DK159175B - Materiale til fluorescensimmunbestemmelse af biologiske vaesker - Google Patents

Description

i

DK 159175 B

Den foreliggende opfindelse angår et materiale til fluores-censimmunbestemmelse af biologiske væsker, med et kvældbart, rehydratiserbart polymert proteinbindende materiale, som danner en tredimensional grundmasse.

5

Et sådant materiale er kendt fra DE-OS 26 03 004. I den deri beskrevne porøse polyvinylchloridgrundmasse er indlejret finde lt si 1iciumdioxid.

10 Også US-PS 4.061.466 beskriver et sådant materiale, hvori der dog er immobi1iseret et biologisk aktivt makromolekulært stof.

DE-OS 28 47 995 beskriver som substratmateriale et på bærerlegemet anbragt lag af syntetisk polymert materiale og på la-15 get afsat dobbelthelix-DNS. Anvendelsen af acrylcopolymere som substratmateriale er kendt fra DE-OS 27 33 380 og fra ovennævnte US-PS 4.061.466.

F1uorescensbestemmeIse er en virkningsfuld teknik til at på-20 vise små mængder af stoffer i en kompleks blanding. Den er særligt nyttig til fluorescensimmunbestemmelse (FIA) af legemsvæsker såsom blod, hvor der skal påvises små mængder af et antigen og antistoffer, som genkender det.

25 FIA er nyttig til diagnose af en sygdom, når den er specifik for et særligt antigen eller antistof, der er karakteristisk for sygdommen. For at give en pålidelig diagnose skal FIA imidlertid også være ikke blot specifik, men også meget følsom, fordi stoffet, der skal påvises, ofte findes i meget små 30 mængder i væsken, der skal analyseres.

Tidligere forsøg på at forøge følsomheden af FIA indbefatter udviklingen eller brugen af substrater, der selektivt binder proteiner. Disse substrater kan være immobi1iseret på faste 35 overflader, således at immunreaktionen mellem antigen og antistof lettere kan iagttages.

' DK 159175 B

2

Da FIA indebærer påvisning af lys udsendt af en særlig fluor-ofor, afhænger følsomheden også af intensiteten af det således udsendte lys og dets relation til baggrunden eller spredt lys.

Valg af en- indfaldende bølgelængde, der passer til stimule-5 ringsfrekvensen af fluorofor, er en vigtig faktor til forøgelse af følsomheden. Harte m.fl. i amerikansk patent nr. 4.340.564 beskriver et fastfase-immunsubstrat, der omfatter en overbelægning af polymere perler med lysspredende centre og bindemidler, som forøger spredt lys. Andre måder til at for-10 bedre substrater og forøge mængden af transmitteret lys er blevet søgt (se f.eks. amerikansk patent nr. 4.258.002).

Materialet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved (1) partikelformede ikke-specifikke lysspredende centre fordelt i den 15 polymere grundmasse, og som er i stand til at sprede synligt lys, og (2) partikel formede specifikke lysspredende centre fordelt i den polymere grundmasse, der er i stand til at reflektere specifikt fluorescerende stimuleringslys og absorbere uspecifikt lys.

20

De partikelformede, ikke-specifikke lysspredende centre i materialet forøger følsomheden af fluorescensimmunbestemmelse med materialet ifølge opfindelsen ved" at‘ sprede både indfaldende synligt lys og emitteret fluorescerende lys.

25 I det optiske fluorescensimmunbestemmelsesskema bærer antigenet eller antistoffet et fluorescerende farvestofmolekyle som et identificerende mærke, idet dette farvestofmolekyle bliver — anslået med bølgelængder af lys, som passer til farvestoffets 30 lysabsorberende spektrum. Når farvestofmolekylet absorberer en foton af lys inden for dets specifikke stimuleringscentrum, hæves en elektron til en højere energitilstand, og en foton med mindre energi (længere bølgelængde) bliver derefter genudsendt. En specifik lyssprede.r i forb.i ndel se. med fluorescens 35 ville fremme overføring af sådant lys til en detektor. Sådanne partikler ville imidlertid også absorbere og derfor slukke det oprindelige stimulerende lys og derved gøre det umuligt at 3

DK 159175 B

anslå farvestoffet. De uspecifikke lysspredere ifølge den foreliggende opfindelse er derfor valgt således, at de er uspecifikke for ikke at absorbere det stimulerende lys, men stadig være i stand til at sprede det udsendte fluorescerende lys fra 5 farvestoffet.

De specifikke lysspredende centre i materialet spreder kun det snævre bånd af lys, som svarer til farvestoffets fluorescerende stimuleringsbølgelængde. Disse specifikke lysspredere er 10 pigmenter, hvis lysspredende spektrum passer til det lysabsor berende spektrum af det fluorescerende farvestof. Overføring af indfaldende lys, der har bølgelængder inden for dette spek-trale område, som stimulerer det fluorescerende mærke, forøges derved. På et eller andet tidspunkt absorberes generende bag-15 grundslys med anden bølgelængde og slukkes derved af disse specikke lysspredere. Da overføringen af fluorescerende lys forøges, medens baggrundslys reduceres af disse specifikke lysspredere, forbedres følsomheden af FIA med materialet ifølge den foreliggende opfindelse.

20

Det proteinbindende polymere materiale er fortrinsvis en acrylcopolymer, f.eks. især en emulsion på vandbasis af en acrylpolymerharpiks.

25 De uspecifikke lysspredende partikelformede centre er for trinsvis partikler af zinkoxid eller titandioxid (fortrinsvis i rutil-formen), enten hver for sig eller kombineret. I almindelighed kan de uspecifikke lysspredende partikler dog være uorganiske, såsom anatas- eller ruti 1 formerne af titandioxid, 30 zinkoxid, calciumcarbonat, eller de kan hidrøre fra ler, såsom kaolin (porcelænsler), bentonit eller Fuller-jord, eller de kan være af organisk oprindelse, såsom stivelser. Disse lysspredere er partikelformede, er ensartet fordelt og spreder alt lys effektivt.

De specifikke lysspredende centre er også partikelformede, tilfældigt fordelt i den proteinbindende polymere latex og er 35 4

DK 159175 B

fortrinsvis en pigmenteret forbindelse med specifik ønskelig spektralreflektans. Mest foretrukket er et metallisk phthalo-cyaninsalt, kobber-phthalocyanirr; f.eks. er ptrthalocyanin-forbindelsen (ofte omtalt som "pigmentet") en specifik absor-5 ber af lys, hvis spektrale spredningsfordeling er afpasset til stimuleringsspektret for det anvendte fluorescerende farvestof og reducerer således eventuelt lys af uønsket bølgelængde, hvad enten det skyldes autoflourescens eller baggrundsspredning. Når man således anvender fluoresceinisothioscyanat 10 (FITC) som det farvestof, hvis spektrale absorbanstop er i det "blå" område af spektret ved 470 nanometer, vil man anvende partikler af kobberphthalocyanin, hvis spektrale reflektans eller spredning er påvist at være optimal ved 470 nanometer.

Hvis det anvendte farvestof er et rhodaminderivat, som absor-15 berer i det "grønne" område af spektret og fluorescerer i det "orange" område af spektret, skal man anvende det passende pigment til at maksimere spredning ved ca, 530 nanometer bølgelængde , 20 Det foretrækkes at anvende uspecifikke lysspredende centre i et vægtforhold på ca. 30:1 i forhold til de specifikke lys-spredende cenfre.

I foretrukne udførelsesformer ifølge opfindelsen findes det 25 immunadsorptive materiale i kombination med en fast bærer.

Mere foretrukket omfatter den faste bærer en i det væsentlige flad overflade, f.eks. overfladen af en prøveglasplade. Mest foretrukket findes det immunadsorptive materiale som et forholdsvis tykt lag (40 - 50 mikron i dybden) på den i det 30 væsentlige flade bund af prøvefordybninger i den faste bærer. Prøvefordybningerne er fortrinsvis af cirkulær dimension med stejlt skrånende vægge.

Det immunadsorptive materiale ifølge opfindelsen kan desuden 35 omfatte et immunogent reagens, enten antigen eller antistof. Materialet i disse udførelsesformer er særligt nyttigt til analyse- af fri od eller andre legemsvæsker for immunogene rea- 5

DK 159175 B

genser, der er karakteristiske for en sygdom, især de der forårsages af virale bakterielle eller parasitiske infektioner. Eksempler herpå er: katteleukæmivirus, katteinfektiøs peritonitis, toxoplasmose, katteinfektiøs ansmi, hjerteorm, 5 hundebrucellosis, hundeparvovirus, antinukleare antistoffer, reumatoid faktor og hundesyge, diagnose af heste og beslægtede dyr for hesteinfektiøs anæmi, hestesvangerskab, kværke, heste-pneumonitis, hestemetritis og hesteinfluenza, virale programmer for laboratoriemus og -rotter, oksebrucellosis, fuglesyg-10 domme, herunder Newcastle's sygdomsvirus, psittacosis og leukosis, sygdomme hos svin såsom trichinosis, gastroenteritis, pseudo-rabies og afrikansk svinefeber.

Endvidere er mængdebestemmelser af IgG, IgA, IgM og IgE, se-15 rumproteinkomponenter af komplementærsystemet og andre serum-proteiner mulig.

Det proteinbindende immunsubstrat kan fremstilles ved at blande et acrylcopolymermateriale omfattende 50% harpiks og 20 50% vand ved en pH-værdi på ca. 8-9 (bestanddel A) med en emulsion af acrylcopolymer og vand blandet med en suspension af titandioxid og zinkoxid (bestanddel B) og en emulsion af acrylcopolymer og vand blandet med en suspension af titandioxid og kobberphthalocyanin (bestanddel C). Bestanddel B kan 25 desuden omfatte et strømningsfremmende middel, f.eks. en tallesterharpiks. Fortrinsvis omfatter bestanddel B ca. 3-5% tal lesterharpiks. Bestanddelene kombineres fortrinsvis i forholdet A: B: C = 2,5:2,5:1 og fortyndes før brugen i 5 dele destilleret vand.

30

Acrylcopolymeren kan være afledt af methacrylsyre eller poly-methylmethacrylat eller copolymere af kombinationer deraf.

Materialet kan også være afledt af vinylacetater og -derivater 35 eller af butadien-styren og copolymere af disse med andre polymere. Det kan være et epoxypolymermateriale, vi nyIchlorid-materiale eller copolymer af de monomere komponenter af vilkårlige to eller flere af de ovennævnte.

. . 6. .....

DK 159175 B

Harpiksen i bestanddelene A, B og C er fortrinsvis i perleform, hvor perlerne har en diameter fra 0,1 til 1,0 mikron, fortrinsvis ca. Or,2 mikron. Oxiderne i bestanddelene B og C er partikler, der er valgt til at være ca. af størrelse som 5 havldelen af bølgelængden af lys, som rettes mod prøven. Til flourbestemmelser ifølge den foreliggende opfindelse er partiklerne f.eks. fortrinsvis ca. 0,2 mikron. Phthalocyaninfor-bindelserne, der er tilfældigt fordelt i den polymere grundmasse, er i al mi ndel i g hed mindre end 0,1 mi kron og er for-10 trinsvis mellem 0,05 og 0,1 mikron.

En foretrukket udførelsesform omfatter FITC som farvestofmærket og kobberphthalocyanin som den spredende pigmentpartikel. Optimalt størrelsesvalg af partiklerne er baseret på spred-15 ningsteorien og indicerer, at optimal spredning sker, når partikeldiameteren er ca. halvdelen af lysets bølgelængde. Da der med FITC som farvestofsmolekyle rettes "blåt" lys med bølgelængder på 420 - 4SQ nanometer mod- filmen-, ville- det være ideelt at have partikler med diameter på 0,2 - 0,3 mikron.

20

Acrylpolymerperlerne og titandioxidet har fortrinsvis diameterfordelinger, som er maksimum ved ca. 0,2- mikron. Kobber-phthalocyanidet omfatter fortrinsvis partikler, der er noget mindre, men som stadig repræsenterer et effektivt sprednings-25 tværsnit.

Foretrukne materialer ifølge opfindelsen er immobi1iseret på en fast bærer. Den faste bærer har fortrinsvis en i det væsentlige jflad overflade, hvorpå substratet af lejres i i det 30 mindste ét tydeligt adskilt område. Mest foretrukket omfatter den faste bærer desuden en eller flere prøvefordybninger med i hovedsagen flad bundoverflade og divergerende sidevægge. Substratet. immobi1iseres fortrinsvis« på fordyPn i ngernes flade bundoverflader. Fordybningerne med substratet aflejret derpå 35 frembyder således et afgrænset område, hvori bestemmelser af en væske kan ske. Immobi1iseret under regulerede temperatur-og fugtighedsbetingelser (f.eks. 20e‘C og 70% fugtighed) dannes 7

DK 159175 B

en kolloid film med en tykkelse på 40 - 50 mikron, og som er vandpermeabel.

Med kontrollerede tørringshastigheder (temperatur og fugtighed 5 må ikke svinge eller være ekstreme, og der tolereres ingen udsættelse for træk) og med den passende fortynding med destilleret vand, som vist i sammensætningen, bringes en flydende aflejring af emulsionen med en højde på ca. 75 mikron til at flyde sammen til en tyk film på ca. 40 - 45 mikron, som vist i 10 elektronmikrografer.

Når en typisk film er tør, vejer den fra 60 til 65 mg. Efter 10 minutters udsættelse for vandige opløsninger (f.eks. efter udblødning i vand eller aflejringer af legemsvæsker) vokser 15 filmens vægt til 115 milligram, en 75%'s forøgelse på grund af vandindhold. Selv efter 1¾ times påfølgende tørring ved stuetemperatur findes der et resterende overskud på 6 - 7% vandindhold, som forsvinder eksponentielt.

20 0e følgende eksempler illustrerer brugen af materialerne ifølge opfindelsen til immunbestemmelse af væsker ved diagnose af sygdomme.

EKSEMPEL 1.

25

Katteleukæmi-bestemmeIse.

Bestemmelse af opbrug af antistof: 30

Materiale ifølge opfindelsen blev immobi1iseret på bunden af prøvefordybninger i en fast bærer. P-27-antigen, et af kerneantigenerne i katteleukæmivi rus, blev høstet fra en voksende cellelinie Fl-74 og aflejret på en første prøvefordybning. 1 35 en anden prøvefordybning blev en prøve indeholdende P-27-antigen inkuberet med anti-P-27-antistof, der var udviklet i

DK 159175 B

s kaniner. Efter 10 minutters inkubation blev en del af denne blanding overført til den første forsøgsfordybning for at lade eventuelt frit antistof, der ikke allerede var bundet til antigenprøven, gå i forbindelse med P-27-antigenet i substratet.

5 Efter 15 minutters inkubation og en kort vask blev gede-anti-kanin-immunoglobulin G (IgG), som var mærket med fluorescein-isothiocyanat (FITC), sat til substratet. Efter 10 minutters inkubation blev substratet vasket og indsat i et Daryl "TRACK ΧΓ’-apparat og målt for transmitteret fluorescerende lys. Ka-10 1ibreringsprøver af leukæmivirus var normal kattesera indehol dende kendte koncentrationer af P-27-antigenet.

Kliniske forsøg med 104 tidligere frosne katteserumprøver viste en specificitet på 85% og en følsomhed på 95% over for 15 en sammenlignet ELISA-subjektiv "sandwich"-bestemmelse.

EKSEMPEL 2.

20 Fluorescensimmunbestemmelse af katteinfektiøs peritonitis CFIP1.

Til alternative fordybninger indeholdende materiale ifølge opfindelsen blev anvendt kontrol præparat og antigenpræparat.

25 Kontrolpræparatet var overliggende væske, der var fremkommet af dyrkede svinenyreceller (PK), fortyndet 1:3 med 0,1 M bicarbonatstødpude, pH 9. Antigenpræparatet var TGE-virioner fremkommet af overliggende væske fra dyrkede PK-celler, der var inficeret med TGE-vi rus (Mi lier-stammen). Katteinfektiøs 30 peritonitis-antistoffer krydsreagerer kraftigt med TGE-vi rus.

En katteblodprøve blev indført i både kontrol- og antigenfordybningen og inkuberet i 10 minutter. Efter en vask blev ka-nin-anti-kat-IgG med FITC-mærke derefter indført i fordybnin-35 gerne. Efter 10 minutters inkubation og en endelig vask med vand blev fordybningerne undersøgt for fluorescens i måleapparatet. Ved analyse af resultaterne trækkes fluorescensen af \ 9

DK 159175 B

kontrollen fra den fra antigenfordybningen fremkomne fluorescens af begge kalibrerede prøver og ukendte prøver for at få en netto-fluorescensaflæsning. - Kalibrerede prøver er sammenblandede sera med kendt FIP-titer bestemt ved anden teknik.

5 Kliniske forsøg med 124 prøver af forud frosne katteserumprø-ver visete en specificitet på 80% sammenlignet med den kendte kinetiske enzymbundne bestemmelse (KELA) og en følsomhed på 90%.

10 EKSEMPEL 3.

Fluorescensimmunbestemmelse af Toxoplasma gondii.

15 Toxoplasma gondii kan påvirke mange forskellige dyr, men katten tjener som det naturlige reservoir. Den er af alvorlig klinisk betydning, idet overføring fra en huskat til en gravid ejer kan føre til katastrofale fødselsdefekter hos fosteret. Både den svangre kvinde og hendes kat skal derfor undersøges 20 periodisk ved serologi under svangerskabet.

Til understøttet materiale, som anvendt i eksempel 1, sættes opløselige antigener, der er ekstraheret fra sprængte Toxoplasma gondii-organismer. Substrat og antigen immobi1iseres i 25 prøverfordybninger. En dråbe fuld, ufortyndet serum eller blod anbringes i hver fordybning. Fordybningerne inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur for at tillade reaktionen mellem antistoffer for T. gondii og det immobi1 i serede antigen. Fordybningerne vaskes og bringes så i kontakt med anti-katte- 30 antistoffer mærket med fluoresceinisothiocyanat (FITC). Efter 10 minutters inkubation blev fordybningerne vasket og iagttaget for fluoresens. Kontrolprøver med kendt titer blev behandlet samtidig for at skabe en kalibreringsprøve.

35 10

DK 159175 B

EKSEMPEL 4.

De følgende bestemmelser blev udført ved anvendelse af den 5 almene fremgangsmåde, og materialet og udstyret, der er beskrevet i eksempel 1-3. Katte-IgG blev fremstillet som i eksempel 3, men intet antistof eller antigen blev forud tilført det kolloide substrat. Serum blev anbragt i fordybninger i 10 minutter. Alle serumproteiner blev absorberet.

10 Efter vask blev anti-katte-IgQ-antistof med FITC-mærke tilført. Det reagerede kun med det bundne IgG. Efter 10 minutters inkubation blev overskud af anti-katte-IgG vasket bort, og fluorescensen blev aflæst. Kalibreringer gav kvantificering i mg IgG pr. 100 ml blod.

15

Heste-IgG-bestemmelse blev udført på samme måde som katte-IgG-bestemmelsen, men blev kalibreret til lave niveauer for at bestemme, om et nyfødt føl var immunodefekt, da det ikke havde taget råmælken fra hoppen.

20

Hundesyge-antistof, hundeparvovirus-antistof og hunde-antistof mod Brucella blev alle anvendt i ,,sandwich"-teknik, udført som i eksempel 3, og rettet mod de pågældende antigener. Alle anvendte to 10 minutters inkubationer og to korte vaskninger.

25 Ingen krævede brug af kontrol fordybninger således som FIP-prøven i eksempel 2. Til en prøve for reumatoide faktorer i hunde var antigenet "ændret" kanin-IgG, hvortil der i nogle hunde rettes IgM-antistoffer. Et anti-hund-IgM-antistof med FITC-mærke blev anvendt på samme måde som i eksempel 1-3.

30 Til en hunde-antinuklear antistofprøve blev dobbeltstrenget og enkeltstrenget DNA plus ribonuklear protein kombineret som antigen. Prøven blev udført som i eksempel 1-3.

35

Claims (12)

1. Materiale til f luorescensimmu'nbestemmelse af biologiske 5 væsker, med et kvældbart, rehydratiserbart polymert proteinbindende materiale, som danner en tredimensional grundmasse, kendetegnet ved, (1) partikelformede i kke-speci- fikke lysspredende centre fordelt i den polymere grundmasse, og som er i stand til at sprede synligt lys, og (2) partikel- 10 formede specifikke lysspredende centre fordelt i den polymere grundmasse, der er i stand til at reflektere specifikt fluorescerende stimuleringslys og absorbere uspecifikt lys.

2. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 15 det polymere prateinbindende materiale er en acrylcopolymer.

3. Materiale ifølge krav 2, kendetegnet ved, at acrylcopolymeren består af methacrylsyre og polymethylmeth-acry1 at. 20

4. Materiale ifølge krav i, kendetegnet ved, at de ikke-specifikke lysspredende centre er oxider af titan og zink hver for sig eller i kombination.

5. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det specifikke lysspredende centrum er en phthalocyaninforbin-delse.

6. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 30 det er immobi1iseret på en fast bærer.

7. Materiale ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den faste bærer har en i det væsentlige flad overflade.

8. Materiale ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det omfatter en eller flere prøvefordybninger, der har i hovedsagen flad bund og udadskrånende sidevægge og hvor materialet er immobi1 i seret på bunden. DK 159175 B

9. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at substratet er et lag med en dybde fra 40 til 50 mikron på den flade overflade.

10. Materiale ifølge et af de foregående krav, kende tegnet ved, at det har bundet deri og dertil et første stof, som er i stand til at reagere med et eller flere følgende stoffer til dannelse af et fluorescerende produkt.

11. Materiale ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det første stof er et antigen eller antistof.

12. Materiale ifølge krav 11, kendetegnet ved, at antigenet eller en fraktion deraf er TGE-virioner, P-27-anti-15 genet eller katteleukæmivirus, Toxoplasma gondii, hundesyge-virus, hundeparvovirus, hunde-Brucel1a-organismer, Brucella abortus-organismer, hjerteorm eller Trichinella. 20 25 30 35