DE60027910T2

DE60027910T2 - Hochsensitiver zeitaufgelöster immunofluoreszenzassay zum nachweis von chemokinen

Info

Publication number: DE60027910T2
Application number: DE60027910T
Authority: DE
Inventors: Kei Kyoto-shi TASHIRO; Tasuku Kyoto-shi HONJO; Masaya 401 Kitashirakawa Kop Kyoto-shi IKEGAWA; Kazuko Setagaya-ku MATSUMOTO
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-09-28
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: CA2385613A1; DE60027910D1; KR20020033208A; EP1221616B1; KR100542033B1; EP1221616A1; CA2385613C; WO2001023891A1; TWI270672B; CN1227532C; JP3586243B2; CN1402834A; EP1221616A4; AU7448600A; US7255998B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay (time-resolved fluoroimmunoassay; TR-FIA)-Verfahren zum Nachweis von Chemokinen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit und insbesondere ein Assay-Verfahren zum hochsensitiven Nachweis von Chemokinen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit durch Verwendung eines fluoreszierenden Europium-Komplexes.
STAND DER TECHNIK
Die Konzentration freier Zytokine oder Chemokine, die in einer normalen biologischen Flüssigkeit, wie z.B. in humanem Plasma, vorhanden ist, liegt nahe an oder unterhalb der Nachweisgrenze eines herkömmlichen ELISA-Assays. Es wurde beispielsweise berichtet, dass ein herkömmlicher ELISA-Assay, dessen Nachweisgrenze bei etwa 6 pikomol (pM) liegt, IL-8 in normalem humanem Plasma nicht nachweisen kann (Leonhard et al. (Dokument 1)). Die Verbesserung der Messungssensitivität und die Verringerung des nicht-spezifischen Hintergrunds, der mit der Probe der biologischen Flüssigkeit assoziiert ist, sind die hauptsächlichen Probleme, die gelöst werden müssen, um eine genaue Messung der Chemokin-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit zu erreichen.
In den letzten Jahren wurde ein zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay-Verfahren, das einen Europium-Komplex nutzt, entwickelt und in klinischen Anwendungen eingesetzt (Kropf et al. (Dokument 2)). Die Strahlungswellenlänge (615 nm) eines freien, komplexierten Europium-Ions (Eu³⁺) wird durch die Anregungswellenlänge (340 nm) oder durch eine transiente Hintergrundfluoreszenz (350 bis 600 nm), die mit einer bestimmten Art von Protein verbunden ist, nicht beeinflusst, was praktisch ist.
Eine Art eines Analyseverfahrens, das auf diesem Prinzip basiert, wird als DELFIA (dissociation-enhanced lanthanoid fluoroimmunoassay; Dissoziations-verstärkter Lanthanoidfluorimmunoassay; Pharmacia) kommerziell vertrieben und wird in Assays für TNF-α und IL-6 verwendet. DELFIA war jedoch bei der genauen Messung der Konzentrationen solcher Zytokine im Plasma nicht erfolgreich (Ogata et al. (Dokument 3)).
Knopf H.-P. et al. ((1991) Journal of Immunological Methods 138(2), 233–236), beschreiben einen zeitaufgelösten Fluorimmunoassay für den Nachweis von Zytokinen, insbesondere von humanem Interleukin-3, unter Verwendung eines Europiummarkierten Streptavidin-Komplexes.
Ruedl C. et al. ((1994) Journal of Immunological Methods 168(1), 61–67) beschreiben einen weiteren Fluorimmunoassay, der mit Streptavidin verknüpftes Europium zum Nachweis verwendet. Es wurde ein DELFIA eingesetzt und die Europium-Ionen wurden aus dem nicht-fluoreszierenden Komplex durch Zugabe eines chelatierenden Mittels entfernt, was zur Fluoreszenz führte.
Vor kurzem entwickelte eine von Matsumoto geführte Gruppe einen 4,4'-Bis(1'',1'',2'',2'',3'',3''-heptafluor-4'',6''-hexandion-6''-yl)-sulfo-o-terphenyl(BHHCT)-Eu³⁺-Komplex als Markierungsverbindung. Dieser Komplex ist in der Lage, direkt an Proteine zu binden und erlaubt eine hochsensitive Analyse durch eine Fluoreszenzmessung zeitaufgelöster Art (Yuan et al. ('97) (Dokument 4) und Yuan et al. ('98) (Dokument 5)). BHHCT hat eine (β-Diketonstruktur und eine Bindungsstabilitätskonstante in Bezug auf Eu³⁺ von 10¹⁰ M^–1. Ein resultierender Eu³⁺-Komplex zeigt exzellente Eigenschaften, wie durch eine 400 Mikrosekunden (μs) übersteigende Lebenszeit sowie durch Absorptions- und Emissionswellenlängen-Maxima von 330 nm und 615 nm gezeigt wird. Es ist gezeigt worden, dass dieser Komplex für den Nach weis eines α-Fetoproteins (Yuan et al. ('98) (Dokument 5) und von Immunoglobulin E (IgE) Yuan et al. ('97) (Dokument 4)), welches Tumormarker in humanem Plasma sind, nützlich ist. Es sind jedoch keine Beispiele bekannt, in denen ein solcher Eu³⁺-Komplex für den Nachweis von Zytokinen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit verwendet wurde.
Der stromale Zell-abgeleitete Faktor-1 (SDF-1; stromal cellderived factor-1) ist ein Zytokin, das zur Familie der Chemokine gehört und 1993 als erstes aus einer stromalen Zelllinie kloniert wurde (Tashiro et al. (Dokument 6)). SDF-1 ist ein Haupt-Ligand für einen CXCR4-Rezeptor (Bleul et al. (Dokument 7) und Oberlin et al. (Dokument 8)). Von diesem Rezeptor ist bekannt, dass er als ein CD4-Corezeptor für eine Untergruppe des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) wirkt. Des weiteren hat eine Studie vor kurzem gezeigt, dass ein Polymorphismus des SDF-1 Gens an der Verlangsamung der Progression eines erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS) beteiligt ist, (z.B. Winkler et al. (Dokument 9) und Martin et al. (Dokument 10)). Sein funktioneller Mechanismus lässt jedoch verschiedene Theorien zu und muss noch aufgeklärt werden.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass SDF-1 eine wichtige Rolle bei der Embryogenese des hämatopoietischen Systems, des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems spielt (z.B. Zou et al. (Dokument 11) und Tachibana et al. (Dokument 12)). Auf der anderen Seite sind viele biologische Funktionen von SDF-1 in adultem Gewebe immer noch unbekannt.
Wie oben beschrieben ist es für die Verbesserung des Verständnisses von SFD-1 extrem wichtig, eine Technik für die exakte Quantifizierung und Beobachtung von SDF-1 in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit zu entwickeln. Es ist unnötig zu erwähnen, dass ein exaktes Messungsverfahren in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit gleichzeitig einen akademischen und klinischen Beitrag zu anderen Chemokinen und Zytokinen leisten würde. Daher ist ein Assay-Verfahren zum Nachweis von Zytokinen mit einer höheren Sensitivität wünschenswert.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, die soeben genannten Probleme zu lösen und stellt ein Verfahren zum Nachweis von Chemokinen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit erhöhter Sensitivität und Einfachheit zur Verfügung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Verfahren zum Nachweis eines Chemokins in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit bereitgestellt, Schritte umfassend, bei denen man:
aus (a) einem ersten Antikörper, der einen an eine feste Phase gebundenen Teil und einen Bereich, der an ein Chemokin binden kann, umfasst; (b) dem Chemokin; (c) einem zweiten Antikörper, der einen Bereich umfasst, der an das Chemokin binden kann, sowie einen Teil, an den Biotin gebunden ist; (d) einem Konjugat, das Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil umfasst, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann; und (e) dem Lanthanoid-Metallion eine Zusammensetzung bildet, wobei die Zusammensetzung auf einer festen Phase gebildet wird; und
die Fluoreszenz des fluoreszierenden Strukturteils bestimmt, der von dem Lanthanoid-Metallion komplexiert wurde,
wobei der fluoreszierende Strukturteil durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird: -R-Ar-C(=O)-CH₂-C(=O)-C_nF_2n-X (I) (in der R ein Rest ist, der eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit dem Protein zu bilden; Ar eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, die ein konjugiertes Doppelbindungssystem aufweist; n eine ganze Zahl ist, die gleich oder größer als 1 ist; und X ein Fluoratom oder eine Gruppe ist, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird: -C(=O)-CH₂-C(=O)-Ar-R- (II).
In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Lanthanoid-Metallion Europium sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der fluoreszierende Strukturteil durch die allgemeine Formel (III) dargestellt werden: -R-Ar-(C(=O)-CH₂-C(=O)-C_nF_2n)₂ (III)(wobei R, Ar und n dieselben Bedeutungen wie oben haben).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der fluoreszierende Strukturteil 4,4'-Bis(1'',1'',1'',2'',2'',3'',3''-heptafluor-4'',6''-hexandion-6''-yl)-sulfo-o-terphenyl sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können 10 bis 60 Einheiten des fluoreszierenden Strukturteils pro Molekül Streptavidin oder Avidin in dem Konjugat vorhanden sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Schritt der Fluoreszenzmessung durchgeführt werden, ohne es der auf der festen Phase gebildeten Zusammensetzung zu erlauben, zu dissoziieren.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Schritt der Fluoreszenzmessung durchgeführt werden, nachdem es der auf der festen Phase gebildeten Zusammensetzung erlaubt wurde, zu dissoziieren.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Chemokin ein CXC-Chemokin sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Chemokin stromaler Zell-abgeleiteter Faktor-1 (SDF-1) sein.
Alternativ dazu kann das Chemokin in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Chemokin sein, das als löslicher Faktor in der Blutkreislauf existiert und in einer winzigen Menge eine biologische Aktivität aufweist.
Alternativ dazu kann das Chemokin in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) oder Interleukin 2 (IL-2) sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Probe einer biologischen Flüssigkeit Plasma oder Vollblut sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Schritt des Verdünnens der Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einer Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird, vor dem Schritt der Bildung der Zusammensetzung umfasst sein, und die Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird, kann 0,01 bis 0,1 M Tris-Salzsäure, deren pH 7,3 bis etwa 8,3 ist, sein, wobei die Pufferlösung 0,1 bis 0,3% bovines Serumalbumin, 0,05 bis 0,2% Natriumazid und 0,5 bis 1,5% Natriumchlorid enthält.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ferner vor dem Schritt der Bildung der Zusammensetzung ein Schritt umfasst sein, bei dem die biologische flüssige Probe einer Hitzebehandlung unter nicht-denaturierenden Temperaturbedingungen für das Chemokin unterzogen wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein weiterer Schritt des Waschens der Zusammensetzung, die auf der festen Phase gebildet wurde, mit einer Pufferlösung, die für das Waschen verwendet wird, vor dem Schritt der Fluoreszenzmessung umfasst sein, und die Pufferlösung, die für das Waschen der Zusammensetzung verwendet wird, kann 0,01 bis 0,1 M Tris-Salzsäure sein, deren pH 8,5 bis etwa 9,5 ist, wobei die Pufferlösung 0,01 bis 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat enthält.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die feste Phase eine Mikrotiterplatte sein, die eine Adsorptionsfähigkeit von IgG von 50 bis 200 ng/cm² hat.
Außerdem wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kit für ein zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Verfahren zum Nachweis eines Chemokins in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit bereitgestellt, das umfasst: einen ersten Antikörper, der einen an eine feste Phase gebundenen Teil und einen Bereich, die an ein Chemokin binden kann, umfasst; einen zweiten Antikörper, der einen Bereich umfasst, der an das Chemokin binden kann, sowie einen Teil, an den Biotin gebunden ist; ein Konjugat, das Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil enthält, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann; und das Lanthanoid-Metallion;
wobei der fluoreszierende Strukturteil durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird: -R-Ar-C(=O)-CH₂-C(=O)-C_nF_2n-X (I)(wobei R ein Rest ist, der eine funktionelle Gruppe darstellt, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einem Protein zu bilden; Ar eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, die ein konjugiertes Doppelbindungssystem hat; n eine ganze Zahl ist, die gleich oder größer als 1 ist; und X ein Fluoratom oder eine Gruppe ist, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird: -C(=O)-CH₂-C(=O)-Ar-R- (II).
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1a ist ein Graph, der eine Kalibrierungskurve für SDF-1 darstellt. Ein Referenz-SDF-1 wurde durch Verwendung eines TR-FIA-Verfahrens wie in Beispiel 2 beschrieben gemessen. Die Daten zeigen die Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
1b ist ein Graph, der eine ähnliche Kalibrierungskurve wie in 1a darstellt, mit einem besonderen Fokus auf die Messungen in einem niedrigen Konzentrationsbereich. Die Gerade in dem Graph ist wie folgt: Y = 1,3X + 1,2 (x10000 a.u.); r = 0,995. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
1c ist ein Graph, der die Messungsergebnisse der CXCR4-Expression auf der EL-4 Zelloberfläche gemäß einem Protokoll, das in Beispiel 3 beschrieben ist, als ein Weg der Beobachtung der biologischen Aktivität von SDF-1 darstellt. Der Prozentsatz der Abnahme in der Durchschnittsfluoreszenzintensität (MFI) wurde basierend auf dem Vergleich mit Kontrollen berechnet, die ohne humanes SDF-1β inkubiert wurden. Die Daten stel len Mittelwerte dar, die aus drei Läufen einer Experimenten-Reihe ausgewählt wurden.
1d ist ein Graph, der die Messungsergebnisse verschiedener Chemokine für die Evaluierung der Spezifität des TR-FIA bezüglich SDF-1 darstellt. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
2 ist ein Graph, der einen Vergleich zwischen TR-FIA und DELFIA bezüglich SDF-1 darstellt. Auf der linken Seite der 2 sind Messungsergebnisse einer Referenzlösung von humanem SDF-1β durch DELFIA- und TR-FIA-Systeme gezeigt, wobei dieselben Kombinationen eines Einfang-(„capture") Antikörpers und eines Detektions-Antikörpers verwendet wurden wie in Beispiel 2. Auf der rechten Seite der 2 sind Ergebnisse endogener SDF-1 Konzentrationen in Plasmaproben, die durch die zwei Systeme erhalten wurden, gezeigt. Den Proben, die auf der rechten Seite der 2 gezeigt sind, wurde kein Referenz-SDF-1 zugesetzt. Die Daten auf der rechten Seite der 2 und die Daten, die in Tabelle 1 gezeigt sind, stellen Messungsergebnisse für verschiedene Proben dar. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
3a ist ein Graph, der die Einflüsse von Antikoagulantien und Protease-Inhibitoren auf die SDF-1 Messung durch TR-FIA darstellt. Die Plasmaproben wurden mit EDTA (1 mg/ml); Heparin (30 IU/ml); einem Citrat (Natriumcitrat 0,38%); oder mit EDTA (1 mg/ml), das Aprotinin (1 μg/ml) enthielt, behandelt. Die ausgefüllten Balken und die schraffierten Balken stellen Messungsergebnisse für zwei verschiedene Proben dar. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
3b ist ein-Graph, der die Einflüsse einer vorübergehenden Erhitzung der Plasmaproben auf die SDF-1 Messung durch TR-FIA zeigt. Die Plasmaproben wurden vor dem Assay für 30 Minuten bei 55°C inkubiert, oder direkt ohne jede Erhitzung für die Messung verwendet. Die Plasmaproben wurden von 24 gesunden japanischen Freiwilligen erhalten. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Zweifachmessungen.
3c ist ein Graph, der die Einflüsse der Plamaprobenverdünnung auf die SDF-1 Messung durch TR-FIA zeigt. Jede Probe wurde in Pufferlösung 4 verdünnt. Die Plasmaproben wurden von fünf gesunden japanischen Freiwilligen erhalten. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
4a ist ein Graph, der die Einflüsse der Blutzellen auf eine ELISA-Quantifizierung von IL-8 als eine Kontrolle für SDF-1 darstellt. Nach Zugabe von IL-8 zu den Plasmaproben wurden Zellpellets oder Plasma damit gemischt. Nach Inkubation für 15 Minuten bei 37°C wurde das lösliche IL-8 innerhalb des Plasmas quantifiziert. Die leeren Quadrate zeigen Referenzproben, die nicht mit Zellpellets oder Plasma gemischt wurden; die schwarzen Kreise zeigen Proben, die mit Plasma gemischt wurden und die leeren Kreise zeigen Proben, die mit Zellpellets gemischt wurden. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Vierfachmessungen.
4b ist ein Graph, der die Einflüsse von Blutzellen auf eine ELISA-Quantifizierung von MCP-1 als eine Kontrolle für SDF-1 darstellt. Nach Zugabe von MCP-1 zu den Plasmaproben wurden Zellpellets oder Plasma damit gemischt. Nach einer Inkubation für 15 Minuten bei 37°C wurde das lösliche MCP-1 innerhalb des Plasmas quantifiziert. Die Symbole sind dieselben, wie die in 4a. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Vierfachmessungen.
4c ist ein Graph, der die Einflüsse von Blutzellen auf eine TR-FIA-Quantifizierung von SDF-1 darstellt. Nach Zugabe von SDF-1 zu den Plasmaproben wurden Zellpellets oder Plasma damit gemischt. Nach einer Inkubation für 15 Minuten bei 37°C wurde das lösliche SDF-1 innerhalb des Plasmas quantifiziert. Die Symbole sind dieselben, wie die in 4a. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Vierfachmessungen.
5 ist ein Graph, der die Mengen von SDF-1 in humanem Plasma bei 36 gesunden japanischen Freiwilligen zeigt. Alle Plasmaproben wurden vor dem Assay für 30 Minuten einer Hitzebehandlung bei 55°C ausgesetzt. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen aus zwei getrennten Messungen.
6 ist ein Graph, der die Einflüsse der IgG-Abnahme als Folge einer Protein-G-Sepharose auf humane Plasmaproben darstellt. Plasmaproben von 7 gesunden japanischen Freiwilligen wurden für 30 Minuten auf Eis mit Protein-G-Sepharose inkubiert und zentrifugiert, und es wurde die Menge an SDF-1 in den Überständen gemessen. Die schraffierten Balken und schwarzen Balken zeigen nicht-erhitzte Proben bzw. erhitzte Proben (55°C für 30 Minuten).
7 ist ein Graph, der eine Kalibrierungskurve für GM-CSF darstellt. Ein Referenz-GM-CSF wurde durch ein TR-FIA-Verfahren gemessen. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
8 ist ein Graph, der eine Kalibrierungskurve für IL-2 darstellt. Ein Referenz-IL-2 wurde durch ein TR-FIA-Verfahren gemessen. Die Daten zeigen Durchschnittswerte von Dreifachmessungen.
DIE BESTEN ARTEN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung basiert auf einer zeitaufgelösten Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Methode. Ein "zeitaufgelöster Fluorimmunoassay" bezieht sich auf ein Assay-Verfahren, bei dem ein Messungs-Subjekt mit einer fluoreszenten Verbindung markiert wird, die in der Lage ist, durch eine immunologische Reaktion eine langlebige Fluoreszenz abzustrahlen (z.B. ein erfindungsgemäßer Lanthanoid-Metallion-Komplex), und bei dem Messungen zeitaufgelöster Art eines Fluoreszenzsignals des markierten Subjektes aufgenommen werden, nachdem die Hintergrundfluoreszenz mit kürzerer Lebenszeit verschwunden ist.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist insbesondere für einen hochsensitiven Nachweis von Chemokinen in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit geeignet. Eine "Probe einer biologischen Flüssigkeit" bezieht sich auf eine Flüssigkeit, die aus einem lebenden Tier gewonnen wird, vorzugsweise aus einem Säugetier und insbesondere aus einem Menschen. Repräsentative Beispiele umfassen Blut (d.h. Vollblut) und dessen Fraktionen oder Plasma und Serum, ebenso wie cerebrale Spinalflüssigkeit, Galle, amniotische Flüssigkeit, pleurale Flüssigkeit, Aszites, tracheobronchiales Sekret, Markflüssigkeit, Milch, Lacrimalflüssigkeit, nasalen Ausfluss, Endokardialflüssigkeit, intra-aritkuläre Flüssigkeit, Speichel, Samen, Urin und Ähnliches. Des Weiteren können biologische flüssige Überstände von kultivierten Zellen eines tierischen Ursprungs und Ähnliches einschließen. In dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können bemerkenswerte Effekte bereitgestellt werden, wenn Vollblut, Plasma, Serum oder Cerebralspinalflüssigkeit verwendet wird, und insbesondere wenn Vollblut oder Plasma verwendet wird. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit umfasst eine Probe einer biologischen Flüssigkeit wie vorliegend verwendet sowohl eine biologische Flüssigkeit selbst als auch eine flüssige Probe, die einer Behandlung wie beispielsweise einer Verdünnung in einem Träger, der für die biologische Flüssigkeit geeignet ist, unterzogen wurde.
Ein "Zytokin" bezieht sich auf eine Protein-artige chemische Substanz, die für die Informationsübertragung zwischen Zellen in einem lebenden Organismus verantwortlich ist. Für jedes individuelle Zytokin wird ein charakteristischer Rezeptor auf der Oberfläche einer Zielzelle exprimiert. Die Bindung an solch einen Rezeptor führt zur Manifestation physiologischer Aktivitäten, wie beispielsweise Zellwachstum und Differenzierung. Eine Gruppe von Zytokinen, die insgesamt als "hämatopoietische Faktoren" bezeichnet werden, welche die Differenzierung und das Wachstum von Blutzellen induzieren, umfassen Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs), einschließlich Granulozytenmakrophagen-Kolonie-stimulierende Faktoren (GM-CSFs), Stammzellfaktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin und Ähnliche. Interleukine, die Lymphozyten kontrollieren, umfassen IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18 und Ähnliche. Eine Gruppe von Zytokinen, die insgesamt als "Wachstumsfaktoren" bezeichnet werden, umfassen die TGF-β-Familie, die EGF-Familie, die FGF-Familie, die IGF-Familie, die NGF-Familie, von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGFs), hepatische Zellwachstumsfaktoren (HGFs), vaskuläre endotheliale Zellwachstumsfaktoren (VEGFs) und Ähnliche. Eine Gruppe von Zytokinen, die insgesamt als "Tumornekrose-Faktoren" bezeichnet werden, umfassen TNF-α, TNF-β und Ähnliche. Eine Gruppe von Zytokinen, die insgesamt als "Interferone" bezeichnet werden, umfassen INF-α, INF-β, INF-γ und Ähnliche. Andere bekannte Zytokine umfassen Endothelin, von Gliazellen abgeleitete neurotrophische Faktoren (GDNFs) und Ähnliche. Eine Gruppe von Zytokinen, die eine Chemotaxis an jede Art funktionelle reife Blutzelle verleihen, wird insbesondere als Chemokine bezeichnet. Abhängig von der konservierten Cystein-Position an deren N-terminalen Bereichen, werden Chemokine in vier Kategorien klassifiziert: CC, CXC, C oder CXXXC.
Nachweisgegenstand des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedes der zuvor genannten Chemokine sein. Des weiteren können alle neu detektierten Mitglieder von jeder der zuvor genannten Gruppen von Chemokinen oder alle neu entdeckten Chemokine, die nicht zu irgendeiner der zuvor genannten Gruppen von Chemokinen gehören, Nachweisobjekte des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung sein. Insbesondere ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auf Chemokine anwendbar, die als lösliche Faktoren im Blutkreislauf existieren, biologische Aktivität in winzigen Mengen aufweisen und an verschiedenen Pathologien beteiligt sind.
Ein Beispiel für einen Nachweisgegenstand für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können Chemokine sein, die zu den zuvor genannten CXC-Chemokinen gehören; das Verfahren ist aber nicht notwendigerweise auf solche Kategorien beschränkt. Ein bevorzugtes Beispiel für einen Nachweisgegenstand für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist SDF-1.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die das Chemokin enthält, auf einer festen Phase gebildet, um das gewünschte Chemokin in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit selektiv einzufangen und zu markieren. Es wird eine Chemokin-enthaltende Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen auf einer geeigneten festen Phase gebildet:

(a) einem ersten Antikörper, der einen an die feste Phase gebundenen Teil umfasst, sowie einen Bereich, der an ein Chemokin binden kann;
(b) dem Chemokin;
(c) einem zweiten Antikörper, der einen Bereich umfasst, der an das Chemokin binden kann, sowie einen Teil, an den Biotin gebunden ist;
(d) einem Konjugat, das Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil umfasst, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann; und
(e) dem Lanthanoid-Metallion.

Im Folgenden werden die entsprechenden Bestandteile beschrieben.
Als "feste Phase" kann eine feste Substanz jeder Form und jeden Materials verwendet werden, solange es einem Antikörper erlaubt, daran zu binden und die Bildung des zuvor genannten Konjugates. und die Fluoreszenzmessung (später beschrieben) nicht behindert. Zur Erleichterung der Durchführung des Assay-Verfahrens wird typischerweise eine Mikrotiterplatte mit mehreren Vertiefungen verwendet, aber jede andere Konfiguration kann verwendet werden, wie beispielsweise eine Säule, die mit Kügelchen gefüllt ist (wobei das Material der Kügelchen Sepharose, Agarose, etc. sein kann, aber nicht darauf beschränkt ist). Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Mikrotiterplatte, die eine mittlere Adsorptionsfähigkeit für Protein aufweist, besonders geeignet sein. Wie vorliegend verwendet, bezieht sich eine "mittlere Adsorptionsfähigkeit für Protein" auf eine Eigenschaft, die typischerweise etwa 50 bis etwa 200 ng/cm², vorzugsweise etwa 15 bis 150 ng/cm², und mehr bevorzugt etwa 90 bis etwa 120 ng/cm² zeigt, wenn Immunglobulin G (IgG) als Referenzprotein adsorbiert wird. Das Material der Mikrotiterplatte kann vorzugsweise Polystyren sein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Komponente (a) oder der "erste Antikörper" ist ein Antikörper, der in einer Form existiert, bei der er an die zuvor genannte feste Phase gebunden ist, und der zur Bindung an ein gewünschtes Chemokin durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion fähig ist. In diesem Sinn wird der erste Antikörper auch als "Einfang-Antikörper" (capture antibody) bezeichnet. In der vorliegenden Beschreibung umfasst ein "Antikörper" ein Immunglobulin (Ig) und ein Immunglobulin-abgeleitetes Molekül jeder Art, z.B. einen polyklonalen Antikörper, einen monoklonalen Antikörper, Fab, (Fab)₂ oder einen chimären Antikörper. Der Ausdruck "Antikörper" wird in einer breiten Bedeutung verwendet und umfasst -sofern dieser zur Bindung an ein Chemokin in einer Art, die der eines Immunoglobulins ähnelt- sogar einen Rezeptor ein, der ein Chemokin als Liganden hat. Ein Beispiel für einen bevorzugten Antikörper ist ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper. Antikörper gegen verschiedene Chemokine sind kommerziell erhältlich, z.B. von R&D System Inc. (Minnesota, US), Dako Immunoglobulins a/s (Dänemark), PharMingen (California, US), Southern Biotechnology Associates (Alabama, US), und Ähnliche. Alternativ dazu kann ein Antikörper gegen ein gewünschtes Chemokin durch Verwendung von herkömmlichen Verfahren erzeugt werden, wie beispielsweise durch Immunisierung eines Tieres oder durch Hybridom-Methoden.
Die Bindung an die feste Phase kann durch Befolgen herkömmlicher Verfahren erreicht werden, z.B. durch direkte Beschichtung des ersten Antikörpers auf einer Mikrotiterplatte. Der "an die feste Phase gebundene Teil" des ersten Antikörpers bezieht sich typischerweise auf eine Fc-Region eines Antikörpers, die teilweise an eine feste Phase adsorbiert ist, ist aber nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel kann ein bifunktionales Verbindungsmolekül (linker) verwendet werden, das in der Lage ist, an die feste Phase und an einen Teil des Antikörpers zu binden.
Komponente (b) oder ein gewünschtes Chemokin, das in der Probe der biologischen Flüssigkeit vorhanden ist, wird an die feste Phase immobilisiert, typischerweise durch Bindung an den ersten Antikörper. Das Chemokin muss nicht in einem freien Zustand vorliegen, um in Kontakt mit dem ersten Antikörper zu stehen. Beispielsweise kann das Chemokin an den ersten Antikörper binden, nachdem es an den zweiten Antikörper gebunden hat (wird später beschrieben). Somit ist die Konjugatbildung gemäß der vorliegenden Erfindung nicht hinsichtlich der Reihenfolge der Bindung der entsprechenden Bestandteile beschränkt.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass es für einen hochsensitiven Nachweis von Chemokin essentiell ist, dass die Probe einer biologischen Flüssigkeit, die das gewünschte Chemokin enthält, mit einer geeigneten Pufferlösung auf eine geeignete Konzentration verdünnt wird, bevor sie mit dem Antikörper zusammengebracht wird, der in der Lage ist, dieses Chemokin zu binden. Das Verdünnungsverhältnis von Probe einer biologischen Flüssigkeit und Pufferlösung kann typischerweise etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 30 sein, vorzugsweise etwa 1 : 2,5 bis etwa 1 : 20 und mehr bevorzugt etwa 1 : 5 bis 1 : 15 wie auf Basis der Volumen (Probe einer biologischen Flüssigkeit : Pufferlösung) dargestellt. Der optimale Wert des Verdünnungsverhältnisses kann abhängig von der Art der Probe einer biologischen Flüssigkeit und der Art des Chemokins, etc. und ferner abhängig von der Zusammensetzung der Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird, variieren.
Eine geeignete Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird, ist eine alkalische Pufferlösung, die aus Tris(hydroxymethyl)aminomethan (abgekürzt als "Tris") und ei ner anorganischen Säure und typischerweise einer Tris-Salzsäure, deren pH typischerweise etwa 7,0 bis etwa 8,6, vorzugsweise etwa 7,3 bis etwa 8,3 und mehr bevorzugt etwa 7,5 bis etwa 8,1 ist, und deren Konzentration typischerweise etwa 0,005 bis etwa 0,2 mal (M), bevorzugt etwa 0,01 bis etwa 0,1 M, und mehr bevorzugt etwa 0,025 bis etwa 0,075 M ist.
Die Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird; enthält des Weiteren geeignete Mengen einer Plasmaproteinkomponente und Salze. Die Plasmaproteinkomponente ist typischerweise Serumalbumin und vorzugsweise bovines Serumalbumin (BSA), deren Konzentration typischerweise etwa 0,05 bis etwa 0,5%, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 0,3% und mehr bevorzugt etwa 0,15 bis etwa 0,25% ist. Die Salze sind typischerweise Natriumazid (NaN₃) und Natriumchlorid (NaCl). Die Konzentration des NaN₃ kann typischerweise etwa 0,02 bis etwa 0,4%, bevorzugt etwa 0,05 bis etwa 0,2%, und mehr bevorzugt etwa 0,05 bis etwa 0,15% sein. Die Konzentration des NaCl kann typischerweise etwa 0,2 bis etwa 3%, bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 1,5% und mehr bevorzugt etwa 0,6 bis etwa 0,12% sein.
Es verständlich, dass die Zusammensetzung der Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird, nicht auf die zuvor genannten Bedingungen beschränkt ist und verschiedene Modifikationen erlaubt, die dem Fachmann einfach in den Sinn kommen. Beispielsweise ist es möglich, einen Teil oder das gesamte der zuvor genannten Natriumsalze durch andere alkalische Metallsalze oder entsprechende Erdalkalimetallsalze zu ersetzen. Die optimalen Werte für den pH der Pufferlösung, der für die Probenverdünnung verwendet wird; und die Konzentrationen der entsprechenden Bestandteile können abhängig von der Art des Chemokins, welches Gegenstand des Nachweises ist, variieren und können ferner von dem Verdünnungsverhältnis der Probe der biologischen Flüssigkeit abhängen. Solche Optimierungen. können innerhalb der Grenzen gewöhnlicher Verfahren zum Einstellen der Bedingungen durch den Fachmann erreicht werden.
Komponente (c) oder der "zweite Antikörper" umfasst einen Bereich, der an das Zytokin binden kann, sodass er das gewünschte Chemokin mit dem ersten Antikörper in Sandwich-Art einfängt (capture). Es ist wünschenswert, dass der erste Antikörper und der zweite Antikörper anti-Peptid-Antikörper sind, die verschiedene Stellen (d.h. verschiedene Epitope) desselben Chemokin-Moleküls erkennen, ohne miteinander in Wechselwirkung zu treten. Daher ist es essentiell, dass der erste Antikörper und der zweite Antikörper hinsichtlich der Bindungsfähigkeit mit dem gewünschten Chemokin eine geeignete Kombination ergeben. Beispielsweise können geeignete Kombinationen aus mehreren Mengen polyklonaler Antikörper, die durch die Immunisierung eines geeigneten Tieres mit dem Chemokin vollständiger Länge oder mit einem Fragment dieses Chemokins, von dem bekannt ist, oder vorhergesagt ist, dass es eine Vielzahl von Epitopen einschließt, ausgewählt werden. Alternativ dazu können geeignete Kombinationen aus einer Vielzahl von monoklonalen Antikörpern ausgewählt werden, die verschiedene Epitope erkennen. Eine solche Auswahl kann ohne besondere Schwierigkeiten durch ein vorbereitendes Experiment erhalten werden, das die Herstellung einer Referenzlösung eines Chemokins und die Durchführung eines gewöhnlichen ELISA-Verfahrens mit den Kombinationen der Antikörper, die in Betracht gezogen werden, einschließt.
Der zweite Antikörper kann ferner einen Teil umfassen, an den Biotin gebunden ist, sodass er den Nachweis des Chemokins durch Fluoreszenzmessung ermöglicht. In diesem Sinn wird der zweite Antikörper auch als "Nachweisantikörper" bezeichnet. Biotin ist ein Vitamin, das auch als Vitamin H oder Coenzym R bezeichnet wird und zur Bildung einer Amidbindung mit einer Aminogruppe wie beispielsweise einem Peptid fähig ist. Der zweite Antikörper kann durch Biotinylierung und Aufreinigung eines Antikörpers gegen das Chemokin, welches Gegenstand des Nachweises ist, gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Der "Teil, an den Biotin gebunden ist" des zweiten Antikörpers bezieht sich auf das Biotin selbst sowie auf den Teil des Antikörpers, an den das Biotin gebunden ist (typischerweise die Fc-Region). Falls nötig kann das Biotin und ein Teil des Antikörpers durch Verwendung eines bifunktionalen Verbindungsmoleküls (linker), welches in der Lage ist, an beide zu binden, verknüpft werden.
Wie vorliegend verwendet, bezieht sich der Ausdruck "zweiter Antikörper" nicht notwendigerweise auf ein einziges Molekül, sondern kann darüber hinaus jede strukturelle Einheit darstellen, die die geforderten Funktionen erfüllt (d.h. die Funktion, in der Lage zu sein, durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion oder eine Liganden-Rezeptorbindung an ein Chemokin zu binden und die Funktion, Biotin zu tragen). Dasselbe gilt für den zuvor genannten "ersten Antikörper". Beispielsweise kann eine Kombination eines Antikörpers gegen das gewünschte Chemokin und ein biotinylierter anti-IgG-Antikörper, der zur Bindung dieses anti-Chemokin-Antikörpers fähig ist, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. In diesem Fall wird die Kombination des anti-Chemokin-Antikörpers und des biotinylierten anti-IgG-Antikörpers insgesamt als der "zweite Antikörper" bezeichnet. Ein biotinylierter anti-IgG-Antikörper ist aufgrund seiner Vielseitigkeit geeignet. Wenn ein Antikörper gegen ein gewünschtes Chemokin aus irgendeinem Grund eine Resistenz gegen eine Biotinylierungsreaktion aufweist, kann die Verwendung einer Kombination mit einem biotinylierten anti-IgG-Antikörper nützlich sein. Für die Vereinfachung des Assay-Verfahrens und die Maximierung der Sensitivität des Chemokin-Nachweises ist es andererseits bevorzugt, ein einziges Molekül als zweiten Antikörper einzusetzen.
Komponente (d) oder ein "Konjugat" ist jede strukturelle Einheit, die ein Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil enthält, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann, und typischerweise ein Molekül ist, in dem das Streptavidin oder Avidin und der fluoreszierende Strukturteil direkt oder indirekt über eine kovalente Bindung verknüpft sind. Streptavidin ist allgemein als Protein bekannt, das von Actinomyceten produziert wird und ein Molekulargewicht von etwa 60000 hat und von Natur aus stark an Biotin bindet. In der vorliegenden Erfindung ist "Streptavidin" jedoch nicht auf solche von irgendeinem besonderen mikrobiellen Ursprung beschränkt, sondern kann auch entsprechende Proteine anderen mikrobiellen Ursprungs einschließen, ebenso wie Modifikationen derselben, solange seine Bindefähigkeit mit Biotin im Wesentlichen erhalten bleibt. Avidin ist allgemein als Protein bekannt, das ein Molekulargewicht von etwa 70000 hat und in Eiweiß enthalten ist und ebenfalls von Natur aus stark an Biotin bindet. In der vorliegenden Erfindung ist "Avidin" nicht notwendigerweise auf natürliches Eiweißprotein beschränkt sondern kann Modifikationen desselben einschließen, solange seine Bindefähigkeit mit Biotin im Wesentlichen erhalten bleibt.
Wie aus den zuvor genannten Prinzipien erkannt werden wird, kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch ausgeführt werden, indem anstelle von Komponente (c) ein Antikörper verwendet wird, der einen Bereich umfasst, welcher an ein Chemokin binden kann sowie einen Teil, an den Streptavidin oder Avidin gebunden ist; und indem anstelle von Komponente (d) ein Konjugat verwendet wird, das Biotin und einen fluoreszierenden Strukturteil umfasst, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann.
Der fluoreszierende Strukturteil des Konjugates der Komponente (d), der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann, ist eine Teilstruktur, die erhalten werden kann, indem einer entsprechenden fluoreszierenden Verbindung erlaubt wird, so zu reagieren, dass sie direkt oder indirekt über eine kovalente Bindung mit Streptavidin oder Avidin verbunden wird. Der fluoreszierende Strukturteil wird durch die nachstehende, allgemeine Formel (I) dargestellt: -R-Ar-C(=O)-CH₂-C(=O)-C_nF_2n-X (I)(in der Formel stellt R einen Rest dar, der eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einem Protein zu bilden; Ar stellt eine Kohlenwasserstoffgruppe dar, die ein konjugiertes Doppelbindungssystem aufweist; n ist eine ganze Zahl, die gleich oder größer als 1 ist; und X ist ein Fluoratom oder eine Gruppe, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird: -C(=O)-CH₂-C(=O)-Ar-R- (II).
In der oben genannten Formel bezieht sich die "funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einem Protein zu bilden", und die den Rest R definiert, auf jede organische funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, durch Reaktion mit einer reaktiven Gruppe (typischerweise eine Aminogruppe, Carboxylgruppe und eine Hydroxylgruppe), welche in einem Aminosäurerest im Protein enthalten ist, eine kovalente Bindung zu bilden. Beispiele für solche funktionellen Gruppen umfassen die folgenden Gruppen:
(wobei X ausgewählt ist aus einem Halogenidatom, -OSO₂CH₃, -OSO₂F, -OSO₂CF₃, -OSO₂C₄F₉, oder -OSO₂PhCH₃-p (wobei Ph eine Phenylgruppe darstellt); R^A ausgewählt ist aus einer Alkylgruppe, einer Alkenylgruppe, einer Arylgruppe oder einer Aralkylgruppe; R^B ausgewählt ist aus einer Alkylengruppe, einer Alkenylengruppe, einer Arylengruppe oder einer Aralkylengruppe; p 0 bis 5 ist; und q 2 bis 10 ist).
In der oben gezeigten allgemeinen Formel ist die "Kohlenwasserstoffgruppe, die ein konjugiertes Doppelbindungssystem aufweist", welche Ar definiert, eine Kohlenwasserstoffgruppe, die mindestens drei konjugierte Doppelbindungen hat und typischerweise eine divalente oder trivalente aromatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, die mindestens einen Phenylring aufweist. Die obere Grenze der Anzahl von Kohlenstoffatomen in der Kohlen wasserstoffgruppe liegt typischerweise bei etwa 50 oder weniger, und vorzugsweise bei etwa 30 oder weniger, obwohl sie nicht darauf beschränkt ist. Hier können ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome ersetzt sein (z.B. ein Sauerstoff oder ein Schwefelatom). Beispiele für die Kohlenwasserstoffgruppe Ar umfassen die folgenden Gruppen:
Vorzugsweise ist die Kohlenwasserstoffgruppe Ar trivalent, und der fluoreszierende Strukturteil wird durch die allgemeine Formel (III) dargestellt: -R-Ar-(C(=O)-CH₂-C(=O)-C_nF_2n)₂ (III).
Ein mehr bevorzugtes Beispiel für Ar ist vorliegend o-Terphenyl, das an zwei β-Diketongruppen an den 4,4'-Positionen bindet. Ein weiteres, ähnlich bevorzugtes Beispiel für Ar ist eine trivalente aromatische Kohlenwasserstoffgruppe, die zwei β-Diketongruppen dazu bringen kann, an ähnlichen Orten positioniert zu sein, wie die Positionen der β-Diketongruppen, die mit o-Terphenyl assoziiert sind, oder in einem im Wesentlichen gleichen räumlichen Abstand .
In der obigen allgemeinen Formel ist n eine ganze Zahl von 1 oder mehr, typischerweise 1 bis 6 und vorzugsweise 2 bis 4.
In der vorliegenden Erfindung ist ein besonders bevorzugter fluoreszierender Strukturteil 4,4'-Bis(1'',1'',1'',2'',2'',3'',3''-heptafluor-4'',6''-hexandion-6''-yl)-sulfo-o-terphenyl. Dieses wird aus einer entsprechenden fluoreszierenden Verbindung 4,4'-Bis(1'',1'',1'',2'',2'',3'',3''-heptafluor-4'',6''-hexandion-6''-yl)-chlorsulfo-o-terphenyl (abgekürzt als "BHHCT") erhalten, Die strukturelle Formel des BHHCT ist unten gezeigt:
Eine gewünschte fluoreszierende Verbindung, die das zuvor genannte fluoreszierende Strukturteil ergibt, kann unter Verwen dung von routinemäßigen organischen Synthesereaktionen synthetisiert werden. Typischerweise kann sie durch Befolgen der Prozedur, die aus den folgenden Schritten besteht, synthetisiert werden:
(Erster Schritt) Es wird eine Claisen-Kondensationsreaktion zwischen einer acetylierten aromatischen Verbindung und einem Perfluorcarboxylatester in einem geeigneten Lösungsmittel in Anwesenheit eines basischen Katalysators (z.B. Natriummethylat) ausgeführt, wobei eine β-Diketonverbindung hergestellt wird, in der das CH₃- einer Acetylgruppe perfluorcarbonyliert wurde.
(Zweiter Schritt) Eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, eine kovalente Bindung mit einem Protein zu bilden, wird in die β-Diketonverbindung eingebracht. Beispielsweise werden Wasserstoffatome des aromatischen Rings durch Chlorsulfonylgruppen (ClSO₂-) durch eine Chlorsulfonylierungsreaktion unter Verwendung von Chlorschwefelsäure ersetzt. Nach den entsprechenden Schritten kann, falls notwendig, eine Aufreinigung wie beispielsweise eine Rekristallisation oder Präzipitation durchgeführt werden.
Der resultierenden fluoreszierenden Verbindung wird erlaubt, mit einem Protein unter geeigneten Bedingungen zu reagieren, wobei abhängig von der Art der funktionellen Gruppe, die während dem zuvor genannten zweiten Schritt eingefügt wurde, der fluoreszierende Strukturteil von Interesse erhalten wird. Beispielsweise bildet eine Chlorsulfonylgruppe leicht ein Amid mit einer Aminosäure innerhalb eines Proteins unter basischen Reaktionsbedingungen.
Bei der vorliegenden Erfindung kann das Konjugat der Komponente (d) durch direkte Markierung von Streptavidin oder Avidin mit einer fluoreszierenden Verbindung hergestellt werden. Al ternativ dazu kann das Konjugat der Komponente (d) hergestellt werden, indem es zunächst Streptavidin und Avidin erlaubt wird, an ein anderes Protein zu konjugieren (z.B. bovines Serumalbumin) und es dann weiter markiert wird. Die Konjugation zwischen dem Streptavidin oder Avidin und einem anderen Protein. kann durch Befolgen herkömmlicher Verfahren erreicht werden, z.B. durch eine Quervernetzungsreaktion unter Verwendung von Glutaraldehyd.
Die Markierungsreaktion für das Protein mit einer fluoreszierenden Verbindung kann typischerweise durch Auflösung des Proteins in einer Pufferlösung, die auf einen geeigneten pH für die Reaktion eingestellt wurde (z.B. etwa pH 9 im Falle einer Chlorsulfonylierung) und durch Zugabe einer fluoreszierenden Verbindung, die in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wurde (z.B. Ethanol oder Dimethylsulformamid in einer entsprechenden Menge, um das gewünschte molare Verhältnis zu erhalten), ausgeführt werden. Durch Einstellen des molaren Verhältnisses der fluoreszierenden Verbindung zu Protein und Konzentration der Lösung, die die fluoreszierende Verbindung enthält, ist es möglich, das Verhältnis (ebenfalls bezeichnet als das "Konjugationsverhältnis") der fluoreszierenden Verbindung, welche an jedes Molekül des Proteins konjugiert, zu kontrollieren. Das Konjugationsverhältnis entspricht der Anzahl der Einheiten des fluoreszierenden Strukturteils, die pro Molekül Streptavidin oder Avidin in dem Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung vorhanden sind. Das Konjugationsverhältnis kann typischerweise 5 bis 100 Einheiten und vorzugsweise 10 bis 60 Einheiten sein. Wenn das Konjugationsverhältnis zu klein ist, wird eine ausreichend hohe Sensitivität des Zytokinnachweises möglicherweise nicht erhalten. Auf der anderen Seite kann ein zu hohes Konjugationsverhältnis die Verbesserung bei der Nachweissensitivität möglicherweise nicht ausmachen.
Die Bildung der Zusammensetzung auf einer festen Phase wird bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch erreicht, dass Komponente (e) eines Lanthanoid-Metallions mit dem zuvor genannten fluoreszierenden Strukturteil einen Komplex bildet. Beispiele solcher Lanthanoid-Metallionen umfassen Europium (Eu), Samarium (Sm), Terbium (Tb) und Dysprosium (Dy). Europium (Eu) ist bevorzugt. Das Lanthanoid-Metallion bildet zunächst mit dem Konjugat der Komponente (d) einen Komplex und wird für die Bildung der Zusammensetzung in dieser Form verwendet. Mit anderen Worten ist der fluoreszierende Strukturteil normalerweise bereits ein Komplex geworden, der Eu³⁺ zurückbehält, wenn sich die Konjugation mit Streptavidin oder Avidin oder Biotin ausbildet. Dies schließt jedoch den entgegengesetzte Prozess nicht aus.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass es für einen hochsensitiven Chemokinnachweis essentiell ist, dass die Zusammensetzung, die auf diese Weise auf der festen Phase gebildet wurde, entsprechend mit einer geeigneten Pufferlösung vor der Fluoreszenzmessung gewaschen wird. Hier ist eine geeignete Pufferlösung, die für das Waschen der Zusammensetzung verwendet wird, ein alkalischer Puffer, der aus Tris und anorganischen Säuren zusammengesetzt ist und typischerweise Tris-Salzsäure, deren pH typischerweise etwa 8,2 bis 9,8, vorzugsweise etwa 8,5 bis 9,5, und mehr bevorzugt etwa 8,7 bis 9,4 beträgt, und deren Konzentration typischerweise etwa 0,005 bis 0,2 M, vorzugsweise etwa 0,01 bis 0,1 M und mehr bevorzugt etwa 0,025 bis 0,075 M beträgt.
Die Pufferlösung, die für das Waschen der Zusammensetzung verwendet wird, enthält des Weiteren eine geeignete Menge eines nichtionischen Tensids, das eine Proteinlösungsfähigkeit hat. Das nichtionische Tensid ist typischerweise Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, und bevorzugt ein Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, das kommerziell unter dem Namen "Tween (registrierte Handelsmarke) 20" (Molekulargewicht: um 1200) erhältlich ist. Andere nicht-ionische Tenside die im Wesentlichen dieselben Eigenschaften wie die von Tween (registrierte Handelsmarke) 20 haben (z.B. ein Hydroxywert um 95 bis 115, einen Verseifungs-Wert von etwa 35 bis 55 und eine HLB (Hydrophilizitäts-Hydrophobizitäts-Balance) von etwa 15 bis 18)) können ebenfalls bevorzugt verwendet werden. Die Konzentration des nicht-ionischen Tensids beträgt typischerweise etwa 0,005 bis 0,2%, bevorzugt etwa 0,01. bis 0,1% und mehr bevorzugt etwa 0,025 bis 0,075%.
Es wird angemerkt, dass die Zusammensetzung der Pufferlösung, die für das Waschen der Zusammensetzung verwendet wird, nicht auf die zuvor genannten Bedingungen beschränkt ist und verschiedene Variationen, die dem Fachmann einfach in den Sinn kommen, erlaubt sind. Die maximalen Werte des pH und der Konzentration der entsprechenden Bestandteile können abhängig von der Art des nachzuweisenden Chemokins variieren. Solche Optimierungen können innerhalb des Bereichs des gewöhnlichen Verfahrens zur Bestimmung der Bedingungen durch den Fachmann erreicht werden.
Im Folgenden wird ein typisches Beispiel einer Prozedur für die Bildung der Zusammensetzung auf einer festen Phase gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben.

1) Eine Lösung des ersten Antikörpers, der in einer geeigneten Pufferlösung verdünnt wurde, die für die Beschichtung eingesetzt wird, wird auf eine feste Phase (z.B. in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen) gegeben, und der erste Antikörper wird durch Inkubation auf der festen Phase immobilisiert. Als Pufferlösung für die Beschichtung kann eine Phosphatpufferlösung, die eine geeignete Menge Natriumchlorid enthält, eingesetzt wer den. Typischerweise sind die Inkubationsbedingungen von 2 bis 6°C für etwa 20 Stunden oder mehr.
2) Als nächstes wird die Oberfläche der festen Phase, die mit dem ersten Antikörper beschichtet wurde, mehrere Male gewaschen, wobei eine Pufferlösung für das Waschen verwendet wird. Als Pufferlösung für das Waschen kann beispielsweise alkalische Tris-Salzsäure eingesetzt werden, und es kann eine geeignete Menge eines nicht-ionischen Tensids, das eine Proteinlösungsfähigkeit hat, zugesetzt werden (falls notwendig). Nach dem Waschen wird die beschichtete feste Phase bei einer niedrigen Temperatur von etwa –20°C bis kurz vor der Verwendung in einem Assay aufbewahrt.
3) Wie oben beschrieben, wird die Probe einer biologischen Flüssigkeit, die das Chemokin enthält, welches Gegenstand des Nachweises ist, vorzugsweise zunächst mit einer Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird, auf eine geeignete Menge verdünnt. Die Probe einer biologischen Flüssigkeit, und falls nötig eine Referenzlösung des Chemokins, wird auf die beschichtete feste Phase aufgebracht und inkubiert. Typischerweise sind die Inkubationsbedingungen etwa 35 bis 39°C für etwa 40 Minuten bis 2 Stunden. Nach der Inkubation wird die Oberfläche der festen Phase mehrere Male mit einer Pufferlösung, die für das Waschen verwendet wird, gewaschen, ähnlich wie oben.
4) Danach wird eine Lösung des zweiten Antikörpers, der in einer geeigneten Pufferlösung verdünnt wurde, auf die feste Phase aufgebracht und inkubiert. Hier ist es bevorzugt, dieselbe Pufferlösung, die für die Probenverdünnung wie oben beschrieben verwendet wurde, einzusetzen. Die Inkubationsbedingungen sind ähnlich zu denen, bei der zuvor genannten Inkubation der biologischen flüssigen Probe. Nach der Inkubation wird die Oberfläche der festen Phase mehrere Male mit einer Pufferlösung, die für das Waschen verwendet wird, gewaschen, ähnlich wie oben beschrieben.
5) Das Konjugat wird mit einer Lösung eines Salzes des Lanthanoid-Metallions so gemischt, sodass sich ein fluoreszierender Komplexteil bilden kann. Nachdem es in einem geeigneten Lösungsmittel verdünnt wurde, wird das komplexierte Konjugat auf die Festphase aufgebracht und inkubiert. Die Inkubationsbedingungen sind ähnlich zu denen in der vorgenannten Inkubation der biologischen flüssigen Probe und des zweiten Antikörpers. Nach der Inkubation wird die Zusammensetzung, die auf der festen Phase gebildet wurde, mehrere Male mit einer geeigneten Pufferlösung, die für das Waschen der Zusammensetzung verwendet wird, in der zuvor genannten Art gewaschen.

Als Nächstes wird die Zusammensetzung, die einen Lanthanoidkomplex enthält, der in der zuvor beschriebenen Art erhalten wurde, einer zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung in einer festen oder flüssigen Phase unterzogen. Geräte für diese Fluoreszenzmessungen sind kommerziell erhältlich. Typischerweise sind die Messungsbedingungen wie folgt: Verzögerungszeit von etwa 0,2 bis etwa 0,3 Millisekunden (ms); eine Fensterzeit von etwa 0,2 bis etwa 0,6 ms, eine Blitzrate von 0,5 bis etwa 1,5 ms; eine Anregungswellenlänge von 237,1 nm (Wellenlänge eines Stickstofflaser); und eine Messungswellenlänge von 650 nm.
Im Fall einer Festphasen-Fluoreszenzmessung kann die feste Phase, die die zuvor genannte Zusammensetzung enthält, der Fluoreszenzmessung so wie sie ist unterzogen werden. Im Falle einer Fluoreszenzmessung in flüssiger Phase wird die Zusammensetzung mit einer geeigneten Dissoziationslösung behandelt, um es jeder der strukturellen Einheiten, die den fluoreszierenden Komplexteil enthalten, zu erlauben, in die Lösung zu gelangen; diese Lösung wird den Fluoreszenzmessungsbedingungen unterzogen. Die Dissoziation ist typischerweise eine schwachbasische wässrige Lösung, die Trialkylphosphinoxid und ein anionisches Tensid enthält. Als ein Beispiel für eine Dissoziationslösung kann eine wässrige Lösung eines Natriumhydrogencarbonats (NaH-CO₃), die Tri(n-octyl)phosphinoxid (TOPO) und Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, verwendet werden. Durch Inkubieren der festen Phase, die die zuvor genannte Zusammensetzung enthält, bei etwa 45 bis 55°C für etwa 40 Minuten bis 2 Stunden wird die Konjugation mit dem Streptavidin oder Avidin oder Biotin aufgehoben, sodass das Konjugat, das den fluoreszierende Komplexteil enthält in die Lösung gelangt.
Die zuvor genannte Fluoreszenzmessung in flüssiger Phase erlaubt einen weiteren Bereich von Typen fester Phasen und Materialien, die ausgewählt werden können, da die Fluoreszenzmessung keine feste Phase beinhaltet. Auf der anderen Seite führt die Fluoreszenzmessung in flüssige Phase zu einem komplizierteren Verfahren, da im Vergleich mit der Festphasen-Fluoreszenzmessung zusätzliche Schritte erforderlich sind. Des Weiteren kann die Fluoreszenzmessung in flüssige Phase in einigen Fällen eine etwas geringere Sensitivität als bei der Festphasen-Fluoreszenzmessung ergeben, aus Gründen wie beispielsweise der Empfänglichkeit gegenüber dem Einfluss von Unreinheiten während des Schrittes der Dissoziationslösungsbehandlung. Es ist jedoch verständlich, dass die entsprechenden Maximalsensitivitäten, die durch die Fluoreszenzmessungen in fester und flüssiger Phase erreicht werden, von der Kombination verschiedener Bedingungen betreffend den Assay abhängen können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird des Weiteren ein Kit zum Ausführen des zuvor genannten zeitaufgelösten Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Verfahrens bereitgestellt. Dieses Kit umfasst norma lerweise mindestens die zuvor genannten Komponenten (a), (c), (d) und (e) als Bestandteile. Mit anderen Worten,
ein erster Antikörper; der einen an eine feste Phase gebundenen Teil umfasst und einen Bereich, der an ein Chemokin binden kann; ein zweiten Antikörper, der einen Bereich enthält, der an ein Chemokin binden kann und einen Teil, an den Biotin gebunden ist; ein Konjugat, das Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil enthält, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann; und das Lanthanoid-Metallion werden demjenigen vollständig zur Verfügung gestellt, der die Messung durchführt, wodurch es möglich wird, einen Assay zum Nachweis des Chemokins in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit durchzuführen. Falls notwendig kann das Kit ein Referenzchemokin, die zuvor genannten verschiedenen Pufferlösungen (insbesondere eine Pufferlösung, die für die Probenverdünnung verwendet wird und eine Pufferlösung, die für das Waschen der Zusammensetzung verwendet wird) und Ähnliches enthalten. Die Bestandteile des Kits können normalerweise in Gefäßen in ihren jeweiligen geeigneten Formen bereitgestellt werden und vollständig zusammen mit Erklärungen oder Instruktionen für die Verwendung verpackt werden.
Die vorliegende Erfindung macht ein neues Verfahren zugänglich, welches in der Lage ist, Chemokine mit hoher Sensitivität, einschließlich SDF-1, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit nachzuweisen. Die Nachweisgrenze gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist typischerweise etwa 100 pg/ml oder weniger und vorzugsweise etwa 50 pg/ml oder weniger und mehr bevorzugt etwa 30 pg/ml oder weniger, die unter im Wesentlichen denselben Bedingungen wie im unten beschriebenen Beispiel 2 erhalten wird. Darüber hinaus wird der Variationskoeffizient (CV) für die Chemokinmessung typischerweise weniger als 10%, vorzugsweise weniger als 8% und mehr bevorzugt weniger als 7% sein, wie er unter im Wesentlichen den selben Bedingungen wie im unten beschriebenen Beispiel 2 erhalten wird. Die Rückgewinnungsrate des Chemokins aus einer Plasmaprobe kann typischerweise etwa 70% oder mehr, vorzugsweise etwa 80% oder mehr und mehr bevorzugt etwa 90% oder mehr sein, wie sie unter im Wesentlichen denselben Bedingungen wie im unten beschriebenen Beispiel 6 erhalten wird. Des Weiteren werden die Fluktuationen bei den gemessenen Werten, die erhalten werden, wenn die Messungen für das Chemokin in Plasmaproben, die von demselben Individuum erhalten wurden unter denselben Bedingungen an vier oder mehr verschiedenen Tagen wiederholt wurden, vorzugsweise in einem Bereich von etwa 10 bis 20% sein.
Wie in den unten gezeigten Beispielen dargestellt, wurde die Nachweissensitivität, insbesondere in Bezug auf SDF-1, in Plasmaproben im Bereich von zwei oder drei Größenordnungen bezüglich herkömmlicher Verfahren wie beispielsweise ELISA und DELFIA verbessert, wenn ein Eu³⁺-Komplex verwendet wurde, der aus einer fluoreszierenden Verbindung BHHCT gemäß der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurde. Es ist sehr wichtig, das Verhalten von SDF-1 in vivo exakt zu begreifen und seine physiologischen Funktionen aufzuklären, um das Verständnis von HIV-1 Infektionen zu vertiefen und neue Wege der AIDS-Behandlung zu eröffnen. Es ist ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung besondere signifikante Beiträge zu der Entwicklung und Anwendung der Molekularbiologie betreffend Chemokinen leisten kann.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, wie in den Beispielen unten dargestellt, dass durch Verwenden eines Eu³⁺-Komplexes, der aus einer fluoreszierenden Verbindung BHHCT gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, Messungen für Chemokine, die andere sind als diejenigen der Chemokin-Familie, z.B. Chemokine, die im Blutkreislauf als lösliche Faktoren existieren und biologische Aktivitäten in winzigen Mengen aufweisen und die nicht nur an verschiedenen Pathologien beteiligt sind, sondern auch bereits in therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden, mit einer hohen Sensitivität, wie die für SDF-1, möglich sind, und zwar ebenfalls mit einer guten Reproduzierbarkeit.
BEISPIELE
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlicher durch Beispiele beschrieben. Diese Beispiele beschränken die vorliegende Erfindung nicht.
Materialien, Geräte und Messungsbedingungen, die in den Beispielen verwendet werden, sind unten beschrieben.
Antikörper: Anti-SDF-1 Antiserum wurde durch Immunisierung eines Kaninchens mit einem Multi-Antigenpeptid (Research Genetics, Alabama, US) einschließlich der Reste 33–45 (RFFESHI-ARANVK) des humanen SDF-1β erzeugt. Das Antiserum wurde mit einer Affinitätssäule gereinigt und verwendet. Ein Ziegepolyklonaler Antikörper gegen humanes SDF-1β wurde von R&D Systems Inc. (Minnesota, US) bezogen. Ein humaner monoklonaler Antikörper gegen humanen Granulzyten-Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) wurde von PharMingen (California, US) bezogen. Ein monoklonaler Antikörper gegen humanes Interleukin 2 (IL-2) wurde von PharMingen (California, US) bezogen.
Chemokine: Humanes RANTES, humanes MIP-1α und β, humanes MDC, und humanes Fractalkin wurden von DIACLONE Research (Frankreich) bezogen. Humanes IL-8 wurde von ENDOGEN (Massachusetts, US) bezogen. Ein kommerziell erhältliches ELISA-Kit wurde für die Bestimmung von Maus-IL-8 und Maus-MCP-1, die zu Plasma zugegeben wurden, verwendet. Maus-IL-8 wurde von Amersham Phar macia Biotech (Schweden) bezogen und Maus-MCP-1 wurde von PharMingen (California, US) gekauft. Maus-SDF-1α, Maus-SDF-1β, humanes SDF-1α, und humanes SDF-1β wurden vom Genetics Institute (Massachusetts, US) zur Verfügung gestellt. Humanes GM-CSF wurde von PharMingen (California, US) käuflich erworben. Humanes IL-2 wurde von PharMingen (California, US) bezogen.
Geräte und Messungsbedingungen: 1420 ARVO Multi-Markierungszähler von Wallac (Finnland) und Amersham Pharmacia Biotech (Schweden) wurde für die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung unter den folgenden Messungsbedingungen verwendet: eine Verzögerungszeit von 0,20 Millisekunden (ms), eine Fensterzeit von 0,40 ms, eine Blitzrate von 1,00 ms. Um ein stark sensitives TR-FIA Assay-System zu erhalten, wurden 5 Typen von Mikrotiterplatten, die von Nunc (Dänemark) bezogen wurden, untersucht, von denen die Polysorp-Platte die am stärksten sensitiven Fluoreszenzsignale bei der Messung des als Referenz verwendeten humanen SDF-1β produzierte. Die Reihenfolge der Sensitivität war wie folgt: White C96 Maxisorp > C96 Maxisorp > White C8 Maxisorp > Black F16 Maxisorp.
In den nachfolgenden Experimenten wurden durchgehend White C96 Polysorp-Mikrotiterplatten verwendet.
(Beispiel 1: Einleitende Studie für TR-FIA)
Zunächst wurden Anstrengungen unternommen, gute Kombinationen von Festphasen-gebundenen Einfang-Antikörpern (capture antibodies) und Nachweis-Antikörpern zu identifizieren, die für ein ELISA-basiertes Immunoassaysystem zur SDF-1-Messung geeignet sind. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Kombinationen aus insgesamt fünf Arten einschließlich polyklonalen Kaninchen-anti-SDF-1-Antikörpern und polyklonalen Ziege-anti-3DF-1-Antikörpern untersucht. Ein spezifischer Nachweis des Refe renz-SDF-1 wurde bei drei Kombinationen beobachtet. Die Nachweisgrenze für SDF-1 überstieg in den ELISA-Assays jedoch nie 10 bis 20 ng/ml. Für gewöhnlich ist die Menge an SDF-1, die im Plasma vorhanden ist, sehr viel niedriger als eine solche Nachweisgrenze. Somit wurde bestätigt, dass es praktisch unmöglich ist, SDF-1 in Plasmaproben mit einem ELISA-Assay nachzuweisen.
Durch Einsatz der am meisten bevorzugten Kombinationen der polyklonalen Antikörper, die in der zuvor genannten Art gefunden wurden, wurde der SDF-1 Nachweis durch Modifizierung der gewöhnlichen TR-FIA Bedingungen wie unten beschrieben durchgeführt.
(Beispiel 2: TR-FIA für Referenz SDF-1)
Vier Arten Assay-Pufferlösungen wurden für den TR-FIA hergestellt: Pufferlösung 1 zur Beschichtung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (0,15 M Phosphatpuffer (PBS), der 0,14 M NaCl enthält); Pufferlösung 2 zum Waschen der Platten (0,05 M Tris-HCl, das 0,05% Tween 20 enthält, pH 7,8); Pufferlösung 3 zum Waschen der Platten (0,05 M Tris-HCl, pH 7,8); und Pufferlösung 4 zum Verdünnen der Proteinlösungen (0,05 M Tris-HCl, das 0,2% BSA, 0,1% NaN₃ und 0,9% NaCl enthält, pH 7,8).
Die Synthese des BHHCT wurde gemäß einem Verfahren, das von Yuan et al. beschrieben wurde ('98) (Dokument 5), durchgeführt; und die Herstellung eines Konjugates aus Streptavidin und bovinem Serumalbumin (SA-BSA) und die Markierung des Konjugates mit BHHCT wurden gemäß einem Verfahren, das in Yuan et al. ('97) (Dokument 4) beschrieben wurde, durchgeführt. Eine Lösung des markierten Konjugates wurde bei –20°C aufbewahrt und 100-fach mit der Pufferlösung unten (Pufferlösung 4) direkt vor der Verwendung verdünnt.
Polyklonaler Kaninchen-anti-Human-SDF-1β-Antikörper oder polyklonaler Ziege-anti-Human-SDF-1β-Antikörper wurde als Einfang-Antikörper verwendet. Sie produzierten ähnliche Ergebnisse. Eine Lösung des Einfang-Antikörpers (jeweils 60 μl), die auf 10 μg/ml mit Pufferlösung 1 verdünnt wurde, wurde in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen bei 4°C 24 Stunden inkubiert. Als Nächstes wurde diese Vertiefung zweimal mit Pufferlösung 2 und einmal mit Pufferlösung 3 gewaschen. Die Platte, die mit anti-SDF-1-Antikörper in der oben beschriebenen Art beschichtet worden ist, kann für mindestens 1 Monat bei –20°C aufbewahrt werden.
Eine Referenzlösung von SDF-1 (50 μl) wurde auf die zuvor genannte beschichtete Platte pipettiert und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen der Platte mit Pufferlösungen 2 und 3 wurden 50 μl einer Lösung eines biotinylierten polyklonalen Ziege-anti-Human-SDF-1β-Antikörpers (erhalten durch Biotinylierung des zuvor genannten Ziege-Antikörpers von R&D System durch Durchführung gewöhnlicher Verfahren), die 1000-fach mit Pufferlösung 4 verdünnt wurden, in einer Vertiefung bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Platte zweimal mit Pufferlösung 2 und einmal mit Pufferlösung 3 gewaschen, und 50 μl einer BSA-SA Lösung (50 μl), markiert mit BHHCT-Eu³⁺, wurden in einer Vertiefung bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Platte wurde viermal mit 0,05 M Tris-HCl, pH 9,1, das 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen. Diese Platte wurde einer festen Fluoreszenzmessung durch Verwendung eines 1420 ARVO Multi-Markierungszählers unterzogen.
Kalibrierungskurven für das Referenz SDF-1 innerhalb einer wässrigen Lösung sind in den 1a und 1b gezeigt. Die Nachweisgrenze für SDF-1 durch TR-FIA kann aus der folgenden Gleichung berechnet werden (gemäß Kropf et al. (Dokument 2): 3 × [S0] × SB/(S0 – B), wobei

[S₀]: eine minimale Konzentration der Referenzlösung ist;
S_B: die Standardabweichung einer Blindprobe („blank") ist;
S₀: eine Fluoreszenzsignalintensität der Referenzlösung bei minimaler Konzentration ist; und
B: eine Fluoreszenzsignalintensität der Blindprobe ist.

Aus der obigen Gleichung wurde die Nachweisgrenze für TR-FIA als 30 pg/ml berechnet, was drei Größenordnungen geringer als die Nachweisgrenze für ELISA (um 10 bis 20 ng/ml) für das zuvor genannte Referenzbeispiel ist. Da 50 μl der Lösung pro Vertiefung verwendet werden, ist die minimale Menge des SDF-1 Proteins, die durch TR-FIA nachweisbar ist, 1,5 pg/Vertiefung.
Es wurde ferner gezeigt, dass der TR-FIA bezüglich der Messungsreproduzierbarkeit verbessert wurde. Der Variationskoeffizient (CV) für den SDF-1 Nachweis durch TR-FIA war weniger als 7% für eine Referenzprobe in einem Konzentrationsbereich von 0,1 ng/ml bis 1024 ng/ml. Dies muss der Tatsache gegenübergestellt werden, dass der CV-Wert für einen ELISA in dem oben beschriebenen Referenzbeispiel 10% bei einem Konzentrationsbereich von 10 ng/ml bis 1000 ng/ml überstieg und dass der CV-Wert für DELFIA (siehe das vergleichende Beispiel unten) ebenfalls 10% in einem Konzentrationsbereich von 0,1 ng/ml bis 1024 ng/ml überstieg.
Zusätzlich zu der zuvor genannten Festphasen-Fluoreszenzmessung wurde ebenfalls eine Fluoreszenzmessung in flüssiger Phase untersucht. Insbesondere wurde eine fluoreszierende Zusammensetzung (polyklonaler anti-SDF-1-Antikörper-SDF-1 biotinylierter polyklonaler anti-SDF-1-Antikörper-BHHCT-Eu³⁺, markiert mit BSA-SA), die auf einer festen Phase durch die zu vor genannte Prozedur gebildet wurde, mit einer sauren chelatierten Tensid Lösung (eine 0,1 M NaHCO₃ wässrige Lösung, die 10 μM TOPO und 0,05% SDS enthält) behandelt, wodurch es dem markierten BSA-SA-Konjugat erlaubt wurde, sich von der festen Phase zu lösen. Die Fluoreszenzintensität des Konjugats innerhalb der Lösung wurde durch Verwendung eines 1420 ARVO Multi-Markierungszählers gemessen. Die SDF-1 Nachweissensitivität in diesem Falle lag um 100 pg/ml, was nicht so hoch wie bei der zuvor genannten Festphasenmessung ist.
(Beispiel 3: Heruntermodulierung von CXCR4 durch humanes SDF-1β)
Um die Beziehung zwischen den SDF-1 Messwerten durch TR-FIA gemäß dem Beispiel 2 und der biologischen Aktivität des Referenz-SDF-1 Proteins zu bestätigen, wurde eine in vitro Heruntermodulierung (down modulation) eines SDF-1-Rezeptors (CXCR4), welche in EL-4 Zellen nach Bindung des SDF-1 induziert wurde, gemessen.
EL-4 Zellen wurden in Dulbecco-modifiziertem Eagle's-Medium (D' MEM), zu dem 10% fötales Kalbserum (FCS) zugegeben wurde, in Anwesenheit oder Abwesenheit eines humanen SDF-1β (1, 10, 20, 40, 100 und 1000 ng/ml) kultiviert. Nach 6 Stunden Inkubation bei 37°C wurde CXCR4 auf der Zelloberfläche mit Fc-humanem SDF-1α-chimärem Protein und FITC-gebundenen Ziege-F(ab')₂-anti-humanem IgG (Southern Biotechnology Associates, Alabama, US) angefärbt. Eine Fluoreszenzintensitätsmessung wurde durch Fluorzytometrie (FACSCalibur, BECTON DICKINSON, Kalifornien, US) durchgeführt. Die Hunteruntermodulierung des CXCR4 wurde durch Berechnung des Prozentsatzes der Reduktion bei der Durchschnittsfluoreszenzintensität (MFI) des markierten CXCR4 gemessen. Die Ergebnisse sind in 1c gezeigt.
Aus 1c folgt, dass EL-4 Zellen, die mit humanem SDF-1β kultiviert wurden, bezüglich der CXCR4-Expression in einer Dosis-abhängigen Art heruntermoduliert werden. Die erhaltenen Ergebnisse waren in guter Übereinstimmung mit früheren Berichten (Hesselgesser et al. (Dokument 13) und Amara et al. (Dokument 14), das SDF-1α und β an CXCR4 mit Kd-Werten von 5 bis 10 nM bzw. 2,2 bis 3,6 nM binden.
(Beispiel 4: Spezifität der SDF-1-Messung durch TR-FIA)
Um die Spezifität des TR-FIA bezüglich SDF-1 zu bestimmen, wurden TR-FIA-Messungen, ähnlich zu denen, die in Beispiel 2 beschrieben wurden, für die folgenden verschiedenen Chemokine durchgeführt: CC-Chemokine (Maus MCP-1, humanes MIP-1α und β, humanes RANTES, humanes MDC), CXC-Chemokine (humanes IL-8, Maus-SDF-1α und Maus-SDF-1β, humanes SDF-1α und humanes SDF-1β), und ein CXXXC-Chemokin (humanes Fractalkin). Die Ergebnisse sind in 1d gezeigt. Es wurde kein signifikanter Anstieg bei der Fluoreszenzintensität bei ein einem anderen Chemokin als SDF-1 beobachtet. Somit wurde bestätigt, dass der zuvor genannte TR-FIA fähig ist, SDF-1 mit einer hohen Spezifität nachzuweisen. Eine Kreuzreaktivität zeigte sich zwischen humanem und Maus-SDF-1α und SDF-1β.
(Beispiel 5: Herstellung einer Plasmaprobe)
Die Plasmaproben, die in den folgenden Beispielen verwendet wurden, wurden aus dem Blut von 36 gesunden Freiwilligen (Japaner) im Alter zwischen 18 und 30 Jahren unter Verwendung von EDTA (1 mg/ml Blut) als Antikoagulanz hergestellt. Insbesondere wurde PBS, das 0,5 M EDTA enthielt, in eine Spritze, die mit 0,1 M EDTA beschichtet war, gefüllt, sodass 7 μl davon für jeden ml des gessmmelten Blutes vorhanden waren. Blut wurde in dieser Spritze gesammelt, bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert und dann bei 3000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, wobei das Plasma erhalten wurde. Die Plasmaproben wurden bei –80°C aufbewahrt und direkt vor der Verwendung 10-fach mit Pufferlösung 4 verdünnt, solange nicht anders angegeben ist. Es wurde sichergestellt, dass das Einfrieren/Auftauen vor dem Assay nicht wiederholt wurde.
(Beispiel 6: TR-FIA für Plasmaproben)
Für die Referenz-SDF-1 Lösung und die zuvor genannten Plasmaproben (erhalten aus 5 Individuen) wurde der in Beispiel 2 beschriebene TR-FIA durchgeführt. Die SDF-1-Konzentration in jeder Plasmaprobe wurde durch Vergleich gegen eine Kalibrierungskurve berechnet (d.h. ein Liniengraph, gezeigt mit schwarzen Kreisen auf der linken Seite der 2), die aus den Messungen für die Referenzlösungen erhalten wurde. Um des Weiteren die Genauigkeit der Messungen zu bestätigen, wurde eine Messung durch Zugabe von 0,4 oder 0,8 ng/ml Referenz-SDF-1 zu jeder Plasmaprobe durchgeführt und die Rückgewinnungsraten wurden berechnet.
Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten für die Plasmaproben, denen Referenz-SDF-1 zugegeben wurde, sind auf der rechten Seite der 2 gezeigt (unter der Überschrift "TR-FIA"). Die SDF-1 Konzentrationen und Rückgewinnungsraten der Plasmaproben vor und nach der Zugabe des Referenz-SDF-1 sind in Tabelle 1 unten gezeigt. Es wurde gezeigt, dass der TR-FIA es möglich macht, SDF-1 in Plasmaproben wie im Fall der Referenzlösung mit hohen Rückgewinnungsraten nachzuweisen.
(Vergleichendes Beispiel: DELFIA für SDF-1)
Die folgenden Messungsoperationen eines DELFIA wurden in Übereinstimmung mit den Anleitungen, die von den Herstellern zur Verfügung gestellt wurden (Amersham Pharmacia Biotech: ab hier "APB") durchgeführt, solange nicht anderweitig angegeben. Alle Waschungen wurden durch Verwendung von PBS/0,05% Tween 20 durchgeführt.
Eine Lösung von Kaninchen-anti-humanem-SDF-1β-Antikörper oder Ziege-anti-humanem-SDF-1β-Antikörper (jeweils 60 μl), die auf 10 μg/ml mit PBS herunterverdünnt wurden, wurde an eine transparente Maxisorp-Platte (Nunc, Dänemark) adsorbiert, bei 4°C für 24 Stunden inkubiert und danach einmal gewaschen. Als nächstes wurden 180 μl einer DELFIA-Assay-Pufferlösung (APB) bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten eingesetzt, um nicht-spezifische Bindung. zu blockieren.
Nachdem die Platte dreimal gewaschen worden war, wurde Referenz-SDF-1 mit der DELFIA-Assay-Pufferlösung verdünnt, oder 10-fach verdünnte Plasmaproben wurden in einer Menge von 50 μl pro Vertiefung zugegeben und bei 4°C für mindestens 6 Stunden inkubiert. Nachdem die Platte dreimal gewaschen worden war, wurden 100 μl Eu-markiertes Streptavidin (APB), das auf 20 ng/ml herunterverdünnt wurde, in die Assay-Pufferlösung zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Nachdem die Platte sechsmal gewaschen worden war, wurde eine DELFIA Sensibilisierungslösung (APB) zugegeben, sodass es dem Eu³⁺ erlaubt wurde, aus den Eu-markierten Antikörpern, die an die feste Phase gebunden waren, zu dissoziieren. Nachdem die Mikroplatte für 5 Minuten langsam geschüttelt wurde, wurde die Fluoreszenz mit einem zeitaufgelösten Fluorometer (ARVO 1420) gemessen.
Eine Kalibrierungskurve, die aus Messungen der Referenzlösung abgeleitet wurde, ist auf der linken Seite der 2 gezeigt, (d.h. ein Liniengraph, gezeigt mit schwarzen Quadraten). Die Nachweisgrenze wurde in Übereinstimmung mit der Gleichung, die in Beispiel 2 beschrieben ist, mit 130 pg/ml berechnet. DELFIA war in der Lage, SDF-1 in der Referenzlösung nachzuweisen, allerdings mit einer geringeren Sensitivität als durch TR-FIA. Jedoch wies keine der Messungen der Plasmaproben (von vier Freiwilligen) erfolgreich endogenes SDF-1 nach. Darüber hinaus waren die Rückgewinnungsraten bei den Messungen, die durch Zugabe von 1,0 ng/ml Referenz-SDF-1 zu jeder Plasmaprobe genommen wurden, um 20% oder weniger, was sehr viel geringer als die sind, die mit TR-FIA assoziiert sind.
Die Fluoreszenzintensitäten, die für die Plasmaproben gemessen wurden, zu denen das Referenz-SDF-1 zugegeben wurde, sind auf der rechten Seite der 2 gezeigt (unter der Überschrift "DELFIA"). Die SDF-1 Konzentrationen und Rückgewinnungsraten der Plasmaproben vor und nach der Zugabe des Referenz-SDF-1 sind in Tabelle 1 gezeigt. (Es sollte angemerkt werden, dass die Plasmaproben, die in 2 dargestellt sind und die Daten der Tabelle 1 alle einer vorherigen Erhitzung bei 55°C für 30 Minuten unterzogen wurden).
Tabelle 1 Rückgewinnungsraten für SDF-1, zugegeben zu humanem Plasma

< D.L.: unter der Nachweisgrenze (130 pg/ml)

(Beispiel 7: Einfluss von Antikoagulantien und Protease-Inhibitoren)
Es wird berichtet, dass Antikoagulantien und Protease-Inhibitoren die Messung von Zytokinen in humanen Plasmaproben beeinflussen (Thavasu et al. (Dokument 15)). Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die SDF-1-Messung durch TR-FIA durch solche Faktoren beeinflusst wird oder nicht.
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (1,0 mg/ml), Heparin (30 IU/ml), Natriumcitrat (0,38%) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (1,0 mg/ml) und Aprotinin (1 μg/ml), das ein Protease-Inhibitor ist, wurde zu Plasmaproben zugegeben. SDF-1 wurde in einer Art, die ähnlich zu Beispiel 2 ist, durch TR-FIA für jede Probe mit den Zugaben gemessen. Die Ergebnisse sind in 3a gezeigt. Es wurde bestätigt, dass Antikoagulantien und Protease-Inhibitoren die Plasma-SDF-1-Messungen durch TR-FIA nicht signifikant beeinflussen.
(Beispiel 8: Einfluss einer vorübergehenden Erhitzung der Plasmaproben)
In klinischen Anwendungen der SDF-1-Messung durch TR-FIA wird es notwendig sein, HIV-Viren zu inaktivieren, die in den Ursprungsblutproben existieren können. Demgemäß wurden die Einflüsse einer vorübergehenden Erhitzung der Plasmaproben auf den TR-FIA untersucht.
Als erstes wurden SDF-1-Referenzlösungen bei 0°C für 30 Minuten; 37°C für 30 Minuten, 55°C für 30 Minuten, 70°C für 30 Minuten oder 100°C für 1 Minute gehalten, um die thermale Stabilität des SDF-1 Proteins zu untersuchen und danach wurden sie einem Assay unterzogen. Unter den Bedingungen von 70°C für 30 Minuten und 100°C für 1 Minute wurde eine Verringerung in der nachgewiesenen Menge beobachtet, was höchstwahrscheinlich die Folge der thermalen Denaturierung des SDF-1 war. Auf der anderen Seite ergab eine Erhitzung bei 37°C oder 55°C für 30 Minuten im Wesentlichen dieselbe Kalibrierungskurve und beeinflusste die nachgewiesene Menge des SDF-1 nicht.
Basierend auf den obigen Ergebnissen wurden Plasmaproben von 24 Individuen (siehe Beispiel 5) verwendet, mit einer vorhergehenden Inkubation bei 55°C für 30 Minuten vor dem Assay oder ohne Erhitzung, um SDF-1 durch TR-FIA in einer Art, die Beispiel 2 entspricht, zu messen. (Die vorübergehende Erhitzung wurde vor der Verdünnung der Plasmaproben mit Pufferlösung 4 durchgeführt). Die Ergebnisse sind in 3b gezeigt. Die vorübergehende Erhitzung bei 55°C für 30 Minuten führte zu einer durchschnittlichen Steigerung der Fluoreszenzintensität von etwa 20%.
Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass zumindest ein Teil des SDF-1 in den Plasmaproben in Form von Multimeren und/oder in gebundener Form an einen Bindungsfaktor, welcher thermal dissoziiert, zersetzt, etc. wird, vorliegt. Es ist möglich, dass SDF-1, das in solchen Multimeren und/oder gebundenen Formen existiert, von der Bindung an ein Epitop abgehalten wird.
(Beispiel 9: Einfluss der Verdünnung auf Plasmaproben)
Eine vorhergehende Arbeit, die die Messung von IL-8 und MCP-1 Plasmaproben betraf (Thavasu et al. (Dokument 15) und Kajikawa et al. (Dokument 16)), hat gezeigt, dass die Menge der vorhandenen Chemokine in Messungen von nicht-verdünnten Proben unterschätzt wird. Demgemäß haben wir die Einflüsse der Verdünnung von Plasmaproben auf die SDF-1 Messung durch TR-FIA untersucht.
Plasmaproben von 5 Individuen, die in Pufferlösung 4 mit verschiedenen Verhältnissen von 1 : 1 bis 1 : 20 verdünnt wurden, wurden verwendet, um SDF-1 mittels TR-FIA in einer ähnlichen Art wie Beispiel 2 zu messen. Die Ergebnisse sind in 3c gezeigt. Eine beträchtliche stetige Verbesserung der Nachweissensitivität wurde beobachtet, während das Verdünnungsverhält nis von 1 auf 10-fach gesteigert wurde. Auf der anderen Seite gab es keine Verbesserung der Nachweissensitivität wenn das Verdünnungsverhältnis von 10-fach auf 20-fach gesteigert wurde. Daher wurde eine 10-fach Verdünnung (d.h. 10 Teile Pufferlösung 4 auf 1 Teil Plasmaprobe) als die am meisten effektive Bedingung bestimmt.
(Beispiel 10: Einflüsse der Zugabe von Blutzellen zu den Plasmaproben)
Es wurde berichtet, dass die Zugabe von IL-8 und MCP-1 zu Vollblut dazu führt, dass diese Chemokine durch die Blutzellen absorbiert wurden (Amara et al. (Dokument 14), Darbonne et al. (Dokument 17) und Neote et al. (Dokument 18)). Wir haben untersucht, ob eine ähnliche Absorption durch Blutzellen für SDF-1 beobachtet wurde oder nicht.
Plasma wurde als 125 μl Überstandfraktion erhalten, indem man 250 μl Vollblut so in eine Mikrozentrifuge einsetzte, dass die Zellen sich abzusetzen konnten. IL-8, MCP-1 oder SDF-1 wurde zu den 125 μl Plasma zugegeben, sodass eine vorbestimmte Endkonzentration erhalten wurde. Als nächstes wurde das Plasma, zu dem diese Chemokine zugegeben wurden, mit Zellpellets, die in 125 μl Volumen vorlagen, oder mit 125 μl Plasma gemischt und danach bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. Als nächstes wurde es den Zellen (wie bei den Proben, in denen die Zellpellets gemischt wurden) erlaubt, sich nach Zentrifugation abzusetzen, und sie wurden isoliert. Das lösliche IL-8 und MCP-1 innerhalb der Proben wurde mit ELISA quantifiziert und das SDF-1 wurde durch TR-FIA quantifiziert. Die Ergebnisse sind in den 4a bis 4c gezeigt.
Das Meiste des zugegebenen IL-8 und MCP-1 wurde durch die Blutzellen absorbiert (4a und 4b). Auf der anderen Seite war die Reduktion des SDF-1 nach Inkubation mit Blutzel len weniger als 10% (4c). In einem anderen Experiment wurde SDF-1 direkt zu Vollblut zugegeben; nach einer Inkubation wurden die Blutzellen isoliert; und danach wurde ein TR-FIA Quantifizierung durchgeführt; die keine signifikanten Unterschiede im Vergleich mit den Kontrollen zeigte, die durch Zugabe von SDF-1 zu Plasma erhalten wurden (die Daten sind nicht gezeigt). Aus dem oben Genannten wurde bestätigt, dass SDF-1 nur geringfügig durch Blutzellen absorbiert wird.
(Beispiel 11: TR-FIA in Plasmaproben – multipler Nachweis)
Für Plasmaproben aus 36 Individuen wurde SDF-1 durch TR-FIA auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 2 gemessen, nach einer vorübergehenden Erhitzung bei 55°C für 30 Minuten (siehe Beispiel 7). Die Ergebnisse sind in 5c gezeigt. Die Menge an SDF-1 in humanem Plasma zeigt einen Durchschnittswert und eine Standardabweichung von 0,85 ± 0,26 ng/ml.
Die Messungen wurden wiederholt für Plasmaproben derselben (drei) Individuen unter denselben Bedingungen an vier oder mehr verschiedenen Tagen durchgeführt, wobei die Messungswerte Fluktuationen innerhalb von 10 bis 20% zeigten. Es wurde gezeigt, dass die Plasma-SDF-1 Messung durch TR-FIA eine ausreichend hohe Verlässlichkeit hat.
(Beispiel 12: Assoziierung von SDF-1 mit IgG in Plasmaproben)
Wie für IL-8 und MCP-1 wurden die Möglichkeiten der Bindung oder Assoziierung mit Autoantikörpern innerhalb des zirkulatorischen Systems als ein weiterer Faktor berichtet, der Immunoassays für Plasmaproben behindern könnte (Leopard et al. (Dokument 1) und Thavasu et al. (Dokument 15)). In der folgenden Art wurde SDF-1 bezüglich der Assoziierung mit IgG im Plasma untersucht.
Plasmaproben von 7 Individuen, wurden ohne Erhitzung oder nach einer Hitzebehandlung (55°C, 30 Minuten) auf Eis mit Protein-G-Sepharose für 30 Minuten inkubiert, wobei IgG vermindert wurde. Die Proben wurden zentrifugiert und es wurden Überstandfraktionen derselben genommen. Das SDF-1 in dem Überstand wurde durch TR-FIA gemessen. Die Rate der Verminderung der Fluoreszenzintensität relativ zu den Messungswerten für die Plasmaproben vor der Protein-G-Sepharose Behandlung wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
In 6 stellen die schraffierten Balken und schwarzen Balken nicht-erhitzte Proben bzw. erhitzte Proben dar. Es ist zu erkennen, dass die nicht-erhitzten Proben zugänglicher für den Einfluss der Protein-G-Sepharose Behandlung sind als die erhitzten Proben. In den nicht-erhitzten Proben sank die die durch TR-FIA meßbare SDF-1-Menge um 23 auf 37% (ein Durchschnitt von 30%) als Folge der Verminderung des IgG. Auf der anderen Seite war die entsprechende Verminderung für die erhitzten Proben 6 bis 22% (ein Durchschnitt von 15%). Somit können die Effekte der vorübergehenden Erhitzung (3b), die in Beispiel 8 gezeigt sind, durch die Hypothese erklärt werden, dass ein Teil des SDF-1 in den Plasmaproben in einer assoziierten Form mit IgG existiert, welches durch die Erhitzung dissoziiert, sodass es in eine lösliche Form umgewandelt wird, die durch TR-FIA messbar ist.
In einem anderen Experiment wurde keine signifikante Verminderung des Referenz-SDF-1, welches zu den Plasmaproben selbst nach einer Protein-G-Sepharose Behandlung zugegeben wurde, beobachtet (diese Daten sind nicht gezeigt). Somit konnte die Möglichkeit, das SDF-1 selbst an Protein-G-Sepharose adsorbiert wird, und die Möglichkeit, dass andere Antikörper oder Proteine als anti-SDF-1-IgG in den Plasmaproben an die Protein-G-Sepharose adsorbiert werden, und dass SDF-1 an solche Antikörper oder Proteine adsorbiert wird, verneint werden.
Aus den obigen Ergebnissen ist verständlich, dass die durch TR-FIA meßbare Menge an SDF-1 in humanem Plasma sehr nahe an der physiologischen SDF-1-Menge liegt, die tatsächlich im Blut vorhanden ist.
(Beispiel 13: TR-FIA für GM-CSF)
Eine Referenzlösung von GM-CSF (50 μl) wurde einer Festphasenfluoreszenzmessung in der gleichen Art wie in Beispiel 2 unterzogen, mit Ausnahme der Verwendung eines monoklonalen antihumanen-GM-CSF-Antikörpers als Einfang-Antikörper und Verwendung eines biotinylierten monoklonalen anti-humanen-GM-CSF-Antikörpers (erhalten durch Biotinylierung des zuvor genannten humanen Antikörpers von PharMingen durch Befolgen herkömmlicher Verfahren), und eine Kalibrierungskurve wurde für das Referenz-GM-CSF erzeugt. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Des Weiteren wurden Plasmaproben aus gesunden japanischen Freiwilligen durch ein Verfahren, das ähnlich zu dem des Beispiels 5 ist, hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben in Pufferlösung 4 verdünnt und einer GM-CSF-Messung durch TR-FIA in der gleichen Art wie für die Referenzlösung unterzogen. Als Ergebnis war eine hochsensitive Messung auch für GM-CSF möglich und die exzellenten Ergebnisse wurden, soweit reproduzierbar, bestätigt.
(Beispiel 14: TR-FIA für IL-2)
Eine Referenzlösung von IL-2 (50 μl) wurde einer Festphasenfluoreszenzmessung ähnlich wie in Beispiel 2 unterzogen, mit Ausnahme der Verwendung eines monoklonalen anti-humanen-IL-2-Antikörpers als Einfang-Antikörper unter Verwendung eines biotinylierten monoklonalen anti-humanen-IL-2-Antikörpers (erhalten durch Biotinylierung des zuvor genannten PharMingen humanen Antikörpers durch Befolgen herkömmlicher Verfahren), und eine Kalibrierungskurve für Referenz-IL-2 wurde erzeugt. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Des Weiteren wurden Plasmaproben aus gesunden japanischen Freiwilligen durch ein Verfahren, das dem des Beispiels 5 gleicht, hergestellt, wie in Beispiel 9 beschrieben in Pufferlösung 4 verdünnt, und einer IL-2 Messung durch TR-FIA in der gleichen Art wie für die Referenzlösung unterzogen. Als Ergebnis war eine hochsensitive Messung auch für IL-2 möglich und die exzellenten Ergebnisse wurden, soweit reproduzierbar, bestätigt.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Es wird ein zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Verfahren zur Verfügung gestellt, das in der Lage ist, Chemokine, einschließlich SDF-1, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit sehr hoher Sensitivität bei einfacher Verwendung nachzuweisen, ebenso wie ein Kit für dieses Verfahren. Das Verfahren und das Kit sind auf Chemokine anwendbar, die als lösliche Faktoren im Blutkreislauf vorkommen, in winzigen Mengen eine biologische Aktivität aufweisen und an verschiedenen Pathologien beteiligt sind.
Referenzen:

1. Leonard, E.J. et al., (1996) METHODS 10:150–157.
2. Kropf, J. et al., (1991) Anal. Biochem. 197:258–265.
3. Ogata, A. et al., (1992) J. Immunol. Methods 148:15–22.
4. Yuan, J. et al., (1997) Anal. Biochem 254(2):283–287.
5. Yuan, J. et al., (1998) Anal. Chem 70(3):596–601.
6. Tashiro, K. et al., (1993) Science 26:600–603.
7. Bleul, C.C. et al., (1996) Nature 382:635–638.
8. Oberlin, E. et al., (1996) Nature 382 :829–833.
9. Winkler, C. et al., (1998) Science 279:389–393.
10. Martin, M.P. et al., (1998) Science 282:1907–1911.
11. Zou, Y-R. et al., (1998) Nature 393:595–599.
12. Tachibana, K. et al., (1998) Nature 393:591–594.
13. Hesselgesser, J. et al., (1998) J. Immunol. 160:877–883.
14. Amara, A. et al., (1997) J. Exp. Med., 186:139–146.
15. Thavasu, P.W. et al., (1992) J. Immunol. Methods 153:115–124.
16. Kajikawa, 0. et al., (1996) J. Immunol. Methods 197:19–29.
17. Darbonne, W.C. et al., (1991) J. Clin. Invest. 88:1362–1369.
18. Neote, K. (1994) Blood 84:44–52.

Claims

Zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Verfahren zum Nachweis eines Zytokins in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, Schritte umfassend, bei denen man: aus (a) einem ersten Antikörper, der einen an eine feste Phase gebundenen Teil und einen Bereich, der an ein Chemokin binden kann, umfasst; (b) dem Chemokin; (c) einem zweiten Antikörper, der einen Bereich umfasst, der an das Chemokin binden kann, sowie einen Teil, an den Biotin gebunden ist; (d) einem Konjugat, das Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil umfasst, der in der Lage ist, von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert zu werden; und (e) dem Lanthanoid-Metallion eine Zusammensetzung bildet, wobei die Zusammensetzung auf einer festen Phase gebildet wird; und die Fluoreszenz des fluoreszierenden Strukturteils bestimmt, der von dem Lanthanoid-Metallion komplexiert wurde, wobei das Zytokin ein Zytokin aus der Familie der Chemokin ist, wobei der fluoreszierende Strukturteil durch die allgemeine Formel (1) dargestellt wird: -R-Ar-C(=O)-CH2-C(=O)-CnF2n-X (I)in der R eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit dem Protein zu bilden; Ar eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, die ein konjugiertes Doppelbindungssystem aufweist; n eine ganze Zahl ist, die gleich oder größer als 1 ist; und X ein Fluoratom oder eine Gruppe ist, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird: -C(=O)-CH2-C(=O)-Ar-R- (II).
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Lanthanoid-Metallion Europium ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der fluoreszierende Strukturteil durch die allgemeine Formel (III) dargestellt wird: -R-Ar-(C(=O)-CH2-C(=O)-CnF2n)2 (III),in der R, Ar und n dieselben Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben.
Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem der fluoreszierende Strukturteil 4,4'-Bis(1'',1'',1'',2'',2'',3'',3''-heptafluor-4'',6''-hexandion-6''-yl)-sulfo-o-terphenyl ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem 10 bis 60 Einheiten des fluoreszierenden Strukturteils pro Molekül Streptavidin oder Avidin in dem Konjugat vorliegen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt der Fluoreszenzmessung durchgeführt wird, ohne es der auf der festen Phase gebildeten Zusammensetzung zu erlauben, zu dissoziieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt der Fluoreszenzmessung durchgeführt wird, nachdem es der auf der festen Phase gebildeten Zusammensetzung erlaubt wurde, zu dissoziieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Zytokin ein CXC-Chemokin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem das Zytokin stromaler Zell-abgeleiteter Faktor-1, SDF-1, ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Probe einer biologischen Flüssigkeit Plasma oder Vollblut ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner Schritte umfassend, bei denen man vor dem Schritt der Bildung der Zusammensetzung eine Verdünnung der Probe der biologischen Flüssigkeit mit einer Pufferlösung durchführt, welche für die Verdünnung der Probe benutzt wird, wobei die für die Verdünnung der Probe benutzte Pufferlösung 0,01 bis 1,0 M Tris-Salzsäure mit einem pH von 7,3 bis etwa 8,3 ist, die Pufferlösung 0,1 bis 0,3% bovines Serumalbumin, 0,05 bis 0,2% Natriumazid und 0,5 bis 1,5 Natriumchlorid enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man ferner vor dem Schritt der Bildung der Zusammensetzung einen Schritt ausführt, bei dem die Probe der biologischen Flüssigkeit einer Hitzebehandlung unter für das Zytokin nicht-denaturierenden Temperaturbedingungen unterworfen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, ferner Schritte umfassend, bei denen man vor dem Schritt der Fluoreszenzmessung einen Schritt durchführt, bei dem die auf der festen Phase gebildete Zusammensetzung mit einer Pufferlösung gewaschen wird, wobei die für das Waschen der Zusammensetzung verwendete Pufferlösung eine 0,01 bis 0,1 M Tris-Salzsäure ist, deren pH-Wert 8,5 bis etwa 9,5 ist, und die Pufferlösung 0,01 bis 0,1% Polyoxyethylensorbitanmonolaurat enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die feste Phase eine Mikrotiterplatte ist, die eine Adsorptionsfähigkeit für IgG von 50 bis 200 ng/cm² aufweist.
Kit für ein zeitaufgelöstes Fluorimmunoassay (TR-FIA)-Verfahren zur Bestimmung eines Zytokins in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend: einen ersten Antikörper, der einen an eine feste Phase gebundenen Teil und einen Bereich, der an ein Chemokin binden kann, umfasst; einen zweiten Antikörper, der einen Bereich umfasst, der an das Chemokin binden kann, sowie einen Teil, an den Biotin gebunden ist; ein Konjugat, das Streptavidin oder Avidin und einen fluoreszierenden Strukturteil umfasst, der von einem Lanthanoid-Metallion komplexiert werden kann; und das Lanthanoid-Metallion; wobei das Zytokin ein Zytokin ist, das zur Familie der Chemokine gehört, wobei der fluoreszierende Strukturteil durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird: -R-Ar-C(=O)-CH2-C(=O)-CnF2n-X (I)in der R eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit dem Protein zu bilden; Ar eine Kohlenwasserstoffgruppe ist, die ein konjugiertes Doppelbindungssystem aufweist; n eine ganze Zahl gleich oder größer als 1 ist; und X ein Fluoratom oder eine Grup pe ist, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird: -C(=O)-CH2-C(=O)-Ar-R- (II).