JP2753597B2 - グルコース―６―リン酸の測定方法および測定用組成物 - Google Patents
グルコース―６―リン酸の測定方法および測定用組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、グルコース−６−リン酸の測定方法および
測定用組成物に関する。
測定用組成物に関する。
本明細書において、核酸、ヌクレオチド、糖質または
酵素などに関して用いる略号は、生化学命名委員会（CB
N）の勧告によるかあるいは当該分野の慣用に従うもの
とし、具体的には以下のとおりである。
酵素などに関して用いる略号は、生化学命名委員会（CB
N）の勧告によるかあるいは当該分野の慣用に従うもの
とし、具体的には以下のとおりである。
ADP:アデノシン二リン酸 AMY:アミラーゼ ATP:アデノシン三リン酸 CR:クレアチン CK:クレアチンキナーゼ CMS:カルボキシメチルスターチ CP:クレアチンリン酸 GA:グルコアミラーゼ Glc:グルコース Glck:グルコキナーゼ G6P:グルコース−６−リン酸 G6PDH:グルコース−６−リン酸脱水素酵素 HK:ヘキソキナーゼ NAD:酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド NADH:還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド NADP:酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸 NADPH:還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸 6PG:6−ホスホグルコン酸 6PG−δ−L:6−ホスホ−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン 背景技術 ヒト血清等の生体液体試料中に含まれている各種の酵
素や生理活性物質を、酵素反応の特異性に基づいて分析
し、疾病診断や臨床検査に利用する測定技術が広く実施
されている。その測定技術において、各種の検査対象・
生理活性物質からグルコース−６−リン酸（G6P）を定
量的に誘導し、以下の反応式（Ｉ） に示す様に、そのグルコース−６−リン酸（G6P）をグ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素（G6PDH）およびNADま
たはNADPの存在下で脱水素化して６−ホスホグルコン酸
（6PG）を生成させ、それと同時に生成されるNADH量ま
たはNADPH量を吸光度から測定して、前記の検査対象・
生理活性物質を定量する方法も周知である。
ン酸 NADPH:還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸 6PG:6−ホスホグルコン酸 6PG−δ−L:6−ホスホ−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン 背景技術 ヒト血清等の生体液体試料中に含まれている各種の酵
素や生理活性物質を、酵素反応の特異性に基づいて分析
し、疾病診断や臨床検査に利用する測定技術が広く実施
されている。その測定技術において、各種の検査対象・
生理活性物質からグルコース−６−リン酸（G6P）を定
量的に誘導し、以下の反応式（Ｉ） に示す様に、そのグルコース−６−リン酸（G6P）をグ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素（G6PDH）およびNADま
たはNADPの存在下で脱水素化して６−ホスホグルコン酸
（6PG）を生成させ、それと同時に生成されるNADH量ま
たはNADPH量を吸光度から測定して、前記の検査対象・
生理活性物質を定量する方法も周知である。
G6Pに誘導して定量することのできる検査対象・生理
活性物質としては、例えば、心筋梗塞や筋ジストロフィ
ーなどの診断指標となるクレアチンキナーゼ（CK）、膵
疾患や肝疾患等の診断指標となるアミラーゼ（AMY）、
または糖尿病などの診断指標となるグルコース（Glc）
を挙げることができる。定量的に誘導されたG6Pから前
記式（Ｉ）の反応でNAD（Ｐ）Ｈを生成させ、その増加
を、例えば波長340nmにおける吸光度変化から測定し、
その測定値から、前記の生理活性物質のレベルを分析
し、疾病診断や臨床検査を行うことができる。
活性物質としては、例えば、心筋梗塞や筋ジストロフィ
ーなどの診断指標となるクレアチンキナーゼ（CK）、膵
疾患や肝疾患等の診断指標となるアミラーゼ（AMY）、
または糖尿病などの診断指標となるグルコース（Glc）
を挙げることができる。定量的に誘導されたG6Pから前
記式（Ｉ）の反応でNAD（Ｐ）Ｈを生成させ、その増加
を、例えば波長340nmにおける吸光度変化から測定し、
その測定値から、前記の生理活性物質のレベルを分析
し、疾病診断や臨床検査を行うことができる。
しかしながら、従来の測定系においては、試料中の生
理活性物質含有量が一定量を越えると、所定の試薬組成
および反応時間内においてNAD（Ｐ）Ｈの生成量が定量
的には増加せず、生理活性物質含有量を正確に測定する
ことができないことがあった。従って、最初の測定で試
料中の生理活性物質含有量が多いことがわかった場合に
は、その試料を適当に希釈して再検査する必要があっ
た。
理活性物質含有量が一定量を越えると、所定の試薬組成
および反応時間内においてNAD（Ｐ）Ｈの生成量が定量
的には増加せず、生理活性物質含有量を正確に測定する
ことができないことがあった。従って、最初の測定で試
料中の生理活性物質含有量が多いことがわかった場合に
は、その試料を適当に希釈して再検査する必要があっ
た。
本発明の目的は、従来法において正確な測定が不可能
であった高濃度域においても、正確な測定を行うことが
できる手段を提供することにある。
であった高濃度域においても、正確な測定を行うことが
できる手段を提供することにある。
発明の開示 前記の目的は、本発明により、 グルコース−６−リン酸とNADまたはNADPとをグルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素の存在下で脱水素して６−
ホスホグルコン酸とNADHまたはNADPHとを生じさせる工
程を含むグルコース−６−リン酸の測定方法において、
６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させることを特
徴とする、前記の測定方法によって達成することができ
る。
ース−６−リン酸脱水素酵素の存在下で脱水素して６−
ホスホグルコン酸とNADHまたはNADPHとを生じさせる工
程を含むグルコース−６−リン酸の測定方法において、
６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させることを特
徴とする、前記の測定方法によって達成することができ
る。
また、本発明は、 ６−ホスホグルコノラクトナーゼと、グルコース−６
−リン酸脱水素酵素と、NADまたはNADPとを含むことを
特徴とする、グルコース−６−リン酸の測定用組成物に
も関する。
−リン酸脱水素酵素と、NADまたはNADPとを含むことを
特徴とする、グルコース−６−リン酸の測定用組成物に
も関する。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明の６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下（曲線２）および不在下（曲線１）における、
グルコース−６−リン酸の消費量の差を示すグラフであ
る。
の存在下（曲線２）および不在下（曲線１）における、
グルコース−６−リン酸の消費量の差を示すグラフであ
る。
第２図は、本発明の６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下（曲線４）および不在下（曲線３）における、
クレアチン消費量の差を示すグラフである。
の存在下（曲線４）および不在下（曲線３）における、
クレアチン消費量の差を示すグラフである。
第３図は、本発明の６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下および不在下における、グルコース消費量の差
を示すグラフである。
の存在下および不在下における、グルコース消費量の差
を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 本発明の測定方法および測定用組成物は、従来のG6P
測定系に、新たに６−ホスホグルコノラクトナーゼを共
存させることからなる。
測定系に、新たに６−ホスホグルコノラクトナーゼを共
存させることからなる。
従って、本発明で用いるG6Pは、任意の公知の反応系
から誘導したものでよい。例えば、クレアチンキナーゼ
（CK）、アミラーゼ（AMY）、またはグルコース（Glc）
の測定で誘導されたものであることができる。また、G6
PDHとしても、従来法で使用されている任意の酵素（例
えば、市販酵素）を用いることができる。
から誘導したものでよい。例えば、クレアチンキナーゼ
（CK）、アミラーゼ（AMY）、またはグルコース（Glc）
の測定で誘導されたものであることができる。また、G6
PDHとしても、従来法で使用されている任意の酵素（例
えば、市販酵素）を用いることができる。
本発明において新たに加える６−ホスホグルコノラク
トナーゼは公知の酵素であり、後述するように６−ホス
ホ−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（6PG−δ−Ｌ）を６
−ホスホグルコン酸（6PG）に変える活性を有し、例え
ば、J.Research Natl.Bur.Standards,48,163（1952）；
または、生化学,37,788（1965）に記載されている。６
−ホスホグルコノラクトナーゼは、例えば、シュードモ
ナス属（Pseutdomonas）もしくはロイコノストック属
（Leyconostoc）に属する微生物、または酵母から得る
ことができる。６−ホスホグルコノラクトナーゼの添加
量には特に制限はなく、前記の6PG−δ−Ｌから6PGへの
反応を進行させるのに十分な量で存在させればよい。
トナーゼは公知の酵素であり、後述するように６−ホス
ホ−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン（6PG−δ−Ｌ）を６
−ホスホグルコン酸（6PG）に変える活性を有し、例え
ば、J.Research Natl.Bur.Standards,48,163（1952）；
または、生化学,37,788（1965）に記載されている。６
−ホスホグルコノラクトナーゼは、例えば、シュードモ
ナス属（Pseutdomonas）もしくはロイコノストック属
（Leyconostoc）に属する微生物、または酵母から得る
ことができる。６−ホスホグルコノラクトナーゼの添加
量には特に制限はなく、前記の6PG−δ−Ｌから6PGへの
反応を進行させるのに十分な量で存在させればよい。
本発明の分析用組成物は、６−ホスホグルコノラクト
ナーゼ0.01〜50U/ml、好ましくは0.01〜10U/mlと、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素0.5〜20U/ml、好ましく
は１〜5U/mlと、NADまたはNADP0.2〜20mM、好ましくは
0.5〜5mMとを含有する。
ナーゼ0.01〜50U/ml、好ましくは0.01〜10U/mlと、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素0.5〜20U/ml、好ましく
は１〜5U/mlと、NADまたはNADP0.2〜20mM、好ましくは
0.5〜5mMとを含有する。
本発明においては、測定系を酸性ないし弱アルカリ性
（特には、pH約5.5〜約85）に調整することのできる任
意の緩衝液、例えば、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝
液、リン酸緩衝液、またはグッド緩衝液を用いることが
できる。
（特には、pH約5.5〜約85）に調整することのできる任
意の緩衝液、例えば、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝
液、リン酸緩衝液、またはグッド緩衝液を用いることが
できる。
本発明においては、種々の反応系によって検査対象・
生理活性物質から誘導されたG6Pに対して、G6PDH、NAD
（Ｐ）および６−ホスホグルコノラクトナーゼを含む試
薬組成物を加え（または、G6Pを誘導する反応系に最初
から前記組成物を共存させ）、反応によって生成するNA
D（Ｐ）Ｈの量を波長340nm付近における吸光度によって
測定し、その測定値から目的とする検査対象・生理活性
物質の活性を測定することができる。
生理活性物質から誘導されたG6Pに対して、G6PDH、NAD
（Ｐ）および６−ホスホグルコノラクトナーゼを含む試
薬組成物を加え（または、G6Pを誘導する反応系に最初
から前記組成物を共存させ）、反応によって生成するNA
D（Ｐ）Ｈの量を波長340nm付近における吸光度によって
測定し、その測定値から目的とする検査対象・生理活性
物質の活性を測定することができる。
本発明を用いて、水性液体、特に生物学的水性液、例
えば、血液または血液から誘導した液体（特に血清、ま
たは血漿）、あるいは尿または組織抽出液中に含まれて
いるクレアチンキナーゼ（CK）、アミラーゼ（AMY）ま
たはグルコース（Glc）を測定することができる。以
下、それらの生理活性物質の測定方法について順に説明
する。
えば、血液または血液から誘導した液体（特に血清、ま
たは血漿）、あるいは尿または組織抽出液中に含まれて
いるクレアチンキナーゼ（CK）、アミラーゼ（AMY）ま
たはグルコース（Glc）を測定することができる。以
下、それらの生理活性物質の測定方法について順に説明
する。
クレアチンキナーゼ（CK） 従来から公知のCK測定法の反応経路の一例を示せば、
以下のとおりである。
以下のとおりである。
本発明によれば、前記式（Ｉ）の脱水素反応におい
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる。本
発明は、前記式（II）、式（III）および式（Ｉ）から
なる全反応系を１工程または多工程で実施するいずれか
の方法においても用いることができる。従って、６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを全反応系の最初から存在さ
せても、後から添加してもよい。このCK測定法の被検試
料としては、CKを含む可能性のある試料であれば特に制
限されないが、特には血液または血液から誘導した液体
（特に血清、または血漿）、あるいは尿または組織抽出
液を挙げることができる。
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる。本
発明は、前記式（II）、式（III）および式（Ｉ）から
なる全反応系を１工程または多工程で実施するいずれか
の方法においても用いることができる。従って、６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを全反応系の最初から存在さ
せても、後から添加してもよい。このCK測定法の被検試
料としては、CKを含む可能性のある試料であれば特に制
限されないが、特には血液または血液から誘導した液体
（特に血清、または血漿）、あるいは尿または組織抽出
液を挙げることができる。
アミラーゼ（AMY） 従来から公知のAMY測定法の反応経路の一例を示せ
ば、以下のとおりである。
ば、以下のとおりである。
本発明によれば、前記式（Ｉ）の脱水素反応におい
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる。本
発明は、前記式（IV）、式（Ｖ）および式（Ｉ）からな
る全反応系を１工程または多工程で実施するいずれの方
法においても用いることができる。従って、６−ホスホ
グルコノラクトナーゼを全反応系の最初から存在させて
も、後から添加してもよい。このAMY測定法の被検試料
としては、AMYを含む可能性のある試料であれば特に制
限されないが、特には血液または血液から誘導した液体
（特に血清、または血漿）、あるいは尿または組織抽出
液を挙げることができる。
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる。本
発明は、前記式（IV）、式（Ｖ）および式（Ｉ）からな
る全反応系を１工程または多工程で実施するいずれの方
法においても用いることができる。従って、６−ホスホ
グルコノラクトナーゼを全反応系の最初から存在させて
も、後から添加してもよい。このAMY測定法の被検試料
としては、AMYを含む可能性のある試料であれば特に制
限されないが、特には血液または血液から誘導した液体
（特に血清、または血漿）、あるいは尿または組織抽出
液を挙げることができる。
グルコース（Glc） 従来から公知のGlc測定法の反応経路の一例を示せ
ば、以下のとおりである。
ば、以下のとおりである。
本発明によれば、前記式（Ｉ）の脱水素反応におい
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる。本
発明は、前記式（VI）および式（Ｉ）からなる全反応系
を１工程または多工程で実施するいずれかの方法におい
ても用いることができる。従って、６−ホスホグルコノ
ラクトナーゼを全反応系の最初から存在させても、後か
ら添加してもよい。このGlc測定法の被検試料として
は、Glcを含む可能性のある試料であれば特に制限され
ないが、特には血液または血液から誘導した液体（特に
血清、または血漿）、あるいは尿または組織抽出液を挙
げることができる。
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させる。本
発明は、前記式（VI）および式（Ｉ）からなる全反応系
を１工程または多工程で実施するいずれかの方法におい
ても用いることができる。従って、６−ホスホグルコノ
ラクトナーゼを全反応系の最初から存在させても、後か
ら添加してもよい。このGlc測定法の被検試料として
は、Glcを含む可能性のある試料であれば特に制限され
ないが、特には血液または血液から誘導した液体（特に
血清、または血漿）、あるいは尿または組織抽出液を挙
げることができる。
次に、本発明の測定原理を説明するが、本発明は以下
の記載によって限定されるものではない。
の記載によって限定されるものではない。
前記式（Ｉ）の反応を素反応に分けると以下のとおり
である。
である。
即ち、グルコース−６−リン酸（G6P）をグルコース
−６−リン酸脱水素酵素（G6PDH）の存在下で脱水素化
すると、まず６−ホスホ−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン
（6PG−δ−Ｌ）が生成し、続いて６−ホスホグルコン
酸（6PG）が生成する。
−６−リン酸脱水素酵素（G6PDH）の存在下で脱水素化
すると、まず６−ホスホ−Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン
（6PG−δ−Ｌ）が生成し、続いて６−ホスホグルコン
酸（6PG）が生成する。
ここで、式（１）の反応は可逆反応であり、式（２）
の反応は不可逆反応であるものと思われる。式（１）の
左方向反応（6PG−δ−ＬからG6Pへの反応）の速度と比
較して式（２）の反応速度が速ければ、式（１）の反応
生成物・6PG−δ−Ｌがすぐに式（２）によって6PGに変
化していくので、式（１）の反応は右方向（G6Pから6PG
−δ−Ｌ）へ進行し、反応系中のNAD（Ｐ）Ｈ量が増大
する。逆に、式（２）の反応速度が遅いと、式（１）の
反応生成物・6PG−δ−Ｌは、式（１）の可逆反応によ
ってG6Pに戻り、その際にNAD（Ｐ）Ｈを消費するので、
反応系中のNAD（Ｐ）Ｈ量の増加を抑える方向へ働く。
の反応は不可逆反応であるものと思われる。式（１）の
左方向反応（6PG−δ−ＬからG6Pへの反応）の速度と比
較して式（２）の反応速度が速ければ、式（１）の反応
生成物・6PG−δ−Ｌがすぐに式（２）によって6PGに変
化していくので、式（１）の反応は右方向（G6Pから6PG
−δ−Ｌ）へ進行し、反応系中のNAD（Ｐ）Ｈ量が増大
する。逆に、式（２）の反応速度が遅いと、式（１）の
反応生成物・6PG−δ−Ｌは、式（１）の可逆反応によ
ってG6Pに戻り、その際にNAD（Ｐ）Ｈを消費するので、
反応系中のNAD（Ｐ）Ｈ量の増加を抑える方向へ働く。
従来、式（２）の反応は、特に酵素を必要とせず、例
えば加水分解になどにより速やかに進行するものと考え
られていた。
えば加水分解になどにより速やかに進行するものと考え
られていた。
しかしながら、本発明者が見い出したところによれ
ば、本発明による６−ホスホグルコノラクトナーゼを存
在させない場合、pH8.5以上では式（２）の反応が比較
的速やかに進行するpH8.5以上では式（２）の反応が比
較的速やかに進行するのに対し、pH8.5以上では式
（２）の反応進行速度は極めて遅いことがわかった。
ば、本発明による６−ホスホグルコノラクトナーゼを存
在させない場合、pH8.5以上では式（２）の反応が比較
的速やかに進行するpH8.5以上では式（２）の反応が比
較的速やかに進行するのに対し、pH8.5以上では式
（２）の反応進行速度は極めて遅いことがわかった。
従って、pH8.5以下において、本発明による６−ホス
ホグルコノラクトナーゼの不存在下で、前記式（Ｉ）、
即ち式（１）および（２）の反応を行うと、通常の測定
時間内では反応が完了せず、得られる結果も不正確なも
のとなる。例えば、クレアチンキナーゼ（CK）の場合、
活性測定至適pHは一般に約6.5であるので、前記の現象
は重大な影響を与える。
ホグルコノラクトナーゼの不存在下で、前記式（Ｉ）、
即ち式（１）および（２）の反応を行うと、通常の測定
時間内では反応が完了せず、得られる結果も不正確なも
のとなる。例えば、クレアチンキナーゼ（CK）の場合、
活性測定至適pHは一般に約6.5であるので、前記の現象
は重大な影響を与える。
本発明は、前記のように、前記式（１）の脱水素反応
工程に特定の酵素を存在させることにより、式（２）の
反応を促進させて、短時間内に反応を完結させ、迅速
で、正確で、高精度の測定結果が得られることを可能に
するものである。
工程に特定の酵素を存在させることにより、式（２）の
反応を促進させて、短時間内に反応を完結させ、迅速
で、正確で、高精度の測定結果が得られることを可能に
するものである。
なお、本発明は、pH8.5以下での測定に利用するのが
特に好ましいが、pH8.5以上での測定に用いて、一層迅
速で、正確で、高精度の測定結果を得ることもできる。
特に好ましいが、pH8.5以上での測定に用いて、一層迅
速で、正確で、高精度の測定結果を得ることもできる。
実施例 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
が、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１ G6PDH（ベーリンガー・マンハイム社製）2U/mlとNADP
（オリエンタル酵母社製）2.5mMとを含有する100mMイミ
ダゾール−酢酸緩衝液（pH6.7）［以下、Ａ液と称す
る］3mlに、G6P（オリエンタル酵母社製）8mMを含有す
る100mMイミダゾール緩衝液（pH6.7）30μｌを加え、37
℃で反応させ、NADPH量の増加を示す、波長340nmにおけ
る吸光度変化を経時的に10分間測定した。結果を第１図
の曲線１に示す。
（オリエンタル酵母社製）2.5mMとを含有する100mMイミ
ダゾール−酢酸緩衝液（pH6.7）［以下、Ａ液と称す
る］3mlに、G6P（オリエンタル酵母社製）8mMを含有す
る100mMイミダゾール緩衝液（pH6.7）30μｌを加え、37
℃で反応させ、NADPH量の増加を示す、波長340nmにおけ
る吸光度変化を経時的に10分間測定した。結果を第１図
の曲線１に示す。
次に、前記Ａ液の代わりに、６−ホスホグルコノラク
トナーゼ（後記参考例で調製したもの）0.2U/mlをＡ液
に添加して調製した液3mlを使用すること以外は前記と
同様に操作して、NADPH量の増加を10分間測定した。結
果を第１図の曲線２に示す。
トナーゼ（後記参考例で調製したもの）0.2U/mlをＡ液
に添加して調製した液3mlを使用すること以外は前記と
同様に操作して、NADPH量の増加を10分間測定した。結
果を第１図の曲線２に示す。
実施例２ ヒトプール血清に、CK（ウサギ筋肉由来：ベーリンガ
・マンハイム社）を5000U/リットルの濃度で加えてか
ら、精製水で希釈し、10種（500U/リットル、1000U/リ
ットル、1500U/リットル、2000U/リットル、2500U/リッ
トル、3000U/リットル、3500U/リットル、4000U/リット
ル、4500U/リットル、および5000U/リットル）の希釈系
列を調製した。
・マンハイム社）を5000U/リットルの濃度で加えてか
ら、精製水で希釈し、10種（500U/リットル、1000U/リ
ットル、1500U/リットル、2000U/リットル、2500U/リッ
トル、3000U/リットル、3500U/リットル、4000U/リット
ル、4500U/リットル、および5000U/リットル）の希釈系
列を調製した。
次に、グルコキナーゼ（ユニチカ社製）4U/mlと、グ
ルコース25mMと、ADP2mMと、G6PDH（ベーリンガ・マン
ハイム社製）1.5U/mlとNADP（オリエンタル酵母社製）
2.8mMとを含有する100mMイミダゾール−酢酸緩衝液（pH
6.7）［以下、Ｂ液と称する］320μｌ、およびクレアチ
ンリン酸125mMと酢酸マグネシウム50mMとを含有する25m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）80μｌを前記の各希釈系
列８μｌに加え、37℃で反応させ、反応開始後、３分〜
５分間にかけて、吸光度変化を波長340nmにおいて測定
し、単位時間当たりの吸光度変化量（ΔAbs/min）を求
めた。結果を第２図において○（線３）で示す。
ルコース25mMと、ADP2mMと、G6PDH（ベーリンガ・マン
ハイム社製）1.5U/mlとNADP（オリエンタル酵母社製）
2.8mMとを含有する100mMイミダゾール−酢酸緩衝液（pH
6.7）［以下、Ｂ液と称する］320μｌ、およびクレアチ
ンリン酸125mMと酢酸マグネシウム50mMとを含有する25m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）80μｌを前記の各希釈系
列８μｌに加え、37℃で反応させ、反応開始後、３分〜
５分間にかけて、吸光度変化を波長340nmにおいて測定
し、単位時間当たりの吸光度変化量（ΔAbs/min）を求
めた。結果を第２図において○（線３）で示す。
次に、前記Ｂ液の代わりに、６−ホスホグルコノラク
トナーゼ（後記参考例で調製したもの）0.2U/mlをＢ液
に添加して調製した液320μｌを使用すること以外は前
記と同様に操作して、NADPH量を測定した。結果を第２
図において●（線４）で示す。
トナーゼ（後記参考例で調製したもの）0.2U/mlをＢ液
に添加して調製した液320μｌを使用すること以外は前
記と同様に操作して、NADPH量を測定した。結果を第２
図において●（線４）で示す。
実施例３ グルコースを精製水で希釈し、400mg/dl、700mg/dlお
よび1000mg/dlの濃度の希釈溶液を調製した。
よび1000mg/dlの濃度の希釈溶液を調製した。
次に、グルコキナーゼ（ユニチカ社製）4U/mlとG6PDH
（ベーリンガー・マンハイム社製）1.5U/mlとNADP（オ
リエンタル酵母社製）2.8mMとを含有する100mMイミダゾ
ール−酢酸緩衝液（pH6.5）［以下、Ｃ液と称する］2.0
mlに、ATP（ベーリンガー・マンハイム社製）8.5mMを含
有する100mMイミダゾール−酢酸緩衝液（pH6.5）0.50ml
を混合した後、前記の各グルコース希釈溶液20μｌを加
え、37℃で反応させ、反応開始後10分間の吸光度変化を
波長340nmにおいて測定した。
（ベーリンガー・マンハイム社製）1.5U/mlとNADP（オ
リエンタル酵母社製）2.8mMとを含有する100mMイミダゾ
ール−酢酸緩衝液（pH6.5）［以下、Ｃ液と称する］2.0
mlに、ATP（ベーリンガー・マンハイム社製）8.5mMを含
有する100mMイミダゾール−酢酸緩衝液（pH6.5）0.50ml
を混合した後、前記の各グルコース希釈溶液20μｌを加
え、37℃で反応させ、反応開始後10分間の吸光度変化を
波長340nmにおいて測定した。
次に、前記Ｃ液の代わりに、６−ホスホグルコノラク
トナーゼ（後記参考例で調製したもの）0.09U/mlの濃度
となるようにＣ液に添加して調製した液を使用すること
以外は前記と同様に操作して、NADPH量を測定した。
トナーゼ（後記参考例で調製したもの）0.09U/mlの濃度
となるようにＣ液に添加して調製した液を使用すること
以外は前記と同様に操作して、NADPH量を測定した。
前記の結果を第３図に示す。第３図において、曲線5C
はグルコース400mg/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを加えなかった場合、曲線5Eはグルコース40
0mg/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノラクトナーゼを加
えた場合、曲線6Cはグルコース700mg/dl希釈溶液に６−
ホスホグルコノラクトナーゼを加えなかった場合、曲線
6Eはグルコース700mg/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノ
ラクトナーゼを加えた場合、曲線7Cはグルコース1000mg
/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノラクトナーゼを加え
なかった場合、曲線7Eはグルコース1000mg/dl希釈溶液
に６−ホスホグルコノラクトナーゼを加えた場合の結果
を示し、そして曲線８はグルコースを含まない精製水に
６−ホスホグルコノラクトナーゼを加えた場合の結果を
示す。
はグルコース400mg/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを加えなかった場合、曲線5Eはグルコース40
0mg/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノラクトナーゼを加
えた場合、曲線6Cはグルコース700mg/dl希釈溶液に６−
ホスホグルコノラクトナーゼを加えなかった場合、曲線
6Eはグルコース700mg/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノ
ラクトナーゼを加えた場合、曲線7Cはグルコース1000mg
/dl希釈溶液に６−ホスホグルコノラクトナーゼを加え
なかった場合、曲線7Eはグルコース1000mg/dl希釈溶液
に６−ホスホグルコノラクトナーゼを加えた場合の結果
を示し、そして曲線８はグルコースを含まない精製水に
６−ホスホグルコノラクトナーゼを加えた場合の結果を
示す。
参考例:6−ホスホグルコノラクトナーゼの調製 （１）ペナッセイ（Penassay）ブロス（Difco社製）を
用いてシュードモナス・フルオレセンス（Pseudmonas f
luorescens:RIMD1615005;大阪大学微生物病研究所より
入手）を30℃で１日間前培養した。この培養物を、更に
ハート・インフュージョン培地で30℃にて１日間培養し
た。得られた培養液を遠心して集菌した。食塩水で洗浄
後、トリス緩衝液中にて超音波で細胞を破壊し、更に遠
心処理した。上清をpH7.5で硫安分画し、硫安30〜70％
飽和で沈殿するタンパク質分を遠心して集めた。このタ
ンパク質分をトリス緩衝液に溶解させ、透析した後、DE
AEーセルロースカラムで粗精製した。得られた粗精製物
をHPLC［カラム充填剤:ZORBAX GF−250（デュポン
社）］によって更に精製し、分子量３万〜５万に流出す
る単一ピーク分として目的の６−ホスホグルコノラクト
ナーゼを分取した。
用いてシュードモナス・フルオレセンス（Pseudmonas f
luorescens:RIMD1615005;大阪大学微生物病研究所より
入手）を30℃で１日間前培養した。この培養物を、更に
ハート・インフュージョン培地で30℃にて１日間培養し
た。得られた培養液を遠心して集菌した。食塩水で洗浄
後、トリス緩衝液中にて超音波で細胞を破壊し、更に遠
心処理した。上清をpH7.5で硫安分画し、硫安30〜70％
飽和で沈殿するタンパク質分を遠心して集めた。このタ
ンパク質分をトリス緩衝液に溶解させ、透析した後、DE
AEーセルロースカラムで粗精製した。得られた粗精製物
をHPLC［カラム充填剤:ZORBAX GF−250（デュポン
社）］によって更に精製し、分子量３万〜５万に流出す
る単一ピーク分として目的の６−ホスホグルコノラクト
ナーゼを分取した。
（２）分取した６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性
は以下の試験によって規定した。
は以下の試験によって規定した。
使用溶液： Ｄ液:NADPが0.85mMおよびG6Pが0.08mMとなるように、10
mM塩化マグネシウムを含む100mMイミダゾール−酢酸緩
衝液（pH6.5）で調製した。
mM塩化マグネシウムを含む100mMイミダゾール−酢酸緩
衝液（pH6.5）で調製した。
Ｅ液:6−ホスホグルコノラクトナーゼを含まないG6PDH
を200U/mlとなるように精製水に溶解して調製した。
を200U/mlとなるように精製水に溶解して調製した。
Ｆ液:6−PGDH硫安懸濁液（120U/ml:ベーリンガー・マン
ハイム社）。
ハイム社）。
操作方法： Ｅ液10μｌにＤ液3mlを加え、37℃で２分間反応させ
た。参考例（１）で調製した６−ホスホグルコノラクト
ナーゼ液20μｌを加え、37℃で２分間放置した後、Ｆ液
５μｌを加えた。Ｆ液を添加してから２〜４分後の波長
340nmにおける吸光度変化を測定した。
た。参考例（１）で調製した６−ホスホグルコノラクト
ナーゼ液20μｌを加え、37℃で２分間放置した後、Ｆ液
５μｌを加えた。Ｆ液を添加してから２〜４分後の波長
340nmにおける吸光度変化を測定した。
この際、２〜４分間の吸光度が0.06Abs.を越えた場
合、または２分までの吸光度0.8Abs.を越えた場合は、
６−ホスホグルコノラクトナーゼ液を精製水で希釈し
て、再度測定を行った。
合、または２分までの吸光度0.8Abs.を越えた場合は、
６−ホスホグルコノラクトナーゼ液を精製水で希釈し
て、再度測定を行った。
同様に、６−ホスホグルコノラクトナーゼ液のかわり
に精製水を用いて空試験を行った。
に精製水を用いて空試験を行った。
活性の計算は以下の式によって行った。
前記の式で、ΔＥは吸光度変化、Ｔは反応時間（mi
n）、εはNADPHの吸光係数（6.22cm2/μmol）、ｄはセ
ル長（cm）、Ｖは最終液料（ml）、ｖは６−ホスホグル
コノラクトナーゼ含有液の液料（ml）、そしてDFは６−
ホスホグルコノラクトナーゼ含有液の希釈倍率である。
n）、εはNADPHの吸光係数（6.22cm2/μmol）、ｄはセ
ル長（cm）、Ｖは最終液料（ml）、ｖは６−ホスホグル
コノラクトナーゼ含有液の液料（ml）、そしてDFは６−
ホスホグルコノラクトナーゼ含有液の希釈倍率である。
産業上の利用可能性 本発明は、グルコース−６−リン酸（G6P）から６−
ホスホグルコン酸（6PG）を生成する脱水素反応工程に
６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させることによ
り、G6Pから6PGへの反応を促進させて、迅速で、正確
で、高精度の測定を可能にするものである。
ホスホグルコン酸（6PG）を生成する脱水素反応工程に
６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させることによ
り、G6Pから6PGへの反応を促進させて、迅速で、正確
で、高精度の測定を可能にするものである。
従って、各種の生体試料に含まれている生理活性物
質、例えば、心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの診断指
標となるクレアチンキナーゼ（CK）、膵疾患や肝疾患等
の診断指標となるアミラーゼ（AMY）、または糖尿病な
どの診断指標となるグルコース（Glc）からG6Pを定量的
に誘導し、更にNAD（Ｐ）Ｈを生成させ、その量を測定
することにより、前記の生理活性物質のレベルを迅速、
正確、そして高精度に分析し、疾病診断や臨床検査を行
うことができる。
質、例えば、心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの診断指
標となるクレアチンキナーゼ（CK）、膵疾患や肝疾患等
の診断指標となるアミラーゼ（AMY）、または糖尿病な
どの診断指標となるグルコース（Glc）からG6Pを定量的
に誘導し、更にNAD（Ｐ）Ｈを生成させ、その量を測定
することにより、前記の生理活性物質のレベルを迅速、
正確、そして高精度に分析し、疾病診断や臨床検査を行
うことができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/54 Ｃ１２Ｑ 1/54 (72)発明者 稲葉 聡 千葉県八千代市大和田新田1144番地 株 式会社ヤトロン八千代工場内 (56)参考文献 特公 平１−55880（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (6)
- 【請求項１】グルコース−６−リン酸とNADまたはNADP
とをグルコース−６−リン酸脱水素酵素の存在下で脱水
素して６−ホスホグルコン酸とNADHまたはNADPHとを生
じさせる工程を含むグルコース−６−リン酸の測定方法
において、６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させ
ることを特徴とする、前記の測定方法。 - 【請求項２】被検試料を、クレアチンリン酸、グルコー
ス、ヘキソキナーゼ、ADP、NADまたはNADP、そしてグル
コース−６−リン酸脱水素酵素と接触させる工程を含む
クレアチンキナーゼの測定方法において、６−ホスホグ
ルコノラクトナーゼを存在させることを特徴とする、前
記の測定方法。 - 【請求項３】被検試料を、スターチ、グルコアミラー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ATP、NADまたはNADP、そしてグル
コース−６−リン酸脱水素酵素と接触させる工程を含む
アミラーゼの測定方法において、６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを存在させることを特徴とする、前記の測定
方法。 - 【請求項４】被検試料を、ヘキソキナーゼ、ATP、NADま
たはNADP、そしてグルコース−６−リン酸脱水素酵素と
接触させる工程を含むグルコースの測定方法において、
６−ホスホグルコノラクトナーゼを存在させることを特
徴とする、前記の測定方法。 - 【請求項５】６−ホスホグルコノラクトナーゼと、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素と、NADまたはNADPとを
含むことを特徴とする、グルコース−６−リン酸の測定
用組成物。 - 【請求項６】６−ホスホグルコノラクトナーゼ0.01〜50
U/mlと、グルコース−６−リン酸脱水素酵素0.5〜20U/m
lと、NADまたはNADP0.2〜20mMとを含む、請求の範囲５
に記載の組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP50401891A JP2753597B2 (ja) | 1990-02-20 | 1991-02-19 | グルコース―６―リン酸の測定方法および測定用組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-39324 | 1990-02-20 | ||
| JP3932490 | 1990-02-20 | ||
| JP50401891A JP2753597B2 (ja) | 1990-02-20 | 1991-02-19 | グルコース―６―リン酸の測定方法および測定用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2753597B2 true JP2753597B2 (ja) | 1998-05-20 |
Family
ID=26378672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50401891A Expired - Lifetime JP2753597B2 (ja) | 1990-02-20 | 1991-02-19 | グルコース―６―リン酸の測定方法および測定用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2753597B2 (ja) |
-
1991
- 1991-02-19 JP JP50401891A patent/JP2753597B2/ja not_active Expired - Lifetime
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