ar为具有共轭双键体系的烃基，n为1以上的整数，X为氟原子或通式(II)表示的基团。
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