CN1050995C - 通过系统的dsＲＮＡ治疗使宿主防御介质进入生物液体中 - Google Patents

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Abstract

肠道外系统施用dsRNA可使宿主介质释放到各种区域化生物液体中以抵抗各种微生物，特别是病毒，从而降低各种微生物的传染力和传播，所说微生物与由性病瘤，疱疹和HIV引起的各种疾病有关。

Description

包括眼泪，阴道分泌物，和男性精液(富含精子)在内的生物液体可含有各种能引起和传播各种可怕疾病的微生物(真菌、细菌、病毒)。经常采用局部的或直接的抗微生物处理(泡沫体，喷雾剂等)，尽管其极限值是由于微生物的隔绝性质，这些微生物相对地下易受到处理的影响。也可凭借局部刺激限制局部施用，从而增强其引起变态反应的潜力。我在此描述双链核糖核酸(ds RNA)的肠道外给药途径，ds RNA可导致宿主防御介质意外释放到各种生物液体(包括在性交过程中正常交换的液体)中。因此，我已描述了一种降低各种微生物传染力和传播的新技术，这些微生物包括与由性病瘤，疱疹和人类免疫缺陷病毒等引起的各种疾病有关的微生物。
可在防治感染和癌症中起决定性作用的新产物是所谓免疫调节剂，诸如干扰素(IFN)，白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)。它们均为蛋白质药物，可增强和激发机体天然的抗病力。然而，这种含有蛋白质的产品一般可以液体或片剂形式给药，因为在其进入血流之前，可在胃中破坏蛋白质。此外，肠道外(静脉内、肌内或皮下)给药也可产生讨厌的副作用，特别是在药物浓度较高时或在极长的治疗时间内。因此，研究者们试图开发这样的药物，即用于皮肤，眼睛，特别是抵抗各种性病的局部有效制剂。例如，Rapp和Wiz-os(Antimicrobia Agents and Chemotherapy，第2卷，第449页，1985)描述了一种避孕药膏，其中抗病毒剂(IFN)与非离子型表面活性剂去污剂结合，其主要目的在于使性交的一方(或双)不承受疱诊病毒感染。这种局部用制剂的相对效力等还未阐述；但以前使用局部用抗病毒制剂的成功率是有限的。这种方法的限制因素包括隔绝性质(不易受制剂的影响)或某些病毒微粒以及机体受感染区降低的局部免疫能力(不可能作出持久的治疗应答)。
用干扰素诱导物dsRNA特别是多聚I.C的局部组合物，持续释放治疗感染对IFN敏感的病毒的组织，诸如皮肤，眼睛和粘膜的病毒(单纯性疱疹)感染，如在美国专利4,283,393号(Field等人)中所述。该专利文献也描述了局部用抗病毒剂，如作为单纯性疱疹失活性剂的非离子型表面活性剂，如在美国专利4,020,183(Asculai等人)中所述，其可单独使用或与干扰素结合使用，见美国专利4,507,281号(Asculai等人)。
通过一组令人惊奇而新颖的观察，我已克服了先有技术的方法和材料中这些固有的限制因素，在观察中我证明了ds RNA的肠道外给药可引起生物活性dsRNA片段的释放，这些片段易于穿过血—脑屏障并进入区域化液体，包括唾液，眼泪，浆液，浆液性渗出物等等。这些抗病介质易于进入各种生物液体—甚至在这些液体内缺乏可测的完整ds RNA。
这里所用的“区域化体液”是指来自系统血液循环以外的局部化体液。这些区域化体体包括在浆膜表面，粘膜表面，滑衬，尿道表面，颈口衬上的液体，脑脊髓液并位于围液腔内。
我特别说明能够直接攻击病毒并同时装备局部免疫系统的介质。如在泌尿生殖系统中的介质。通过实施本发明，我想明确地说明如何自发地减少男性精液或可能消灭潜在高水平的病毒(包括HIV，疱疹病毒和细胞肥大病毒)，这些病毒在其他方面能使自身和其性伙伴患各种可怕的疾病。本发明也与生产在渗出液或漏出物(关节炎的关节)和脑脊髓液内的抗病介质紧密相关。因此，本发明与各种各样的疾病(如关节炎和中枢神经系统的疾病)直接相关。
在1987年3月11日公开的，题为“双链RNA对病毒相关活动的调节”的欧洲专利申请0213921中，本发明人描述了在人的细胞培养物中HIV受到ds RNA的抑制，特别是用Ampligen作为原型ds RNA时。
图1是一个三部分的高压液相色谱(HPLC)图，在给与实例1患者A ds RNA之前和之后测定天然(2′-5′-寡腺苷酸/RNA酶L)抗病毒途径中患者生物液体中的各种组分。
图2是显示实例1患者C标准曲线⑥和HPLC分析结果④和⑤的三部分图。
图3是显示ds RNA对用ds RNA预处理的细胞被细胞肥大病毒感染的抑制作用与实例4所述未处理细胞对比的图。
本发明描述在机体暴露于病毒前激活天然抗病毒途径和装备个体免疫系统以防治疾病的程序，激活的目的是诱导患者机体将抗病介质释放到各种生物液体中，包括局部化体腔内的生物液体，如下所述。dsRNA，最好是失配的ds RNA片段的肠道外给药(详见下述)导致生物活性ds RNA片段(有时被称为抗病介质)释放到这些生物液体中，甚至在这些液体中缺乏可测的完整ds RNA。这些生物活性ds RNA片段易于穿过血一脑屏障和其他被组织与一般血液循环分隔开的体腔而进入所期望的液体中。
测定生物液体中失活宿主/患者防御介质的诊断试验程序也被描述了，而且如果不够的话，可施用dsRNA，施用量和时间应足以降低一种或多种致病物的量和/或减轻病变并修复必要的ds RNA成为生物活性片段，从而改进检验时液体中防御介体的生化参数。
用本发明的方法诊断和/或治疗的疾病可以是病毒性疾病，例如，包括细胞肥大病毒在内的疱诊病毒类，包括HIV在内的逆转录病毒类，也可以是发炎疾病(例如关节炎)，细菌敏感性疾病或真菌或原生动物引起的疾病。
在血流以外的生物液体中有许多潜在隔开的致病物。系统施用的药物大分子(蛋白质，核酸等)通常不易进入这些区域化生物液体(不包括血液)。如本文所用和医药领域中所知，肠道外给药手段可通过静脉内灌注等使药直接进入血液，或通过最初的肌肉或皮下注射药物大分子释放到血流易于进入的区域。这些高分子量大分子也可适当地装入胶囊。包上肠溶衣或加以保护后口服，它们不会被胃肠道上部的pH和酶所破坏。所有这些释放方式最终都会在血流中或多或少地达到可测的水平或产生大分子，但不会在其它生物液体(浆液)中—当然至少不会以具有高度生物活性的形式或构型测得。
不能到达这些远侧区域化液体的主要原因是物理屏障(膜，细胞等)，它们适用于保护各种体腔(泌尿生殖道，关节，口腔，中枢神经系统等)使致病物不会从一个体腔进入另一个体腔(即，致病物传播)。因此，尽管这些物理屏障在防止疾病传染和减少微生物(包括病毒传播方面对人类有显著的价值，但它们对抗病物质(如免疫调节剂)的有利分布产生很大的阻碍，这种阻碍倾向(a)大分子(虽然不总是如此)，和(b)抗病物质不易穿透这种包括细胞/膜梯度的“屏障”。因此，研究者们都在寻求使这类免疫调节剂/抗病毒剂/抗癌化合物通过生理上适合的屏障(如棉塞，避孕套等)直接释放到局部化体腔内的方法。到目前为止，这类方法只取得了有限的成功。
在浆液腔(如最初进入人体的入口)使广度惊人的致病微生物隔开。关于衣原体(与骨盆发炎和不育有关)和各种病毒，性病(与性交有关)的传染方式极为惊人。例如，生殖器疱诊和口部疱疹，细胞肥大病毒，生殖器瘤和逆转录病毒(特别是HIV)的传播速度都是惊人的并且目前没有迹象表明象基于干扰素的局部用制剂或干扰素—诱导物局部用制剂等方法可作为确定的治疗或预防方法。
本发明的目的在于设计一种治疗方式。使得在各种大量遍及患者体内的浆液中有效地产生抗病介质，这种治疗方法可单独使用或与局部治疗方法结合起来。本发明另外的价值在于它可与传统的方法(如浸有干扰素的避孕套等)协力实行，如果需要对干扰素敏感疾病达到更高程度的局部保护。
我已观察到以前未测出的生化异常，其中与机体抵抗癌症和病毒性疾病的防御机制有关的关键酶(RNA酶L)以加速且明显失控的方式起作用。这些和其它观察见我于1987年7月17日提交的编号为07/074,649的共同未决美国专利申请，题目为“与失控肿瘤和病毒生长周期相关的异常代谢途径双链RNA校正”，其内容作为参考合并于此。在这个实验中，我比较了这两种具有异常RNA酶L的不同细胞和具有正常量RNA酶L细胞抵抗病毒攻击的相对能力。我观察到子代逆转录病毒的效价(产率)在那些具有异常RNA酶L活性的细胞中明显增高，对于NCP其产生得如此迅速。
双链RNA，特别是失配ds RNA，使RNA酶L动力学和降解产物恢复正常(见上述美国专利申请07/074,649所报导)。此外，通过双链RNA使之恢复正常的速度可通过预先与淋巴激活素接触而加快。
双链RNA(ds RNA)是双链合成多聚核苷酸复合物。“失配ds RNA”是指其中在配对链之间的氢键(碱基堆积)是相对完整的，即，每29个连续的碱基残基平均不到一个碱基对的氢键被打断的ds RNA。失配是RNA双螺旋的正常几何形状被代表ds RNA易受攻击点(易被核糖核酸酶酶解)的链向内凹陷(或向外凸起)而打断。这样也可理解“失配ds RNA”。
ds RNA可以是含有一定比例的尿嘧啶碱基或鸟嘌呤碱基，例如1∶5～1∶30这类碱基的多聚肌苷酸和多聚胞苷酸复合物(多聚I.(C4-29X＞U或G)。
ds RNA的通式可为rIn·(C11-14，U)n或rIn·(C12。U)n。n的值从4到29。下面讨论其它适宜的ds RNA实例。
本发明优选的失配ds RNA是基于选自poly(Cn.G)的共聚核苷酸，其中n是4-29的整数，并为多聚核糖肌苷酸和多聚核糖胞苷酸复合物的失配类似物，通过修饰rIn·rCn以沿着多聚核糖胞苷酸(rCn)链掺入未配对碱基(尿嘧啶或鸟嘌呤)形成失配ds RNA。此外，也可通过修饰多聚核糖肌苷酸(rIn)的核酸基骨架，例如含有2′-O-甲基核糖基残基，从多聚肌苷酸，多聚胞苷酸得到ds RNA。Carter和Ts′O在美国专利4,130,641和4,024,222中描述了这些rIn·rCn的失配类似物，优选失配类似物的通式为rIn·r(C11-14，U)n和rIn·r(C29，G)n，其揭示的内容作为参考合并于此。所述的ds RNA一般是适用本发明的。
在优选的失配ds RNA，rIn·(C12，U)n中，包括一段未打断的6-12个碱基对的区域，即，RNA螺旋的半圈到一整圈，作为使淋巴激活素释放的生物触发器和天然抗病毒途径中酶的专性细胞内辅助因子。包括尿嘧啶基的失配区定期插入多聚嘧啶链以加速dsRNA水解，从而防止毒性。
用于本发明的失配ds RNA的其它实例包括：
多聚(I)·多聚(C4，U)
多聚(I)·多聚(C7，U)
多聚(I)·多聚(C13，U)
多聚(I)·多聚(C22，U)
多聚(I)·多聚(C20，G)多聚(I)·多聚(C29，G)和
多聚(I)·多聚(CP)23 GU)p
如在此所讨论的，应了解到淋巴激活素包括干扰素，最好是干扰素α，白细胞介素，特别是白细胞介素2(IL-2)和重组白细胞介素-2(r IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF)。也包括在与淋巴激活素接触的动物中形成的淋巴激活素活化杀伤(LAK)细胞。
当用干扰素(α)作为淋巴激活素时，给药量为每毫升患者体液含0.01-100,000IRU。当IL-2，最好是r IL-2为淋巴激活素时，给药量为每公斤患者体重给大约101IL-2单位，直到接近患者不能接受的毒性水平，可高达106IL-2单位。然而，最有效的，毒性反应易处理的量为每公斤体重大约10-104IL-2。
ds RNA的常用给药量为每毫升患者体液0.1～1,000μgds RNA。体液是指血清，盐，维生素等组成的溶液，其在生物体内循环并浸湿组织。患者的体液量可用医学上可得到的表明受体重量与其体液量相互关系的表来确定，该表显示了患者体液总量和供与必要量的ds RNA平衡的体液量。例如，一位60或70公斤重的患者，其体液量约为5～6升。当同时施用两种药剂(ds RNA和淋巴激活素)时，可以混合物形式分别，但同时给药，或相继给药。
ds RNA和一种淋巴激活素“结合”给药包括两种药剂以治疗混合物的形式一起给药，也包括两种药剂分别但同时给药，例如，通过不同的静脉内路线进入同一个体内。“结合”给药还包括单独给一种药物，其中先给药物之一，不久后再给第二种药物。
实施例1
对几组体重为40～70公斤的个体，每周静脉内注射20～1000克失配ds RNA[AMPLIGEN(HEM Re-search，Inc，Rockville，MD)，通式为rIn·r(C12，U)n的失配ds RNA]并测定其浆液(特别是阴道分泌液和男性精液)中可能存在的ds RNA诱导宿主防御介质。在伴随的临床试验中，在用干扰素或白细胞介素灌注的个体中研究了相似的参数以确定这些方法的特异性。在光学显微镜下，从受治疗患者中分离出的液体包含各种细胞，包括单核细胞，扁平上皮(女性外生殖器样品)和精子(男性精液)以及相当无定形细胞(“碎片”)。
用ds RNA治疗了三例患者，不同时间内观察到的结果总结于下表中：
表1
      系统ds RNA治疗对区域化生物
      液体中的可收集病毒水平的作用患者       时间   外源ds RNA    共培养所载病毒
              (接受量(克))1.患者A    预处理      0        0.6，0.8，0.5(男，患有  4周         1.6      0.3，0.25，0.25HTLV-III   30周        12       0.2，0.15，0.15感染)2.患者B    预处理      0        1.5，1.2，1.2(男，患有  8周         2.8      0.6，0.5，0.7HTLV-III   40周        10.0     0.15，0.10，0.18感染)
                               病毒效价(RFU)3.患者C    预处理      0        1×104，2×104，2×104(女，患有慢性 8周      2.6      2×103，5×102，1×103单纯性疱疹    36周    10.8      ＜1×102，＜1×102，＜1×102(HS)2型感染)
取2.0～4.0cc患者A和B的清液，用最近报导的外周血单核细胞测定方法I(Carter等人，Lancet，第1卷，1987年6月6日，第1287页)通过共培养测定之，精液中可恢复的HIV-III有很高效价。简言之，从正常供体中取血液单核细胞，用PHA刺激2-4天并继续培养28天，然后用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定细胞外病毒。共培养效价的定义为在减去阴性对照值后用ELISA法测得的平均光密度(在490nm处的OD值)(小于0.1)。患者C患有慢性单纯性疱疹，表现在阴道分泌物中，与围肌囊形成有关。用Rapp所述方法利用在35mm平板上增殖的融合HEL细胞培养单纯性疱疹(Rapp等人)，Antimicrob Agent &Chemoth，第28卷，第449页，1985)。
附图1和2报导了在ds RNAr In·r(C12，U)n单独和与淋巴激活素结合系统给药之前和之后，用HLPC法测定患者体液样品的结果。在图1中，用三氯乙酸(TCA)和丙酮沉淀法制备了所有样品，图2中的④和⑤样品也是如此制得。在图2中，用⑥建立一条标准校准曲线，如下所述。图的排列如下：图1，③是治疗前的患者A，②是治疗4周后的患者A；①是治疗12周后的患者A；图2，⑤是治疗前的患者C，④是治疗期间的患者C；⑥是标准曲线。图1和2可与上述表1对比。
在ds RNA系统给药后用高压液相色谱法(HPLC)测定患者样品，结果表明宿主防御介质增加。对于天然(2′-5′寡聚腺苷酸/RNA酶L)抗病毒途径中的各种成分，测定了患者的阴道分泌液(3号)和精液(1号和2号)，见我最近描述的外周血单核细胞(Carter等人，Lancet，如上所述；也见Kariko等人，Biochem. Biophys Res Comm第128卷，695页，1985年和Suhadolnik等人，Biochemistry，22卷，4153页，1983年)。结果如图1A，1B和1C所示。我特别发现了在ds RNA给药前所有系统组分都几乎没有可测的活性。然而，在ds RNA系统给药期间，我观察到在这些浆液中介质特别丰富，如图1和2所示，介质的富集在动力学上与在这些相同位点上病毒表达的降低和完全没有可测的大分子ds RNA相关联。这些值是用我以前报导的快速吸印和液体闪烁分光光度测定法测得的(Brodsky等人，J.Biol.Response Modifiers，第4卷，669页，1985年)。
为估价该方法的特异性，我们还研究了高用量(＜10毫1RU(d)不同干扰素和白细胞介素处理的相似个体(或动物)，在这些区域化体液中没有显示抗病介质作用的加强。然而当系统地将淋巴激活素和失配双链RNA结合注射，在这些区域化体液中明显加强了该调节因子的作用。高压液相色谱结合放射结合，放射免疫和rRNA酶解试验证实作为用于体内任何处的dsRNA结果的特异的新2′-5′寡腺苷酸，当其用足够量时可预定疾病，表1清楚地说明了这一结果。
用TCA丙酮沉淀制备样品后，将其进行高压液相色谱鉴定(见lee和Suhadolnik，Biochemistry Vol，24P551，1985)。用Waters C18微米Bondapark分析柱，通过含甲醇和水的磷酸铵缓冲液(pH7.0)展开梯度(柱长50mm)。命名为#6(图2)的色谱表示用已证实为P3A3和P3A4作的标准校正色谱，P3A3和P3A4为酶促合成的(见Layley等人Europ J.Biochem Vol.143，P165，1984，参考资料也已提及)。关键的分离物为高压液相色谱的峰部分，它们出现在该特定色谱6.8～7分钟和约12分钟洗脱出来的部分，这些蜂是大部分有生物活性的介质，将其命名为P3A3和P3A4，它们分别是2′-5′相连寡腺苷酸介质的三聚体或四聚体。值得注意的是表1的患者A(用其射出的精液分析预处理(图1，③)和后处理②4周时和①12周后)用标准核糖核酸酶L酶解测定显示两种有生物活性的2′-5′寡腺苷酸水平都逐级增加，用HPLC测定证实其结构为2′-5′寡腺苷酸的分子的增值水平。从患者B得到的结果与患者A相似(未给结果)。图2表示在系统dsRNA治疗前(图2，⑤)和治疗期间(图2，④)用患者C阴道分泌物所得结果。值得注意的是对患者C，比较其表1和图2，看出其感染疱疹病毒水平随着根据其生物活性和证实的化学结构测得的介质的增加而急剧降低。
由于不想被任何特定理论和操作方式所束缚，我们在体内局部区得到这些效果的机制似乎至少部分涉及信号转导方法，这里ds RNA作用于血管壁周围或近血管壁的细胞上，该方法导致波动过程从而引起在局部腔内形成介质。
实施例2
本发明确定了该失配双链RNA的唯一结构是实施本发明最有利的操作法。这是由于ds RNA的失配导致在相对稳定的ds RNA复合体内产生一个脆弱区；其结果产生的ds RNA具生物活性的小片段更活跃，它可接近特定的体腔，在那里产生局部的，高特异性的免疫调节和抗病毒作用。然而到达隔绝的体腔不是应用在本试验大多数外源ds RNA的性质。
在用于说明这个现象的其它试验中，我们模拟生物降解的活体条件，通过将少量碱基配对很好的dsRNA(poly I.polyC)及少量失配ds RNA(poly I.poly CU)暴露于S，核酸酶(ds RNA降解酶)，以比较之。两者降解曲线完全不同，我们相信这种不同是针对非常不同的治疗性质。poly I.poly C解降曲线是单特异性的，简单地生成无生物活性的小的残留核酸材料。而与其相反，失配ds RNA的降解曲线是双相的：在曲线的第一相、形成较小的有生物活性的片段；进来的母分子约为1000个碱基对长，相对于沉降值(S20，W)为11.0-15.0S(用超速离心分析得到)，而子分子(部分水解)产物仅为50～100个碱基对长。令人吃惊的是发现它们仍是有生物活性的，作为人的关键的2′-5′腺苷酸天然防御途径一些成分的细胞内催化剂。当在相似条件下将样品poly I.C暴露于可观量ds RNA降解酶如：S1核酸酶时，没有发现这些片段。
在失配ds RNA降解曲线第二相中收集到少于50个碱基对的ds RNA片段。我们将这些片段命名为“抗核酸酶核”，但我们还不能将这种残留片段与用poly I.poly C得到的残留片段区分开。因此，我们的结论是当生物降解具特定构型的ds RNA(命名为失配ds RNA)时，得到了ds RNA特定的生物活性片段，而这些片段又有特殊的人们不期望的性质如：它们可有效地进入系统循环或供血系统以外的体液(腔)内。这些腔包括但不限于各种浆膜和/或粘膜表面，诸如：滑膜内壁，尿道表面，颈骨壁以及脑脊柱和眼液腔。
实施例3
进行体外及体内试验以证实这种在生物降解期间产生的新的ds RNA分子可使各种生物(体)液内天然防御系统(例如，2′-5′腺苷酸系统)的介质达到意料之外的高水平。
A、核酸酶降解相对于失配ds RNA的poly I.polyC：
用放射性poly I.poly C和失配ds RNA研究双链RNA(ds RNA)对核酸酶水解的敏感性。(8-14C)多聚肌苷酸(S.P.act 3.6μCi/μmole)购自P-L Bro-chemicals。这种标记的poly I长度大于1000对碱基。将(8-14C)poly I与未标记poly I.poly C或失配dsRNA混合。将混合物加热变性并重退火，人而得到放射性ds RNAs。
测定S核酸酶(E.C.3.1.30.1)的降解产物。S1核酸酶将降解单链核酸，剩下完整的以链区。用S1核酸酶降解poly I.poly C以每分钟得到1.4％溶于TCA的ds RNA的速率显示单相动力学。加热变性后，水解率达到每分钟1.8％。
用标记的失配ds RNA作类似的试验表明，其降解动力学为两相的天然的失配ds RNA开始有快速降解成分(每分钟3.2％)，而后出现慢得多的降解成分(每次只降解0.5％)。变性的失配ds RNA显示相对快速的降解(每分钟4.5％)。
本试验超过45分钟的天然poly I.poly C和失配ds RNA总体降解是相似的。如前报道(Carter等JMol. Biol，70：567，1972)失配ds RNA水解率开始大于poly I.poly C，而失配ds RNA降解的两相动力学说明这种材料与完全配对的poly I.poly C间有明显的木质的不同。这些结果说明由于其二级或四级结构的明显不同导致这些ds RNA间对核酸酶敏感性的差异及意料之外的生物效应。这些效应在本申请中已报道。此外，一些ds RNA两相成分间水解速率有6倍差异及水解慢的成分的相对低的水解都说明了这类不像是poly I.poly C的ds RNA存在一个相对抗核酸酶的核。
用标准培养基(R PM I1640)加10％热失活的胎儿牛血清或人血清进行核酸酶降解失配ds RNA试验。这种血清是核糖核酸酶的来源。用该培养基降解失配ds RNA是迅速的，在3分钟内可使大约40％这种ds RNA成为TCA可溶的。进一步降解到2小时，也未得到更多量的降解物。系列稀释培养基，再加失配ds RNA温肓3分钟，在1/16稀释的培养基中约有50％降解，再浓的血清也未见加强进一步降解。由于在相当长时间内和可观的稀释范围内TCA可沉淀材料的量相对是稳定的，这种持久的稳定性可能不是由于TCA可溶材料的优先降解。这些结果再一次说明在失配ds RNA分子中有抗核酸酶核的存在。
B、失配ds RNA抗核酸酶核的分子量
通过测定沉降系数来测定其分子量。将未处理的ds RNA样品置于Becman E型超速离心机中在20℃下以48,000转/分离心。每隔8分钟测得5个点用来计算沉降系数。将ds RNA样品在缓冲液A中(含0.15MNaCl，0,01M磷酸钠，0.001M MgCl2，pH7.2，)稀释到OD2600为0.63。再将S1核取酶处理的ds RNA样品(放在缓冲液A中OD260为0.65)在20℃下以52.000转/分离心。用半高度和二次矩(half-height a andsecond moment)方法计算沉降系数。
用以上两个方法计算的ds RNA沉降系数分别为12.74和13.29。用S1核酸酶水解后，ds RNA沉降系数分别降为6.18和7.21。这些数据表明用S1核酸酶处理的失配双链RNA降沉成低分子量的片段。
C、ds RNA抗核酸酶核的生物活性：
用标准组织培养肿瘤生长抑制试验测定S1核酸酶降解的ds RNA的生物活性。将ds RNA与S核酸酶一起温育120分钟，然后用来抑制人纤维肉瘤细胞株H I1080 C14的生长。未处理的对照细胞生长百分数是用50μg/ml S1核酸酶降解的失配ds RNA处理72小时后得到的。未处理的ds RNA抑制细胞生长约为50％。用S1核酸酶处理失配ds RNA时，不管S1核酸酶对其降解的程度，均可见类似的抑制现象。热变性结合S1核酸酶处理消除了失配ds RNA抗增殖作用。
这些结果说明即使延长核酸酶处理后仍可维持失配ds RNA的抗增殖活性。由于这个系统中降解的头15～20分钟内抗核酸酶核似乎仍在产生，稍后的时间内仍抑制生长说明ds RNA抗增殖活性是存在于抗核酸酶核之中，从而还可解释为什么在各种体腔内具生物活性的介质含量很高。
为进一步探索抗核酸酶核的生物活性，用S1核酸酶降解ds RNA60分钟，取少部分用乙醇沉淀以有效地除去不能沉淀的小的降解物。为测定其生物活性，用200μg/ml天然ds RNA，S1核酸酶降解的Ampligen处理人神经胶质瘤细胞株A1235，再用乙醇沉淀，降解ds RNA。培养72小时后，Amligen对A1235细胞的抑制为99.8％，S1核酸酶处理的Ampligen抑制78.1％，乙醇沉淀及S核酸酶处理的Ampligen抑制84.4％，各种处理均保持了ds RNA抗憎增活性。
还测定了在这些A1235细胞株中这些制剂诱导2-5腺苷酸合成酶(ATP：(2′，5′-寡(A)腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.19)的能力。用PBS洗涤细胞沉淀，将其重悬在5ml溶胞缓冲液(20mM Tris，pH7.5，01mM EDTA，0.25M蔗糖，50mM KCl，2mM MgCl2和1m MDTT)置于冰上5分钟。再用PBS洗两次，将细胞沉淀物重悬于0.1ml缓冲液B(20mMH EPES，pH7.5，5mMMgCl2，120mM，DTT和10％甘油)加0.5％Nonidet-P40，置于冰上10分钟以溶胞。在8000g下离心6分钟得到胞质萃取物，将其以50μl的小份贮存在-70℃。
2-5腺苷酸合成酶试验见Suhadolnic等“Bio-chemistry 22：4153(1983)。将融化的细胞萃取物(相当25μg的蛋白)与30μl市售的poly(rI).poly(rC)-琼脂糖混合，在25℃下温育20分钟。用0.4ml缓冲液B洗两次，除去未结合的蛋白。加入含2.5mM(-32P)ATP(0.12 ci/mM)，2.5mM DTT，3单位/ml磷酸肌酸激酶和10mM磷酸肌酸的10μl缓冲液B开始酶促合成2′-5′-寡腺苷酸(2-5A)。30℃下温育20小时，离心(8000g，25℃离心3分钟)沉淀琼脂糖。上清液中2-5A混合物根据Doetsh等人(Nature，291：355，1981)所述方法用DEAE-纤维素柱层析分析。通过0.35M KCl缓冲液的柱洗脱物中放射活性量除以回收的总放射活性量计算出生成的产物。
沉淀后用ds RNA核酸酶处理过的ds RNA和核酸酶处理的ds RNA的无细胞萃取物加酶温育合成2-5A，表明时间对ATP转化成2-5A的作用。还有一些显著的结果。首先，用未处理的失配ds RNA温育无细胞萃取物18小时后，2-5A合成酶的比活性为41.5。其次，在S1核酸酶处理后，ATP向2-5A的转化明显增加。例如：温育18小时后，比活性为284，比用未处理的失配ds RNA所观察的结果高约7倍。第三点，用S1核酸酶处理的ds RNA，再沉淀，12小时后2-5A合成达最高值。这些数据说明在S1核酸酶处理失配ds RNA后使2-5A的三聚体，四聚体及更高寡聚物酶促合成量明显增加。随着ds RNA尺寸的减小而酶活性增加说明是与变构修饰剂，即部分降解的失配ds RNA有关，失配ds RNA可结合到2-5A合成酶上并使之活化，因而比未处理的失配ds RNA更好。这些发现的治疗意义是明显的。与此相反，当S1核酸酶处理的失配ds RNA低分子量降解物被沉淀除去后温育12小时后最大限度合成2-5A。沉淀后S1核酸酶降解的ds RNA使2-5A合成酶达最大活性说明抗核酸酶核可以与温育18小时后用S1核酸酶处理的失配ds RNA激活等同的方式激活2-5A合成酶。
这些资料证实有生物活性的失配ds RNA片段的存在，并解释了这些片段在生物体液中有治疗活性的物质基础。这些资料也说明生物活性片段比其母体化合物更具活性。
实施例4
本发明另一个实施例是用其预防性传染病，诸如：细胞肥大病毒(CMV)(见N.Y.Times，July14，1988，PB6)该文章概述了性病的发生)。细胞肥大病毒(疱疹病毒的一种)仅在美国就感染了一百万以上的人，及有免疫系统缺陷的人常发生的胃肠絮乱或失明)无论是病毒感染的表而部分还是某个体腔都很难用抗病毒剂治愈)。CMV是性交传播的，施用适量失配ds RNA(Ampligen)经过一段时间生成具生物活性的片段，就可高效抑制该病毒。例如：图3表示当将CMV暴露于Ampligen片段24小时可100％抑制该病毒。当用相对无效的ds RNA时用表皮敷用的软膏是不可能控制活性材料的释放。
用细胞肥大病毒进行组织培养研究来说明dsRNA有生物活性片段在一段时间内的生成，有时称之为巨细胞内涵病，即在用该病毒感染的增大的细胞内发现有核内内涵物。人细胞肥大病毒是与疱疹病毒有关的一种病毒。1988年在美国估计有一百万人以上通过性感染这种CMV。感染通常不显症状，但对有免疫缺陷的人会导致胃肠絮乱和失明，新生儿对其特别敏感，因此CMV可导致流产，死产或产后死亡。见(The Merk Manual，14th Edition(1982)P205-206)对这种病无特异性治疗方法。
在本试验中，可用下列步骤和材料。
从新生儿分离人包皮成纤维细胞(HFF)，以低传代(＜20代)保存在含Earle氏盐补加有10％牛胎儿血清，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，20mM HEPES缓冲液和抗生素的基本培养基中。当细胞达到融合时，将其保存在含5％牛胎儿血清的上述培养基中。每周对细胞试验一次使其没受细菌和支原体的污染。
整个试验过程均用人细胞肥大病毒(CMV，ATCC#VR-538，AD169株)。它包含HFF的第二代，它是在当75％宿主细胞被其感染时收集的。将无细胞的储备病毒贮藏在试管中，保存于-120℃。细菌和支原体污染试验为阴性。在HFF细胞上测定CMV储备制剂的感染效价，为4×106形成荧光内涵物/ml(见下)。
用冷冻干燥的临床用Ampligen失配ds RNA；polyI.poly C U，Hem Research，Inc，Rockvill，Maryland，USA)。根据生产者说明书来重配Ampligen，分成小份及贮存于-120℃。每个试验取出一个小份，置于50℃水浴中转动使其融化，再根据上述组织培养基的需要浓度来稀释。
在不同条件下，用HFF细胞与药物温育，条件的变化包括(1)Ampligen浓度(2)供病毒摄取的Ampli-gen的顺序；和(3)HFF暴露于Ampligen时间的长短。用台盼蓝排斥法测定结果Ampligen处理的HFF与未处理的HFF活力基本一样(即，＞99％)。
将融合的HFF放在一打兰(容积3.7ml)壳型小瓶中在环状盖玻片上培养。用0.25ml适当稀释度的CMV与壳形小瓶一起温育开始感染细胞。在37℃700xg转速下使HFF暴露于CMV一小时使其摄取更多病毒。将小瓶洗2-3次除去细胞外病毒。然而向小瓶再加入1ml组织培养基，在常温下温育18-24小时，再在37℃温育72小时。
用下列步骤测量CMV的复制：
加入100％丙酮固定HFF，从而中止了病毒繁殖。将含原有HFF的盖玻片冲洗，并与抗CMV的小鼠单克隆抗体(Dupont)温育，该抗体是对72千道尔顿即刻早期蛋白特异的。加入FITC标记的抗小鼠IgGF(ab)2(Sigma)探测结合的抗体。当用表荧光显微镜放大250倍时可见感染病毒的细胞显示亮苯果绿核荧光。可在该显微镜下为CMV感染细胞计数(即这些细胞展示了荧光核内涵物)。将阳性储备制剂在无Ampligen下稀释，使其在温育24小时后每盖玻片上产生200-1200个CMV感染细胞。当感染倍数(MOI)为0.04时即可达到。
测定每个试验条件下复制的盖玻片上CMV内涵物平均数，比较没接受Ampligen的正对照细胞。平行估计未暴露于Amplign或CMV的负对照细胞。根据下式表示Ampligen抗病毒活性：
CMV内涵物抑制％有CMV内涵物平均数/用Amplinen处理HFF盖玻片＝100％((---------------)×100)有CMV内涵物平均数/未处理的HFF盖玻片
Ampligen预处理时间长短对人包皮成纤锥细胞感染细胞肥大病毒的影响表示在图3。复制单层人包皮成纤维细胞或是：
(1)用10μg/ml，Ampligen(开段)预处理的或是(2)用100μg/ml，(断段)在CMV摄取前特定时间间隔预处理的。
用所述IFA方法在病毒摄入后24时测定CMV感染程度。Ampligen处理培养物每盖玻片上CMV内涵物平均数与未用药处理的对照比较。结果说明Ampligen预处理时间长短与CMV感染抑制程度成正比。当用Ampligen预处理HFF24小时时可达CMV抑制最大值。
此研究表明失配ds RNA抗CMV病毒感染效果随时间而增强。CMV对失配ds RNA敏感性，时间，所用浓度，及相对无每性ds RNA滞留释放的水平本申请均未触及。

Claims (5)

1.一种制备含有失配多聚核苷酸复合物的低分子量生物活性片段的药物组合物的方法，该方法包括使其中在配对链之间的碱基氢键(碱基堆积)每29个连续的碱基残基平均不到一个碱基对被打断的双链合成多聚核苷酸复合物(dsRNT)受到核酸酶的水解以生成长度小于100个碱基对的小的、有生物活性的dsRNA片段。
2.权利要求1所述的方法，其中生物活性片段的长度小于50个碱基对。
3.权利要求1所述的方法，其中dsRNA是1∶5-1∶30尿嘧啶或鸟心呤碱基的多聚肌苷酸和多聚胞苷酸的复合物。
4.权利要求3所述的方法，其中dsRNA是rIn·r(C12-14，U)n。
5.权利要求3所述的方法，其中dsRNA是rIn·(C29，G)n。
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