DE3881223T2 - Mit der faehigkeit zur lokalisation von objekten ausgestattete liposomen und ihre verwendung in einem immunoassay. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft Immunoassay-Verfahren, und insbesondere Empfängerliposome, die in solchen Verfahren brauchbar sind.
• Der Assay von zellgebundenen Antigenen und insbesondere Zelloberflächen-Antigenen macht es möglich, z.B. Veränderungen in Zelloberflächen oder die Anwesenheit abnormaler Zellen zu bestimmen, was ein Anzeichen für einen spezifischen pathologischen Zustand sein kann, z.B. eine Autoimmunkrankheit, wie z.B. eine hämolytischen Krankheit eines Neugeborenen oder eine Immunthrombozytopenie.
• Es ist bekannt, Zelloberflächen-Antigene durch Immunofluoreszenz-Markierung zu bestimmen. Für diesen Zweck wurde ein Fluoreszenzmarker mit einem Antikörper konjugiert. Bei der direkten Fluoreszenzmarkierung wird ein Antikörper, der spezifisch für das Zelloberflächen-Antigen ist, verwendet, und dieser Antikörper wird selbst an den Fluoreszenzmarker gebunden. Bei der indirekten Fluoreszenzmarkierung wird ein nicht markiertes Immunoglobulin (insbesondere ein monoklonaler Antikörper), der spezifisch für das Zelloberflächen-Antigen ist, verwendet, und der Fluoreszenzmarker wird an ein Anti-Immunoglobulin gebunden, das für das nicht markierte Immunoglobulin spezifisch ist. Die indirekte Methode erlaubt eine gewisse Verstärkung des Signals, weil mehr als ein fluoreszierender Anti-Immunoglobulin-Antikörper sich an jedes zellgebundene Immunoglobulin-Molekül anlagern kann. Es ist normalerweise jedoch nur möglich, einige wenige fluoreszierende Moleküle an jedes Anti-Immunoglobulinmolekül anzulagern. Bei einem IgG Anti-Immunoglobulin ist es z.B. nur möglich, vier Moleküle des Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Markers anzulagern.
• Im Assay auf zellgebundene Antigene sind Liposome verwendet worden, z.B. durch Bindung eines Markers an Liposome und nachfolgende Anlagerung der markierten Liposome an einen Antikörper, der auf das zu bestimmende oder zu messende Antigen spezifisch ist. Der verwendete Marker kann z.B. ein Radioisotop oder eine fluoreszierende Verbindung sein. Die Menge an Marker, die mit jedem Liposom assoziiert werden kann, und damit mit jedem zu bestimmenden Antigen, ist größer, als sie erreicht werden könnte, wenn keine Liposomen verwendet werden, und der Marker direkt mittels der vorstehend beschriebenen Methoden an den Antikörper gebunden wird. Dies ist insbesondere im Falle einer Fluoreszenzmarkierung von Vorteil, wo der Grad der erreichbaren Sensitivität durch die Zahl der fluorophoren Moleküle begrenzt wird, die an einen Antikörper gebunden werden können.
• In einer veröffentlichten Beschreibung der Verwendung von markierten Liposomen ist der Marker eine fluoreszierende Verbindung (J. Immunol Methods 46 (1981) 141-151), und der an die Liposomen gebundene Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper, der für ein bestimmtes Mausantigen (H-2k) spezifisch ist. In diesem Fall wird angegeben, daß die erreichte Markierung 4-6 mal größer ist als mit einer Standard-Immunofluoreszenzmarkierung. Obgleich diese Methode eine hohe Sensitivität erreicht, ist sie jedoch hochspezifisch, da die markierten Liposome sich nur an Mäusezellen vom H-2k-Typ anlagern können.
• In einer zweiten veröffentlichten Arbeit (Nature 288, 11. Dezember 1980, Seite 602-604) wird Protein A an fluoreszierende Liposome angelagert, wodurch die letzteren spezifisch an menschliche Zellen gerichtet werden, die vorher mit Anti-Human β&sub2;-Mikroglobulin-Antikörper inkubiert wurden, aber auch hier ist die Spezifität wieoer hoch, weil das Protein A nur an ganz bestimmte Klassen von Antikörpern bindet.
• Die EP-A-196 880 beschreibt Beutel, insbesondere Vesikel, die einen bestimmbaren Marker einschließen und ihre Verwendung in einem Assay für einen Analyt. Es werden fluoreszierend markierte Liposome beschrieben, die Konzentration der in den Liposomen enthaltenden fluoreszierenden Verbindung ist jedoch selbstlöschend, d.h. die fluoreszierende Verbindung muß aus den Liposomen freigesetzt werden, um bestimmbar zu sein.
• Die EP-A-201 211 beschreibt die Verwendung lumineszierender polymerer Mikrokügelchen zur Bestimmung von Analyten in biologischen Fluiden und anderen Proben. Sie enthält keine Beschreibung der Verwendung von Liposomen für diesen Zweck.
• Liposome, die einen Fluoreszenzmarker tragen, der an ein Zielagens, wie z.B. Protein A oder einen monoklonalen Antikörper, gekoppelt ist, haben nur eine begrenzte Brauchbarkeit, da die Analyten, die potentiell bestimmt oder gemessen werden können, beschränkt sind. Es ist deshalb wünschenswert, ein Markierungsverfahren zu entwickeln, das allgemeiner anwendbar ist, aber nicht weniger empfindlich ist, damit die Empfängerliposome, die einen Marker tragen, verwendet werden können, um eine große Vielzahl von Analyten zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Reagens bereit, das diese Aufgabe löst.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein biologisches Reagens bereit, das ein Liposom umfaßt, das eine fluoreszierende Verbindung enthält, und ein zweites Bindungsagens (wie nachfolgend definiert), das an die Oberfläche des Liposoms kovalent gebunden ist, und worin das Liposom die fluoreszierende Verbindung in einer Konzentration enthält, die dem Reagens maximale Fluoreszenz verleiht, wenn die Verbindung innerhalb des Liposoms zurückgehalten wird. Dieses biologische Reagens kann als Marker bei einem System verwendet werden, das besteht aus (1) einem Träger mit einem daran gebundenen Material, (2) einem ersten Bindungsagens (wie nachfolgend definiert) und (3) dem erfindungsgemäßen biologischen Reagens, in dem das zweite Bindungsagens (wie nachstehend definiert) eine spezifische Affinität für das erste Bindungsagens besitzt.
• Der hier verwendete Ausdruck "erstes Bindungsagens" bedeutet eine Spezies, die spezifisch mit sowohl dem trägergebundenen biologischen Material als auch dem zweiten, wie nachstehend definierten Bindungsagens reagieren kann. Der hier verwendete Ausdruck "zweites Bindungsagens" bedeutet eine Spezies, die an die markierten Liposome des Komplexes des biologischen Materials plus erstes Bindungsagens anlagert, indem es spezifisch mit dem ersten Bindungsagens kuppelt und nicht mit dem biologischen Material selbst. Das biologische Reagens ist deshalb für das erste Bindungsagens spezifisch, während das letztere spezifisch für das trägergebundene biologische Material ist. Die Menge an Marker, der an den Träger gebunden ist, hängt deshalb von der Menge des vorhandenen biologischen Materials und von der Menge des ersten Bindungsagens ab. Von diesen beiden bestimmt die Substanz, die in geringerer Menge vorhanden ist, die Menge des Markers, der an den Träger fixiert wird. Abhängig von den Bedingungen seiner Verwendung kann das erfindungsgemäße Reagens deshalb verwendet werden, um entweder das trägergebundene biologische Material oder das erste Bindungsagens zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere brauchbar im Hinblick auf die Bestimmung des trägergebundenen biologischen Materials selbst, das z.B. ein Zelloberflächen-Antigen sein kann. In geeigneten Fällen kann sie jedoch auch verwendet werden, um das erste Bindungsagens zu bestimmen, z.B. in einer Autoimmunkrankheit, wo Antikörper, die sich spontan an Zelloberflächen-Antigene anlagern, die zu bestimmenden Spezies sind.
• Obwohl die folgende Beschreibung sich größtenteils auf bevorzugte Ausführungsformen bezieht, in denen das trägergebundene biologische Material der Analyt ist, ist es klar, daß im wesentlichen die gleiche Technik in Fällen angewandt werden kann, in denen der Analyt das erste Bindungsagens ist.
• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erste Bindungsagens ein Maus-monoklonaler Antikörper, der spezifisch für das zellgebundene Antigen ist, das der zu bestimmende Analyt ist. Das zweite Bindungsagens, das kovalent an Liposome gebunden ist, die vorzugsweise Carboxyfluorescein oder eine ähnliche fluoreszierende Verbindung enthalten, ist dann ein Antikörper, z.B. von Schaf oder Ziege, der spezifisch für Mausimmunoglobulin ist.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Erhöhung der Zahl fluoreszierender Moleküle dar, die mit jedem Immunoglobulin (Ig)-Molekül assoziiert sein können, und deshalb eine hervorragende Sensitivität besitzt. Erfindungsgemäß hergestellte Liposome, die eine fluoreszierende Verbindung enthalten, sind hochfluoreszent und behalten auch nach einigen Monaten Lagerung sowohl ihre Fluoreszenz als auch ihre Antikörper-Empfängereigenschaft. Obgleich die Erfindung hier unter besonderer Bezugnahme auf die Verwendung von Fluorescein als Marker beschrieben wird, können Liposome auch andere Fluorophore, z.B. Phycoerythrin, einschließen.
• Zur Herstellung der Liposome kann eine Vielzahl von Lipiden verwendet werden, aber es sollten solche Merkmale wie der Grad der Sättigung, die Übergangstemperatur und die Fettsäureacyl-Kettenlänge berücksichtigt werden. Der Einschluß von Cholesterin im Fett ist wünschenswert, um die Membranpermeabilität zu verringern. Es ist auch notwendig, ein geeignetes Lipid einzuschließen, das als Anker für die kovalente Bindung des zweiten Bindungsagens wirkt.
• Irgendein Ankerlipid, das in den Liposomen vorhanden ist, sollte ähnliche Eigenschaften haben wie die des Strukturlipids, und auch eine reaktive Gruppe zur Proteinkupplung besitzen. Phosphatidylethanolamin (P.E.) hat z.B. eine terminale Aminogruppe, die mit dem heterobifunktionellen Agens N-Hydroxysuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) substituiert werden kann, um PE-3-(2-Pyridyldithio)-propionat (PE-DTP) zu ergeben. Diese Umsetzung wird vor der Bildung der Liposome durchgeführt.
• Im allgemeinen sind Lipide bevorzugt, die neutral und vollständig gesättigt sind, und einen Schmelzpunkt von oberhalb 37ºC haben. Bevorzugte Lipide und ihre bevorzugten relativen Anteile, die sich als brauchbar erwiesen haben, sind die folgenden: Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) 66%; Cholesterin 33%; Dipalmitoylphosphaditylethanolamin-DTP (DPPE-DTP) 1%.
• Die Liposome können auf bekannte Weise, z.B. wie folgt, hergestellt werden. Die Lipide werden in einer Chloroform- Methanol-Mischung gelöst und mittels Rotationsverdampfung an die Wand eines Rundkolbens aufgebracht. Lösungsmittelspuren werden durch Gefriertrocknung entfernt. Dann wird eine wässerige Lösung eines wasserlöslichen Fluoreszenzfarbstoffes zugegeben. Die Konzentration des Farbstoffes kann innerhalb weiter Grenzen variieren, aber eine ca. 20 mmolare Konzentration an Carboxyfluorescein (CF) als Natriumsalz ergibt die maximale Fluoreszenz für diese Verbindung. Die Lipide werden mit dar wässerigen Komponente durch Verwirbeln hydratisiert, bis das gesamte Lipid von den Wänden des Gefäßes aufgenommen ist. Die Suspension wird dann in die Kammer eines Sondensonikators gebracht, der einige Grade oberhalb der Übergangstemperatur des Lipids gehalten wird. Die Beschallung wird dann nach der optischen Klärung der Suspension ca. 30 Minuten lang fortgesetzt. Die Liposomendispersion wird bei 1000 g zentrifugiert, um Bruchstücke von der Wolframsonde zu entfernen, und kann einige Stunden abkühlen gelassen werden. Uneingekapseltes CF wird durch Filtration an einer kleinen Säule, die mit Sephadex G50 bestückt ist, entfernt, und die Liposomen sind dann zur Kupplung mit dem Antikörper fertig.
• Gereinigter Antikörper wird mit dem gleichen Vernetzungsmittel (SPDP) als Ankerlipid umgesetzt und dann durch milde Reduktion mit Dithiothreitol aktiviert. Die Reaktionsteilnehmer werden in jeder Stufe durch Gelfiltration abgetrennt. Der aktivierte Antikörper wird sofort mit den Liposomen gemischt und bei Raumtemperatur während 24 Stunden kuppeln gelassen. Ungekuppeltes Protein wird durch Gelfiltration entfernt, und die Liposom-Antikörper-Komplexe werden durch Hindurchgehenlassen durch ein 0.45 um- Filter sterilisiert und vor Licht geschützt bei 4ºC gelagert.
• Dieses Verfahren ergibt die Synthese kleiner unilamellarer Vesikel (SUV), die stabiler sind als andere Formen von Liposomen, wie z.B. multilamellare Vesikel (MLV) oder Liposome, die mittels der Umkehrphasenmethode (REV) hergestellt wurden. Diese anderen Liposomenformen haben ein größeres einkapselndes Volumen als SUV und können für spezielle Anwendungen nützlich sein. Das Verfahren zur Bestimmung der maximalen Fluoreszenzkonzentration und zur Anlagerung des Anti-Immunoglobulin-Antikörpers an die Liposomen ist jedoch das gleiche.
• Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines trägergebundenen biologischen Materials oder eines dazu komplementären ersten Bindungsagens (wie vorstehend definiert) umfaßt die Inkubierung eines Konjugates des biologischen Materials und des ersten Bindungsagens mit einem Überschuß des biologischen Reagens, das ein Liposom umfaßt, in das ein fluoreszierender Marker, wie vorstehend beschrieben, eingebaut wurde, und einem zweiten Bindungsagens (wie vorstehend definiert), das an das Liposom kovalent gebunden ist; Abtrennung des ungebundenen Überschusses des Reagens vom Konjugat, das die Liposomen daran gebunden enthält; und schließlich die Feststellung des gebundenen und/oder ungebundenen Markers im intakten Liposom.
• In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das biologische Material Zelloberflächen-Antigene an Lymphozyten und das erste Bindungsagens ist ein Maus-monoklonaler Antikörper für die Lymphozyten. Das biologische Reagens kann dann Mausantikörper, der kovalent an Liposomen gebunden ist, die eine wasserlösliche Verbindung von Carboxyfluorescein als Fluorophor enthalten, umfassen.
• Die breite Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch eine weitere bevorzugte Ausführungsform gezeigt, in der das trägergebundene biologische Material DNA- oder RNA-Fragmente umfaßt, die, nach Gelelektrophorese, an Nitrocellulose oder ein chemisch reaktives Papier "Blot"-übertragen wurden. In dieser Ausführungsform ist das erste Bindungsagens eine DNA- oder RNA-Sonde, die kovalent an Biotin oder Avidin gebunden ist. Nach Inkubation dieses Agens mit dem Analyt wird das erfindungsgemäße biologische Reagens zugegeben, das aus Avidin bzw. Biotin als zweites Bindungsagens, das an die fluoreszierenden Liposome gebunden ist, besteht. Nach Entfernung tLes Überschusses des biologischen Reagens wird das Vorhandensein des Analyten durch eine Fluoreszenzbande im Gelelektrophorese- Profil angezeigt.
• Mit diesem Verfahren können nach Gelelektrophorese auch spezifische Polypeptide bestimmt werden; sie werden auf Nitrocellulose aufgebracht, und dann inkubiert, zuerst mit einem Antikörper, der daran gebunden Biotin oder Avidin enthält. Avidin- bzw. Biotin-tragende fluoreszierende Liposome werden dann zugegeben und die Polypeptide nach Entfernung des Überschusses des biologischen Reagens durch Fluoreszenz bestimmt.
• Ein mit der Verwendung von fluoreszenzmarkierten Liposomen als biologische Reagentien verbundener Nachteil ist die Fluoreszenzlöschung, die den Grad der Empfindlichkeit des Reagens stark beschränken kann.
• Das erfindungsgemäße biologische Reagens wird durch die Verwendung der ganz bestimmten Konzentration an Fluoreszenzverbindung, die dem Reagens eine maximale Fluoreszenz verleiht, wenn der Fluorophor innerhalb des Liposoms zurückgehalten wird, optimal empfindlich gehalten. Die Bestimmung dieser optimalen Konzentration wird im nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben. Es wurde auch gefunden, daß eine solche Verstärkung des Fluoreszenzsignales nicht auch einen entsprechenden Anstieg der Hintergrundfluoreszenz ("Geräusch") bewirkt, wie dies in Beispiel 2 gezeigt wird.
• Dieses größere Verhältnis von Signal zu Geräusch ergibt zusammen mit der vorstehend beschriebenen optimalen Fluorophorkonzentration einen Vorteil des erfindungsgemäßen biologischen Reagens in Assays, in denen der Analyt mittels bekannter Standardverfahren teilweise oder vollständig unbestimmbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das die Bestimmung von Zelloberflächen-Antigenen umfaßt, hat es sich z.B. gezeigt, daß es möglich ist, die Gegenwart bestimmter Antigene, die durch andere Fluoreszenzverfahren nicht bestimmt werden können, festzustellen.
• Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige erfindungsgemäße Aspekte.
Beispiel 1
• Dieses Beispiel zeigt, wie die maximale Fluoreszenzkonzentration des Fluorophors bestimmt wird. Aufgrund des Effektes der Selbstlöschung ergibt die Erhöhung der Fluorophorkonzentration einen Spitzenwert, nach dem eine weitere Erhöhung eine Verringerung der Fluoreszenz verursacht. Für jeden Fluorophor kann deshalb die optimale Konzentration durch eine Familie von Liposomen bestimmt werden, die mit Ausnahme der Konzentration des eingeschlossenen Fluorophors sonst in jeder Hinsicht identisch sind. Die Tabelle 1 zeigt die Fluoreszenzwerte einer solchen Familie, die verschiedene Konzentrationen des Fluorophors Carboxyfluorescein (CF) enthält: Tabelle I Konzentration an Carboxyfluorescein in den Liposomen Fluoreszenz- Einheiten vor Zugabe von Triton nach Zugabe von Triton
• Für dieses Fluorophor wird deshalb eine eingekapselte Konzentration von ca. 20 mM CF gewählt.
Beispiel 2
• Dieses Beispiel zeigt, wie eine Zelle, die durch konventionelles Anfärben leicht bestimmbar ist, erfindungsgemäß sogar noch deutlicher dargestellt werden kann. 2 x 10&sup5; periphere Blutlymphozyten wurden in Mikrotiter-Vertiefungen abgelagert. 50 ul einer 2.5 ug/ml-Lösung von UCHT1 monoklonaler Antikörper, der für bestimmte Oberflächen-Antigene, die an Lymphozyten vorhanden sind, spezifisch ist, wird während 30 Minuten zugefügt, wonach die Zellen dreimal mit Kulturmedium gewaschen wurden. 50 ul einer gesättigten Lösung von FITC-markiertem Schaf Anti-Maus Immunoglobulin (SαM-FITC) oder 50 ul kleiner unilamellarer Liposomen, die mit Schaf Anti-Maus Immunoglobulin (SαM-SUV) gekuppelt waren, wurden zugegeben und die Zellen wurden 30 Minuten inkubiert, und danach dreimal gewaschen. Alle Inkubationen und Waschungen wurden bei 4ºC durchgeführt. Die Zellen wurden in kleine Kunststoffröhrchen überführt und mittels Durchflußzytometrie untersucht. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: Tabelle II % positive Zellen durchschnittliche Zellfluoreszenz (Hintergrund) Zellen
• Dies zeigt einen siebenfachen Anstieg der Leuchtkraft der mit Liposomen angefärbten Zellen im Vergleich zu mit FITC angefärbten Zellen (531 v 50 MCF). Dieses Ergebnis wurde nicht auf Kosten der Hintergrundfluoreszenz (Zellen mit nur zweiter zugegebener Schicht) erreicht, weil die letztere sogar verringert wurde.
Beispiel 3
• Dieses Beispiel veranschaulicht, wie eine Zelle, die sich gegenüber konventionellen Färbemethoden negativ verhält, erfindungsgemäß positiv dargestellt werden kann.
• Periphere Blutlymphozyten wurden wie vorstehend angegeben angefärbt, mit der Ausnahme, daß der verwendete monoklonale Antikörper DMS-2 war, ein Antikörper gegen Interleukin- 2 (IL-2). Die Ergebnisse sind die folgenden: Tabelle III % positive Zellen durchschnittliche Zellfluoreszenz Zellen (Hintergrund)
• Mit FITC angefärbte Zellen waren deshalb nicht stärker fluoreszierend als die Hintergrundfluoreszenz, während Zellen, die erfindungsgemäß angefärbt wurden, zeigen, daß bei etwa 20 % mehr Zellen als der Hintergrund IL-2 an der Zellmembran vorhanden ist.
Beispiel 4
• Dieses Beispiel zeigt den Vergleich der Hintergrundfluoreszenz von mit verdünnten Liposomen inkubierten Zellen mit der Autofluoreszenz der Zellen selbst.
• Periphere Blutlymphozyten (2 x 10&sup5; pro Vertiefung) wurden mit SαM-SUV in verschiedenen Verdünnungen während 30 Minuten inkubiert, und dann vor der Analyse mittels Durchflußzytometrie dreimal mit dem Medium gewaschen.
• Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden: Tabelle IV Mittlere Zellfluoreszenz Zellen allein Zellen (serielle Verdünnungen von Liposomen in Puffern)
• Bei einer Verdünnung der Liposomen zwischen 1:16 und 1:32 ist die Hintergrundfluoreszenz der Zellen deshalb äquivalent zur Autofluoreszenz. Die folgende Tabelle (Tabelle V) zeigt die Ergebnisse der gleichen Liposomenverdünnungen, die mit Zellen inkubiert sind, die mit der ersten Antikörperschicht, in diesem Fall UCHT1, markiert wurden. Zum Vergleich wurden auch Zellen mit einer optimalen Konzentration an SαM-FITC inkubiert. Tabelle V % positive Zellen Peak-Kanal Nr. Zellen + SαM-FITC (serielle Verdünnungen von Liposomen in Puffer)
• Die Peak-Kanal-Nr. zeigt die mittlere Zellen-Leuchtkraft mit der Zellenverteilung in einem logarithmischen Maßstab. Bei einer Liposomenverdünnung von 1/32, wo die Hintergrundfluoreszenz äquvalent zur Autofluoreszenz ist (vgl. Tabelle IV) ist deshalb die vorliegende Erfindung immer noch dem SαM-FITC iin Hinblick auf die Zellen-Leuchtkraft (164 v 131) überlegen.
• Erfindungsgemäß hergestellte Fluoreszenz-Immunoliposome können bei der Untersuchung von Zellerscheinungsformen unter Verwendung der Durchflußzytometrie, Fluorimetrie und UV-Mikroskopie verwendet werden. Zur Verwendung in der letzteren Methode kann es nützlich sein, ein Antibleichmittel, wie z.B. Natriumazid oder Paraphenylendiamin, mit einzubauen, das eine verlängerte Beobachtungszeit und eine Photographie der fluoreszierenden Testobjekte vor dem Verblassen erlaubt. Immunoliposome sind in einer 1%igen Lösung von Formaldehyd, das die Zellen fixiert, stabil. Dies erlaubt es, markierte Zellen vor der Analyse ohne Zerstörung des Fluoreszenzsignals zu lagern oder zu sammeln. Ein Liposomenansatz kann bequem in 48 Stunden synthetisiert werden. Eine leicht handhabbare Menge von 6 ml reicht für mindestens 500 Tests aus.
• Die vorliegende Erfindung kann unter anderem in den folgenden Situationen angewendet werden:
(i) Zellerscheinungsbild.
• Dies umfaßt: Die Bestimmung von Antigenen an leukämischen Bläschen, malignen Lymphomzellen oder Karzinomzellen, die als undifferenziert klassifiziert worden sind, und die unbestimmten Ursprungs sind; das Screening von monoklonalen Antikörpern und die positive Bestimmung bei einem Antigen-Dichteniveau, die bisher nicht möglich war; die frühere Bestimmung von differenzierungsaktiven Antigenen während Zellontogenie und Vermehrung; Doppelanfärbetechniken, bei denen das Signal vom Fluoresceinmarker eine Verstärkung erfordert, um mit anderen Farbmarkern gleich zu sein; die Fluoreszenzmarkierung von Gewebeausschnitten bei der Bestimmung maligner Zellen; Retikulozyten-Zählung unter Verwendung von Anti-Transferrin oder Anti-Transferrin-rezeptor-Antikörper als erste Schicht.
• Ein einfacher Ersatz von Anti-Human Antikörper für Anti- Maus-Antikörper, der mit den Liposomen konjugiert ist, erweitert die erfindungsgemäße Anwendung auf HLA A, B und Dr-Typisierung. Sie erweitert die erfindungsgemäße Anwendung auch auf die Bestimmung von Antikörpern, die auf Zelloberflächen-Antigenen während eines Krankheitsverlaufes angelagert wurden, z.B. während Immuno- oder Autoimmuno- Erkrankungen, wie z.B. hämolytische Anämie, Immunothrombozytopenie und Immunoneutropenie; und auf die Bestimmung von Autoantikörpern, die an in Gewebeschnitten vorhandenen Zellen existieren.
(ii) Bestimmung der DNA-Restriktionsfragmente, von RNA und Polypeptiden nach "Blotting",
• wie vorstehend beschrieben. Dieses Verfahren vermeidet das Risiko und die Unannehmlichkeiten der Verwendung einer hochradioaktiven Sonde mit begrenzter Lagerfähigkeit.
(iii) Fluoreszenz-Immunosorbens-Assay.
• Dies ist die Bestimmung von Antigen oder Antikörper, die durch Anlagerung an eine feste Oberfläche, z.B. eine Mikrotiterplatte, immobilisiert wurden. Wie im konventionellen enzym-linked- immunosorbent-assay (ELISA) wird das zu testende Antigen zuerst an die feste Phase gebunden, gefolgt von einer Zugabe des zu testenden Antikörpers. Nach dem Waschen wird der an das Antigen gebundene Antikörper durch Zugabe von immunofluoreszierenden Liposomen bestimmt.

Claims (13)

1. Biologisches Reagens, umfassend ein Liposom, das eine fluoreszierende Verbindung enthält, und ein zweites Bindungsagens, das an die Oberfläche des Liposoms kovalent gebunden ist, und worin das Liposom die fluoreszierende Verbindung einer Konzentration enthält, die dem Reagens maximale Fluoreszenz verleiht, wenn die Verbindung innerhalb des Liposoms zurückgehalten wird, und das zweite Bindungsagens eine Spezies ist, die dazu fähig ist, das markierte Liposom an einen Komplex aus einem trägergebundenen biologischen Material und einem ersten Bindungsmittel zu binden, indem es spezifisch mit dem ersten Bindungsmittel und nicht mit dem biologischen Material selbst reagiert, wobei das erste Bindungsmittel eine Spezies ist, die spezifisch mit dem biologischen Material reagiert.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Verbindung ein wasserlösliches Salz von Carboxyfluorescein ist.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Bindungsmittel ein Antikörper ist.

4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper Schaf- oder Ziegen-Anti-Maus-Immunoglobulin ist.

5. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Bindungsmittel Avidin oder Biotin ist.

6. Verfahren zur Analyse eines trägergebundenen biologischen Materials oder eines ersten dazu komplementären Bindungsmittels, wobei das erste Bindungsmittel eine Spezies ist, die spezifisch mit dem biologischen Material reagiert, umfassend: Inkubierung eines Konjugates des biologischen Materials und ersten Bindungsmittels mit einem Überschuß eines biologischen Reagens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem das zweite Bindungsmittel eine Spezies ist, die die markierten Liposome an das biologische Material bindet, indem es spezifisch mit dem ersten Bindungsmittel und nicht mit dem biologischen Material selbst reagiert, Abtrennung des ungebundenen Überschusses des Reagens aus dem Konjugat, das daran gebundene Liposome besitzt, und schließlich Bestimmung des gebundenen und/oder ungebundenen Markers im intakten Liposom.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material ein Antigen ist und das erste Bindungsmittel ein monoklonaler Antikörper ist, der spezifisch für dieses Antigen ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Bindungsmittel ein Antikörper für den monoklonalen Antikörper ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein Zellenoberflächen-Antigen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Bindungsmittel ein spezifisches Reagens für das trägergebundene biologische Material und entweder Biotin oder Avidin umfaßt, und das zweite Bindungsmittel Avidin bzw. Biotin umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das trägergebundene biologische Material DNA- oder RNA-Fragmente umfaßt, die "Blot"-übertragen wurden und das spezifische Reagens eine DNA- bzw. RNA- Sonde ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das trägergebundene biologische Material Polypeptide umfaßt, die "Blot"-übertragen wurden und das spezifische Reagens ein Antikörper für diese Polypeptide ist.

13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat des trägergebundenen biologischen Materials und ersten Bindungsmittels ein Konjugat eines zellgebundenen Antigens und eines Autoimmun- Antikörpers ist.