DE3412340C2 - Substrat zur Fluoreszenz-Immunanalyse von biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Substrat zur Fluoreszenz-Immunanalyse von biologischen Flüssigkeiten

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Abstract

Ein Substrat für die Fluoreszenzimmunanalyse umfaßt ein quellbares, rehydrierbares, polymeres proteinbindendes Material, das eine dreidimensionale Matrix bildet; teilchenförmige, unspezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, sichtbares Licht zu streuen, sowie teilchenförmige, spezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, spezifisches fluoreszierendes Erregerlicht zu reflektieren und unspezifisches Licht zu absorbieren. Das Substrat bindet wirkungsvoll Proteine und verstärkt das übertragene fluoreszierende Licht, womit die Sensitivität von Untersuchungen, die fluoreszierende Messungen einschließen, verbessert wird.

Description

(1)
(2)
teilchenförmige, unspezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, sichtbares Licht zu streuen, sowie
teilchenförmige, spezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, spezifisches fluoreszierendes Erregerlicht zu reflektieren und unspezifisches Licht zu absorbieren.
2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Protein bindende Material ein Acrylcopolymeres ist
3. Substrat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylcopolymere aus Methacrylsäure und Polymethylmethacrylat besteht
4. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die unspezifisches Licht streuende Zentren Oxide von Titan und Zink, getrennt oder in Kombination sind.
5. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Licht streuende Zentrum eine Phthalocyaninverbindung ist
6.Substrat nach Anspruch !,dadurch gekennzeichnetdaßesaufeinemfestenTrägerimmobilisiertist
7. Substrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß der feste Träger eine im wesentlichen ebene Oberfläche umfaßt
8. Substrat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger ein eine im wesentlichen flache Bodenfläche und Jivergierende Seitenwandungen aufweisender Testbehälter ist, wobei das Substrat auf dem Boden immobilisiert ist.
9. Substrat nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß hierin und hieran eine erste Substanz gebunden ist, die in der Lage ist, mit einer oder mehreren Nachfolgesubstanzen zu reagieren, zur Bildung eines fluoreszierenden Produktes.
10. Substrat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Substanz ein Antigen oder ein Antikörper ist.
11. Substrat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen den ganzen Organismus oder eine Fraktion von TGE-Viren, Toxoplasma gondii. Hundestaupe-Virus, Hundestaupe-Parvovirus, Hundebrucelloseorganismen. Brucella abortus, Dirofilaria immitis (heartworm), Trichinella oder das P-27 Antigen des Katzenleukämievirus umfaßt.
12. Fluoroimmunoassay zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, die mit einer bakteriellen, viralen, parasitären oder Pilzinfektionskrankheit verbunden sind, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Substrats gemäß Anspruch 1.
13. Fluoroimmunoassay nach Anspruch 12, zum Nachweis von Katzenleukämie-Virus, Toxoplasmen bei Menschen und anderen Säugetieren, Katzen-IgG, Hunde-IgG, Hundestaitpe-Virus, Hunde-Parvovirus oder Brucella-Organismen von Hunden.
Die Erfindung betrifft ein Substrat zur Fluoreszenz-Immun-Analyse von biologischen Flüssigkeiten mit einem quellbaren, rehydrierbaren, polymeren proteinbindenden Material, das eine dreidimensionale Matrix bildet
Ein derartiges Substrat ist aus der DE-OS 26 03 004 bekannt in die dortige poröse Polyvinylchloridmatrix ist feinverteiltes Siliciumdioxid eingebettet
Auch die US-PS 40 61 466 beschreibt ein derartiges
ίο Substrat, in welchem jedoch eine biologisch aktive makromolekulare Substanz immobilisiert ist
Die DE-OS 28 47 995 beschreibt als Substrat eine auf dem Trägerkörper angebrachte Schicht synthetischen polymeren Materials und auf der Schicht abgesetzte Doppelhelix-DNS. Die Verwendung von Acrylcopolymeren als Substratmaterial ist aus der DE-OS 27 33 380 sowie aus der bereits erwähnten US-PS 4ί> al 466 bekannt
Fluoroassay oder Fluoreszenzanalyse ist eine Technik zur Bestimmung kleiner Mengen von Substanzen in einer komplexen Mischung. Besonders zweckmäßig und vorteilhaft ist die Fluoreszenz-Immun-Analyse oder Fluoroimmunoassay (FIA) von Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, in welchem geringe Mengen an Antigenen und Antikörpern enthalten sind
FlA ist nützlich bei der Diagnose einer Krankheit, wenn diese spezifisch ist für ein besonderes Antigen oder einen Antikörper, der für diese Krankheit charakteristisch ist Für eine verläßliche Diagnose muß jedoch FIA nicht nur spezifisch sein, sondern auch höchst sensitiv, da die zu bestimmende Substanz oft in sehr kleinen Mengen in der zu analysierenden Flüssigkeit vorliegt
Frühere Versuche zur Verbesserung der Sensitivität von FIA umfassen die Entwicklung oder den Einsatz von Substraten, die selektive Proteine binden. Diese Substrate können auf einer festen Oberfläche immobilisiert werden, so daß die Immunreaktion zwischen Antigen und Antikörper leichter beobachtet werden kann.
Da FIA die Aufnahme von Licht umfaßt, das von einem speziellen Fluorophor abgesandt wurde, hängt die Sensitivität auch von der Intensität des so emittierten Lichtes ab und dessen Beziehung zum Hintergrund oder dem gestreuten Licht. In der Auswahl einer eigenen Wellenlänge, die der Erregerfrequenz des Fluophor angepaßt ist. liegt ein wichtiger Faktor bei der Erhöhung der Sensitivität. Die US-PS 43 40 564 beschreibt ein Festphasen-Immunsubstrat, das eirwn Überzug aus
so polymeren Perlen mit Lichtstreuzentren umfaßt, sowie Bimiarn, die das gestreute Lichtverstärken. Auch andere Möglichkeiten, oie Substrate zu verbessern und die Menge an übertragenem Licht zu erhöhen, sind gesucht worden, wie z. B. gemäß der US-PS 42 58 002.
Gemäß der Erfindung umfaßt das eingangs genannte Substrat teilchenförmige, unspezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, sichtbares Licht zu streuen, sowie teilchenförmige, spezifisches Licht streuende Zentren, die in der polymeren Matrix verteilt und in der Lage sind, spezifisches fluoreszierendes Erregerlicht zu reflektieren und unspezifisches Licht zu absorbieren.
Die teilchenförmigen, unspezifischen l.ichtstreuzentren des Substrats verbessern die Sensitivität der FIuoreszenz-ltnmun-Analyse mit dem Substrat gemäß der Erfindung, indem sowohl das eigene sichtbare Licht wie auch das emittierte fluoreszierende Licht gestreut wird.
Bei dem Schema der Fluoreszenz-Immun-Analyse irägl das Antigen oder der Antikörper ein fluoreszierendes Farbmolekül als Identifizierungsetikett, wobei das Farbmolekül mit Lichtwellenlängen erregbar ist, die dem Lichtabsorptionsspektrum der Farbe angepaßt sind. Wenn das Farbmolekül ein Lichtphoton innerhalb seines spezifischen Erregerspektrums absorbiert, wird ein Elektron auf einen höheren Energiestatus angehoben, und ein Photon geringerer Energie (größerer Wellenlänge) wieder emittiert. Eine spezifische Lichtstreuung zusammen mit der Fluoreszenz verstärkt den Transfer eines solchen Lichtes auf einen Detektor. Solche Partikel würden jedoch auch das ursprüngliche Erregerlicht absorbieren und damit auslöschen, womit eine Erregung der Farbe verhindert würde. Dementsprechend wurde die unspezifische Lichtstreuung gemäß der Erfindung so ausgewählt daß sie nicht das Erregerlicht absorbiert und trotzdem in der Lage ist, das emittierte fluoreszierende Licht zu streuen.
Die spezifisch-en Lichtstreuzentren des Substrates streuen nur das tilge Band des Lichtes, das den fluoreszierenden Erregerwellenlängen der Farbe entspricht Diese spezifischen Lichtstreuer sind Pigmente, deren Lichtstreuspektrum dem Lichtabsorptionsspektrum der fluoreszierenden Farbe angepaßt ist Der Obergang von eigenem Licht mit Wellenlängen innerhalb dieses Spektralbereiches, der die fluoreszierende Markierung erregt ist somit verstärkt Manchmal wird störendes Hintergrundlicht unterschiedlicher Wellenlänge absorbiert und somit durch diese spezifischen Lichtstreuer gelöscht Da somit der Übergang von fluoreszierendem Licht verstärkt wird, während Hintergrundlicht durch diese spezifischen Lichtstreaer vei.nindert wird, wird die Sensitivität von FIA durd. das Substrat gemäß der Erfindung verbessert.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem proteinbindenden polymeren Material um ein Acrylpolymeres, und zwar vorzugsweise eine Emulsion auf Wasserbasis eines Acrylpolymerharzes.
Die unspezifischen lichtstreuenden Teilchenzentren sind vorzugsweise Teilchen aus Zinkoxid oder Titandioxid (in seiner rutilen Form), entweder getrennt oder kombiniert Die unspezifischen lichtstreuenden Partikel können anorganisch sein, wie etwa die anatasen oder rutilen Formen von Titandioxid, ferner Zinkoxid, Calciumcarbonat, oder sie können von Tonursprung sein, wie etwa Kaolin, Bentonit oder Bleicherde, oder sie können organischen Ursprungs sein, wie etwa Stärken. Diese Lichtstreuer sind teilchenförmig, sind gleichförmig verteilt und streuen wirkungsvoll alles Licht.
Die spezifisches Licht streuenden Zentren sind ebenfalls teilchenförmig, willkürlich in dem proteinbindenden polymeren Latex verteilt und besonders bevorzugt eine pigmentierte Verbindung mit einem spezifisch angestrebten spektralen Reflektionsvermögen. Besonders bevorzugt ist ein metallisches Phthalocyaninsalz, wie z. B. Kupfernaphthalocyanin. Die Phthalocyaninverbindung (manchmal auch hier als »Pigment« bzeichnet) ist ein spezifischer Absorber von Licht, dessen spektrale Streuverteilung dem Erregerspeklrum der fluoreszierenden Farbe angepaßt ist und vermindert dementsprechend das Licht unerwünschter Wellenlänge, unabhängig davon, ob es auf Autofluoreszenz oder Hintergrundstreuung beruht. Setzt man z. B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) als Markierungssubstanz ein, deren spektrale dekadische Extinktion eine Spitze im »Blau«-Teil des Spektrums bei 470 Nanometern besitzt, so eignen sich Partikel aus Kupferphthalocyanin, dessen spektrales Reflektionsvermögen oder Streuung mit einem Optimum bei 470 Nanometern nachgewiesen wurde. Sollte die eingesetzte Farbe ein Rhodaminderivat sein, das in dem »Grün«-Bereich des Spektrums absorbiert und in dem »Orange«-Bereich des Spektrums fluoresziert, sollte man ein Pigment einsetzen, um die Streuung bei etwa 530 Nanometern Wellenlänge zu maximieren.
Vorzugsweise werden unspezifisches licht streuende Zentren in einem Gewichtsverhältnis von etwa & sißig zu eins in bezug auf spezifisches Licht streuende Zentren eingesetzt
Gemäß bevorzugten Ausfuhrungsformen der Erfindung liegt das Substrat in Kombination mit einem festen Träger vor. Besonders bevorzugt umfaßt der feste Träger eine im wesentlichen flache Oberfläche, wie z. B. diejenige eines Untersuchungsträgers. Am meisten bevorzugt liegt jedoch das Substrat als relativ dicke Schicht (40 bis 50 Micron Dicke) auf dem im wesentlichen flachen Boden der Testbehälter als festem Träger vor. Die Testbehälter sind vorzugsweise kreisförmig ausgebildet mit schräg abfeilenden Wändeu.
Das Substrat gemäß der Erfindung kann zusätzlich noch ein immunogenes Reaktionsmittel umfassen — entweder ein Antigen oder einen Antikörper. Das Substrat in diesen Ausführungsformen ist besonders vorteilhaft einsetzbar bei der Analyse von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten zu-n Nachweis von Antigenen oder Antikörpern, die für eine Krankheit charakteristisch sind, im besonderen solche, die verursacht sind durch eine virale, bakterielle oder parasitäre Infektion. Beispiele hierfür sind:
Katzenleukämievirus, infektiöse Katzenperitonitis, Toxoplasmose, infektiöse Katzenanämie, Dirofilaria immitis (heart-worm), Hundebrucellose, Hundeparvovirus, antinukleare Antikörper, Rheumafaktor und Hundestaupe. Die Diagnose von Pferden im Hinblick auf infektiöse Pferdeanämie, Pferdeträchtigkeit Pferdedrusen, Pferdepneumonitis, Pferdemetritis und Pferdeinfluenza; virale Listen für Labormäuse- und -reiten; Rinderbrueel lose; Vogelkrankheiten einschließlich des Newcastle Krankheitsvirus, Psittacose und Lei'kose, Krankheiten des Schweins, wie etwa Trichinose, Gastroenteritis, Pseudorabies und afrikanisches Schweinefieber.
Ferner sind Mengenbestimmungen von IgG, IgA, IgM und IgE, Serumproteinkomponenten des Komplementärsystems und anderen Serumproteinen möglich.
Das proteinbindende Substrat kann hergestellt werden durch die Mischung eines Acrylcopolymeren, bestehend aus 50% Harz und 50 Wasser, bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 9 (Bestandteil A) mit einer Emulsion von Acrylharz und Wasser, gemischt mit einer Suspension aus Titandioxid und Zinkoxid (Bestandteil B) sowie einer Emulsion aus Acrylharz und Wasser, vermischt mit einer Suspension aus Titandioxid und Kupferphthalocyanin (Bestandteil C). Der Bestandteil B kann zusätzlich einen Fließverbesserer, wie etwa Tallesterharz enthalten. Vorzugsweise umfaßt der Bestandteil B etwa 3 bis 5% Tallesterharz. Die Bestandteile werden vorzugsweise in dem Verhältnis A : B : C = 2,5 :2,5 :1 miteinander vermischt und vor dem Einsatz in fünf Teilen destilliertem Wasser verdünnt.
Das Acrylcopolymere kann abgeleitet sein von Methacrylsäure oder Polymethylmethacrylat oder Copolymeren der Kombination hiervon.
Das Substrat kann außerdem abgeleitet werden von Vinylacetaten und Derivaten oder von Butadienstyrol und Copolymeren hiervon mit anderen Polymeren. Es können Epoxypolymermaterialien, Vinylchloridmateria-
lien und Copolymere von irgendeinem oder allen der oben erwähnten MateriaKen sein.
Das Harz bei den Bestandteilen A, B und C liegt vorzugsweise in Perlenform vor, wobei die Perlen einen Durchmesser zwischen etwa 0,1 und 1,0 Micron und vorzugsweise etwa 0,2 Micron aufweisen. Die Oxide in den Bestandteilen B und C sind Partikel, die so ausgewählt sind, daß sie etwa die Größe der Hälfte der Wellenlänge des Lichtes ausmachen, das auf die Probe gerichtet wird Für die Fluoreszenzanalyse der vorliegenden Erfindung beispielsweise besitzen die Partikel eine bevorzugte Größe von 0,2 Micron. Die Phthalocyaninbestandteile, die unregelmäßig in der polymeren Matrix verteilt sind, besitzen eine Größe von weniger als 0,1 Micron, wobei deren Größe vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,1 Micron liegt
Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt FlTC als Markierung und Kupferphthalocyanin als StreupigmentpartikeL Die optimale Größe der Partikel beruht auf der Streutheorie und zeigt an, daß die optimale Streuung eintritt, wenn der Teilchendurchmesser etwa die Hälfte der Weilenlänge des Lichtes ausmacht. Da bei FITC als Farbmolekül »blaues« Licht mit Wellenlängen von 420 bis 480 Nanometern auf den Fürn gerichtet wird, würde es ideal sein, wenn die Partikel einen Durchmesser von 0,2 bis 03 Micron aufweisen würden.
Die Acrylpolymerperlen und das Titandioxid besitzen vorzugsweise Durchmesserverteilungen, die maximal bei 02 Micron liegen. Das Kupferphthalocyanin umfaßt vorzugsweise etwas kleinere Partikel, die aber nach wie vor einen wirkungsvollen Streuquerschnitt aufweisen.
Nach bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Substrat auf einen festen Träger immobilisiert. Der feste Träger besitzt vorzugsweise eine im wesentlichen flache Oberfläche, auf welcher das Substrat aufgebracht wird, in mindestens einem diskreten Bereich. Besonders bevorzugt umfaßt der feste Träger einen oder mehrere Testbehälter mit im wesentlichen flachen Bodenflächen und geneigten Seitenwänden. Das Substrat ist vorzugsweise auf den flachen Bodenflächen der Behälter immobilisiert. Die Behälter mit dem eingebrachten Substrat stellen somit einen Bereich dar, in welchem die Untersuchung eines Fluids durchgeführt werden kann. Bei einer Immobilisierung unter gesteuerten Temperatur- und Feuchtigke-tsbedingungen (beispielsweise 25,56° und 70% Feuchte) wird ein kolloida!- ler Film gebildet, mit einer Dicke von 40 bis 50 Micron, der wasserdurchlässig ist.
Bei gesteuerten Trockungsgeschwindigkeiten (wenn die Temperatur und Feuchtigkeit nicht schwankt oder extrem ist und keine Zugluft gestattet wird) und bei der entsprechenden Verdünnung mit destilliertem Wasser, wie dies der Vorschrift entspricht, wird eine Flüssigkeit auf der Emulsion mit einer Schichtdicke von 75 Micron Höhe aufgebracht und verschmilzt zu einem dicken Film von etwa 40 bis 45 Micron, wie ein Elektronenmikroschreiber zeigt.
Nach dem Trocknen beträgt ein typisches Filmgewicht 60 bis 65 mg. Nachdem der Film 10 Minuten einer wäßrigen Lösung ausgesetzt war (beispielsweise nach dem Vorweichen in Wasser oder dem Aufbringen von Körperflüssigkeiten), steigt das Filmgewicht an auf 115 mg, was einen 75%-igen Anstieg aufgrund des Wassergehaltes bcdculcl. Auch bei einem anschließenden Trocknen wahrem1 I 1/2 Stunden bei Raumtemperatur ist ein Restüberschuß von 6 bis 7 % Wasser vorhanden, der exponentiell verschwindet.
Die folgenden Beispiele erläutern den Einsatz der Erfindung.
Beispiel 1
5
Katzenleukämietest
A. Antikörperabreicherungstest
Das Substrat wurde auf den Boden eines Testbehälters immobilisiert. P-27 Antigen, eines der Kernantigene des Katzenleukämievirus, wurde von einer wachsenden Zellinie Fl-74 geerntet und in einem ersten Testbehälter aufgebracht.
In einem Hilfstestbehäiter wurde eine Probe von P-27 Antigen mit Anti-P-27 Antikörper aus Kaninchen inkubiert Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde ein Teil dieser Mischung auf den ersten Testbehälter übertragen, um freie Antikörper, die nicht schon an das Probenaatigen gebunden waren, mit dem P-27 Antigen in dem Substrat zu kombinieren..', sch einer Inkubation von 15 Minuten und einer kurzen Was;hung wurde Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin G (IgG), das mit Fluoreszinisothiocyanat (FITC) markiert war, dem Substrat beigegeben. Nach einer Inkubation von 10 Minuten v-jrde das Substrat gewaschen und in eine Meßvorrichtung eingebracht und gemessen. Bei den Eichproben für den Leukämievirus handelte es sich um normale Katzensera mit einem bekannten Gehalt an P-27 Anti-
gen.
Klinische Untersuchungen an 104 vorher gefrorenen Katzenserumproben zeigten eine Spezifität von 85% und eine Sensitivität von 95% gegen einen Vergleich ELISA Sandwichversuch.
Beispiel 2
Fluoreszenzimmunassay der infektiösen
Katzenperitonitis (FIP)
In unterschiedliche Gefäße wurden die Kontrollpräparation und die Antigenpräparation eingebracht. Die Kontrollpräparation war obenschwimmend, und man erhielt sie aus kultivierten Schweinen-eren (PK) Zellen verdünnt 1 :3 mit 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH-Wert 9. Die Antigenpräparation waren TGE Viren, infiziert mit dem TGE Virus (Miller Strain). Infektionöse Katzenperitonitisantikörper wurden stark quer reagiert mit dem
so TGE Virus.
Katzenblutproben wurden sowohl in die Kontroll- als auch die Antigenbehälter eingegeben und 10 Minuien lang inkubiert. Nach einer Waschung wurde Kaninchenantikavzen-IgG mit FITC-Markierung den Behältern beigegeben. Bei einer Inkubation von 10 Minuten und eine endgültigen Waschung mit Wasser wurden die Gefäße hinsichtlich ihrer Fluoreszenz im Meßgerät beobachtet. Bei der Analysierung der Ergebnisse wird die Kontrollfluoresz^nz von der von dem Antigengefäß abgeleiteten Fluoreszenz sowohl bei den geeichten Proben als auch den unbekannten Proben abgezogen, um zu einer Nettofluoreszenzablesung zu komiVien. Die geeichten Proben sind koordinierte Sera mit bekanntem FIP Titer, bestimmt nach anderen Verfahren. Klinische
M Tests an 124 Prohon zuvor gefrorener Knl/.cnscrtimprobcn zeigten eine Spe/ifilai von HO1Vo, verglichen mil einer bekannten kinetischen ELISA-Untersuchung(Kt-LA) und eine 9O°/oiee Sensitivität-
6A 12
7
Beispiel 3 arprotein als Antigen kombiniert. Der Test wurde
durchgeführt, wie in den Beispielen 1 bis Fluoroimmunoassay von Toxoplasma Gondii
Toxoplasma Gondii kann verschiedene Tiere befallen, wobei jedoch die Kaue als das natürliche Reservoir dient. Hierin liegt eine ernsthafte klinische Bedeutung, da die Übertragung von der Haushaltskatze auf eine schwangere Besitzerin zu katastrophalen Geburtsschäden des Fötus führen kann. Dementsprechend sollten sowohl die schwangere Frau als auch ihre Katze in periodischen Abständen serologisch während der Schwangerschaft untersucht werden.
Dem Substrat £<;mäß Beispiel 1 wurden lösliche Antigene beigegeben, die extrahiert waren von zersprengten Toxoplasma Gondii Oragnismen. Substrat und Antigen wurden in den Testgefäßen immobilisiert. Ein Tropfen von ganzem unverdünntem Serum oder Blut wird in :—1— τ—»—rsn ~:——k..ni.· n:»rArsßn...ni—1~~ in KA'.
jiuu I tsig^Klu 1.11IgLUi OLUi. L/ic uviauv ηι,ιυ^,Η iw inr nuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Reaktion zwischen den Antikörpern zu T. Gondii und dem immobilisierten Antigen zu gestatten. Die Gefäße wurden gewaschen und dann mit Antikatzenantikörpern konirakticn. die mit Fluoreszeinisothyisocyanat (FITC) markiert waren. Nach einer Inkubation von IO Minuten wurden die Gefäße gewaschen und hinsichtlich der Fluoreszenz beobachtet. Kontrollbeispiele mit bekanntem Titer wurden gleichzeitig gefahren, um eine Eichkurve aufzustellen.
30
Beispiel 4
Die folgenden Untersuchungen wurden ausgeführt unter Einsatz des allgemeinen Verfahrens, des Substrats und der Ausrüstung gemäß dem Beispiel 1 bis 3. Katzen-IgG wurde behandelt wie in Beispiel 3, jedoch kein Antikörper oder Antigen wurde zuvor dem Kolloidsubstrat beigegeben. Das Serum wurde 10 Minuten lang in Gefäße eingegeben. Alle Serumproteine wurden absorbiert. Nach dem Waschen wurde Antikatzen IgG Antikörper mit FITC MarkL. ung aufgebracht. Es reagierte nur mit dem gebundenen IgG. Nach einer Inkubation von 10 Minuten wurde das überschüssige Antikatzen-lgG abgewaschen und die Fluoreszenz wurde abgelesen. Die Eichungen ergaben die Mengenbestimmung von mg von IgG pro 100 ml Blut.
Pferde-lgG Untersuchung wurde ausgeführt in der gleichen Weise wie die Katzen IgG Untersuchung, aber eine Eichung für niedrige Niveaus wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein neugeborenes Fohlen einen Immunschaden haae, das noch keine Vormilch von der Stute getrunken hatte.
Hundestaupenantikörper, Hundeparvovirusantikörpcr und Hundeantikörper gegenüber Brucellose wurden alle Sandwichverfahren unterworfen, die in einer ähnlichen Weise ausgeführt wurden, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist und gegen die entsprechenden Antigene gerichtet Es wurden bei allen zwei 10 minütige Inkubationen und zwei kurze Waschungen durchgeführt Keinmal wurde der Einsatz eines Kontrollgefäßes erforderlich, wie dies bei dem FIP Test des Beispiels 2 der Fall war. Für einen Rheumafaktortest in Hunden war das Antigen ein »geändertes« Kaninchen-IgG, auf welches in einigen Hunden IgM Antikörper gerichtet wurden. Ein Antihund-lgM FITC Antikörper wurde in der gleichen Weise eingesetzt wie in den Beispielen 1 bis 3. Für einen Hundeantinuklearantikörpertest wurden doDoelt und einfach verbundene DNA und Ribonukle-

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Substrat zur Fluoreszenz-Immun-Analyse von biologischen Flüssigkeiten, mit einem quellbaren, rehydrierbaren, polymeren proteinbindenden Material, das eine dreidimensionale Matrix bildet, gekennzeichnet durch
DE3412340A 1983-04-07 1984-04-03 Substrat zur Fluoreszenz-Immunanalyse von biologischen Flüssigkeiten Expired DE3412340C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/483,055 US4540660A (en) 1983-04-07 1983-04-07 Substrate for fluoroimmunoassay of biological fluids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3412340A1 DE3412340A1 (de) 1984-10-11
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